專利名稱：：免疫球蛋白變體及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及抗-CD20抗體及其在治療B細胞相關疾病中的用途。
背景技術：
：淋巴細胞是白細胞的幾個群體之一；它們特異性地識別和對外部抗原作出反應。淋巴細胞的三種主要類別是B淋巴細胞(B細胞)、T淋巴細胞(T細胞)與自然殺傷(NK)細胞。B淋巴細胞是負責抗體產生與提供體液免疫的細胞。B細胞在骨髓內部成熟并離開骨髓，在它們的細胞表面表達與抗原結合的抗體。當幼稚B細胞首次遇到其膜-結合抗體所特異的抗原時，細胞開始迅速分裂，其后代分化成記憶B細胞與被稱為"漿細胞"的效應細胞。記憶B細胞具有較長壽命期限，并且繼續(xù)表達與最初的母細胞具有相同特異性的膜結合抗體。漿細胞不產生膜結合抗體，但是相反產生分泌形式的抗體。分泌的抗體是體液免疫的主要效應物。CD20抗原(也被稱作人B淋巴細胞限制的分化抗原，Bp35)是位于前-B與成熟B淋巴細胞上的疏水跨膜蛋白質，具有分子量大約35kD。/所o/.C77e附.264(19):11282-11287(1989);與Einfelda/.7(3):711-717(1988))。該抗原也在超過90%的B細胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)上表達63(6):1424-1433(1984))，但是在造血千細胞、原B細胞、正常漿細胞或者其它正常組織中沒有找到(TedderdJ！/畫畫/.135(2):973-979(1985))。CD20被認為調節(jié)細胞周期起始與分化的激活過程中的一個早期步驟。(Tedder"a/"swpra)，并且可能作為4丐離子通道發(fā)揮作用(Tedder^CW/.歷oc/ze附.14D:195(1990》。由于CD20在B細胞淋巴瘤中的表達，這一抗原已被用作治療該淋巴瘤的有用的治療靶向。在美國有超過300，000人患有B細胞NHL，每年有超過56，000個新病例被診斷。例如，rituximab(RITUXAN)抗體被用來治療具有復發(fā)或難治療的低級或者濾泡的、CD20陽性的B細胞非何杰金氏淋巴瘤，該抗體是遺傳改造的針對人CD20抗原的嵌合鼠/人單克隆抗體(可從Genentech，Inc.SouthSanFrancisco,California,U.S.購得)。Rituximab是在1998年4月7日發(fā)布的美國專利號5，736,137(Andersonetal.)與在美國專利號5,776，456中被稱做"C2B8"的抗體。體外作用機理研究顯示RITUXAN與人補體結合，并且通過補體依賴的細胞毒性(CDC)溶解淋巴樣B細胞系Blood83(2):435-445(1994))。另夕卜，它在對抗體依賴的細胞的細胞毒性(ADCC)的分析中具有顯著活性。體內臨床前研究表明RITUXAN⑧消減來自獼猴周圍血液、淋巴結與骨髓的B細胞，推測是通過補體與細胞介導的過程B/ood83(2):435-445(1994))。其它指示NHL治療的抗CD20抗體包括鼠抗體ZevalinTM，其與放射性同位素釔90連接(IDECPharmaceuticals,SanDiego,CA)，和BexxarTM，其是與I131偶聯的另一個完全的鼠的抗體(Corixa,WA)。鼠抗體在人類治療中的使用的一個主要限制之處在于人抗小鼠抗體(HAMA)反應(參見，侈'B口Miller,R.A.etal."MonoclonalantibodytherapeutictrialsinsevenpatientswithT-celllymphoma"Blood,62:988-995，1983;和Schroff,R.W.,etal."Humananti-murineimmunoglobulinresponseinpatientsreceivingmonoclonalantibodytherapy"CancerRes.,45:879-885,1985)。即使嚙齒類動物抗體的可變(V)結構域與人恒定(C)區(qū)域融合的嵌合分子仍然能引發(fā)顯著的免疫反應(HACA,人抗嵌合抗體)Nature(Lond.),314:268-270,1985)。克服在單克隆抗體的臨床利用中的這些限制的一個有效手段是"人源化"鼠抗體或者來自非人物種的抗體。(Jonesda/.Nature(Lond),321:522-525:1986;RiechmanNature(Lond)，332:323-327,1988)。因此，生產針對CD20抗原的治療抗體是有利的，該抗體當給藥給病人、特別是用于長期治療時產生最低的或沒有抗原性。本發(fā)明滿足這一及其它需求。本發(fā)明提供克服目前治療性組合物限制性的抗CD20抗體，以及4是供額外的好處，這些好處將從下面的詳細說明中加以明了。發(fā)明概述本發(fā)明提供CD20結合抗體或其功能性片段，以及其在治療B細胞相關疾病中的用途。這些抗體是單克隆抗體。在特定的實施方式中，結合CD20的抗體是人源化的或者嵌合的。人源化的2H7變體包括在FR中具有氨基酸取代的變體，以及在移植的CDR中具有改變的親和力成熟變體。在CDR或者FR中取代的氨基酸不局限于在供體或者受體抗體中存在的那些氨基酸。在其它實施方式中，本發(fā)明的抗-CD20抗體更進一步地包含Fc區(qū)域的氨基酸殘基改變，這些改變導致效應子功能改善，包括增強CDC和/或ADCC功能與B細胞殺傷(在此也稱為B細胞耗盡)。本發(fā)明的其它抗-CD20抗體包括那些具有能改善穩(wěn)定性的改變的抗體。在一個特殊的具體實施方式中，穩(wěn)定性增加的人源化2H7變體在下面實施例6中加以描述。還提供在體內具有改善的ADCC功能的巖藻糖缺陷的變體。在一個實施方式中，嵌合抗CD20抗體具有鼠可變區(qū)與人恒定區(qū)。一個像這樣的特殊嵌合抗CD204元體是Rituxan(Rituximab;Genentech,Inc.)。在本發(fā)明的所有抗體組合物和使用方法的一個優(yōu)選實施方式中，人源化的CD20結合抗體是2H7.vl6，具有分別如圖6和圖7所示的SEQIDNO.21和22的輕與重鏈氨基酸序列。當提及在圖6、7和8中的多肽序列時，應該理解，形成分泌信號序列的前19個左右氨基酸在成熟多肽中不存在。除了在說明書中指示的氨基酸取代位置之外，基于version16的所有其它變體的可變區(qū)將具有v16的氨基酸序列。除非另外指明，2H7變體將具有與vl6相同的輕鏈。本發(fā)明提供與人CD20結合的人源化抗體或者其抗原結合片段，其中抗體對體內消減靈長類動物B細胞是有效的，該抗體在H4連可變區(qū)(VH)包含至少來自抗人CD20抗體的SEQIDNO.12的CDR3序列、和人重鏈亞群(subgroup)III(VHlII)的基本上(substantially)的人共有框架(FR)殘基。在一個實施方式中，靈長類動物B細胞來自于人和獼猴。在一個實施方式中，抗體更進一步包含SEQIDNO.10的H鏈CDR1序列與SEQIDNO.11的CDR2序列。在另一個實施方式中，前述抗體包含SEQIDNO.4的L鏈CDR1序列、SEQIDNO.5的CDR2序列、SEQIDNO.6的CDR3序列，具有人輕鏈k亞群I(VkI)的實質上人共有框架(FR)殘基。在一優(yōu)選實施方案中，VL的FR區(qū)域在位置46具有供體抗體殘基；在一個具體的實施方式中，Vl的FR2具有l(wèi)euL46pro的氨基酸取代(在人Kl共有序列中的Leu換成在m2H7相應位置存在的pro)。VH區(qū)域更進一步在框架的至少氨基酸位置49、71與73上包含供體抗體殘基。在一個實施方式中，在Vh中，人重鏈亞群m的以下FR位置被取代FR2中的AlaH49Gly;FR3中的ArgH71Val與AsnH73Lys。在其它實施方式中，人源化抗體的CDR區(qū)域更進一步包含氨基酸取代，其中殘基既不來自供體抗體也不來自受體抗體。前述實施方式的抗體可以包含v16的SEQIDNO8的Vh序列，如圖1B所示。在前面的更進一步的實施方式中，抗體更進一步包含v16的SEQIDN02的Vl序列，如圖1A所示。在其它實施方式中，人源化抗體是2H7.v31,具有SEQIDNO.21與23的輕與重鏈氨基酸序列，分別如圖6與圖8所示；具有如圖8所示SEQIDNO.23的重鏈氨基酸序列的2H7.v31;具有v16的H鏈的D56A與N100A與L鏈的S92A的氨基酸取代的2H7.v96。在分開的實施方式中，任何前述實施方式中的抗體更進一步包含在Fc區(qū)域中的至少一個氨基酸取代，該取代與衍生它的原始或者親本抗體相比改善了ADCC和/或CDC活性，在大多數場合下被比較的親本抗體是v.16,在其它情況下是Rituxan。具有改善活性的一個象這樣的抗體在Fc區(qū)域包含S298A/E333A/K334A的三重丙氨酸取代。具有S298A/E333A/K334A取代的一個抗體是具有SEQIDNO.23的重鏈氨基酸序列的2H7.v31。同Rituxan比較起來抗體2H7.vl14與2H7.vl15顯示ADCC活性改善至少10倍。在另一個實施方式中，抗體更進一步包含在Fc區(qū)域的至少一個氨基酸取代，該取代同衍生它的親本抗體比較起來CDC活性降低，衍生它的親本抗體在大多數情況下是v16。同v16比較起來CDC活性降低的一個象這樣的抗體包含在H鏈中的至少K322A取代。ADCC與CDC活性的比較可以如實施例中所描述的進行分析。在一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的抗體是全長抗體，其中Vh區(qū)域連接至人IgG重鏈恒定區(qū)。在優(yōu)選實施方式中，IgG是人IgGl或者IgG3。在一個實施方式中，CD20結合抗體結合至細胞毒性劑。在優(yōu)選實施方式中，該細胞毒性劑是毒素或者放射性同位素。在一個實施方式中，本發(fā)明的用于治療或者診斷用途的抗體在CHO細胞中產生。還提供一種組合物，該組合物包含前述實施方式中的任何一個的抗體，以及載體。在一個實施方式中，載體是藥學上可以接受的載體。這些組合物可以以制品或者試劑盒提供。本發(fā)明也提供液體制劑，包含20mg/mL抗體的人源化2H7抗體，10mM石克酸組氨酸pH5.8,60mg/mL蔗糖(6%),0.2mg/mL聚山梨酸酯20(0.02°/。)。本發(fā)明也提供分離的核酸，該核酸編碼在此所披露的抗體中的任何一種，包括表達抗體的表達載體。本發(fā)明的另一個方面是包含前述核酸的宿主細胞與產生該抗體的宿主細胞。在后者的一個優(yōu)選實施方案中，宿主細胞是CHO細胞。提供了產生這些抗體的方法，該方法包含培養(yǎng)產生抗體的宿主細胞，并且從細胞培養(yǎng)物中回收抗體。本發(fā)明的另一方面是一種制品，包括一個容器與包含在其中的組合物，其中組合物包含前述實施方式中的任何一個的抗體。為用來治療NHL,該制品更進一步包含包裝說明書，指示該組合物被用來治療非何杰金氏淋巴瘤。本發(fā)明的更進一步的方面是體內在B細胞中誘發(fā)程序性細胞死亡的方法，包含將B細胞與前述中的任何的抗體接觸，從而殺死B細胞。本發(fā)明也提供治療在此所披露的疾病的方法，該方法通過將CD20結合抗體或者其功能性片段給藥哺乳動物，例如患該疾病的人類病人，而治療該疾病。在任何治療自身免疫病或者CD20陽性癌癥的方法中，在一個實施方式中，抗體是2H7.vl6,分別具有SEQIDNO.21與22的輕與重《連氨基酸序列，如圖6與圖7所示。因此，一個實施方式是治療CD20陽性癌癥的方法，包含給予患該癌癥的病人治療有效量的本發(fā)明的人源化CD20結合抗體。在優(yōu)選實施方式中，CD20陽性癌癥是B細胞淋巴瘤或者白血病包括非何杰金氏淋巴瘤(NHL)或者淋巴細胞占優(yōu)勢的何杰金氏病(LPHD)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)或者SLL。在治療B細胞淋巴瘤或者白血病的方法的實施方式中，抗體以劑量范圍大約275-375mg/i^給藥。在其它的實施方式中，治療方法更進一步包含給予病人至少一種化療劑，在其中對于非何杰金氏淋巴瘤(NHL)而言，化療劑選自由阿霉素、環(huán)^疇酰胺、長春新石威與氫化潑尼+》(prednisolone)組成的組。也提供治療自身免疫病的方法，包含給予病人治療有效量的前述權利要求中任何一個的人源化CD20結合抗體，該病人患有自身免疫病。自身免疫病選自由下列組成的組類風濕性關節(jié)炎、青少年類風濕性關節(jié)炎、系統性紅斑狼瘡(SLE)、韋格內氏病(Wegener，sdisease)、炎癥性腸病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板減少、多發(fā)性硬化、牛皮癬、IgA腎病、IgM多神經病、重癥肌無力、血管炎、糖尿病、雷諾氏征(Reynaud，ssyndrome)、斯耶格侖氏綜合癥(sjorgen，ssyndrome)與腎小球腎炎。當自身免疫病是類風濕性關節(jié)炎時，抗體可以與第二治療劑聯合給藥，該第二治療劑優(yōu)選地是氨曱喋呤。在這些治療方法中，CD20結合抗體可以單獨或者與第二治療劑結合給藥，第二治療劑例如第二抗體、或者化療劑或免疫抑制劑。第二抗體可以是結合CD20或者不同B細胞抗原、或者NK或T細胞抗原的抗體。在一個實施方式中，第二抗體是放射性同位素標記的抗CD20抗體。在其它實施方式中，CD20結合抗體偶聯至細胞毒性劑，包括毒素或者放射性同位素。在另一方面，本發(fā)明提供治療自身免疫病的方法，自身免疫病選自由皮肌炎(Dermatomyositis)、韋格內氏肉芽腫病、ANCA、再生障礙性貧血、自身免疫性溶血性貧血(AIHA)、凝血因子vni缺乏、曱型血友病、自身免疫性中性白細胞減少、Castleman's綜合癥、古德帕斯徹氏綜合癥(Goodpasture'ssyndrome)、實體器官移植排斥、移植物抗宿主疾病(GVhD)、IgM介導的神經病、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、橋本氏曱狀腺炎(Hashimoto'sThyroiditis)、自身免疫性肝炎、淋巴組織間質肺炎(HIV)、閉塞NSIP)、格-巴二氏綜合癥(Guillain-Barresyndrome)、大血管血管炎、巨細月包(高安氏)動脈炎(giantcell(Takayasu，s)ateritis)、中等血管血管炎(mediumvesselvasculitis)、川崎病(Kawasaki，sDisease)、結節(jié)性多動脈炎(polyateritisnodosa),包含給予患該疾病的患者治療有效量的CD20結合抗體。在該方法的一個實施方式中，CD20結合抗體是Rituxan。本發(fā)明還提供分離的核酸，包含獼猴(Cynomolgusmonkey)CD20的SEQIDNO.:24的核苦酸序列(如圖19所示)，或該序列的簡并變體。一個實施方式是分離的核酸，包含一序列，該序列編碼具有SEQIDNO.25(如圖20所示)的氨基酸序列的多肽，或具有保守性氨基酸取代的SEQIDNO.25(圖20)。另一個實施方式是包含前述核酸的載體，包括用來在宿主細胞表達的表達載體。也包括包含該載體的宿主細胞。還提供分離的多肽，該多肽包含獼猴CD20的氨基酸序列(SEQIDNO.25;圖20)。本發(fā)明涉及1.一種與人CD20結合的人源化抗體或者其抗原結合片段，其中抗體對體內削減靈長類動物B細胞是有效的，該抗體在重鏈可變區(qū)(VH)至少包含來自抗人CD20抗體的SEQIDNO.12的CDR3序列、和人重鏈亞群III(VhIII)的基本上的人共有框架(FR)殘基。2.項1的抗體，所述抗體進一步包含SEQIDNO.10的重鏈CDR1序列和SEQIDNO.11的CDR2序列.3.項2的抗體，進一步包含SEQIDNO.4的輕鏈CDR1序列、SEQIDNO.5的CDR2序列、SEQIDNO.6的CDR3序列、和人輕鏈k亞群I(VkI)的基本上的人共有框架(FR)殘基。4.前述項的抗體，包含SEQIDNO.8的Vh序列(V16，如圖IB所示)。5.項4的抗體，進一步包含SEQIDN0.2的Vl序列(V16,如圖1A所示)。6.項3的抗體，其中VH區(qū)域連接至人IgG鏈恒定區(qū)。7.項6的抗體，其中人IgG是IgGl或lgG3。8.項1的抗體，其中抗體是具有分別為SEQIDNO.21和22的輕鏈與重鏈氨基酸序列的2H7.vl6。9.項1的抗體，其中抗體是具有分別為SEQIDNO.21和23的輕鏈與重鏈氨基酸序列的2H7.v31。10.項5的抗體，但是具有重鏈中D56A和N100A、以及輕鏈中S92A的氨基酸取代(v.96)。11.前述項中任一項的抗體，進一步包含在Fc區(qū)域中的至少一個氨基酸取代，所述取代增進ADCC和/或CDC活性。12.項11的抗體，其中氨基酸取代是S298A/E333A/K334A。13.項12的抗體，其中抗體是具有SEQIDNO.23的重鏈氨基酸序列的2H7.v31(如圖8所示)。14.項1-10中任一項的抗體，進一步包含在Fc區(qū)域中的至少一個氨基酸取代，所述取代降低CDC活性。15.項14的抗體，至少包含取代K322A。16.項1-10任一項的抗體，其中抗體是2H7.v114或2H7.vl15,所述抗體同Rituxan比較ADCC活性改善至少10倍。17.項1的抗體，其中靈長類動物B細胞來自于人類和獼猴。18.前述項中任一項的抗體，該抗體偶聯至細胞毒藥劑。19.項18的抗體，其中細胞毒藥劑是放射性同位素或毒素。20.前述項中任一項的抗體，所述抗體在CHO細胞中產生。21，一種分離的核酸，其編碼前述項中任一項的抗體。22.—種表達載體，其編碼前述項中任一項的抗體。23.—種宿主細胞，其包含項21的核酸。24.項23的宿主細胞，所述宿主細胞產生前述項中任一項的抗體。25.項24的宿主細胞，所述宿主細胞是CHO細胞。26.生產前述項中任一項的抗體的方法，包含培養(yǎng)生產項24的抗體的細月包，并從細胞培養(yǎng)物中回收抗體。27.—種組合物，包含項1的抗體和載體。28.項27的組合物，其中抗體是2H7.vl6，并且載體是藥學上可接受的載體。29.—種制品，包含一種容器和包含在其中的組合物，其中該組合物包含前述項中任一項的抗體。30.項29的制品，進一步包含包裝說明書，所述包裝說明書指示該組合物可用于治療非何杰金氏淋巴瘤。31.—種體內在B細胞中誘導程序性細胞死亡的方法，包含將B細胞與前述項中任一項的抗體接觸，從而殺死B纟田胞。32.—種治療CD20陽性癌癥的方法，包含給予患該癌癥的病人治療有效量的前述項中任一項的人源化CD20結合抗體。33.項32的方法，其中CD20陽性癌癥是B細胞淋巴瘤或白血病。34.項33的方法，其中CD20陽性癌癥是非何杰金氏淋巴瘤(NHL)或淋巴細胞占優(yōu)勢的何杰金氏病(LPHD)。35.項32的方法，其中癌癥是慢性淋巴細胞性白血病或SLL。36.項34或35的方法，其中抗體選自2H7.vl6、v31.v96、vll4或v115，所述抗體具有附圖和表中所示的各自氨基酸序列。37.項34或35的抗體，其中抗體是具有分別為圖6和圖7所示SEQIDNO.21和22的輕鏈與重鏈氨基酸序列的2H7.vl6。38.項33的方法，其中抗體以大約275-375mg/m2的劑量范圍給藥。39.項32的方法，進一步包含給予病人至少一種化療劑。40.項39的方法，其中癌癥是非何杰金氏淋巴瘤(NHL),并且化療劑選自阿霉素、環(huán)磷酰胺、長春新堿或氫化潑尼松。41.一種治療自身免疫病的方法，包含給予患該自身免疫病的病人治療有效量的前述項中任何一項的人源化CD20結合抗體。42.項41的方法，其中該自身免疫病選自由下列疾病組成的組類風濕性關節(jié)炎、青少年類風濕性關節(jié)炎、系統性紅斑狼瘡(SLE)、韋格內氏病、炎癥性腸病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板減少、多發(fā)性硬化、牛皮癬、IgA腎病、IgM多神經病、重癥肌無力、血管炎、糖尿病、雷諾氏癥、斯耶格侖氏綜合癥與腎小球腎炎。43.項42的方法，其中自身免疫病是類風濕性關節(jié)炎。44.項43的方法，進一步包含給予病人第二種治療劑。45.項44的方法，其中第二種治療劑是免疫抑制劑。46.項45的方法，其中免疫抑制劑是氨曱喋呤。47.—種治療選自由下列組成的組中的自身免疫病的方法，包含給予患該疾病的患者治療有效量的CD20結合抗體或其功能性片段皮肌炎、韋格內氏肉芽腫病、ANCA(包括在血管炎下的)、再生障礙性貧血、自身免疫性溶血性貧血(AIHA)、凝血因子VIII缺乏、曱型血友病、自身免疫性中性白細胞減少、Castleman氏綜合癥、古德帕斯徹氏綜合癥、實體器官移植排斥、移植物抗宿主疾病(GVhD)、IgM介導的血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、橋本氏曱狀腺炎、自身免疫性肝炎、淋巴間質肺炎(HIV)、閉塞性細支氣管炎(非移植)對應的NSIP、格-巴二氏綜合癥、大血管血管炎、巨細胞(高安氏)動脈炎、中等血管血管炎、川崎病和結節(jié)性多動脈炎。48.項47的方法，其中CD20結合抗體是Rituxan。49.一種分離的核酸，所述核酸包含獼猴CD20的SEQIDNO.:24的核苦酸序列(如圖19所示)，或這一序列的簡并性變體。50.—種分離的核酸，所述核酸包含編碼具有SEQIDN0.25(如圖20所示)、或帶有保守氨基酸取代的SEQIDNO.25(如圖20所示)的氨基酸序列的多肽。51.—種載體，包含項50的核酸。52.項51的載體，其為表達載體，所述表達載體包含與表達調控序列可操作連接的項49的核酸。53.—種宿主細胞，包含項50的核酸。54.—種分離的多肽，包含獼猴CD20的SEQIDNO.25的氨基酸序列(如圖20所示)。55.—種液體制劑，包含20mg/mL的人源化2H7抗體、10mM組氨酸硫酸酯pH5.8、60mg/mL蔗糖、0.2mg/mL聚山梨酸酯20。圖1A是序列比對，比較小鼠2H7(SEQIDNO.1)、人源化2H7.vl—6變體(SEQIDNO,2)、和人k輕鏈亞群I(SEQIDNO.3)中每一個的輕鏈可變結構域(Vl)的氛基酸序列。2H7和hu2H7.v16的VL的CDR如下CDR1(SEQIDN0.4)、CDR2(SEQIDNO,5)、與CDR3(SEQIDNO.6)。圖1B是序列比對，比較如下來源的vh序列鼠2H7(SEQIDNO,7)、人源化2H7.vl6變體(SEQIDN0.8)、和重鏈亞群III的人共有序列(SEQIDN0.9)。2H7和hu2H7.v16的VH的CDR如下CDRl(SEQIDNO.IO)、CDR2(SEQIDN0.11)、與CDR3(SEQIDNO.12)。在圖1A與圖1B中，每一鏈的CDR1、CDR2與CDR3用括號圍起來，其兩側為框架區(qū)FR1-FR4,如圖中所指示。2H7指鼠2H7抗體。兩行序列之間的星號表示在兩序列之間不同的位置。殘基編號#^居Kabatetal.,SequencesofImmunologicalInterest.5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，Md.(1991),4翁入物用a、b、c、d、與e表示。圖2A-E顯示用來構建2H7Fab質粒的噬菌粒pVX4的序列(SEQIDN0.13)以及CDR移植的抗IFN-oc人源化抗體的Fab的輕鏈(SEQIDNO.14)與重鏈(SEQIDNO.15)的氨基酸序列。圖3A-E顯示編碼嵌合2H7.v6.8Fab的表達質粒的序列(SEQIDNO.16)。顯示輕鏈(SEQIDNO.17)與重鏈(SEQIDNO.18)的氨基酸序列。圖4A-B顯示如實施例1中所描述的用于表達免疫球蛋白輕鏈的質粒pDRl的序列(SEQIDN019;5391bp)。pDRl包含編碼一無關抗體、人源化抗CD3抗體的輕鏈(Shalabyetal.，J.Exp.Med.175:217-225(1992))的序列,其起始和終止密碼子以粗體和下劃線指示。圖5A-B顯示如實施例1中描寫的用于表達免疫球蛋白重鏈的質粒pDR2的序列(SEQIDNO.20;6135bp)。pDR2包含一編碼無關抗體、人源化抗CD3抗體的重鏈的序列(Shalabyetal.，上文)，其起始和終止密碼子以粗體與下劃線指示。圖6顯示2H7.vl6完整輕鏈的氨基酸序列(SEQIDN0.21)。DIQ以前的前19個氨基酸是在成熟多肽鏈中不存在的分泌性信號序列。圖7顯示2H7.vl6完整重鏈的氨基酸序列(SEQIDN0.22)。EVQ以前的前19個氨基酸是在成熟多肽鏈中不存在的分泌性信號序列。將圖1B的VH序列(SEQIDNO.8)與完整重鏈序列比對，人yl恒定區(qū)來自于SEQIDNO.22中的氨基酸位置114-471。圖8顯示2H7.v31完整重鏈的氨基酸序列(SEQIDN0.23)。EVQ以前的前19個氨基酸是在成熟多肽鏈中不存在的分泌性信號序列。輕鏈與2H7.vl6相同(參見圖6)。圖9顯示如實施例中所描述的2H7.vl6與2H7.v73IgG變體的相對穩(wěn)定性。分析結果校正至孵育前數值，以孵育后的剩余百分比報告。圖10是一流程圖，總結從鼠2H7至直到v75的人源化型式的亞群的氨基酸改變。圖11是在所有組(結合2H7研究與Rituxan研究)中平均絕對B細胞計數[CD3-/CD40+]的總結，如實施例IO中所描述。圖12顯示如在實施例11中所描述的在巖藻糖缺陷的2H7變體上代表性ADCC試-瞼的結果。圖13顯示將膜聯蛋白V染色以抗體濃度的函數作圖的結果。在交聯第二抗體存在下，將Ramos細胞用無關IgGl對照抗體(Herceptin;圓形)、Rituximab(方形)、或者rhuMAb2H7.vl6(三角形)處理，用FACS分析。圖13-15在實施例13中加以描述。圖14顯示膜聯蛋白V與碘丙錠雙染色作為抗體濃度的函數作圖的結果。在交聯第二抗體存在下，將Ramos細胞用無關IgGl對照抗體(Herc印tin⑧;圓形)、Rituximab(方形)、或者rhuMAb2H7.vl6(三角形)處理，用FACS分析。圖15顯示活的、未染色細胞計數(每IO個)作為抗體濃度的函數作圖。在交聯第二抗體存在下，將Ramos細胞用無關IgGl對照抗體(Herceptin⑧；圓形)、Rituximab(方形)、或者rhuMAb2H7.vl6(三角形)處理，用FACS分析。圖16、17、18顯示如實施例14中所描述的在棵鼠中對Raji細胞腫瘤生長的抑制。動物用PBS(對照)或者用Rituxan⑧或rhuMAb2H7.vl6以5mg/kg(圖16)、0.5mg/kg(圖17)、或者0.05mg/kg(圖18)每周處理(如垂直箭頭指示的；11=8只小鼠每組)，共6周。圖19顯示如實施例15中所描述的獼猴CD20的核苷酸(SEQIDNO.24)與氨基酸(SEQIDNO.25)序列。圖20顯示獼猴CD20的氨基酸序列(SEQIDN0.25)。與人CD20不同的殘基有下劃線，人殘基(SEQIDNO.26)直接在猴殘基下標示。猴CD20的推定胞外結構域以黑體字表示。圖21顯示如在實施例15中所描述的，表達CD20的獼猴細胞與hu2H7.v16、.v31與Rituxan的結合。分析抗體結合獼猴CD20并且取代FITC偶聯的鼠2H7與獼猴CD20結合的能力。圖22顯示類風濕性關節(jié)炎臨床試驗階段I/II劑量漸增的方案。圖23顯示在CHO細胞中表達2H7.v16的載體。優(yōu)選實施方案的詳細說明"CD20"抗原是一非糖基化的跨膜磷蛋白，具有分子量大約35kD，在來自外周血或淋巴器官的超過90%的B細胞的表面上發(fā)現。CD20在早期前B細胞發(fā)育期間表達，并且保持直到漿細胞分化。其在人干細胞、淋巴祖先細胞或者正常漿細胞上沒有發(fā)現。CD20在正常B細胞以及惡性B細胞上存在。在文獻中CD20的其它名字包括"B淋巴細胞限制的分化抗原"和"Bp35"。CD20抗原在例如Clark與Ledbetter,Adv.Can.Res.52:81-149(1989)與Valentineetal.J.Biol.Chem.264(19):11282-112871989)中描述。術語"抗體"以最寬泛的意義使用，并且特別地涵蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、與抗體片段，只要它們顯示出所需的生物活性或功能?？贵w與人CD20的結合，更優(yōu)選與人及其它靈長類動物(包括獼猴、恒河猴、黑猩猩)CD20結合。抗體將以不高于lxl(T8的Kd值結合CD20,優(yōu)選地Kd值不高于大約lxl(T9,并且能體內殺死或消減B細胞，優(yōu)選地當與合適的負對照比較時殺死或者消減至少20%,所述負對照未用這樣的抗體處理。B細胞消減可以是ADCC、CDC、細胞程序死亡或者其它沖幾制中一個或多個的結果。在這里的疾病治療的一些實施方式中，特定的效應子功能或者機制與其它相比可能更需要，并且人源化2H7的某些變體對取得生物學功能例如ADCC是優(yōu)選的。"抗體片段"包含全長抗體的一部分，通常是其抗原結合或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2、與Fv片段；雙抗體；線狀抗體(linearantibody);單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。"Fv"是包含完全抗原識別與結合部位的最小抗體片段。這個片段由一個重鏈與一個輕鏈可變區(qū)結構域以緊密、非共價聯合而形成的二聚物組成。這兩個結構域的折疊產生六個高變環(huán)(重鏈與輕鏈各三個環(huán))，提供抗原結合的氨基酸殘基并且賦予抗體抗原結合特異性。然而，即使單個的可變結構域(或者僅僅包含特定于抗原的三個CDR的Fv的一半)具有識別與結合抗原的能力，雖然親合力比整個結合部位低。術語"單克隆抗體"如在這里所使用的指獲得自實質上均一的抗體群體的抗體，即構成該群體的單獨抗體除了那些可能少量存在的自然發(fā)生的突變之外是同一的。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一抗原位點。此外，與常規(guī)的(多克隆)抗體制備相反——所述常規(guī)抗體一般包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體——每個單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。修飾語"單克隆"指示抗體的特性為獲得自實質上均一群體的抗體，不允許被解釋為要求經過任何特定的方法生產抗體。例如，依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可能是通過Kohleretal.，Nature256:495(1975)首次描述的雜交瘤方法生產，或可通過重組DNA方法生產(參見，例如，美國專利號4,816,567)。利用例如在Clacksonetal,,Nature352:624-628(199l)與Marksetal.，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技術，"單克隆抗體"也可以^^噬菌體抗體文庫中分離。本發(fā)明的CD20結合抗體的"功能性片段"是這樣一些片段，其保有與其所衍生的完整全長分子相比實質上相同的親合力結合CD20的能力，并且在經過例如在這里所描述的體外或體內分析而進行的測量中顯示生物活性，包括消減B細胞。術語"可變"指這一事實，即可變結構域的某些片段在抗體序列中存在廣泛差別。V結構域介導抗原結合，并且定義特定的抗體對其特定抗原的特異性。然而，可變性在可變結構域的110個氨基酸跨度內不是均勻分布的。相反，可變區(qū)包括相對不變的幾段序列稱為框架區(qū)(FR)，為15-30氨基酸長，其間被極端可變的較短區(qū)域分開，稱為"高變區(qū)，，，每個9-12氨基酸長。天然重與輕鏈的可變結構域每個包含四個FR，基本上采取P片層構型，由三個高變區(qū)連接，高變區(qū)形成連接環(huán)，并且有時候形成P片層結構的一部分。每個鏈的高變區(qū)由FR十分接近地維系在一起，并且與另一鏈的高變區(qū)一起參與抗體的抗原結合部位的形成(參見Kabatetal.，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth，Bethesda,MD.1991))。恒定結構域不直接涉及抗體與抗原的結合，但是顯示出各種效應子功能，例如在抗體參與抗體依賴細胞細胞毒性(ADCC)中。術語"高變區(qū)"當在這里使用時指抗體負責抗原結合的氨基酸殘基。高變區(qū)通常包括來自"補體決定區(qū)"或"CDR"(例如VL中大約殘基24-34(Ll)、50-56(L2)與89-97(L3)周圍，與VH中大約31-35B(H1)、50-65(H2)與95-102(H3)周圍(Kabatetal,，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd-PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991))),和/或來自"高變環(huán)，，的殘基(例如Vl中殘基26-32(L1)、50-52(L2)與91-96(L3)，與Vh中26-32(Hl)、52A-55(H2)與96-101(H3)(Chothia與Lesk,J.Mol.Biol,196:901-917(1987))。如在此所提到的，"共有序列"或者共有V結構域序列是人工序列，源自對已知人免疫球蛋白可變區(qū)序列的氨基酸序列的比較?；谶@些比較，制備編碼V結構域氨基酸的重組核酸序列，該序列對于源自人和人H鏈亞群IIIV結構域的序列是共有的。該共有V序列沒有任何已知抗體結合特異性或親合力。"嵌合抗體"(免疫球蛋白)重和/或輕鏈的一部分與來源于特定的物種或者屬于特定的抗體種類或者亞類的抗體的相應序列相同或同源，而鏈的其余部分與來源于另一個物種或者屬于另一個抗體種類或者亞類的抗體的相應序列相同或同源，只要它們顯示出該所需生物活性(美國專利號4,816,567;與Morrisonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。在此所使用的人源化抗體是嵌合抗體的亞群。非人(例如，鼠的)抗體的"人源化"形式是嵌合抗體，其包含來源于非人免疫球蛋白的最小序列。在極大程度上，人源化抗體是人免疫球蛋白(受者或受體抗體)，其中受者的高變區(qū)殘基被來自非人物種(供體抗體)例如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物的高變區(qū)殘基替代，該高變區(qū)殘基具有所需的特異性、親合力和能力。在有些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基被相應的非人殘基替代。此外，人源化抗體可以包含受者抗體或供體抗體中沒有發(fā)現的殘基。這些修飾被用來更進一步地改善抗體性能例如結合親合力。一般地，人源化抗體將基本上包含所有至少一個、并且典型地兩個可變結構域，其中相當于非人免疫球蛋白的高變環(huán)的所有或者基本上所有高變環(huán)、以及所有或者基本上所有FR區(qū)域是人免疫球蛋白序列的，雖然FR區(qū)域可以包括改善結合親合力的一或多個氨基酸取代。在FR中的這些氨基酸取代的數目在重鏈中典型地不超過6個，在輕鏈中不超過3個。人源化抗體任意地也包括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫5求蛋白恒定區(qū)的至少一部分。詳細內容參見Jonesetal.，Nature321:522-525(1986);Reichmannetal.,Nature332:323-329(1988);與Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)?？贵w"效應子功能"指可歸因于抗體Fc區(qū)域(天然序列Fc區(qū)域或者氨基酸序列變體Fc區(qū)域)的那些生物活性，并且隨抗體同種型而變化?？贵w效應子功能的例子包括Clq結合與補體依賴的細胞毒；Fc受體結合；抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC);吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)的下調；與B細胞活化。"抗體依賴的細胞介導的細胞毒性"或"ADCC"指一種細胞毒性形式，其中與存在于某些細胞毒細胞(例如自然殺傷(NK)細胞、嗜中性白細胞與巨噬細胞)上的Fc受體結合的分泌Ig使得這些細胞毒效應細胞特定地與攜帶抗原的靶細胞結合，并且接著用細胞毒素殺死該靶細胞?？贵w"武裝，，細胞毒細胞，并且對這樣的殺傷是絕對需要的。介導ADCC的主要細胞^NK細胞一僅僅表達FcyRin,而單核細胞表達FcyRI、FcyRII與FcyRIII。在造血細胞上的FcR表達在Ravetch與Kinet，Annu.Rev.Immunol9:457-92(199l)第464頁表3中概括。為評估目的分子的ADCC活性，可進行體外ADCC試驗，例如在美國專利號5，500，362或5，821,337中描述的。對這樣的試驗有用的地，目的分子的ADCC活性可以體內評估，例如，在例如Clynesetal.PNAS(USA)95:652-656(1998)中所披露的動物模型中。"Fc受體"或者"FcR"描述與抗體Fc區(qū)域結合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。此外，優(yōu)選的FcR是結合IgG抗體的FcR(—個y受體)，并且包括FcyRI、FcyRII、與FcyRIII亞類的受體，包括等位基因變體和這些受體的不同拼接形式。FcyRII受體包括FcyRIIA("激活受體")與FcyRIIB("抑制受體")，其具有類似氨基酸序列，該氨基酸序列的主要不同在于其細胞質結構域。激活受體FcyRIIA在它的細胞質結構域包含免疫受體酪氨酸為基礎的激活基序(ITAM)。抑制受體FcyRIIB在它的細胞質結構域包含免疫受體酪氨酸為基礎的抑制基序(ITIM)。(參見綜述M.inDagron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997》。FcR在Ravetch與Kinet,A畫.Rev.Imm漏l9:457-92(1991);Capeletal.，I醒unomethods4:25-34(1994);與deHaasetal.J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中綜述。其它的FcR,包括那些將來要被鑒別的FcR，在此包括在術語"FcR，，內。該術語也包括新生兒受體FcRn,其負責將母體igG轉移給胎兒(Guyeretal.J.Immunol.117:587(1976)與Kimetal.,J.Immunol.24:249(1994))。WO00/42072(Presta)描述抗體變體，其具有改善的或者降低的與FcR結合能力。該專利出版物的內容在這里特別地引入作為參考。也參見，Shieldsetal.J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。"人效應細胞"是表達一或多個FcR并JU亍4吏效應子功能的白細月包。優(yōu)選地，細胞至少表達FcyRIII并且行使ADCC效應子功能。介導ADCC的人白細胞的例子包括外周血單核細胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞與中性粒細胞，以PBMC與自然殺傷細月包為優(yōu)選。效應細胞可能,人天然來源，例如從血中分離。"依賴于補體的細胞毒性"或"CDC"指補體存在下靶細胞的溶解。通過補體系統的第一組分(Clq)與合適亞類的抗體結合而啟動經典補體途徑的激活，所述抗體是與其相關抗原結合的。為評估補體激活，可進行CDC試驗，例3口如Gazzano-Santoroetal"丄Immunol.Methods202:163(1996)中4苗寫的。在美國專利號6，194,551B1與W099/51642中描述了多肽變體，具有改變的Fc區(qū)域氨基酸序列與增加或降低的Clq結合能力。那些專利出版物的內容在此特別地引入作為參考。也參見Idusogieetal.J.Immunol.164:4178-4184(2000)。IgG中N-糖基化位點在CH2結構域的Asn297。本發(fā)明也提供CD20結合的、人源化抗體組合物，該抗體具有fc區(qū)域，其中組合物中抗體的大約80-100%(并且優(yōu)選地大約90-99%)包含成熟核心糖結構，該糖結構缺乏巖藻糖，附著于糖蛋白的Fc區(qū)域。象這樣的組合物在此被證明顯示出在與Fc丫RIIIA(F158)結合上的驚人改善，該結合不如FcyRHIA(V158)與人IgG相互作用有效。因此，在這里的組合物預計優(yōu)于以前描述的抗CD20抗體組合物，特別是對于治療表達FcyRinA(F158)的病人而言。在正常、健康的非洲裔美國人與白種人中，FcyRIIIA(F158)比FcyRinA(V158)更常見。參見Lehmbecheretal.Blood94:4220(1999)。本申請更進一步顯示FcyRIII結合和/或ADCC功能的協同增加，該協同增加源自在此的糖基化作用變異與糖蛋白Fc區(qū)域的氨基酸序列修飾的聯合。"分離的"抗體是已經從它的自然環(huán)境的組分中鑒別與分離和/或回收的抗體。其自然環(huán)境的污染物組分是將干擾抗體的診斷或治療使用的物質，并且可包括酶、激素及其它蛋白的或者非蛋白的溶解物。在優(yōu)選實施方式中，抗體將被純化至(l)如經過Lowry方法確定的，按重量計算大于抗體的95%,并且最優(yōu)選按重量計算超過99%，(2)足夠獲得通過利用轉杯測序儀(spinningcups叫uenator)N末端或者內部氨基酸序列的至少15個殘基的程SDS-PAGE下達到均一。分離的抗體包括在重組細胞內部的原位抗體，因為抗體自然環(huán)境中的至少一個組分將不存在。然而，一般地，分離的抗體將通過至少一個純化步驟制備。"分離的"核酸分子是從至少一個污染物核酸分子中鑒別與分離的核酸分子，在抗體核酸的天然來源中其一般地與該污染物核酸分子有聯系。分離的核酸分子在其形式或環(huán)境上與其在自然界中發(fā)現時不同。分離的核酸分子因此不同于其在自然細胞中存在的核酸分子。然而，分離的核酸分子包括在通常表達抗體的細胞中加以包含的核酸分子，在該細胞中例如核酸分子位于與自然細胞不同的染色體位置上。表示法"控制序列"指在一特定宿主有機體中表達可操作連接的編碼序列所需的DNA序列。適于原核生物的控制序列例如包括啟動子，任選操縱子序列，以及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號與增強子。當核酸被置于與另一核酸序列的功能性關系時其是"可操作連接的"。例如，如果前序列或分泌性前導序列的DNA作為參與多肽分泌的前蛋白質加以表達，其與多肽的DNA是可操作連接的。如果啟動子或者增強子影響序列的轉錄，其與編碼序列是可操作地連接的。或如果核糖體結合位點被置于促進翻譯的位置，則其與編碼序列是可操作地連接的。一般地，"可操作地連接，，指被連接的DNA序列是鄰近的，并且在分泌性前導序列的情況下，是鄰近的和在閱讀狀態(tài)下。然而，增強子不必是鄰近的。連接通過在適宜限制性位點的連接而完成。如果這樣的位點不存在，根據通常的做法使用合成寡核苷酸連接物或接頭。"載體"包括穿梭與表達載體。典型地，質粒構建物包括復制起始點(例如ColEl復制起始點)與選擇性標記(例如氨千青霉素或四環(huán)素抗性)，分別用于質粒在細菌中的復制與選擇。"表達載體"指一種載體，其包含在細菌或真核細胞中表達本發(fā)明的抗體、包括抗體片段所需的控制序列或調控元件。合適的載體在下面披露。產生本發(fā)明的人源化CD20結合抗體的細胞包括細菌與真核宿主細胞，其中已經引入編碼抗體的核酸。合適的宿主細胞在下面披露。用詞"標記"當在這里使用時指可檢測的化合物或組合物，其直接或間接地與抗體接合。標記可本身是可檢測的(例如放射性同位素標記或熒光的標記)或者，在酶促標記的情況下，可以催化可檢測的底物化合物或組合物的化學改變。"自身免疫病，，在此是來自并針對個體自身(自己的)抗原和/或組織的非惡性疾病或紊亂。如同在這里使用的，"B細胞消減"指在藥物或者抗體處理之后同像這樣的處理以前的水平比較起來在動物或者人中B細胞水平的減少。利用眾所周知的試驗，例如在實驗實施例中描述的試驗，測量B細胞水平。B細胞消減可以完全的或者部分的。在一個實施方式中，表達CD20的B細胞消減至少25%。不受任何機制的限制，B細胞消減的可能機制包括ADCC、CDC、細胞程序死亡、鈣流的調制或者在前;^制中兩個或更多的組合。術語"細胞毒性劑"如同在此使用的指一種物質，該物質抑制或防礙細胞功能和/或導致細胞破壞。術語意圖包括放射性同位素(例如I131、I125、Y9G與Re186)、化療劑和毒素例如細菌、真菌、植物或動物來源的酶促活性毒素或其片段。"化療劑"是在癌癥治療中有用的化合物?；焺嵗ㄍ榛瘎绡幪孢?thiotepa);環(huán)膦酰胺(cyclosphamide)(CYTOXANTM);烷基磺酸酯如白消安(busulfan),英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙咬如節(jié)替p底(benzodopa),卡波醌(carboquone)，美妥替派(meturedopa)和尿烷亞胺(uredopa);氮丙咬和methylamelamine包括六曱蜜胺(altretamine),三乙撐蜜胺(triethylenemelamine),三亞乙基磷酰胺，三亞乙基硫代磷酰胺和三羥曱基蜜胺(trimethylolomelamine);氮芥(nitrogenmustards)i口苯丁酸氮芥,萘氮芥,月旦石粦酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，異環(huán)石舞酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，鹽酉交氧氮芥；左》走苯丙氨酸氮芥(melphalan),*斤氮芥(novembichin)，膽甾醇苯乙酸氮芥，松龍苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧咬氮芥；亞硝基脲(nitrosureas)如亞硝基脲氮芥(carmustine),氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine),〉各莫司汀(lomustine),尼莫司汀(nimustine),雷莫司汀(ranimustine);抗生素如阿克拉霉素，放線菌素，authramycin，重氮絲氨酸，博來霉素，放線菌素C(cactinomycin),力口利車霧素(calicheamicin)，carabicin,洋紅審素，嗜癌素(carzinophilin),色霉素(chromomycin)，放線菌素D,道諾紅菌素(daunorubicin),地托比星(detorubicin)，6-重氮-S-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin,Adriamycin),表阿霉素(epirubicin),依索比星(esorubicin)，伊達比星(idarubicin)，發(fā)波霉素(marcellomycin),絲裂霉素，霉酚酸，諾加霉素(nogalamycin),揪欖霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin,噪呤霉素，三鐵阿霉素(quelamycin)，羅多比星(rodorubicin)，鏈黑菌素；鏈脲霉素(streptozocin)，殺結核菌素，烏苯美司(ubenimex),凈司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubidn);抗代謝藥如氨曱蝶呤，5-氟尿嘧咬(5-FU);葉酸類似物如二甲葉酸(denopterin)，氨甲蝶呤，丁蝶翼素(pteropterin)，三曱曲沙(trimetrexate);噪p令類4以物氟達才立濱(fludarabine),6-巰基噤呤，硫咪噪呤，硫鳥噪呤；嘧啶類似物如安西他濱(ancitabine),阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿香，卡莫氟(carmofur),阿糖胞苷，雙脫氧尿苷，多西氟尿啶，依諾他濱(enocitabine),氟尿苷，5-FU;雄激素類如二曱睪酮，丙酸曱雄烷酉同(dromostanolongpropionate),環(huán)石危名,醇(epitiostanol)，美力,氨(mepitiostane)，睪內酉旨(testolactone);抗腎上腺類如氨魯米特(aminoglutethimide)，鄰氯苯對氯苯二氯乙烷(mitotane),曲洛司坦(trilostane);葉酸才卜充劑i口frolinicacid;醋葡內面旨；趁石辟耽胺#唐苦(aldophosphamideglycoside);氛基乙酰丙酸(aminolevulinicacid);安吖咬(amsacrine);bestrabucil;t匕生群(biasntrene);依達曲沙、(edatraxate);石岸氨氮芥(defofamine);秋水仙胺；地吖醌(diaziquone);依洛尼塞(elfornithine);醋酸羥吡呼唑(elliptiniumacetate);依托格魯(etoglucid);硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan);氯尼達明(lonidamine);米4乇胍月宗(mitoguazone);米4乇蒽醌(mitoxantrone);莫派達醇(mopidamol);二胺硝吖咬(nitracrine);噴司他丁(pintostatin);phenamet;p比柔比星(pirarubicin);鬼臼杉于酸(podophyllinicacid);2畫乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine);PSK;雷佐生(mzoxane);西索菲蘭(sizofiran);鍺螺胺(spirogermanium);細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2'，2"-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine);烏拉坦(urethan);長春堿酰胺；達卡巴噢(dacarbazine);甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛(wèi)矛醇；溴丙p底n秦(pipobroman);gacytosine;阿^立伯4唐苷("Ara-C");塞^,艱(thiotepa);紫杉烷(taxoid),如紫杉醇(TAXOL⑧，Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,NJ)和doxetaxel(TAXOTERE,Rhone-PoulencRorer，Antony,France);苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine);6-硫代烏噪呤；巰基噪呤；氨曱蝶呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑；柏；鬼臼乙叉甙(etoposide)(VP-16);異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C;米托蒽醌；長春新堿；長春花堿；長春瑞賓(vinorelbine);#斤霉酰氨(navelbine);二，5基蒽西同(novantrone);尼泊戒(teniposide);柔紅霉素；氨基蝶呤；xeloda;伊拜膦酸鹽(ibandronate);CPT-11;拓樸異構酶抑制劑RFS2000;二氟曱基鳥氨酸(DMFO);維曱酸；esperamicins;capecitabine;以及上述寸壬^f可物質的可藥用鹽，酸或書t生物。此定義還包括能調節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素制劑，如抗雌激素制劑包括他莫昔芬(tamoxifen),雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制劑4(5)-咪唑，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene),keoxifene,LY117018,奧那司酉同(onapristone),和4乇瑞米芬(Fareston);和抗i#激素制劑如IU也氨(flutamide)，尼魯米特(nilutamide),bicalutamide，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);和上述任何物質的可藥用鹽，酸或書f生物。"治療，，或"處理，，或"緩和"既指治療性處理也指預防性或者預防性措施，其中目的是防止或減慢(減弱)所針對的病理情況或紊亂。如果個體根據本發(fā)明的方法接受治療量的本發(fā)明的CD20結合抗體后，顯示該特定疾病的一或多個體征和癥狀的可觀測的和/或可度量的減少，該個體#:成功地"治療，，CD20陽性癌癥或自身免疫病。例如，對于癌癥來說，癌細胞數目減少或者癌細胞消失；腫瘤體積減?。灰种?即在某種程度上減慢并且優(yōu)選地停止)腫瘤轉移；在某種程度上抑制腫瘤生長；延長癥狀緩解的時間，和/或在某種程度上減輕與該特定的癌癥有聯系的一個或多個癥狀；減低發(fā)病率與死亡率，與生命質量的改進等事宜。病人也可以感到疾病征候或癥狀的減低。治療可以取得完全響應，定義為所有癌癥跡象的消失，或者部分響應，其中腫瘤尺寸減小，優(yōu)選地超過50%,更優(yōu)選地超過75%。如果病人病情平穩(wěn)，也被認為是已治療的。在一優(yōu)選實施方式中，在一年之后癌癥病人的癌癥仍然沒有進展，優(yōu)選地在15個月之后。評估疾病成功治療與改善的這些參數通過為本領域醫(yī)師所熟悉的常規(guī)程序是容易度量的。"治療有效量"指在個體中有效"治療"疾病或紊亂的抗體或藥物的量。對于癌癥，藥物治療有效量可減少癌細胞的數量；減小腫瘤體積；抑制(即在一定程度上減慢并優(yōu)選停止)癌細胞對周圍器官的浸潤；抑制(即在一定程度上減慢到并優(yōu)選停止)腫瘤轉移；在一定程度上抑制腫瘤生長；和/或在一定程度上減輕與癌癥相關的一種或多種癥狀。參見前述對"治療"的定義。"慢性"給藥指以與急性方式相反的連續(xù)方式給藥所述藥劑，從而在更長的時間內維持最初的治療效果(活性)。"間歇性"給藥是并非不間斷地連續(xù)進行、而實際上是周期性的治療。本發(fā)明的方法與組合物本發(fā)明提供結合人CD20、并且優(yōu)選地也結合其它靈長類動物CD20的人源化抗體，包含一個重鏈，該重鏈包含非人物種抗人CD20抗體(供體抗體)的至少一個、優(yōu)選地兩個或者所有H鏈CDR，和作為受者抗體的人共有抗體的基本上所有框架殘基。供體抗體可以來自于各種的非人物種，包括小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、兔、馬、靈長類動物，但是最經常地是小鼠抗體。在這里"基本上所有的"指人源化抗體的受者FR區(qū)域可以包括在人共有FR序列中原來不存在的一或多個氨基酸取代。這些FR改變可以包含在受者或供體抗體中未找到的殘基。在一個實施方式中，供體抗體是鼠抗體，可變區(qū)包括圖1A與1B所示的H與L鏈的每一個的CDR與FR序列。在一個特定的實施方式中，人Fab框架的殘基相應于人VK亞群I和VH亞群III的共有序列，這些共有序列分別地如圖1A與圖1B所示。本發(fā)明的人源化2H7抗體具有小鼠供體抗體的H鏈的至少一個CDR。在一個實施方式中，結合人CD20的人源化2H7抗體包含供體抗體H與L《連兩者的CDR。在一個全長抗體中，本發(fā)明的人源化CD20結合抗體將包含人源化的可變結構域，該結構域與人免疫球蛋白的恒定結構域連接。在一優(yōu)選實施方式中，重鏈恒定區(qū)來自人IgG優(yōu)選地IgGl或者IgG3。輕鏈恒定結構域優(yōu)選地來自人K鏈。除非另外指示，除了在下面的實驗實施例中指示的氨基酸取代或改變位置之夕卜，在這里的人源化2H7抗體型式將具有2H7.vl6輕鏈(圖6,SEQIDNO.21)與H《連(圖7，SEQIDNO.22)的V與C結構域序列。該人源化CD20結合抗體將至少結合人CD20，并且優(yōu)選地結合其它靈長類動物CD20，例如猿猴(monkey)包括獼猴和恒河猴，與黑猩猩的CD20。獼猴CD20的序列在實施例15與圖19中披露。體與人CD20的結合，更優(yōu)選與人和靈長類動物(包括獼猴、恒河猴、黑猩猩)CD20結合，其Kd值不高于lxl(T8，優(yōu)選地Kd值不高于大約lxl0—9,甚至更優(yōu)選地Kd值不高于大約lxlO"并且能體外或體內殺死或者消減B細胞，優(yōu)選地當與基線水平或未用這樣的抗體處理過的恰當的負對照相比殺死或者消減至少20%。B細胞消減的所需水平將取決于疾病。對于治療CD20陽性癌癥來說，也許需要最大限度消減作為本發(fā)明的抗CD20抗體目標的B細胞。因此，對于治療CD20陽性B細胞肺瘤而言，最好對B細胞的消減是足夠的，以至少防止疾病的進展，而疾病的進展是本領域熟練醫(yī)師可以評估的，例如通過監(jiān)測胂瘤生長(大小)、癌細胞類型的增殖、轉移、及該特定癌癥的其它體征和癥狀。優(yōu)選地，B細胞消減足以防止疾病的進展至少2個月，更優(yōu)選3個月，甚至更優(yōu)選4個月，更優(yōu)選5個月，甚至更優(yōu)選6或更多個月。在甚至更優(yōu)選的實施方式中，B細胞消減足以提高癥狀緩解時間至少6個月，更優(yōu)選9個月，更優(yōu)選一年，更優(yōu)選2年，更優(yōu)選3年，甚至更優(yōu)選5年或更多年。在一個最優(yōu)選實施方式中，B細胞消減足以治療疾病。在優(yōu)選實施方案中，在癌癥病人中的B細胞消減是治療以前基線水平的至少大約75和優(yōu)選地80%、85%、90%、95%、99%并且甚至100%。對于治療自身免疫病，也許需要依賴個體病人的疾病和/或病癥的嚴重程度，通過調整CD20結合抗體的劑量，調制B細胞消減的程度。因此，可以消減B細胞、但不必是完全的。或者，在起始治療中可能需要總B細胞消減，但在隨后治療中，可能調整劑量以達到僅部分消減。在一個實施方式中，與治療前的基線水平相比，B細胞消減至少20。/。，即余留80%或者更少的CD20陽性B細胞。在其它實施方式中，B細胞消減25%、30°/。、40%、50%、60%、70%或者更多。優(yōu)選地，B細胞消減足以使疾病進展停頓，更優(yōu)選緩和在治療下的特定疾病的體征和癥狀，甚至更優(yōu)選治愈疾病。本發(fā)明還提供雙特異性CD20結合抗體，其中抗體的一個臂具有本發(fā)明的人源化CD20結合抗體的人源化重與輕鏈，并且另一個臂具有針對第二抗原的結合特異性的可變區(qū)。在特定的實施方式中，第二抗原選自由CD3、CD64、CD32A、CD16、NKG2D或者其它NK激活配體組成的組。同Rituxan(rituximab)比較起來)，v16顯示出ADCC效力增加大約2至5倍，CDC比Rituxan降低3-4倍?？贵w產生卓^發(fā)拔體單克隆抗體可用Kohleretal,Nature,256:495(1975)首先描述的雜交瘤法制備或通過重組DNA法(美國專利4，816，567)制備。在雜交瘤方法中，如上述免疫小鼠或其它適宜的宿主動物，例如倉鼠，來激發(fā)產生或能產生特異結合免疫所用蛋白的抗體的淋巴細胞。可選地，所述淋巴細胞可被體外免疫。免疫后，淋巴細胞可被分離并隨后使用適宜的融合劑例如聚乙二醇與骨髓瘤細胞系融合，以形成雜交瘤細胞(Goding,卓乂發(fā)^^沐a"^Prac"ce，59-103頁(AcademicPress，1986》。由此制備的雜交瘤細胞被接種于適宜的培養(yǎng)基并在其中生長，該培養(yǎng)基優(yōu)選包含一種或多種抑制未融合親代骨髓瘤細胞(也稱為融合伴侶)的生長或存活的物質。例如，如果親代骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT),雜交瘤的選擇培養(yǎng)基通常包括次黃嘌呤，氨基蝶呤，和胸腺嗜啶("HAT培養(yǎng)基")這些抑制HGPRT-缺陷細胞生長的物質。優(yōu)選融合伴侶骨髓瘤細胞為那些能有效融合、支持所選抗體生成細胞以穩(wěn)定的高水平產生抗體、并對選擇未融合親代的選擇培養(yǎng)基敏感的那些融合伴侶骨髓瘤細胞系。優(yōu)選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓瘤系，如由SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego，CaliforniaUSA才是供的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤，和由美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville,MarylandUSA提供的SP-2或其衍生物，如X63-Ag8-653細胞。也描述了人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系可用于產生人單克隆抗體[Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);和Brodeur等，單克隆抗體的制備技術和應用(MarcelDekker,Inc.,NewYork紐約，(1987))51-63頁)。可在含有生長的雜交瘤細胞的培養(yǎng)基中分析抗所述抗原的單克隆抗體的產生。優(yōu)選地，雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的結合特異性通過免疫沉淀或通過體外結合試驗，如放射免疫分析(RIA)或酶聯免疫吸附試驗(ELISA)來分析。單克隆抗體的結合親合力可通過，例如Muson等，爿"a/.Aoc/zem.，107:220(1980)所述Scatchard分析來測定。一旦鑒定出產生具有所需特異性、親合力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞，這些細胞克隆可通過有限稀釋進行亞克隆，并通過標準方法(Goding，#義發(fā)awdPra"/ce，59-103頁(AcademicPress,1986))寸吏其生長。適合此目的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，通過例如將細胞腹膜內注射入小鼠中，可以使雜交瘤細胞以動物腹水腫瘤的形式在體內生長。上述亞克隆所分泌的單克隆抗體可用經典抗體純化方法如，例如，親和層析(例如使用蛋白A或蛋白G瓊脂糖)或離子交換層析，羥基磷灰石層析，凝膠電泳，透析等從培養(yǎng)基，腹水或血清中分離。使用傳統方法(例如通過使用能與編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異結合的寡核苷酸探針)可輕易分離并測序編碼單克隆抗體的DNA。雜交瘤細胞是此DNA的優(yōu)選來源。一旦分離出該DNA,可以將它置入表達載體中，該載體隨后被轉染至宿主細胞中例如大腸桿菌細胞，猴COS細胞，中國倉鼠卯巢(CHO)細胞，或不另外生成抗體蛋白的骨髓瘤細胞，從而在重組宿主細胞中合成單克隆抗體。關于在細菌中重組表達編碼抗體的DNA的綜述文字包括Skerraefa/"CwrOpz.w'ow/w畫wo/.,5:256-262(1993)和Pliickthun,/mmw"o/.7ev&，130:151-188(1992)。在進一步的實施方案中，可從使用McCafferty等，A^we，348:552-554(1990)描述的技術產生的抗體噬菌體文庫中分離單克隆抗體或抗體片段。Clackson等，Atoww，352:624-628(1991)和Marks等，/Mo/.5/o/.，222:581-597(1991)分別描述了使用噬菌體文庫分離鼠和人抗體。隨后的文章描述了通過鏈改組產生高親和性(納米級)人抗體(Marks等，5!'o/Tec/mo/ogy，10:779-783(1992))，以及將組合感染和體內重組作為策略構建非常大的噬菌體文庫(Waterhouse等，A^c.^c/血Aes.,21:2265-2266(1993))。因此，這些技術是用于分離單克隆抗體的傳統單克隆抗體雜交瘤技術的可行(viable)選擇。也可采用以下方法對編碼抗體的DNA進行》務飾以產生嵌合或融合抗體多肽例如，以人重鏈和輕鏈恒定區(qū)(CH和QJ的序列代替同源小鼠序列(美國專利4，816,567;和Morrison等，尸rac.脂McW.5W.C/5^，81:6851(1984))，或將免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽(異源多肽)的完整或部分編碼序列融合。非免疫球蛋白多肽序列可取代抗體的恒定區(qū)，或它們可取代抗體的一個抗原結合位點的可變區(qū)以產生嵌合二價抗體，該抗體包含針對一個抗原的一個抗原結合位點，和具有對不同抗原的特異性的另一抗原結合位點。人源化戎糸使非人抗體人源化的方法已在本領域中描述。優(yōu)選地，人源化抗體具有一或多個從非人來源引入它的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常稱為"引進的，，殘基，它們通常來自"引進的，，可變區(qū)。人源化過程基本是按照Winter及其同事(Jones等，A^we,321:522-525(1986);Riechmann等，A^we，332:323-327(1988);Verhoeyen等，5W置e,239:1534-1536(1988))所述，通過高度可變區(qū)序列替換人抗體的對應序列來進行。因此，這樣的"人源化，，抗體是嵌合抗體(美國專利4,816，567),其中完整人類可變區(qū)的很少一部分被非人物種的相應序列取代。實踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中有些高變區(qū)殘基且可能有些FR殘基被嚙齒動物抗體中類似位點的殘基取代。當抗體用于人類治療用途時，選擇人源化抗體制備所用的人輕鏈和重鏈可變區(qū)，對于降低抗原性和HAMA反應(人抗鼠抗體)非常重要。根據所謂的"最適"方法，針對已知人可變區(qū)序列的整個文庫篩選嚙齒類抗體的可變區(qū)序列。鑒定與嚙齒類V區(qū)序列最接近的人V區(qū)序列，并且其中的人框架區(qū)(FR)作為人源化抗體被接受(Simsef"/，/mm畫/"151:2296(1993);Chothia"a/.，J!Mo/.5/o/.，196:901(1987))。另一種方法使用從具有輕鏈或重鏈特定亞群的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架區(qū)。同樣的框架區(qū)可被用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，Prac.Ato/.5W.t/W,89:4285(1992);Presta等，J//wrnwo/.,151:2623(1993))。重要的是，將抗體人源化后保留了對抗原的高結合親和力和其它有利的生物特性。為達到此目的，在一種優(yōu)選方法中，通過用親本序列和人源源化抗體。免疫球蛋白三維模型已有商品，是本領域技術人員所熟悉的。還有用于描述和展示所選候選免疫球蛋白序列可能的三維構象結構的計算機程序。通過檢查這些展示結果可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能發(fā)揮的作用，即分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結合的能力的殘基。通過這種方法，可從受體序列和引進序列中選出FR殘基并組合，從而得到所需抗體性質，如對靶抗原的親和力增加?？傊咦儏^(qū)殘基直接并且最主要涉及對抗原結合的影響。人源化抗體可以是抗體片段，例如Fab，其可選地與一種或多種細胞毒性制劑偶聯以產生免疫偶聯物。可選地，人源化抗體可以是全長的抗體，例如全長IgGl抗體。人拔謬和噬蘿伴屬^才法作為人源化的備選，可制備人抗體。例如，現在可以制備轉基因動物(如小鼠)，它經過免疫能在缺乏內源性免疫球蛋白生成的情況下產生全套人抗體。例如，已指出在嵌合和胚系(germ-line)突變小鼠中，抗體重鏈連接區(qū)(&)基因的純合缺失導致內源性抗體生成的完全抑制。將人胚系免疫球蛋白基因陣列轉移到此胚系突變小鼠中，將導致在抗原攻擊的情況下產生人抗體。見例如，Jakobovits等尸rac.脂/.^cad固，90:2551(1993);Jakobovits等，淑wre，362:255-258(1993);Bruggemann等，腸r/m畫肌，7:33(1993);美國專利5,545,806，5，569，825,5，591，669(所有均授予GenPharm);5,545,807;和WO97/17852.或者，可用噬菌體展示技術(McCafferty等，自然348:552-553(1990))從未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因庫體外產生人類抗體和抗體片段。依據此技術，抗體V區(qū)基因在框架內(in-frame)克隆入絲狀噬菌體(如M13或fd)主要或次要衣殼蛋白基因，并在噬菌體顆粒的表面展示為功能性抗體片段。因為絲狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，根據抗體的因此，噬菌體模仿了B細胞的部分特點。噬菌體展示可以以多種形式進行；這些綜述見例^口Johnson,KevinS.和Chiswell,David丄，CurrentOpinioninStructuralBiology3,564-571(1993)?？墒褂肰基因節(jié)段的多個來源進行噬菌體展示。Clackson等，Nature352，624-628(1991)從免疫小鼠脾臟來源的V基因小隨機組合文庫中分離出一批多樣的抗-噁唑酮抗體?？苫救鏜arks等，JMo/.編.222:581-597(1991)，或Griffith等，五MS(9/12:725-734(1993)所述，構建未免疫的人類供體的V基因庫，并分離針對多種多樣抗原(包括自身抗原)的抗體。也見美國專利5,565,332和5,573,905。如上討論，人抗體也可通過體外活化的B細胞產生(見美國專利5，567,610和5,229,275)。在特定的情況下，使用抗體片段比整個抗體更有優(yōu)勢。片段的較小體積允許快速清除，并可導致更好地接近實體腫瘤。已開發(fā)了多種技術用于生產抗體片段。傳統上，這些片段通過對完整抗體進行蛋白水解消化來衍生(見例如，Morimoto等，5/oc/7em.MeAoA24:107-117(1992)和Brennan等，S"'e"ce229:81(1985))。然而，這些片段現在可通過重組宿主細胞直接生產。Fab，Fv和ScFv抗體片段均可在大腸桿菌中表達并從中分泌，從而使這些片段的大量生產變容易。也可自上述的抗體噬菌體文庫分離抗體片段?？蛇x地，Fab，-SH片段可自大腸桿菌直接回收并利用化學方法偶聯形成F(ab，)2片段(Carter等，Bio/Technology10:163-167(1992))。根據另一方法，F(ab，)2片段可直接從重組宿主細胞培養(yǎng)物中分離。包括補救受體結合表位殘基并具有延長的體內半壽期的Fab和F(ab')2片段在美國專利5,869，046中描述。熟練技術人員掌握其它產生抗體片段的技術。其它實施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。見WO93/16185;美國專利5,571,894;和美國專利5,587,458。Fv和sFv是具有完整結合位點的種類中唯一缺乏恒定區(qū)的；因此，其適于在體內應用期間降低非特異結合?？梢詷嫿╯Fv融合蛋白，從而在sFv的氨基或羧基末端融合效應蛋白。見上文的AntibodyEngineering,Borrebaeck編輯?？贵w片|殳也可以是"線性抗體"，例如在美國專利5,641，870中描述。此種線型抗體片段可以是單特異或雙特異的。雙掙弄在沐雙特異抗體是對至少兩種不同表位具有結合特異性的抗體。典型的雙特異抗體可結合CD20蛋白質的兩種不同表位。其它此種抗體可將CD20結合位點與針對另一蛋白質的結合位點組合?；蛘?，抗CD20臂可以與結合白細胞上觸發(fā)分子的臂結合，觸發(fā)分子例如T細胞受體分子(例如CD3)或IgG的Fc受體(FcyR)例如FcyRI(CD64)、FcYRII(CD32)和FcyR(CD16),或NKG2D或其它NK細胞激活配體，以將細胞防御機制針對和定位在CD20表達細胞上。雙特異抗體也可用來將細胞毒制劑定位在表達CD20的細胞上。這些抗體具CD20臂和結合細胞毒性制劑的臂(例如皂草素(saporin)，抗ot-干擾素，長春花生物堿，蓖麻毒蛋白A鏈，氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)?？梢詫㈦p特異抗體制備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2雙特異抗體)。W096/16673描述了雙特異性抗ErbB2/抗FcyRIII抗體，美國專利5,837,234披露了雙特異性抗ErbB2/抗FcyRI抗體。在WO98/02463中顯示雙特異性抗ErbB2/Fcoc抗體。美國專利5,821,337教導了雙特異性抗ErbB2/抗CD3抗體。制備雙特異性抗體的方法是本領域已知的。全長雙特異性抗體的傳統制備是基于兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中這兩條鏈具有不同特異性(Millsteinetal,Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈輕鏈隨機分配，這些雜交瘤("四鏈瘤，，(quadroma))產生10種不同抗體分子的可能混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結構。對所述正確分子的純化(通常通過親和層析步驟來進行)非常復雜，且產量很低。類似的方法在WO93/08829和Traunecker等，EMBOJ，10:3655-3659(1991)中披露。依據另一不同方法，可將具有所需結合特異性的抗體可變區(qū)(抗體-抗原結合位點)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。該融合優(yōu)選與包含鉸鏈區(qū)、CH2及CH3區(qū)的至少一部分的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選使含有輕鏈結合所需位點的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)出現在至少在一種融合中?？蓪⒕幋a免疫球蛋白重鏈融合體，以及必要時，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同表達載體，共轉染至適當宿主細胞。在使用非等比的三種多肽鏈進行構建以獲得所需雙特異性抗體最佳產量的實施方案中，這提供調整三種多肽片段的相互比例上的較大靈活性。但也可在至少兩種多肽鏈以等比例表達而獲得高產時或所述比例對所需鏈組合的產量無特別意義時，將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一表達載體。在該方法的一個優(yōu)選實施方案中，所述雙特異性抗體由一條臂上的具有第一結合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一條臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。已發(fā)現這種不對稱結構有利于從不想要的免疫球蛋白鏈的混合中分離出所需雙特異性化合物，因為只有該雙特異性分子的一半存在免疫球蛋白輕鏈，這使得分離更加容易。此方法/>開于1994年3月3日公開的WO94/04690中。制備雙特異性抗體的進一步纟田節(jié)可以參見，例^口Suresh等，MethodsinEnzymology，121:210(1986)。根據美國專利5，731,168所述的另一種方法，可改造一對抗體分子之間的界面，使得從重組細胞培養(yǎng)中獲得的異二聚體的百分比最大。優(yōu)選的界面包括CH3結構域的至少一部分。在該方法中，源于第一抗體分子界面上的一條或多條氨基酸小側鏈被較大側鏈(如酪氨酸或色氨酸)取代。與所述大側鏈大小相同或相近的互補"溝"可通過將氨基酸大側鏈用小側鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代而在第二抗體分子的界面上形成。這提供了一種機制，其使異二聚體的產量比其它不想要的終產物如同型二聚體高。雙特異性抗體包括交聯抗體或"異源偶聯的"抗體。例如，可使異源偶聯物中的抗體之一與抗生物素蛋白偶聯，使另一抗體與生物素偶聯。有觀點認為，這類抗體可用于將免疫系統細胞導向不想要的細胞(美國專利4,676,980),也可用于治療HIV感染(W091/00360，WO92/200373,EP03089)。異源偶聯抗體可通過任何適當的交聯方法制備。適當的交聯制劑和多種交聯技術為本領域已知，在美國專利4,676，980號中獲得。從抗體片段制備雙特異性抗體的技術已有文獻。例如，雙特異性抗體可利用化學連接制備。Brennan等，科學229:81(1985)中描述了將完整抗體經蛋白水解切割制備F(ab')2片段的方法。這些片段在二巰基復合劑亞砷酸鈉存在時被還原，從而穩(wěn)定相鄰的巰基，并阻止分子間二硫鍵的形成。生成的Fab'片段被轉化為硫硝基苯曱酸鹽(TNB)衍生物。其中一種Fab'-TNB衍生物經巰基乙胺還原再轉化成Fab'-硫醇，再與等摩爾量的其它Fab'-TNB衍生物混合形成雙特異性抗體。如此產生的雙特異性抗體可作為酶的選擇性固相化中所用的試劑。近期的進展促進了Fab'-SH片段從大腸桿菌的直接回收，該片段可經化學偶聯形成雙特異性抗體。Shalaby等，/￡xp.Med，175:217-225(1992)描述了完全人源化雙特異抗體F(ab')2分子的產生。每一Fab'片段分別從大腸桿菌中分泌出來，體外直接化學偶聯形成雙特異性抗體。如此制備的雙特異性抗體能與過表達ErbB2受體的細胞和正常人T細胞結合，還能引發(fā)人類細胞毒淋巴細胞對人乳腺腫瘤靶向的裂解活性。直接從重組細胞培養(yǎng)中制備并分離雙特異性抗體片段的多種技術也已有描述。例如，可用亮氨酸拉鏈制備雙特異性抗體。Kostelny等，■//mm柳o/.，148(5):1547-1553(1992)。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab'部分通過基因融合而連接。使抗體的同二聚體在鉸鏈區(qū)被還原成單體，然后被再氧化形成抗體的異二聚體。該方法也可用于制備抗體同二聚體。Hollinger等，戶rac.層ia""..t/514,90:6444-6448(1993)所述的"二價抗體"技術提供了另一種制備雙特異性抗體片段的方法。所述片段中含有Vh，其通過接頭與Vl相連，該接頭非常短，使得同一鏈的兩個結構域之間無法配對。因此，同一片段上的Vh和ViJ吉構域被迫與另一片段上的互補V^和VH結構域配對，乂人而形成兩個抗原結合位點。此外還報道了另一種用單鏈Fv(sFv)二聚體來制備雙特異性抗體的策略。見Gruber等，《//wm柳o/.,152:5368(1994)。本發(fā)明還涉及二價以上的抗體。例如可制備三特異抗體。Tutt等乂/謹,/.147:60(1991)。多價抗體比二價抗體更容易被表達與該抗體結合的抗原的細胞內化(和/或異化)。本發(fā)明的抗體可以是具有三個或更多個抗原結合位點的多價抗體(例如四價抗體)(它們不是IgM類)，通過使編碼所述抗體多肽鏈的核酸重組表達可輕易制備該抗體。多價抗體可以包含二聚體化結構域和三個或更多個抗原結合位點。優(yōu)選的二聚體化結構域包括Fc區(qū)或鉸鏈區(qū)，或由其組成。在本文中，抗體包含一個Fc區(qū)和三個或更多個位于Fc區(qū)氨基端的抗原結合位點。優(yōu)選的多價抗體在此包括三到約八個抗原結合位點，或由它們組成，但優(yōu)選四個抗原結合位點。多價抗體包括至少一條多肽鏈(并優(yōu)選兩條多肽鏈)，其中所述多肽鏈包含兩個或多個可變區(qū)。例如，多肽鏈可包含VDl-(XlVVD2-(X2VFc，其中VD1是第一可變區(qū)，VD2是第二可變區(qū)，Fc是Fc區(qū)的一條多肽鏈，XI和X2代表氨基酸或多肽，n是0或l。例如，多肽鏈可包括VH-CHl-柔韌接頭(flexiblelinker)-VH-CH1-Fc區(qū)鏈；或VH-CH1-VH-CH1-Fc區(qū)鏈。本文的多價抗體優(yōu)選進一步包含至少兩個(優(yōu)選四個)輕鏈可變區(qū)多肽。例如本文的多價抗體可包含從約兩個到約八個輕鏈可變區(qū)多肽。本文的輕鏈可變區(qū)多肽包含輕鏈可變區(qū)以及可選地進一步包含CL結構域。本發(fā)明還涉及對本文所述CD20結合抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能希望改進抗體的結合親和力和/或其它生物學特性?？笴D20抗體的氨基酸序列變體可通過在抗CD20抗體核酸中導入適當的核苦酸改變，或通過肽合成法來制備。所述修飾包括，如該抗CD20抗體的氨基酸序列中的殘基缺失，和/或插入和/或取代?？蓪θ笔?、插入、和取代進行任意組合以獲得最終構建體，只要該最終構建體具有所需特性。氨基酸的變化還可改變抗CD20抗體的翻譯后加工，如改變糖基化位點的數目或位置。一種鑒別抗CD20抗體中處于誘變優(yōu)選位置的特定殘基或區(qū)域的有效方法是Cunningham和Wells，科學244:1081-1085(1989)所述的"丙氨酸掃描誘變"。這里，鑒定一個殘基或一組靶殘基(例如，帶電的殘基如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)并用中性或帶負電的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以便影響氨基酸與CD20抗原的相互作用。那些證實對取代具有功能敏感性的氨基酸位置通過在取代點引入進一步的或其它的變體而改進。故，盡管引入氨基酸序列變異的位點是預先決定的，但突變本身不必是預定的。例如，為分析在指定位點處突變的作用，在所述靶密碼子或區(qū)域實行丙氨酸掃描或隨機誘變，并篩選所表達的具有預期活性的抗CD20抗體變體。氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-端的融合(其長度從一個殘基至包括100個或更多殘基的多肽)，以及序列內單個或多個氨基酸殘基的插入。末端插入的例子包括帶有N-末端曱硫氨酰殘基的抗CD20抗體或與細胞毒性多肽融合的抗體?？笴D20抗體分子的其它插入變體包括使該抗CD20抗體的N或C末端與酶(例如ADEPT)或增加該抗體血清半壽期的多肽融合形成的融合體。另一類變體是氨基酸取代變體。這些變體使抗CD20抗體分子中至少一個氨基酸殘基被不同殘基取代。最有興趣進行取代誘變的位點包括高變區(qū)，也可以改變FR。保守取代見表1的"優(yōu)先取代"欄。如果這些取代引起生物學活性的改變，則可引入表l中"取代舉例"欄的更實質性改變，或進一步在下文的氨基酸分類中所述的更實質性改變，并篩選產物。氨基酸取代表<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>的效應在維持(a)取代區(qū)多肽框架的結構，例如片層結構或螺旋構象，(b)該分子靶位點的電荷或疏水性，(c)側鏈的大小這幾方面有顯著差異。天然殘基根據共有的側鏈特性可分為(1)疏水性正亮氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸(2)中性親水半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸(3)酸性天冬氨酸，谷氨酸(4)堿性天冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸(5)影響側鏈定向的殘基甘氨酸，脯氨酸，和(6)芳香族色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。非保守取代將限定上述某一類的成員被另一類取代。任何不參與保持抗CD20抗體正確構型的半胱氨酸殘基可被替代，通常由絲氨酸替代，來提高分子的氧化穩(wěn)定性并防止錯誤交聯。反之，可在抗體中添加半胱氨酸連接以提高其穩(wěn)定性(特別當抗體為抗體片段如FV片段時)。取代變體的特別優(yōu)選類型包括取代親本抗體(例如人源化抗體或人抗體高變區(qū)的一或多個殘基。通常，所選用于進一步開發(fā)的所得變體相對于其所來源的親本抗體應具有改進的生物學活性。產生這種取代變體的一個方便方法是利用了噬菌體展示的親和力成熟。簡單地說，使高變區(qū)的幾個位點(如6-7個位點)突變以便在每一位點產生所有可能的氨基酸取代。這樣產生的抗體變體以單價形式展示在絲狀噬菌體顆粒上，其為與每個顆粒內包裝的M13基因in產物的融合體。然后篩選噬菌體展示的變體是否具有本文所述生物學活性(如結合親和力)。為了鑒定備選的高變區(qū)修飾位點，可通過丙氨酸掃描誘變來鑒定對抗原結合作出主要貢獻的高變區(qū)殘基?；蛘呋虼送?，分析抗原-抗體復合物的晶體結構以確定CD20與抗體之間的接觸點也較有利。這些接觸殘基及鄰近殘基是根據本文所述技術進行取代的候選位點。一旦產生這樣的變體，如本文所述對它們全部進行篩選，選出在一或多個相關實驗中具有良好特性的抗體以便進一步開發(fā)?？贵w的另一種氨基酸變體改變了該抗體原來的糖基化模式。所謂改變就是去掉抗體中的一或多個糖組分，和/或添加一或多個原本不存在于該抗體中的糖基化位點?？贵w的糖基化通常為N-連接或O-連接。N-連接指將糖組分與天冬酰胺殘基的側鏈相連。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是使糖組分與天冬酰胺進行側鏈酶促相連的識別序列。因此，多肽中存在上述任一種三肽序列都可產生潛在的糖基化位點。O-連接糖基化指將N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖附著于羥基氨基酸，主要是絲氨酸、蘇氨酸，但也可用5-羥脯氨酸和5-羥賴氨酸。在抗體分子中添加糖基化位點可通過改變氨基酸序列，使其包含一或多個上述三肽序列(在添加N-連接糖基化位點的情況下)而實現。這種改變也可通過在原始抗體序列中添加或取代一或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來實現(在添加O-連接的情況下)。編碼抗CD20抗體的氨基酸序列變體的核酸分子由本領域已知的各種方法制備。這些方法包括但不限于從天然來源分離(在天然氨基酸序列變體的情況下)，或通過對早期制備的變體或未變異的抗CD20抗體進行寡核苷酸介導的(或定點)誘變，PCR誘變和盒式誘變來制備。也許希望在效應子功能方面修飾本發(fā)明的抗體，例如以增強抗體的抗原依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)和/或依賴于補體的細胞毒性(CDC)。這可通過在抗體Fc區(qū)域引入一或多個氨基酸取代而達到。二者擇一地或者另夕卜，半胱氨酸殘基可被引入Fc區(qū)域，從而允許在該區(qū)內形成鏈間二硫鍵。如此生產的同型二聚體抗體可具有改善的內在化能力，和/或增加補體介導的細胞殺傷與抗體依賴的細胞的細胞毒性(ADCC)。見Caronetal.,J.ExpMed.176:1191-1195(1992)與Shopes,B.J.Immunol.148:2918-2922(1992)。也可以利用如Wolffetal.CancerResearch53:2560-2565(1993)描述的異雙功能交聯劑制備具有增強的抗腫瘤活性的同型二聚體抗體。或者，抗體可以被改造使其具有兩個Fc區(qū)域，并且可以由此具有增強的補體介導的溶解與ADCC能力。見Stevensonetal.Anti-CancerDrugDesign3:219-230(1989)。為延長抗體的血清半衰期，可以將補救受體結合表位加入抗體(特別是抗體片段)，例如在美國專利5,739，277中描述的。如同在這里所使用的，術語"補救受體結合表位"指IgG分子(例如IgGl，IgG2，IgG3，或IgG4)Fc區(qū)域的表位，其負責延長IgG分子的體內血清半衰期。岸它戎傳發(fā)#在此也涉及抗體的其它修飾。例如，抗體可以與各種非蛋白聚合物中的一種連"^妻，例如聚乙二醇，聚丙二醇，聚氧化烯，或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物?？贵w也可以在膠體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球粒、微乳劑、納米顆粒與納米膠嚢)中，或者在粗乳狀液中捕捉在微膠嚢中，所述微膠嚢例如通過凝聚技術或界面聚合作用制備，例如，分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢與聚異丁烯酸甲酯微膠嚢。這一技術在Remington'sPharmaceuticalSciences,16thedition,Oslo,A.，Ed.，(1980)中披露。/#逸的我體可如實驗實施例中描述的選擇具有某些生物學特性的抗體。本發(fā)明的抗CD20抗體的生長抑制效果可以通過本領域已知的方法評估，例如利用內源或者在用CD20基因轉染之后表達CD20的細胞。例如，肺瘤細胞系與CD20轉染的細胞可以用本發(fā)明的抗CD20單克隆抗體在各種濃度處理幾天(例如，2-7天)，用結晶紫或MTT染色，或用其它比色定量進行在下處理，細胞311-胸腺嘧啶核苷的攝取。在抗體處理之后，收獲細胞，并且在閃爍計數器上測定摻入DNA的放射性的量。合適的正對照包括用已知抑制該細胞系生長的生長抑制性抗體處理選定的細胞系。為選擇誘導細胞死亡的抗體，可相對于對照評估膜完整性的喪失，膜完整性的喪失用例如多典化丙錠(PI)、錐蟲藍或7AAD攝取指示。PI攝取試驗可以在缺乏補體與免疫效應細胞下進行。表達CD20的肺瘤細胞單獨與培養(yǎng)基孵育，或者與包含濃度例如大約10pg/ml的合適的單克隆抗體的培養(yǎng)基一起脬育。細胞孵育3天。每次處理后，洗細胞，等分入35毫米帶過濾器帽的12x75管(每管lml,每試驗組3管)，以除去細胞團塊。樣品可用FACSCAN流式細胞儀與FACSCONVERTTMCellQuest軟件(BectonDickinson)分析。用PI攝取確定誘導統計上顯著意義的細胞死亡水平的抗體可,皮選為誘導細力包死亡的抗體。為了篩選與被目的抗體結合的CD20上的表位結合的抗體，可以進行常^見雜交阻滯試-驗，例如在antibodies,aLaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlowandDavidLane(1988)中所描述的。這一試4僉可用于判斷受試抗體是否與本發(fā)明的抗CD20抗體結合在相同的位點或表位上。或者或另外，可以用本領域已知的方法進行表位作圖。例如，抗體序列可以例如通過丙氨酸掃描進行誘變處理，以鑒別接觸殘基。一開始測試突變抗體對多克隆抗體的結合以保證適當的折疊。在一不同方法中，相應于CD20不同區(qū)域的肽可用在與測試抗體或者與測試抗體和具有已表征或已知表位的抗體的竟爭試驗中。載體，宿主細胞和重組方法
技術領域：
：本發(fā)明還提供編碼人源化CD20結合抗體的分離的核酸，包含該核酸的載體和宿主，以及制備該抗體的重組技術。為了重組制備所述抗體，分離其編碼核酸并插入復制型載體中以便進一步克隆(擴增DNA)或表達。編碼所述抗體的DNA可以用常規(guī)方法很容易地分離并測序(例如使用能夠特異性結合編碼抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。有多種載體可以利用。載體組分通常包括但不限于一或多個下列組分信號序列，復制起點，一或多個標記基因，增強子元件，啟動子，和轉錄終止序列。0信##/(/逸為、本發(fā)明的CD20結合抗體不僅可以直接重組產生，還可作為與異源多肽融合的融合多肽來重組產生，所述異源多肽優(yōu)選信號序列或其它在成熟蛋白或多肽的N末端上具有特異性裂解位點的多肽。所選異源信號序列優(yōu)選是被宿主細胞識別并加工(即4皮信號肽酶裂解)的序列。對于不能識別和加工天然CD20結合抗體信號序列的原核宿主細胞，信號序列被選自，例如，堿性磷酸酶，青霉素酶，lpp或熱穩(wěn)定腸毒素II前導序列的原核生物信號序列取代。為了進行酵母分泌，可以將天然信號序列取代為，例如，酵母轉化酶前導序列，a因子前導序歹'J(包括糖酵母CSacc/wra^yc^)a因子前導序列和克魯維酵母(K/w;;vmw^ce力a因子前導序列)，或酸性磷酸酶前導序列，白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前導序列，或WO90/13646描述的信號。在哺乳動物細胞表達中，哺乳動物信號序列以及病毒的分泌前導序列，如單純皰疹病毒gD信號都可以采用。這些前體區(qū)的DNA與編碼CD20結合抗體的DNA連接在閱讀框內。0》復夯啟^表達載體和克隆載體都包含能使該載體在一或多種選定的宿主細胞中復制的核酸序列。一般情況下，在克隆載體中，這種序列是能使該載體獨立于宿主染色體DNA而復制的序列，包括復制起點或自主復制序列。這樣的序列在各種細菌、酵母和病毒中都是眾所周知的。質粒pBR322的復制起點適合大多數革蘭氏陰性細菌，2n質粒起點適合酵母菌，多種病毒起點(SV40,多瘤病毒(Polyoma),腺病毒，VSV或BPV)可用于哺乳動物細胞中的克隆載體。復制起點組分一般不是哺乳動物表達載體所必需的(SV40起點的使用通常僅僅是由于其包含早期啟動子)。遂#"差西邀為、表達載體和克隆載體可以包含選擇基因，也稱選擇標記。典型的選擇基因編碼具有以下性質的蛋白(a)賦予對抗生素或其它毒素(如氨芐青霉素，新霉素，氨曱蝶呤或四環(huán)素)的抗性，(b)彌補營養(yǎng)缺陷，或(c)提供復合培養(yǎng)基不能供給的關鍵營養(yǎng)物，例如編碼芽孢桿菌(5a"7/!')D-丙氨酸消旋酶的基因。選擇方案的一個實例是利用藥物限制(arrest)宿主細胞的生長。那些被異源基因成功轉化的細胞產生賦予藥物抗性的蛋白，從而在該選擇環(huán)境中存活。這種顯性選擇的實例采用藥物新霉素，霉酚酸和潮霉素。適合于哺乳動物細胞的另一例選擇標記是允許鑒定能攝取所述抗體核酸的細胞的那些，如DHFR,胸苷激酶，金屬硫蛋白-I型和-II型，優(yōu)選靈長類金屬硫蛋白基因，腺苷脫氨酶，鳥氨酸脫羧酶等。例如，細胞被DHFR選擇基因轉化后，先將所有轉化體培養(yǎng)在包含氨曱蝶呤(Mtx,為DHFR的一種竟爭型拮抗劑)的培養(yǎng)基中來鑒定細胞。當采用野生型DHFR時，合適的宿主細胞是DHFR活性有缺陷的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系?；蛘?，宿主細胞(尤其包含內源DHFR的野生型宿主)^皮編碼CD20結合抗體的DNA序列，野生型DHFR蛋白，以及另一種選擇標記如氨基糖苷3，-磷酸轉移酶(APH)轉化或共轉化以后，可以通過在含有針對該選^^標記的選擇試劑如氨基糖苷類抗生素(如卡那霉素，新霉素或G418)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞來進行選擇。參見美國專利4,965,199。適用于酵母的合適選擇基因是存在于酵母質粒YRp7中的^/1基因(Stinchcomb等，Atoww,282:39(1979))。^pl基因為不能在色氨酸中生長的酵母突變抹(例如ATCC44076或PEP4-1)提供了選擇標記(Jones，C7e"W"，85:12(1977))。此后，酵母宿主細胞基因組中f/^l損傷的存在提供了通過在缺乏色氨酸的條件中生長而檢測轉化的有效環(huán)境。類似地，丄ew2-缺陷型酵母菌抹(ATCC20,622或38,626)可以由攜帶Lew2基因的已知質粒來互補。此外，源自1.6|iim環(huán)狀質粒pKDl的載體可以用于轉化克魯維酵母(《/w"eromyce力。備選地，VandenBerg,歷0/Tec/7"0/0gy,8:135(1990)才艮道了一種用于在乳克魯維酵母(K/acto)中大規(guī)模制備重組小牛凝乳酶的表達系統。還有人公開了用于通過克魯維酵母工業(yè)菌株分泌成熟重組人血清白蛋白的穩(wěn)定、多拷貝表達載體。Fleer等，所o/rec/mo/ogy,9:968-975(1991)。卩yj啟動子逸為^表達載體和克隆載體通常包含能被宿主生物識別的啟動子，它與所述編碼CD20結合抗體的核酸可操作相連。適用于原核宿主的啟動子包括p/zo4啟動子，p-內酰胺酶和乳糖啟動子系統，堿性磷酸酶，色氨酸(trp)啟動子系統，和雜合(hybrid)啟動子如tac啟動子。但其它已知的細菌啟動子也是合適的。適用于細菌系統的啟動子還可以包含與編碼CD20結合抗體的DNA可操作相連的Shine-Dalgamo(S.D.)序列。真核生物的啟動子序列是已知的。幾乎所有的真核基因在轉錄起始點上游約25-30個堿基處具有AT-富集區(qū)。很多基因在其轉錄起始點上游70-80個堿基處有另一種序列CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。大多數真核基因的3，端是AATAAA序列，它可以作為一種信號用于將poly-A尾添加到編碼序列3，端。所有這些序列都適合于插入真核表達載體中。適用于酵母宿主的啟動子序列的實例包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子，所述其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脫氬酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6磷酸異構酶，3-磷酸甘油變位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖異構酶，磷酸葡萄糖異構酶和葡萄糖激酶。其它的酵母啟動子，即那些另具有由生長條件控制轉錄的優(yōu)點的誘導型啟動子，是下述基因的啟動子區(qū)醇脫氫酶2、異細胞色素C(isocytochromeC)、酸性磷酸酶、與氮代謝相關的降解酶、金屬石危蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氬酶，以及負責麥芽糖和半乳糖利用的酶。在EP73,657中進一步描述了適用于酵母表達的載體和啟動子。酵母增強子與酵母啟動子聯合使用也是有利的。在哺乳動物宿主細胞中，從載體轉錄CD20結合抗體是受，例如啟動子調控，所述啟動子來自病毒基因組，如多形瘤病毒、雞痘病毒(fowlpoxvims)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、乙型肝炎病毒，最優(yōu)選猴病毒40(SV40)的啟動子，來自異源哺乳動物的啟動子，如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子等，來自熱休克啟動子，前提是這些啟動子與宿主細胞系統相容。SV40病毒的早期和晚期啟動子可以作為還包含SV40病毒復制起點的SV40限制性片段而方便地獲得。人巨細胞病毒的立即早期啟動子可以作為HindIIIE限制性片段方便地獲得。美國專利4，419，446中公開了在哺乳動物宿主中用牛乳頭瘤病毒作為載體來表達DNA的系統。美國專利4,601,978中敘述了對這個系統改進。另見Reyes等，A^wre，297:598-601(1982)關于在單純皰滲病毒胸苷激酶啟動子控制下在小鼠細胞中表達人(3干擾素cDNA。備選地，可以將勞氏肉瘤病毒長末端重復序列用作啟動子。(V」增強子無伴逸為、編碼本發(fā)明CD20結合抗體的DNA在高等真核生物中的轉錄常常通過將增強子序列插入載體中來增加。目前已知很多哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、曱胎蛋白和胰島素)的增強子序列。但通常使用真核細胞病毒的增強子。實例包括在復制起始點晚期側的SV40增強子(bp100-270)，巨細胞病毒早期啟動子增強子，在復制起始點晚期側的多形瘤增強子，和腺病毒增強子。也可參見Yaniv，A^ww，297:17-18(1982)所述用于活化真核啟動子的增強元件。增強子可以剪接插入載體中抗體編碼序列的5，或3'側，但優(yōu)選位于啟動子的5'側。W脊絲乂妙用于真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細胞生物的有核細胞)的表達載體，還可以包括對轉錄終止和mRNA穩(wěn)定所必需的序列。這些序列通常來自真核細胞或病毒的DNA或cDNA的5'(偶爾為3')非翻譯區(qū)。這些區(qū)域包含轉錄為編碼多價抗體的mRNA的非翻譯區(qū)中聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。一種有效的轉錄終止組分是牛生長激素聚腺香酸化區(qū)。參見WO94/11026以及本文公開的表達載體。鄉(xiāng)遞脊并脊化荷力眾^克隆或表達本文所述載體中的DNA的適宜宿主細胞，包括上述原核生物、酵母或高等真核細胞。適于此目的的原核生物包括真細菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae),如埃希氏菌屬C&c/zen-c/2/a),例如，大腸桿菌(五.co//)，腸桿菌屬CE"&ra6fl"er),歐文菌屬(五rw/m'fl)，克雷白菌屬(《/eZwW/fl)，變形菌桿屬(尸rafew力，沙門菌屬(;5^/wo"e〃(3)(:i口鼠"f另寒沙、門菌(5b/wo"e〃"(y//H.附wWww》，沙、雷菌屬(5"err"Z/a)(如粘質沙雷菌(&rra"amwcMcara))和志賀菌屬(5Tz/ge/Z")等，以及芽孢桿菌屬(5ac!W)如枯草芽孢桿菌(及si^""s)和地衣芽孢桿菌(jB."c/zem/onw'力(例如1989年4月12日出版的DD266，710中所述地衣芽孢桿菌41P)等，假單胞菌屬(尸"wt/cwo"os):i口銅纟錄菌々I單月包菌CP"erwg/"ayof),及《連霉菌OSy^ptow_ycay)。優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31,446)，j旦其它菌抹，如大腸桿菌B,大腸桿菌X1776(ATCC31，537)和大腸桿菌W3110(ATCC27，325)也是合適的。這些實例是用于說明，并非限制。全長抗體、抗體片段與抗體融合蛋白質可以在細菌中產生，特別是當不需要糖基化作用與Fc效應子功能時，例如當治療抗體偶聯至細胞毒藥劑(例如毒素)并且免疫偶聯物自身顯示在破壞肺瘤細胞上的效力時。全長抗體在循環(huán)中具有更長的半衰期。在大腸桿菌中生產是更快和更具有成本效率的。對于抗體片段與多肽在細菌中的表達，見例如美國專利5,648,237(Carteretal.),美國專利5,789，199(Jolyetal.)，與美國專利5,840，523(Simmonsetal.),其中描繪了用于最優(yōu)化表達與分泌的翻譯起始區(qū)域(TIR)和信號順序，這些專利在此引入作為參考。在表達之后，抗體從大腸桿菌細胞糊狀混合物中在可溶組分中分離，并且取決于同種型，可以通過例如蛋白A或者G柱純化。最后純化可以以類似于純化在CHO細胞中表達的抗體的程序進行。除了原核生物，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是適合于編碼CD20結合4元體的載體的克隆或表達宿主。酉良酒酵母(6""cc/7arcw少cescerev/s/(^)或常見的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。還有多個其它屬、種和抹已有商品供應，并且可以用于本發(fā)明，例如粟酒裂殖酵母(/Sc/n'zasacc/iaram;vcespom6e);克魯維酵母屬(X"/t(yveram3/ces)宿主,例^口乳克魯維酵母(尺./a"/力、脆壁克魯維酵母(《./^^7/力(ATCC12,424)、保加利亞克魯維酵母(《.6w/gan'cw力(ATCC16，045)、威克曼氏克魯維酵母(Kw/cferaAm7)(ATCC24,178)、尺.wa/"《ATCC56,500)、果蠅克魯維酵母(尺^aso//n7an^)(ATCC36,906)、耐熱克魯維酵母(KAermoto/era""和馬克斯克魯維氏酵母(尺m^x/"""力等；西洋蓍霉OwroM^)(EP402,226);巴斯德畢赤酵母(p/c/z/flpaston》(EP183，070);念珠菌屬(OmAWa);7Wc/zc^enwawes/a(EP244,234);粗糙鏈孢霉(A^wms/oracrn^a);許旺氏酵母屬(sc/nvanm'ow;yces)^口西方"i午旺氏酵母(sc/7wa"m.omjvcesocc〖fife"ta/^s)等；禾口絲一犬真菌，i"列^口4連孑包霉屬(7Vewas/ora)、青霉屬(尸e"/c/〃/w附)、7b/;^oc/a(iz'w附以及曲霉屬宿主如構巢曲霉(yiwV/w/""》和黑曲霉(yl"/gw)等。適合于表達糖基化CD20結合抗體的宿主細胞來自多細胞生物。無脊堆動物細胞的實例包括植物和昆蟲細胞。目前已經從下述宿主中鑒定了大量的桿狀病毒4朱和變體以及相應的容許型昆蟲宿主細胞草地z艮蛾(5)0(io;7feraFn/g7)era^,毛蟲)、i矣及^f尹蟲丈(y4ecfesaegvp",蟲丈子)、白纟文j尹蟲丈(/letfesa腸//cto，蚊子)、Dmso//zz7awe/awogos^(果蟲菱)和家香喊(5ow^yxmoW)等。用于轉染的各種病毒株可以公開地獲得，例如加利福尼亞Y級夜蛾04^ograp/2"ca/i/brm'fl)NPV的L-l變體和家蠶蛾NPV的Bm-5抹，并且這些病毒可以在此用作本發(fā)明的病毒，尤其是用于轉染草地夜蛾細胞。棉花(cotton)、玉米(corn)、土豆(potato)、大豆(soybean)、矮牽牛(petunia)、西紅柿(tomato)和煙草(tobacco)的植物細胞培養(yǎng)物也可以用作宿主。然而，關注最多的是脊推動物細胞，而且在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中繁殖脊推動物細胞已經成為常規(guī)方法。有效哺乳動物宿主細胞系的實例是用SV40轉化的猴腎CV1細胞系(COS-7，ATCCCRL1651);人胚腎細胞系(293細胞或經過再克隆后能在懸浮培養(yǎng)物中生長的293細胞，Graham等，《/Wra/.36:59(1977));倉鼠幼鼠腎細胞(BHK,ATCCCCL10);中國倉鼠卵巢細胞/陽DHFR(CHO，Urlaub等，Ato/.^cadSc/.C/.S.A77:4216(1980));小鼠足細胞(TM4，Mather,5z'o/.i^prad23:243-251(1980));浙美腎細胞(CV1ATCCCCL70);非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCCCRL-1587);人宮頸癌細胞(HELA，ATCCCCL2);犬腎細胞(MDCKATCCCCL34);布法羅(buffalo)大鼠肝細胞(BRL3A,ATCCCRL1442);人肺細胞(W138，ATCCCCL75);人肝細胞(H印G2，HB8065);小鼠乳腺肺瘤(MMT060562，ATCCCCL51);TRI細胞(Mather等，」""a/s〃K^c^.5W.383:44-68(1982));MRC5細胞；FS4細胞；和人肝細胞癌細胞系(HepG2)。宿主細胞用上述用于制備CD20結合抗體的表達或克隆載體轉化，并在改進型傳統營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基經改進已適于誘導啟動子、篩選轉化體、或擴增編碼所需序列的基因。一潛棗荷J:勿應用于產生本發(fā)明的CD20結合抗體的宿主細胞可以在各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。市售培養(yǎng)基如Ham'sF10(Sigma)，極限必需培養(yǎng)基((MEM),Sigma),RPMI-1640(Sigma),和Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基((DMEM)，Sigma)都適于培養(yǎng)所述宿主細胞。此外，Ham"a/.,MeA.58:44(1979)，Barnes""/.,顛/.所oc/z亂102:255(1980),U.S.Pat.Nos.4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;or5,122,469;WO90/03430;WO87/00195;或U.S.PatentRe.30,985所述的任一種培養(yǎng)基也可以用作宿主細胞培養(yǎng)基。任何上述培養(yǎng)基可以根據需要添加激素和/或其它生長因子(如胰島素，運鐵蛋白，或表皮生長因子)，鹽(如氯化鈉，鈣，鎂，和磷酸鹽)，緩沖液(如HEPES)，核苷酸(如腺香和胸芬)，抗生素(如GentamycinTM)，痕量元素(定義為通常以孩i摩爾水平的終濃度出現的無機化合物)，和葡萄糖或等效能源。還可以包括本領域技術人員已知的適當濃度的任何其它必需添加物。培養(yǎng)條件，如溫度，pH等，都是在選定的表達宿主上已用到的那些，并且對本領域技術人員而言也是顯而易見的。使用重組技術時，所述抗體可產生在細胞內，在周質空間中，或直接分泌到培養(yǎng)基中。如果所述抗體是產生在細胞內，首先要通過例如離心或超濾作用除去顆粒狀殘渣(為宿主細胞或裂解的片段)。Cartera歷o/7fec/mo/ogv10:163-167(1992)描述了一種將已分泌到大腸桿菌周質空間中的抗體分離的方法。簡言之，在有乙酸鈉(pH3.5)，EDTA,和苯曱基磺酰氟(PMSF)存在的情況下將細胞團解凍約30分鐘。細胞碎片可以通過離心除去。在抗體分泌至培養(yǎng)基的情況中，通常首先使用諸如Amicon或MilliporePellicon超濾單元等市售蛋白濃縮濾器濃縮這類表達系統的上清。上述任一步驟中可以包括PMSF等蛋白酶抑制劑，以便抑制蛋白水解，還可以包括抗生素，以便防止外來污染物(adventitiouscontaminant)的生長。從所述細胞制備的抗體組合物可以利用，例如，鞋基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、和親和層析等方法純化，優(yōu)選親和層析純化技術。蛋白A類和同種型。蛋白A可以用來純化基于人yl,Y2或丫4重鏈的抗體(Lindmark"a/.,J!/mmw"o/.Me仇62:1-13(1983))。蛋白G被建議用于所有小鼠同種型以及用于人y3(Guss"a/.,嵐50/5:15671575(1986》。親和配體附著的基質最常是瓊脂糖，也可以采用其它基質。機械穩(wěn)定的基質例如控制孔徑的玻璃(controlledporeglass)或聚(苯二乙烯)苯(poly(styrenedivinyl)benzene)與瓊脂糖相比，其流速更快且處理時間更短。當抗體包含Ch3區(qū)時，可以用BakerbondABXTm村脂(J.T.Baker,Phillipsburg，NJ)純化。其它蛋白純化技術，例如離子交換柱分級分離，乙醇沉淀，反相HPLC,硅層析，肝素SEPHAROSETM層析，陽離子或陰離子交換樹月旨(例如聚天冬氨酸柱)層析，層析聚焦，SDS-PAGE,和」琉酸4妄沉淀也可以采用，這取決于所回收的抗體。在任何初步提純步驟之后，在pH大約2.5-4.5之間利用洗脫緩沖液對包含目的抗體與污染物的混合物進行低pH疏水相互作用層析，優(yōu)選地在低鹽濃度下進4于(例如大約0-0.25M鹽)?？贵w偶耳關物抗體可被偶聯至細胞毒性劑例如毒素或放射性同位素。在某些實施方式中，毒素是力o利車霉素、maytansinoid、多拉司他汀、auristatinE與其類似物或衍生物是優(yōu)選的。優(yōu)選的藥物/毒素包括DNA損傷劑、微管聚合或解聚抑制劑與抗代謝物。細胞毒藥劑的優(yōu)選類別包括，例如，酶抑制劑例如二氫葉酸還原酶抑制劑，與胸苷酸合酶抑制劑，DNA嵌入劑，DNA裂解劑、拓樸異構酶抑制劑、蒽環(huán)類抗生族藥物、長春花屬藥物、絲裂霉素素、博來霉素、細胞毒核苦、喋咬族藥物、diynenes、鬼臼霉素與分化誘導物。這些類別的特別有用的成員包括，例如，氨曱喋呤，曱氨喋呤，二氯氨曱喋呤，5-氟尿嘧咬，6-巰基嘌呤，阿糖胞苷，美法侖，環(huán)氧長春堿，洛諾西丁、放線菌素、道諾紅菌素、阿霉素、N-(5,5-二醋氧戊基)阿霉素、嗎啉代阿霉素、1-(2-氯乙基)-1,2-二精脒曱磺酰酰肼、N8-乙?；?、氨基蝶呤甲氨喋呤、esperamicin、絲裂霉素C、絲裂霉素A、放線菌素、博來霉素、洋紅霉素、氨基蝶呤、太利蘇霉素、鬼臼霉素與鬼臼霉素衍生物例如鬼臼亞乙普或鬼臼亞乙普磷酸鹽、長春堿、長春新石威、去乙酰長春酰胺、紫杉酚、泰索帝、視黃酸、丁酸、N8-乙?；?、喜樹堿、加利車霉素、苔蘚4中素、cephalostatins、美登木素、布4立;也l斤4內、maytansinoids例3口DM-1、美登素、美登醇、N-去曱基-4，5-去環(huán)氧基美登醇、C-19-去氯美登醇、C-20-羥美登醇、C-20-去曱氧基美登醇、C-9-SH美登醇、C-14-烷氧基曱基美登醇、C-14-羥基或乙酰氧曱基美登醇、C-15-羥基/乙酰氧美登醇、C-15-曱氧基美登醇、C-l8-N-去曱基美登醇與4，5-脫氧美登醇、auristatins例如auristatinE、M、PHE與PE;dolostatins例i口dolostatinA、dolostatinB、dolostatinC、dolostatinD、dolostatinE、(20-epi與1l-epi)、dolostatinG、dolostatinH、dolostatinI、dolostatin1、dolostatin2、dolostatin3、dolostatin4、dolostatin5、dolostatin6、dolostatin7、dolostatin8、dolostatin9、dolostatin10、deo-dolostatin10、dolostatin11、dolostatin12、dolostatin13、dolostatin14、dolostatin15、dolostatin16、dolostatin17、與dolostatin18;cephalostatins例^口cephalostatin1、cephalostatin2、cephalostatin3、cephalostatin4、cephalostatin5、cephalostatin6、cephalostatin7、25'-epi-cephalostatin7、20-epi-cephalostatin7、cephalostatin8、cephalostatin9、cephalostatin10、cephalostatin11、cephalostatin12、cephalostatin13、cephalostatin14、cephalostatin15、cephalostatin16、cephalostatin17、cephalostatin18、與cephalostatin19。Maytansinoids是有絲分裂抑制劑，通過抑制微管蛋白聚合而起作用。美登素最初從東非灌木齒葉美登木分離出來(美國專利3，896,111)。隨后，人們發(fā)現某些微生物也產生maytansinoids,例如美登醇與C-3美登醇酯(美國專利4,151,042)。在美國專利4,137,230;4,248,870;4，256，746;4,260,608;4,265,814;4,294,757;4,307,016;4,308,268;4，308，269;4,309,428;4,313,946;4,315,929;4317,821;4,322,348;4,331,598;4,361,650;4,364,866;4,424,219;4,450,254;4,362,663;與4,371,533中披露了合成美登醇與其衍生物和類似物，在此特別地引入作為參考。美登素與maytansinoids已與特定地與腫瘤細胞抗原結合的抗體偶聯。包含maytansinoids的免疫偶聯物及其治療用途在例如美國專利5,208,020，5，416，064與歐洲專利EP0425235B1中披露，其公開在此特別地引入作為參考。Liuetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623(1996)描述了包含指定為DM1的maytansinoid，該maytansinoid與針對人結腸直腸癌癥的單克隆抗體C242連接。偶聯物被發(fā)現對培養(yǎng)的結腸癌細胞具有高度細胞毒性，并且在體內月中瘤生長試驗中顯示抗腫瘤活性。Charietal.CancerResearch52:127-131(1992)描述了免疫偶聯物，其中maytansinoid通過二硫鍵接頭與鼠抗體A7偶聯，該鼠抗體A7與人結腸癌細胞系上的抗原結合，或者maytansinoid偶聯至另一鼠單克隆抗體TA.l，該抗體與HER-2/neu癌基因結合。本領域已知許多連接基團用于制備抗體maytansinoid偶聯物，包括，例如，在美國專利5，208，020或EP專利0425235B1，與Charietal.CancerResearch52:127-131(1992)中所披露的。連接基團包括如上述專利中所披露的二硫化物基團、硫醚基團、對酸敏感的基團、對光敏感的基團、對肽酶敏感的基團、或對酯酶敏感的基團，優(yōu)選二硫化物與硫醚基團。可以使用各種雙功能蛋白偶聯劑制備抗體與maytansinoid的偶聯物，例如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸鹽(SPDP)、琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-l-羧酸鹽、iminothiolane(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(例如二曱基己二酰亞氨酯HCL),活性酯(例如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、二疊氮化物(例如二-(p-疊氮苯甲?；?已二胺)、二重氮衍生物(例如二-(p-重氮苯甲?；?-乙二胺)、二異氰酸鹽(例如曱苯2，6-二異氰酸鹽)、與二-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。特別優(yōu)選的偶聯劑包括N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸鹽(SPDP)(Carlssonetal"Biochem.J.173:723-737[1978])與N畫琥珀酰亞胺基-4-(2-吡咬基巰基)戊酸鹽(SPP),以提供二石克鍵。取決于連接類型，4妄頭可以附著于maytansinoid分子的各個位置。例如，利用常規(guī)的偶聯技術，用羥基反應可以形成酯鍵。反應可以發(fā)生在有羥基的C-3位置，C-14位置用羥曱基修飾，C-15位置用羥基修飾，C-20位置具有羥基。在優(yōu)選實施方式中，在美登醇或美登醇類似物的C-3位置形成連接*辦另一個感興趣的免疫偶聯物包含偶聯至一或多個加利車霉素分子的CD20結合抗體。加利車霉素族抗生素能夠在皮摩爾濃度以下產生雙鏈DNA斷裂。制備加利車霉素族的偶聯物參見美國專利5,712,374,5,714,586，5,739,116，5,767285,5，770，701,5,770,710，5,773,001，5，877,296(均屬于AmericanCyanamidCompany)。可被4吏用的加利車霉素的結構類似物包括，但不局限于，Yl'，a2!，a3'，N-乙酰基Yl!，PSAG與211(Hinmanetal.CancerResearch53:3336-3342(1993),Lodeetal.CancerResearch58:2925-2928(1998)與前面^_到過的屬于AmericanCyanamid的美國專利)。另一個可以偶聯至抗體的抗腫瘤藥物是QFA，其為抗葉酸物。加利車霉素與QFA均具有胞內作用位點，并且不容易越過質膜。因此，通過抗體介導的內在化所導致的這些藥劑的細胞攝取大大增強他們的細胞毒效果。放射性同位素抗體可以包含高度放射性原子以選擇性破壞腫瘤。已有各種放射性同位素用于生產放射性偶聯的抗CD20抗體。實例包括At211、I131、I125、Y9Q、Re186、Re188、Sm'53、Bi212、P32、Pb212與Lu的放射性同位素。當偶聯物被用于診斷時，其可包含放射性原子用于閃爍法研究，例如tc"m或I123,或包含自旋標記物用于核爿磁共振(NMR)成像(又名磁共振成象，mri)，例如還是石輿-123,石典-131,銦-111，氟-19,碳-13，氮-15，氧-17，釓，錳或鐵。放射性或其它標記可以已知方式摻入偶聯物。例如，肽可以生物合成或可以利用合適的氨基酸前體經由化學氨基酸合成來合成，化學氨基酸合成涉及例如用氟-19代替氫。標記例如tc，或I'23、Re186、Re咖與In川可以通過肽中的半胱氨酸殘基附著。釔-卯可以通過賴氨酸殘基附著。IODOGEN方法(Frakeretal(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57)可用于摻入石典-123。"MonoclonalAntibodiesinImmunoscintigraphy"(Chatal,CRCPress1989)詳細描述了其它方法。可以使用各種雙功能蛋白偶聯劑制備抗體與細胞毒性劑的偶聯物，例如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸鹽(SPDP)、琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-l-羧酸鹽、iminothiolane(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(例如二曱基己二酰亞氨酯HCL),活性酯(例如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、二疊氮化物(例如二-(p-疊氮苯曱酰基)已二胺)、二重氮衍生物(例如二-(p-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二異氰酸鹽(例如甲苯2，6-二異氰酸鹽)、與二-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2，4-二硝基笨)。例如，可以如Vitettaetal.Science238:1098(1987)描述制備蓖麻毒免疫毒素。碳-14-標記的1-異硫氰酸千基-3-曱基二乙烯-三胺五乙酸(MX-DTPA)是示例性的螯合劑，用來將放射性核苷酸結合至抗體。見WO94/11026。接頭可以是"可斷裂的接頭"，以促進細胞毒類藥物在細胞中的釋放。例如，可使用酸不穩(wěn)定的接頭、肽酶敏感的接頭、光敏感的接頭、二曱基接頭或包含二硫化物的接頭(Charietal.CancerResearch52:127-131(1992);美國專利5,208,020)。CD20結合抗體的治療用途本發(fā)明的CD20結合抗體可用于治療多種惡性與非惡性疾病，包括自身免疫病與相關病癥，與CD20陽性癌癥，包括B細胞'淋巴瘤與白血病。骨髓中的干細胞(B細胞祖先)缺乏CD20抗原，允許健康B細胞在治療后再生，并在幾個月之內回復至正常水平。自身免疫病或自身免疫相關病癥包括關節(jié)炎(類風濕性關節(jié)炎，青年類風濕性關節(jié)炎，骨關節(jié)炎，牛皮癬關節(jié)炎)，牛皮癬，皮炎包括異位性皮炎；慢性自身免疫蕁麻疹，多肌炎/皮肌炎，中毒性表皮壞死松解，全身性硬皮病/硬化癥，與炎性腸疾病(inflammatoryboweldisease(IBD》有關的應答(Crobn，s病，潰癡性結腸炎)，呼吸窘迫綜合癥，成人呼吸窘迫綜合癥，腦膜炎，過敏性鼻炎，腦炎，葡萄膜炎，結腸炎，腎小球腎炎，過敏性病癥，濕滲，哞喘，T細胞浸潤有關的病癥和慢性炎癥反應，動脈粥樣硬化，自身免疫性心肌炎，白細胞粘附缺陷，系統性紅斑狼瘡(SLE)，狼瘡(包括腎炎型，非腎型，盤型，脫發(fā)型)，少年發(fā)作的糖尿病(juvenileonsetdiabetes),多發(fā)性硬化，變應性腦脊髓炎，細胞因子與T淋巴細胞介導的與急性和遲發(fā)性過敏反應有關的免疫反應，肺結核，結節(jié)病，肉芽腫病包括韋格內氏肉芽腫病，粒細胞缺乏癥，血管炎，再生障礙性貧血，庫姆斯氏陽性貧血，戴布二氏貧血，免疫性溶血性貧血包括自身免疫性溶血性貧血(AIHA),惡性貧血，純紅細胞發(fā)育不全(PRCA),凝血因子VIII缺乏，曱型血友病，自身免疫性中性白細胞減少，全血細胞減少癥，白血球減少癥，涉及白細胞血細胞滲出的疾病，CNS炎性紊亂，多器官損傷綜合癥，重癥肌無力，抗原抗體復合物介導的疾病，抗腎小球基底膜疾病，抗磷脂抗體綜合癥，過敏性神經炎，Bechet病，Castleman綜合癥，古德帕斯徹氏綜合癥，蘭-伊二氏類重癥肌無力綜合征，雷諾氏綜合癥，斯耶格侖氏綜合癥，斯-約二氏綜合癥，實體器官移植排斥(包括對高位反應性抗體滴度的預處理，IgA在組織沉積，等等)，移植物抗宿主病(GVhD)，天皰瘡樣大皰，天皰瘡(所有的，包括尋常的、葉狀的)，自身免疫性多內分泌腺病，賴特爾氏病(Reiter'sdisease),僵人綜合癥，巨細胞性動脈炎，免疫復合物性腎炎，IgA腎病，IgM多神經病或IgM介導的神經病，特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP),血栓性血小板減少性紫癜(TTP)，自身免疫性血小板減少，睪丸與卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睪丸炎與卵巢炎，原發(fā)性曱狀腺功能減退，自身免疫性內分泌疾病包括自身免疫性曱狀腺炎，慢性曱狀腺炎(橋本氏曱狀腺炎)，亞急性曱狀腺炎，自發(fā)性曱狀腺機能減退，阿狄森氏病，格雷夫斯氏病、自身免疫的多腺綜合癥(或多腺內分泌病綜合癥)，I型糖尿病也稱為胰島素依賴性糖尿病(IDDM)與席漢氏綜合癥，自身免疫性肝炎，淋巴結間質肺炎(HIV)，閉塞性細支氣管炎(非移植)與NSIP，格-巴二氏綜合癥，大血管血管炎(包括風濕性多肌痛與巨細胞(高安氏)動脈炎)，中等血管血管炎(包括川崎病與結節(jié)性多動脈炎)，強直性脊柱炎，貝爾格爾氏病(IgA腎病)，快速進展的腎小球腎炎，原發(fā)性膽汁性肝硬變，Celiacsprue(粘膠質腸病)，冷球蛋白血癥，ALS,冠〗犬動"永病。CD20陽性癌癥是那些包含在細胞表面表達CD20的細胞的異常增殖的癌癥。CD20陽性B細胞腫瘤包括CD20陽性何杰金氏病，包括淋巴細胞占優(yōu)勢的何杰金氏病(LPHD);非何杰金氏淋巴瘤(NHL);濾泡中心細胞(FCC)淋巴瘤；急性淋巴細胞性白血病(ALL);慢性淋巴細胞性白血病(CLL);毛細胞白血病。非何杰金氏淋巴瘤包括低級/濾泡的非何杰金淋巴瘤(NHL)，小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL),中等/濾泡NHL，中等擴散NHL，高級成免疫細胞的(highgradeimmuoblastic)NHL,高級成淋巴細胞的NHL,高級小非核裂纟田月包(highgradesmallnon-cleavedcell)NHL,bulkydiseaseNHL,類漿細月包淋巴細胞性淋巴瘤，套細胞淋巴瘤，AIDS相關的淋巴瘤與瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥。也涉及這些癌癥復發(fā)的治療。LPHD是一類何杰金氏病，盡管用放射或化學療法治療仍傾向經常復發(fā)，其特征在于CD20陽性的惡性細胞。CLL是四種主要類型的白血病之一。作為稱為淋巴細胞的成熟B細胞的癌癥，CLL表現為細胞在血液、骨髓與淋巴組織中的進行性堆積。在具體的實施方式中，人源化CD20結合抗體與其功能性片段被用于治療非何杰金氏淋巴瘤(NHL),淋巴細胞占優(yōu)勢的何杰金氏病(LPHD)，小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL),慢性淋巴細胞性白血病，類風濕性關節(jié)炎與青年類風濕性關節(jié)炎，系統性紅斑狼瘡(SLE)包括狼瘡腎炎，韋格內氏病，炎癥性腸病，特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)，血栓性血小板減少性紫癜(TTP),自身免疫性血小板減少，多發(fā)性硬化，牛皮癬，IgA腎病，IgM多神經病，重癥肌無力，血管炎，糖尿病，雷諾氏癥，斯耶格侖氏綜合癥與腎小球腎炎。人源化CD20結合抗體或其功能性片段可用在對，例如，復發(fā)或難治的低級或濾泡CD20陽性B細胞NHL的單一藥劑治療中，或者可以在多種藥物療法中與其它藥物聯合對病人給藥。無痛淋巴瘤是一緩慢增長、不可治愈的疾病，其中一般的病人存活六到十年之間，經歷多個癥狀緩解與復發(fā)周期。在一個實施方式中，人源化CD20結合抗體或其功能性片段被用來治療無痛NHL。評估胂瘤治療效力或成績的參數對于對該恰當疾病熟悉的醫(yī)師來說是已知的。通常，熟練醫(yī)師將試圖減少該特定疾病的體征和癥狀。參數可以包括疾病進行的中值時間、癥狀緩解時間及病情平穩(wěn)。以下參考文獻描述了淋巴瘤與CLL,其診斷、治療和用于測量治療效力的標準醫(yī)學程序。CanellosGP，Lister,TA,SklarJL:rAeW.B.SaundersCompany,Philadelphia,1998;vanBesienKandCabanillas,F:ClinicalManifestations,StagingandTreatmentofNon-Hodgkin'sLymphoma,第70章,pp1293-1338，在//ema/o/o(gy,5asz.c尸n'"c^/es/Vacf/ce，3rded.Hoffmanetal.(editors).ChurchillLivingstone,Philadelphia,2000中；和Rai,KandPatel,D:ChronicLymphocyticLeukemia,第72章,pp1350-1362,在//emafo/ogy'jBos/c尸n'wcii^/es尸rac"ce，3rded.Hoffmanetal,(editors).ChurchillLivingstone,Philadelphia,2000.評估治療自身免疫或自身免疫相關疾病效力或成績的參數對于在該恰當疾病領域熟練的醫(yī)師來說是已知的。通常，熟練醫(yī)師將試圖減少該特定疾病的體征和癥狀。以下舉例^兌明。在一個實施方式中，本發(fā)明的抗體用于治療類風濕性關節(jié)炎。類風濕性關節(jié)炎的特征在于多關節(jié)炎癥、軟骨損耗與骨侵蝕，導致關節(jié)破壞，并且最終減低關節(jié)功能。另外，由于RA是全身疾病，其可對其它組織例如肺、眼與骨髓產生作用。在患RA超過IO年的病人中不到50%能繼續(xù)進行日常工作或生活?？贵w可以在早期RA(即未用氨甲喋呤(MTX)治療的)病人中作為第一線治療使用，可作為單一治療藥物使用，或者與例如MTX或環(huán)磷酰胺聯合4吏用?；蛘?，抗體可以在治療DMARD和/或MTX難治的病人中作為第二線治療藥物使用，可作為單一治療藥物使用，或者與例如MTX聯合使用。人源化CD20結合抗體在預防和控制關節(jié)損害、延緩結構破壞、降低與RA中炎癥相關的疼痛中有用，并且通常在中度至嚴重RA中減少體征和癥狀。可以在用其它用于治療RA的藥物治療之前、之后或過程中用人源化CD20抗體治療RA病人(見下面的聯合治療)。在一個實施方式中，先前曾用具有減輕疾病效果的抗風濕藥治療失敗和/或對僅用氨曱喋呤治療反應不足的病人用本發(fā)明的人源化CD20結合抗體治療。在這一治療的實施方式中，對病人實施17天的治療方案，其中僅接受人源化CD20結合抗體(在第1與第15天，lgiv輸注)；CD20結合抗體加環(huán)磷酰胺(在第3與第17天，750mgiv輸注)；或者CD20結合抗體加氨曱喋呤。評價RA治療效力的一個方法是以美國風濕病學學院(ACR)標準為基礎，該標準測量在關節(jié)觸痛與肺脹上改善的百分比，同時測量其它內容。與未用抗體治療(例如治療前基線)或用安慰劑治療相比較，RA病人可被評分為，例如ACR20(改善20。/。)。評價抗體治療效力的其它途徑包括X線評分，例如SharpX線評分，該評分被用來對結構石皮壞例如骨侵蝕與關節(jié)間隙變窄評分。在治療期間或之后，也可以健康評估調查表[HAQ]評分、AIMS評分、SF36為基礎，評價病人殘疾的預防或改善。ACR20標準可以包括在觸痛(疼痛)關節(jié)計數與腫脹關節(jié)計數上改善20%,加上在如下5個附加測量標準中至少3個改善20%:用視覺模擬尺度(VAS)評估病人疼痛，病人對疾病活動性的綜合評估(VAS)，醫(yī)師對疾病活動性的綜合評估(VAS)病人通過健康評估調查表對殘疾的自我評估，和急性期反應物，CRP或ESR。ACR50與70類似地進行定義。優(yōu)選地，給予病人有效量的本發(fā)明的CD20結合抗體，以達到評分為至少ACR20，優(yōu)選地至少ACR30，更優(yōu)選地至少ACR50,甚至更優(yōu)選地至少ACR70,優(yōu)選地至少ACR75和更高。牛皮癬關節(jié)炎具有獨一無二和特殊的放射線照相特征。對于牛皮癬關節(jié)炎而言，關節(jié)侵蝕與關節(jié)間隙變窄也可以用Sharp記分評估。本發(fā)明的人源化CD20結合抗體可用于防止關節(jié)損害和減少該紊亂的疾病體征和癥狀。本發(fā)明的另一方面為通過給予患SLE的患者治療有效量的本發(fā)明的人源化CD20結合抗體，治療狼瘡或SLE的方法。SLEDAI評分提供疾病活動性的數值定量。SLEDAI是24個已知與疾病活動性相關的臨床與實驗室參數的加權指數，數值范圍為0-103。見BryanGescuk&JohnDavis,"Noveltherapeuticagentforsystemiclupuserythematosus，，在CurrentOpinioninRheumatology2002,14:515-521中。針對雙鏈DNA的抗體被認為導致腎性潮紅(renalflares)及其它狼皰表現?？梢詫M行抗體治療的病人隨時間監(jiān)測腎性潮紅，其被定義為血清肌酸酐、尿蛋白質或血尿的顯著的、可再現的增加?；蛘呋蛄硗猓梢员O(jiān)測病人抗核抗體與抗雙鏈DNA抗體的水平。對于SLE的治療包括高劑量皮質類固醇和/或環(huán)磷酰胺(HDCC)。脊推關節(jié)病是關節(jié)的一組疾病，包括強直性脊柱炎、牛皮癬關節(jié)炎與克朗氏病(crohn'sdisease),治療成果可以用經驗證實的病人與醫(yī)師綜合評估測量工具來判定。各種藥物被用來治療牛皮癬，治療與疾病嚴重程度直接有關。具有較輕型牛皮褲的病人一般用局部治療，例如局部類固醇、蒽林、卡泊三烯、氯氟美松、與他佐羅汀，以控制病癥，而具有中度與重度牛皮癬的病人則更可能使用系統的(氨曱喋呤、類視黃醇、環(huán)孢菌素、PUVA與UVB)療法。也使用焦油(Tars)。這些療法的缺點在于安全性考慮、耗時或治療過程不便利。此外，有些要求昂貴的設備與在辦公室環(huán)境下設定專用空間。系統藥物可產生嚴重的副作用，包括高血壓、高脂血癥、骨髓抑制、肝臟疾病、腎病與胃腸不適。并且，使用光照療法可以增加皮膚癌的發(fā)病率。除與使用局部治療相關的不便與不適之外，光照療法和系統治療要求不斷地使病人在治療與停止治療之間反復，并由于其副作用需要監(jiān)測終生照射量。牛皮褲治療效力通過監(jiān)測與基礎狀態(tài)相比較疾病臨床征象與癥狀的改變而評估，包括醫(yī)師綜合評估(PGA)改變與牛皮癬面積和嚴重性指數(PASI)評分、牛皮痺癥狀評估(PSA)。可在整個治療過程重周期性地測量病人的視覺模擬等級(Visualanalogscale),視覺模擬等級被用來表示特定時間點所感受到的癢感程度。病人在首次輸注治療性抗體時可發(fā)生輸注反應或輸注相關癥狀。這些癥狀在嚴重程度方面有差異，并且通常在藥物介入后是可逆的。這些癥狀包括但不局限于流感樣發(fā)熱、寒戰(zhàn)/強直、惡心、蕁麻滲、頭痛、支氣管痙攣、血管性水腫。對本發(fā)明的疾病治療方法來說，可能需要使輸注反應達到最小。因此，本發(fā)明的另一方面是通過給予人源化CD20結合抗體而披露的治療疾病的方法，其中抗體同用Rituxan㊣治療比較起來具有降低的或不具有依賴于補體的細胞毒性，并且導致與輸注相關的癥狀的減少。在一個實施方式中，人源化CD20結合抗體是2H7.v116。浙量取決于所要治療的適應癥以及本領域熟練醫(yī)師所熟悉的與規(guī)定劑量有關的因素，本發(fā)明的抗體將以有效治療適應癥并使毒性與副作用減至最小的劑量被給藥。對于治療CD20陽性癌癥或自身免疫病來說，治療有效的劑量在大約250mg/n^至大約400mg/m2或500mg/n^范圍內，優(yōu)選地大約250-375mg/m2。在一個實施方式中，劑量范圍是275-375mg/m2。在治療CD20陽性B細胞腫瘤的一個實施方式中，抗體以300-375mg/m2的范圍給藥。對于治療患B細胞淋巴瘤例如非何杰金氏淋巴瘤的病人而言，在特定的實施方式中，本發(fā)明的抗CD20抗體與人源化抗CD20抗體將以10mg/kg或375mg/n^劑量給予人類患者。對于治療NHL來說，一個給藥法是在治療第一周以10mg/kg劑量給予一次劑量的抗體組合物，繼之以二周間隔，然后給予第二次劑量的相同量的抗體。通常，NHL病人在一年內接受一次象這樣的治療，但是一旦淋巴瘤復發(fā)，象這樣的治療可以被重復。在另一個給藥法中，治療低級NHL的病人接受四周一種型式的人源化2H7，優(yōu)選地vl6(375mg/m2每周)，隨后在第五周進4于三個附加療程的抗體加標準CHOP(環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿和強的松)或CVP(環(huán)磷酰胺、長春新堿、強的松)化療，其每三周給藥，共三個周期。對于治療類風濕性關節(jié)炎而言，在一個實施方式中，人源化抗體的劑量范圍是125mg/m、相當于大約200mg/每劑)至600mg/m2，分成兩劑，例如第一劑200mg在第一天給藥，繼之以在第15天給予第二劑量200mg。在不同實施方式中，劑量是250mg/每劑、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg。在治療疾病時，如在該疾病領域熟練的醫(yī)師所決定的，本發(fā)明的CD20結合抗體可以長期或者間歇地給予病人。靜脈內輸注或皮下給藥可使病人感覺到不利反應例如發(fā)熱、寒戰(zhàn)、燒灼感、無力和頭痛。為緩和或使這樣的不利反應達到最小，病人可接受抗體的初始調制劑量(initialconditioningdose)，繼之以治療劑量。調制劑量可以比治療劑量低，以調節(jié)病人使其耐受較高劑量。發(fā)秀途徑根據已知方法將CD20結合抗體給予人類病人，例如通過靜脈內給藥，例如以丸劑(bolus)或通過在一段時期內的連續(xù)輸注，經過皮下、肌肉、腹膜內、腦脊膜內、關節(jié)內、滑膜內、鞘內、或吸入途徑，通常經過靜脈內或皮下給藥。在一個實施方式中，人源化2H7抗體經過靜脈內輸注給藥，以0.9%氯化鈉溶液作為輸注載體。在治療上面描述的B細胞腫瘤時，病人可以用本發(fā)明的CD20結合抗體與一或多種治療劑例如化療劑一起用多藥物療法加以治療。CD20結合抗體可以與化療劑同時、序貫地或者交替地給藥，或在用其它治療不反應之后進行聯合治療。淋巴瘤治療的標準化學療法包括環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、美法侖、與米托蒽醌加美法侖。CHOP是治療非何杰金氏淋巴瘤最常見的化學療法。以下是用于CHOP療法的藥物環(huán)磷酰胺(商品名Cytoxan,neosar);阿霉素(亞德里亞霉素/羥基亞德里亞霉素)；長春新堿(Oncovin);與氫化潑尼松(有時稱為Deltasone或Orasone)。在一個具體的實施方式中，CD20結合抗體與下列化療劑中的一個或多個聯合給藥至需要其的病人阿霉素、環(huán)磷酰胺、長春新堿與氬化潑尼松。在特定的實施方式中，患淋巴瘤(例如非何杰金氏淋巴瘤)的病人用本發(fā)明的抗CD20抗體與CHOP(環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新石威和強的+>)療法聯合治療。在另一個實施方式中，癌癥病人可以用本發(fā)明的人源化CD20結合抗體與CVP(環(huán)磷酰胺、長春新堿與強的松)化療聯合治療。在特定的實施方式中，患CD20陽性NHL的病人用人源化2H7.vl6與CVP結合進行治療。在治療CLL的特定實施方式中，CD20結合抗體與用氟達拉濱與環(huán)磷酰胺中的一個或兩個進行的化學療法聯合給藥。在治療上面描述的自身免疫病或自身免疫相關病癥中，病人可以用本發(fā)明的CD20結合抗體與第二治療劑，例如免疫抑制劑，例如在多藥物療法中聯合治療。CD20結合抗體可以與免疫抑制劑同時、序貫地或者交替地給藥，或在不反應時與其它療法聯用。免疫抑制劑可以以現有技術中所披露的相同或較少劑量給藥。優(yōu)選的附加免疫抑制劑將取決于許多因素，包括所治療的疾病種類以及病人的病史。在此用于附加治療的"免疫抑制劑，，指抑制或掩蔽病人的免疫系統的物質。象這樣的藥劑將包括抑制細胞因子生產、下調或抑制自身抗原表達、或掩蔽MHC抗原的物質。象這樣的藥劑的例子包括類固醇例如糖皮質激素，例如強的松、曱基強的松龍、與地塞米松、2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(見美國專利4,665,077)、咪唑^/票呤(或環(huán)磷酰胺，如果有對咪唑^/票呤的副反應)；溴隱亭；戊二醛(掩蔽MHC抗原，如美國專利4,120,649所描述)；針對MHC抗原與MHC片段的抗特應抗體；環(huán)孢菌素A;細胞因子或細胞因子受體拮抗劑包括抗干擾素Y，P，或a抗體；抗胂瘤壞死因子a抗體；抗腫瘤壞死因子p抗體；抗白介素-2抗體與抗IL-2受體抗體；抗L3T4抗體；異源的抗'淋巴細胞5求蛋白；泛T抗體，優(yōu)選地抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；包含LFA-3結合結構域的可溶性肽(W090/08187,公開日7/26/90);鏈激酶；TGF-卩；鏈道酶；來自宿主的RNA或DNA;FK506;RS-61443;脫氧精胍菌素；雷帕霉素；T細胞受體(美國專利5，114,721);T細胞受體片段(Offneretal.，Science251:430-432(1991);WO90/11294;與WO91/01133);與T細胞受體抗體(EP340,109)例如T10B9。為了治療類風濕性關節(jié)炎，病人可以用本發(fā)明的CD20抗體結合下述藥物中的任何一個或更多進行治療DMARDS(減輕病癥的抗風濕病藥物(例如氨甲喋呤)，NSAI或NSAID(非類固醇類抗炎藥物)，HUMIRA(adalimumab;AbbottLaboratories),ARAVA(來氟米特)，REMICADE(infliximab;CentocorInc.ofMalvern,Pa)，ENBREL(etanercept;Immunex，WA):COX-2承卩制劑。通常用于RA的DMARD是hydroxycloroquine、sulfasalazine、氨曱喋呤、來氟米特、依那西普、英夫利昔單抗、咪唑硫嘌呤、D-青霉胺、Gold(口服)、Gold(肌肉)、二曱胺四環(huán)素、環(huán)孢菌素、葡萄球菌蛋白A免疫吸附。阿達木單抗(Adalimumab)是與TNFa結合的人單克隆抗體。英夫利昔單抗(Infliximab)是與TNFa結合的嵌合單克隆抗體。依那西普(etanercept)是一"免疫粘附素，，融合蛋白，包括人75kD(p75)腫瘤壞死因子受體(TNFR)的細胞外配體結合部分連接至人IgGl的Fc部分。對于RA的常規(guī)治療，參見例如，"GuidelinesForthemanagementofrheumatoidarthritis，，,arthritis&Rheumatism46(2):328-346(2002年2月)。在一特定的實施方式中，RA病人用本發(fā)明的CD20抗體聯合氨曱喋呤(MTX)治療。示例性的MTX劑量為大約7.5-25mg/kg/周。MTX可口月良和皮下給藥。對于治療強直性脊柱炎、牛皮癬關節(jié)炎與克朗氏病而言，病人可以用本發(fā)明的CD20結合抗體與例如Remicade(infliximab;來自CentocorInc.,Malvem，Pa.)，ENBREL(etanercept;Immunex,WA)聯合治療。對于SLE的治療包括高劑量皮質類固醇和/或環(huán)磷酰胺(HDCC)。對于治療牛皮癬而言，可以給予病人CD20結合抗體結合局部治療，例如局部類固醇、蒽林、卡泊三烯、氯氟美松與他佐羅汀，或結合氨甲喋呤、類視黃醇、環(huán)孢菌素、PUVA與UVB治療。在一個實施方式中，牛皮癬病人用CD20結合抗體順序處理或者同時用環(huán)孢菌素處理。藥物制劑根據本發(fā)明使用的CD20結合抗體的治療制劑通過以凍干制劑或水溶液的形式混合具有所需純度的抗體和任選藥學上可接受的載體、賦形劑或穂-定劑(Remington'sPharmaceuticalSciences16thedition,Osol,A.Ed.(1980))用于儲存而制備。可接受的載體、賦形劑、穩(wěn)定劑在所用劑量及濃度對受體無毒性，并包括緩沖劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽，及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和曱硫氨酸；防腐劑(例如十八烷基二曱基千基氯化銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨，苯索氯銨；酚、丁醇或苯曱醇；烷基對羥基苯曱酸酯如甲基或丙基對羥基苯曱酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間曱酚)；低分子量多肽(少于約IO個殘基)；蛋白質如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它糖包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA;糖類如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬復合物(例如鋅-蛋白復合物)和/或非離子表面活性劑如TWEEN,PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。示例性的抗CD20抗體制劑在W098/56418中描述，在此特別地引入作為參考。另一種制劑是液體多劑量制劑，包含40mg/mL抗CD20抗體、25mM醋酸鹽、150mM海藻糖、0.9%苯曱西孚、0.02。/。pH5.0的聚山梨酸酯20，在2-8。C最短保存期限兩年。另一感興趣的抗CD20制劑包含溶解在9.0mg/mL氯化鈉、7.35mg/mL檸檬酸鈉二水合物、0.7mg/mL聚山梨酸酯80與滅菌注射水中的10mg/mL抗體，pH6.5。另一水性藥物制劑包含大約pH4.8至大約pH5.5、優(yōu)選地pH5.5的10-30mM乙酸鈉、含量大約0.01-0.1%v/v的聚山梨酸酯作為表面活性劑、含量大約2-10°/。w/v的海藻糖與作為防腐劑的苯曱醇(U.S.6,171,586)。適宜于皮下給藥的凍干制劑在WO97/04801中描述。象這樣的凍干制劑可以用合適的稀釋劑重新配制成高蛋白濃度溶液，并且重新配制的制劑可皮下給藥至在此將要^^皮治療的哺乳動物。人源化2H7變體的一個制劑是12-14mg/mL抗體，溶解在10mM組氨酸、6%蔗糖、0.02%聚山梨酸酯20中,pH5.8。在一個具體的實施方式中，2H7變體并且特別地是2H7.vl6，以20mg/mL抗體溶解在10mM組氨酸硫酸酯、60mg/mL蔗糖、0.2mg/mL聚山梨酸酯20與滅菌注射水中，pH5.8的形式配制。制劑在此也可包含特定適應癥所需的多于一種活性化合物，優(yōu)選地是那些具有不對彼此產生不利影響的互補活性的化合物。例如，可能需要進一步提供細胞毒藥劑、化療劑、細胞因子或免疫抑制劑(例如作用于T細胞的藥劑例如環(huán)孢菌素，或作用于結合T細胞的抗體的藥劑例如結合LFA-1的藥劑)。象這樣的其它藥劑的有效量取決于制劑中存在的抗體量、疾病或紊亂或治療的種類、以及上面所討論的其它因素。這些通常以相同劑量、和經由在此所描述的給藥途徑、或在此以前所使用的劑量的大約1-99%而使用?；钚猿煞忠部梢栽谀z體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球粒、微乳劑、納米顆粒與納米膠嚢)中，或者在粗乳狀液中捕捉在微膠嚢中，所述微膠嚢例如通過凝聚技術或界面聚合作用制備，例如，分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢與聚異丁烯酸曱酯微膠嚢。這一技術在Remington'sPharmaceuticalSciences,16thedition,Oslo,A.,Ed.,(1980)中披露。可以制備緩釋制劑。合適的緩釋制劑的例子包括含拮抗劑的固態(tài)疏水聚合物的半滲透性基質，其中基質是以成形物品的形式，例如薄膜或微嚢劑。緩釋基質的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-異丁烯酸)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利3，773，919)、L-谷氨酸與乙基-L-谷氨酸的共聚物、非可降解乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物例如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物與醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球粒)、與聚-D-(-)-3-羥丁酸。用于體內給藥的制劑必須是無菌的。這通過經由無菌過濾膜過濾而很容易地完成。制品和試劑盒本發(fā)明的另一實施方式是一種制品，包含對治療自身免疫病與相關病癥和CD20陽性癌癥例如非何杰金氏淋巴瘤有用的物質。制品包含容器和標簽或包裝說明書，該標簽或包裝說明書在容器上或與容器相關。合適的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器等等。容器可能是由各種材料形成，例如玻璃或塑料。容器容納對治療該病癥有效的組合物，并且可具有無菌進入孔(例如容器可以是具有可被皮下注射針穿透的塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中至少一種活化劑是本發(fā)明的CD20結合抗體。標簽或包裝說明書指示該組合物用于治療該特定病癥。標簽或包裝說明書將進一步包含將抗體組合物給藥病人的指示。包裝說明書指通常包括在治療產品商業(yè)包裝中的指示，該指示包含有關適應癥、用法、劑量、給藥、禁忌癥和/或關于使用象這樣的治療產品的警告的信息。在一個實施方式中，包裝說明書指示該組合物用于治療非何杰金氏'淋巴瘤。另外，該制品可進一步包含第二容器，該容器包含藥學上可接受的緩沖液，例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏液與右旋糖溶液。其可進一步包括從商業(yè)與用戶角度需要的其它材料，包括其它緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭與注射器。也提供用于各種用途的試劑盒，例如用于B細胞殺傷試驗、作為細胞程序死亡試驗的正對照、用于從細胞純化或免疫沉淀CD20。為了分離和純化CD20,試劑盒可包含偶聯至珠(例如瓊脂糖珠)的抗CD20抗體?？商峁┰噭┖校撛噭┖邪糜隗w外，例如在ELISA或者蛋白質印跡中檢測與定量CD20的抗體。如同制品一樣，試劑盒包含容器，和在容器上或與容器相關的標簽或包裝說明書。容器容納包含本發(fā)明的至少一個抗CD20抗體的組合物。可包括額外的容器，該容器包含例如稀釋劑和緩沖液、對照抗體。標簽或包裝說明書可提供對組合物的描述，以及對預期體外或診斷用途的指示。獼猴CD20本發(fā)明還提供分離的核酸，該核酸包含如圖19所示的獼猴CD20的核苷酸序列SEQIDNO.:24。在一個實施方式中，核酸是cDNA。在一個實施達載體中的SEQIDNO.:24的核苷酸序列可操作地連接至表達控制序列，例如啟動子、或啟動子與增強子。表達控制序列可以是通常與獼猴CD20基因相關的天然序列，或者是對該基因異源的序列。還提供分離的多肽，該多肽包含獼猴CD20的氨基酸順序[SEQIDNO.25;圖19和20]，以及包含獼浙吳CD20核酸的宿主細胞。在一個方面，宿主細胞是真核細胞，例如CHO細胞。也考慮包含獼猴CD20氨基酸序列或序列片段的融合蛋白。實驗實施例實施例12H7抗CD20鼠單克隆抗體的人源化鼠抗人CD20抗體2H7(在這里也稱為m2H7，m指鼠的)的人源化在一系列定點誘變步驟中進行。鼠2H7抗體可變區(qū)序列和小鼠V與人C的嵌合2H7已被描述，見例如美國專利5,846，818與6,204,023。通過將鼠2H7可變區(qū)的氨基酸序列(4皮露在U.S.5，846,818中)與已知抗體的序列(Kabatetal.，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,Ed.5.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD(1991))進行比較，而鑒別2H7的CDR殘基。基于序列高變性(Kabatetal.，上文)定義輕與重鏈的CDR區(qū)域，并分別顯示于圖1A與圖1B。利用合成寡核苷酸(表1),用定點誘變(Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.82:488-492(1985))將所有六個鼠2H7CDR區(qū)域引入包含在質粒pVX4上包含的相應于共有序列VkI、VHlII(vlk亞群I、vh亞群III)的完整人Fab框架(圖2)。噬菌粒pVX4(圖2)被用于誘變以及用于F(ab)s在大腸桿菌中的表達。pVX4以pb0475(Cunninghametal.，Science243:1330-1336(1989))的衍生物、噬菌粒pb0720為基礎，包含一DNA片段，該片段編碼人源化的共有k亞群I輕鏈(VLKl-CL)和人源化的共有亞群III重鏈VHIII-CH1抗IFN-a(干擾素-a)抗體。pVX4還具有堿性磷酸酶啟動子和Shine-Dalgamo序歹。，兩者均來源于另一以前描述過的以pUC119為基礎的質粒pAK2(Carteretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285(1992))。在編碼F(ab)輕與重鏈DNA之間引入唯一的Spel限制性位點?？笽FN-a重與輕鏈中的前23個氨基酸是StII分泌信號序列(Changetal.,Gene55:189-196(1987))。為了構建2H7的CDR交換型式(CDR-swapversion)(2H7.v2)，在包含脫氧尿苷的pVX4模板上進行定點誘變；抗IFN-a的所有六個CDR都換成小鼠2H7CDR。所得到的分子稱為人源化的2H72型(2H7.v2)或2H7的"CDR交換型式，，；其具有圖1A與1B所示的帶有共有人FR殘基的m2H7CDR殘基。人源化的2H7.v2被用于進一步人源化。表1顯示被用來生成重鏈與輕鏈中每一鼠2H7(m2H7)CDR的寡核苦酸序列。例如，CDR-H1寡核苦酸被用來再生成m2H7重鏈CDRl。CDR-H1、CDR-H2與CDR-H3分別指重鏈CDR1、CDR2、與CDR3;類似地，CDR-L1、CDR-L2與CDR-L3指輕鏈CDR中的每一個。CDR-H2中的取代用兩個寡核苷酸，CDR-H2A與CDR-H2B,在兩個步驟中進行。表1用于將鼠2H7CDR的CDR交換構建入pVX4中的人框架的寡核芬酸。在被每一寡核苷酸改變的殘基下劃線。<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>為與人源化的構建物進行比較，使用合成寡核苷酸、經由定點誘變(Kunkel,上文)構建表達嵌合2H7Fab(包含鼠V^和VH結構域，和人d與CH,結構域)的質粒，以將鼠框架殘基引入2H7.v2。所得到的質粒構建物序列示于圖3,該構建物用于表達稱為2H7.v6.8的嵌合Fab。Fab的每一編碼鏈具有如上面為pVX4(圖2)所描述的23個氨基酸的StII分泌信號序列。基于鼠2H7框架殘基與人VKl,VHlII共有框架(圖1A與1B)和先前人源化的抗體(Carteretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285-4289(1992))進行的序列比較，通過定點誘變將幾個框架突變引入2H7.v2Fab構建物。這些突變導致某些人共有框架殘基改變成在鼠2H7框架中發(fā)現的那些殘基，所述改變在那些可能影響CDR構型或抗原接觸的位點發(fā)生。型式3包含Vh(R71V，N73K),型式4包含VH(R71V)，型式5包含VH(R71V，N73K)和Vl(L46P)，型式6包含Vh(R71V,N73K)和Vl(L46P,L47W)。如下述在大腸桿菌中表達與純化m2H7抗體的人源化與嵌合Fab型式。質粒被轉化入大腸桿菌抹XL-1Blue(Stratagene，SanDiego,CA)用于制備雙鏈DNA與單鏈DNA。對于每一變體，使用雙脫氧核苷酸法(Sequenase,,U.S.BiochemicalCorp.)對輕與重鏈進行完全測序。質粒被轉化入MM294的衍生物、大腸桿菌抹16C9，鋪于含5fig/ml羧節(jié)青霉素的LB板上，選擇用于蛋白表達的單一菌落。單個菌落生長在5mlLB-100)ig/ml羧千青霉素上，37°C5-8小時培養(yǎng)。5ml培養(yǎng)物被加至500mlAP5-100|_ig/ml羧節(jié)青霉素中，并允許在4L帶障板的搖瓶中在37C生長16小時。AP5培養(yǎng)基包括1.5g葡萄糖，11.0HycaseSF，0.6g酵母抽提物(經過檢驗的)，0.19g無水MgS04，1.07gNH4Cl，3.73gKCl，1.2gNaCl，120ml1M三乙醇胺，pH7.4,加水至1L,然后通過0.1|LiMSealkeen過濾器無菌過濾。通過在1L離心瓶(Nalgene)中在3000xg離心收獲細胞，并且除去上清液。冰凍1小時后，沉淀小丸被再懸浮在25ml冷的10mMMES-10mMEDTA,pH5.0(緩沖液A)。加入250pl0.1MPMSF(Sigma)以抑制蛋白質水解，并且力口入3.5ml10mg/ml雞蛋白溶菌酶(heneggwhitelysozyme)(Sigma)卡者存液，以幫助細菌細胞壁溶解。冰上輕輕搖動l小時后，樣品在40,000xg離心15分鐘。上清液用緩沖液A加至體積50ml,并且加樣至用緩沖液A平衡的2mlDEAE柱上。然后將流出物(flow-through)上樣至用緩沖液A平衡的G蛋白-瓊脂糖CL-4B(Pharmacia)柱(0.5ml柱床體積)。柱子用10ml緩沖液A洗，用3ml0.3M甘氨酸pH3.0洗脫入1.25mllMTris，pH8.0中。然后用Centricon-30(Amicon)將F(ab)緩沖液更換入PBS,并且濃縮至終容積0.5ml。所有F(.ab)的SDS-PAGE凝膠均進行電泳以保證純度，每個變體的分子量用電噴射質譜法證實。在以細胞為基礎的ELISA結合試驗中(如下所述)，包括嵌合2H7Fab在內的Fab與CD20的結合難以4全測。因此，2H7Fab型式被重新才各式化(reformatted)成全長IgGl抗體，以進行試驗和進一步誘變。通過將嵌合2H7(v6.8)Fab的Vl與Vh結枸域和人源化Fab型式2至型式6亞克隆至先前描述過的用于哺乳動物細胞表達的pRK載體(Gormanetal.,DNAProt.Eng.Tech.2:3(1990)),構建表達全長IgG的質粒。簡要地說，每個Fab構建物用五coiV與消化以切除VL片段，該片段被克隆入質粒pDRl的五co^V/^pI位點(圖4)用于完整輕鏈CVL-cl結構域)的表達。另夕卜，每個Fab構建物用尸vwil與j/al消化以切除Vh片段，該片段被克隆入質粒pDR2的尸vwll/^al位點(圖5)用于完整重鏈(vh-CH,-鉸鏈-CHrCH3結構域)的表達。對于每個IgG變體，通過將表達輕鏈的質粒與表達重鏈的質粒共轉染入用腺病毒轉化的人胚腎細胞系293(Grahametal.,J.Gen,Virol.,36:59-74，(1977))，進行瞬時轉染。簡要地說，在轉染的前一天將293細胞分瓶，并且鋪于含血清的培養(yǎng)基上。第二天，加入以磷酸鈣沉淀制備的雙鏈DNA,繼之以pAdVAntageTMDNA(Promega，Madison,WI)，細胞在37°C孵育過夜。細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在4天之后收獲。用蛋白質A-瓊脂糖CL-4B從培養(yǎng)物上清液純化抗體，然后緩沖液更換入10mM琥珀酸鈉、140mMNaCl，pH6.0,并用Centricon-10(Amicon)濃縮。用定量的氨基酸分析測定蛋白質濃度。為了測量對CD20抗原的相對結合親合力，發(fā)展出以細胞為基礎的ELISA試驗。將人B類淋巴母WIL2-S細胞(ATCCCRL8885,AmericanTypeCultureCollection,Rockville，MD)在補充有2mML-谷氨酰胺、20mMHEPES，pH7.2與10%熱滅活的胎牛血清的RPMI1640中、在濕潤的5%C02培育箱中生長。細胞用含1%FBS的PBS(分析緩沖液)洗，以250-300,000細胞/孔接種于96孔圓底平板上(Nunc,Roskilde，Denmark),向板中加入溶于分析緩沖液的兩倍連續(xù)稀釋的標準液(15.6-1000ng/ml的2H7v6.8嵌合的IgG)與三倍連續(xù)稀釋的樣品(2.7-2000ng/ml)。將平板埋在冰中，孵育45分鐘。為了除去未結合抗體，向孔中加入O.lmL分析緩沖液。將平板離心，除去上清。細胞再用0.2mL分析緩沖液洗兩次。通過向平板中加入過氧化物酶偶聯的山羊抗人Fc抗體(JacksonImmunoResearch，Grove,PA)，檢測與平板結合的抗體。孵育45分鐘后，如以前所述洗細胞。板中加入TMB底物(3,3',5,5'隱四曱基聯苯胺；Kirkegaard&PerryLaboratories,Gaithersburg，MD)。力口入1M磷酸以停止反應。用四參數非線性回歸曲線擬合程序(KaleidaGraph,Synergysoftware,Reading,PA)擬合滴定曲線。測定滴定曲線中點的吸收率(中點-OD)確定標準物的相應濃度。然后測定每個變體在這一中點OD所對應的濃度，標準物濃度被每個變體的濃度除。因此所得數值是每個變體的結合相對于標準的比率。相對親合力(當量濃度)在實驗間的標準偏差通常為+/-10%。如表2所示，與嵌合2H7(v.6.8)相比，CDR交換變體(CDR-swapvariant)(v.2)的結合被極度降低。然而，型式3至6顯示結合改善。為了測定將結合親合力恢復至嵌合2H7的結合親合力所需突變的最小數目，通過定點誘變構建額外的突變與突變組合，以生成變體7至17,如表2中所指示。特別地，這些包括Vh突交A49G、F67A、I69L、N73K和L78A;與VL突變M4L、M33I和F71Y。型式16和17顯示最好的相對結合親合力，在嵌合型式的2倍范圍內，型式16和17之間沒有顯著差異(s.d^+/-10%)。為了使突變數目最少，因此選擇型式16作為人源化形式用于額外表征，該型式僅具有4個由人框架殘基變?yōu)槭罂蚣軞埢耐蛔?表3)。表2.使用以細胞為基礎的ELISA，將人源化的2H7IgG變體和CD20的相對結合親合力與嵌合2H7和CD20的相對結合親合力進行比較。相對結合用嵌合2H7的濃度比等量結合所需變體濃度來表示；因此比值<1指示對變體親合力較弱。相對親合力測定中的標準偏差平均為+/-10%?？勺兘Y構域中的框架取代系根據Kabat的編號系統(Kabatetal.，上文)相對于CDR-交換型式。<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>表3用來在人源化2H7型式16(2H7，vl6)中構建突變VH(A49GR7V，N73K)與ViXL46P)的寡核苷酸序列。帶下劃線的密碼子編碼所指示的氨基酸取代。對于Vh(R71V,N73K)與VL(L46P),寡核苷酸以有意義鏈顯示，因為這些被用于在Fab模板上誘變，而對于VH(A49G)，寡核苦酸以反義鏈顯示，因為該鏈被與pRK(IgG重鏈)模板一起使用。型式16的蛋白質序列示于圖6和圖7。<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>實施例22H7的抗原結合決定簇(互補位)在2H7.vl6或2H7.vl7中進行丙氨酸取代(Cunningham&Wells，Science244:1081-1085(1989)以檢驗抗體的個別側鏈在與CD20結合中的作用。在293細胞中從pDRl與pDR2載體表達IgG變體，純化，并如上述分析相對結合親合力。幾處丙氨酸取代導致WIL-2S細胞上與CD20相對結合的顯著降低(表4)。表4利用以細胞為基礎的ELISA(WIL2-S細胞)測量得到的丙氨酸取代對人源化2H7.vl6的CDR區(qū)域的效應。相對結合用2H7.vl6親本的濃度比等量結合所需的變體濃度來表示，因此比值<1指示變體具有較弱親合力；比值>1指示變體具有較高親合力。相對親合力測定中的標準偏差平均為+/-10%?？勺兘Y構域中的框架取代系根據Kabat的編號系統(Kabatetal.,上文)相對于2H7.vl6。NBD的意思是沒有可檢測的結合。型式45中的兩個數字來自于各自獨立的實驗。<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>實施例32H7CDR區(qū)域內部的附加突變也測試了額外殘基的取代以及通過丙氨酸掃描被鑒定為是重要的CDR位置的取代的結合。幾種變體組合，特別是v.96,似乎比v.l6結合更緊密。表5使用以細胞為基礎的ELISA(WIL2-S細胞)測量在人源化2H7.vl6的CDR區(qū)域中的突變組合與非丙氨酸取代的效應。對CD20的相對結合用2H7.vl6親本的濃度比等量結合所需的變體濃度來表示，因此比值<1指示變體具有較弱親合力；比值>1指示變體具有較高親合力。相對親合力測定中的標準偏差平均為+/-10%?？勺兘Y構域中的框架取代系根據Kabat的編號系統(Kabatetal.，上文)相對于2H7.vl6。<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>實施例4在框架人源化取代位點的突變在人源化期間發(fā)生改變的框架位置中附加殘基的取代也在2H7.vl6背景中被測試。特別地，在Vl(P46)與VH(G49，V71,與K73)中進行既不在鼠2H7親本中也不在人共有框架中存在的可替換的框架取代。這些取代通常導致相對結合的極子的改變(表6)，指示在這些位置的框架殘基中存在一些靈活性。表6在框架取代的以細胞為基礎的(WIL2-S)試驗中的相對結合。用相對于2H7.vl6背景的突變顯示IgG變體。相對結合用2H7.v6.8嵌合體的濃度比等量結合所需的變體濃度來表示，因此比值<1指示變體具有較弱親合力；比值>1指示變體具有較高親合力。相對親合力測定中的標準偏差平均為+/-10%。可變結構域中的框架取代系根據Kabat的編號系統(Kabatetal.，上文)相對于2H7.vl6的。(*)用2H7.vl6作為標準比較物分析的變體；相對值校正至嵌合體的值。<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>(*)用2H7.vl6作為標準比較物分析的變體；相對值校正至嵌合體的值。實施例5具有增強的效應子功能的人源化2H7變體由于2H7可通過補體依賴的細胞毒性(CDC)和抗體依賴的細胞的細胞毒性(ADCC)介導B細胞溶解，我們設法產生具有改善的CDC與ADCC活性的人源化2H7.vl6的變體。其它抗體的Fc區(qū)域內的某些殘基突變也已經被描述(Idusogieetal.，J.Immunol.166:2571-2575(2001)),用于通過增強與補體成分Clq的結合而改善CDC。用于改善ADCC的某些突變也已被描述(Shieldsetal.，J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001);Prestaetal.,Biochem.Soc.Trans.30:487-490(2002))，所述改善是通過增強IgG與激動性Fcy受體的結合、并降低IgG與抑制性FcY受體的結合而達到的。特別地，三種突變已被鑒別具有改善的CDC與ADCC活性如所描述的(Idusogieetal.，上文(2001);Shieldsetal.，上文)，S298A/E333A/K334A(在這里也稱為三重丙氨酸突變體或變體；Fc區(qū)域的編號方式根據EU編號系統；Kabatetal.,上文)。為了增強2H7的CDC與ADCC活性，構建2H7Fc的三重丙氨酸突變體，稱為4D5FcllO(即抗pl85HER2IgGl(S298A/E333A7K334A);Shieldsetal.上文)。編碼抗體4D5Fcl10的質粒p4D5FcllO(Shieldsetal.，上文)用^pal與州>/111消化，Fc片段(包含突變S298A/E333A/K334A)連接入2H7重鏈載體pDR2-vl6的位點，產生pDR2-v31。31型完整重《連的氨基酸序列示于圖8。輕鏈與vl6的輕鏈相同。雖然IgGl抗體的Fc區(qū)域恒定區(qū)在一特定物種內相對保守，仍存在等^f立基因變異(綜述見Lefranc與Lefranc，在"ThehumanIgGsubclasses:molecularanalysisofstructure,fbnction,andregulation"中，pp.43-78,F.Shakib(ed.),PergammonPress,Oxford(1990))。表7Fc區(qū)域的取代對CD20結合的影響。與CD20的相對結合在對框架取代所進行的以細胞為基礎的(WIL2-S)試驗中加以測量。Fc突變(*)用EU編號方式(Kabat,上文)加以指示，并相對于2H7.vl6親本。v.31的Fc區(qū)域中三個丙氨酸改變的組合被稱作"FcllO"。用相對于2H7.vl6背景的突變顯示IgG變體。相對結合用2H7.v6.8嵌合體的濃度比等量結合所需的變體濃度來表示；因此比值<1指示變體的親合力較弱。相對親合力測定中的標準偏差平均為+/-10%。<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>實施例6穩(wěn)定性增強的人源化2H7變體為了開發(fā)出治療性蛋白質，需要選擇在適當制劑緩沖液中，在氧化、脫胺或其它可影響產品質量的過程中保持穩(wěn)定的變體。在2H7.vl6中，幾個殘基被鑒定為不穩(wěn)定性的可能來源Vl(M32)與VH(M34，NIOO)。因此，突變被引入這些位點，用于與vl6進行比較。表8，被設計具有增強的穩(wěn)定性和/或效應子功能的2H7變體在以細胞為基礎的(WIL2-S)試驗中對CD20的相對結合。用相對于2H7.vl6背景的突變顯示IgG變體。相對結合用2H7.v6.8嵌合體的濃度比等量結合所需的變體濃度來表示；因此比值<1指示變體的親合力較弱。相對親合力測定中的標準偏差平均為+/-10%?？勺兘Y構域框架取代相對于2H7.vl6，并根據Kabat的編號系統，Fc突變(*)用EU編號方式(Kabatetal.,上文)指示。(**)用2H7.vl6測量的變體，作為標準比較物；相對值校正至嵌合體的值。基于先前報導過的突變(Idusogieetal.(2000);Idusogieetal.(2001);Shieldsetal.(2001))，附加的Fc突變與穩(wěn)定性或親合力增強的突變結合起來，以改變或增強效應子功能。這些改變包括實施例中所描述的S298、E333A、K334A;K322A，以降低CDC活性；D265A,以降低ADCC活性；K326A或K326W，以增強CDC活性；和E356D/M358L，以測試Fc區(qū)域異型改變(allotypicchange)的效果。這些突變均不導致CD20結合親合力的顯著變化。<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>(**)用2H7.vl6測量作為比較物的變體相對結合值校正至嵌合體的值為了測試穩(wěn)定性突變對蛋白質降解率的影響，2H7.vl6與2H7.v73以12-14mg/mL配制在10mM組氨酸、6%蔗糖、0.02%聚山梨酸酯20，pH5.8中，在40。C孵育16天。所孵育的樣品然后用離子交換層析分析電荷變體的改變、用大小排阻層析分析聚合與斷裂、通過測試以細胞為基礎的(WIL2-S)試驗分析相對結合。結果(圖9)顯示，與2H7v.l6相比，2H7v.73具有較高穩(wěn)定性，這是通過在增加穩(wěn)定性的條件下離子交換層析中主峰級分的丟失而檢測的。在聚合、斷裂或結合親合力上未見明顯差別。實施例7在WIL2-S細胞上抗體與CD20結合的Scatchard分析使用放射性同位素標記的2H7IgG測定2H7IgG變體與WIL2-S細胞結合的平衡離解常數(Kd)。IgG變體在CHO細胞中產生。Rituxar^(所有實驗中均來自Genentech,S.SanFrancisco,CA)和小鼠2H7(BDPharMingen,SanDiego,CA)被用來與人源化變體比較。鼠2H7抗體也可從其它來源獲得，例^口eBioscience與Calbiochem(均在SanDiego,CA)、AccurateChemical&ScientificCorp.(Westbury，NY)、Ancell(Bayport,MN)、與Vinci-Biochem(Vinci，Italy)。所有稀釋均在結合分析緩沖液(DMEM培養(yǎng)基，包含1%牛血清白蛋白、25mMHEPESpH7.2、與0.01%疊氮鈉)中進行。將濃度為0.8nM的^I-2H7.vl6(用乳過氧物酶碘化了的)等分試樣(0.025mL)分配入V形底96孔微分析板的孔中，加入冷的抗體的系列稀釋物(0.05mL),并混合。然后加入WIL2-S細胞(0.025mL中60,000個細胞)。封閉板子，在室溫下孵育24小時，然后在3，500RPM離心15分鐘。然后吸出上清液，洗細胞沉淀團并離心。再次吸去上清液，細胞小團溶解在1NNaOH中，并轉移至管中用于y計數。使用Ligand程序(McPherson,Comput.ProgramsBiomed.17:107-114(1983))對數據進行Scatchard分析(Munson與Rodbard，Anal.Biochem.107:220-239(1980))。如表9所示，結果表明人源化2H7變體的CD20結合親合力類似于鼠2H7、結合親合力類似于Rituxan0?；谏厦姹?所示結合，預期2H7.v31將具有與v.16非常類似的Kd。表9從Scatchard分析得到的2H7變體的平衡結合親合力<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>實施例8補體依賴的細胞毒性(CDC)分析基本上如所描述的(Idusogieetal.，J.ImmunoU64:4178-4184(2000);Idusogieetal"J.Immunol.166:2571-2575(001)),分析2H7IgG變體介導WIL2-S細胞補體依賴的溶解的能力，該細胞是表達CD20的成淋巴細胞樣(limphoblastoid)的B細胞系?？贵w從0.1mg/mLHi存液中1:3連續(xù)稀釋。向包含0.05mL正常人補體(Quidel，SanDiego，CA)溶液的96孔組織培養(yǎng)板中加入每一稀釋的0.05mL等分試樣。向這一混合物中加入0.05mL體積的50,000WIL2-S細胞。37。C孵育2小時后，加入0.05mLAlamarblue溶液(AccumedInternational,Westlake,OH),在37。C再繼續(xù)孵育18小時。將蓋子從板上拿開，板子在定軌搖床上于室溫下搖動15分鐘。<吏用530nm激發(fā)濾光器和590nm發(fā)射濾光器讀取相對熒光單位(RFU)。使用KaleidaGraph軟件，通過將RFU擬合為每一抗體的濃度的函數計算EC50。結果(表IO)顯示人源化2H7抗體導致CDC令人驚奇的改善，v.73的相對效能類似于Rituxan,v.75比Rituxan⑧強出3倍，v.16比Rit畫n⑧弱3倍。表10與Rituxan相比2H7抗體的CDC活性。數字>1表示CDC活性不如Rituxar^強，數字<1表示活性比Rituxan③更強。除那些用(*)指示的是短暫產生的以外，抗體產生自穩(wěn)定的CHO系?？贵w變體EC5。(變體)/EC5o(Rituxan)<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>實施例9抗體依賴的細胞毒性(ADCC)分析基本上如所描述的(Shieldsetal.，J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001))，利用乳酸脫氫酶(LDH)讀數，分析2H7IgG變體介導自然殺傷細胞(NK細胞)溶解WIL2-S細胞的能力，該細胞是表達CD20的成淋巴細胞樣的B細胞系。NK細胞制備自用100mLPBS稀釋的100mL肝素化的血液，該血液獲得自已經為FcyRIII(又名CD16)(Koeneetal.，blood90:1109-111409-1114(1997))同種型的(isotyped)正常人供體。在這一實驗中，NK細胞來自于對CD16雜合的人供體(F158/V158)。稀釋的血液在15mL淋巴細胞分離介質(ICNBiochemical,Aurora,Ohio)上進行分層，在2000RPM離心20分鐘。將層間分界面上的白細胞分配于4個干凈的50mL管中，管里充滿含15%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基。管子在1400RPM離心5分鐘，棄去上清液。細胞小團重懸浮于MACS緩沖液(0.5。/。BSA，2mMEDTA)中，NK細胞用小珠(NK細胞分離試劑盒，130-046-502)根據廠家的操作程序(MiltenyiBiotech，)純化。NK細胞在MACS緩沖液中稀釋至2xl06細胞/毫升。將分析培養(yǎng)基(F12/DMEM50:50無甘氨酸，lmMHEPES緩沖液pH7.2，青霉素/鏈霉素(100單位/mL;Gibco)，谷氨酰胺，與1%熱滅活的胎牛血清)中的抗體系列稀釋加至96孔圓底組織培養(yǎng)板中。WIL2-S細胞在分析緩沖液中稀釋至濃度4xl0VmL。WIL2-S細胞(0.05mL每孔)在96孔板中與稀釋抗體混合，在室溫下孵育30分鐘，讓抗體與CD20結合(調理作用)。通過向每孔中加入0.1mLNK細胞起動ADCC反應。在對照孔中，加入2%TritonX-100。板子在37。C孵育4小時。釋放的乳酸脫氫酶水平用細胞毒寸生(LDH)才全觀'H式劑盒(i式劑盒弁1644793,RocheDiagnostics,Indianapolis,Indiana)按照廠家指示進行測量。每孔加入O.lmLLDH顯色劑，隨后混合10秒。板子然后用鋁箔覆蓋，在黑暗中室溫下孵育15分鐘。然后讀取490nm光密度，并通過被對照細胞中測得的總LDH除，來計算溶解百分比。溶解被繪制為抗體濃度的函數，四參數曲線擬合(KaleidaGraph)被用于判定EC50濃度。結果表明，人源化2H7抗體在ADCC方面活躍，v.31與v.75的相對功效比Rituxan⑧高20倍，v.16比Rituxa,強5倍，v.73比Rituxai^高幾乎4倍。表11基于n實驗，與2H7.vl6相比，2H7抗體對WIL2-S細胞的ADCC活性。(數值>1表示比ZH.vM效力較低，數值<1表示效力較強。)<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>進行額外的ADCC分析，以將2H7組合變體與Rituxan⑧比較。這些分析的結果顯示，同Rituxan⑧比較，2H7.vl14和2H7.vl15的ADCC效力改善超過10倍(表12)。表12基于n實驗，與Rituxai^相比，2H7抗體對WIL2-S細胞的ADCC活性。(數值>1表示比Rituxai^效力較低，數值<1表示效力較強。)<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>實施例10獼猴pilot研究中2H7變體的體內效應在正常雄性獼猴(Macacafascicularis)中測試瞬時轉染CHO細胞所產生的2H7變體，以評定其體內活性。其它抗CD20抗體，例如C2B8(Rituxan已顯示具有在正常靈長類動物中消減B細胞的能力(Reffetal.，Blood83:435-445(1994))。在一項研究中，比較人源化2H7變體。在一項平行研究中，在獼猴中也測試了Rituxan。以下五個劑量組中，每組使用四只猴子(1)載體，(2)0.05mg/kghu2H7,v16,(3)10mg/kghu2H7.v16，(4)0.05mg/kghu2H7.v31，和(5)10mg/kghu2H7.v31。抗體以0、0.2、或20mg/mL濃度靜脈內給藥，總共兩劑，一劑在研究的第一天，另一劑在第八天。給藥的第一天指定為第l天，前一天指定為第-l天；恢復的第一天(對于每組中兩個動物而言)指定為第11天。在第-19、-12、1天(給藥前)，以及在第一次給藥后第6、24、72小時收集血樣。在第8天(給藥前)、第10天(殺死每組兩只動物前)和在第36和37天(對于恢復動物而言)取額外的樣本。用FACS方法測定外周B細胞濃度，該方法計數CD3VCD40+細胞。通過如下門化(gating)策略在猴樣品中獲得CD3-CD40+B細胞在總淋巴細胞中的百分率。在前向散射/側向散射點圖上標記淋巴細胞群體以定義區(qū)域l(Rl)。使用R1中的事件，顯示CD40和CD3標志物的熒光強度點圖。熒光標記的同種型(isotype)對照被用來判定CD40和CD3陽性各自的截止點。結果指示2H7.vl6和2H7.v31能在10mg/kg劑量產生完全外周B細胞削減、并且在0.05mg/kg劑量產生部分外周B細胞削減(圖11)。時間進程與在給藥的第一個72小時期間測量得到的B細胞削減的程度在兩種抗體間類似。對恢復動物的隨后分析表明，同用2H7.vl6給藥的動物比較起來，那些用2H7.v31處理的動物顯示B細胞削減的持續(xù)時間較長。特別地，在用10mg/kg2H7.v16處理的恢復動物中，B細胞在第10天與第36天取樣之間的某個時間顯示實質性(substantial)的B細胞恢復。然而，對于用10mg/kg2H7.v31處理的恢復動物中，B細月包直到第36天與第67天之間的某個時間才顯示恢復(圖11)。這暗示，與2H7.vl6相比，2H7.v31完全削減的持續(xù)時間長出大約一個月。在獼猴研究中，^^或高劑量未觀察到毒性，總病理學(grosspathology)也是正常的。在其它研究中，在這些猴子中相隔兩周i.v.給藥兩次后，Vl6直到所評估的最高劑量(l00mg/kgx2=1200111§/111、2)仍被良好耐受。在獼猴中用2H7.vl6與Rituxai^比較所得到的數據暗示，CDC活性減少5倍對于效力并沒有不利影響。具有強ADCC活性、但CDC活性降低的抗體在首次灌注反應方面可能比具有較強CDC活性的抗體具有更好的安全特性。實施例11具有增強的效應子功能的巖藻糖缺陷的2H7變體抗體正常CHO與HEK293細胞將巖藻糖加至IgG寡糖至高程度(97-98%)。來自血清的IgG也是高度巖藻糖基化的。DP12和Lecl3被用來產生本研究的抗體，DP12是具有巖藻糖基化能力的無二氬葉酸還原酶缺陷的(DHFR-)CHO細胞系，Lecl3是蛋白質巖藻糖基化缺陷的細胞系。CHO細胞系Pro-Lecl3.6a(Lecl3)獲得自猶太高等學校大學阿爾伯特愛因斯坦醫(yī)學院PamelaStanley教授。親本系是Pro-(脯氨酸營養(yǎng)缺陷型)和Gat-(甘氨酸、腺苷、胸苷營養(yǎng)缺陷型)。CHO-DP12細胞系是CHO-K1細胞系的衍生物(ATCC弁CCL-61)，后者是二氫葉酸還原酶缺陷的，并且對胰島素的需求降低。使用Superfect方法(Qiagen，Valencia,CA)用cDNA轉染細胞系。4吏用噤呤霉素二鹽酸化物(Calbiochem,SanDiego,CA)在10pg/ml濃度在生長培養(yǎng)基中選擇表達轉染的抗體的Lecl3細胞，所述生長培養(yǎng)基含有具有L-谷氨酰胺、核糖核苷與脫氧核糖核苷酸的MEMa培養(yǎng)基(GIBCO-BRL，Gaithersburg,MD)、補充有10%滅活FBS(GIBCO)、10mMHEPES、與IX青霉素/鏈霉素(GIBCO)。在無GHT的包含Ham'sF12生長培養(yǎng)基中類似地選擇CHO細胞無甘氨酸、有NaHC03、補充有5%FBS的低葡萄糖DMEM(GIBCO)、10mMHEPES、2mML-谷氨酰胺、1XGHT(甘氨酸、次黃噪呤、胸苷)與1X青霉素/鏈霉素。在兩至三周之內形成菌落，混合起來用于進行擴增和蛋白質表達。細胞集合體最初以3xl()S細胞/10厘米板的濃度接種，用于小批量蛋白質表達。一旦細胞生長至90-95%滿板，便轉移至無血清培養(yǎng)基中，并且在3-5天之后收集細胞上清液，在FcIgG與完整IgGELISA中測試以估計蛋白質表達水平。Lecl3與CHO細胞在轉移至PS24生產培養(yǎng)基之前一天以大約8xl06細胞/15厘米板接種，所述PS24生產培養(yǎng)基補充有10mg/L重組人胰島素與lmg/L微量元素。Lecl3細胞與DP12細胞在無血清生產培養(yǎng)基中保持3-5天。收集上清液，在150ml錐形管中通過離心作用使之澄清以除去細胞和碎片。加入蛋白酶抑制劑PMSF與抑肽酶(Sigma，St.Louis,MO)，使用MWCO30過濾器(Amicon，Beverly,MA)在攪動的細胞上濃縮上清液5倍，然后使用G蛋白層片斤法(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway，NJ))立即纟屯4b上;青'液。所有蛋白質均利用Centripriep-30濃縮器(Amicon)緩沖液更換入磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，并用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。利用A280測定蛋白質濃度，并利用氨基酸組成分析驗證。使用表達人源化2H7v16、2H7v.31的載體轉染CHO細胞，并如所描述的進行選擇。2H7v.16抗體保留有野生型Fc區(qū)域，而v.31(見上面實施例5，表7)的Fc區(qū)域中3個氨基酸發(fā)生改變(S298A、E333A、K334A),導致對FcyRIIIa受體的高親合力(Shieldsetal.J.Biol.Chem.276(9):6591匿6604(2001))。轉染和選擇后，分離出細胞的單個集落，并評估蛋白質表達水平，產量最高的細胞進行氨曱喋呤選擇以選擇那些質粒拷貝數被擴增并且因此生產較高水平抗體的細胞。使細胞生長，轉移至無血清培養(yǎng)基中7天，然后收集培養(yǎng)基，裝載至A蛋白柱上，用標準技術洗脫抗體。使用測定完整抗體的Elisa測定抗體的最后濃度。使用Centripriep-30濃縮器(Amicon)將所有蛋白質緩沖液更換入磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)并用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。犬冬戚廢遽凝的慕^的差f裙勿的浚^席戎/g薄fM4ZZ>/-r<9"^##》^f:使用Papacetal.，Glycobiology8,445-454(1998)的程序從重組糖蛋白上釋放N-連接的寡糖。簡要地說，96孔帶有PVDF襯里的微滴定板(MUlipore，Bedford,MA)用100jxl曱醇調理，通過在Millipore多屏幕真空歧管上施加真空使該曱醇透過PDVF膜。調理過的PVDF膜用3X250pl水洗。在所有洗滌步驟之間，通過向歧管輕輕施加真空使孔完全排干。用還原和羧曱基化緩沖液(RCM)洗膜，所述緩沖液包含6M鹽酸胍、360mMTris、2mMEDTA、pH8.6。將糖蛋白樣品(50嗎)加至各個孔中，再次輕輕施加真空使其透過PVDF膜，孔用小時來還原被固定化的樣品。用真空除去DTT，孔用4x250pl水洗。通過添加5(^1的O.IM碘乙酸(IAA)溶液來羧曱基化半胱氨酸殘基，所述碘乙酸溶液在1MNaOH中新鮮配制，并用RCM緩沖液稀釋至O.IM。通過在室溫下在黑暗中孵育30分鐘完成羧曱基化。向板子施加真空以除去IAA溶液，孔用4x250pl凈化水洗。通過添加100pl的1。/。PVP360(聚乙烯吡咯烷360,OOOMW)(Sigma)溶液并在室溫下孵育1小時封閉PVDF膜。通過輕輕施加真空除去PVP-360溶液，孔用4x250|ul水洗。PNGaseF(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)消化溶液(在10mMTris醋酸鹽中的25|nl的25單位/ml溶液，pH8.4)被加入每孔中，消化在37。C進行3小時。消化之后，樣品轉移至500^1微量離心管中，每個樣品中加入2.5^1的1.5M乙酸溶液。酸化樣品在室溫孵育3小時以將寡糖從葡基胺轉換成羥基形式。在MALDI-TOF質譜分析之前，所釋放的寡糖用勻漿填充入壓緊的反應管(USBiochemical,Cleveland,OH)的0.7ml床的陽離子交換樹脂(以氫形式的AG50W-X8樹脂)(Bio-Rad,Hercules，CA)脫鹽。為了以陽性方式(positivemode)進行樣品的MALDI-TOF質譜分析，將脫鹽的寡糖(0.5iLi1等分試樣)用0.5|Lil的2，5二羥苯曱酸基質(sDHB)上樣至不銹鋼靶(stainlesstarget),所述2，5二羥苯曱酸基質通過將2mg2,5二羥苯曱酸用溶解在lml乙醇/lmM氯化鈉1:1(v/v)中的O.lmg的5-methoxyslicylicacid溶解而制備。樣品/基質混合物用真空干燥。為了以負方式(negativemode)進行分析，將脫鹽的N-連接的寡糖(0.5nl等分試樣)與0.5^12，，4，，6，-三羥基乙酰苯基質(THAP)—起上樣至不銹鋼靶，所述2，，4，，6，-三羥基乙酰苯在1:3(v/v)乙腈/13.3mM檸檬酸銨緩沖液中制備。真空干燥樣品/基質混合物，然后在分析之前讓其吸收空氣中的水分。所釋放的寡糖在PerSeptiveBioSystemsVoyager-質譜儀上用MALDI-TOF進行分析。質譜儀在20kV以正性或負性方式用線狀排列(linearconfiguration)并利用延遲提取(delayedextraction)進行操作。使用1300的激光功率并以數據總和方式(240掃描)獲得數據以改善信噪比。儀器用標準寡糖的混合物校準，并在質量分配前用19點Savitsky-Golay算法將數據變平滑(smoothed)。利用Caesar7.0數據分析軟件包(SciBridgesoftware)得到質譜數據的整合。自然殺傷(NK)細胞抗體依賴的細胞毒性試驗如實施例9所描述進行ADCC試驗。NK細胞與靶細胞(WIL2-S)的比例為4:1，試驗進行4小時，如前面使用乳糖脫氫酶試驗那樣測量毒性。在添加NK細胞之前用所指示的抗體濃縮物調理靶細胞30分鐘。所使用的Rituxar^抗體來自Genentech(S.SanFrancisco,CA)。圖12顯示代表性的ADCC試驗的結果。結果表明，低巖藻糖基化的抗體比完全巖藻糖化的抗體更有效地介導NK細胞靶細胞殺傷。低巖藻糖基化抗體2H7v.31在介導靶細胞殺傷上最有效。這一抗體在較低濃度下有效，并能在較高濃度下比其它抗體介導更高比率的耙細胞殺傷。抗體活性如下Lecl3衍生的2H7v31>Lecl3衍生的2H7vl6〉Dp12衍生的2H7v31〉Dp12書f生的2H7vl6〉或-Rituxan。附加蛋白質與糖的改變。比較Lecl3產生的與CHO產生的IgG中天然IgG上的糖，顯示在半乳糖苷化程度上沒有可明顯察覺的差異，由此該結果可以完全歸因于巖藻糖的存在或缺乏。實施例12具有體內增強的ADCC的巖藻糖缺陷2H7變體抗體本實施例描述了在表達人CD16[FcRIII]和人CD20的小鼠中，Lecl3產生的巖藻糖缺陷的人源化2H7變體包括v.16與v.31與在DP12中產生的正常的巖藻糖基化的同類抗體相比，體內ADCC活性。/mCZ)20rg+/zwC￡)/6rg+mCD/f、/、武的,^:人CD20轉基因小鼠從人CD20BACDNA(Invitrogen，Carlsbad,CA)產生。基于人CD20表達的FACS分析篩選小鼠。HuCD20Tg+小鼠然后與huCD16Tg+mCD16一小鼠雜交以生成huCD20Tg+huCD16Tg+mCD16一小鼠。經腹膜內注射將10至100pg的每一2H7變體或Rituxai^給藥給huCD20Tg+huCD16Tg+mCD16一小鼠。等量的同種型匹配的抗體以類似方式給藥給負對照組動物。Vv究^S勿應斜務來自全血、脾、淋巴結、與骨髓的小鼠淋巴細胞根據在"CurrentProtocolsinImmunology,JohnColigan、AdaKruisbeek、DavidMargulies編輯,EthanShevachandWarrenStrober，1994"中所描述的標準程序制備。E4GS分浙洗50萬個細胞，重懸在100^1的FACS緩沖液中，該緩沖液是含1%BSA的磷酸鹽緩沖鹽水，包含5pl的染色或對照抗體。所有染色抗體，包括同種型對照，均獲自PharMingen，SanDiego，CA。通過用Rituxar^與FITC-偶聯的抗人IgGl第二抗體一起染色，評估人CD20表達。使用FACScan和CellQuest(BectonDickinsonImmunocytometrySystems,SanJose,CA)進行FACS分析。所有淋巴細胞用前和側光散射確定，而所有B淋巴細胞用細胞表面上的B220的表達確定。在注射后第一周每天、并在此后每周通過分析外周B細胞計數和通過對脾、淋巴結和骨髓進行FACS分析hCD20+B細胞，來評估B細胞削減與恢復。監(jiān)測所注射的2H7變體抗體的血清水平。這一體內試驗的結果進一步證實了體外研究結果，即巖藻糖缺陷的2H7變體與野生型(在巖藻糖基化方面)糖基化同類抗體相比具有較高ADCC活性和較多的B細胞削減。實施例13細胞程序性死亡活性包括Rituxar^在內的抗CD20抗體已表明當被第二抗體或者通過化學方法被交聯時可體外誘導細胞程序死亡(Shanetal.,Blood9:1644-1652(1998);Byrdetal.,Blood99:1038-43(2002);Pedersonetal.,Blood99:1314-19(2002))。當被化學交聯時，鼠2H7二聚物誘導Daudi細胞的細胞程序死亡(Ghetieetal.,ProcNatlAcadSciUSA94:7509-14(1997))。鼠2H7抗體與第二抗體交聯也誘導細胞程序死亡(Shanetal.,1998)。這些活性被認為是在生理上相關的，因為各種各樣的機制可以導致體內與細胞表面CD20結合的抗CD20抗體的交聯。利用第二交聯抗體在體外細胞程序死亡試驗中比較RhuMAb2H7.vl6[人源化2H7vl6;RhuMAb表示重組人單克隆抗體]與Rituxar^。表達CD20的人B淋巴細胞細胞系Ramos細胞(CRL-1596，ATCC,Manassas，VA)被用于測量抗CD20單克隆抗體rhuMAb2H7.v16與Rituximab相對于負對照抗體Trastuzumab(Herceptin,Genentech,SouthSanFrancisco,CA)誘導細胞程序死亡的能力，所述誘導細胞程序死亡的能力通過膜聯蛋白(Annexin)V染色與^典丙錠染料排斥(Vybrant細胞程序死亡分析試劑盒，MolecularProbes,Seattle,WA)測量。Ramos細胞培養(yǎng)在包含10%胎牛血清(BiosourceInternational,Camarillo,CA)和2mML畫谷氨酰胺(Gibco)的RPMI-1640培養(yǎng)基中。分析之前，細胞在新鮮培養(yǎng)基中洗兩次，然后調整至細胞濃度2X1()6每毫升。細胞(150pL)被加至96孔分析板(BectonDickinson,PaloAlto，CA)中，板子包含150|aL的預先確定數量的對照IgGl、rhuMAb2H7.vl6或Rituximab、以及F(ab)'2山羊抗人Fc(PierceBiotechnology,Rockford,IL)。最終的IgG濃度為100、10、1.0、0.1、0.01與O.OOlnM，F(ab)，2山羊抗人Fc抗體濃度#1設置成各個樣品抗體濃度的兩倍。每次稀釋都設置成一式三份。在37。C孵育24小時后，細胞用PBS洗兩次，然后根據廠家建議用膜聯蛋白V與碘丙錠染色。Ramos細胞的染色才莫式使用FACscan流式細胞儀(BectonDickinson,SanJose,CA)通過流式細胞計分析，在10秒的時間內收集數據。使用CellquestPro軟件(BectonDickinson)對數據還原。Ramos細胞對于(l)膜聯蛋白V染色、(2)膜聯蛋白V與碘丙錠雙染色呈陽性，并且(3)計數未染色的活細胞的數目，并利用KaleidaGraph軟件(Synergysoftware,Reading,PA)繪圖。當與抗人Fc交聯和同無關IgGl對照抗體比較時，rhuMAb2H7.vl6和Rituximab兩者都誘導Ramos細胞的細胞程序死亡(圖13-15)。rhuMAb2H7的細胞程序死亡活性稍低于Rituximab。在交聯rhuMAb2H7、Rituximab和對照IgGl抗體的濃度為10nM時，膜聯蛋白V染色的細胞的比例分別是18.5%、16.5%、2.5%，雙標記細胞的比例為29%、38%與16%,并且每10秒計數的活細胞數目為5200、3100與8600。這些體外數據顯示，細胞程序死亡是體內B細胞削減的一個可能的機制。與細胞表面CD20結合的rhuMAb2H7或Rituximab的體內交3關可能通過免疫效應細胞表面上的FcyR發(fā)生。實施例14腫瘤生長的體內抑制在Balb/c棵(無胸腺)小鼠中評估rhuMAb2H7.vl6抑制淋巴瘤細胞系Raji人B細胞(ATCCCCL86)生長的能力。Raji細胞表達CD20,并已報道可在棵鼠中生長，產生轉移性疾??；腫瘤生長被Rituxai^所抑制(Clyneseta1.，NatureMedicine6，443-446(2000))。五十六只8-10周大的Balb/c棵鼠被分成7組(A-G)，每組包括8只小鼠。在第0天，每只小鼠在脅部接受5xl06的RajiB淋巴瘤細胞皮下注射。從第O天開始，每只小鼠接受lOOpl的負對照溶液(PBS;磷酸鹽緩沖鹽溶液)、Rituxai^或2H7.vl6。劑量取決于體重，通過尾靜脈靜脈內給藥。A組小鼠接受PBS。B-D組分別以5.0mg/kg、0.5mg/kg、與0.05mg/kg接受Rituxan⑧。組E-G分別以5.0mg/kg、0.5mg/kg、與0.05mg/kg接受2H7v.16。注射每周重復，共6周。在治療期間一周一次，觀察每只小鼠注射部位可觸腫瘤的存在，如果存在則測量腫瘤體積并登記。在第8周做最后的檢查(在間隔兩周不進行治療之后)。這一研究的結果表明rhuMAb2H7.vl6與Rituxan⑧在抑制棵鼠中皮下Raji細胞肺瘤的生長中均有效(圖16-18)。從第4周開始在PBS對照組中觀察到腫瘤生長。然而，在該研究的8周持續(xù)時間內，在用Rituxan⑧或2H7.vl6以5mg/kg或0.5mg/kg處理的組中沒有觀察到腫瘤生長。在低劑量0.05mg/kg處理組中，在2H7組的一只動物和在Rituxar^組的一只動物中觀察到腫瘤(圖18)。實施例15獼猴CD20的克隆與抗體結合從獼猴脾cDNA文庫分離編碼CD20的cDNA之后，測定獼猴(Macaca/wc/cM/an》CD20DNA序列。cDNA合成與質?？寺〉腟UPERSCRIPTTM質粒系統(目錄號18248-013，Invitrogen，Carlsbad，CA)稍加改變后被用于構建文庫。使用限制性位點Xhol和Notl將cDNA文庫連接入pRK5E載體。從脾組織分離mRNA((CaliforniaRegionalResearchPrimateCenter,Davis，CA)。端區(qū)域引物5'-AGTTTTGAGAGCAAAATG-3'(SEQIDNO.37)與C末端區(qū)域引物5'-AAGCTATGAACACTAATG-3'(SEQIDNO.38)被用來通過聚合酶鏈式反應(PCR)克隆編碼獼猴CD20的cDNA。使用PlatinumTaqDNAPolymeraseHighFidelity根據廠家建議(Gibco,Rockville,MD)進行PCR反應。PCR產物亞克隆入PCR⑧2.1-TOPO⑧載體(Invitrogen)，并轉化入XL-1藍色大腸桿菌(Stratagene.LaJolla,CA)。從單個克隆中分離包含連接有PCR產物的質粒DNA，并測序。獼猴CD20的氨基酸序列示于圖19。圖20顯示獼猴與人CD20的比較。獼猴CD20與人CD20具有97.3。/。的相似性，有8處差異。細胞外結構域在V157A包含一個改變，而其余7個殘基可在細胞質或跨膜區(qū)域找到。分析針對抗人CD20的抗體結合并替代FITC偶聯的鼠2H7結合表達CD20的獼猴細胞的能力。從兩只獼猴(CaliforniaRegionalResearchPrimateCenter,Davis,CA)取血20毫升加入肝素鈉，并直接運至健泰科公司。在同一天，匯集血樣，通過添加40ml的磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)1:1稀釋。20ml的稀釋血液分層鋪于50ml錐形管(目錄號352098，Falcon,FranklinLakes,NJ)中的4x20mlFicoll-PaqueTMPlus(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden),在Sorval7離心機(Dupont，Newtown,CT)上以1300rpm室溫離心30分鐘。分離出PBMC層，在PBS中洗。紅細胞在0.2%NaCl溶液中裂解，用等體積的1.6。/。NaCl溶液恢復至等滲，以1000RPM離心10分鐘。PBMC小丸再懸浮在包含5。/。胎牛血清(FBS)的RPMI1640(Gibco，Rockville,MD)中，在37。C分散入10cm組織培養(yǎng)亞l小時。非粘附的B和T細胞群體用吸出除去，離心并計數?；厥盏玫娇偣?.4xl0"田胞。重新懸浮的PBMC分配入20個12x75mm培養(yǎng)管(目錄號352053，Falcon),每管包含1乂106細胞,體積0.25ml。管子被分成四組，每組五管。每組加入培養(yǎng)基(RPMI1640,5%FBS)、滴定量的對照人IgGl抗體、Rituxan⑧、2H7.vl6、或2H7.v31，每個抗體的終濃度為30、10、3.3與l.lnM。此外，每管還加入20^1的異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯的抗人CD20(目錄號555622,BDBiosciences,SanDiego,CA)。輕輕混合細胞，在水上孵育1小時，然后在冷PBS中洗兩次。在EpicXL-MCL(Coulter，Miami,FL)上分析細胞表面染色，針對抗體濃度導出并繪制幾何平均數(KaleidaGraphTM,SynergySoftware,Reading,PA)。圖21中的數據顯示，2H7v.16與2H7v.31竟爭性替代FITC-鼠2H7與獼猴細胞的結合。此外，Rituxan⑧也替代FITC-鼠2H7的結合，因此證明2H7與Rituxar^兩者結合于CD20上的重疊表位。此外，數據顯示，2H7v.16、2H7v.31與Rituxan具有類似的IC50值，落在4-6nM范圍內。實施例16rhuMAb2H7(2H7.vl6)在中度至重度類風濕性關節(jié)炎中的I/II期研究過程提要在患中度至重度類風濕性關節(jié)炎的個體中，所述個體同時接受穩(wěn)定劑量的氨甲喋呤，對逐漸升高劑量的PRO70769(rhuMAb2H7)的安全性進行隨機的、安慰劑對照的、多中心(multicenter)、盲的I/II期研究。目的本研究的主要目的是評定在患中度至重度類風濕性關節(jié)炎(RA)個體中逐漸增高的靜脈內(IV)劑量的PRO70769(rhuMAb2H7)的安全性與耐受性。研究設計這是一項隨機的、安慰劑對照的、多中心的、盲的、1/11期、研究者與受試者雙盲研究，研究逐漸增高劑量的PRO70769與MTX聯合在中度至重度RA個體中的安全性。研究包括劑量逐漸增高期和第二期，其中第二期中有更多數量的個體加入。主辦者對治療方案保持不參與?？梢约尤胫委煹氖茉囌呋贾卸戎林囟萊A,遭受一種至五種具有減輕癥狀作用的抗風濕藥或生物制劑治療失敗，目前用MTX治療的臨床反應不佳。在研究開始之前，受試者要每周接受10-25mg范圍內的MTX至少12周，并接受穩(wěn)定劑量至少4周，然后接受其首次量的研究藥物(PR070769或安慰劑)。受試者也可以接受穩(wěn)定劑量的口服皮質激素(最多達每天10mg或等量強的松)和穩(wěn)定劑量的非類固醇類抗炎藥(NSAID)。根據下面的劑量漸增計劃(參見圖22)，受試者將在第1與第15天以指定劑量接受PR070769或安慰劑的兩次靜脈內輸注。根據特定標準，并且在由內部安全數據檢查委員會對安全性數據進行檢查之后，并且在每一組的最后一個受試者接受第二次輸注后72小時對急性毒性進行了評估之后，進行劑量升級。劑量升級期后，另外40個受試者(32個接受藥物的和8個接受安慰劑的)將被隨機分配入以下劑量水平的每一劑量2x50mg、2x200mg、2x500mg、和2xl000mg，如果該劑量水平在劑量升級期內已經被證實是可耐受的。大約205個受試者將加入該研究。獲得B細胞計數并登記。在為時6個月的效力估價期之外的48周追蹤期內，利用流式細胞計評價B細胞計數。B細胞削減將不會被認為是劑量限制的毒性(dose-limitingtoxicity,DLC),而是PRO70769治療的預期藥效學結果。在一可選的亞研究中，將在各個時間點從受試者獲得血清血和RNA分析、以及尿樣。這些樣品可^1用來鑒定生物標志物，這些生物標志物可能對患中度至重度RA的受試者對PRO70769治療響應性有預示作用。結果的測量本研究的主要結果測量是患中度至重度RA的受試者中PRO70769的安全性與耐受性。研究治療受試者群體將根據以下升級計劃在第1與第15天以指定劑量接受PRO70769或等量安慰劑的兩次靜脈內輸注-lOmgPRO70769或等量安慰劑4個受試者接受活性藥物，1個接受對照-50mgPRO70769或等量安慰劑8個受試者接受活性藥物，2個接受對照-20011^11070769或等量安慰劑8個受試者接受活性藥物，2個接受對照-50011^11070769或等量安慰劑8個受試者接受活性藥物，2個接受對照-lOOOmgPRO70769或等量安慰劑8個受試者接受活性藥物，2個接受對照效力PRO70769的效力將通過ACR反應測量。取得ACR20、ACR50、和ACR70反應的受試者百分率將通過處理組匯總，每一組生成95%置信區(qū)間。這些反應的組分以及其從基線的變化將通過治療與訪問加以匯總。結論上面的數據證明制備人源化CD20結合抗體，特別是人源化2H7抗體變體的成功，所述抗體保持、甚至增強其生物學特性。本發(fā)明的人源化2H7抗體以與小鼠供體和嵌合2H7抗體類似的親合力與CD20結合，在靈長類動物的B細胞殺傷中是有效的，導致B細胞削減。某些變體與目前用于治療NHL的嵌合抗CD20抗體相比顯示出增強的ADCC，有利于在患者中使用較低劑量的治療抗體。此外，盡管對帶有鼠FR殘基的嵌合抗體而言，需要以足以取得完全B細胞削減的劑量給藥以消除針對其的抗體反應，本發(fā)明人源化抗體可以以取得部分或完全B細胞削減的劑量給藥，并且依該特定疾病和病人所需按不同持續(xù)時間給藥。此外，這些抗體顯示出在溶液中的穩(wěn)定性。人源化2H7抗體的這些性質使得它們在CD20陽性癌癥和自身免疫疾病中可用作理想的免疫治療藥劑；在人類患者中這些抗體預期是不參考文獻在本申請中所引用的參考文獻，包括專利、公開的申請及其它出版物，在此引入作為參考。除非另外指明，本發(fā)明的實施將使用本領域范圍內的分子生物學的傳統方法等等。這樣的技術在文獻中充分加以解釋。參見，例如MolecularCloning:ALaboratoryManual,(J.SambrookColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y"1989);CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.Ausubela/"eds.，1987updated);EssentialMolecularBiology(T.Browned.，IRLPress1991);GeneExpressionTechnology(Goeddeled.,AcademicPress1991);MethodsforCloningandAnalysisofEukaryoticGenes(A.Bothwella/,eds.,BartlettPubl.1990);GeneTransferandExpression(MKriegler,StocktonPress1990);RecombinantDNAMethodologyII(R.Wua/,eds,,AcademicPress1995);PCR:APracticalApproach(M.McPhersonIRLPressatOxfordUniversityPress1991);OligonucleotideSynthesis(M.Gaited.,1984);CellCultureforBiochemists(R.Adamsed.，ElsevierSciencePublishers1990);GeneTransferVectorsforMammalianCells(J.Miller&M.Caloseds"1987);MammalianCellBiotechnology(M.Butlered.,1991);AnimalCellCulture(J.Pollardda/,eds.,HumanaPress1990);CultureofAnimalCells,2ndEd.(R.FreshneyWa/,eds"AlanR.Liss1987);<formula>formulaseeoriginaldocumentpage93</formula>序列表<110>健泰科生物才支術4^司(Genentech,Inc.).<120>免疫球蛋白變體及其用途<130>P1990R3C1<140>US11/147,780<141>2005-06-07<150>US60/434,115<151>2002-12-16<150〉US60/526，163<151>2003-12-01<150>PCT/US03/40426<151>2003-12-16<160>53<210>1<211>107<212>PRT<213>鼠(Musmusculus)<400>1GinlieValLeuSerGinSerProAlalieLeuSerAlaSerPro151015GlyGluLysValThrMetThrCysArgAlaSerSerSerValSer202530TyrMetHisTrpTyrGinGinLysProGlySerSerProLysPro354045TrplieTyrAlaProSerAsnLeuAlaSerGlyValProAlaArg505560PheSerGlySerGlySerGlyThrSerTyrSerLeuThrlieSer657075ArgValGluAlaGluAspAlaAlaThrTyrTyrCysGinGinTrp808590SerPheAsnProProThrPheGlyAlaGlyThrLysLeuGluLeu95100105LysArg<210>2<211〉107<212>PRT<213>人工序列<220〉.<223>該序列是人工合成的<400>2AsplieGinMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerVal151015GlyAspArgValThrlieThrCysArgAlaSerSerSerValSer202530TyrMetHisTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysPro354045LeulieTyrAlaProSerAsnLeuAlaSerGlyValProSerArg505560PheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSer657075SeiLeuGinProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinTrp808590SerPheAsnProProThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulie95100105LysArg<210〉3<211>108<212>PRT<213>人工序列<220〉<223〉該序列是人工合成的<400〉3AsplieGinMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerVal151015GlyAspArgValThrlieThrCysArgAlaSerGinSerlieSer202530AsnTyrLeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLys354045LeuLeulieTyrAlaAlaSerSerLeuGluSerGlyValProSer505560ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlie657075SerSerLeuGinProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGin808590TyrAsnSerLeuProTrpThrPheGlyGinGlyThrLysValGlu95100105lieLysArg<210>4<211>10<212>PRT<213>鼠(Mus<400>4ArgAlaSermusculus)SerSerValSerTyrMetHis510<210>5<211>7<212〉PRT<213〉鼠(Musmusculus)<400>5AlaProSerAsnLeuAlaSer<210>6<211>9<212>PRT<213>鼠(Musmusculus)<400〉6GinGinTrpSerPheAsnProProThr<210>7<211>122<212>PRT<213>鼠(Musmusculus)<400>7GinAlaTyrLeuGinGinSerGlyAlaGluLeuValArgProGly151015AlaSerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThr202530SerTyrAsnMetHisTrpValLysGinThrProArgGinGlyLeu354045GluTrplieGlyAlalieTyrProGlyAsnGlyAspThrSerTyr505560AsnGinLysPheLysGlyLysAlaThrLeuThrValAspLysSer657075SerSerThrAlaTyrMetGinLeuSerSerLeuThrSerGluAsp808590SerAlaValTyrPheCysAlaArgValValTyrTyrSerAsnSer95100105TyrTrpTyrPheAspValTrpGlyTtuGlyThrThrValThrVal110115120SerSer<210>8<211>122<212>PRT<213>人工序列(220〉<223>該序列是人工合成的<400>8GluValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGly151015GlySerLeuArgLeuSerCysAla"aSerGlyTyrThrPheThr202S30SerTyrAsnMetHisTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeu354045GluTrpValGlyAlalieTyrProGlyAsnGlyAspThrSerTyr505560AsnGinLysPheLysGlyArgPhe丁hrlieSerValAspLysSer657075LysAsnThrLeuTyrLeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAsp808590ThrAlaValTyrTyrCysAlaArgValValTyrTyrSerAsnSer95100105TyrTrpTyrPheAspValTrpGlyGinGlyThrLeuValThrVal1]0115120SerSer<210>9<211>119<212>PRT<2I3>人工序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage97</formula>tcgcaatatggcgc3aaatgaccaacagcggttgattgatcaggUgagg200gggcgctgUcgaggtaaagcccgatgccagcsttCCtg3cg汪cgatacg250gagctgctgcgcgatUcgtaaagaagttaUgaagcatcctcgtcagta300aaaagtuatctutcaacagctgtcataaagttgtcacggccgagactt350atagtcgctttgtttttattttttaatgta11tgtaactagaattcgagc400txggtacccggggatcctctagaggttgaggtgatttUtgaaaaagaat450atcgcatttcttcttgcatctatgttcgttttttctattgctacaaacgc500gtacgctgatatccagBtgacccagtccccgagctccctgtccgcctctg550tgggcgaUgggtcaccatcacctgcagagccagtcagagcgtgtcgact600agctcttatagctatatgcactggtatcaacagaaaccaggaaaagctcc650gaaactactgatttacUtgctagcaacctcgagtctggagtcccttctc700gcttctctggatccggttctgggacggatttcactctgaccatcagcagt750ctgcagccagaagacttcgcaactutuctgtcaacactCttggggUt800tccgcgcacaUtggacagggtaccaaggtggagatcaaacgaactgtgg850ctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatct900ggaactgcttctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggc950caaagtacagataacgccctccaatcgggtaactcccagg1000agagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagc1050accctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtcUcgcctg1100catcagggcctgagctcgccagcttcaeicgi1150ggggagagtgtUagctgatcctcucgccggacgcatcgtggcccUgt1200acgcaagttcacgtaaaaagggtatctagaggttgaggtgatI:ttatgaa1250aaagaaUtcgcatttcttcUgcatctatgttcgtttUtctattgcta]300caaacgcgtacgctgaggttcagctggtggagtctggcggtggcctggtg1350cagccagggggctcactccgUtgtcctgtgcagcttctggcUcacctt1400caccgaatatatcatccactgggtccgtcaggccccgggtaagggcctgg1450aatgggugcatcgattaatcctgactacgacatcacgaactataaccag1500cgcttcaagggccgtttcactaUagtcgcgacgattccaaaaacacatt1550atacctgcagatgaacagcctgcgtgctgaggacactgccgtctatutt1600gtgctcgatggatcagcgatttcttcgactactggggtcaaggaaccctg1650gtcaccgtctcctcggcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggc1700accctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctgg1750tcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgcc1800ctgaccag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rg60LeuThrlieSer75CysGinGinTrp90LysValGlulie10權利要求1.一種與人CD20結合的人源化抗體或者其抗原結合片段，其中抗體對體內削減靈長類動物B細胞是有效的，該抗體在重鏈可變區(qū)(VH)至少包含來自抗人CD20抗體的SEQIDNO.12的CDR3序列、和人重鏈亞群III(VHIII)的基本上的人共有框架(FR)殘基。2.—種分離的核酸，其編碼前述權利要求中任一項的抗體。3.—種表達載體，其編碼前述權利要求中任一項的抗體。4.一種宿主細胞，其包含權利要求2的核酸。5.生產權利要求1的抗體的方法，包含培養(yǎng)生產權利要求4的抗體的細胞，并從細胞培養(yǎng)物中回收抗體。6.—種組合物，包含權利要求1的抗體和載體。7.—種制品，包含一種容器和包含在其中的組合物，其中該組合物包含權利要求1的抗體。8.—種體內在B細胞中誘導程序性細胞死亡的方法，包含將B細胞與權利要求1中的抗體接觸，從而殺死B細胞。9.一種治療CD20陽性癌癥的方法，包含給予患該癌癥的病人治療有效量的權利要求1中的人源化CD20結合抗體。10.—種治療自身免疫病的方法，包含給予患該自身免疫病的病人治療有效量的前述權利要求中任何一項的人源化CD20結合抗體。全文摘要本發(fā)明涉及免疫球蛋白變體及其用途。本發(fā)明提供人源化和嵌合的抗CD20抗體，用于治療CD20陽性惡性腫瘤和自身免疫病。文檔編號A61KGK101418043SQ20081017481公開日2009年4月29日申請日期2003年12月16日優(yōu)先權日2002年12月16日發(fā)明者亨利·B·洛曼,倫納德·G·普雷斯塔,克雷格·W·克勞利,卡梅利亞·W·亞當斯,安德魯·C·陳,杰拉爾德·R·納卡馬拉申請人:健泰科生物技術公司