專利名稱：伴侶蛋白10的免疫抑制作用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及治療移植物抗宿主疾病，和其他移植物相關的免疫學反應和疾病的方法。更具體的是，本發(fā)明涉及使用伴侶蛋白10預防和治療移植物抗宿主疾病的方法。
背景技術：
移植物抗宿主疾病(GVHD)是當免疫活性細胞(immunologically-competent cell)被導入個體體內時，例如在骨髓或干細胞移植過程中，發(fā)生的一種疾病。GVHD是指一種免疫學過程，是通過新移植的細胞產生的針對宿主組織的排斥反應。GVHD可在移植或輸入骨髓組織、造血干細胞、未被照射的血液制品和含有淋巴組織的實體器官后發(fā)生。
有兩種類型的GVHD，即急性和慢性的GVHD。急性GVHD在移植后的頭三個月內發(fā)生，臨床癥狀包括皮炎、腸炎和肝炎。慢性GVHD通常在移植三個月以后發(fā)生，是一種影響多器官和組織，如皮膚、胃腸道和肝臟的自體免疫綜合征。
供體T細胞可激發(fā)GVHD的發(fā)生。供體細胞識別宿主細胞抗原為外源物質，并通過增殖和釋放細胞因子發(fā)生應答，這些細胞因子反過來活化自體免疫系統(tǒng)的細胞。
同種異體骨髓移植或造血細胞移植仍然是治療惡性血液疾病如，白血病、骨髓瘤、淋巴瘤和再生障礙性貧血的最有效方法。嚴重的急性GVHD是骨髓移植過程中引起死亡和疾病的主要原因。慢性GVHD也可引起死亡，其幸存者經常是嚴重殘疾。
免疫抑制藥物在急性和慢性GVHD的預防、治療和處理中具有很重要的地位。該藥物可在移植之前和之后給予患者。目前用于治療GVHD的藥物包括環(huán)孢霉素、氨甲喋呤、他克莫司、西羅莫司(sacrolimus)、麥考酚酸嗎啉乙酯和類固醇。免疫抑制方案通常通過給予多種藥物的組合來取得最大作用。
伴侶蛋白10(cpn10)存在于多種生物體中，從細菌到人類，是熱休克蛋白家族(伴侶)的成員，是現有的進化最穩(wěn)定的蛋白質之一。伴侶分子涉及翻譯后折疊、靶向和其他蛋白質的組裝(Hartman等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，3394-8)，但它們本身不構成最終組裝結構的一部分(Ellis等人，1991，Annu.Rev.Biochem.60，321-47)。這些蛋白質在正常細胞中起一些基本的作用，但在細胞應激過程(例如，代謝紊亂、感染、炎癥、轉化)中其產生被上調。
出乎意料地發(fā)現伴侶蛋白10與早孕因子(EPF)具有相同的氨基酸序列(Morton等人，國際專利公開WO 95/15338)。EPF是一種與妊娠相關的物質，出現在受精后6-24小時內的母體血清中(Morton等人，1974，Nature，249；459-460和Morton等人，1976，Proc.R.Soc.Lond.，193；413-9)。它至少存在于妊娠的前半期，對胚胎的持續(xù)生長和存活是非常重要的(Morton等人，1987，Current Topics in Developmental Biology 23；73-92)?，F在清楚的是EPF具有許多生理學功能，其產生并不限于妊娠。
已有報道EPF可作為一種來自淋巴細胞的免疫抑制劑，釋放抑制因子(Rolfe等人，1988，Clin.Exp.Immunol.73，219-225)，并增強免疫抑制性抗淋巴細胞血清的玫瑰花抑制特性(rosette-inhibiting property)(Morton等人，1974和1976，見前)。EPF可抑制小鼠對2，4，6-三硝基氯苯的遲發(fā)型變態(tài)反應(Noonan等人，1979，Nature，278，649-51)，抑制有絲分裂原誘發(fā)的淋巴細胞增殖作用(Athanasas-Platsis，1993，PhDThesis，The University of Queensland)并抑制CD4+T細胞產生的IFN-γ。
但是，沒有直接的證據證實EPF或cpn10是否可能作為移植中的免疫抑制劑的能力，特別是在GVHD的預防中。伴侶蛋白60，是一種相關的熱休克蛋白，也可作為免疫抑制劑，還沒有顯示在GVHD中具有任何治療作用。實際上，以前的文獻教導熱休克蛋白對移植可產生副作用(Ogita等人，2000，Transplantation，69，2273-2277)。
發(fā)明目的本發(fā)明者已經意識到現在用于治療和處理GVHD的免疫抑制劑具有下列明顯缺陷(i)它們可誘發(fā)嚴重的副作用，例如高血壓，其需要另外用藥控制；中毒性腎損害(腎中毒，nephrotoxicity)，可在高達40％的患者中發(fā)生，經常迫使醫(yī)生使用藥物的亞最佳劑量來抑制這種毒性；CNS作用，如震顫、頭痛、抑郁、感覺異常、視力障礙和痙攣；細菌、真菌或病毒感染的機會增加，癌癥，特別是皮膚癌發(fā)生的機會增加，食欲減退，惡心和毛發(fā)生長過度；(ii)在很大比例的患者中GVHD對藥物是有抗性的，需要組合藥物治療；(iii)這種藥物非常昂貴；(iv)已經證明這些藥物與其他治療藥物、免疫作用和天然食物具有負性的相互作用，這種治療藥物如抗生素，NSAID，抗癲癇藥和抗真菌劑，這種免疫作用，如風疹和脊髓灰質炎，這種天然食物如葡萄柚(在環(huán)孢菌素的情況下)。
因此，開發(fā)與現在所使用的治療方法相比，具有更小的副作用，并對市場上現有藥物有抗性的患者更有效的新型藥物來治療和處理GVHD，在市場上具有巨大的需求。
本發(fā)明者出乎意料地發(fā)現cpn10可作為一種新的治療方法，在GVHD的治療和處理中具有巨大的臨床潛力。

發(fā)明內容
在廣義上，本發(fā)明致力于在移植中應用cpn10，特別是治療和/或預防移植物抗宿主疾病中應用cpn10。
在廣義形式上，本發(fā)明提供了將cpn10給予供體和/或受體動物或細胞、來自供體的組織或器官，盡管本發(fā)明特別有優(yōu)勢的方面是提供對供體和受體動物的治療。
因此，在第一個方面，本發(fā)明提供了治療性或預防性處理移植物抗宿主疾病(GVHD)的方法，包括以下步驟(i)給予供體動物或細胞、來自該動物的器官或組織藥學有效量的伴侶蛋白10(cpn10)或cpn10的衍生物；并(ii)給予受體動物藥學有效量的cpn10或cpn10的衍生物，以延緩、減輕、抑制或進一步減少移植一種或多種細胞、組織或器官給受體動物后產生的一種或多種GVHD癥狀。
優(yōu)選在步驟(ii)之前或之后均給予受體動物藥學有效量的cpn10或cpn10的衍生物。
優(yōu)選給予動物的藥學有效量的cpn10或cpn10衍生物的范圍在0.1-100mg每千克/體重之間。更優(yōu)選，其范圍在0.1-10mg每千克/體重之間。
優(yōu)選，動物是哺乳動物。
優(yōu)選哺乳動物是人。
較合適的是，細胞、組織或器官是骨髓或來自骨髓。
較合適的是，治療或預防性治療GVHD的方法進一步包括下列的步驟，即給予所述的供體動物和/或所述的受體動物至少另一種選自環(huán)孢菌素、他克莫司、西羅莫司、麥考酚酸嗎啉乙酯和氨甲喋呤的免疫抑制劑。
較合適的是，治療或預防性治療GVHD的方法進一步包括給予所述供體動物和/或所述受體動物類固醇的步驟。
在第二個方面，提供了抑制、阻止或進一步減少動物產生TNFα的方法，包括給予所述動物藥學有效量的cpn10或cpn10衍生物的步驟，以抑制、阻止或進一步減少所述動物中TNFα的產生。
優(yōu)選動物是哺乳動物。
優(yōu)選動物是人。
根據這個方面，本發(fā)明也提供了一種抑制、阻止或進一步減少從動物獲得的一種或多種細胞、組織或器官產生的TNFα的方法，其包括以下步驟，即給予所述細胞、組織或器官藥學有效量的cpn10或cpn10衍生物以抑制所述動物產生TNFα。
在第三個方面，本發(fā)明提供了誘導、擴大或進一步增加動物IL-10產生的方法，包括以下的步驟，即給予所述動物藥學有效量的cpn10或cpn10衍生物，以誘導、擴大或進一步增加所述動物中IL-10的產生。
優(yōu)選動物是哺乳動物。
優(yōu)選哺乳動物是人。
根據這個方面，本發(fā)明也提供了誘導、擴大或進一步增加來自動物的一種或多種細胞、組織或器官產生TNFα的方法，其包括以下的步驟，即給予所述細胞、組織或器官藥學有效量的cpn10或cpn10衍生物以誘導所述動物產生IL-10。
在第四個方面，提供了一種藥學組合物，可根據任何前述的方面中的方法應用，其含有藥學有效量的cpn10或cpn10衍生物，以及一種藥學可接受的載體，賦形劑或稀釋液。
優(yōu)選另一種免疫抑制劑中至少一種是一種免疫抑制藥物，或針對B或T淋巴細胞或介導它們活化的表面受體的特異抗體。
優(yōu)選，該免疫抑制藥物是環(huán)孢霉素、他克莫司、西羅莫司、麥考酚酸嗎啉乙酯和氨甲喋呤中的任何一種。
在第五個方面，提供了含有類固醇的第四個方面的藥學組合物。
優(yōu)選，所述的cpn10蛋白具有

圖1(SEQ ID NO1)中所示的氨基酸序列。
在本說明書中，″含有″被廣泛使用而不是專用，應被理解為包含所述的整數或一組整數，但不排除任何其他的整數或整數組。
附表簡要說明圖1cpn10蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。
圖2體內cpn10治療對LPS和同種抗原誘導的小鼠腹膜巨噬細胞促炎應答和T細胞分化的作用。
圖3骨髓移植的和移植后用cpn10治療的小鼠的存活。在移植后的時間(0天至21天)，動物皮下注射載體(同系，n＝8，同種異體對照組，n＝10)或cpn10(10和100μg/動物/天cpn10 10μg/天，同種異體，n＝10和cpn10 100μg/天，同種異體，n＝10)。B.小鼠GVHD臨床計分與時間的作圖(0-45天；**P＜0.01)。
圖4骨髓移植的和移植前用cpn10治療的小鼠的存活。受體和供體小鼠移植前皮下注射cpn10(100μg/天)或對照稀釋液5天。然后產生5組動物第1組同系對照(n＝8)表示為B6D2F1，移植了同系的B6D2F1骨髓和T細胞；第2組由稀釋液預處理的B6D2F1受體組成的同種異體對照(n＝10)移植了稀釋液預處理的B6供體細胞；第3組預處理的同種異體受體(n＝10)，受體B6D2F1小鼠移植前用cpn10處理，移植B6供體細胞預處理的載體；第4組用稀釋液預處理的受體B6D2F1小鼠僅接受cpn10預處理的B6供體的移植物(同種異體預處理的供體，n＝10)；和第5組B6D2F1受體和B6供體小鼠在移植前均用cpn10預處理(同種異體預處理的受體和供體，n＝10)。(與同種異體對照相比*P＜0.01)。B.小鼠的GVHD臨床計分與時間的作圖(0-30天；***P＜0.001)。
具體實施例方式
本發(fā)明者已經證明了cpn10在小鼠體內移植模型中具有顯著的免疫抑制活性，cpn10的處理可提高患有GVHD的小鼠的生存率。這是第一次證實了cpn10的有效的免疫抑制作用和在體內GVHD模型中增加的生存率。
如果供體和受體動物在移植手術之前都用cpn10處理，cpn10處理的效果是增加的。本發(fā)明也證實了cpn10可抑制脂多糖介導的TNFα分泌，并促進小鼠巨噬細胞產生IL-10。IL-10是一種有效的免疫抑制性細胞因子，其對LPS發(fā)生獲得性和先天性免疫應答的有效抑制劑。
同種異體骨髓移植(BMT)后的急性GVHD是一種T細胞介導的疾病，其中供體T細胞可識別異種的宿主抗原，并以Th1顯性的方式分化。得到的T細胞來源的Th1細胞因子當與脂多糖(LPS)接觸時，可激發(fā)供體的單核細胞釋放可引起細胞病變數量的炎性細胞因子(如，TNFα)。LPS可從GVHD和以前放射治療損壞的胃腸道粘膜中滲透出來。因此，TNFα以及產生的失調的細胞毒性細胞因子可一起誘導宿主組織發(fā)生凋亡。T細胞定向的免疫抑制作用，特別是可抑制IL-2產生的藥物可防止BMT模型中GVHD的死亡率。
本發(fā)明在骨髓移植方面進行了舉例說明。但要理解的是這種概念可應用于其他細胞、組織和器官，其包括能夠啟動宿主免疫應答的免疫活性細胞。這些細胞、組織或器官的非限制性實例包括肝、肺、心、腎和干細胞和祖細胞。
在此描述的發(fā)明可廣泛用于任何動物，但特別針對哺乳動物，優(yōu)選人。例如，本發(fā)明針對家畜、家養(yǎng)動物、實驗室動物和表演動物(例如，賽馬和駱駝)的移植。
對于本發(fā)明而言，“分離的”的含義是指已經從其天然狀態(tài)或經過人為處理移出的物質。分離的物質實質上或基本上去掉了在其天然狀態(tài)中與其正常相伴隨的成分，或被處理以與其天然狀態(tài)中正常伴隨的成分處于人造的狀態(tài)。分離的物質可以是天然的、化學合成的或重組的形式。
“蛋白質”是指氨基酸聚合物。如本領域中所熟知的那樣，氨基酸可以是D-和L-型的天然的或非天然的氨基酸。
“肽”是具有不超過50個氨基酸的蛋白質。
“多肽”是具有超過50個氨基酸的蛋白質。
本文所使用的術語“核酸”是指單鏈或雙鏈mRNA，RNA，cRNA，RNAi和DNA，包括cDNA和基因組DNA。
“免疫抑制劑”是指可預防或治療性抑制自體免疫，或針對移植的同種異體或異種細胞、組織或器官的免疫應答，或防止移植物抗宿主疾病。
優(yōu)選給予個體的藥學有效量的cpn10的范圍在0.1-100mg之間。
更優(yōu)選給予個體的藥學有效量的cpn10的范圍在0.1-10mg之間。
普通技術人員可以理解的是前述的藥學有效量是根據標準的70kg人來計算的。因此，用藥量可根據個體的體重、年齡、性別、一般健康狀況和適應情況，以及個體進行的任何其他治療而變化。而且，給予的cpn10的量要同時考慮給藥頻次和給藥時間。
也可理解的是前述的藥物有效量的cpn10可給予動物，例如家養(yǎng)動物和家畜。對本領域的普通技術人員而言用藥量可根據動物的體重和類型而改變是很淺顯的。
給予人或其他動物的cpn10可以是任何形式的分離的cpn10，包括但不限于重組的cpn10(SEQ ID NO1)、天然cpn10、聚乙二醇化的cpn10、重組cpn10-GSM或cpn10的任何其他衍生蛋白質。
合適的cpn10核苷酸和氨基酸序列在本領域中是為人所熟知的，但是為了方便普通技術人員引用下列哺乳動物的cpn10序列(i)人cpn10(NCBI Entrez登記號No.U07550；Chen等人，1994，Biochim.Biophys.Acta，1219，189-190)(ii)鼠cpn10(NCBI Entrez登記號No.U09659；Dickson等人，1994，J.Biol.Chem.，269，26858-864)；和(iii)大鼠cpn10(NCBI Entrez登記號No.X71429；Ryan等人，1994，FEBS Lett.，337，152-156)。
在移植手術前，供體和受體均用cpn10治療。
優(yōu)選供體在移植手術之前不超過7天接受cpn10治療。更優(yōu)選供體在移植手術之前2至5天接受cpn10治療。
優(yōu)選受體在移植手術前不超過7天接受cpn10治療，在手術后不超過90天接受cpn10治療。更優(yōu)選的是，受體在移植手術前2至5天接受cpn10治療，手術后不超過60天接受cpn10治療。更為優(yōu)選的是，受體在移植手術前2至5天接受cpn10治療，在手術后10至30天接受cpn10治療。
本文所使用的，本發(fā)明的“衍生”蛋白質是一些如cpn10蛋白的蛋白質，它已經通過例如與其他化學成分交聯或絡合，或通過如本領域所知的翻譯后修飾技術被改變，包括融合伴侶蛋白。
本發(fā)明考慮的其他衍生作用包括但不限于，在肽、多肽或蛋白合成過程中聚乙二醇化進行側鏈的修飾，摻入非天然氨基酸和/或其衍生物，和使用交聯劑和可將構象約束(conformaional constraint)施加于本發(fā)明的多肽、片段和變異體上的其他方法。本發(fā)明所考慮的側鏈修飾的實例包括氨基基團的修飾，如醋酸酐的酰化；琥珀酸酐和四氫鄰苯二甲酸酐對氨基基團的?；?；甲基亞氨逐乙酸酯(methylacetimidate)的瞇基化；氰酸鹽對氨基基團的氨基甲?；?；5-磷酸吡哆醛對賴氨酸的吡哆化，然后用NaBH4還原；與乙醛反應進行還原性烷基化反應，然后用NaBH4還原；并用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)對氨基基團進行三硝基芐基化。
羧基通過形成O-acylisourea可被碳化二亞胺活化，隨后衍化為、例如相應的酰胺。
精氨酸殘基的胍基可通過使用一些如2，3-丁二酮，苯甲酰甲醛和乙二醛的試劑形成雜環(huán)縮合產物而被修飾。
巰基可通過如下列的方法進行修飾，如過甲酸氧化為半胱磺酸；使用4-氯汞基硫酸苯酯、4-氯汞基苯甲酸鹽、2-氯汞基-4-硝基酚、苯基氯化汞和其他的汞劑形成汞衍生物；與其他的硫醇化合物形成混合二硫化物；與馬來酰亞胺、馬來酸酐或其他被取代的馬來酰亞胺反應；與碘乙酸或碘乙酰胺的羧甲基化作用；和與氰酸鹽在堿性pH條件下的甲氨酰化作用。
色氨酸殘基可被修飾，例如2-羥基-5-硝基芐基溴化物或磺酰鹵對吲哚環(huán)的烷基化作用；或N-溴代丁二酰亞胺的氧化作用。
酪氨酸殘基可通過四硝基甲烷的硝化作用形成3-硝基酪氨酸衍生物而被修飾。
組氨酸殘基的咪唑環(huán)可通過焦碳酸二乙酯的N-乙酯基化或通過碘乙酸衍生物的烷基化作用而被修飾。
在肽合成過程中摻入非天然氨基酸的實例包括但不限于，使用4-氨基丁酸、6-氨基己酸、4-氨基-3-羥基-5-苯戊酸、4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸、t-丁基甘氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、苯基甘氨酸、鳥氨酸、肌氨酸、2-噻吩丙氨酸和/或氨基酸的D-異構體。
衍生物也可包括融合伴侶(fusion partner)和抗原決定簇標志。熟知的融合伴侶的實例包括但不限于，谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)，人IgG的Fc部分，麥芽糖結合蛋白(MBP)和六聚組氨酸(HIS6)，特別用于親和色譜分離融合蛋白。為了使用親和色譜進行融合多肽純化，親和色譜的相應基質分別是谷胱甘肽-，直鏈淀粉-，和鎳-或鈷-交聯的樹脂。許多這樣的基質可在“試劑盒”中獲得，如使用(HIS6)融合伴侶的QIAexpressTM系統(tǒng)(Qiagen)和Pharmacia GST純化系統(tǒng)。
如Ryan等人(見前)所述，融合伴侶的一個特殊實例是GST。在一些情況下，融合伴侶也具有蛋白酶裂解位點，如因子Xa或凝血酶的位點，可使相關的蛋白酶部分地消化本發(fā)明的融合多肽，從而從中釋放本發(fā)明的重組多肽。然后，釋放的多肽通過隨后的色譜分離從融合伴侶中分離。例如在裂解GST-cpn10的過程中，產生了衍生的GSM-cpn10蛋白。
根據本發(fā)明的融合伴侶也包括在“抗原決定簇標志”的范圍內，而抗原決定簇標志通常是可獲得特異抗體的短肽序列。熟知的很容易獲得特異單克隆抗體的抗原決定簇標志包括c-myc、血細胞凝集素和FLAG標志。
本發(fā)明的cpn10蛋白(包括片段、變異體、衍生物和同系物)可通過本領域中普通技術人員已知的任何合適的方法來制備，包括化學合成和重組表達。
優(yōu)選cpn10是重組cpn10。
例如，該重組cpn10蛋白可通過包括下列步驟的方法來制備(i)制備一種表達構建物，含有編碼cpn10的分離核酸，在表達載體中與一個或多個調控核苷酸序列可操作地相連接；(ii)用表達構建物轉染或轉化合適的宿主細胞；和(iii)在所述的宿主細胞中表達重組蛋白。
“表達載體”可以是可自我復制的染色體外載體，如質粒，或可整合進宿主基因組的載體。
“可操作連接”是指所述的調控核苷酸序列可相對于本發(fā)明的重組核酸被定位來啟動、調節(jié)或控制轉錄。
調控核苷酸序列通常適合于用于表達的宿主細胞。對于各種宿主細胞，在本領域中已知有多種類型的合適的表達載體和合適的調控序列。
一般所述的一條或多條調控核苷酸序列包括但不限于，啟動子序列、引導或信號序列、核糖體結合位點、轉錄起始點和終止序列、拼接供體/受體序列，和增強子或激活物序列。
本發(fā)明可考慮本領域中已知的結構性或誘導性啟動子，包括例如，四環(huán)素阻遏性和金屬硫蛋白誘導性啟動子。這些啟動子可以是天然的啟動子或組合了超過一個啟動子的元件的雜合啟動子。
在一個優(yōu)選的實施方案中，該表達載體含有一個可選擇的標記基因，這樣可以選擇被轉化的宿主細胞?？蛇x擇的標基基因在本領域中是為人所熟知的，可根據所使用的宿主而變化。
合適的表達宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞，如大腸埃希氏桿菌(例如，DH5α)、酵母、使用桿狀病毒表達系統(tǒng)的SF9細胞、CHO細胞、COS、CV-1和293細胞，此外沒有限制。
重組cpn10蛋白可由本領域的普通技術人員使用標準的方法常規(guī)制備，例如Sambrook等人，Molecular Cloning(分子克隆)，實驗室手冊(Cold Spring Harbor Press，1989)所述，特別是第16和17節(jié)，其在此合并為參考文獻；Current Protocols in Molecular Biology(現代分子生物學方法)。Ausubel等人主編(John Wiley & Sons，Inc.1995-1999)，特別是第10和16章，其在此合并為參考文獻；和Current Protocols inProtein Science(現代蛋白科學方法)，Coligan等人(John Wiley & Sons，Inc.1995-1999)，特別是第1，5和6章，其在此合并為參考文獻。
使用pGEX系統(tǒng)產生和純化重組合成的cpn10的實例在WO95/15338中提供。使用已知可產生活性cpn10的高產量細菌表達系統(tǒng)(Ryan等人，見前)來產生用于本文所述的試驗中的cpn10(SEQ ID NO1)。
藥學組合物本發(fā)明提供了cpn10治療細胞、組織或器官移植引起的疾病或醫(yī)學病征，特別是GVHD的用途。
本發(fā)明也提供了含有cpn10或cpn10衍生物的藥學組合物。
很合適的是，藥學組合物含有一種合適的藥學可接受的載體、稀釋液或賦形劑。
很合適的是，藥學組合物含有cpn10或cpn10的衍生物、藥學可接受的載體、稀釋液或賦形劑和至少一種其他的免疫抑制劑。優(yōu)選，其他的免疫抑制劑是免疫抑制藥物或針對B或T淋巴細胞或介導它們活化的表面受體的特異抗體。更優(yōu)選的是，該免疫抑制劑是環(huán)孢霉素、氨甲喋呤、他克莫司、西羅莫司、麥考酚酸嗎啉乙酯和類固醇。該藥學組合物也可含有類固醇。
“藥學可接受的載體、稀釋液或賦形劑”的含義是固體或液體填充劑，稀釋液或可安全用于全身給藥的包封物質。根據給藥的具體途徑，可使用本領域熟知的多種載體。這些載體可選自糖、淀粉、纖維素及其衍生物、麥芽、明膠、滑石、硫酸鈣、植物油、合成油、多元醇、藻酸、磷酸鹽緩沖液、乳化劑、等滲鹽水和如包括鹽酸鹽、溴化物和硫酸鹽的無機酸鹽，如醋酸鹽、丙酸鹽和丙二酸鹽的有機酸的鹽類和無熱原水。
描述藥學可接受載體、稀釋液和賦形劑的有用的參考文獻是Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.N.J.USA，1991)，在此合并為參考文獻。
可使用任何安全的給藥途徑，為患者提供本發(fā)明的組合物。例如，可使用口服、直腸、胃腸外、舌下、含服、靜脈內、關節(jié)內、肌肉內、真皮內、皮下、吸入、眼內、腹膜內、腦室內、透皮等途徑。例如，肌肉內和皮下注射適合給予免疫原組合物，疫苗和DNA疫苗。
劑型包括片劑、分散劑、懸浮劑、注射劑、溶液劑、糖漿劑、錠劑、膠囊劑、栓劑、氣霧劑、透皮貼片劑等。這些劑型也包括注射或植入特別為此目的設計的可控釋放裝置，或被修飾以此方式作用的其他形式的植入體。例如，包括丙烯酸樹脂、蠟、高級脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸的疏水聚合物，和如羥基丙甲基纖維素的某些纖維素衍生物包被可影響治療制劑的可控釋放。另外，使用其他的聚合物基質(matrice)，脂質體和/微球體可影響可控釋放。
上述的組合物可用劑型相容的方式給藥，其量是藥學上有效的。給予患者的劑量，就本發(fā)明而言，應該足以在適當的時間周期內在患者身上產生有益的反應。給藥的制劑量可根據要治療的受試者的情況而定，包括年齡、性別、體重和一般健康狀況，以及根據醫(yī)生判斷的一些因素。
因此本發(fā)明很容易被理解，并付諸于實際應用，普通技術人員可參照下列非限制性的實例。
實施例方法移植根據Hill等人，1997，Blood，90，3204-3213，和Hill等人，1999，J.Clin.Invest，104，459-467所述的標準方法對小鼠進行移植。在第0天，B6D2F1小鼠接受1400cGy總量的全身照射(TBI，137Cs源)，這種照射間隔3小時分成兩次，以盡量減小胃腸道毒性。5×106骨髓細胞和2×106尼龍纖維純化的來自B6小鼠(同種異體)或B6D2F1小鼠(同系)脾供體的T細胞重新懸浮在0.25ml Leibovitz L-15培養(yǎng)基中，并靜脈注射進被照射的受體中。
重組cpn10的制備
XL 1-Blue大腸桿菌細胞使用表達載體pPL550轉化cpn10，并在37℃生長。對數生長的細胞通過將溫度增加至42℃，4小時誘導表達蛋白質。細胞離心沉淀，重新懸浮在30ml 0.025M pH8.0的TrisHCl中，并在-30℃儲存。
復溫來自1L培養(yǎng)物的細胞沉淀，用溶菌酶(100μg/ml；37℃15分鐘)溶解細胞，然后，超聲處理(5×10秒，4℃)，通過離心(30分鐘，4℃，48 384×g)去掉細胞碎片。
通過離子交換和疏水相互作用層析從已凈化的溶解物中純化Cpn10。使用10-20％Tris-Tricine的SDS-PAGE凝膠(100×100×1mm；Novex)，在柱餾分中該蛋白質被鑒定為大約10kDa的區(qū)帶。
將溶解物加于200ml Macroprep HighQ(BIO-RAD)的柱上，使用0.025M pH8.0的TrisHCl作為工作緩沖液，流速為8ml/min。保留未結合的餾分，調整pH為6.8。樣品加于5ml EconoPac S cartridge(BIO-RAD)上，使用0.025M磷酸鈉pH6.8緩沖液作為工作緩沖液，流速為2ml/min。用0→1M NaCl梯度的0.025M磷酸鈉緩沖液pH6.8的洗脫該柱，以2ml/min工作超過30分鐘。
含有cpn10的餾分被集中起來，加入等體積pH6.8的3M(NH4)2SO4的0.05M磷酸鈉緩沖液。樣品加于5ml Econo-pac Methyl HIC cartridge上，使用pH6.8的1.5M(NH4)2SO4的0.05M磷酸鈉緩沖液作為工作緩沖液，流速為2ml/min。用1.5→0M(NH4)2SO4梯度的0.05M磷酸鈉緩沖液pH6.8的洗脫該柱，以2ml/min工作超過15分鐘。
含有cpn10的餾分被集中起來，鹽水透析過夜，分成適當的體積，在-30℃下儲存。
Cpn10的治療在注射前重組人cpn10在PBS中進行稀釋。如所述，在BMT之前或之后對小鼠每天皮下注射cpn10(10μg/次，或100μg/次)。對照組的小鼠僅注射稀釋液。
評價GVHD全身GVHD程度的評價可通過存活率和評分系統(tǒng)進行評價，該系統(tǒng)以5個臨床參數的改變進行綜合體重下降、體態(tài)(隆起)、活力、皮毛質地和皮膚完整性(最大指數＝10)(Cooke等人，1996，Blood，88，3230-3239；Hill等人，1999，J.Clin.Invest，104，459-467)。每個小鼠進行耳標記，每周按照每個標準從0-2進行分級。具有嚴重臨床GVHD的動物(評分＞6)根據倫理學指導原則被處死，死亡日被認為是第二天。
統(tǒng)計學分析使用Kaplan-Meier估計值制作生存曲線，通過log-rank analysis進行比較。The Mann Whitney-U檢驗用來進行臨床計分的統(tǒng)計學分析。P＜0.05被認為是統(tǒng)計學上的差異。
實施例1-體外小鼠巨噬細胞實驗進行體外實驗以確定cpn10在生理細胞群體中的作用。
小鼠從澳大利亞研究中心(Perth，Western Australia，Australia)購買雌性C57BL/6(B6，H-2b，Ly-5.2+)，B6PtprcaLy-5a(H-2b，Ly-5.1+)和B6D2F1(H-2b/d，Ly-5.2+)小鼠。由澳大利亞國立大學(Canberra，Australia)提供C57BL/6IL-10-/-小鼠(B6，H-2b，Ly-5.2+)。用作移植受體的小鼠年齡在8至14周齡之間。移植后前2周，小鼠圈養(yǎng)在無菌微型隔離籠中，攝入酸性熱處理水(pH2.5)，正常飲食。
骨髓移植根據標準方法(Hill等人，1997，見前)對小鼠進行移植。簡言之，在第一天，B6D2F1小鼠全身接受1300cGy的總照射劑量(137Cs源，108cGy/min)，這種照射間隔3小時分成兩次，以盡量減小胃腸道毒性。供體骨髓(每個動物5×106)和脾T細胞(每個動物3×106)重新懸浮在0.25ml Leibovitz L-15培養(yǎng)基(Gibco BRL，Gaithersburg MD)中，靜脈注射給受體。每天監(jiān)測生存情況，每周進行GVHD臨床評分。Cpn10或對照稀釋液以每只動物100μg的劑量皮下注射。如上所述評價全身GVHD的程度。
細胞培養(yǎng)全過程使用的培養(yǎng)基為10％FCS/IMDM(JRH Biosciences，Lenexa，KS)，添加了50單位/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素、2mM L-谷胺酰胺、1mM丙酮酸鈉、0.1mM非必需氨基酸、0.02mM β-巰基乙醇和10mM HEPES。在pH7.75和37℃下，在5％CO2濕潤孵箱中進行實驗。
對于體外LPS刺激實驗，使用梯度濃度的LPS、TNFα和IL-10對腹膜巨噬細胞和脾細胞進行刺激，分別在5小時和48小時的培養(yǎng)上清液中進行測定。對于體外同種異體抗原實驗，在含有105被照射(2000cGy)的B6D2F1腹膜巨噬細胞(原代MLC)和72小時收獲的上清液的96孔板(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中培養(yǎng)純化的C57BL/6T細胞。然后用脈沖向培養(yǎng)物中添加3H-胸腺嘧啶核苷(每孔1μCi)，16小時后在1205Betaplate讀數儀(Wallac，Turku，Finland)上測定增殖情況。對于體外有絲分裂原的刺激，在平底96孔板中培養(yǎng)純化的C57BL/6T細胞，96孔板中預鋪單克隆CD3和CD28，終濃度為10μg/ml。48小時時收獲上清液，用脈沖向培養(yǎng)物中添加3H-胸腺嘧啶核苷(每孔1μCi)。16小時后測定增殖。
細胞因子ELISAS用于IFNγ、IL-10、IL-4和TNFα測定的抗體從PharMingen(SanDiego，CA)購買，根據生產廠商的方法進行測定。簡言之，樣品稀釋為1∶3至1∶24，用特異單克隆一抗(mAb)俘獲細胞因子，用生物素化標記的二抗mAb檢測。用鏈霉和素(strepavidin)和底物(Kirkegaard and Perrylaboratories，Gaithersburg，MD)對生物素標記的測定進行顯影。使用Spectraflour Plus微量滴定板讀數儀(Tecan，Durham，NC)在450nm對平板進行讀數。使用重組細胞因子(PharMingen)作為ELISA測定的標準品。樣品和標準品重復兩次，IFNγ的測定精度為0.063U/ml，IL-10，IL-4和TNFα為15pg/ml。
結果體內給予cpn10可降低腹膜巨噬細胞產生TNFα的能力(圖2A)。B6小鼠(n＝3)用cpn10(100μg，每天一次)(cpn10+)或對照稀釋液(cpn10-)治療5天。在第6天通過腹腔灌洗收獲腹膜巨噬細胞，在治療組內將每只動物的細胞集中在一起。沒有(未顯示)或存在LPS(1μg/ml)下，細胞以2×105/孔接種。5小時時收集培養(yǎng)上清液，通過ELISA測定TNFα(pg/ml)水平。根據CD11b的染色將結果標準化為每105巨噬細胞的產生量。圖2A顯示兩次相同試驗的結果。這些細胞中LPS-誘導的TNFα分泌減少了40％。
體內用cpn10治療可增加脾細胞IL-10的產生(圖2B)。如上所述B6小鼠用cpn10或對照稀釋液處理。第6天收獲脾細胞，在治療組中將來自每個動物的細胞集中在一起，然后沒有(未顯示)或存在LPS(10μg/ml)下，以5×105/孔進行培養(yǎng)。48小時時收集培養(yǎng)上清液，ELISA測定IL-10(pg/ml)的水平。兩次相同試驗的數據顯示在圖2B中。與對照動物相比，可觀察到顯著增加的IL-10產生。
體內用cpn10處理可減少IL10-/-腹膜巨噬細胞的TNFα產生(圖2C)。IL10-/-B6小鼠用cpn10或對照稀釋液治療，第6天通過腹腔灌洗收獲腹膜巨噬細胞，將治療組內每只動物的細胞集中在一起。培養(yǎng)5小時后，在沒有(LPS 0)或存在LPS(0.1、1和10μg/ml)的情況下，在培養(yǎng)上清液中測定TNFα的量。Cpn10-介導的減少LPS誘導的TNFα的產生(圖2A)不需要IL-10，因為當來自cpn10處理的IL-10-/-小鼠的腹膜巨噬細胞用LPS體外刺激時，可觀察到類似的TNFα分泌減少。因此，減少的TNFα分泌和增加的IL-10產生似乎與cpn10處理的結果無關。
Cpn10處理似乎不影響T細胞IFNγ或IL-4的分泌。以前的報道表明cpn10可抑制T細胞對有絲分裂原應答的增殖作用(Morton H.1998Immunol.Cell Biol，76，483-496)。Th1免疫反應的特征通常是如TNFα和IFNγ的促炎細胞因子。Th2反應涉及IL-4和IL-10的分泌，調節(jié)性T細胞(Treg)反應的特征是IL-10和TGFβ的產生。由于Th2和Treg反應可抑制增殖，Th1反應可抑制細胞因子的產生，因此研究cpn10影響T細胞分化的能力。
體內給予cpn10不影響T淋巴細胞對同種異體抗原的增殖性反應(圖2D)。B6小鼠(n＝3)每天注射cpn10或對照稀釋液進行處理。脾細胞來源的T細胞群體在體外用同種異體脾細胞在混合淋巴細胞培養(yǎng)(MLC)中刺激7天。純化的T細胞(0.5×105，1×105和2×105/孔)用被照射的同種異體B6D2F1腹膜巨噬細胞(0.5×105/孔)刺激，72小時時通過標準的3[H]胸腺嘧啶核苷摻入試驗測定增殖。圖2D中標注的數值代表3個孔的均數±SE。MLC中T細胞的增殖在cpn10治療和對照動物之間的變化不明顯，表明cpn10不是T細胞生長調節(jié)物。
圖2E-G顯示體內給予cpn10對T細胞分化的作用。如上所述用cpn10體內處理B6動物。來自cpn10處理和載體處理動物的T細胞(2×106/孔)用被照射的同種異體B6D2F1脾細胞(3×106/孔)(原代混合淋巴細胞培養(yǎng))在培養(yǎng)中刺激7天。在第7天，收集T細胞，用結合在平板上的可刺激T細胞的CD3和CD28抗體重新刺激。24小時時收獲培養(yǎng)上清液，通過ELISA測定IFNγ、IL4和IL-10的濃度。圖4E-G中的濃度數值代表三個孔的均數±SE。
在cpn10處理和對照動物之間T細胞的IL-4分泌(圖2E)和IFNγ分泌(圖2F)變化不明顯，表明cpn10不影響Th1/Th2的平衡。
相反，T細胞IL-10的分泌明顯升高(圖2G)。當在體外而不是體內細胞培養(yǎng)(MLC)過程中進行cpn10處理時，也觀察到類似的IL-10分泌增加和增殖，IFNγ和IL-4未受影響(數據未顯示)。這些數據表明cpn10可增強對LPS和同種異體抗原刺激反應引起的IL-10產生，表明cpn10增強的IL-10產生部分來自T細胞來源的IL-10。
實例2-在體內GVDH模型中移植前和移植后cpn10治療的作用進行體內實驗以便研究是否在移植期前給予cpn10可預防GVHD。
處理后給予cpn10來自供體B6小鼠的骨髓細胞(5×106/動物)和純化的T細胞(上述)移植進致死量照射(1100cGy)的B6D2F1受體小鼠(同種異體組)內。同系對照組的B6D2F1受體接受相同劑量的B6D2F1骨髓和T細胞。在移植后的時間(0至21天)動物皮下注射載體(同系，n＝8和同種異體對照組，n＝10)或cpn10(10和100μg/動物/天cpn10 10μg/天同種異體組，n＝10和cpn10 100μg/天，同種異體組，n＝10)。GVHD臨床計分(如上所述)被確定為生存動物GVHD嚴重性的指標。與用載體處理的同種異體對照相比，在用100μg/天cpn10注射的同種異體動物中在第14和21天觀察的臨床GVHD更輕微(**P＜0.01)。在載體注射和cpn10注射的同種異體組之間生存百分比沒有顯著差異。圖3顯示了小鼠生存曲線的Kaplan-Meier分析。
骨髓移植(BMT)后給予cpn10不能預防GVHD的死亡，通過GVHD臨床計分測定死亡率僅暫時降低(圖3B)。與用載體治療的同種異體對照相比，在用100μg/天cpn10注射的同種異體動物中在第14和21天觀察到的GVHD臨床更輕微(**P＜0.01)。
處理前給予cpn10受體B6D2F1和供體B6小鼠移植前用cpn10(100μg/天/皮下)或對照稀釋液治療5天。第6天從B6供體小鼠收獲的骨髓(5×106/動物)和T細胞(3×106/動物)被移植進致死量照射的B6D2F1受體中。5組受體分組如下第1組同系對照(n＝8)代表用同系B6D2F1骨髓和T細胞移植的B6D2F1。
第2組由稀釋液預處理的B6D2F1受體組成的同種異體對照(n＝10)，移植用稀釋液預處理的B6供體細胞。
第3組同種異體受體預處理(n＝10)，受體B6D2F1小鼠移植前用cpn10處理，并移植載體預處理的B6供體小鼠細胞。
第4組僅用稀釋液預處理的受體B6D2F1小鼠接受cpn10預處理的B6供體的移植物(同種異體供體預處理，n＝10)。
第5組在移植前，B6D2F1受體和B6供體小鼠用cpn10預處理(預處理的同種異體受體和供體，n＝10)。
如上所述GVHD臨床計分被認為是衡量存活動物GVHD嚴重性的指標。
與同種異體對照組相比，第5組中第7天觀察到的臨床計分顯著較低(在移植前用cpn10預處理的受體和供體)(圖4B；***P＜0.001)。圖4顯示了小鼠生存曲線的Kaplan-Meier分析。
在移植前給予移植供體和受體cpn10五天可顯著降低GVHD的死亡率(與同種異體對照相比*P＜0.01)。另外，以臨床計分作為指標，GVHD嚴重程度也在BMT后早期被降低。當在BMT前給藥時，cpn10減少GVHD死亡率的能力與在此所述的抗炎作用是密切相關的，即限制TNFα的產生(Hill等人，1998 J.Clin.Invest.，102，115-123；Hill等人，1997，見前)。在BMT后給予cpn10不能阻止GVHD的發(fā)生，與此相一致的是在本實施例中所使用的劑量和用藥方案下對T細胞的活化和分化沒有作用，表示在圖3中。
在這些模型中，移植物的預處理(致死性照射)產生了一種過程，進行性的胃腸道損傷、LPS泄漏和炎性細胞因子的產生反過來可誘導進一步的胃腸道損傷，這樣該過程形成了一種正反饋環(huán)路。該過程可被一些保護腸道放射損傷的藥物制劑(如IL-11和角質形成細胞生長因子；Krijanovski等人，1999，Blood，94，825-831)、直接的LPS拮抗劑(Cooke等人，2001，J.Clin.Invest.，107，1581-1589)或TNFα本身的抑制劑(Hill等人，1997見前)所中斷。但是，除非TNFα被完全中和，或對T細胞活化和分化有其他的作用，這些制劑傾向于延緩而不是防止GVHD，。因此通過給予cpn10降低GVHD死亡率與在BMT后早期限制LPS的信號傳導和隨后TNFα的產生是密切相關的，但對隨后同種異體反應性的T細胞功能沒有影響。
因此，在GVHD的治療中cpn10有潛力成為一種重要的治療性藥物。當在移植操作前同時給予供體和受體cpn10時，觀察到GVHD的治療有效性增加，與其密切相關的事實是在移植期后TNFα從組織或器官中均可產生(Cooke等人，2000，J.Immunol.，165，6612-6619；Speiser等人，1997，J.Immunol.，158，5185-5190)。
而且，cpn10可與限制再次獲得性免疫反應的傳統(tǒng)免疫抑制劑聯合用于治療GVHD。
在整篇說明書中，其目的是要描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，而不將本發(fā)明限制于任何一個實施方案或一些具體的特征。因此，本領域普通技術人員要理解的是，就本說明書而言，對于作為例證的特殊實施方案可進行各種各樣的改進和變換，并不背離本發(fā)明的精神。
在此所引用的所有計算機程序、算法、專利和科學文獻在此作為參考文獻。
權利要求
1.一種治療性或預防性治療移植物抗宿主疾病(GVHD)的方法，其特征在于包括以下步驟(i)將藥學有效量的伴侶蛋白10(cpn10)或cpn10的衍生物給予供體動物或從其獲得的細胞、器官或組織；和(ii)給予受體動物藥學有效量的cpn10或cpn10的衍生物，以延緩、減輕、抑制或進一步減少移植一種或多種細胞、組織或器官給受體動物后產生的一種或多種GVHD癥狀。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述藥學有效量的伴侶蛋白10或cpn10的衍生物在步驟(ii)之前和之后均給予受體動物。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述藥學有效量的cpn10或cpn10的衍生物在步驟(ii)前不超過7天給予供體和受體動物。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述藥學有效量的cpn10或cpn10的衍生物在步驟(ii)前2至5天給予供體和受體動物。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述藥學有效量的cpn10或cpn10的衍生物在步驟(ii)后不超過90天給予受體動物。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述藥學有效量的cpn10或cpn10的衍生物在步驟(ii)后不超過60天給予受體動物。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述藥學有效量的cpn10或cpn10的衍生物在步驟(ii)后10至30天給予受體動物。
8.根據權利要求1至7中任何一項所述的方法，其特征在于所述cpn10蛋白具有圖1(SEQ ID NO1)中所示的氨基酸序列。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述給予動物的藥學有效量cpn10或cpn10的衍生物在0.1-100mg每千克/體重范圍內。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述給予動物的藥學有效量cpn10或cpn10的衍生物在0.1-10mg每千克/體重范圍內。
11.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述細胞、組織或器官是骨髓，或來自骨髓。
12.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述動物是哺乳動物。
13.根據權利要求12所述的方法，其特征在于所述哺乳動物是人。
14.根據權利要求1中的方法，其特征在于進一步包括給予所述供體動物和/或所述的受體動物至少一種其他的選自環(huán)孢菌素、他克莫司、西羅莫司、麥考酚酸嗎啉乙酯和氨甲喋呤的免疫抑制劑的步驟。
15.根據權利要求1中的方法，其特征在于進一步包括給予所述的供體動物和/或受體動物類固醇的步驟。
16.一種抑制、阻止或進一步減少動物產生TNFα的方法，其特征在于包括給予所述動物藥學有效量的cpn10或cpn10的衍生物以抑制、阻止或進一步減少所述動物產生TNFα的的步驟。
17.一種抑制、阻止或進一步減少來自動物的一種或多種細胞、組織或器官產生TNFα的方法，其特征在于包括給予所述細胞、組織或器官藥學有效量的cpn0或cpn10的衍生物以抑制所述動物產生TNFα的步驟。
18.根據權利要求16或17所述的方法，其中所述動物是哺乳動物。
19.根據權利要求18所述的方法，其特征在于所述哺乳動物是人。
20.一種誘導、擴大或進一步增加動物IL-10產生的方法，其特征在于包括給予所述動物藥學有效量的cpn10或cpn10的衍生物以誘導、擴大或進一步增加所述動物產生IL-10的步驟。
21.一種誘導、擴大或進一步增加來自動物的一種或多種細胞、組織或器官產生TNFα的方法，其特征在于包括給予所述細胞、組織或器官藥學有效量的cpn10或cpn10的衍生物以誘導所述動物產生IL-10的步驟。
22.根據權利要求20或權利要求21所述的方法，其特征在于所述動物是哺乳動物。
23.根據權利要求22所述的方法，其特征在于所述哺乳動物是人。
24.一種根據權利要求1、16或17使用的藥學組合物，其特征在于含有藥學有效量的cpn10或cpn10的衍生物，和藥學可接受的載體、賦形劑或稀釋液。
25.根據權利要求24所述的藥學組合物，其特征在于進一步含有至少一種其他的免疫抑制劑。
26.根據權利要求25所述的藥學組合物，其特征在于所述的其他免疫抑制劑是免疫抑制藥物，或針對B或T淋巴細胞或介導它們活化的表面受體的特異抗體。
27.根據權利要求25中的藥學組合物，其特征在于所述的其他免疫抑制劑是環(huán)孢菌素、他克莫司、西羅莫司、麥考酚酸嗎啉乙酯和氨甲喋呤中的任何一種。
28.根據權利要求24至27中任何一項所述的藥學組合物，其特征在于進一步含有類固醇。
29.根據任何前述權利要求所述的藥學組合物，其特征在于所述的cpn10具有圖1(SEQ ID NO1)中所示的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明是針對cpn10在移植中的應用，特別是針對在治療和/防止移植物抗宿主疾病中的應用。本發(fā)明提供了將cpn10給予供體和/或受體動物或細胞、來自供體的組織或器官的方法，盡管本發(fā)明特別優(yōu)選用于治療供體和受體動物。該方法進一步包括給予供體和/或受體動物至少一種其他的免疫抑制劑以防止或緩解移植物抗宿主疾病。
文檔編號A61P37/06GK1735428SQ200380108296
公開日2006年2月15日 申請日期2003年11月6日 優(yōu)先權日2002年11月6日
發(fā)明者G·R·希爾, T·巴諾維奇 申請人:悉生物有限公司