專利名稱:一種乳制品中β-乳球蛋白含量的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種乳制品中β -乳球蛋白含量的檢測方法。
背景技術(shù):
β-乳球蛋白(β-lactoglobulin)是鮮奶當中蛋白質(zhì)的一種,約占鮮奶蛋白質(zhì)的 7-12%。在若干細胞及動物實驗研究中發(fā)現(xiàn),認為β-乳球蛋白的水解物質(zhì)或分子修飾物, 具有降膽固醇與抗氧化等生理活性。目前測定乳制品中乳球蛋白含量的方法有很多,如酶聯(lián)免疫法、電泳和毛細管電泳等幾種方法。但以上各種方法在測定β -乳球蛋白時都有一定的局限性,如酶聯(lián)免疫法對試劑的選擇性高,牛乳中蛋白質(zhì)種類很多,很難有效的準確檢測;電泳技術(shù)在定量方面有很大的局限性;毛細管電泳重復(fù)性差,容易堵塞。以上技術(shù)上的局限性限制了這些方法在實踐中推廣應(yīng)用。因而,探尋一種成本低廉、檢測快速、準確、適用于復(fù)雜體系,如乳制品中β-乳球蛋白含量的檢測方法是研究的首要問題。高效液相色譜法(HPLC)是定量分析的有效測試方法之一,與其他方法相比具有分辨率和回收率高、重復(fù)性好、操作簡便等優(yōu)勢。但是目前關(guān)于高效液相色譜法測定分析 β -乳球蛋白含量的報道較少,而且其采用的檢測方法還存在著色譜峰較多,難于定量以及分析時間過長等缺點。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服了現(xiàn)有測定乳制品中乳球蛋白含量方法的成本高,準確性較差,分析時間長,樣品中乳球蛋白含量低時測定不準確的缺陷,提供了一種乳制品中乳球蛋白含量的檢測方法。本發(fā)明的檢測方法目標物出峰時間短, 峰形尖銳對稱,分離度好,準確性高。本發(fā)明提供了一種乳制品中乳球蛋白含量的檢測方法,其包括如下步驟按照本領(lǐng)域常規(guī)方法提取乳制品中的乳球蛋白,再通過高效液相色譜法測定含量;所述高效液相色譜法的色譜條件為色譜柱為C18色譜柱,等度洗脫,檢測波長為 210-230nm,洗脫液由流動相A和流動相B組成,所述流動相A和所述流動相B的體積比為80 20-82 18 ;所述流動相A為體積分數(shù)0.05-0. 15%的三氟乙酸的超純水溶液, 所述流動相B為乙腈、超純水和三氟乙酸的混合液;所述流動相B中所述乙腈和超純水的體積比為320 100-480 100,優(yōu)選400 100 ;所述超純水和三氟乙酸的體積比為 100 0.4-100 0.6。其中,所述的C18色譜柱可為現(xiàn)有的各種型號和規(guī)格的C18色譜柱,如 4. 6mmX 250mm和4. 6mmX 150mm等徑長規(guī)格均可適用。本發(fā)明優(yōu)選Agilent ZORBOX ECLIPSE XDB-C18 柱(4. 6mm X 250mm)。
其中,所述的檢測波長較佳地為215nm。其中,所述高效液相色譜法的其他色譜條件為本領(lǐng)域常規(guī)條件,優(yōu)選條件為流動相總流速較佳地為0. 5-1. OmL/min,更佳地為0. 8mL/min ;柱溫較佳地為30_40°C,更佳地為 35 "C。其中,所述的乳制品是指本領(lǐng)域常規(guī)的乳制品,一般為液體乳或乳粉。所述的液體乳可以為鮮乳、殺菌乳、酸乳或配方乳。所述的乳粉可以為全脂乳粉、脫脂乳粉或配方乳粉。其中,所述的提取乳制品中的β -乳球蛋白的方法優(yōu)選下述操作方式進行①離心脫脂所述的乳制品離心,去除脂肪得脫脂樣品;②凈化將ρΗ值為4. 6的醋酸鹽緩沖液和所述的脫脂樣品混合均勻,離心后取上
清液;③過濾過濾所述的上清液,得上機液。步驟①中,所述離心的條件和方法為本領(lǐng)域常規(guī)的離心條件和方法。所述離心的溫度較佳地為1-4°C。所述離心的速度較佳地為3500-4500轉(zhuǎn)/分鐘。所述離心的時間較佳地為10-15min。步驟①中,根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)方法,所述的乳制品以液態(tài)形式進行離心,即當所述的乳制品為液態(tài)乳時,可直接將所述的液態(tài)乳進行離心;當所述的乳制品為乳粉時,需將所述的乳粉與水混合得乳液,再進行離心,乳粉與水的混合比例較佳地為Ig乳粉5mL水-Ig 乳粉15mL水。步驟①中,所述的脫脂的條件和方法為本領(lǐng)域常規(guī)的脫脂條件和方法,其目的在于去除所述乳制品中的脂肪。按本領(lǐng)域常識,步驟①中所述的脫脂樣品可于_20°C保存,在M小時內(nèi)進行步驟 ②即可。步驟②中,所述醋酸鹽緩沖液中醋酸的濃度為本領(lǐng)域常規(guī)濃度,較佳地為 0.08-0. 12mol/Lo步驟②中,所述的醋酸鹽緩沖液和所述的脫脂樣品的體積比較佳地為 4 1-6 1。步驟②中,所述混合均勻的條件和方法為本領(lǐng)域常規(guī)的條件和方法,較佳地用漩渦振蕩器振蕩1-aiiin。步驟②中,所述離心的條件和方法為本領(lǐng)域常規(guī)的離心條件和方法。所述離心的溫度較佳地為1-4°C。所述離心的速度較佳地為6000-8000轉(zhuǎn)/分鐘。所述離心的時間較佳地為8-10min。步驟③中,所述過濾的條件和方法為本領(lǐng)域常規(guī)的條件和方法,較佳地采用 0. 45 μ m的濾膜進行過濾。本發(fā)明中,β -乳球蛋白的含量可通過本領(lǐng)域常用的定量分析方法確定的,較佳地選用外標法計算峰面積,從而確定β -乳球蛋白的含量。在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上,上述各優(yōu)選條件,可任意組合,即得本發(fā)明各較佳實例。本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。本發(fā)明的積極進步效果在于
本發(fā)明解決了復(fù)雜乳制品體系中乳球蛋白的快速提取和準確定量分析的問題,該法與目前常用的酶聯(lián)免疫法相比,具有檢測費用低、目標物出峰時間短,峰形尖銳對稱,分離度好,準確程度高,受環(huán)境變化影響小,有利于乳球蛋白在乳制品中含量的檢測。
圖1為β -乳球蛋白標準品的HPLC曲線圖。圖2為實施例2中檢測β -乳球蛋白的HPLC曲線圖。圖3為HPLC法測定β -乳球蛋白質(zhì)量濃度的標準曲線圖。
具體實施例方式下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明,但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,按照常規(guī)方法和條件,或按照商品說明書選擇。下述實施例中,β-乳球蛋白標準品購自于Sigma-Aldrich中國有限公司,批號為 9045-23-2,純度彡 90%。實施例1-2的高效液相色譜法條件色譜柱C18色譜柱(4. 6mmX250mm, Agilent公司,美國);流動相A 體積分數(shù) 0. 三氟乙酸的超純水溶液,流動相B 乙腈、超純水和三氟乙酸以400 100 0.5的體積比混合的混合液,等度洗脫流動相A和流動相B的體積比為81 19,總流速0.8mL/min, 柱溫35°C,檢測波長215nm。工作曲線的繪制(外標法測定物質(zhì)含量)準確稱取β-乳球蛋白標準品(其HPLC曲線見圖1),制成β-乳球蛋白溶液,用高效液相色譜測定溶液,其在215nm處的吸收峰繪制標準曲線如下Y = 1. 9729Χ-14. 674(R2 =0. 9942,見圖 3)實施例1嬰幼兒奶粉中β -乳球蛋白的含量測定①離心脫脂準確稱取IOg嬰幼兒奶粉(市售)樣品,使其完全溶解于IOOmL水中,然后在4°C下以4000r/min速度離心lOmin,去除上層漂浮的脂肪得脫脂樣品;②凈化分別取5mL 0. lOmol/L、pH值為4. 6的醋酸鹽緩沖液和ImL脫脂樣品于 IOmL離心管中,用漩渦振蕩器振蕩anin混合均勻,于4°C溫度下8000r/min離心lOmin,取
上清液;③過濾上清液經(jīng)0. 45 μ m濾膜過濾,得上機液;④取10 μ L上機液進高效液相色譜儀。測得嬰幼兒奶粉中β -乳球蛋白的含量15. 8mg/g。實施例2乳飲料中β-乳球蛋白的含量測定①離心脫脂取乳飲料樣品(市售)500ml,在4°C下以4000r/min速度離心lOmin, 去除上層漂浮的脂肪得脫脂樣品;②凈化取5mL 0. lOmol/L、pH值為4. 6的醋酸鹽緩沖液和ImL脫脂樣品于IOmL 離心管中,用漩渦振蕩器振蕩anin混合均勻,于4°C溫度下SOOOr/min離心lOmin,取上清液;③過濾上清液經(jīng)0. 45 μ m濾膜過濾,得上機液;④取10 μ L上機液進高效液相色譜儀。測得乳飲料中β -乳球蛋白的含量為2. 2mg/mL·效果實施例準確稱取3份實施例1的嬰幼兒奶粉10g,分別完全溶解于IOOmL水后,分別添加 500mg、lg和2g的β-乳球蛋白,其它步驟同實施例1。按實施例1-2的高效液相色譜法條件進行回收率試驗,分別重復(fù)6次。測得實施例1的樣品加標回收率分別為92%、92%和 100%, RSD分別為3. 1%,2. 9%和3. 6%,結(jié)果見表1。準確稱取3份實施例2的乳飲料500mL,分別添加1. 0g、2. 5g和5g的β -乳球蛋白,其它步驟同實施例2。按實施例1-2的高效液相色譜法條件進行回收率試驗,分別重復(fù) 6次。測得實施例2的樣品加標回收率平均值分別為85%、92%和98%,RSD分別為4. 6%、 1.9%和1.8%,結(jié)果見表1。準確稱取實施例1的嬰幼兒奶粉10g,完全溶解于IOOmL水后,添加500mg的β -乳球蛋白,其它步驟同實施例1。按實施例1-2的高效液相色譜法條件進行回收率試驗,重復(fù)測定12次,回收率為97%,RSD為1.8%,結(jié)果見表2。準確稱取實施例2的乳飲料500mL,添加2. 5g的β -乳球蛋白,其它步驟同實施例 2。按實施例1-2的高效液相色譜法條件進行回收率試驗,重復(fù)測定12次,回收率為93%, RSD為2.8%,結(jié)果見表2。表1實施例1-2回收率試驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種乳制品中β-乳球蛋白含量的檢測方法,其包括如下步驟提取乳制品中的 β-乳球蛋白,再通過高效液相色譜法測定含量;所述高效液相色譜法的色譜條件為色譜柱為C18色譜柱,等度洗脫,檢測波長為210-230nm,洗脫液由流動相A和流動相B組成, 所述流動相A和所述流動相B的體積比為80 20-82 18 ;所述流動相A為體積分數(shù) 0. 05-0. 15%的三氟乙酸的超純水溶液,所述流動相B為乙腈、超純水和三氟乙酸的混合液,所述流動相B中所述乙腈和超純水的體積比為320 100-480 100,所述超純水和三氟乙酸的體積比為100 0. 4-100 0.6。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測方法,其特征在于,所述的Cw色譜柱為AgilentZORBOX ECLIPSE XDB-C18柱;和/或,所述的檢測波長為215nm。
3.如權(quán)利要求1或2所述的檢測方法,其特征在于,所述高效液相色譜法測定的色譜條件還包括流動相總流速為0. 5-1. OmL/min,較佳地為0. 8mL/min ;柱溫為30_40°C,較佳地為 35 0C ο
4.如權(quán)利要求1所述的檢測方法,其特征在于,所述的乳制品為液體乳或乳粉。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測方法,其特征在于,所述提取乳制品中的β-乳球蛋白的方法按下述操作方式進行①離心脫脂所述的乳制品離心,去除脂肪得脫脂樣品;②凈化將PH值為4.6的醋酸鹽緩沖液和所述的脫脂樣品混合均勻,離心后取上清液;③過濾過濾所述的上清液,得上機液。
6.如權(quán)利要求5所述的檢測方法,其特征在于,步驟①中所述離心的溫度為1-4°C;所述離心的速度為3500-4500轉(zhuǎn)/分鐘;所述離心的時間為10-15min。
7.如權(quán)利要求5所述的檢測方法,其特征在于,步驟①中所述的乳制品以液態(tài)形式進行離心,當所述的乳制品為乳粉時,需將所述的乳粉與水混合得乳液,再進行離心,乳粉與水的混合比例較佳地為Ig乳粉5mL水-Ig乳粉15mL水;和/或,步驟①中所述的脫脂樣品于_20°C保存,在M小時內(nèi)進行步驟②即可。
8.如權(quán)利要求5所述的檢測方法,其特征在于,步驟②中所述醋酸鹽緩沖液中醋酸的濃度為0. 08-0. 12mol/L ;和/或,步驟②中所述的醋酸鹽緩沖液和所述的脫脂樣品的體積比為 4 1-6 1。
9.如權(quán)利要求5所述的檢測方法,其特征在于,步驟②中所述混合均勻采用漩渦振蕩器振蕩Ι-aiiin ;和/或,步驟②中所述離心的溫度為1-4°C ;所述離心的速度為6000-8000 轉(zhuǎn)/分鐘;所述離心的時間為8-lOmin。
10.如權(quán)利要求5所述的檢測方法,其特征在于,步驟③中所述的過濾采用0.45μπι的濾膜進行。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種乳制品中β-乳球蛋白含量的檢測方法提取乳制品中的β-乳球蛋白,高效液相色譜法測定含量;高效液相色譜法C18色譜柱,等度洗脫,檢測波長為210-230nm,洗脫液由流動相A和流動相B組成,該流動相A為體積分數(shù)0.05-0.15%三氟乙酸的超純水溶液,該流動相B為乙腈、超純水和三氟乙酸的混合液,流動相A和流動相B的體積比為80∶20-82∶18;流動相B中乙腈和超純水的體積比為320∶100-480∶100,超純水和三氟乙酸的體積比為100∶0.4-100∶0.6。本發(fā)明的檢測方法費用低、目標物出峰時間短,峰形尖銳對稱,分離度好,準確程度高,受環(huán)境變化影響小,有利于β-乳球蛋白在乳制品中含量的檢測。
文檔編號G01N30/02GK102539575SQ201210015969
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月17日
發(fā)明者何亞斌, 孟瑾, 樓飛, 鄭小平, 韓奕奕, 韓惠雯 申請人:上海德諾產(chǎn)品檢測有限公司