一種提高臍血外向生長內皮細胞增殖能力及性能的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種提高臍血外向生長內皮細胞增殖能力及性能的方法。該方法是從新鮮臍血中分離純化臍血源外向生長內皮細胞，與臍帶來源的間充質干細胞混合培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含體積分數10％胎牛血清+EGM-2BulletKit完全培養(yǎng)基。通過本發(fā)明的方法，以達到提高其增殖效率及成血管能力的目的。本發(fā)明的方法應用后由于間充質干細胞的免疫下調作用和治療總細胞量的擴充，減少了由于免疫反應損失細胞的比例，保證治療效果，增強了臍血源外向生長內皮細胞的應用可能性。間充質干細胞還具有輔助維持血管的能力，為長期治療的效果提供了保證。本發(fā)明的主要使用范圍是應用于臍血外向生長內皮細胞在血管修復治療、組織工程等方面。
【專利說明】一種提高臍血外向生長內皮細胞增殖能力及性能的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于細胞治療領域，特別涉及一種提高臍血外向生長內皮細胞增殖能力及 性能的方法。

【背景技術】
[0002] 外向生長內皮細胞（outgrowth endothelial cell, 0EC)，屬于血管內皮前體類 細胞，體外培養(yǎng)時呈鋪路石樣生長，形成細胞單層，與成熟內皮細胞形態(tài)一致，但其具有快 速擴增和生成血管的能力，使之成為細胞治療領域的新寵，研究者們希望能將其用于心腦 血管疾病、心臟病、肢體缺血等疾病的治療。Jumi Kim等（Jumi Kim，Young-Joo Jeon. Comparative proteomic analysis of endothelial cells progenitor cells derived from cord blood-and peripheral blood for cell therapy. Biomaterials. Volume34, Is sue6, February2013, Pagesl669 - 1685.)比較了胳血外向生長內皮細胞和外周血外向生長 內皮細胞的差異，發(fā)現無論是體外成血管能力還是動物的體內缺血損傷的修復實驗，臍血 外向生長內皮細胞都優(yōu)于外周血。David A等（David A. Ingram, Laura E. · Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood blood, 2004, 104:2752-2760.)也報道臍血中外向生長內皮細胞體 外培養(yǎng)時表現出更高的擴增能力，能夠在長期培養(yǎng)中保持前體細胞特性。
[0003] 雖然臍血外向生長內皮細胞相對外周血外向生長內皮細胞有相當多的好處，但是 由于其適應癥多為退行性疾病，類似心腦血管疾病、糖尿病足等，需要長期多次的輸注，細 胞量就成為了其應用的瓶頸。臍血外向生長內皮細胞原代誘導率不高，低密度下尤其生長 緩慢，細胞治療需要的細胞量比較大，如何增加細胞量，同時增強其生成血管的能力是臨床 前研究的主要方向。
[0004] 間充質干細胞已證明在增殖過程中分泌大量細胞因子，體內可以促進血管再生、 增加血管強度，現廣泛用于糖尿病足等再生醫(yī)學輔助治療領域。


【發(fā)明內容】

[0005] 為了克服現有技術的缺點與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種提高臍血源外向生 長內皮細胞增殖能力及性能的方法。通過間充質干細胞和臍血外向生長內皮細胞混合培 養(yǎng)，提高臍血外向生長內皮細胞的增殖效率及成血管能力。該方法采用可靠的供體，經分 離、培養(yǎng)得到干細胞產品。制備過程簡單、可靠、重復性好。間充質干細胞和臍血外向生長 內皮細胞共培養(yǎng)，提高臍血外向生長內皮細胞低密度下的增殖能力，同時可以充分利用間 充質干細胞的旁分泌作用促進臍血外向生長內皮細胞成血管。實驗證明在胞外基質不足以 支撐血管時，間充質干細胞可以輔助支撐血管，維持血管形態(tài)。
[0006] 本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現：一種提高臍血源外向生長內皮細胞增殖能 力及性能的方法，包括如下步驟：
[0007] 將間充質干細胞和內皮細胞混合培養(yǎng)，即能提高臍血外向生長內皮細胞增殖能力 及性能；其中所述的間充質干細胞為健康人的臍帶源間充質干細胞，所述內皮細胞為健康 人臍血源外向生長內皮細胞，以下簡稱內皮細胞。
[0008] 所述的提高臍血源外向生長內皮細胞增殖能力及性能的方法，具體包括如下步 驟：
[0009] (1)間充質干細胞的分離和原代培養(yǎng)：將臍帶剔除血管，去除殘余血液，剝離出沃 頓膠，剪成1?2_ 2的組織塊，平鋪在T25培養(yǎng)瓶底，加入1?2mL間充質干細胞培養(yǎng)基 (L0NZA ;以下簡稱間充質干細胞培養(yǎng)基），培養(yǎng)7?11天，分離出原代間充質干細胞；
[0010] (2)間充質干細胞的傳代：將步驟（1)獲得的原代間充質干細胞傳代，質量分數 0. 25%胰酶消化，間充質干細胞培養(yǎng)基終止消化，離心去上清，留取細胞沉淀，用間充質干 細胞培養(yǎng)基重懸，接種在T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，按1:3的比例傳代，3?4天傳代一次；
[0011] (3)內皮細胞的分離和原代培養(yǎng)：新鮮臍血密度梯度離心分離出單個核細胞，所 得單個核細胞重懸于內皮細胞培養(yǎng)基中，在膠原預鋪板的6孔板中培養(yǎng)10?20天后得到 原代內皮細胞；
[0012] (4)內皮細胞P1傳代：在步驟⑶獲得的原代內皮細胞集落細胞數大于1000時， 傳代，37°C預熱的質量分數0. 25%胰酶消化，內皮細胞培養(yǎng)基終止消化，收集細胞懸液，離 心去上清，留取細胞沉淀，用內皮細胞培養(yǎng)基重懸，接種在膠原預鋪板的6孔板中培養(yǎng)；
[0013] (5)內皮細胞P2傳代：P1細胞70%融合后傳代，37°C預熱的質量分數0· 25%胰酶 消化，內皮細胞培養(yǎng)基終止消化，收集細胞懸液，離心去上清，留取細胞沉淀，用內皮細胞培 養(yǎng)基重懸，接種在膠原預鋪板的T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)；
[0014] (6)內皮細胞P3傳代：P2細胞70 %融合后傳代，37°C預熱的質量分數0· 25 %胰酶 消化，內皮細胞培養(yǎng)基終止消化，收集細胞懸液，離心去上清，留取細胞沉淀，用內皮細胞培 養(yǎng)基重懸，接種在膠原預鋪板的T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)；
[0015] (7)內皮細胞與間充質干細胞混合培養(yǎng)：將內皮細胞與間充質干細胞分別計數， 以細胞個數1 :1的比例混合，以每瓶10mL的量接種在膠原預鋪板的T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，即 能提高臍血外向生長內皮細胞增殖能力及性能。
[0016] 步驟（1)中所述的培養(yǎng)的條件優(yōu)選為置于37°C，飽和濕度，體積分數5%二氧化碳 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0017] 步驟⑵中所述的離心的條件優(yōu)選為離心時間5min，離心力500g，離心加速度7g， 減速度7g，溫度20°C ;
[0018] 步驟⑴和⑵中所述的間充質干細胞培養(yǎng)基優(yōu)選為L0NZA公司的 TheraPEAK?MSCGM-CD?Medium ；
[0019] 步驟（3)中所述的新鮮臍血優(yōu)選應采用24小時之內新鮮臍血；
[0020] 步驟（3)中所述的新鮮臍血密度梯度離心分離出單個核細胞的條件優(yōu)選為新鮮 臍血與生理鹽水體積比1 :1稀釋后，經Ficoll淋巴細胞分離液分離單個核細胞，離心時間 25min，尚心力500g，尚心加速度lg，減速度lg，溫度20 C ;尚心結束后，取白?旲層（白?旲層 在血漿層和分離液層之間）；加入3倍體積的生理鹽水，洗滌一次，離心力800g，離心時間 8min，離心加速度7g，減速度7g，收集細胞沉淀，30mL的生理鹽水再洗一次，離心力200g，離 心時間lOmin，離心加速度4g，減速度4g，收集細胞沉淀，即為單個核細胞；
[0021] 步驟（4)、（5)和（6)中所述的傳代優(yōu)選按1 : (3?5)比例進行傳代；更優(yōu)選為1 : 3 ；
[0022] 步驟（4)、（5)和（6)中所述的離心的條件優(yōu)選為離心時間4?8min，離心力 400g?800g，離心加速度7g，減速度7g，溫度20°C ;更優(yōu)選為離心時間5min，離心力500g， 離心加速度7g，減速度7g，溫度20°C ;
[0023] 步驟（3)?（7)中所述的內皮細胞培養(yǎng)基優(yōu)選為體積分數10%胎牛血清 +EGM-2BulletKit 完全培養(yǎng)基（L0NZA 公司）
[0024] 步驟（7)中所述的內皮細胞與間充質混合培養(yǎng)，接種時總細胞密度優(yōu)選為 3 X 104 ?5 X 104 個 /mL ;更優(yōu)選為 4 X 104 個 /mL ;
[0025] 步驟（7)中所述的內皮細胞與間充質干細胞混合培養(yǎng)，內皮細胞代數優(yōu)選為3? 6代，更優(yōu)選為3代；
[0026] 步驟（7)中所述的內皮細胞與間充質干細胞混合培養(yǎng)，間充質干細胞代數優(yōu)選為 4代以內，更優(yōu)選為2代；
[0027] 步驟（7)中所述的內皮細胞與間充質干細胞混合培養(yǎng)，培養(yǎng)時間優(yōu)選不超過7天， 更優(yōu)選為3?4天；
[0028] 步驟（7)中所述的內皮細胞與間充質干細胞混合培養(yǎng)，混合細胞可在一代內獲得 5?6倍的擴增，有效減少傳代次數，避免傳代時損傷細胞和引起分化；
[0029] 步驟（7)中所述的混合培養(yǎng)后的細胞在matrigel中表現出更好的成血管能力；
[0030] 步驟（7)中所述的混合培養(yǎng)后的細胞在去除培養(yǎng)基中外源因子的條件下，在 matrigel中血管保持的時間更長；
[0031] 步驟（7)中所述的內皮細胞與間充質干細胞混合培養(yǎng)，兩種細胞在混合前的特征 為：
[0032] ①內皮細胞鋪路石樣生長，細胞形態(tài)均一，高密度培養(yǎng)時增殖迅速；⑶309、⑶34 陽性表達；⑶105>80% ;在matrigel中能迅速成血管；在培養(yǎng)到5?6代后進入分化，⑶34 表達量增加，增殖能力減弱，在matrigel中成血管能力減弱；
[0033] ②臍帶源間充質干細胞成纖維樣生長，細胞形態(tài)均一，增殖迅速，流式表型為 CD105>90 %, CD90>90 %, CD73>90 %, CD45〈2 %, CD34〈2 %。
[0034] 步驟（7)中所述的內皮細胞與間充質干細胞混合培養(yǎng)，兩種細胞在混合后的特征 為：增殖迅速，在matrigel中能迅速成血管，流式表型⑶105>80%。
[0035] 本發(fā)明的機理是：間充質干細胞分泌大量血管生成相關細胞因子，有助于內皮細 胞的增殖和血管的形成，例如VEGF-A、VEGF-D、bFGF等，并且臍帶間充質干細胞在分泌細胞 因子促進血管生成方面優(yōu)于骨髓間充質干細胞。外向生長內皮細胞是一種密度依賴形的細 胞，增殖需要一定的細胞數量和生長因子含量，臍血外向生長內皮細胞由于細胞量的制約 而不能有效用于臨床，間充質細胞剛好可以提供這樣的條件，作為一種基質細胞加速臍血 外向生長內皮細胞的生長。
[0036] 同時，間充質干細胞作為一種基質細胞支持內皮細胞血管形成，增加血管形成的 數量，特別是在胞外基質不能夠支撐所形成的血管時，間充質細胞可以起到支撐的作用，輔 助維持血管形態(tài)。
[0037] 本發(fā)明相對于現有技術，具有如下的優(yōu)點及效果：
[0038] (1)本發(fā)明將間充質干細胞在短時間內旁分泌促進血管再生的能力利用起來，首 先促進了臍血外向生長內皮細胞迅速增殖，縮短應用所需要的時間，增加細胞數量；其次增 強細胞成血管能力，在matrigel中能迅速成血管，提高治療效果；再者，間充質干細胞具有 輔助維持血管的能力，為長期治療的效果提供了保證；此外，本發(fā)明得到的混合細胞的流式 表型 CD105>80%。
[0039] (2)在細胞治療中，細胞總量是一個很重要的問題，外源細胞進入人體會引發(fā)一定 程度的免疫反應，這些免疫反應導致細胞量減少。而本發(fā)明的方法應用后擴充了治療總細 胞量，減少由免疫反應損失細胞的比例。同時由于間充質干細胞的免疫下調作用，進一步減 少了損失的細胞量，保證治療效果
[0040] (3)對于患者來說，自體外周血的外向生長內皮細胞活性一般較差，異體細胞來源 雖然豐富但免疫原性較強，不適合細胞治療應用。臍血外向生長內皮細胞經大量文獻證實， 其治療前景是優(yōu)于外周血來源的，但是由于來源有限，導致細胞量受到限制而難以進入應 用，本發(fā)明的方法在擴充了總細胞量、增強其作用能力的同時減少了治療中的損耗。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0041] 圖1是倒置顯微鏡下觀察第2代間充質干細胞的形態(tài)圖。
[0042] 圖2是流式細胞儀檢測第2代間充質干細胞的表面抗原的表達情況圖。
[0043] 圖3是倒置顯微鏡下觀察第3代內皮細胞的形態(tài)圖。
[0044] 圖4是流式細胞儀檢測第3代內皮細胞的表面抗原的表達情況圖。
[0045] 圖5是第3代、4代、5代和6代內皮細胞的成血管實驗圖。
[0046] 圖6是倒置顯微鏡下觀察第2代間充質干細胞和第3代內皮細胞共培養(yǎng)的形態(tài) 圖。
[0047] 圖7是成血管實驗圖；其中，圖A為第2代間充質干細胞和第3代內皮細胞共培養(yǎng) 后的混合細胞成血管實驗圖；圖B為內皮細胞成血管實驗圖；圖C為間充質干細胞成血管 實驗圖。
[0048] 圖8是流式細胞儀檢測實施例5混合組細胞的⑶105表達情況圖。

【具體實施方式】
[0049] 下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0050] 下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)實驗條件或按照制 造廠商所建議的實驗條件。
[0051] 間充質干細胞培養(yǎng)基為L0NZA公司的TheraPEAKTMMSCGM-CD?Medium ;
[0052] 內皮細胞培養(yǎng)基為體積分數10 %胎牛血清+EGM-2BulletKit完全培養(yǎng)基， EGM-2BulletKit 購自 L0NZA 公司。
[0053] 實施例1
[0054] 臍血和臍帶標本為通過無菌操作，由健康產婦娩出的胎盤獲取。經檢測乙型肝炎、 丙型肝炎、梅毒、艾滋、巨細胞病毒、TORCH檢測、支原體、衣原體、G-6TO和地貧等均陰性。標 本采集后運回血庫過程保持4?8°C運輸條件。按照以下方法處理。
[0055] 1、臍帶間充質干細胞的制備
[0056] 從健康人的臍帶組織中提取間充質干細胞，獲取的間充質干細胞進行體外培養(yǎng)、 擴增。原代細胞收集后按1 :3的比例進行傳代培養(yǎng)，當細胞鋪滿瓶底約80%密度時，利用 胰酶進行消化、收集，按相同的比例進行傳代，最多傳代培養(yǎng)至第3代，收集第3代的細胞， 此時收集的細胞生物學性狀穩(wěn)定，細胞活性好，增殖能力強。具體過程如下：
[0057] 1)無菌采取健康人的臍帶；
[0058] 2)去掉臍帶里的血管和外層羊膜，留取沃頓膠質；
[0059] 3)將臍帶組織剪切成1?2cm2的小塊。
[0060] 4)將剪切后的小塊接種T25的培養(yǎng)瓶中，加入1?2mL間充質培養(yǎng)基，置于37°C， 飽和濕度，體積分數5%二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國）中培養(yǎng)；
[0061] 5)經過7天后，細胞換液，3?4天后細胞可以傳代。
[0062] 6)利用質量分數0. 25%的胰酶（GIBC0公司，美國）進行消化，收集細胞，接種在 T25的培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)。
[0063] 7)當細胞鋪滿瓶底約80 %密度時，利用質量分數0. 25%的胰酶進行消化，收集細 胞。
[0064] 2、臍血外向生長內皮細胞的制備
[0065] 從24小時內的新鮮健康人臍血中獲取單個核細胞，于內皮細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)至 P1代，具體過程如下。
[0066] 1)生理鹽水與50mL新鮮臍血1:1的比例稀釋，混合均勻后，加到淋巴細胞分離液 上，進行單個核細胞的分離，離心時間25min，離心力500g，離心加速度lg，減速度lg，溫度 20。。。
[0067] 2)離心結束后，取白膜層（白膜層在血漿層和分離液層之間）。加入3倍體積的 生理鹽水，洗滌一次,離心力800g，離心8min。
[0068] 3)收集細胞沉淀，用30mL的生理鹽水再洗一次，離心力200g，離心時間lOmin，離 心加速度4g，減速度4g，收集細胞沉淀，即得單個核細胞。
[0069] 4)將臍血單個核細胞以1 X 105個/mL接種在膠原預鋪板的6孔板中，加入2mL內 皮細胞培養(yǎng)基/孔。
[0070] 5)第5天將未貼壁細胞棄去，3天換液一次直到發(fā)現鋪路石樣細胞集落。繼續(xù)培 養(yǎng)4天左右即可收集細胞。
[0071] 6)P1傳代：利用37°C預熱的質量分數0. 25%的胰酶進行消化，內皮細胞培養(yǎng)基終 止消化，收集細胞懸液，離心，離心時間5min，離心力500g，離心加速度7g，減速度7g，溫度 20°C，去上清，留取細胞沉淀，用內皮細胞培養(yǎng)基重懸，接種在膠原預鋪板的6孔板中培養(yǎng)。
[0072] 7) P2傳代：P1細胞70 %融合后，利用37°C預熱的質量分數0. 25 %的胰酶進行消 化，內皮細胞培養(yǎng)基終止消化，收集細胞懸液，離心，離心時間5min，離心力500g，離心加速 度7g，減速度7g，溫度20°C，去上清，留取細胞沉淀，用內皮細胞培養(yǎng)基重懸，接種在膠原預 鋪板的T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
[0073] 8) P3傳代：P2細胞70 %融合后，利用37°C預熱的質量分數0. 25 %的胰酶進行消 化，內皮細胞培養(yǎng)基終止消化，收集細胞懸液，離心，離心時間5min，離心力500g，離心加速 度7g，減速度7g，溫度20°C，去上清，留取細胞沉淀，用內皮細胞培養(yǎng)基重懸，接種在膠原預 鋪板的T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
[0074] 3、間充質干細胞和內皮細胞的鑒定
[0075] 1)間充質干細胞的鑒定通過以下方法
[0076] a)間充質干細胞的形態(tài)學分析及細胞計數：將培養(yǎng)至第2代的細胞，在倒置顯微 鏡觀察細胞狀態(tài)，并拍照。
[0077] b)流式細胞儀的表型測定：取第2代細胞，經質量分數0. 25%胰酶消化收集后，生 理鹽水離心洗滌2次。同型對照管加入鼠IgG-FITC、IgG-PE (BD公司，美國），檢測管分別 加入鼠抗人 CD105-PE、CD90-FITC、CD73-PE、CD45-FITC、CD34-PE(BD 公司，美國）各 5μ L。 室溫避光孵育30min，流式細胞儀（Fascalibur，BD公司，美國）檢測。
[0078] 2)內皮細胞的鑒定通過以下方法
[0079] a)內皮細胞的形態(tài)學分析及細胞計數：將P3代培養(yǎng)至第2天的細胞，在倒置顯微 鏡觀察，并拍照。消化傳代過程中取微量細胞懸液，計數細胞數量。
[0080] b)流式細胞儀的表型測定：將第3代培養(yǎng)的細胞，消化傳代過程中取足量細胞懸 液，經離心收集后，生理鹽水離心洗滌2次。同型對照管加入鼠IgG-FITC、IgG-PE，檢測管分 別加入鼠抗人CD309-PE、CD34-PE、CD105-PE (BD公司，美國）各5 μ L。室溫避光孵育30min， 流式細胞儀（Fascalibur，BD公司，美國）檢測。
[0081] c)成血管實驗鑒定融解matrigel (BD公司，美國），用預冷槍頭將已完全融 解的matrigel加入預冷的的96孔板，每孔40 μ L，37?孵育30?60min。收獲內皮細胞， 重懸于EBM-2基礎培養(yǎng)基（L0NZA公司），細胞密度5 X 105個/mL，加入96孔板，每孔加入 5〇1^，371：培養(yǎng)1811，觀察血管形成效果。
[0082] 3)細胞鑒定結果：
[0083] 倒置顯微鏡下觀察第2代間充質干細胞形態(tài)較單一，長梭形細胞多見，少量的星 形細胞，圓形細胞極少。細胞低密度時長成扁平單層細胞，細胞生長密度增加時，細胞形態(tài) 變得細長，形態(tài)類似成纖維細胞，呈平行排列生長或旋渦狀生長（見圖1)。經流式細胞儀 (Fascalibur，BD公司，美國）檢測顯示，細胞表面抗原CD105、CD90、CD73陽性表達率達到 95%以上，⑶45、⑶34陽性表達率2%以下（見圖2)。綜上所述，按照本發(fā)明專利方法制備 出的間充質干細胞純度高，活性好，符合要求。
[0084] 倒置顯微鏡下觀察第3代（P3代）內皮細胞形態(tài)較單一，鋪路石樣生長。細胞低 密度時呈集落生長，傳代后集落不明顯（見圖3)。經流式細胞儀檢測顯示，細胞表面抗原 ⑶309、⑶34陽性表達，⑶105陽性表達率達到80%以上（見圖4)。經成血管實驗，本申請 所獲得內皮細胞在3代到六代均能穩(wěn)定成血管（見圖5)。6代以后細胞增殖速度下降，8? 9代后不再增殖。綜上所述，按照本發(fā)明專利方法制備出的內皮細胞活性好，符合要求。
[0085] 4、該實驗重復3次，每次均后續(xù)進行實施例2實驗。
[0086] 實施例2
[0087] 參照實施例1的方法，將收集到的內皮細胞以內皮細胞培養(yǎng)基調整密度到IX 105 個/mL，標為細胞懸液A ;將收集到的間充質干細胞以內皮細胞培養(yǎng)基調整密度到1 X 105個 /mL，標為細胞懸液B，取細胞懸液A和細胞懸液B各2mL加入到6mL內皮細胞培養(yǎng)基中，即 混合組。
[0088] 同時設內皮細胞組為0EC組，間充質干細胞組為MSC組，0EC組取細胞懸液A2mL加 入到8mL內皮細胞培養(yǎng)基中。MSC組取細胞懸液B2mL加入到8mL內皮細胞培養(yǎng)基中。
[0089] 3組分別加入到膠原預鋪板的T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
[0090] 該實驗重復3次，每次實驗均按照實施例3、實施例4和實施例5進行結果分析。
[0091] 實施例3
[0092] 參照實施例2的方法，4天后收獲細胞，對收獲的細胞進行細胞計數，對比3組細胞 量，用以下公式計算其增殖倍數。
[0093] 增殖倍數=收獲細胞量/接種細胞量
[0094] 結果見表1 :混合組細胞增殖率較內皮細胞組和間充質干細胞組更大，差異有統 計學意義，達到本申請快速擴增的要求。
[0095] 表 1
[0096]

【權利要求】
1. 一種提高臍血外向生長內皮細胞增殖能力及性能的方法，其特征在于包括如下步 驟： 將間充質干細胞和內皮細胞混合培養(yǎng)，即能提高臍血外向生長內皮細胞增殖能力及性 能；其中所述的間充質干細胞為健康人的臍帶源間充質干細胞，所述內皮細胞為健康人臍 血外向生長內皮細胞。
2. 根據權利要求1所述的提高臍血外向生長內皮細胞增殖能力及性能的方法，其特征 在于包括如下具體步驟： (1) 間充質干細胞的分離和原代培養(yǎng)：將臍帶剔除血管，去除殘余血液，剝離出沃頓 膠，剪成1?2_2的組織塊，平鋪在T25培養(yǎng)瓶底，加入1?2mL間充質干細胞培養(yǎng)基，培 養(yǎng)7?11天，分離出原代間充質干細胞； (2) 間充質干細胞的傳代：將步驟（1)獲得的原代間充質干細胞傳代，質量分數0. 25% 胰酶消化，間充質干細胞培養(yǎng)基終止消化，離心去上清，留取細胞沉淀，用間充質干細胞培 養(yǎng)基重懸，接種在T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，按1:3的比例傳代，3?4天傳代一次； (3) 內皮細胞的分離和原代培養(yǎng)：新鮮臍血密度梯度離心分離出單個核細胞，所得單 個核細胞重懸于內皮細胞培養(yǎng)基中，在膠原預鋪板的6孔板中培養(yǎng)10?20天后得到原代 內皮細胞； (4) 內皮細胞P1傳代：在步驟（3)獲得的原代內皮細胞集落細胞數大于1000時，傳代， 37°C預熱的質量分數0. 25%胰酶消化，內皮細胞培養(yǎng)基終止消化，收集細胞懸液，離心去上 清，留取細胞沉淀，用內皮細胞培養(yǎng)基重懸，接種在膠原預鋪板的6孔板中培養(yǎng)； (5) 內皮細胞P2傳代：P1細胞70%融合后傳代，37°C預熱的質量分數0.25%胰酶消 化，內皮細胞培養(yǎng)基終止消化，收集細胞懸液，離心去上清，留取細胞沉淀，用內皮細胞培養(yǎng) 基重懸，接種在膠原預鋪板的T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)； (6) 內皮細胞P3傳代：P2細胞70%融合后傳代，37°C預熱的質量分數0.25%胰酶消 化，內皮細胞培養(yǎng)基終止消化，收集細胞懸液，離心去上清，留取細胞沉淀，用內皮細胞培養(yǎng) 基重懸，接種在膠原預鋪板的T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)； (7) 內皮細胞與間充質干細胞混合培養(yǎng)：將內皮細胞與間充質干細胞分別計數，以細 胞個數1 :1的比例混合，接種在膠原預鋪板的T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，即能提高臍血外向生長內 皮細胞增殖能力及性能。
3. 根據權利要求2所述的提高臍血外向生長內皮細胞增殖能力及性能的方法，其特征 在于： 步驟（3)中所述的新鮮臍血應采用24小時之內新鮮臍血； 步驟（3)中所述的新鮮臍血密度梯度離心分離出單個核細胞的條件為新鮮臍血與生 理鹽水體積比1 :1稀釋后，經Ficoll淋巴細胞分離液分離單個核細胞，離心時間25min，離 心力500g，離心加速度lg，減速度lg，溫度20°C;離心結束后，取白膜層；加入3倍體積的生 理鹽水，洗滌一次，離心力800g，離心時間8min，離心加速度7g，減速度7g，收集細胞沉淀， 30mL的生理鹽水再洗一次，離心力200g，離心時間lOmin，離心加速度4g，減速度4g，收集細 胞沉淀，即為單個核細胞。
4. 根據權利要求2所述的提高臍血外向生長內皮細胞增殖能力及性能的方法，其特征 在于：步驟（4)、（5)和（6)中所述的傳代按1 : (3?5)比例進行傳代。
5. 根據權利要求2所述的提高臍血外向生長內皮細胞增殖能力及性能的方法，其特征 在于： 步驟（2)中所述的離心的條件為離心時間5min，離心力500g，離心加速度7g，減速度 7g，溫度 20°C ; 步驟（4)、（5)和（6)中所述的離心的條件為離心時間4?8min，離心力400g?800g, 離心加速度7g，減速度7g，溫度20°C。
6. 根據權利要求2所述的提高臍血外向生長內皮細胞增殖能力及性能的方法，其特 征在于：步驟（7)中所述的內皮細胞與間充質混合培養(yǎng)，接種時總細胞密度為3X10 4? 5X104f/mL。
7. 根據權利要求2所述的提高臍血外向生長內皮細胞增殖能力及性能的方法，其特征 在于：步驟（7)中所述的內皮細胞與間充質干細胞混合培養(yǎng)，內皮細胞代數為3?6代。
8. 根據權利要求2所述的提高臍血外向生長內皮細胞增殖能力及性能的方法，其特征 在于：步驟（7)中所述的內皮細胞與間充質干細胞混合培養(yǎng)，間充質干細胞代數為4代以 內。
9. 根據權利要求2所述的提高臍血外向生長內皮細胞增殖能力及性能的方法，其特征 在于：步驟（7)中所述的內皮細胞與間充質干細胞混合培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不超過7天。
10. 根據權利要求2所述的提高臍血外向生長內皮細胞增殖能力及性能的方法，其特 征在于：步驟（7)中所述的內皮細胞與間充質干細胞混合培養(yǎng)，兩種細胞在混合前的特征 為： ① 內皮細胞鋪路石樣生長，細胞形態(tài)均一，高密度培養(yǎng)時增殖迅速；CD309、CD34陽性 表達，⑶105>80%;在matrigel中能迅速成血管；在培養(yǎng)到5?6代后進入分化，⑶34表達 量增加，增殖能力減弱，在matrigel中成血管能力減弱； ② 臍帶源間充質干細胞成纖維樣生長，細胞形態(tài)均一，增殖迅速，流式表型為 CD105>90%, CD90>90%, CD73>90%, CD45〈2%, CD34〈2%。
【文檔編號】C12N5/071GK104099291SQ201410333512
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月14日 優(yōu)先權日:2014年7月14日
【發(fā)明者】嵐山芮, 魏偉, 郭磊 申請人:廣州市天河諾亞生物工程有限公司