專利名稱：：靶特異性雙突變體融合蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及具有靶細(xì)胞特異性細(xì)胞毒性的融合蛋白質(zhì)，具體地說，本發(fā)明涉及人促性腺激素釋放激素突變體(mGnRH)與重組綠膿桿菌外毒素A突變體(PE38m4a)融合蛋白質(zhì)的構(gòu)建，以及所說的雙突變體融合蛋白質(zhì)作為抗腫瘤藥物，在抑制類固醇激素刺激的腫瘤發(fā)生和發(fā)育中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：傳統(tǒng)的腫瘤治療方法是使用化學(xué)藥物直接殺傷體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。然而，大多數(shù)抗腫瘤藥物在殺傷腫瘤的同時(shí)還殺傷正常細(xì)胞，即不可避免地造成嚴(yán)重的毒副作用。為了提高抗腫瘤藥物對腫瘤細(xì)胞的選擇性，自20世紀(jì)70年代后期以來，人們就試圖將某些抗腫瘤藥物或本來缺乏耙向選擇性的毒素(包括細(xì)菌或動植物來源的毒素)化學(xué)偶聯(lián)到適當(dāng)?shù)膶?dǎo)向分子或稱識別分子上，以制備雜交的具有靶特異性的抗腫瘤劑。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，進(jìn)而建立了以DNA重組技術(shù)制備這樣的融合蛋白質(zhì)的方法。在腫瘤的發(fā)生和發(fā)育過程中，許多腫瘤細(xì)胞都在其表面過量表達(dá)某些細(xì)胞因子或受體蛋白質(zhì)，例如表皮生長因子受體(EGF-R)和轉(zhuǎn)化生長因子a受體(TGFa-R)。因此，可將某些細(xì)胞毒性劑(如綠膿桿菌外毒素(PE)、白喉毒素、霍亂毒素、葡萄球菌內(nèi)毒素及蓖麻毒素等)連接到作為導(dǎo)向劑的EGF、TGF-a或bFGF分子上，以產(chǎn)生兼有腫瘤細(xì)胞導(dǎo)向功能和細(xì)胞毒活性的雜交分子。這些雜交分子借助其對靶腫瘤細(xì)胞導(dǎo)向能力將整個分子引向靶細(xì)胞并通過其毒素部分殺傷靶細(xì)胞。目前研究較多且較深入的細(xì)胞毒性劑是綠膿桿菌外毒素A(PEA)(參見美國專利4,545,985)。PEA是由613個氨基酸組成的單鏈多肽。對PE分子的X射線晶體學(xué)研究和突變分析顯示，PE分子包括三個與產(chǎn)生細(xì)胞毒性相關(guān)的結(jié)構(gòu)區(qū)域負(fù)責(zé)與敏感細(xì)胞結(jié)合的氨基末端細(xì)胞受體結(jié)合區(qū)(I區(qū))；負(fù)責(zé)毒素分子向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位的中間轉(zhuǎn)位區(qū)(II區(qū))；以及負(fù)責(zé)失活細(xì)胞延伸因子-2并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡的羧基末端酶促活性區(qū)(III區(qū))。其中I區(qū)包括介導(dǎo)細(xì)胞結(jié)合的Ia區(qū)(氨基酸1-252)和目前尚未明確其功能的Ib區(qū)(氨基酸365-399)?？梢允褂蒙锘瘜W(xué)或重組DNA技術(shù)修飾PE分子，以制備PE分子中有一個或多個氨基酸缺失或取代的各種修飾的PE片段，例如，一般將刪去了PE分子中Ia區(qū)，只含有酶促和轉(zhuǎn)位區(qū)，分子量約為40KDa的PE-A蛋白質(zhì)稱為PE40?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)刪除PE的Ia和大部分lb區(qū)(氨基酸365-380)后，即PE38毒素分子，該分子仍保留其特異性細(xì)胞毒性，但降低了非特異性毒性和抗原性(例如參見Hwangetal.,Cell48:129-136，1987;美國專利4,892,827和歐洲專利0261671)。許多現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)已描述了PE與各種生長因子、抗體、激素或CD4融合，以產(chǎn)生可選擇性地導(dǎo)向并殺傷具有不同細(xì)胞膜蛋白(受體或抗原)之靶細(xì)胞的雜交蛋白質(zhì)的方法(參見PastanandFitz.G，Science254:1173-1177,1991)。例如，Chaudhary等人(PNAS84:4538-4542,1987)描述了PE40與TGFa間形成的雜交體融合蛋白質(zhì)(TGFa-PE40)。TGFa-PE40的臨床實(shí)用性依賴于其結(jié)合并殺傷具有表皮生長因子受體之細(xì)胞的能力。美國專利5,428,143公開了用于選擇性殺傷HIV感染之細(xì)胞的雜交蛋白質(zhì)及編碼該雜交蛋白質(zhì)的嵌合基因的構(gòu)建。其中所說的雜交蛋白質(zhì)由含有HIV結(jié)合位點(diǎn)的人CD4和可殺死HIV感染之細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)(PE40)組成。作為與本發(fā)明更為相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)，國際專利W093/15751公開了將促性腺激素釋放激素(GnRH)肽直接偶聯(lián)到綠膿桿菌外毒素分子上制成的嵌合蛋白質(zhì)分子。據(jù)稱，投用這樣的嵌合分子可導(dǎo)致腦垂體中攜帶GnRH受體的細(xì)胞被破壞，并伴有性激素分泌的降低，因而可望將其用于動物不育化及抑制類固醇激素相關(guān)腫瘤的增殖。另外，國際專利申請W097/15325描述了一種含有與綠膿桿菌外毒素化學(xué)結(jié)合的GnRH的免疫原性載體系統(tǒng)，以其作為疫苗可在動物體內(nèi)誘發(fā)產(chǎn)生高濃度抗GnRH抗體，因而可用于控制受孕、減少生殖激素驅(qū)動的行為及治療類固醇激素反應(yīng)性腫瘤。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供靶特異性雙突變體融合蛋白質(zhì)，它是由突變的促性腺激素釋放激素mGnRH與重組綠膿桿菌外毒素A突變體融合而成的融合毒素，特征在于所述的重組綠膿桿菌外毒素是去除la區(qū)及l(fā)b區(qū)的氨基酸365-380，且C末端氨基酸Glu610、Leu612、Lys613分別人工突變?yōu)長ys610、Glu612和Leu613的PEA分子，即PE38m4a。所述的突變的促性腺激素釋放激素mGnRH,它的基因是以大腸桿菌偏性密碼子為主體的基因形式合成的，氨基酸序列為Met-Gly-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-His。耙特異性雙突變體融合蛋白質(zhì)它的基因序列如序列表SEQIDNO.l所示。它的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.2所示?！N表達(dá)載體，pET27-mGnRH-PE38m4a,其基因序列如序列表SEQIDNO.l所示。本發(fā)明耙特異性雙突變體融合蛋白質(zhì)是由下述方法制備的；(1)人工合成適合基因表達(dá)的mGnRH基因序列，和PE38m4a基因序列；(2)將人工合成的融合基因序列通過基因操作克隆到表達(dá)載體中；(3)用步驟(2)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌中；(4)在適當(dāng)條件下表達(dá)所說的融合蛋白質(zhì)；(5)從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化融合蛋白質(zhì)。步驟(l)mGnRH基因序列，采用人工設(shè)計(jì)合成了Ncol內(nèi)切酶識別序列--大腸桿菌偏性密碼子組成的mGnRH核苷酸序列，其中第6位Gly突變?yōu)門rp—Ndel內(nèi)切酶識別序歹ij-PE38m4a核苷酸序列-EcoRI內(nèi)切酶識別序列；合成的基因序列的5'和3'端分別引入了Ncol和EcoRI核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，并造成適于連接的粘性末端。步驟(2)所述的基因如序列表SEQIDNO.l所示。所述的載體是pET27。步驟(3)所述的大腸桿菌為大腸桿菌BL21aDE3)。本發(fā)明的再一個目的是靶特異性雙突變體融合蛋白質(zhì)在治療與促性腺激素釋放激素受體有關(guān)的腫瘤藥物的應(yīng)用GnRH是由Schally等于1971年從動物體內(nèi)分離純化，闡明其結(jié)構(gòu)后又人工合成的，并以此獲得了1976年的Nobel獎。GnRH為一個不含游離氨基酸與羧基的十肽，其分子結(jié)構(gòu)為P-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，其中第4-6位氨基酸形成P轉(zhuǎn)折，呈發(fā)夾形，適合與受體結(jié)合，第2和3位對生物活性很重要，第6位對維持發(fā)夾構(gòu)象起重要作用，第1位與第4-10位氨基酸均參與受體結(jié)合，若置換以上氨基酸殘基可導(dǎo)致活力喪失或呈幾何級增強(qiáng)。在體內(nèi)很容易被蛋白水解酶降解，故其半衰期僅4-8min。其水解酶肽酶的主要作用部位是Gly6-Leu7和Pro9-GlylO-NK。為尋求高效且持久的GnRH類似物，通過對其肽鏈結(jié)構(gòu)中氨基酸的拾取或替換，己合成3000多種GnRH類似物。由于合成的GnRH半衰期長，作用更強(qiáng)，所以比天然的GnRH更適于病人的治療。合成長效的GnRH激動劑的要求是穩(wěn)定分子結(jié)構(gòu)，使之不易被酶水解，增加與循環(huán)中的蛋白和胞膜的結(jié)合及提高對GnRH受體的親和力。如6位為D-氨基酸的類似物和取代GlylO酰胺基。這種GnRH激動劑不僅耐蛋白酶水解作用較大，而且對受體有較高的親和力。若在第6位引入龐大的疏水基團(tuán)可進(jìn)一步增加與受體的親和力。這樣的置換穩(wěn)定了釋放激素類似物的"活性"構(gòu)型，提高了與循環(huán)中蛋白的結(jié)合，從而延長半衰期。早期開發(fā)的GnRH拮抗劑的理論基礎(chǔ)與GnRH激動劑相似，可改善與受體結(jié)合，卻產(chǎn)生不易接受的組胺釋放副作用。因此，開發(fā)下一代的GnRH拮抗劑的焦點(diǎn)集中到既提高效能又減少組胺釋放這一方面。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，某些激素和細(xì)胞因子的受體在腫瘤細(xì)胞上有異常高的表達(dá)，如EGFR、GnRHR等。而且，激素和細(xì)胞因子的分子相對較小，結(jié)構(gòu)簡單，基因操作方便，因此，作為免疫毒素的載體有很大的可行性。目前有很多的細(xì)胞因子和激素被利用來做免疫毒素的載體，如IL-2、IL-4、EGF、GnRH等，并且表達(dá)的重組免疫毒素蛋白均具有特異性細(xì)胞毒效應(yīng)。GnRH受體最早發(fā)現(xiàn)于垂體，隨著近年來對GnRH及其受體研究的進(jìn)一步深入，越來越多的臨床和實(shí)驗(yàn)表明，垂體外組織也有GnRH及其受體的分布，并且垂體外正常組織及其相應(yīng)部位癌組織GnRH受體性質(zhì)有許多不同。有文獻(xiàn)報(bào)道，它們所介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路不同，也有報(bào)道，癌細(xì)胞表面的GnRH受體可能介導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡。另外，癌細(xì)胞膜表面受體的親和力通常大于相應(yīng)正常組織細(xì)胞膜表面受體親和力。據(jù)報(bào)導(dǎo)，在脊椎動物牛蛙腦垂體和后腦的細(xì)胞上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3種GnRH受體的亞型，人體中目前發(fā)現(xiàn)兩種亞型，但其分布和功能各不相同，I型受體與I型GnRH結(jié)合，n型受體與II型GnRH結(jié)合，二者之間交叉反應(yīng)極低。已經(jīng)有大量的實(shí)驗(yàn)證明(1)人類正常組織的性腺(包括子宮內(nèi)膜、子宮肌層、卵巢和睪丸)，胎盤和大腦組織的細(xì)胞膜上有GnRH受體的分布。(2)不排除其他正常組織細(xì)胞膜上有親和力及低的GnRH受體存在的可能，如肝臟。(3)GnRH受體主要分布在肝癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮肌瘤、乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞膜上。本文所使用的術(shù)語"mGnRH"是指能夠與其表面上具有類固醇激素受體的細(xì)胞結(jié)合，并且當(dāng)以高劑量投用于哺乳動物宿主時(shí)能引發(fā)抗GnRH抗體產(chǎn)生的天然GnRH的類似物或衍生物。天然GnRH也稱為促黃體激素釋放激素(LHRH或LRH)，其為具有下示氨基酸序列的十肽分子pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2式中所用的氨基酸符號為本領(lǐng)域通用的三字母縮寫符號，并且其中的pGlu代表焦谷氨酸。由于基因工程表達(dá)中無法合成焦谷氨酸，所以一般都將之突變?yōu)楣劝滨０??？蛇m用于本發(fā)明的mGnRH類似物或衍生物是Trp6iGnRH。研究結(jié)果顯示，分子中的第36位氨基酸是維持GnRH活性所必需的，而Se一和TyrS則在受體結(jié)合中起到關(guān)鍵性作用。已有證據(jù)表明，卵巢細(xì)胞特別是粒層細(xì)胞表面具有GnRH受體。已證明小鼠睪丸細(xì)胞(Legdig細(xì)胞)表面的受體表達(dá)與體內(nèi)激素水平有關(guān)(Harwood,J.P.etal.,Endocrinology107:407-413,1980)。另外，還有人發(fā)現(xiàn)大鼠子宮內(nèi)膜上具有親合力很高的GnRH受體(曹詠清等，中國科學(xué)B輯1:32-37，1984)。雖然目前對GnRH的垂體外作用機(jī)理尚不完全清楚，但可以肯定的是，GnRH與性腺或子宮內(nèi)膜等類固醇激素相關(guān)組織或細(xì)胞上特異性受體的結(jié)合是GnRH發(fā)揮垂體外作用的一個重要環(huán)節(jié)。而且也已顯示，與靶細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒上存在的GnRH受體結(jié)合基本上是沒有種屬特異性的(張崇理等，中國應(yīng)用生理學(xué)雜志5(1):87-93，1988)。本發(fā)明所涉及的融合毒素中設(shè)計(jì)的導(dǎo)向部分為突變的mGriRH氨基酸序列為Met-Gly-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-His式中所用的氨基酸符號為本領(lǐng)域通用的三字母縮寫符號，其中為了基因連接方便在基因合成時(shí)于N末端加入了Met-Gly的密碼子，并且將新序列中第八位氨基酸于基因水平上突變?yōu)門rp，以使表達(dá)產(chǎn)物與相應(yīng)受體結(jié)合能力的增強(qiáng)；同時(shí)將大腸桿菌偏性密碼子引入到其中，以使表達(dá)產(chǎn)物適合在大腸桿菌中表達(dá)。我們對按本發(fā)明方法制備的mGnRH-PE38m4a融合蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性分析己清楚地證明，mGnRH-PE38m4a具有與包括A549細(xì)胞在內(nèi)多種性器官來源的腫瘤細(xì)胞具有殺傷活性，而對多種組織來源的正常細(xì)胞則沒有這種特異殺傷活性(參見實(shí)施例2)。本文中所使用術(shù)語"IC5e"是指殺死靶細(xì)胞達(dá)到對照組的50%所需的嵌合毒素的濃度。本發(fā)明中使用標(biāo)準(zhǔn)的MTT法檢測"IC5o"值。Allured等人對PE晶體的X線衍射分析表明PE是613個氨基酸組成的單鏈毒素蛋白，分子量66kDa，其前體為638個氨基酸，在分泌過程中切去了由25個氨基酸組成的高度疏水的引導(dǎo)肽。從PE的晶體結(jié)構(gòu)中得知，它在空間上分為三個結(jié)構(gòu)域(Domain,D)區(qū)，即I區(qū)、n區(qū)和II1區(qū)(見圖l)。I區(qū)在PE的氨基端(N端)，占分子的l/3強(qiáng)，呈反向平行的日結(jié)構(gòu)，它由Ia區(qū)和Ib區(qū)組成，這兩部分在DNA序列上是分離的，但在三維結(jié)構(gòu)中緊靠在一起。Ia區(qū)由第1~252個氨基酸組成，Ib區(qū)由第365399個氨基酸組成。Ff區(qū)由第253364個氨基酸組成，為中央?yún)^(qū)，由6-7個a-螺旋組成。UI區(qū)由第400613個氨基酸組成，為羧基端區(qū)，占分子的1/3。此毒素的分子結(jié)構(gòu)中有8個半胱氨酸，形成4個二硫鍵，它們是三級結(jié)構(gòu)形成折疊的決定因素。PEA結(jié)構(gòu)功能的特點(diǎn)在于它的三個結(jié)構(gòu)功能區(qū)在單一肽鏈上行使其細(xì)胞毒性所必需的細(xì)胞結(jié)合、轉(zhuǎn)位和ADP-核糖基化這三種功能，探知各區(qū)的功能及分析各區(qū)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系主要根據(jù)PEA基因突變的研究。Ia區(qū)行使識別和結(jié)合靶細(xì)胞表面受體的功能，Ia區(qū)的缺失產(chǎn)生了分子量40000的PE40，它保留了完整的ADP-核糖基化功能，但細(xì)胞毒性減低到1%，這是由于PE40喪失細(xì)胞結(jié)合能力的結(jié)果。對Ia區(qū)的定點(diǎn)誘變研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將第57位賴氨酸(Lys57)誘變?yōu)楣劝彼?Glu)時(shí)突變的PE細(xì)胞毒性減低到1%，這是由于突變毒素同靶細(xì)胞表面結(jié)合能力喪失的緣故。同時(shí)已觀察到Lys57位于PE分子表面，這與其有受體結(jié)合能力是相符合的。I區(qū)上其它Lys位點(diǎn)的突變對PE細(xì)胞毒素作用無任何影響?？梢?，Lys57是Ia區(qū)的關(guān)鍵的氨基酸位點(diǎn)。除Lys57外，位于Ia區(qū)的His246，Arg247和His249三個堿性氨基酸也是維持PE生物學(xué)活性的重要位點(diǎn)。在突變型PE的Glu246，247,249和PEGlu57，246，247，249，上述堿性氨基酸已由Glu替換，使Ia區(qū)與II區(qū)間連接的氫鍵受阻斷，突變型分子比天然PE較為伸展，增加了對蛋白酶的敏感性，縮短了在小鼠體內(nèi)循環(huán)的半衰期，因此，它們對動物顯示低的細(xì)胞毒性。Ib區(qū)在三維結(jié)構(gòu)上位于Ia區(qū)和III區(qū)之間，此區(qū)的大部缺失并不影響PE的生物學(xué)活性。在PE40的基礎(chǔ)上缺失了Ib區(qū)的第365381位氨基酸，形成了PE38分子。PE38分子比PE40分子量小2000Da，缺失了3-4個關(guān)鍵的抗原決定簇，因此抗原性明顯降低。n區(qū)在毒素跨膜轉(zhuǎn)位過程中起主導(dǎo)作用。當(dāng)n區(qū)缺失時(shí)，盡管其細(xì)胞結(jié)合能力和ADP-核糖基化活性尚存，但細(xì)胞毒性喪失，說明n區(qū)為毒素轉(zhuǎn)位功能所必需的。n區(qū)的強(qiáng)疏水區(qū)插入膜或橫跨膜是轉(zhuǎn)位過程的重要環(huán)節(jié)。A與B螺旋之間有一個環(huán)位于分子表面，Arg276和Arg279在此環(huán)上，細(xì)胞蛋白酶裂解作用發(fā)生在第279和第280位氨基酸之間。實(shí)驗(yàn)表明，將Arg276、Arg279點(diǎn)突變成Gly后，其細(xì)胞毒性作用減低到1/400。因?yàn)橥蛔兎肿訉?xì)胞蛋白酶有抗力，因而不能裂解產(chǎn)生37000片段，毒素不能轉(zhuǎn)位入胞漿而不產(chǎn)生細(xì)胞毒作用。研究發(fā)現(xiàn)Arg276不可用大小相近和電荷相同的氨基酸替換，說明此位點(diǎn)與細(xì)胞有關(guān)成分的相互作用是專一的?？梢姡珹rg276和Arg279是維持n區(qū)轉(zhuǎn)位功能的關(guān)鍵性位點(diǎn)。其他重要的氨基酸位點(diǎn)有Cys265，Cys287等，它們點(diǎn)突變成Ser或Ala后，造成細(xì)胞毒作用減低到1/10。此外，n區(qū)E螺旋的部分(第346364位氨基酸)缺失不引起PE活性的喪失。IIJ區(qū)有三個功能，其一是催化EF-2受ADP-核糖基化作用，其二引導(dǎo)毒素的酶活性片段進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。其三激活與細(xì)胞凋亡有關(guān)的Caspases-3酶，啟動細(xì)胞的凋亡機(jī)制而引起細(xì)胞凋亡。Allured提出III區(qū)的一個裂縫區(qū)是酶活性中心?，F(xiàn)己證實(shí)，定位在裂縫區(qū)的Glu553是關(guān)鍵的活性位點(diǎn)，Glu553參與結(jié)合NAD的過程，Glu553向Asp的點(diǎn)突變導(dǎo)致其ADP-核糖基化活性至少減低到1%，缺失它則完全喪失活性。其他幾個裂縫區(qū)的殘基Arg458，Arg467及Trp466也參與III區(qū)同NAD相互作用的過程。Tyr481以Phe替代時(shí)引起ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性減低卻不減低NAD糖苷水解酶活性而被推測參與同EF-2相互作用；Trp558也不直接參與結(jié)合NAD的過程卻為ADP-核糖基化作用所必需。111區(qū)的另一個關(guān)鍵殘基His426位于由第421432位氨基酸殘基構(gòu)成的a螺旋內(nèi)，此螺旋位于酶催化作用中心的遠(yuǎn)端，在111區(qū)酶催化位點(diǎn)的分子構(gòu)筑上起關(guān)鍵作用。此外，UI區(qū)表面Arg490附近是另一處蛋白酶靶區(qū)。Arg490的缺失或突變可導(dǎo)致產(chǎn)生耐蛋白酶的分子，Arg492的缺失或突變引起ADP-核糖基化活性減低。111區(qū)C末端特異的氨基酸序列的功能是介導(dǎo)PE由胞吞泡向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)位。此特異序列是Arg609-Glu610-Asp611-Leu612-Lys613(即REDLK)五個氨基酸殘基片段。它的缺失使PE的細(xì)胞毒性喪失，但對其ADP-核糖基化活性并無任何影響。在活性PE分子的C末端特異序列REDLK和使蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列KDEL之間有功能相似性。當(dāng)編碼PE的C末端REDLK序列以KDEL片段取代時(shí)可導(dǎo)致其細(xì)胞毒性提高2-8倍，證明KDEL序列使PE在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留作用更為有效。用于構(gòu)建本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)的pe分子是在缺失了Ia區(qū)和大部分Ib區(qū)的PE分子基礎(chǔ)上，保留609位Arg和611位Asp，將Glu610、Leu612、Lys613分別突變?yōu)長ys610、Glu612和Leu613，而形成一種新的氨基酸組合RKDEL，即PE38m4a。鑒于本發(fā)明抗腫瘤嵌合毒素中導(dǎo)向劑或稱識別分子的促性腺激素釋放激素的原序列基因不適合于基因工程表達(dá)，另外作為細(xì)胞毒性成分的PE38m4a多位點(diǎn)突變，為了便于基因操作，人工設(shè)計(jì)合成了如下組分的基因序列Ncol內(nèi)切酶識別序列-大腸桿菌偏性密碼子組成的mGnRH核苷酸序列，其中第6位Gly突變?yōu)門rp-Ndel內(nèi)切酶識別序列-PE38m4a核苷酸序列-EcoRI內(nèi)切酶識別序列。合成的基因序列的5'和3'端分別引入了NcoI和EcoRI核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，并造成適于連接的粘性末端?？砂凑毡绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組技術(shù)(例如參見Sambrooketal"MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborlaboratory,1989)，克隆合成的基因入表達(dá)載體pET27(MerckCo.)系列中構(gòu)建pET27-mGnRH-PE38m4a。然后將重組載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化到原核細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞中以生產(chǎn)mGnRH-PE38m4a融合蛋白質(zhì)。DNA重組操作中，使用限制性酶切法鑒定序列連接方向的正確性和可能的突變，最后以Sanger雙脫氧鏈終止法進(jìn)行序列測定以進(jìn)一步證實(shí)之。這里應(yīng)特別指出的是，由于相對于細(xì)胞毒性部分PE38m4a來說，導(dǎo)向部分mGnRH的分子量小得多，所以由兩者產(chǎn)生的融合蛋白質(zhì)很可能形成新的二級空間構(gòu)象，導(dǎo)致PE38m4a部分對mGnRH的巻曲，影響融合蛋白質(zhì)的受體結(jié)合的程度。然而通過技術(shù)人員計(jì)算機(jī)分析PE38m4a部分的巻曲并不能影響mGnRH的分子暴露和與受體結(jié)合。重組蛋白質(zhì)基因?qū)⒈豢刹倏v地連接到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列上，如連接到適于在大腸桿菌中使用的T7、trp或入啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄終止信號上?？墒褂靡阎霓D(zhuǎn)化方法，如適于原核細(xì)胞的氯化鈣處理法將本發(fā)明的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到選擇的宿主細(xì)胞中?？苫谫|(zhì)粒上所含抗生素抗性基因所賦予的抗生素抗性來選擇被轉(zhuǎn)化的陽性細(xì)胞。一旦表達(dá)了所需的融合蛋白質(zhì)，即可按照本領(lǐng)域己知的方法分離并純化該融合蛋白質(zhì)。例如，可從發(fā)酵培養(yǎng)物中離心收集菌體細(xì)胞并用溶菌酶和超聲波裂解之，然后超速離心并在低濃度磷酸鹽(約20mM)溶液中加入飽和硫酸銨進(jìn)行分步沉淀。依次經(jīng)離子交換層析(正C)和體積排阻層析(SEC)純化所需的mGnRH-PE38m4a重組蛋白質(zhì)。另外，亦可使用鹽析、親合層析及制備性凝膠電泳等方法進(jìn)行純化(參見R.Scopes,ProteinPurificafion,Springer-Verlag,N,Y.,1982)。一般說來，使用聚丙烯酰胺凝膠以SDS-PAGE電泳法(Laemmli，Nature227:680-689,1970)分析各柱層析洗脫部分，并使用多克隆抗PE抗血清和以免疫印跡法檢測之。對重組融合蛋白質(zhì)純化產(chǎn)物進(jìn)行腫瘤細(xì)胞抑制試驗(yàn)以檢測融合蛋白質(zhì)的細(xì)胞毒性(IC50)。以及用1251標(biāo)記的天然GnRH與融合蛋白在A549細(xì)胞表面進(jìn)行競爭取代，以確定融合蛋白中的mGnRH與天然GnRH對細(xì)胞表面受體的親合能力。可將本發(fā)明的mGnRH-PE38m4a融合蛋白質(zhì)作為基本活性成分，并加入一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑，制成適于臨床應(yīng)用的藥物組合物。所說的載體或賦形劑包括但不只限于磷酸鹽緩沖鹽水、生理鹽水、等滲葡萄糖溶液、葡聚糖、右旋糖苷等。根據(jù)所治療的疾病的不同，可在本發(fā)明的藥物組合物中加入一種或多種與本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)有輔助或協(xié)同作用的其他天然的、合成的或重組的活性化合物。另外，可在本發(fā)明的藥物組合物中加入選自人血清白蛋白、低分子量肽、甘氨酸或賴氨酸及金屬陽離子(如Zn2+、Mn2+、Mg^和Ca2+)的蛋白質(zhì)保護(hù)劑，以及選自聚乙二醇、羧甲基纖維素、多聚甘氨酸、谷胱甘肽的穩(wěn)定劑?？梢酝ㄟ^常規(guī)給藥途徑，特別是胃腸道外途徑投用本發(fā)明的藥物組合物，例如通過靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下或粘膜內(nèi)途徑給藥。本發(fā)明藥物組合物的有效劑量范圍可從幾毫微克至幾十毫克/公斤體重/天，但針對每個特定病人的具體用藥劑量將根據(jù)待治療疾病或病理狀態(tài)的性質(zhì)及嚴(yán)重程度、病人的年齡、體重、對藥物的反應(yīng)能力及給藥方式等因素而定。應(yīng)特別指出的是，盡管更深入的作用機(jī)理尚不明確，但我們的實(shí)驗(yàn)室已證明本發(fā)明的mGnRH-PE38m4a蛋白質(zhì)對包括結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞、卵巢癌OVCAR3細(xì)胞、子宮頸腺癌HeLa細(xì)胞及肝癌HepG-2細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞系均有明顯的特異結(jié)合活性和細(xì)胞毒性；正常細(xì)胞基本沒有致死作用；融合蛋白比天然PEA活性提高了9-10倍左右；而且成本低，方法簡單，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。圖1顯示用于表達(dá)mGnRH-PE38m4a的重組質(zhì)粒的構(gòu)建圖。圖2顯示的125I-mGnRH-PE38m4a(▲)和125I-GnRH(■)與A549細(xì)胞膜表面受體結(jié)合的飽和曲線。圖3顯示的1251標(biāo)記的mGnRH-PE38m4a和GnRH與A549細(xì)胞膜表面受體結(jié)合后分別用未標(biāo)記的不同濃度的GnRH或mGnRH-PE38m4a競爭替代的曲線。令代表不同濃度的GnRH競爭替代'251-mGnRH-PE38m4a的曲線，國代表不同濃度的mGnRH-PE38m4a競爭替代'25I_GnRH的曲線。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:mGnRH-PE38m4a融合蛋白質(zhì)的制備A.重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定a.mGnRH-PE38m4a雙鏈基因的制備參考現(xiàn)有文獻(xiàn)資料設(shè)計(jì)并人工體外合成如SEQIDNO.l所示mGnRH-PE38m4a的雙鏈核苷酸序列(含酶切識別位點(diǎn)及目的基因共1089bp)。在T4連接酶(Promega)存在下直接克隆于PGEM-T載體中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM105，獲得含PGEM-T/mGnRH-PE38m4a質(zhì)粒的工程菌株。b.mGnRH-PE38m4a表達(dá)質(zhì)粒的制備提取PGEM-T/mGnRH-PE38m4a質(zhì)粒，并利用Ncol和EcoRI核酸內(nèi)切酶雙酶切，收集mGnRH-PE38m4a基因片段，在丁4連接酶(Promega)存在下直接克隆入相同酶切的pET27載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM105，獲得含pET27-mGnRH-PE38m4a質(zhì)粒的工程菌株。c.mGnRH-PE38m4a表達(dá)菌株的篩選提取pET27-mGnRH-PE38m4a質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定后，將正確克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21UDE3)細(xì)胞，并將被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)于含卡那霉素(50yg/ml)的LB培養(yǎng)基中，以擴(kuò)增質(zhì)粒DNA。培養(yǎng)完成后，以常規(guī)方法提取質(zhì)粒DNA。用Ncol和EcoRI酶切鑒定，然后陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列分析。SEQIDN0:1顯示了所測得的mGnRH-PE38m4a重組基因的核苷酸序列。SEQIDNO:2顯示了所測得的mGnRH-PE38m4a重組基因的核苷酸序列所推導(dǎo)出的氨基酸序列。圖I顯示了重組質(zhì)粒pET27-mGnRH-PE38m4a的構(gòu)建。B.mGnRH-PE38m4a融合蛋白質(zhì)的表達(dá)及產(chǎn)物的純化將攜帶pET27-mGnRH-PE38m4a重組基因質(zhì)粒的大腸桿菌BL2iaDE3)(含有T7RNA聚合酶啟動子基因)(Studier，F(xiàn).W.andMoffatt，B.A.,J.Mol，Biol,189:113-130,1986)培養(yǎng)在含有卡那霉素(50yg/ml)的LB培養(yǎng)基中37。C培養(yǎng)，當(dāng)006()()達(dá)到約0.4~0.6時(shí)加入lmM異丙基硫代-e-D-半乳糖苷(IPTG)(終濃度lmM)，37'C繼續(xù)培養(yǎng)3-4小時(shí)，以誘導(dǎo)目的產(chǎn)物的表達(dá)。然后離心收集細(xì)菌，細(xì)菌經(jīng)過適當(dāng)方法破碎后再離心收集沉淀和上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳確定目的蛋白的表達(dá)形式和表達(dá)量。經(jīng)SDS-PAGE電泳表明目的蛋白以可溶性分泌形式表達(dá)，表達(dá)量占菌體總蛋白的20%左右。并將含有目的蛋白質(zhì)上清中加入緩沖液成分，終濃度達(dá)50mMTris-HC1,pH8.0，lmMEDTA，4'C中空纖維超濾器(Milipore)作用30分鐘，4'C離心(20，000g，30分鐘)，取上清(可溶性部分)即為mGnRH-PE38m4a粗提物。mGnRH-PE38m4a粗提物經(jīng)過緩沖液平衡的DEAE-SepharoseFastFlow柱(Pharmacia),用含有0-0.5MNaCl的TE緩沖液(20mMTris-HCl，pH8.0，lmMEDTA)連續(xù)梯度洗脫，并收集蛋白質(zhì)各組分峰部分。目的組分峰部分經(jīng)小型中空纖維超濾器(Milipore)作用30分鐘超濾濃縮換液后，使?jié)饪s物通過用20mMTris-HCl,pH8.0，lmMEDTA，0.15MNaCl緩沖液平衡過的1.6X100cmS印hacryl-100柱(Pharmacia),并用含有0.15MNaCl的TE緩沖液(20mMTris.HCl,pH8.0,lmMEDTA)洗脫。收集活性峰部分并再次過高壓液相色譜柱(日本島津)，收集蛋白質(zhì)峰值(A28。)部分并在30mMPBS中徹底透析，透析后于-20'C下儲存?zhèn)溆?。如此純化的蛋白質(zhì)純度〉95%。利用'251標(biāo)記的天然GnRH和mGnRH-PE38m4a進(jìn)行腫瘤細(xì)胞A549的結(jié)合試驗(yàn)及多克隆抗PE抗血清對純化的mGnRH-PE38m4a蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。實(shí)施例2:標(biāo)記的天然GnRH和mGnRH-PE38m4a融合蛋白質(zhì)的靶特異性和生物學(xué)活性分析A.結(jié)合能力試驗(yàn)a.GnRH和mGnRH-PE38m4a的'251標(biāo)記稱取1mgLodogen溶于0.5ml氯仿中，取50ul(100wg)加至試管底部，用氮?dú)獯蹈桑硬缓Ｗo(hù)劑的多肽或蛋白質(zhì)半成品0.4ml，加入Na'2515mCi室溫反應(yīng)12min，反應(yīng)過程不斷搖動，使之反應(yīng)充分。1251標(biāo)記的混合物利用S印harylS-200服凝膠柱(1X50cm)分離純化，收集各管，取放射性強(qiáng)度最卨的管進(jìn)行試驗(yàn)。b.癌細(xì)胞及正常細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI-1640完全培養(yǎng)基在5%C02，37'C條件下單層貼壁培養(yǎng)并計(jì)數(shù)。每細(xì)胞孔中加入相同CPM的'251標(biāo)記GnRH、mGnRH-PE38m4a(5nCi/孔，稀釋在BSA-PBS中)，并進(jìn)行系列等倍稀釋度，1小時(shí)后RPMI-1640完全培養(yǎng)基洗滌5次，經(jīng)胰蛋白酶消化，吹打收集細(xì)胞懸液，進(jìn)行Y計(jì)數(shù)(結(jié)果見圖2)。從圖2所示的結(jié)果可以看出，'KI標(biāo)記GnRH和mGnRH-PE38m4a均以劑量依賴方式結(jié)合到腫瘤細(xì)胞A549表面直到達(dá)到飽和程度，并且顯示'25I-mGnRH-PE38m4a的結(jié)合能力〉125I_GnRH，而對正常細(xì)胞結(jié)合能力均極低，從而證實(shí)本發(fā)明部分中純化的mGnRH-PE38m4a融合蛋白能夠以劑量依賴方式與受體陽性細(xì)胞結(jié)合。B.GnRH、mGnRH-PE38m4a與'251標(biāo)記GnRH、mGnRH-PE38m4a競爭結(jié)合試驗(yàn)基本上按照Qayum，A.等人(Br丄Cancer62:96-99,1990)所述的方法進(jìn)行多肽或蛋白質(zhì)對A549細(xì)胞結(jié)合的特異性競爭和取代研究。將培養(yǎng)的A549單層細(xì)胞記數(shù)后加入結(jié)合試驗(yàn)飽和曲線拐點(diǎn)處放射性標(biāo)記物Y計(jì)數(shù)單位的'MI-mGnRH并37。C溫浴1小時(shí)。RPMI-1640完全培養(yǎng)基洗絡(luò)5次，1小時(shí)后再分別加入未標(biāo)記的mGnRH-PE38m4a(0.01-1000uM),37。C溫浴1小時(shí)，RPMI-1640完全培養(yǎng)基洗滌5次，經(jīng)胰蛋白酶消化，吹打收集細(xì)胞懸液，進(jìn)行Y計(jì)數(shù)；另外進(jìn)行反證試驗(yàn)將培養(yǎng)的A549單層細(xì)胞計(jì)數(shù)后加入飽和曲線拐點(diǎn)處放射性標(biāo)記物Y計(jì)數(shù)單位的'"I-mGnRH-PE38m4a，用未標(biāo)記的GnRH(0.01-1000uM)進(jìn)行競爭和取代研究，結(jié)果見圖3。圖3中園代表不同濃度的mGnRH-PE38m4a競爭替代'251-GnRH的曲線。余代表不同濃度的GnRH競爭替代'25I-mGnRH-PE38m4a的曲線。從圖3所示的數(shù)據(jù)可以看出，以漸增的濃度加入未標(biāo)記的mGnRH-PE38m4a或GnRH均可以將標(biāo)記物進(jìn)行取代，另外可以看出GnRH取代125I-mGnRH-PE38m4a的濃度是mGnRH-PE38m4a取代125I-GnRH的濃度的7-8倍左右，說明mGnRH-PE38m4a融合蛋白中經(jīng)過突變處理，其中的mGnRH組分較未突變的GnRH對靶細(xì)胞的結(jié)合能力提高7倍以上。實(shí)施例3:細(xì)胞毒性試驗(yàn)定量的樣品經(jīng)過濾除菌，按等倍稀釋法將不同量的樣品加入各細(xì)胞孔中，使之總體積為100y1，5%C02，37'C條件下培養(yǎng)12h,培養(yǎng)板各孔中分別加入100u1MTT染色試劑，5%C02，37'C條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h，于490nm波長下測定吸光值，計(jì)算重組毒素對各種腫瘤和正常細(xì)胞的50%細(xì)胞死亡的濃度(IC5())，同時(shí)利用天然綠膿桿菌外毒素A(PEA,Sigma公司)作為對照，比較融合毒素和天然PEA的活性變化。結(jié)果見表l。表1:純化的mGnRH-PE38m4a和天然PEA對腫瘤和正常細(xì)胞的IC;<table>complextableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表1顯示純化的mGnRH-PE38m4a和天然PEA對某些腫瘤細(xì)胞及某些正常細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞毒性。IC5o數(shù)值是指殺死靶細(xì)胞達(dá)到對照組的50。/。所需的融合蛋白的濃度。A549為人肺腺癌細(xì)胞株、LOVO為人腸癌細(xì)胞株、MKN45為人胃腺癌細(xì)胞株、Bcap37為人乳腺癌細(xì)胞株、QGY為人肝癌細(xì)胞株、PC-3M為人前列腺癌細(xì)胞株、A375為人黑色素瘤細(xì)胞株、KB為人口腔癌細(xì)胞株，正常細(xì)胞有人胚腎、人胚肝培養(yǎng)株。從表1所示的結(jié)果可以看出，本發(fā)明所純化的mGnRH-PE38m4a可以殺死人肺腺癌、人腸癌、人胃腺癌、人乳腺癌、人肝癌、人前列腺癌、人黑色素瘤、人口腔癌細(xì)胞株，并且IC5。值較低，而對正常細(xì)胞人胚腎、人胚肝培養(yǎng)株無殺傷作用；天然PEA對相同種類腫瘤細(xì)胞的ICs。均高于融合蛋白ICs。值，二者相差10倍左右，由此可見，融合蛋白比天然PEA活性提高了9-10倍左右。試驗(yàn)還表明PEA幾乎對所有細(xì)胞都有致死作用，而mGnRH-PE38m4a則對正常細(xì)胞基本沒有致死作用。SEQUENCELISTING<110>北京博翱泰生物技術(shù)有限公司<120>靶特異性雙突變體融合蛋白質(zhì)<160>2<210〉1〈211〉1089<212>DNA<213>人工<400>1atgggtcagcactggtcctactggctgcgtccgggtcatatggccgaagagggcggcsgc60ctggccgcgctgaccgcgcaccetggcttgccacctgccgctggagactttcacccgtcat120cgccagccgcgcggctgggaacaactggagcagtgcggctatccggtgcagcggctggtc180gccctctacctggcggcgcggctgtcgtggaaccaggtcg3CC3ggtg8tccgcaacgcc240ctggccagccccggcagcggcggcgacctgggcgaagcgatccgcgagcagccggsgcag300gcccgtctggccctgaccctggccgccgccgagagcgagcgcttcgtccggcagggcacc360ggcaacgacgaggccggcgcggccaacggcccggcggacEigcggcgacgcCCtgCtgg3g420cgcaactatcccactggcgcggagttcctcggcgacggcggcgacgtceigcttcagcacc480cgcggcacgc3g犯ctggacggtggagcggctgctccaggcgcaccgcca3ctggaggag540cgcggctatgtgttcgtcggctaccacggcaccttcctcg肪gcggcgceiaagcatcgtc600ttcggcggggtgcgcgcgcgcagccaggacctcgacgcgatctggcgcggtttctatatc660gccggcgatccggcgctggcctacggctacgCCC3gg3CCaggaacccgacgcacgcggc720cggatccgc3acggtgccctgctgcgggtctatgtgccgcgctcgagcctgccgggcttc780taccgcaccagcctgaccctggccgcgccggaggcggcgggcgaggtcgaacggctgatc840ggccatccgctgccgctgcgcctggacgccatcaccggccCCg3ggagg33ggcgggcgc■ctggagaccattctcggctggccgctggccgagcgcaccgtggtgattccctcggcgatc960ccceiccgacccgcgc犯cgtCggCggCgEICctcgacccgtccagcatccccgacaaggaa1020caggcgatcagcgccctgccggactacgccagccagcccggcaaaccgccgcgcaaggac1080gagctgt犯<210><211><212><213><400>Met1GluGlyGly2362PRT人工2GinHisTrpSerTyrTrpLeuArgProGlyHisMetAlaGluProLeuLeuAla65LeuGlu50AlaGlyGlu30GinSer20Thr5LeuAlaAlaLeu10AlaHisGinAlaPheThrArgCysGlyTyrArgLeuSerAlaSerProGinProGluGluArgAsnThr145ArgGly130GlyPhe115ProGin層ValGly85AlaTrp70SerPro55AsnHis35ValGinValAspGlyGlyAspThr25ArgGinProArgGinArgLeuVal60ValGly45AlaCys30Trp15HisLeuGluGinLeuTyrLeuArgLeuAlaArgGinGlyAlaAspSerAlaGluPheGlyThrGinAsn165Leu150TrpGly135GlyThr120AspLeu105GlyLeu90ThrGin75GlylieArgAsnGluAlalieLeuAlaAlaAsnAspGluAlaLeuLeuAspGlyGlyThrValGluArg170Asp155LeuGlu140ValAla125ArgAla110GlyArg95GluAla80GluSerAlaAlaAsnTyrProSerPheSerLeuGinAlaHis175Thr160ArgGinLeuGluGluArgGlyTyrValPheValGlyTyrHisGlyThrPhe185PheGlyGlyValGlu180AlaGinSerlieLeuGluAla195LeuAspAlalieGinAsp210AlaLeuAlaTyrGly225ArglieArgAsnTrp215AlaVal200PheGlyGinAspGinGlyTyrGly190AlaArgSerArg205AlaGlyAspProTyr230AlaLeuLeuArglie220ProAspAlaArgGly245TyrArgThrSerGlu235TyrValProArgLeuProGlyPhe260ValGluArgLeuVal250ThrLeuAlaAlaAlaGlyGlu275lieThrGlyProLeu265GlyHisProLeuSer255GluGly240SerAlaAspAla290LeuGly305ProThrProAspProGlyTrpAspLysLys355Glu295Glulie280GluGluGlyGlyPro270ProLeuArgLeu285LeuGluThrlieProLeuAlaGluArgThrVal310AsnValGlyGlyProArg325GinAlalieSerGlu340ProProArgLysAsp360Arg300lieProSerAlaVal315LeuAspProSerAla345GluAsp330LeuProAspTyrLeuAla350Ser335Serlie320lieGin權(quán)利要求1、靶特異性雙突變體融合蛋白質(zhì)，它是由突變的促性腺激素釋放激素mGnRH與重組綠膿桿菌外毒素A突變體融合而成的融合毒素，其特征在于所述的重組綠膿桿菌外毒素是去除Ia區(qū)及Ib區(qū)的氨基酸365-380，且C末端氨基酸Glu610、Leu612、Lys613分別人工突變?yōu)長ys610、Glu612和Leu613的PEA分子，即PE38m4a。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的靶特異性雙突變體融合蛋白質(zhì)，其特征在于所述的突變的促性腺激素釋放激素mGnRH的基因是以大腸桿菌偏性密碼子為主體的基因形式合成的，氨基酸序歹!j為MetGlyGluHisTrpSerTyrTrpLeuArgProGlyHis。3、靶特異性雙突變體融合蛋白質(zhì)它的基因序列如序列表SEQIDNO.l所示。4、靶特異性雙突變體融合蛋白質(zhì)，它的氨基酸序列如序列表SEQIDN0.2所示。5、一種表達(dá)載體，pET27-mGnRH-PE38m4a，其基因序列如序列表SEQIDNO.l所示。6、耙特異性雙突變體融合蛋白質(zhì)是由下述方法制備的(1)人工合成適合基因表達(dá)的mGnRH基因序列，和PE38m4a基因序列；(2)將人工合成的融合基因序列通過基因操作克隆到表達(dá)載體中；(3)用步驟(2)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌中；(4)在適當(dāng)條件下表達(dá)所說的融合蛋白質(zhì)；(5)從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化融合蛋白質(zhì)。7、根據(jù)權(quán)利要求6靶特異性雙突變體融合蛋白質(zhì)，其特征在于步驟(l)所述的mGnRH基因序列，采用人工設(shè)計(jì)合成了Ncol內(nèi)切酶識別序列--大腸桿菌偏性密碼子組成的mGnRH核苷酸序列，其中第6位Gly突變?yōu)門rp--Ndel內(nèi)切酶識別序列--PE38m4a核苷酸序列--EcoRI內(nèi)切酶識別序列；合成的基因序列的5'和3'端分別引入了NcoI和EcoRI核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，并造成適于連接的粘性末端。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的靶特異性雙突變體融合蛋白質(zhì)，其特征在于步驟(2)所述的基因如序列表SEQIDNO.l所示。9、根據(jù)權(quán)利要求6、7、8所述的靶特異性雙突變體融合蛋白質(zhì)，其特征在于所述的載體是pET27，步驟(3)所述的大腸桿菌為大腸桿菌BL21aDE3)。10、根據(jù)權(quán)利要求l、2、3、4、6、7、8、9所述的靶特異性雙突變體融合蛋白質(zhì)，在治療多種與促性腺激素釋放激素受體有關(guān)的腫瘤藥物的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了靶特異性雙突變體融合蛋白質(zhì)，是由人促性腺激素釋放激素突變體(mGnRH)與重組綠膿桿菌外毒素A突變體(PE38m4a)融合蛋白質(zhì)構(gòu)建的，本發(fā)明的mGnRH-PE38m4a蛋白質(zhì)對包括結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞、卵巢癌OVCAR3細(xì)胞、子宮頸腺癌HeLa細(xì)胞及肝癌HepG-2細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞系均有明顯的特異結(jié)合活性和細(xì)胞毒性；正常細(xì)胞基本沒有致死作用；融合蛋白比天然PEA活性提高了9-10倍左右；而且成本低，方法簡單，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號A61K38/10GK101343328SQ20081005111公開日2009年1月14日申請日期2008年8月25日優(yōu)先權(quán)日2008年8月25日發(fā)明者張俊英申請人:北京博翱泰生物技術(shù)有限公司