專利名稱：：菱角揮發(fā)油在制備抑瘤藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于中藥
技術領域：
。技術背景菱角為菱科植物的果實，又稱菱、菱實，是一種應用廣泛的藥食同用水生植物，菱實味甘鮮，性平，無毒，具有清熱祛暑，除濕祛風，益氣健脾功效，被藥典、中藥大辭典等廣泛收載。近年來研究表明，菱角具有抗腫瘤作用，可用于腫瘤的輔助治療，但其作用的有效成分一直未明確。
發(fā)明內容本發(fā)明提供一種菱角揮發(fā)油在制備抑瘤藥物中的應用。本發(fā)明菱角揮發(fā)油可通過現有文獻報導的方法獲得，優(yōu)選為以下超臨界流體萃取方法獲得。具體方法是1、儀器、試劑與原料HA221-50-06超臨界流體萃取儀(江蘇南通華安超臨界萃取有限公司)；TRACE-MS氣相色譜一質譜聯(lián)用儀(美國Finnigan公司)；AB104型電子天平(瑞士Mettletoledo公司)。(:02(食用級，液態(tài)純度為99.99%)乙醚、無水硫酸鈉等均為分析純。所用菱角均采自吉林省大安縣,并經吉林農業(yè)大學樊紹缽教授鑒定為東北菱(TrapamanshuricaFler)。2、實驗方法將干燥菱殼粉粹并過24目篩，稱取1760g盛入5L萃取釜。萃取溫度40'C-45。C,分離溫度45。C-50。C,萃取壓力25Mpa-30Mpa,分離壓力12Mpa-15Mpa，C02流量15-20kg/hr，待各條件穩(wěn)定后開始等壓循環(huán)萃取，共萃取4h,每小時接取一次萃取物。將萃取物溶于50ml乙醚,無水硫酸鈉干燥,低溫存放，用于GC-MS檢測。3、揮發(fā)油GC-MS檢測條件氣相色譜:HP-5MS彈性石英毛細管柱(30mx0.25mmx0.25um);進樣口溫度280°C;起始柱溫80°C，保持1min，以每分鐘20'C升至280°C，保持15min;載氣氦氣，流量1.0mL/min;分流比30:1;進樣量lpL。質譜EI離子源；電子能量70eV;界面溫度28(TC;離子流溫度180°C。掃描范圍33-600U。通過G1701BA化學工作站數據處理系統(tǒng),檢索Nist98譜圖庫，相對含量在1%以上的14種，含量占總化合物的75.2%，其中香豆素類1種，占總化合物的22.97%，脂肪族類2種，占總化合物的26.26%，酮類5種，占總化合物的13.08%，醛類1種，占總化合物的2.36%，吡喃類1種，占總化合物的2.15%,醇類1種，占總化合物的1.87%,酯類1種，占總化合物的1.47%,酚類1種，占總化合物的1.83%;含量較高的化合物依次為蛇床子素(22.97%)，9，12-亞油酸(17.18%)，棕櫚酸(9.08%)，4,5，6，7-四甲基苯并[c]呋喃酮(5.49。/。)。其中含量最高的香豆精類物質蛇床子素，具有抗菌、鎮(zhèn)靜、降壓、抗心律不齊、抗癌抗突變及提高機體免疫力等作用。另外，占揮發(fā)油總量26.26%的兩種脂肪酸具有較多的應用價值,其中亞油酸(LA)為人體必需脂肪酸，是共軛亞油酸(CLA)的前體物，而共軛亞油酸具有抗癌、抗動脈粥樣硬化等生理功能。本發(fā)明的積極效果是菱角揮發(fā)油對腫瘤細胞的生長增殖具有較明顯的抑制作用，藥效學實驗表明對人宮頸癌和肝癌的抑制作用明顯，并且無明顯的毒性反應。本發(fā)明藥物用法用量，口服劑量20毫克-100毫克/次'人，一日三次。圖l是菱角揮發(fā)油總離子流圖。圖2是菱角揮發(fā)油對Hda細胞的生長抑制曲線。圖3是24h后對照組Hela細胞(X200)。圖4是給藥24h后Hela細胞(X200)。圖5是檢測揮發(fā)油誘導Hela細胞凋亡電泳圖。具體實施方式下面通過藥效學實驗來進一步說明菱角揮發(fā)油的抑瘤作用。1.菱角揮發(fā)油對人宮頸癌細胞Hela的增殖抑制作用體外MTT實驗結果表明，菱角揮發(fā)油對Hda細胞作用24h，顯示具有較強的抑制增殖作用，由表2可知IC5o為228.39嗎'mL'1。由圖2可見當菱角揮發(fā)油濃度為12.5、25、50、100、200、300、400、500嗎'mL"時，隨著給藥濃度的增大，對腫瘤細胞的抑制作用逐漸增強，兩者呈明顯的量效關系，與對照組相比，差異顯著(P<0.05)。給藥前后細胞形態(tài)變化見圖3，圖4，在倒置顯微鏡下觀察菱角揮發(fā)油對Hela細胞的作用，發(fā)現未給藥的細胞生長旺盛，而給藥組隨著菱角揮發(fā)油濃度的增加細胞數目逐漸減少，體積變小、變形，貼壁細胞出現皺縮、脫落，細胞胞漿內顆粒增多、增粗，細胞膜邊緣變粗糙。表2菱角揮發(fā)油對Hela細胞24h生長抑制作用(3f士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*尸<0.05vs.陰性對照，**尸<0.01vs.陰性對照2.瓊脂糖凝膠電泳檢測揮發(fā)油誘導Hela細胞凋亡如圖5所示，泳道1和3沒有可見的清晰梯狀條帶，而泳道2則表現為特征性梯狀條帶(DNALadder)。說明Hela細胞經25嗎mU1的菱角揮發(fā)油作用24h后沒有明顯的誘導凋亡作用，而當濃度達5025嗎'mL"時，在核小體連接處的DNA能被揮發(fā)油隨機切斷，形成寡聚核小體，導致Hda細胞發(fā)生凋亡。3.菱角揮發(fā)油對體外培養(yǎng)肝癌細胞SMMC-7721抑制作用采用MTT法評價菱角揮發(fā)油的體外抗腫瘤活性。體外實驗MTT結果表明，超臨界提取揮發(fā)油對SMMC-7721細胞增殖也具有明顯抑制作用，四個時間點的半數抑制濃度ICs。分別為25.88pg'mL'1、10.3昭mL—1、8.46嗎mL"和5.09昭mL"。菱角超臨界提取揮發(fā)油均具有抑制SMMC-7721增殖及誘導細胞凋亡的作用。并且揮發(fā)油對SMMC-7721的抑制作用明顯。表3菱角揮發(fā)油作用24h對SMMC-7721細胞生長抑制作用(元士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>VO.05vs.陰性對照；**尸<0.01vs.陰性對照表4達i角揮發(fā)油作用48h對SMMC-7721細胞生長抑制作用(無士s)組別劑量(nL.ml/1)吸光度(？±s)抑制率(％)IC50(nLmL-1)陰性對照00.287±0,0215FU20.00(|ugmL-1)0.102±0.005*64.5揮發(fā)油6.250.203±0.022**29.310.3012.500.135±0扁**53.025.000.018土0.008"93.750,000.062±0.011**78.4跳OO0.023士0.011**92.0*尸<0.05vs.陰性對照；**P<0.01vs.陰性對照表5菱角揮發(fā)油作用72h對SMMC-7721細胞生長抑制作用(5±s)組別劑量(nLmU1)吸光度(5±s)抑制率(％)1C50(^iL'mL")陰性對照00.480±0.0315FU20.00(叫mU1)0.014±0.015*97.1揮發(fā)油6.250.345±0扁**28.28.4612.500.140±0,015**70,825.000.061±0.011**87,350.000.075±0.022**84.4100.000.020±0.006**95.8叩O.05vs.陰性對照；**尸<0.01vs.陰性對照表6菱角揮發(fā)油作用96h對SMMC-7721細胞生長抑制作用(i±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>7〈0.05vs.陰性對照；**尸<0.01vs.陰性對照本發(fā)明超臨界揮發(fā)油對SMMC-7721細胞24、48、72、96h，半數抑制率ICs。分別為25.88、10.30、8.46和5.09pLmL"，抑制作用顯著。本發(fā)明膠丸劑型的制備菱角揮發(fā)油200克，常規(guī)輔料800克，制成10000粒膠丸。權利要求1.菱角揮發(fā)油在制備抑瘤藥物中的應用。2、如權利要求1所述的菱角揮發(fā)油在制備抑人宮頸癌藥物中的應用。3、如權利要求1所述的菱角揮發(fā)油在制備抑肝癌藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及菱角揮發(fā)油在制備抑瘤藥物中的應用，屬于中藥領域。本發(fā)明菱角揮發(fā)油可通過現有文獻報導的方法獲得，優(yōu)選為用超臨界流體萃取方法獲得。菱角揮發(fā)油對腫瘤細胞的生長增殖具有較明顯的抑制作用，藥效學實驗表明對人宮頸癌和肝癌的抑制作用明顯，并且無明顯的毒性反應。文檔編號A61P15/00GK101264111SQ200810050668公開日2008年9月17日申請日期2008年4月29日優(yōu)先權日2008年4月29日發(fā)明者牛鳳蘭申請人:吉林大學