專利名稱：抗腫瘤聯(lián)合藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雷帕霉素42-酯與3-羥基-2-(羥曱基)-2-甲基丙酸 (CCI-"9)和4-二曱氨基陽(yáng)丁-2國(guó)烯酸[4-(3國(guó)氯-4-氟國(guó)苯基氨基)-3-氰基國(guó)7陽(yáng) 乙氧基-喹啉-6-基]-酰胺(EKB-569)的聯(lián)合藥物的用途。
技術(shù)背景雷帕霉素是由吸水鏈霉菌(S&e/7tomyc^ /^grascop/cw》產(chǎn)生的、在 體外和體內(nèi)均有抗真菌活性、特別是抗白色念珠菌(Ow^/" a歷,c""力 活性的大環(huán)三烯類抗生素[C. Vezina等，J. Antibiot. 28, 721 (1975); S.N. Sehgal等，J. Antibiot. 28, 727 (1975); H. A. Baker等，J. Antibiot 31, 539 (1978);美國(guó)專利3,929,992和美國(guó)專利3,993,749]。另外，已經(jīng)表明， 雷帕霉素單獨(dú)使用(美國(guó)專利4,885,171)或者與溶血性鏈球菌制劑聯(lián)合 使用(美國(guó)專利4,401,653)都具有抗腫瘤活性。FASEB 3, 3411 (1989)中公開(kāi)了雷帕霉素的免疫抑制作用。同樣也 表明其它大環(huán)分子如環(huán)孢菌素A和FK-506可有效作為免疫抑制藥， 因此可用于預(yù)防移植物排斥[FASEB 3, 3411 (1989); FASEB 3, 5256 (1989); R. Y. Calne等，Lancet 1183 (1978)和美國(guó)專利5,100,899]。 R. Martel等[Can. J. Physiol. Pharmacol. 55, 48 (1977)]公開(kāi)了雷帕霉素在 變應(yīng)性腦脊髓炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?即多發(fā)性硬化模型)、佐劑關(guān)節(jié)炎模型(即類 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型)和有效抑制IgE樣抗體的形成中是有效的。雷帕霉素也可用于預(yù)防或治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡[美國(guó)專利5,078,999]、肺部炎癥[美國(guó)專利5,080,899]、胰島素依賴性糖尿病[美 國(guó)專利5,321,009]、皮月夫疾病例如牛皮褲[美國(guó)專利5,286,730]、腸疾 病[美國(guó)專利5,286,731]、血管損傷后平滑肌細(xì)胞增殖和內(nèi)膜增厚[美國(guó) 專利5,288,711和5,516,781]、成人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤[歐洲專利申請(qǐng)525,960 Al]、目艮部炎癥[美國(guó)專利5，387，589]、惡性癌[美國(guó)專利 5,206,018]、心臟炎性疾病[美國(guó)專利5,496,832]和貧血[美國(guó)專利 5,561,138〗。雷帕霉素42-酯與3-羥基-2-(羥甲基)-2-甲基丙酸(CCI-779)是雷 帕霉素的酯，在體外和體內(nèi)模型中均已證明該藥物對(duì)胂瘤生長(zhǎng)有顯 著的抑制作用，雷帕霉素羥基酯(包括CCI-779)的制備和應(yīng)用公開(kāi)于 美國(guó)專利5,362,718。CCI-779表現(xiàn)出與細(xì)胞毒性特性相反的抑制細(xì)胞特性，并且可以 延遲腫瘤進(jìn)程的時(shí)間或胂瘤復(fù)發(fā)的時(shí)間。人們認(rèn)為，CCI-779的作 用機(jī)制與西羅莫司相似，CCI-779與月M蛋白FKBP結(jié)合并形成復(fù)合 物，從而抑制酶mTOR(雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶，也稱為FKBP12-雷 帕霉素相關(guān)蛋白[FRAP])。 mTOR激酶活性的抑制作用可抑制各種信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括細(xì)胞因子刺激的細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1期的 幾種關(guān)鍵蛋白的mRNA的翻譯和IL-2誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致抑制細(xì)胞周 期從Gl期進(jìn)行至S期。導(dǎo)致Gl S期阻斷的CCI-779的作用機(jī)制是 抗腫瘤藥物的一個(gè)新發(fā)現(xiàn)。已經(jīng)表明，CCI-779在體外抑制多種組織多樣化腫瘤細(xì)胞的生 長(zhǎng)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)癌癥、白血病(T-細(xì)胞)、乳癌、前列腺癌和 黑素瘤系中大多數(shù)對(duì)CCI-779敏感。所述化合物使細(xì)胞停止在細(xì)胞 周期的G1期?？檬蟮捏w內(nèi)研究已經(jīng)證明，CCI-779具有抗多種組織類型的人腫 瘤異種移植物的活性。神經(jīng)膠質(zhì)瘤對(duì)CCI-779特別敏感，并且所迷 化合物在原位神經(jīng)膠質(zhì)瘤棵鼠模型中有活性。人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞 系體外的生長(zhǎng)因子(血小板源性)誘導(dǎo)的刺激被CCI-779顯著抑制。數(shù) 種人類胰腺腫瘤在棵鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)以及所研究的兩種乳癌系之一的 體內(nèi)生長(zhǎng)也受到CCI-779的抑制。蛋白酪氨酸激酶是一類催化磷酸基團(tuán)從ATP或GTP轉(zhuǎn)移至位于 蛋白底物上的酪氨酸殘基上的酶。蛋白酪氨酸激酶在正常細(xì)胞生長(zhǎng)中起重要作用。許多生長(zhǎng)因子受體蛋白起酪氨酸激酶的作用，并且 它們正是通過(guò)該過(guò)程發(fā)送信號(hào)。生長(zhǎng)因子與這些受體的相互作用在 細(xì)胞生長(zhǎng)的正常調(diào)節(jié)中是一個(gè)必不可少的事件。然而，在某些情況 下，由于突變或者由于過(guò)量表達(dá)，這些受體可以變得不受控制(deregulated);其結(jié)果是不受控制的細(xì)胞增殖，因而可以引起腫瘤生 長(zhǎng)，最終引起被稱為癌癥的疾病[Wilks A.F.， y4c/v. Ca"cw Was.， 60， 43 (1993)和Parsons, J.T.; Parsons, S.J., /附/ o加"f爿rfrawce51 z'" (9"co/ogy, DeVita V.T.編著，J. B. Lippincott Co.， Phila., 3 (1993)。其中，已鑒定 的并且是本發(fā)明化合物的靶的生長(zhǎng)因子受體激酶及其原癌基因是表 皮生長(zhǎng)因子受體激酶(EGF-R激酶，erbB癌基因的蛋白產(chǎn)物)和由 erbB-2 (也稱為neu或HER2)癌基因產(chǎn)生的產(chǎn)物。由于磷酸化事件是 細(xì)胞分裂發(fā)生所必不可少的信號(hào)，并且由于突變激酶的過(guò)量表達(dá)與 癌癥相關(guān)，因此這些事件的抑制劑如蛋白酪氨酸激酶抑制劑將具有 治療價(jià)值> 以治療特征為不受控制或異常的細(xì)胞生長(zhǎng)的癌癥或其它 疾病。例如，所述erbB-2癌基因的受體激酶產(chǎn)物的過(guò)量表達(dá)與人類 乳癌和卵巢癌相關(guān)[Slamon， D.J.等，Sc/e"ce, W《7(H (1989)和Sde"ce, 235, 1146 (1987)]。 EGF-R激酶的去調(diào)節(jié)與以下腫瘤相關(guān):表皮樣瘤 [Reiss, M.等，Owcer,版,5/, 6254 (1991)]、乳腺腫瘤[Macias， A.等， 7, 459 (1987)]和涉及其它重要器官的腫瘤[Gullick, W,J., Med Sw//., 47， 87 (1991)]。因?yàn)槿フ{(diào)節(jié)受體激酶在癌癥的發(fā) 病機(jī)理中起重要的作用，所以最近的許多研究主要致力于將特異性 PTK抑制劑作為潛在抗腫瘤治療藥物的研發(fā)工作[某些最新綜迷參見(jiàn) Burke. T.R，， Fwmre, /7, 119 (1992)和Chang, C.J., Geahlen, R.L.,丄 艦55, 1529(1992)〗。4-二曱氨基-丁-2-烯酸[4-(3-氯-4-氟-苯基氨基)-3-氰基-7-乙氣基-4r啉-6-基]-酰胺(EKB-569)是EGFR激酶抑制劑，在體外和體內(nèi)模型 中對(duì)腫瘤生長(zhǎng)均具有顯著的抑制作用。EGFR激酶抑制劑例如EKB-569的制備和應(yīng)用公開(kāi)于美國(guó)專利6,002,008。


圖1顯示EKB-569、 CCI-779和EKB-569 + CCI-779的聯(lián)合藥物 在HCT116細(xì)胞中的細(xì)胞毒性曲線，圖2顯示EKB-569 + CCI-779聯(lián)合藥物的等效線圖(有效濃度 50%),圖3顯示從范圍為50-65%的不同終點(diǎn)獲得的EKB-569 + CCI-779 聯(lián)合藥物的等效線圖。圖4顯示EKB-569 + CCI-779聯(lián)合藥物的協(xié)同相互作用的三維分析。圖5顯示EKB-569 + CCI-779聯(lián)合藥物的三維協(xié)同作用圖的等 高線圖。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供CCI-779和EKB-569聯(lián)合藥物作為抗腫瘤聯(lián)合化學(xué) 治療藥物的用途。具體地說(shuō)，這些聯(lián)合藥物可用于治療腎癌、軟組 織癌、乳癌、肺部神經(jīng)內(nèi)分泌性腫瘤、宮頸癌、子宮癌、頭頸部癌、 神經(jīng)膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、胰腺癌、淋巴瘤、黑素瘤、 小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、食管癌、胃癌、白血病、結(jié)腸直腸 癌和未知的原發(fā)性癌。本發(fā)明也提供用作抗腫瘤聯(lián)合化學(xué)治療藥物 的CCI-779和EKB-569聯(lián)合藥物，其中CCI-779或EKB-569或者 CCI-779和EKB-569兩者的劑量都為亞治療有效劑量。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)"治療"是指通過(guò)給罹患肺瘤疾病的哺乳動(dòng) 物提供有效量的一種CCI-779和EKB-569聯(lián)合藥物而治療所述哺乳 動(dòng)物，以抑制所述哺乳動(dòng)物的腫瘤生長(zhǎng)、根除腫瘤或減輕所述哺乳 動(dòng)物的痛苦。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)"提供"就提供所述聯(lián)合藥物而言是指直接 給予所述聯(lián)合藥物或者給予所述聯(lián)合藥物中一種或兩種組分的前 藥、衍生物或類似物，以在生物體內(nèi)生成有效量的所述聯(lián)合藥物。CCI-779的制備方法描述于美國(guó)專利5，362，718，所述專利通過(guò) 引用結(jié)合到本文中。CCI-779的改進(jìn)制備方法公開(kāi)于美國(guó)專利申請(qǐng)SN 09/670,358,所述專利申請(qǐng)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。如果將CCI-779 用作抗腫瘤藥，則考慮在每日一次的給藥方案(每隔2-3周，連續(xù)每 日給藥5天)中，首次靜脈內(nèi)輸注劑量在約0.1 mg/rr^至100 mg/mS之 間；而在每周一次的給藥方案中，首次靜脈內(nèi)輸注劑量在約0.1mg/m2 至1000 mg/mS之間?？诜蜢o脈內(nèi)輸注是優(yōu)選的給藥途徑，其中更 優(yōu)選靜^"內(nèi)輸注。
EKB-569可以依照美國(guó)專利6,002,008中描述的方法來(lái)制備，所 述專利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。EKB-569的優(yōu)選制備方法在本文中 提供。當(dāng)將EKB-569用作抗腫瘤藥時(shí)，則考慮首次口服劑量在l mg/ 天至100 mg /天之間。根椐患者的耐受性，EKB-569可以每日給予達(dá) 一個(gè)治療期，例如14天，然后進(jìn)入休息期(不給予藥物)，或者可以 在連續(xù)給藥的基礎(chǔ)上給予一個(gè)較長(zhǎng)治療期(例如6個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間)。
CCI-779 + EKB-569聯(lián)合藥物的抗腫瘤活性在體外標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)實(shí) 驗(yàn)方法中得到證實(shí)；下面概述所用方法和所得結(jié)果。
細(xì)胞增殖方法-將HCT 116結(jié)腸腺癌細(xì)胞在7% C02、 37。C下 保持在補(bǔ)充10。/。胎牛血清(FBS， Life Technologies)和50 pg/ml慶大霉 素(Life Technologies)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Life Technologies, Inc., Gaithersburg， MD)中。將細(xì)胞平板接種到200 pl含有5% FBS和50 pg/ml慶大霉素的RPM 1640培養(yǎng)基的96孔微量滴定板(6000細(xì)胞/ 孔)中并于37。C孵育過(guò)夜。用同一培養(yǎng)基以5X終濃度制備化合物稀 釋液，然后向含有細(xì)胞的各孔中加入50 |_d所述藥物稀釋液。為了對(duì) 兩種藥物的組合進(jìn)行研究，在存在固定劑量的第二種化合物的情況 下，制備其中一種化合物的系列稀釋液?；蛘?，使用方格圖案稀釋 系列。將細(xì)胞在所述藥物存在下培養(yǎng)3天。用未處理的細(xì)胞作為對(duì) 照。采用蛋白結(jié)合染料磺基若丹明B (sulforhodamine B) (SRB, Sigma-Aldrich, St Louis, MO)測(cè)定存活細(xì)胞的百分率。通過(guò)加入50 fxl 50%冷的三氯乙酸，沉淀各孔中的細(xì)胞蛋白。1小時(shí)后，該板用水充分洗涂
并干燥。加入SRB染料試劑(含0.4% SRB的1%乙酸溶液，80 ixl/孔)， 并將各板在室溫下保持10分鐘。然后各板用1%乙酸溶液充分洗滌 并干燥。將細(xì)胞相關(guān)染料溶于10 mM Tris (150 W)中，用微量滴定板 讀出儀讀出540 nm的吸光度。通過(guò)將細(xì)胞存活率(相對(duì)于未處理的細(xì) 胞)對(duì)化合物劑量作圖，確定引起固定的生長(zhǎng)抑制百分率的化合物濃 度。
協(xié)同作用評(píng)價(jià)-用等效線圖研究這兩種藥物的相互作用。等效 線圖的兩條坐標(biāo)軸分別標(biāo)出各藥物單獨(dú)給藥產(chǎn)生某一終點(diǎn)的濃度(例 如細(xì)胞生長(zhǎng)的50%抑制，IC5。)。連接兩點(diǎn)的直線表示當(dāng)這兩種藥物的 相互作用為純粹的疊加作用時(shí)，這兩種藥物的所有組合的等效劑量。 當(dāng)?shù)刃Ь€圖偏移至預(yù)測(cè)細(xì)胞毒性曲線的左側(cè)(形成凹形曲線)時(shí)表示為 協(xié)同相互作用。相反，偏移至右側(cè)(形成凸形曲線)表示為拮抗性相互 作用。當(dāng)在同一坐標(biāo)體系上作不同終點(diǎn)的等效線圖時(shí)，各藥物的濃 度以產(chǎn)生相同效應(yīng)的各單獨(dú)藥物的濃度百分比表示。這產(chǎn)生一幅對(duì) 稱的等效線圖，各軸上無(wú)單位，因而允許對(duì)不同終點(diǎn)進(jìn)行直接比較。
Prichard和Shipman [Antiviral Research. 14 : 181-206 (19卯)]提出 了用于研究藥物相互作用的第二種模型。該模型是三維模型各藥 物之一和第三種藥物的生物學(xué)效應(yīng)?；诏B加作用的不相似位點(diǎn)模 型(Bliss獨(dú)立性)，根據(jù)獨(dú)立的劑量-反應(yīng)曲線，計(jì)算疊加相互作用的 理論值。實(shí)驗(yàn)曲面減去代表預(yù)測(cè)細(xì)胞毒性的計(jì)算疊加曲面，得出毒 性增力口(協(xié)同作用)或毒性降低(拮抗作用)的面積。當(dāng)相互作用為疊加 作用時(shí)，所得曲面在計(jì)算的疊加曲面之上在0%抑制時(shí)表現(xiàn)為水平面。 偏離該平面的峰和谷分別表示協(xié)同作用和拮抗作用。運(yùn)用基于微軟 公司的Excel軟件的MacSynergyll自動(dòng)進(jìn)行所有的計(jì)算，該電子表格 計(jì)算理論疊加相互作用，并且對(duì)在95%置信水平顯著的協(xié)同相互作 用或拮抗性相互作用定位和定量。將所得結(jié)果繪成三維圖或等高線 圖。結(jié)果-HCT 116細(xì)胞由于它們表達(dá)低，但EGFR的水平可檢測(cè) 且對(duì)EGFR抑制劑的抑制敏感而被選擇.該細(xì)胞對(duì)CCI-779有點(diǎn)抗 性，但受高劑量(5-10 ^ig/ml)的所述藥物抑制。將HCT-116細(xì)胞在存 在單獨(dú)的EKB-569、單獨(dú)的CCI-779或者EKB-569與固定劑量的 CCI-779的稀釋系列的情況下進(jìn)行培養(yǎng)。生長(zhǎng)3天后，釆用SRB實(shí) 驗(yàn)方法測(cè)定細(xì)胞存活率。細(xì)胞毒性曲線示于圖1。 EKB-569對(duì)HCTU6 細(xì)胞的ICs。值為0.31 jug/ml。當(dāng)該化合物與2.08 |tig/ml CCI-779聯(lián)合 使用時(shí)(當(dāng)單獨(dú)給予時(shí)引起41%的生長(zhǎng)抑制)，ICs。值降至0.03 ng/ml， 即降低10倍。當(dāng)與0.026 jxg/ml CCI-779聯(lián)合使用時(shí)(其單獨(dú)抑制36% 的細(xì)胞增殖)，ICs。值降至0.051 ng/ml，即降低6倍。當(dāng)在固定劑量 的EKB-569存在下用CCI-779作劑量-反應(yīng)曲線時(shí)，觀察到相似的結(jié) 果。為了鑒定該藥物相互作用的性質(zhì)，制作EKB-569和CCI-779聯(lián) 合藥物的等效線圖(在50%的有效水平)(圖2)。所述等效線圖曲線具 有深深凹入的凹形，表示在這兩種藥物間存在顯著的協(xié)同相互作用。 在協(xié)同作用最強(qiáng)的點(diǎn)，0.03貼/ml EKB-569和0.077 ng/ml CCI-779的 聯(lián)合藥物與單獨(dú)的0.31 )Lig/ml EKB-569或單獨(dú)的4.3 |ig/ml CCI-779 (各藥物單獨(dú)的IQ。)的效力相同。因此，與任一單獨(dú)的藥物相比，當(dāng) 所述藥物聯(lián)合使用時(shí)，EKB-569的劑量降低10倍和CCI-779的劑量 降低50倍就可抑制50%的細(xì)胞增殖。還檢查從范圍在50-65%的不 同終點(diǎn)獲得的等效線圖。如圖3所示，所產(chǎn)生的等效線圖幾乎重疊， 表示在所有所測(cè)的有效水平都為協(xié)同作用。
還運(yùn)用三維分析來(lái)評(píng)價(jià)EKB-569和CCI-779之間的相互作用。 在此，藥理相互作用以三維圖形表示，其中平面在0%時(shí)表示相加相 互作用，而峰和谷分別表示這兩種藥物之間協(xié)同作用或拮抗作用的 面積 在圖4中，EKB-569和CCI-779的組合產(chǎn)生大面積的協(xié)同相 互作用，與等效線圖研究中所得結(jié)杲一致，三維協(xié)同作用的等高線 圖便于鑒定各藥物在發(fā)生最大協(xié)同毒性時(shí)的濃度(圖5)。在0.0005-3 pg/ml CCI-779和0.16-0.4 pg/ml EKB-569時(shí)觀察到大面積的協(xié)同作用。在該面積內(nèi)，0.0005-0.003pg/ml和0.05-0.3 ng/ml CCI-779以及 0.25-0.37 pg/ml EKB-569時(shí)存在2個(gè)最大協(xié)同作用峰。
根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的結(jié)果，CCI-779和EKB-569的 各種組合起協(xié)同作用，并且可用作抗腫瘤藥物。更具體地講，這些 聯(lián)合藥物可用于治療腎癌、軟組織肉瘤、乳癌、肺部神經(jīng)內(nèi)分泌性 腫瘤、宮頸癌、子宮癌、頭頸部癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌、 前列腺癌、胰腺癌、淋巴瘤、黑素瘤、小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、結(jié)腸 癌、食管癌、胃癌、白血病、結(jié)腸直腸癌和未知的原發(fā)性癌。由于 這些聯(lián)合藥物含有至少兩種活性抗胂瘤藥，因此這類聯(lián)合藥物也可 以以其中 一 種或兩種所述藥物以亞治療有效劑量使用的各藥物的聯(lián) 合藥物進(jìn)行使用，從而降低與單個(gè)化療藥相關(guān)的毒性。
在用于化學(xué)療法時(shí)，多種具有不同作用;f莫態(tài)的藥物通常用作化 療"混合劑"的一部分。根據(jù)待治療腫瘤的性質(zhì)，預(yù)期本發(fā)明的聯(lián) 合藥物將用作可含有一種或多種其它抗腫瘤藥的化療混合劑的一部 分。例如，本發(fā)明也包括結(jié)合如下所述其它化療藥一起使用的CCI-779/EKB-923聯(lián)合藥物的用途抗代謝藥(即5-氟尿嘧啶、氟尿苷、 硫鳥(niǎo)噪呤、阿糖胞苷、氟達(dá)拉濱、6-巰基嘌呤、甲氨蝶呤、吉西他濱、 卡培他濱、噴司他丁、三甲曲沙或克拉屈濱)；DNA交聯(lián)劑和烷基化 劑(即順鉑、卡鉑、str鄰tazoin、美法侖、苯丁酸氮芥、卡莫司汀、 methclorethamine、洛莫司汀、bisulfan、噢替派、異環(huán)磷酰胺或環(huán)磷 酰胺)；激素類藥(即他莫昔芬、roloxifen、托瑞米芬、阿那曲唑或來(lái) 曲唑)；抗生素(即普卡霉素、博萊霉素、米托蒽醌、伊達(dá)比星、放線 菌素D、絲裂霉素、多柔比星或柔紅霉素)；免疫調(diào)節(jié)藥(即干擾素、 IL-2或BCG)、抗有絲分裂藥(即雌莫司汀、紫杉醇、多西他賽、長(zhǎng) 春堿、長(zhǎng)春新堿或長(zhǎng)春瑞濱)；拓樸異構(gòu)酶抑制劑(即托泊替康、伊立 替康、依托泊苷或替尼泊苷)；和其它藥物(即羥基脲、曲妥單抗、六 甲蜜胺、retuximab、 L-天冬酰胺酶或吉姆單抗奧佐米星)。
本發(fā)明所用的聯(lián)合藥物方案可以同時(shí)給予或者可以以交錯(cuò)給藥方案給予，其中在化療過(guò)程中，CCI-779可以在與EKB-923不同的 時(shí)間給藥。給予這兩種藥物之間時(shí)間的間隔范圍為數(shù)分鐘、數(shù)小時(shí)、 數(shù)天、數(shù)周或更長(zhǎng)的時(shí)間。因此，術(shù)語(yǔ)聯(lián)合藥物不一定是指同時(shí)給 藥或者作為一藥劑給予，但各組分在所要求治療期間內(nèi)給予。所述 藥物也可以通過(guò)不同的途徑給予。例如，在CCI-779和EKB-569的 聯(lián)合藥物中，預(yù)期CCI-779可口服或經(jīng)胃腸外給予，其中優(yōu)選經(jīng)胃 腸外給予；而EKB-569可以通過(guò)胃腸外、口服或其它可接受的方式 給予。這些聯(lián)合藥物可以每日、每周或者甚至每月一次給予。作為 一個(gè)典型的化學(xué)治療方案，化學(xué)療法的療程可以在數(shù)周后重復(fù)，并 且這兩種藥物可以在同一時(shí)間段內(nèi)給予或者可以根據(jù)患者的反應(yīng)而 有所變動(dòng)。
作為一個(gè)典型的化學(xué)療法，由主治醫(yī)師根據(jù)包括疾病的嚴(yán)重程 度、對(duì)疾病的反應(yīng)、任何治療相關(guān)毒性、患者的年齡、健康狀況和 其它伴發(fā)疾病或治療在內(nèi)的各種因素來(lái)密切監(jiān)^L給藥方案。
基于用所述CCI-779和EKB-569聯(lián)合藥物獲得的結(jié)果，考慮 CCI-779的首次靜脈內(nèi)輸注劑量在約0.1 mg/i^至100 mg/n^之間， 其中優(yōu)選在約2.5 mg/n^至70 mg/n^之間。也優(yōu)選通常在30分鐘內(nèi) 通過(guò)靜脈內(nèi)給予所述CCI-779,并且以每周約給予一次。EKB-569的 首次日劑量在約1 mg至100 mg之間，優(yōu)選5 mg至75 mg。在一個(gè) 或多個(gè)治療周期后，所用劑量可以根據(jù)所得結(jié)果和所觀察到的副作 用作上下調(diào)整。
含有本發(fā)明活性化合物的口服制劑可以包含任何常用的口服劑 型，包括片劑、膠嚢劑、口含片、糖錠劑、錠劑和口服液體劑、混 懸劑或溶液劑。膠嚢劑可以含有所述活性化合物和惰性填充劑和/或 稀釋劑的混合物，所述填充劑和/或稀釋劑例如藥學(xué)上可接受的淀粉 (例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉)、糖、人工甜味劑、粉狀纖 維素例如結(jié)晶纖維素和微晶纖維素、面粉、明膠、樹(shù)膠等。有用的 片劑制劑可以通過(guò)常規(guī)壓制法、濕制粒法或千制粒法來(lái)制備，并且可利用藥學(xué)上可接受的稀釋劑、粘合劑，潤(rùn)滑劑、崩解劑、表面改 性劑(包括表面活性劑)、懸浮劑或穩(wěn)定劑，包括但不限于硬脂酸鎂、 硬脂酸、滑石粉、十二烷基硫酸鈉、微晶纖維素、羧甲基纖維素4丐、 聚乙烯吡咯烷酮、明膠、藻酸、阿拉伯樹(shù)膠、黃原膠、檸檬酸鈉、
復(fù)合硅酸鹽、碳酸鈣、甘氨酸、糊精、蔗糖、山梨醇、磷酸二4丐、 硫酸鈣、乳糖、高嶺土、甘露醇、氯化鈉、滑石粉、干淀粉和粉糖。 優(yōu)選的表面改性劑包括非離子表面改性劑和陰離子表面改性劑。表 面改性劑的代表性實(shí)例包括但不限于泊洛沙姆188、苯扎氯銨、硬脂 酸鈣、十六醇十八醇混合物、聚西托醇乳化蠟、脫水山梨醇酯、膠 態(tài)二氧化硅、磷酸酯、十二烷基疏酸鈉、硅酸鋁鎂和三乙醇胺。本 文的口服制劑可以利用標(biāo)準(zhǔn)延遲或定時(shí)釋放制劑來(lái)改變所述活性化 合物的吸收。所述口服制劑也可以包括給予所述有效成分的水溶液 或果汁溶液，必要時(shí)含有合適的增溶劑或乳化劑。
在某些情況下，可能最好將所述化合物以氣霧劑的形式直接給 予氣道。
所迷化合物也可以經(jīng)胃腸外或腹膜內(nèi)給予。這些活性化合物的 游離堿或藥學(xué)上可接受的鹽的溶液劑或混懸劑可以在適宜與諸如羥 丙基纖維素的表面活性劑混合的水中制備。也可以制備在甘油、液 體聚乙二醇和它們的混合物油溶液中的分散劑。在貯藏和使用的常 規(guī)條件下，這些制備含有防腐劑，以防止微生物的生長(zhǎng)。
適合于注射用的藥物形式包括無(wú)菌水溶液或分散劑，以及用以 臨時(shí)制備無(wú)菌注射液或分散劑的無(wú)菌粉末。在所有情況下，所述劑 型必需無(wú)菌并且必需為易于注射的液體。所述制劑在生產(chǎn)和貯藏條 件下必需是穩(wěn)定的，并且必需防止微生物例如細(xì)菌和真菌的污染。 所述栽體可以是溶劑或者是含有例如以下組分的分散介質(zhì)水、乙 醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇)、其合適的混合物和 植物油。
對(duì)于本說(shuō)明書(shū)而言，人們知道，透皮給藥包括透過(guò)機(jī)體表面和包括上皮組織和粘膜組織在內(nèi)的機(jī)體通道內(nèi)襯的所有給藥方式。這 樣的給藥可以用含有本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的洗液、 乳油、泡沫劑、貼劑、混懸劑、溶液劑和栓劑(直腸和陰道)來(lái)進(jìn)行，
可以通過(guò)使用含有所述活性化合物和對(duì)所述活性化合物而言為 惰性的栽體的透皮貼劑來(lái)完成透皮給藥，所述透皮貼劑對(duì)于皮膚無(wú) 毒并且允許將供系統(tǒng)吸收的藥物通過(guò)皮膚傳遞至血流中。所述栽體 可以為任何形式，例如乳油和軟骨劑、糊劑、凝膠劑和閉合裝置。 所述乳油和軟骨劑可以是粘稠的液體或者水包油型或油包水型半固 體乳劑。由分散在含有有效成分的石油或親水石油中的吸收粉末組 成的糊劑也可能是合適的?？梢杂酶鞣N各樣的閉合裝置使所述活性 化合物釋放到血流中，例如包括含有所述有效成分以及含有或不含
栽體的貯庫(kù)(reservoir)或者含有所述有效成分的基質(zhì)的半透膜。在文 獻(xiàn)中可了解其它的閉合裝置，
栓劑制劑可以用包括可可脂、加有或不加用以改變栓劑熔點(diǎn)的 蠟和甘油在內(nèi)的傳統(tǒng)材料來(lái)制備。也可使用水溶性栓劑基質(zhì)，例如 各種分子量的聚乙二醇。
具體實(shí)施例方式
下面提供從市售原料或可依照可利用的文獻(xiàn)方法制備的原料制 備EKB-569。
由4"溴巴豆酸三甲基甲硅沈基癍制備4-二甲氨基巴豆酸
A人 (CH3)2NH z 、v \
B踏V、卿c恥 _^_^ (CH3)2NCH^ v 、OSi(CH3)3
Hp
(CHINCH/ v 、OH
將211 ml 二曱胺(2M, THF溶液，0.422摩爾)于0-50。C及N2保護(hù) 下滴加到50 g 4-溴巴豆酸三甲基曱硅烷基酯(0.211摩爾，75.9% (通過(guò) GC-MS測(cè)定))的250 ml THF溶液中。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌30分鐘。濾出白色固體副產(chǎn)物。向該濾液中加入2ml水，然后放入晶 種。濾出所形成的晶體并用乙醚洗滌，得到18.3 g (分兩批)灰白色固 體產(chǎn)物。收率為67.2% (通過(guò)GC-MS測(cè)定的純度為98%， NMR測(cè)試 證實(shí)該結(jié)構(gòu))。由4-溴巴豆酸甲酯制備4-二甲氨基巴豆酸甲酯<formula>formula see original document page 16</formula>將120 ml 二甲胺(2M， THF溶液，0.24摩爾)于0-5(TC及&保護(hù) 下滴加到20 g 4-溴巴豆酸甲酯(純度85%, 0,095摩爾)的150 ml THF 溶液中 將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌15分鐘，TLC(9:1 CH2Cl2:MeOH 和幾滴Et3N)顯示有殘留的4-澳-巴豆酸甲酯。將反應(yīng)混合物加熱至 40-450。C達(dá)15分鐘 濾出白色固體副產(chǎn)物。將濾液蒸發(fā)至得到黃色 油狀物(14 g)。將該黃色油狀物溶于100 ml CH2Cl2f,并用H20洗 滌2次。水層再次用100mlCH2Cl2萃取，合并CH2Cl2層，經(jīng)MgS04 干燥并過(guò)濾。蒸發(fā)濾液至得到油狀物(12 g)。收率為88%。 NMR測(cè) 試顯示所需產(chǎn)物中^^有痕量4-溴巴豆酸甲酯。4-N，N-二甲4^巴豆酸甲醋鹽酸鹽的大M制備<formula>formula see original document page 16</formula>一個(gè)3L燒瓶裝有四氬呋喃(0.71 kg, 0.80 L)。加入4-溴巴豆酸甲 酯(0.20 kg， 0.13 L, d - 1.522 g/mL)，用四氬呔喃(0.18 kg, 0.20 L)沖洗。 攪拌溶液并冷卻至O-l(TC。 一加液漏斗裝有二甲胺的四氫呋喃溶液， 保持溫度在O-l(TC下，在1小時(shí)15分鐘內(nèi)將漏斗的內(nèi)容物加入所溶 液中，攪拌混合物最少30分鐘，并通過(guò)TLC檢查反應(yīng)完成的情況。 當(dāng)存在<2%可檢測(cè)原料(4-溴-巴豆酸甲酯)時(shí)，反應(yīng)完成。將混合物在布氏漏斗(Buchner fonnel)上冷過(guò)濾到一個(gè)3 L多頸燒瓶中，用預(yù)冷 ((M0。C)四氫呋喃(2 x 0.18 kg， 2 x 0.20 L)沖洗-'并保持抽吸直至液滴 滴干為止.所述燒瓶裝有一個(gè)攪拌器、 一支溫度計(jì)和一個(gè)真空蒸餾 裝置，減壓(l25-200 m邁Hg)蒸餾，最高釜溫40。C,將該溶液濃縮至 體積為200 mL。加入異丙醇(0.22 kg, 0.28 L),將混合物冷卻至0-10 'C。將蒸餾頭改裝為一個(gè)裝有鹽酸的異丙醇溶液的加液漏斗，并將 所述溶液在45分鐘內(nèi)加入直至達(dá)到pH 2.0-3.0,同時(shí)保持溫度在0-10 匸，將該混合物靜置最少30分鐘，在布氏漏斗上過(guò)濾，用異丙醇(2x 0.12 kg， 2 x 0.15 L)沖洗。將濾餅打濕并保持抽吸直至液滴滴千為止。 產(chǎn)物在真空爐中于50'C和lOmmHg下千燥18-20小時(shí)。由4-二甲氛基巴豆酸甲癍制備4>二甲氛基巴豆酸鹽酸鹽A叉 NaOH叫(CH3)2NCh/^^^OCH3 -(CH3)2NCH:MeOHHC1 、 a ~PA * (CH妙CH^^、OH'HCl將NaOH溶液(3.35 g, 25ml水溶液，0.084摩爾)在室溫下滴加到 12 g 4-二甲氨基巴豆酸甲酯(0.084摩爾)的100 ml MeOH溶液中。將 反應(yīng)混合物加熱至40-45。C達(dá)1小時(shí)，然后冷卻至室溫。用5 N HC1 將pH調(diào)至l-2。將混合物濃縮至粘稠油狀物，與無(wú)水乙醇一起研磨， 得到固體。濾出固體副產(chǎn)物。將濾液蒸發(fā)至成為油狀物，與IPA — 起研磨，得到7.0 g白色固體產(chǎn)物。收率為50%,純度為86.3% (通 過(guò)GC-MS測(cè)定)。4-N，N-二曱氨基巴豆酸鹽酸鹽的大規(guī)模制備<formula>formula see original document page 18</formula>一個(gè)2 L多頸燒^f瓦裝有一個(gè)攪拌器、 一支溫度計(jì)、 一個(gè)加液漏 斗和一個(gè)氮?dú)獗Ｗo(hù)裝置。該燒瓶裝有乙醇(0.39 kg, 0.50 L) 加入4-N，N-二曱M巴豆酸甲酯鹽酸鹽(0.125kg),用乙醇(O.IO kg, 0.125 L)沖洗。 攪拌懸浮液并冷卻至0-l(TC。往所述加液漏斗中裝入氫氧化鈉(50%) (0.11 kg, 0.072 L, d=1.53 g/mL)，并將所述氫氧化鈉溶液在20分鐘內(nèi) 加入燒瓶中，保持溫度在0-10'C。觀察到輕微放熱并且混合物變?yōu)?黃色。將混合物最少攪拌15分鐘，然后溫至18-22'C，并且最少保 持4小時(shí) 通過(guò)TLC檢查反應(yīng)完成的情況。當(dāng)存在<2%可檢測(cè)原料 (4-N，N-二曱氨基巴豆酸甲酯鹽酸鹽)時(shí)，反應(yīng)完成。將混合物冷卻至 0-10'C。往加液漏斗內(nèi)裝入鹽酸的異丙醇溶液并在40分鐘內(nèi)加入燒 瓶中直至達(dá)到pH 2.0-3.0,同時(shí)保持釜溫在0-10。C。將該混合物最少 ^;拌30分鐘，在布氏漏斗上冷過(guò)濾到一個(gè)2 L多頸燒瓶中，用冷乙 醇(0-10。C) (2 x 0.05 kg, 2 x 0.063 L)沖洗并保持抽吸直至液滴滴千。 所述燒瓶裝有一個(gè)攪拌器、 一支溫度計(jì)和一個(gè)真空蒸餾裝置。減壓 (50-100 mm Hg)蒸餾，最高釜溫40。C,除去溶劑，至體積為160-180 mL。加入異丙醇(0.049 kg, 0.063 L),將混合物在10分鐘內(nèi)溫至35-40 °C 在20分鐘內(nèi)加入丙酮(0.10kg,0.13L)，同時(shí)保持釜溫在35-40。C。 加入混合物并冷卻至環(huán)境溫度25-35'C,且保持該溫度最少12-18小 時(shí)。將混合物冷卻至O-l(TC,并保持該溫度最少1小時(shí)。制備異丙 醇(0.049 kg, 0.063 L)和丙酮(O.IO kg, 0.13 L)的混合物，攪拌至均勻， 并冷卻至0-10'C。將混合物在布氏漏斗上冷過(guò)濾，用異丙醇/丙酮(2x 0.074kg, 2x0.096 L)沖洗，將濾餅打濕，同時(shí)保持抽吸直至液滴滴干為止。產(chǎn)物在真空爐中于50'C和10mmHg下干燥18-20小時(shí),由4-二，(CH3)2NO% -二甲#^1^-巴豆跣苯胺亞硫酰氯OH.HC1 CHiA/DMF (CH^NC]C1'HC1Q"叫 叉將亞硫酰氯(0.36 ml， 0.005摩爾)于O'C及>12保護(hù)下滴加到含有 0,33 g 4-二甲氨基巴豆酸鹽酸鹽(0.002摩爾)和2滴DMF的15 ml012(:12溶液中。將反應(yīng)混合物回流30分鐘。然后于ox:向該反應(yīng)混合物中滴加0.72 ml苯胺(0.008摩爾)并在室溫下攪拌1小時(shí) 將固體 副產(chǎn)物過(guò)濾。濾液蒸發(fā)至得到油狀物(0.6 g)。 GC-MS數(shù)據(jù)顯示該油 狀物為11.7%4-二甲氛基巴豆酸鹽酸鹽和85%所需產(chǎn)物。4-N，N-二甲氨基巴豆酰氯鹽酸鹽的制備和分離將充分?jǐn)嚢璧?-二甲氨基巴豆酸鹽酸鹽(5.0 g， 30mmol)的冷(0'C) THF (40 mL)和DMF (2滴)的懸浮液用草酰氯(3.15 mL, 36 mmol)處 理。將混合物于20-25'C攪拌3小時(shí)，然后冷卻至O'C并保持30分鐘。 在布氏漏斗(氮?dú)獗Ｗo(hù))上收集固體，用冷(O'C) THF (3 x 5 mL)溶液洗 滌。產(chǎn)物于40-5(TC真空(-l托)干燥3小時(shí)，得到4.0 g 4-二甲氨基巴 豆酰氯鹽酸鹽。用甲醇處理所述固體，經(jīng)表征該物質(zhì)為其曱酯。或者，可以用CH3CN制備標(biāo)題化合物，并將其直接用于下述偶 合步驟EKB-569的制備一個(gè)3 L多頸燒瓶裝有一個(gè)攪拌器、 一支溫度計(jì)、 一個(gè)浸漬試管和一個(gè)氮保護(hù)裝置，該燒瓶裝有N-甲基吡咯烷酮(0.77 kg, 0.75 L, d=1.033 g/mL)。在環(huán)境溫度下，加入4=3=氯=4=氟苯基#J^6-M-3-氰基-7-乙氧基會(huì)啉(0.0748 kg)[參見(jiàn)美國(guó)專利6,002,008]，攪拌混合 物，同時(shí)加熱至40-45'C并保持15分鐘。將該燒瓶冷卻至0-10'C。 將含有4-N,N-二甲氨基巴豆酰氯鹽酸鹽的混合物通過(guò)浸漬試管和氮 氣正壓力下在30-45分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)移至3 L燒瓶中，同時(shí)保持溫度在(MO 'C下。將混合物在0-10'C下靜置最少2小時(shí)。通過(guò)HPLC檢查反應(yīng) 完成的情況。當(dāng)存在<2%原料(4-[3-氯-4-氟苯基]-氨基-6-氨基-3-氰基 -7-乙氧基喹啉)時(shí)，反應(yīng)完成。往一個(gè)裝有一個(gè)攪拌器、 一支溫度計(jì)、 一個(gè)浸漬試管和一個(gè)氮?dú)獗Ｗo(hù)裝置的12 L多頸燒瓶中裝入水(2.61 kg, 2.61 L)。加入碳酸氫鈉(0.209 kg)并進(jìn)行攪拌直至形成溶液。將該溶 液冷卻至20-24'C。將NMP-CH3CN混合物通過(guò)浸漬試管和氮?dú)庹龎?力下在45-60分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)移至該12 L燒瓶中，同時(shí)保持溫度在20-24°C 下。將該混合物在20-24。C下最少保持1小時(shí)，在布氏漏斗上過(guò)濾， 用水(3 x 0.40 kg, 3 x 0.40 L)沖洗并保持抽吸直至液滴滴干為止。產(chǎn)物 在真空烘箱中于5(TC和10mmHg下千燥28-30小時(shí)，得到78.5 g(收 率86%)產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.具有下式的化合物或
2. 制備4-二曱氨基-丁-2-烯酸[4- (3-氯-4-氟-苯基氨基)-3-氰 基-7-乙氧基-壹啉-6-基]-酰胺的方法，包括(a) 在0至10°C的溫度下，形成含有(4- [3-氯-4-氟-苯基]氨基-6-氨基-3-氰基-7-乙氧基-喹啉)、4-N， N-二曱氨基巴豆酰氯鹽酸鹽和N-曱基吡咯烷酮的懸浮液；(b) 靜置該懸浮液，直至(4-[3-氯-4-氟-苯基]氨基-6-氨基-3-氰 基-7-乙氧基-喹啉)的濃度等于或低于2%;(c) 在步驟(b)的懸浮液中加入碳酸氬鈉，直至得到一種溶液；(d) 收集步驟(c)的產(chǎn)物，得到4-二甲氨基-丁-2-烯酸[4-(3-氯 -4-氟-苯基氨基)-3-氰基-7-乙氧基-喹啉-6-基]-酰胺化合物。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述收集步驟包括過(guò)濾、沖洗和干 :步驟(c)的產(chǎn)物。
4. 權(quán)利要求2或3的方法，其還包括制備4-N， N-二曱氨基巴豆 酰氯鹽酸鹽的步驟，所述步驟還包括(i)將草酰氯加進(jìn)下式化合物的冷THF和DMF懸浮液中；(ii) 在20-25。C下攪拌步驟(i)的懸浮液；(iii) 冷卻步驟(ii)的懸浮液。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中(i)中的冷懸浮液處于約0°C。
6. 權(quán)利要求4或5的方法，其中(iii)中的冷卻是冷卻至0°C。
7. 權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)的方法，其中用冷四氫呋喃沖洗(i i i) 的產(chǎn)物，以及進(jìn)行干燥，得到4-N，N-二甲氨基巴豆酰氯鹽酸鹽。
8. 權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)的方法，其中4-N，N-二曱氨基巴豆 酰氯鹽酸鹽是在CH3CN中制備而得，不是在THF和DMF中制備而得。
9. 制備具有下式化合物的方法， (ch3〉2nch,其包括下述反應(yīng)順序<formula>formula see original document page 0</formula>其包括任一項(xiàng)下述反應(yīng)順序亞硫酰氯<formula>formula see original document page 0</formula><formula>formula see original document page 4</formula>
全文摘要
本發(fā)明提供一種CCI-779和EKB-569的聯(lián)合藥物在治療腫瘤中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K31/44GK101279983SQ200810081068
公開(kāi)日2008年10月8日 申請(qǐng)日期2002年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月7日
發(fā)明者J·J·小吉邦斯, S·K·拉賓蘭 申請(qǐng)人:惠氏公司