專利名稱：：一種大豆皂苷的醫(yī)藥用途及其純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種農(nóng)副產(chǎn)品的新用途及其純化方法，確切地說是一種大豆皂苷的醫(yī)藥用途及其純化方法。二
背景技術(shù)：
：目前，國內(nèi)外公知的大豆皂苷的提取分離方法大致有三類L用甲醇或者乙醇提取大豆原料，經(jīng)過一系列有機(jī)溶劑萃取后，提取物進(jìn)行硅膠柱色譜分離；2.樹脂法提取大豆原料粗皂苷；3.直接以脫脂大豆或大豆餅粕為原料用有機(jī)溶劑浸提提取大豆皂苷。但是，提取純化大豆皂苷的工藝過程中存在提取率低、產(chǎn)品純度低、成本高等問題。此外，近幾年來，越來越多的研究表明大豆皂苷具有較多有益的生理功能。l.降低血中膽固醇和甘油三酯含量Kitagawa等發(fā)大豆皂苷可抑制血清中脂類的氧化，抑制過氧化脂質(zhì)的生成，并降低血中膽固醇和甘油三酯的含量。2.抗氧化、抗自由基、降低過氧化脂質(zhì)含量Ohminami等已證實大豆皂苷具有抗脂質(zhì)氧化和降低過氧化脂質(zhì)含量的作用，且抑制過氧化脂質(zhì)對肝細(xì)胞的損傷。LP0是自由基的代謝產(chǎn)物，大豆皂苷可降低老齡大鼠LP0在肝臟及血漿中的含量，并可防護(hù)四氯化碳對肝臟的損傷作用。這些都證明大豆皂苷有淬滅自由基的作用，從而促進(jìn)DNA損傷的修復(fù)。高學(xué)敏等研究表明大豆皂苷在一定程度上促進(jìn)細(xì)胞超氧化歧化酶(superoxidedismurse，SOD)的合成，從而使細(xì)胞增加抗自由基能力，延緩衰老過程。3.抑制腫瘤細(xì)胞生長郁利平發(fā)現(xiàn)大豆皂苷對S180細(xì)胞和YAC-1細(xì)胞的DNA合成有明顯抑制作用，并且對K562細(xì)胞和YAC-1細(xì)胞亦有明顯的細(xì)胞毒作用。國外也有學(xué)者報道大豆皂苷的抑瘤作用，認(rèn)為大豆皂苷的抑癌機(jī)制可能為直接的細(xì)胞毒作用、免疫調(diào)節(jié)作用、膽汁酸結(jié)合作用和促使致癌物引起的細(xì)胞擴(kuò)增轉(zhuǎn)為正常。4.抗病毒、抗血栓大豆皂苷的抗病毒作用是最近幾年來關(guān)于大豆皂苷研究的一個新領(lǐng)域。Nakajima報道大豆皂苷對人類艾滋病(AIDS)病毒的感染和細(xì)胞生物學(xué)活性都具有一定的抑制作用，并且認(rèn)為大豆皂苷無論對AIDS的治療還是預(yù)防都是非常有用的。國內(nèi)學(xué)者的研究表明大豆皂苷對單純皰疹病毒I型(HSV-I)，柯薩奇B3(CoxB3)病毒的復(fù)制有明顯的抑制作用，同時大豆皂苷還表現(xiàn)出對病毒感染細(xì)胞具有很強的保護(hù)作用。Kubo以Wistar大鼠為對象進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，大豆皂苷可抑制血小板和血纖維蛋白原的減少，可抑制內(nèi)毒素引起的纖維蛋白的聚集，也可抑制凝血酶引起的血栓纖維蛋白形成，表明大豆皂苷具有抗血栓作用。王銀萍等研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)胃給糖尿病大鼠灌注大豆皂苷，可降低大鼠的血糖、血小板凝聚率及血栓素A2(TXA2)、前列腺素I2(PGI2)值，提高胰島素水平。5.免疫調(diào)節(jié)作用大豆皂苷的抑瘤機(jī)制之一可能與其免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。此外還有大豆皂苷防止動脈粥樣硬化，抗石棉塵毒性等的報道。己經(jīng)證實大豆皂苷具有降血脂、抗氧化、抑制腫瘤、抗血栓、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、減肥、調(diào)節(jié)糖代謝等多種生物活性。大豆中皂苷理論含量0.5%，豆渣中皂苷理論含量1%。田晶等以脫脂大豆為原料利用AB-8樹脂法進(jìn)行提取，結(jié)果表明最佳條件下皂苷提取量為0.45%，提取率為90%(洗脫液中皂苷含量采用205nm波長下紫外光譜法測定)。徐龍權(quán)等以脫脂大豆為原料，用乙醇浸提、正丁醇萃取、丙酮沉淀法提取大豆中皂苷的提取量為0.47%，提取率為94%(洗脫液中皂苷含量采用205nm波長下紫外光譜法測定)。胡學(xué)煙等研究表明正丁醇萃取法所得大豆皂苷含量只有30%左右；李華等研究表明索氏提取法所得豆渣大豆皂苷提取率為36.2%;有機(jī)溶劑回流提取率94%，微波方法提取率59.4%，超聲方法提取率60.7%;田晶等將大豆皂苷的醇提液經(jīng)正丁醇萃取，減壓濃縮得濃縮液加入甲醇溶解后，再加入10倍體積的丙酮，攪拌，靜置沉淀，抽濾后得沉淀，干燥得80%含量的大豆皂苷。酸堿水解-乙酸乙酯萃取法所得產(chǎn)品純度較高，一般在90%以上,但收率低，產(chǎn)品外觀差，分離過程耗用大量的酸堿,不適合工業(yè)化生產(chǎn)。鉛鹽沉淀法所得大豆皂苷產(chǎn)品純度可達(dá)95%以上，但產(chǎn)率極低,且鉛離子有毒，因此限制了其應(yīng)用。朱翠萍等比較了ZTOl、AB-8、XAB-8、X-5、D312等5種大孔吸附樹脂對大豆皂苷的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)選擇ZTC-1樹脂純化大豆皂苷粗提液得到大豆皂苷產(chǎn)品純度為78.2%,回收率為93.1%。李曉霞等，考察HPD-IOO、HPD-300、HPD-600、AB-8、H103等5種樹脂的吸附性能，選用H103樹脂從大豆皂苷的醇提液中吸附異黃酮和皂苷，同時在柱后串聯(lián)對皂苷有良好吸附性能的HPD-600樹脂回收流失的皂苷,經(jīng)樹脂純化所得的皂苷純度為53.4%。許浮萍等發(fā)明采用食用級醇溶液，例如乙醇溶液萃取大豆脫脂豆粕,得到的提取液經(jīng)濃縮后進(jìn)行醇沉，醇沉處理得到的上層液經(jīng)蒸發(fā)除去溶劑后加水離心分離，得到上清液和沉淀物，所述的沉淀物經(jīng)處理后得到高純度大豆異黃酮；離心所得的上清液用中極性或極性大孔樹脂進(jìn)行吸附分離，得到75%以上含量大豆皂苷。Satoshi等利用大孔吸附樹脂處理皂苷提取液，通過醇梯度洗脫制得60%含量的大豆皂苷。王哲等用微濾膜和超濾膜分離系統(tǒng)將均質(zhì)后的提取液分離，得到含有大豆皂苷的透過液；透過液用吸附樹脂進(jìn)行吸附分離，被樹脂吸附的物質(zhì)用60%~90%乙醇梯度解吸，然后將解吸液蒸發(fā)處理，所得大豆皂苷含量在50%以上。Shuichi等將料液先通過弱堿性陰離子交換樹脂(如MP-64樹脂)吸附后,分別通過水洗、70%乙醇洗去除水溶性糖、大豆異黃酮等雜質(zhì)。然后用醇溶液將皂苷洗脫后，再通過非極性大孔吸附樹脂(如HP-20樹脂)純化皂苷，所得產(chǎn)品純度高達(dá)91.4%。備注大豆皂苷制備的原料和方法以及所采用的標(biāo)準(zhǔn)品和大豆皂苷含量的測定方法不同，所以在比較時應(yīng)加以注意。以上所述方法基本上可以得到較高純度的大豆皂苷，但是其產(chǎn)率低、成本高、工藝復(fù)雜。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在開發(fā)大豆皂苷的醫(yī)藥用途以及針對現(xiàn)有大豆皂苷提取率低、產(chǎn)品純度低等缺陷，同時提供一種純化方法，所要解決的技術(shù)問題是提高大豆總皂苷的含量和通過動物模型試驗確證其醫(yī)藥用途。本發(fā)明所稱的大豆皂苷的醫(yī)藥用途是指大豆總皂苷含量>19%的大豆皂苷在制備治療鎮(zhèn)咳祛痰藥物中的應(yīng)用。作為藥物原料，其有效成分的含量高比低好。大豆皂苷作為醫(yī)藥用途，使用大豆總皂苷含量為60%~65%的大豆皂苷在制備治療鎮(zhèn)咳祛痰藥物中的應(yīng)用。本大豆皂苷純化方法，可以以現(xiàn)有方法提取的大豆總皂苷含量為30%或50%的大豆皂苷產(chǎn)品為原料進(jìn)行純化，也可以以脫除大豆蛋白后的豆渣為原料，先提取、后純化，該方法包括大豆皂苷的提取、分離、脫脂和純化，所述的提取使用60%~70%(質(zhì)量百分比，下同)乙醇浸提豆渣，分離得到浸提液，向浸提液中加入石油醚萃取脫脂，與現(xiàn)有技術(shù)的區(qū)別是脫脂后的浸提液經(jīng)前處理得到大豆總皂苷含量為19%~20%(質(zhì)量百分比，下同)的粗品，粗品經(jīng)純化得到大豆總皂苷含量為60%~65%的精品。所述的前處理是脫脂后的浸提液濃縮脫去部分乙醇后加入等體積飽和正丁醇水溶液，攪拌均勻后濃縮脫溶至褐色粘稠膏狀，冷卻后加入70%~90°/。的甲醇攪拌溶解，再加入乙酸乙酯至沉淀完全，分離沉淀并干燥并得到大豆總皂苷含量19%~20%的大豆皂苷粗品。所述的純化是將粗品溶解于去離子水中用經(jīng)預(yù)處理的D101大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附純化，第一次上柱預(yù)吸附后其流出液再上柱重吸附至少一次，最后用60%~70%的乙醇洗脫，收集洗脫液，經(jīng)真空脫溶干燥后得到大豆總皂苷含量60%~65%的皂苷精品。所述的D101大孔吸附樹脂的預(yù)處理包括溶脹和淋洗。先用95%乙醇浸泡使其充分溶脹，再用95%乙醇淋洗至淋洗液加3倍水不出現(xiàn)白色沉淀為止，用去離子水洗至無醇味，然后依次用3~5倍體積的5%HC1和5%NaOH淋洗，酸堿淋洗后分別用去離子水洗去酸、堿，最后流出的水的pH值7.07.5。本方法制備的大豆皂苷經(jīng)小鼠氨水引咳法和氣管酚紅排泌法動物實驗，以氫溴酸右美沙芬口服液為對照，結(jié)果表明具有止咳、祛痰作用，也就是說本方法制備的大豆皂苷的用途就是在制備治療止咳祛痰藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明原料來源豐富，工藝簡便，既可制備大豆皂苷的粗品，又可制備大豆皂苷的精品，而且收率高。經(jīng)動物模型實驗表明，所制備的大豆皂苷具有明顯的祛痰止咳作用，不僅可望直接用于制備止咳祛痰的藥物，而且可以為研制新的療效更好的治療各種常見多發(fā)咳嗽、祛痰藥物提供作為先導(dǎo)化合物而深度開發(fā)。具體實施例方式(一)大豆皂苷的制備1、以去除蛋白的干豆渣為原料、用65%乙醇室溫浸提10~11小時，料液為1:4~5，分離得到浸提液，向浸提液中加入1/3體積的石油醚萃取脫脂，分離除去石油醚層。2、大豆皂苷粗品的制備真空濃縮脫脂后的浸提液，除去部分乙醇，然后加等體積的飽和正丁醇水溶液，攪拌均勻后真空濃縮脫溶，得褐色粘稠膏狀物，冷卻后加入85%甲醇溶液溶解，過濾分離除去部分沉淀物，向濾液中加入乙酸乙酯至有沉淀析出，待沉淀完全后分離、干燥沉淀物，得到淡黃色大豆皂苷粗品，經(jīng)香草醛一高氯酸比色法、齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品對照，大豆總皂苷含量19%~20%。3、大豆皂苷精品的制備(1)D101大孔吸附樹脂的預(yù)處理將D101大孔吸附樹脂置于95y。乙醇中浸泡24小時，使其充分溶脹，分離后用95%乙醇淋洗至淋洗液加3倍水不出現(xiàn)白色沉淀為止；用去離子水淋洗至無醇味；然后用3~5倍體積的5%HC1溶液、以0.3~0.5ral/min速度淋洗，酸液淋洗后用去離子水淋洗至淋出液pH57;最后用3~5倍體積的5%NaOH溶液淋洗，速度同上，堿液淋洗后用去離子水淋洗至淋出液pH7.0~7.5，將樹脂置于去離子水中備用。(2)大豆皂苷粗品純化將大豆皂苷粗品溶于去離子水中，上柱D101樹脂吸附，控制流速0.6ml/min，流出液再返回樹脂重吸附至少一次，最后用65%乙醇溶液洗脫，洗脫速度0.4ml/min，收集洗脫液，真空脫溶干燥，得到白色大豆皂苷精品，用香草醛一高氯酸比色法、齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品對照定量檢測，大豆總皂苷含量60~65%。(二)大豆皂苷鎮(zhèn)咳祛痰動物模型實驗用上述粗品和精品大豆皂苷進(jìn)行小鼠氨水引咳法及氣管酚紅排泌法動物實驗。1實驗原料與試劑準(zhǔn)備1.10.9%的生理鹽水的配制精確稱取9.0gNaCl，置于1000ml容量瓶中，用去離子水溶解并定容至刻度；1.25%粗制大豆皂苷(cSS)生理鹽水溶液的配制精確稱取50.Omg粗制大豆皂苷，置于10ml容量瓶中，用0.9%生理鹽水溶解并定容至刻度;1.310%粗制大豆皂苷(cSS)生理鹽水溶液的配制精確稱取100.Omg粗制大豆皂苷，置于lOml容量瓶中，用0.9%生理鹽水溶解并定容至刻度；1.45%精制大豆皂苷(rSS)生理鹽水溶液的配制精確稱取50.Omg精制大豆皂苷，置于10ml容量瓶中，用0.9%生理鹽水溶解并定容至刻度；1.510%精制大豆皂苷(rSS)生理鹽水溶液的配制精確稱取lOO.Omg粗制大豆皂苷，置于10ml容量瓶中，用0.9%生理鹽水溶解并定容至刻度；1.6粗制大豆皂苷和氫溴酸右美沙芬口服液混合溶液的配制精確量取6ral的10%粗制大豆皂苷生理鹽水溶液和4ml氫溴酸右美沙芬口服液置于10ml容量瓶中混勻；1.7精制大豆皂苷和氫溴酸右美沙芬口服液混合溶液的配制精確量取5ml的10%精制大豆皂苷生理鹽水溶液和5ml氫溴酸右美沙芬口服液置于10ml容量瓶中混勻；1.80.5%苯酚紅注射液的配制將0.5克酚紅置研缽中，緩漫滴加15ml0.IN(0.4%)NaOH溶液邊加邊磨，并不斷吸出已溶解的酚紅液，直至全部溶解，然后加入85ml雙蒸水，顏色為深紅，經(jīng)濾紙過濾后使用，室溫保存；1.95%氫氧化鈉溶液的配制精確稱取5.26g氫氧化鈉置于100ml容量瓶中，用去離子水溶解并定容至刻度；1.104%碳酸氫鈉溶液的配制精確稱取4.17g碳酸氫鈉置于100ml容量瓶中，用去離子水溶解并定容至刻度；2實驗方法與步驟2.1實驗動物分組將小鼠隨機(jī)分成1、生理鹽水(NS)組；2、氫溴酸右美沙芬(DextromethorphanHydrobromide，DH)口服液陽性對照藥物組；3、5%粗制大豆皂苷(cSS)生理鹽水溶液組；4、10%粗制大豆皂苷生理鹽水溶液組；5、5%精制大豆皂苷(rSS)組生理鹽水溶液組；6、10%精制大豆皂苷組生理鹽水溶液組；7、粗制大豆皂苷生理鹽水溶液和氫溴酸右美沙芬口服液合用組；8、精制大豆皂苷生理鹽水溶液和氫溴酸右美沙芬口服液合用組。共8組，每組8只小鼠，標(biāo)記，觀察正?；顒蛹昂粑闆r。2.2實驗設(shè)計(1)生理鹽水組每天灌胃給藥2次，每次0.4ml/只，連續(xù)3d;(2)氫溴酸右美沙芬口服液組每天灌胃給藥2次，每次0.4ml/只，連續(xù)3d;(3)5%粗制大豆皂苷生理鹽水溶液組每天灌胃給藥2次，給藥0.6ml/只，連續(xù)3d;(4)10%粗制大豆皂苷生理鹽水溶液組每天灌胃給藥2次，給藥0.6ml/只，連續(xù)3d;(5)5%精制大豆皂苷組生理鹽水溶液組每天灌胃給藥2次，給藥0.4ml/只，連續(xù)3d;(6)10%精制大豆皂苷組生理鹽水溶液組每天灌胃給藥2次，給藥0.4ml/只，連續(xù)3d;(7)粗制大豆皂苷生理鹽水溶液和氫溴酸右美沙芬口服液合用組每天灌胃給藥2次，每次O.5ml/只，連續(xù)3d;(8)精制大豆皂苷生理鹽水溶液和氫溴酸右美沙芬口服液合用組每天灌胃給藥2次，每次0.4ml/只，連續(xù)3d;2.3末次給藥后40min，將30ml氨水放入50ml錐形瓶中，將氨氣通過導(dǎo)管連到大漏斗，并倒蓋，制造氨氣環(huán)境。然后將小鼠置于氨氣環(huán)境中15s后(30ml/次，一熏一換氨水，每次熏1只小鼠)，立即記錄放入時間，觀察并記錄咳嗽潛伏期及3min內(nèi)咳嗽次數(shù)；2.4觀察結(jié)束后立即腹腔注射0.5%酚紅注射液0.5ml/只，30min后拉頸臼死小白鼠，手術(shù)取出自甲狀軟骨下端至氣管分支處的一段氣管。將所取氣管用4%碳酸氫鈉溶液沖洗3次，合并沖洗液于試管中，加5%氫氧化鈉溶液1滴使成堿性，加4%碳酸氫鈉溶液至5ml，在可見分光光度計546ran波長處測定其吸光度。3實驗結(jié)果與分析3.1實驗結(jié)果3.2各組實驗動物的咳嗽潛伏期表l8組動物的咳嗽潛伏期TablThecoughi對照ubationperiodforthe8groupsofanimals組別實驗動物咳嗽潛伏期/s下；e<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><replacetable>complexreplacetableseeoriginaldocumentpage9</replacetable>注、DH-氫溴酸右美沙芬組，cSS-粗制大豆皂苷組,rSS-精制大豆皂苷組，與生理鹽水組比較，bP<0.053.3各組實驗動物3min咳嗽次數(shù)表28組動物3rain中內(nèi)的咳嗽次數(shù)Tab2Thecoughfreque對照ywithin3minsforthe8groupsofanimals<replacetable>complexreplacetableseeoriginaldocumentpage9</replacetable>注、DH-氫溴酸右美沙芬組，cSS-粗制大豆皂苷組,rSS-精制大豆皂苷組，與生理鹽水組比較，"P<0.013.4各組動物所取氣管的沖洗液在546nm波長處吸光值表38組動物所取氣管的沖洗液的吸光值Tab3Theabsorbe對照yoftracheafluidforthe8groupsofanimals組別實驗動物所取氣管的沖洗液在546nm波長處的吸光值下^e<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注a:DH-氫溴酸右美沙芬組，cSS-粗制大豆皂苷組,rSS-精制大豆皂苷組，與生理鹽水組比較，°:P<0.01。根據(jù)光吸收基本原理，如果保持入射光的波長與溶液厚度不變，光吸收度與溶液的濃度成正比關(guān)系。故吸收度越大，則證明溶液中酚紅的濃度越大，因此可以作為衡量祛痰作用的一個常用指標(biāo)。大豆皂苷制備粗提和純化物經(jīng)動物實驗，以氫溴酸右美沙芬口服液對照，結(jié)果充分顯示大豆皂苷具有劑量依賴性的鎮(zhèn)咳祛痰作用。本制備品可以推廣為工業(yè)化生產(chǎn)用于止咳和祛痰的藥用原料。(三)藥物制劑的制備以大豆總皂苷含量60%~65%的得大豆皂苷為主藥，非限定實施例敘述如下1、普通片劑以玉米淀粉為稀釋吸收劑，添加少量糊精或糖粉以增加其粘性，以淀粉漿為潤濕粘合劑，以硬脂酸鎂或微粉硅膠為潤滑劑，用公知濕法制粒壓片法加工普通片劑，即先制軟材，再制濕粒，經(jīng)干燥整粒后壓片。2、膠囊劑以微晶纖維素為填充料，微粉硅膠為助流劑，與粉碎后的主藥混合均勻后裝3#空心膠囊，得到硬膠囊劑。權(quán)利要求1、一種大豆皂苷的醫(yī)藥用途，其特征在于大豆總皂苷含量為≥19wt％的大豆皂苷在制備治療鎮(zhèn)咳祛痰藥物中的應(yīng)用。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆皂苷的醫(yī)藥用途，其特征在于大豆總皂苷含量為60wt《65wtM大豆皂苷在制備治療鎮(zhèn)咳祛痰藥物中的應(yīng)用。3、由權(quán)利要求1所述的大豆皂苷的純化方法，以脫除大豆蛋白后的豆渣為原料，包括大豆皂苷的提取、分離、脫脂和純化，其特征在于所述的純化是脫脂后的浸提液經(jīng)前處理得到大豆總皂苷含量為19wtM20wty。的大豆皂苷粗品，粗品經(jīng)純化得到大豆總皂苷含量為60w線65wty。的大豆皂苷精品，具體方法如下(1)所述的前處理是脫脂后的浸提液經(jīng)濃縮后攪拌下加入等體積的飽和正丁醇溶液，濃縮脫溶至褐色粘稠膏狀，冷卻，加入70wty。90wty。甲醇溶液，攪拌溶解，分離，向濾液中加入乙酸乙酯至沉淀析出完全，分離、干燥沉淀得到大豆皂苷粗品；(2)所述的純化是大豆皂苷產(chǎn)品溶于去離子水中用經(jīng)預(yù)處理的D101大孔吸附樹脂吸附純化，第一次上柱預(yù)吸附后其流出液再上柱重吸附至少一次，然后60wty。70wty。乙醇洗脫，收集洗脫液經(jīng)脫溶干燥后得到大豆皂苷精品。全文摘要一種大豆皂苷的醫(yī)藥用途是大豆總皂苷含量≥19wt％的大豆皂苷在制備治療鎮(zhèn)咳祛痰藥物中的應(yīng)用。為提高大豆總皂苷的含量，其純化方法是將粗品溶于去離子水中用經(jīng)過預(yù)處理的D101大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附純化，第一次上柱預(yù)吸附后其流出液再上柱重吸附至少一次，最后用60％～70％的乙醇洗脫，收集洗脫液，經(jīng)真空脫溶干燥后得到大豆總皂苷含量為60％～70％的皂苷精品。本發(fā)明不僅可望直接用于制備止咳祛痰的藥物，而且為研制開發(fā)療效更好的止咳祛痰藥物提供了先導(dǎo)化合物。文檔編號A61P11/00GK101342227SQ20081002179公開日2009年1月14日申請日期2008年8月13日優(yōu)先權(quán)日2008年8月13日發(fā)明者鋒孫,偉龐,張必芳,徐曉偉,潘丙南,王俊偉,范遠(yuǎn)景,黃南山申請人:合肥工業(yè)大學(xué)