專利名稱：：一種含有抗腫瘤活性成分的中藥有效部位組合物及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于中藥制劑
技術領域：
，涉及含有抗腫瘤的中藥復方組成、有效部位及其制備方法；更進一步涉及中藥復方有效部位的藥物組合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
：隨著人類生活環(huán)境和水平的不斷變化，惡性腫瘤己經成為當今世界上威脅人類健康的最嚴重疾病之一，其發(fā)病率和死亡率位距榜首，成為人類健康的頭號大敵。因此預防和治療惡性腫瘤疾病藥物的研發(fā)日益成為醫(yī)藥界的研究熱點，由于臨床常用的化療藥物本身的缺陷，使具有抗腫瘤活性的傳統(tǒng)中藥越來越受到科研人員的高度重視。中醫(yī)學認為由于人體正氣內虛，臟腑功能失調，以致邪毒乘虛而入，蘊及于經絡臟腑，使得機體陰陽失調，氣血功能障礙，導致氣滯，血瘀，痰凝，毒聚相互結交的一系列病理變化，日久而形成腫瘤。因此，中醫(yī)治療腫瘤的方法，主要為扶正和祛邪兩個方面。扶正的方法有補氣，補血，滋陰溫陽等；祛邪的方法有清熱解毒，化瘀軟堅等。中醫(yī)藥治療癌癥有其獨特優(yōu)勢S卩"祛邪不傷正"因而避免了一些風險大，復發(fā)率高、后遺癥多的手術；也沒有化療藥物的毒副反應和難以耐受的弊端，從而提高了部分患者的生存質量和生存率，在與癌癥的斗爭中，中醫(yī)藥顯示了不可忽視的作用。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的之一提供一種抗腫瘤中藥復方及其組成和劑量配比。本發(fā)明的目的之二是提供一種抗腫瘤有效部位及其制備方法。本發(fā)明的目的之三是提供以所述有效部位的藥物組合的各種制劑。本發(fā)明的目的之四是提供所述有效部位在制備抗腫瘤及其相關藥物中的應用。中藥復方一般以藥材(飲片)入藥，存在著劑量大，服用不方便等諸多不利因素。提取中藥復方有效部位，對其藥理活性進行驗證，進一步將有效部位復配，制成有效部位復方是一條可行的路子。本發(fā)明涉及的中藥復方含有總黃酮、脂溶性皂苷、萜類、總多糖和水溶性皂苷等多個有效部位，這些有效部位因其結構特點，表現(xiàn)出抗腫瘤，抗病毒，抗菌消炎，增強免疫功能等多方面的生物活性。在研究中藥復方及其組成和劑量配比的基礎上，尋找和發(fā)現(xiàn)中藥復方抗腫瘤有效部位及其制備方法及其應用十分必要。因此，本發(fā)明提供了含有抗腫瘤活性成分的中藥有效部位組合物，由仙鶴草、白花蛇舌草、白英、甘草原料藥中的仙鶴復方有效部位組成；其中所述的仙鶴復方有效部位包括脂溶性皂苷，總黃酮苷和/或苷元，萜類和脂肪酸，水溶性皂苷，總多糖中的一種或多種的組合物。本發(fā)明所述組合物由仙鶴草10150g，白花蛇舌草5100g,白英580g,甘草為5~30g中的脂溶性甾體皂苷，總黃酮苷，萜類，水溶性皂苷，總多糖中的一種或多種有效部位組成；其中脂溶性甾體皂苷、水溶性皂苷〉50%，總黃酮苷、總多糖〉40%。本發(fā)明所述的有效部位可以與脂溶性皂苷，總黃酮苷和/或苷元，萜類和脂肪酸，水溶性皂苷，總多糖以及藥學上可接受的載體混合制成各種制劑。例如口服液、注射液、混懸劑、丸劑、片劑、膠囊、散劑、顆粒劑或滴丸劑。本發(fā)明所述含有抗腫瘤活性成分的中藥有效部位組合物的制備方法，其特征在于該有效部位是由下述方法制備而成(1)將藥材仙鶴草10150g，白花蛇舌草5100g,白英580g，甘草為530g混合，加50-95%的乙醇，回流、提取、濃縮后得醇提浸膏，該浸膏先用與藥材等體積的50-95%乙醇，超聲溶解，加入2—5倍的無水乙醚，得沉淀1和濾液1-a，沉淀1通過大孔吸附樹脂純化后得有效部位XHCI;(2)濾液1-a濃縮后，用堿提、酸沉淀，得沉淀2和濾液2-a,沉淀2經聚酰胺樹脂純化后得有效部位XHCII;(3)濾液2-a用乙酸乙酯萃取，濃縮干燥后得有效部位XHCni;(4)將(1)的乙醇提后藥材，水煮，提取3-5次，每次提取時間為2-5h，將每次所得提取液過濾，合并，離心棄去沉淀后，上清液減壓濃縮至小體積，透析3-4天，將透析液濃縮至小體積，用2-3倍體積的飽和正丁醇萃取2-5次，合并正丁醇層萃取液，濃縮，千燥得XHSI;(5)水層經ZTCII天然澄清劑澄清，除去蛋白、樹脂、色素等成分，用3-10%雙氧水脫色后得XHSII。其中所述有效部位XHCI采用的大孔吸附樹脂為sp-825，洗脫溶媒為50%乙醇；所述有效部位XHCII的聚酰胺樹脂純化指的是聚酰胺60-80目，濕法上樣，控制pH值為3.0,上樣濃度為lg生藥/3ml，洗脫液為20%-95%乙醇，5%Na0H，10%NaOH,收集各部分洗脫液，純化；所述有效部位XHSII采用II型ZTC天然澄清劑純化。II型ZTC是一種新型的澄清劑，購買于天津正天成澄清技術有限公司。本發(fā)明同時也提供了一種抗腫瘤中藥復方制劑及其組成和劑量配比它由仙鶴草1(Tl50g，白花蛇舌草5~100g,白英5~80g,甘草530g的提取物與一種或多種藥學上可接受的載體組成。其制備方法如下(1)將藥材仙鶴草10150g，白花蛇舌草5100g,白英580g,甘草為530g混合，加50-95%的乙醇，回流提取2--4次，每次提取時間為3-5h，合并提取液，回收乙醇后得醇提部分的濃縮物，干燥得浸膏；(2)該浸膏先用與藥材等體積的50-95%乙醇，超聲溶解，加入2—5倍的無水乙醚，得沉淀l和濾液l-a，沉淀1通過大孔吸附樹脂純化后得有效部位XHCI;(3)濾液1-a濃縮后，用堿提取，酸沉淀得沉淀2和濾液2-a，沉淀2經聚酰胺樹脂純化后得有效部位XHCII;(4)濾液2-a用乙酸乙酯萃取，合并，濃縮，干燥后得有效部位XHCIII;(5)將(1)乙醇提后的藥材，干燥，用10—14倍量的水，煮沸提取3-5次，每次提取時間為2-5h，將每次所得提取液過濾，合并，離心棄去沉淀后，上清液減壓濃縮至小體積，透析3-4天。將透析液濃縮至小體積，用2-3倍體積的飽和正丁醇萃取2-5次，合并正丁醇層萃取液，濃縮，干燥得XHSI;(5)水層經II型ZTC天然澄清劑澄清，除去蛋白、樹脂、色素等成分,用3_10%雙氧水脫色后得XHSn。(6)將上述分離得到的5個有效部位中的一個或多個與藥學上可接受的載體混合制成復方制劑。本發(fā)明所涉及的抗腫瘤中藥復方制劑或含有有效部位的組合物，其組方均由仙鶴草、白花蛇舌草、白英和甘草四味中藥組成。方中仙鶴草味苦辛，性平，入肺、肝、脾經，"下氣活血，理百病，散脾滿"(《百草鏡》)，"味苦辛平入肺臟，穿腸穿胃能攻堅"(《本草綱目拾遺》)，"滾咽膈之痰，平翻胃之噦"(《藥鏡拾遺賦》)，"攻堅散脾理百病之良品"(《中國醫(yī)學大辭典》)，故而為君藥；白花蛇舌草味苦甘，性寒，入心、肝、脾三經，"清熱散瘀，消癰解毒"(《泉州本草》)，"清熱解毒，消炎止痛"(《閩南民間草藥》)，故而為臣藥；白英味甘苦，性寒，"消痰祛瘀，理氣解結"(《張壽頤》)，"清熱，利濕，祛風，解毒"(《中藥大辭典》)，故而為佐藥；甘草味甘性平，無毒，入脾胃、肺經，"有補有瀉，能表能里，可升可降"(《本草從新》)，"凡用純寒純熱之品，必用之以緩其勢……"(《本草匯言》)，"入峻劑則緩正氣"(《本草求真》)，故而為佐為使。諸藥合用，具有清熱解毒，攻堅散結，祛瘀止痛等功能，主治因氣滯、血瘀、痰凝、毒聚而導致的各種實體瘤，尤其對肝癌、胃癌、宮頸癌等效果尤佳。本發(fā)明所述中藥復方組成或含有有效部位組合物制劑的制備方法如下使用標準和常規(guī)的技術，將本發(fā)明5個有效部位中的一個或多個與制劑學上可接受的固體或液體載體結合，以及使之任意地與制劑學上可接受的輔助劑和賦形劑結合制備成各種制劑。這些制劑形式包括口服液、注射液、混懸劑、丸劑、片劑、膠囊、散劑、顆粒劑或滴丸劑。所述的藥學上可接受的固體或液體載體，包括制劑中常規(guī)的稀釋劑、填充劑(如乳糖、聚乙二醇)，粘合劑(淀粉、微晶纖維素)，崩解劑(如羧甲基纖維素、低取代的羥丙基纖維素)，潤滑劑(如滑石粉、硬脂酸鎂)，濕潤劑(如丙二醇、乙醇)，穩(wěn)定劑(EDTA-2Na、硫代硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、乙醇胺、碳酸氫鈉、煙酰胺)等等。其中固體劑型包括片劑、分散顆粒、膠囊、緩釋片、緩釋微丸等等。固體載體可以是至少一種物質，其可以充當稀釋劑、香味劑、增溶劑、潤滑劑、懸浮劑、粘合劑、崩解劑以及包裹劑。惰性固體載體包括磷酸鎂、硬脂酸鎂、滑粉糖、乳糖、果膠、丙二醇、干淀粉、聚山梨酯-80、糊精、淀粉、明膠、纖維素類物質例如甲基纖維素、微晶纖維素、低熔點石蠟、聚乙二醇、甘露醇、可可脂等。液體劑型包括溶劑、懸浮液例如注射劑、粉劑等等。本發(fā)明所述中藥復方制劑或含有有效部位組合物以及單元劑型中含有的活性成份(脂溶性皂苷，總黃酮苷和/或苷元，萜類和脂肪酸，水溶性皂苷或總多糖)的量可以根據患者的病情、醫(yī)生診斷的情況特定的加以應用，所用(活性成分的有效部位)的量或濃度在一個較寬的范圍內調節(jié)，通常，活性成分的有效部位的量范圍為組合物的0.5%90%(重量)。另一優(yōu)選的范圍為0.5%-70%。本發(fā)明所涉及的復方藥材有效部位的具體提取方法如下取干燥的復方藥材仙鶴草(拉丁名)、白花蛇舌草(拉丁名)、白英(拉丁名)、甘草(拉丁名)經過鑒定，挑選、粉碎、過篩后，按固定配比，加95%的乙醇，回流提取2—4次，每次提取時間為3—5h，合并提取液，回收乙醇后得醇提部分的濃縮物，干燥得浸膏。該浸膏先用與藥材等體積的95%乙醇，超聲溶解，加入2—5倍的無水乙醚，得沉淀1和濾液l-a，沉淀1通過大孔吸附樹脂純化后得有效部位XHCI，濾液l-a濃縮后，用堿提取酸沉淀方法得沉淀2和濾液2-a，沉淀2經聚酰胺樹脂純化后得有效部位XHCn,濾液2-a用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取液，濃縮干燥后得有效部位XHCIII。乙醇提后的藥材，干燥，用10—14倍量的水，煮沸提取3-5次，每次提取時間為2-5h，將每次所得提取液過濾，合并，離心棄去沉淀后，上清液減壓濃縮至小體積，透析3-4天。將透析液濃縮至小體積，用2-3倍體積的飽和正丁醇萃取2-5次，合并正丁醇層萃取液，濃縮，干燥得XHSI，水層經II型ZTC天然澄清劑澄清，除去蛋白、樹脂、色素等成分，用3-10%雙氧水脫色后得XHSII。采用不同的提取方法獲得的各有效部位，經檢測分析證實有效部位XHCI是具有薯蕷皂苷元母核結構的一類脂溶性甾體皂苷。XHCII是黃酮苷及其苷元的復合物。有效部位XHCIII是萜類和脂肪酸。XHSI為水溶性皂苷。XHSII是多糖。本發(fā)明所述的復方有效部位系上述5個有效部位之一或各部位的自由組合物。例如XHSI與XHSII組合;XHCI與XHCII組合;XHCII與XHCI和XHSII組合;XHCII與XHSII組合；xhcii與xhci、xhsi、xhsii組合，其中xhcii與xhci和xhsii效果最好。本發(fā)明進一步提供了各有效部位組合物在制備抗腫瘤藥物中的應用；其中的腫瘤包括人乳腺癌、肝癌、卵巢癌、人子宮頸癌或肺癌。下面通過體內、體外抗腫瘤實驗進一步說明本發(fā)明各有效部位組合物的藥理活性。(1)體外抗腫瘤實驗分別以抑制MCF-7、H印-G2、ES-2、JTC-26、S180、A549細胞增殖能力為指標。取人乳腺癌細胞系MCF-7、肝癌細胞系H印-G2、卵巢癌細胞系ES-2、人子宮頸癌細胞系JTC-26、肉瘤S180細胞系、肺癌A549細胞系在含10%小牛血清的RPMI—1640培養(yǎng)液，37°C，5%0)2培養(yǎng)箱中生長至細胞旺盛，取對數生長期的細胞進行實驗，經0.25X胰酶后加入0.02XEDTA消化，制成細胞懸液，將細胞懸液均勻接種于96孔微量培養(yǎng)板中(細胞個數為2乂104個/孔)100"1，培養(yǎng)過夜，給藥組分別加入不同劑量的預處理好的藥物濃度，對照組加入相應的培養(yǎng)液，終體積為200yl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h，加2mg/mlMTT40"1(四甲基偶氮唑Sigma),培養(yǎng)4h,棄去上清液,加二甲基甲酰胺(DMSO)150yl，于恒溫震蕩器震蕩3miru待藍色結晶體完全溶解，用酶標儀在550nm波長處測定吸光度(0D)值，并按下列公式計算其抑制率。抑制率計算公式抑制率(%)=[(對照組00值-實驗組OD值)/對照組OD值]X10(m。有效部位對三種腫瘤細胞株的抑制作用結果以而士S表示。計算50%細胞殺傷時藥物濃度(IC5)，ICs(,采用加權直線回歸法處理。體外抗腫瘤試驗結果表明XHCI、XHCII、XHSI、XHSII可明顯抑制Hep-G2、MCF—7，具有細胞毒作用。(2)體內抗腫瘤實驗主要觀察各有效部位給藥后，對小鼠肝癌H22腫瘤的抑制作用。在無菌條件下，從預先接種好的小鼠腹腔腹水中取腫瘤，用NaCl注射液稀釋，混勻后消毒接種小鼠右前肢腋下皮下，每支0.2ml，約含瘤細胞1X1(T個。24h后隨機分組，對照組(水)，陽性對照組(順鉑)，有效部位xhci、xhcii、xHsr、xhsii小剤量,中劑量，大劑量，xhci、xhcii、xhsi、xhsii四個有效部位等比例組合(1:1:1:1)，以及采用權重配方法對其中三個有效部位XHCI、XHCII、XHSI按照不同配比(1:1:1;1:2:3;2:5:10;2:5:2;2:1:4或4:4:1)，單純水煎劑?？诜辔附o藥，每天一次，共10天，觀察小鼠的生理指標和存活時間。并按下列公式計算其抑瘤率。抑瘤率計算公式抑瘤率(%)=[(空白組瘤重值-給藥組瘤重值)/空白組瘤重值]X100%體內抗腫瘤實驗整體解剖實驗觀察，得出數據結果采用SAS統(tǒng)計學軟件處理。結果表明各有效部位不同劑量對肝癌H22均有顯著的抑制作用，其中XHCII和四組等比例組配抑制腫瘤的效果最好，分別為62.03%和72.19%,最高抑瘤率和陽性對照藥順鉑相當，毒性明顯小于順鉑，對免疫功能系統(tǒng)損傷小。權重配方法優(yōu)化三個有效部位XHCII、XHCI、XHSI按照不同配比(1:1:1;h2:3;2:5:10;2:5:2;2:1:4;4:4:1)組合后，抑瘤率明顯高于單個有效部位抑瘤率效果，效果最好配比為XHCII、XHCI、XHSI(4:4:1)。具體實施例方式以下所列實施例有助于本領域技術人員更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實施例1有效部位的制備方法藥材重量(克)(1)(2)(3)(4)(5)仙鶴草白花蛇舌草白英甘草5030205150100803080206025201001015120906030按上述配比取干燥的復方藥材仙鶴草、白花蛇舌草、白英、甘草經過挑選、粉碎、過篩后，按固定配比，加95%乙醇，回流提取2-4次，每次提取時間為1-3h，合并提取液，回收乙醇后得醇提部分的濃縮物，進一步干燥得浸膏。該浸膏先用與藥材l-3倍體積95%乙醇超聲溶解，加入2—5倍的無水乙醚，得沉淀1和濾液1-a，沉淀1通過大孔吸附樹脂純化，洗脫液，干燥得有效部位XHCI，以薯蕷皂苷元為對照品作標準曲線，以紫外分光光度法測定百分含量為57.53%。為提高XHCI中脂溶性皂苷的含量，采用靜態(tài)吸附分離法確定適合的大孔吸附樹脂；采用動態(tài)吸附分離法確定分離條件，洗脫溶媒為水和不同比例的乙醇。結果得出大孔吸附樹脂sp-825對脂溶性皂苷有良好的吸附分離性能，最佳洗脫溶媒為50%乙醇。實施例2:有效部位xHcn的制備方法實施例l中沉淀抽慮后的濾液部分(濾液l-a)，回收溶劑得濃縮液，加入pH值8—9的Na0H水溶液8—12倍量，微沸30min，趁熱抽慮，殘渣加入5倍量的蒸餾水煮沸30min,抽慮，合并得抽慮液。濾液在70—80'C下，濃HCL調pH值在3—5之間，靜置24h有沉淀吸出得沉淀2和濾液2-a，沉淀干燥得總黃酮粗品，以槲皮素為對照品，紫外分光光度法測定百分含量為31.59%。聚酰胺樹脂純化過程通過吸附量和解吸附量為參數得出篩選試驗得出結果為，聚酰胺60-80目，濕法，上樣pH值為3.0,上樣濃度為lg生藥/3ml時純化效果最好，洗脫液依次采用不同比例的乙醇，分別為20%，40%,60%,80%,95%,5%NaOH,10%NaOH,收集各部分洗脫液，回收洗脫液,濃縮后并用鹽酸一鎂粉反應和聚酰胺薄膜跟蹤檢測黃酮類成分的洗脫情況，同時合并斑點相同的洗脫液。聚酰胺薄膜條件為，以槲皮素為對照，乙酸乙酯一甲醇(3:l)為展開劑，晾干后，噴以1%三氯化鋁溶液，于紫外燈下觀察，如有熒光斑點說明有黃酮存在。各不同比例濃度的乙醇洗脫液的鹽酸一鎂粉反應和聚酰胺薄膜跟蹤檢測均為陽性，說明吸附的黃酮類成分已被洗脫。101NaOH洗脫液鹽酸一鎂粉反應和聚酰胺薄膜跟蹤檢測均為陰性，說明吸附的黃酮類成分已被洗脫完畢。合并洗脫濃縮液的純化后總黃酮，紫外分光光度法測其百分含量為45.28%。實施例3:有效部位XHCIII的制備方法將堿提取酸沉淀得到濾液2-a，冷卻，用5WNaOH調pH值至中性，加入1-3倍體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯層，濃縮得浸膏為有效部位XHCIII，干燥稱重，定性鑒別為小分子萜類。以車葉草苷為對照品作標準曲線，以紫外分光光度法測定百分含量為37.83°/。。實施例4:有效部位XHSI的制備方法醇提后藥材干燥，用10—14倍量的水，煮沸提取3-5次，每次提取時間為2—5h，將每次提取的提取液過濾，所得的水提液合并，離心棄去沉淀后水提液減壓濃縮至小體積，對流水透析3-4天，繼續(xù)將溶液濃縮至小體積，用正丁醇萃取，得正丁醇層干燥部分XHSI，主要是水溶性皂苷類成分。以熊果酸為對照品，紫外分光光度法測定其百分含量為56.07%。大孔吸附樹脂純化過程通過靜態(tài)吸附試驗和動態(tài)吸附試驗結果表明SP825型樹脂在靜態(tài)洗脫率、靜態(tài)飽和吸附量、動態(tài)比上柱量、動態(tài)比吸附量均高于其它型號的樹脂，上樣方法為濕法水溶液上樣，上樣濃度為lg生藥/5ml，洗脫液為不同比例乙醇分別為10%、30%、60%、95%，收集各部分洗脫液，回收洗脫液，干燥得純化后，通過紫外分光光度法測定其百分含量為57.83%。實施例5:有效部位XHSII的制備方法醇提后藥材干燥，用10—14倍量的水，煮沸提取3-5次，每次提取時間為2—5h，將每次提取的提取液過濾，所得的水提液合并，離心棄去沉淀后水提液減壓濃縮至小體積，流動水透析3-4天，繼續(xù)將溶液濃縮至小體積，用正丁醇萃取，水層部分加入ZTCII天然澄清劑除蛋白、樹脂。加入澄清劑后，產生絮狀沉淀，離心，棄去沉淀部分，上清液澄明度明顯提高，7CTC加入H202，每100ml水提液中加入10XH202lO—20ml。通過正交試驗優(yōu)選純化多糖部分的實驗條件藥液濃度配成生藥水=1:20，加入B/A兩組分的添加量為8%/4%，于60。C水浴加熱，加入B組分后加熱2小時，然后加入A組分加熱1小時。以葡萄糖為對照品，采用苯酚一硫酸法，通過紫外分光光度法測得多糖百分含量為44.61%。實施例6:有效部位XHCI體外抗腫瘤活性實驗腫瘤細胞株人乳腺癌細胞系MCF-7、肝癌細胞系H印-G2、卵巢癌細胞系ES-2、人子宮頸癌細胞系JTC-26、肉瘤S180細胞系、肺癌A549細胞系在含10X小牛血清的RPMI一1640培養(yǎng)液，溫度37"C，5%C02培養(yǎng)箱中生長至細胞旺盛，取對數生長期的細胞進行實驗，經O.25X胰酶后加入0.02XEDTA消化，制成細胞懸液，將細胞懸液均勻接種于96孔微量培養(yǎng)板中(細胞個數為2X104個/孔)100yl，培養(yǎng)過夜，給藥組分別加入不同劑量的有效部位XHCI，對照組加入相應的培養(yǎng)液，終體積為200u1/孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h，加2mg/mlMTT40y1,培養(yǎng)4小時，棄去上清液，加DMSO150y1,于恒溫震蕩器震蕩10min，待藍色結晶體完全溶解，用酶標儀在550nm波長處測定吸光度(OD)值，并按下列公式計算其抑制率。有效部位對六種腫瘤細胞株的抑制作用結果以^士S表示，見表1。抑制率計算公式抑制率(%)=[(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值]X100%計算50%細胞殺傷時藥物濃度(IC50)，IC50采用加權直線回歸法處理。表1有效部位XHCI體外抗腫瘤活性實驗結果濃度(yg/ml)024.447.690.9166.7231.4286.2Hep-G21.329±0.0270.793±0.2010.499±0.0820.405±0.1030.242±0.1290.271±0.0790.232±0.016MCF-71.270±0.0541.134±0.1240.997±0.0820.888±0.0260.866±0.0470.803±0.0410.745±0.143JTC-261.917±0.3560.925±0.6350.607±0.4020.459±0.3190.235±0.1160.122±0.1150.119±0.2121.528±0.0431.262±0.0391.186±0.0160.837±0.0060.614±0.0050.422±0.0410.144±0.005A5491.842±0.2851.441±0.1931.279±0.0211.117±0.3220.924±0.5150.681±0.1150.307±0.326ES-21.507±0.0251.243±0.0301.148±0.0431.060±0.0470.955±0.0191.261±0.0281.489±0.008IC5031.569474.26524.94895.204109.6006.923實施例7:.有效部位XHIIC體外抗腫瘤活性實驗腫瘤細胞株人乳腺癌細胞系MCF-7、肝癌細胞系H印-G2、卵巢癌細胞系ES-2、人子宮頸癌細胞系JTC-26、肉瘤S180細胞系、肺癌A549細胞系在含10X小牛血清的RPMI一1640培養(yǎng)液，溫度37'C，5%C02培養(yǎng)箱中生長至細胞旺盛，取對數生長期的細胞進行實驗，經O.25X胰酶后加入0.02XEDTA消化，制成細胞懸液，將細胞懸液均勻接種于96孔微量培養(yǎng)板中(細胞個數為2X10MV孔)100yl，培養(yǎng)過夜，給藥組分別加入不同劑量的有效部位XHCII，對照組加入相應的培養(yǎng)液，終體積為200ul/L，繼續(xù)培養(yǎng)48h，加2mg/mlMTT40iU,培養(yǎng)4小時，棄去上清液，加DMSO150y1,于恒溫震蕩器震蕩10min，待藍色結晶體完全溶解，用酶標儀在550咖波長處測定吸光度(0D)值，并按下列公式計算其抑制率。有效部位對六種腫瘤細胞株的抑制作用結果以C]土s表示，結果見表2。抑制率計算公式抑制率(%)=[(對照組0D值-實驗組0D值)/對照組0D值]X100%計算50%細胞殺傷時藥物濃度(IC5。)，ICs。采用加權直線回歸法處理。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實施例8:有效部位XHSI體外抗腫瘤活性實驗腫瘤細胞株人乳腺癌細胞系MCF-7、肝癌細胞系H印-G2、卵巢癌細胞系ES-2、人子宮頸癌細胞系JTC-26、肉瘤S180細胞系、肺癌A549細胞系在含10X小牛血清的RPMI一1640培養(yǎng)液，溫度37'C，5%C02培養(yǎng)箱中生長至細胞旺盛，取對數生長期的細胞進行實驗，經O.25X胰酶后加入0.02XEDTA消化，制成細胞懸液，將細胞懸液均勻接種于96孔微量培養(yǎng)板中(細胞個數為2X10HV孔)100ul，培養(yǎng)過夜，給藥組分別加入不同劑量的有效部位XHSI，對照組加入相應的培養(yǎng)液，終體積為200iU/孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h，加2mg/mlMTT40u1,培養(yǎng)4小時，棄去上清液，加DMSO150y1，于恒溫震蕩器震蕩10min，待藍色結晶體完全溶解，用酶標儀在550nm波長處測定吸光度(OD)值，并按下列公式計算其抑制率。有效部位對六種腫瘤細胞株的抑制作用結果以土S表示，結果見表3。抑制率計算公式-抑制率(％)=[(對照組0D值-實驗組0D值)/對照組0D值]X100%計算50%細胞殺傷時藥物濃度(ICM)，IU采用加權直線回歸法處理。表3有效部位XHSI體外抗腫瘤活性實驗結果濃度(t"g/ml)H印-G2MCF-7ES-2JTC-26A54901.183±0.1271.240±0.0541.515±0.0251.017±0.0560.708±0.0482.822±0.06524.40.793±0.2011.034±0.1241.243±0.0300.314±0.0350.262±0.0391.841±0.11347.60.499±0.0210.907±0.0821.148±0.0430.207±0.0120.186±0.0161.279±0.02190.90.405±0.1030.754±0.0261.060±0.0470.159±0.0070.137±0.0061.117±0.022166.70.242±0.0290.445±0.0470.955±0.0190.145±0.0060.114±0.0050.924±0.015231.40.271±0.0790.866±0.0411.261±0.0280.122±0.0150.122±0.0410.681±0.015286.20.234±0.0160.845±0.1431.489±0.0080.119±0.0120.144±0.0050.307士O.006IC50113.343.4-3.266.2646.8實施例9:有效部位XHSII體外抗腫瘤活性實驗腫瘤細胞株人乳腺癌細胞系MCF-7、肝癌細胞系Hep-G2、卵巢癌細胞系ES-2、人子宮頸癌細胞系JTC-26、肉瘤S180細胞系、肺癌A549細胞系在含10X小牛血清的RPMI一1640培養(yǎng)液，溫度37'C，5%C02培養(yǎng)箱中生長至細胞旺盛，取對數生長期的細胞進行實驗，經0.25X胰酶后加入0.02XEDTA消化，制成細胞懸液，將細胞懸液均勻接種于96孔微量培養(yǎng)板中(細胞個數為2X104個/孔)100ul，培養(yǎng)過夜，給藥組分別加入不同劑量的有效部位XHSII，對照組加入相應的培養(yǎng)液，終體積為200iU/孔,繼續(xù)培養(yǎng)48h，加2mg/mlMTT40u1,培養(yǎng)4小時，棄去上清液，加DMSO150!x1,于恒溫震蕩器震蕩IOmin，待藍色結晶體完全溶解，用酶標儀在550nm波長處測定吸光度(OD)值，并按下列公式計算其抑制率。有效部位對六種腫瘤細胞株的抑制作用結果以而土S表示，結果見表4。抑制率計算公式抑制率(％)=[(對照組0D值-實驗組0D值)/對照組0D值]X100%計算50%細胞殺傷時藥物濃度(IC5。)，IC5。采用加權直線回歸法處理。表4有效部位XHSII體外抗腫瘤活性實驗結果濃度(yg/ml)H印-G2MCF-7ES-2JTC-26A54901.129±0.4271.540±0.0541.515±0.0252.519±0.1342.302±0.1133.105±0.19324.41.024±0.9011.398±0.1241.243±0.0302.247±0.1371.539±0.1961.768±0.35747.60.522±0.3211.007±0.0821.148±0.0431.698±0.6651.004±0.0831.517±0.21090.90.405±0.1030.854±0.026L060士0.0471.230±0.4630.656±0.0271.132±0.405166.70.272±0.0290,645±0.0470.955±0.0190.945±0.2080.334±0.0320,458±0.037231.40.236±0.0790.866±0.0411.261±0.0280.753±0.3610.299±0.0280.381±0.070286.20.234±0.0160.845±0.1431.489±0.0080.636±0.3980.384±0.2190.321±0.019IC5077.005207.8185.546107.50640.41739.241實施例10:XHCI體內抗腫瘤實驗仙鶴復方XHCI有效部位對小鼠肝癌H22腫瘤的抑制情況。在無菌條件下，從預先接種好的小鼠腹腔腹水中取腫瘤，用NaCl注射液稀釋，混勻后消毒接種小鼠右前肢腋下皮下，每支0.2ml，約含瘤細胞lXl(f個。24h后隨機分組，對照組(水)，陽性對照組(順鉑，10mg/kg)，XHCI有效部位小劑量,mg/kg)，中劑量(1600tng/kg)，大劑量(3200mg/kg)，XHCI、XHCII、XHSI、XHSII四個有效部位等比例組合(薩mg/kg)(表5-8中簡稱組合物，以下同)，單純水煎劑(800mg/kg)。口服灌胃給藥，每天一次，共七天，觀察小鼠的生理指標和存活時間。并按下列公式計算其抑瘤率，結果見表5。抑瘤率計算公式抑瘤率(%)=[(空白組瘤重值-給藥組瘤重值)/空白組瘤重值]X100%<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>XHCII體內抗腫瘤實驗仙鶴復方有效部位XHCII對小鼠肝癌H22腫瘤的抑制情況。在無菌條件下，從預先接種好的小鼠腹腔腹水中取腫瘤，用NaCl注射液稀釋，混勻后消毒接種小鼠右前肢腋下皮下，每支0.2ml，約含瘤細胞lXl(f個。24h后隨機分組，對照組(水)，陽性對照組(順鉑，10mg/kg)，XHCII有效部位小劑量(800mg/kg)，中劑量(扁mg/kg)，大劑量(3200mg/kg),XHCI、XHCII、XHSI、XHSII四個有效部位等比例組合(誦mg/kg)(表5-8中簡稱組合物，以下同)，單純水煎劑(800mg/kg)。口服灌胃給藥每天一次共七天，觀察小鼠的生理指標和存活時間。并按下列公式計算其抑瘤率，結果見表6。抑瘤率計算公式抑瘤率(%)=[(空白組瘤重值-給藥組瘤重值)/空白組瘤重值]X100%<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實施例12:XHSI體內抗腫瘤實驗仙鶴復方XHSI有效部位對小鼠肝癌H22腫瘤的抑制情況。在無菌條件下，從預先接種好的小鼠腹腔腹水中取腫瘤，用NaCl注射液稀釋，混勻后消毒接種小鼠右前肢腋下皮下，每支0.2ml，約含瘤細胞1X1(T個。24h后隨機分組，對照組(水)，陽性對照組(順鉬，10mg/kg)，XHSI有效部位小劑量(800mg/kg)，中劑量(薩mg/kg)，大劑量(3200mg/kg)，XHCI、XHCII、XHSI、XHSII四個有效部位等比例組合(1600mg/kg)(表5-8中簡稱組合物，以下同)，單純水煎劑(800mg/kg)?？诜辔附o藥天一次，共七天，觀察小鼠的生理指標和存活時間。并按下列公式計算其抑瘤率，結果見表7。抑瘤率計算公式抑瘤率(%)=[(空白組瘤重值-給藥組瘤重值)/空白組瘤重值]X100%表7XHSI有效部位對肝癌H22的抑制作用(7±S)_抑瘤率組別-^-_空白對照陽性對照XHSI有效部位組合物水煎劑低劑量-73.2635.2260.6822.59中劑量--48.2867.3639.27高劑量-_=_48.12_71.29_40.81實施例13:XHSII體內抗腫瘤實驗仙鶴復方XHSII有效部位對小鼠肝癌H22腫瘤的抑制情況。在無菌條件下，從預先接種好的小鼠腹腔腹水中取腫瘤，用NaCl注射液稀釋，混勻后消毒接種小鼠右前肢腋下皮下，每支0.2ml，約含瘤細胞lXl(f個。24h后隨機分組，對照組(水)，陽性對照組(順鉑，10mg/kg)，XHSII有效部位小劑量(800mg/kg)，中劑量(薩mg/kg)，大劑量(3200mg/kg)，XHCI、XHCII、XHSI、XHSII四個有效部位等比例組合(調mg/kg)(表5-8中簡稱組合物以下同)，單純水煎劑(800mg/kg)，口服灌胃給藥，每天一次，共七天，觀察小鼠的生理指標和存活時間。并按下列公式計算其抑瘤率，結果見表8。抑瘤率計算公式抑瘤率(%)=[(空白組瘤重值-給藥組瘤重值)/空白組瘤重值]X100%表8XHSII有效部位對肝癌H22的抑制作用(7±S)_抑瘤率_空白對照陽性對照XHSII有效部位組合物水煎劑低劑量-73.2659.6260.6822.59中劑量--68.1567.3639.27高劑量--61.6171.2940.81實施例14:復方各組配物的體內抗腫瘤實驗采用權重配方法對仙鶴復方XHCI、XHCII、XHSI有效部位的組配物的劑量配比進行優(yōu)化，每個有效部位設定六個劑量組，分別為最大劑量和最小劑量，在這個范圍內的等比例取其中四個劑量，XHCI最大劑量為120mg/ml，最小劑量12mg/m1,XHCII最大劑量為60mg/ml，最小劑量為18mg/ml，XHSI最大劑量為90mg/ml，最小劑量24mg/ml。給藥觀察對小鼠肝癌H22腫瘤的抑制情況，具體操作為在無菌條件下，從預先接種好的小鼠腹腔腹水中取腫瘤，用NaCl注射液稀釋，混勻后消毒接種小鼠右前肢腋下皮下，每支0.2ml，約含瘤細胞lX1Cf個。24h后隨機分組，對照組(水)，陽性對照組(順鉑，10mg/kg)，不同組配物藥物濃度見表9。根據權重配方法試驗安排6組劑量，由于組方中每個組分藥各發(fā)揮不同的作用，可根據其劑量和聯(lián)合效應關系來衡量每個組分的作用程度和總體的藥理作用?？诜辔附o藥天一次，共七天，觀察小鼠的生理指標和存活時間。采用整體解剖實驗觀察，各生理指標，并按下列公式計算其抑瘤率，結果見表IO。抑瘤率計算公式抑瘤率(%)=[(空白組瘤重值-給藥組瘤重值)/空白組瘤重值]X100%_表9:權重配方法安排三個有效部位組配劑量_<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>443249855250126607777表10復方組配物位對肝癌H22的抑制作用(7±S)抑瘤率(％)組別-工白對照陽性對照組合物1-72.9530.602-72.9532.893-72.9532.014-72.9530.605-72.9556.756-72.9558.24實施例15:藥物制劑劑型的研究(1)片劑不同含量(活性成分XHCn、XHCI、XHSI=4:4:1)，包衣提取物壓片制成片劑的使用，用作賦型劑的輔料有MgS04、玉米淀粉、滑石粉(規(guī)格100mg、150mg、200mg、300mg)。(2)膠囊(活性成分XHCII、XHCI、XHSI=4:1:2)普通及腸溶膠囊，不同規(guī)格。(3)散劑:(活性成分XHCn、XHCI、XHSI=4:1:3)藥物提取后加入一定輔料后，干燥研粉。(4)顆粒沖劑(活性成分XHCII、XHCI、XHSI=2:5:IO)袋裝速溶顆粒劑。(5)滴丸劑(活性成分XHCII、XHCI、XHSI=2:5:2)增加吸收率和吸收速度，起效快。(6)注射劑(活性成分XHCII、XHCI、XHSI=1:1:4)過濾，除菌，除熱源，用注射用水按一定比例溶解完全均勻，吸收效果好，起效快。.(7)凍干粉針(活性成分XHCn、XHCI、XHSI=4:4:l)便于貯存。各種藥物制劑的制備具體操作如下(1)按配置總量計稱取含1070%有效部位提取物，加入3090%的填充劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、矯味劑等，充分攪拌混合制成顆粒，在607(TC干燥24小時后，壓制成片，使每片含有效部位提取物50150mg。(2)將制成的顆粒直接充填入各種空膠囊殼中，使每粒膠囊含提取物50200rag，為膠囊劑。當然各制劑配比及輔料選用會有所差異。(3)按配置總量計稱取含2070%提取物，加入30-80%的助溶劑如糊精、矯味劑等，溶解均勻后干燥，磨細粉裝袋，即得粉劑。(4)按配置總量計稱取含10%60%提取物，加入40%90%的填充劑、崩解劑、矯味劑等，充分攪拌混合用1214目篩制成顆粒。在607(TC干燥充分后裝袋，使每克顆粒劑含提取物100500mg。(5)按配置總量計稱取含10%60%提取物，加入40%90%的助溶劑聚乙二醇、抗氧劑等，加熱熔融溫度(40~90°C)，使原料和輔料充分混溶，滴制成丸，使每粒滴丸含提取物520mg。(6)取水溶性提取物30g,加入適量的注射用水，攪拌并水浴60'C加熱使之溶解，以5%Na2C03溶液調pH值到6.5-8.0，加入0.1%活性炭加熱煮沸15min,以脫色除去熱源，待稍冷后過濾，注射用水加至全量5000ml,微孔濾膜過濾后熔封于5ml安瓿中，105°C加熱滅菌即得。(7)取水溶性提取物30g,加入適量的注射用水，攪拌并水浴6(TC加熱使之溶解，以5Wa2C03溶液調pH值為6.5-8.0，加入0.1%活性炭加熱煮沸15min，以脫色除去熱源，待稍冷后過濾，注射用水加至全量2500ml，微孔濾膜過濾后分裝于西林瓶中，每瓶中裝2.5ml。凍干條件預凍溫度-25°C，預凍時間3小時，升華時間為10小時，第一次干燥溫度20'C，干燥時間為4小時，第二次干燥溫度4(TC，干燥時間為6-8小時，105"C加熱滅菌即得。實施例16用下述成分制備硬明膠膠囊活性成分(XHCI、XHCII、XHSI、XHSII四個有效部位等比例組成)320mg，干淀粉200mg，硬脂酸鎂10mg，將上述成分混合后，以460mg填充入硬明膠膠囊中。實施例17活性成分(XHCI、XHCII、XHSI、XHSII=1:2:1:1組成)lOmg，淀粉45mg，羧甲基淀粉鈉鹽4.5mg，硬脂酸鎂0.5mg，滑石粉1mg。將原輔料預先干燥，過100目篩備用。先將處方量的輔料充分混勻。將原料藥以遞增稀釋法加到輔料中，每次加時充分混勻2—3次，保證藥與輔料充分混勻，過20目篩，在55'C通風烘箱中干燥2h，干顆粒過16目篩整理，測定中間體含量，混合均勻，在壓片機上壓片。實施例17注射液的制備活性成分(XHCI、XHCII、XHSI、XHSII=1:1:1:1)200mg，丙二醇100mg,聚山梨300ml。取活性成分加入到已溶解山梨醇和丙二醇的注射用水中，加入藥用堿調節(jié)PH值至4一8使其溶解。加入活性炭，攪拌吸附30分鐘，除炭、精濾、灌封、滅菌。實施例18活性成分(XHCI、XHCII、XHSI=1:1:0.1)lOOmg，藥用堿1-7%,甘露醇55—85%。取活性成分加入注射用水，用藥用堿調節(jié)PH值至4-8使其溶解。再加入甘露醇，按注射劑的要求進行高壓滅菌.加入活性炭，采用微孔濾膜過濾，濾液進行分裝，采用冷凍干燥法，制得疏松塊狀物，封口即得。綜上所述，本發(fā)明的內容并不局限在的實施例中，相同領域內的有識之士可以在本發(fā)明的技術指導思想之內可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發(fā)明的范圍之內。權利要求1、一種含有抗腫瘤活性成分的中藥有效部位組合物，其特征在于該組合物由仙鶴草、白花蛇舌草、白英、甘草原料藥中的仙鶴復方有效部位組成；其中所述的仙鶴復方有效部位包括脂溶性皂苷，總黃酮苷和/或苷元，萜類和脂肪酸，水溶性皂苷，總多糖中的一種或多種的組合物。2、如權利要求1所述的組合物，其特征在于該組合物由仙鶴草10150g，白花蛇舌草5100g,白英580g，甘草為530g中的脂溶性甾體皂苷，總黃酮苷，砲類，水溶性皂苷，總多糖中的一種或多種有效部位組成；其中脂溶性甾體皂苷、水溶性皂苷〉50%，總黃酮苷、總多糖〉40%。3、如權利要求1所述的組合物，其特征在于有效部位脂溶性皂苷，總黃酮苷和/或苷元，萜類和脂肪酸，水溶性皂苷，總多糖與藥學上可接受的載體混合制成各種制劑。4、如權利要求3所述的組合物，其中的各種制劑包括口服液、注射液、混懸劑、丸劑、片劑、膠囊、散劑、顆粒劑或滴丸劑。5、一種制備權利要求1或2所述組合物的方法，其特征在于該有效部位是由下述方法制備而成(1)將藥材仙鶴草10150g，白花蛇舌草5100g，白英580g，甘草為530g混合，加50-95%的乙醇，回流、提取、濃縮后得醇提浸膏，該浸膏用與藥材等體積的50-95%乙醇，超聲溶解，加入2—5倍的無水乙醚，得沉淀1和濾液1-a，沉淀1通過大孔吸附樹脂純化后得有效部位XHCI;(2)濾液l-a濃縮后，用堿提、酸沉淀，得沉淀2和濾液2-a，沉淀2經聚酰胺樹脂純化后得有效部位XHCII;(3)濾液2-a用乙酸乙酯萃取，濃縮干燥后得有效部位XHCin;(4)將(1)的乙醇提后藥材，水煮，提取3-5次，合并，上清液減壓濃縮，透析3-4天，用2-3倍體積的飽和正丁醇萃取2-5次，合并正丁醇層萃取液，濃縮，千燥得XHSI;(5)水層經ZTCn天然澄清劑澄清，除去蛋白、樹脂、色素等成分，用3-10%雙氧水脫色后得XHSII。6、如權利要求5所述的制備方法，其中所述有效部位XHCI采用的大孔吸附樹脂為sp-825，洗脫溶媒為50%乙醇；所述有效部位XHCII的聚酰胺樹脂純化指的是聚酰胺60-80目，濕法上樣，控制pH值為3.0，上樣濃度為lg生藥/3ml，洗脫液為20%-95%乙醇，5%Na0H,10柳aOH,收集各部分洗脫液，純化；所述有效部位XHSII采用IIZTC天然澄清劑除蛋白。7、權利要求14任一項所述組合物在制備抗腫瘤藥物中的應用；其中的腫瘤包括人乳腺癌、肝癌、卵巢癌、人子宮頸癌或肺癌。8、一種含有抗腫瘤藥物的中藥復方制劑，其特征在于，該復方由仙鶴草l(Tl50g，白花蛇舌草5~100g，白英580g,甘草5~30g的提取物與一種或多種藥學上可接受的載體組成。9、權利要求8所述中藥復方制劑的制備方法，其特征在于該復方制劑由下述方法制備而成(1)將藥材仙鶴草10150g,白花蛇舌草5100g,白英580g,甘草為530g混合，加50-95%的乙醇，回流提取2—4次，每次提取時間為3—5h，合并提取液，回收乙醇后得醇提部分的濃縮物，干燥得浸膏；(2)該浸膏先用與藥材等體積的50-95%乙醇，超聲溶解，加入2—5倍的無水乙醚，得沉淀1和濾液l-a,沉淀1通過大孔吸附樹脂純化后得有效部位XHCI;(3)濾液1-a濃縮后，用堿提取，酸沉淀得沉淀2和濾液2-a，沉淀2經聚酰胺樹脂純化后得有效部位XHCII;(4)濾液2-a用乙酸乙酯萃取，合并，濃縮，干燥后得有效部位XHCm;(5)將(1)乙醇提后的藥材，干燥，用10—14倍量的水，煮沸提取3-5次，每次提取時間為2-5h，將每次所得提取液過濾，合并，離心棄去沉淀后，上清液減壓濃縮至小體積，透析3-4天。將透析液濃縮至小體積，用2-3倍體積的飽和正丁醇萃取2-5次，合并正丁醇層萃取液，濃縮，干燥得XHSI;(6)水層經II型ZTC天然澄清劑澄清，除去蛋白、樹脂、色素等成分，用3-10%雙氧水脫色后得XHSII。()將上述分離得到的5個有效部位中的一個或多個與藥學上可接受的載體混合制成復方制劑。10、如權利要求8或9所述的中藥復方制劑，包括口服液、注射液、混懸劑、丸齊U、片劑、膠囊、散劑、顆粒劑或滴丸劑。全文摘要本發(fā)明提供一種由仙鶴草、白花蛇舌草、白英和甘草四味中藥組成的組合物。以及從該組合物中分離制備總黃酮、脂溶性總皂苷、萜類、總多糖和水溶性總皂苷有效部位的方法及含有有效部位活性成分的組合物在抗腫瘤藥物中的應用。本發(fā)明的有效部位制備方法，具有工藝簡單，收率高，經濟且環(huán)境污染小，易于大規(guī)模的工業(yè)化生產等特點。同時本發(fā)明制備的含有抗腫瘤活性成分的中藥有效部位組合物經體內、體外藥理活性研究表明總黃酮、脂溶性總皂苷、總多糖和水溶性總皂苷及其組合物均具有較好的抗腫瘤活性，有望研制成低毒高效的腫瘤治療的中藥復方制劑。文檔編號A61K9/20GK101564466SQ20081005282公開日2009年10月28日申請日期2008年4月21日優(yōu)先權日2008年4月21日發(fā)明者劉培勛,劍向,秀沈,閣洪,靜高,魏永燕,偉龍申請人:中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所