Hsa-miR-182基因的新用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種Hsa-miR-182基因的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是最為常見、死亡率最高、對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。據(jù) 報道，近50年來很多國家的肺癌發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率 均占所有惡性腫瘤的第一位，女性發(fā)病率占第二位，死亡率第一。肺癌可以分為小細胞肺 癌（small cell lung cancer, SCLC)和非小細胞肺癌（non small cell lung cancer, NSCLC)。據(jù)統(tǒng)計，約80%的肺癌為NSCLC，它是最為常見的肺癌，主要包括腺癌、鱗狀細胞癌、 大細胞未分化癌三大類。
[0003] 治療NSCLC需要根據(jù)肺癌的臨床分析進行。在腫瘤發(fā)生的I、II、IIIA期，主要以 手術(shù)切除為主，對于淋巴轉(zhuǎn)移嚴重的IV期腫瘤，通常于手術(shù)前輔以化療或放療。經(jīng)研宄發(fā) 現(xiàn)，術(shù)后I期化療者的生存周期與術(shù)后未化療者的生存周期一致，這意味著術(shù)后I期化療并 不發(fā)揮作用；對于II期和IIIA期患者，術(shù)后化療對患者有所傷害，會明顯縮短病人的生存 期。手術(shù)后，I期患者的5年生存率約70%、II期患者的5年生存率約50%，III期手術(shù)或化 放療聯(lián)合治療者的5年生存率為15-30%。而對于IIIB期（已侵犯鄰近重要臟器）和IV期 (已有遠端轉(zhuǎn)移）的患者將無法進行手術(shù)治療，通常實行化學藥物、放射線治療或者中醫(yī)中 藥治療，患者的5年生存率僅為7%。
[0004] 對于NSCLC患者的及時治療能夠大大提高病人的生存率，改善病人的健康狀況。 有效的早期診斷方法能夠進行疾病管理，為高風險疾病患者盡早提供有效的治療。肺癌的 早期診斷可以通過胸部X射線來了解肺內(nèi)的異常情況。此外，進行血液常規(guī)檢查以及痰液 病理細胞檢測能夠幫助肺癌的診斷。一系列深入的檢查，包括支氣管鏡、縱隔鏡、肺組織活 檢和胸腔鏡等技術(shù)也用于肺癌的檢查診斷中。然而，NSCLC具有生長分裂緩慢、轉(zhuǎn)移能力強 的特點，這為NSCLC的早期診斷帶來了一定難度。在現(xiàn)有生理學診斷方法的基礎(chǔ)上，我們需 要尋找其它輔助診斷方法，而生物分子標記是一個值得探索的領(lǐng)域。
[0005] 微小 RNA (microRNA，miRNA)是一類長度約 20 個核苷酸（nucleotide, nt)的內(nèi) 源性非編碼RNA分子，它通過特異靶向信使RNAUessenge RNA，mRNA)，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào) 控基因表達。miRNA在很多生物進程中發(fā)揮作用，例如控制發(fā)育，胚胎生成、細胞分化增殖及 凋亡，目前對多數(shù)miRNA的靶基因及功能研宄始終是RNA調(diào)控的研宄熱點。研宄表明，很多 miRNA在不同腫瘤中異常表達，在腫瘤的發(fā)病機制中扮演著重要的角色。miRNA及其靶基因 的功能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中非常重要，一些miRNA甚至有望成為腫瘤治療的基因靶點。而 miRNA的表達譜可能成為腫瘤診斷、預后、個性化治療和疾病分類的潛在生物標記。肺癌中 的miRNA表達一直是研宄的熱點之一。
[0006] 越來越多的研宄證明，miRNA不僅在腫瘤組織中表達異常，它還存在于患者的唾 液、血漿、血清和福爾馬林固定組織之中。因此，循環(huán)miRNA的研宄逐漸成為一個新型熱點。 隨著人體生理代謝活動的進行，人類血清中也檢測出循環(huán)miRNA的存在。由于血清易于獲 得，檢測較為方便，且對病人的傷害較小，血清中miRNA診斷標記的研宄將會對肺癌病人的 診斷、預后、治療等提供更為便捷的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種Hsa-miR-182基因的異常表達在檢測血清中非 小細胞肺癌的應用。
[0008] 本發(fā)明的目的之二在于提供一種Hsa-miR-182在制備篩選和診斷血清中非小細 胞肺癌的試劑盒中的應用。
[0009] miRNA的異常表達在腫瘤生理過程中扮演著重要的角色，大量miRNA被證實在 腫瘤病人的組織及血清中異常表達，從組織或血清中獲得的miRNA能夠作為肺癌(尤其是 NSCLC)的潛在診斷標記。本申請通過solexa測序發(fā)現(xiàn)，小鼠誘導腫瘤組織中大量miRNA存 在不同的表達差異，部分miRNA在腫瘤組織中表達上調(diào)，這在人類肺癌組織中也得到了驗 證，這表明miRNA的表達水平高低可以作為腫瘤組織的診斷標記。
[0010] 同時，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，人類血清中有穩(wěn)定存在的miRNA。血清miRNA的異常表達與 腫瘤的發(fā)生程度具有一定聯(lián)系，因此，一些miRNA可以用作NSCLC病人的血清診斷標志物。
[0011] 因此，本發(fā)明之一涉及Hsa-miR-182,該miRNA在小鼠誘導NSCLC組織、人類NSCLC 組織、NSCLC病人血清樣本及部分常見肺癌細胞系中表達量發(fā)生顯著提高，且與腫瘤的分型 和分期具有密切關(guān)系，因此可以作為NSCLC的診斷標志。
[0012] 在一個優(yōu)選實例中，發(fā)現(xiàn)Hsa-miR-182在人類NSCLC組織中表達異常。在另一個 優(yōu)選實例中，發(fā)現(xiàn)Hsa-miR-182在NSCLC病人血清中表達量升高，而且其表達量變化與腫瘤 分期具有一定關(guān)系。
[0013] 本發(fā)明另一涉及一種循環(huán)miRNA的抽提方法，該方法能夠提高血清中miRNA的抽 提效率及抽提純度。
[0014] 在一優(yōu)選實例中，該方法能夠獲得足夠RNA樣本，可用于qRT-PCR檢測及其它實 驗。
[0015] 本發(fā)明再一涉及一種NSCLC病人血清中miRNA表達豐度的檢測方法。
[0016] 本發(fā)明還涉及Hsa-miR-182在篩選治療和診斷試劑盒中的用途。
[0017] 本發(fā)明的實施步驟如下所述： 第一步分別從小鼠正常肺組織和誘導NSCLC組織中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建二者的cDNA 文庫，進行solexa測序，獲得二者的miRNA測序結(jié)果。
[0018] 第二步，分析測序結(jié)果，選擇表達差異顯著的miRNA，作為候選的檢測標記物。
[0019] 第三步，通過多種渠道收集不同病理分期NSCLC肺癌病人血清樣品，提取血清中 miRNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得每個病人的血清miRNA文庫。
[0020] 第四步，利用實時熒光定量PCR (qRT-PCR)方法，檢測候選miRNA在不同血清樣本 中的表達水平。
【附圖說明】
[0021] 圖1為Solexa測序結(jié)果。表中所列的是小鼠誘導NSCLC模型中表達差異的部分 miRNAo
[0022] 圖2誘導小鼠 NSCLC模型中Mmu-miR-182的表達差異。L822T1是基因型KRAS +/+ 的良性腫瘤，L703T2是基因型LKBryVKRASv+的惡性腫瘤，L903T1為P53 +/KRAS+/+的惡性 腫瘤。
[0023] 圖3人常見NSCLC細胞系中Hsa-miR-182的表達差異。其中Beas_2B為人類非腫 瘤性肺上皮細胞系，U6為內(nèi)參，使用法計算相對表達量，圖示為3個重復實驗結(jié)果。
[0024] 圖4人類NSCLC組織中Hsa-miR-182的表達差異。其中每例樣品以癌旁為參照， 以U6為內(nèi)參，使用法計算相對表達量。
[0025] 圖5 NSCLC病人血清中Hsa-miR-182的表達情況。Α.正常血清樣品（8例）與腫 瘤病人血清（32例）中Hsa-miR-182的表達差異。B.不同分期腫瘤病人血清及正常血清中 Hsa-miR-182的表達差異變化。
[0026] 圖中 * /7C 0· 05, ** /7C 0· 01，*** /7C 0· 001。
【具體實施方式】
[0027] 下面將結(jié)合具體實例進一步闡述本發(fā)明。這些實例僅用于闡述本發(fā)明，而不用于 限制本發(fā)明的范圍。下列實例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，分子 克?。∕olecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)中的所述條件，或按照制造 廠商所建議的條件。
[0028] 實施例一：根據(jù)solexa測序結(jié)果，選擇在NSCLC組織中表達變化明顯的miRNA。
[0029] 本發(fā)明所用到的KRAS基因突變小鼠 NSCLC模型（L822T1、L703T2、L903T1)和正 常肺癌模型（L1805)由中科院生化細胞所季紅斌教授課題組提供。其中L822T1是基因型 KRAS+/+的良性腫瘤，L703T2 是基因型 LKB1+/KRAS+/+的惡性腫瘤，L903T1 為 P53 +/KRAS+/+ 的惡性腫瘤。
[0030] 對正常小鼠的肺組織和誘導癌變的小鼠肺組織分別取樣，使用Trizol法提取組 織內(nèi)總RNA。具體步驟為：以Trizol裂解組織，室溫放置5分鐘，使組織充分裂解，獲得裂 解液；加入氯仿，漩渦震蕩15秒，以12000g/4°C離心10分鐘；離心之后吸取上層水相并加 入等量異丙醇顛倒混勻，室溫放置20分鐘；再次以12000g/4°C離心10分鐘，棄去上清；加 入75%乙醇洗滌沉淀，2000g/4°C離心3分鐘；棄去上清液，室溫干燥沉淀5-10分鐘。晾干 后以DEPC水溶解沉淀即獲得總RNA。
[0031] 其次，對于上述方法獲得的總RNA產(chǎn)物，本發(fā)明使用Takara公司的One St印 PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit (Code No. D350A)進行逆轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建上述組織的 cDNA文庫，以oligo dT為引物進行逆轉(zhuǎn)錄，通過變性反應和逆轉(zhuǎn)錄2步獲得后續(xù)實驗所需 的 miRNA cDNA 文庫。
[0032] 對樣品進行Solexa法測序（Solexa測序由華大基因公司完成)。分析測序數(shù)據(jù)， 結(jié)合相關(guān)研宄報導，發(fā)現(xiàn)部分miRNA在誘導的腫瘤組織中的表達變化明顯，可見其與肺癌 的發(fā)病機制具有一定關(guān)聯(lián)性，其中部分miRNA可能作為潛在的診斷標記(參見圖1)。
[0033] 根據(jù)測序結(jié)果可見，Mmu-miR-182在擁有不同基因背景的小鼠腫瘤的表達量均有 所提高。根據(jù)測序結(jié)果可見，Mmu-miR-182在小鼠肺腫瘤模型的表達量較高，表達變化顯著。 其中，在無 KRAS突變的L822T1模型中，miR-182的表達量提升了約2倍，而在KRAS突變的 L703T2和L930T1模型中，miR-182的水平則提升了 4倍左右。這意味著miR-182的表達量 不僅與肺癌的發(fā)生相關(guān)，還可能與腫瘤的惡性程度具有一定聯(lián)系。
[0034] 實施例二：檢測常見肺癌細胞系中miRNA的表達差異 本發(fā)明涉及的肺癌細胞系包括：A549、95-D、HCC827、H23、H1299、Spca-I等，其中， A549、HCC827和H23為人非小細胞肺癌細胞，Spca-I為人肺腺癌細胞，H1299為非小細胞肺 癌上皮樣細胞，95-D為人高轉(zhuǎn)移性肺癌細胞。本實例以正常肺上皮細胞Beas-2B為參照，同 時培養(yǎng)上述6種肺癌細胞系。細胞培養(yǎng)按照ATCC標準流程進行，分別培養(yǎng)于含10%胎牛血 清的對應培養(yǎng)基中。細胞培養(yǎng)箱保持濕潤，維持5% CO2的培養(yǎng)狀態(tài)，以37 °C培養(yǎng)細胞。
[0035] 當細胞在6cm培養(yǎng)皿中達到約80%密度時，使用實施例一中的Trizol法抽提細胞 RNA，并以 Takara 公司的 One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit (Code No. D350A)逆轉(zhuǎn)錄獲得上述細胞系的miRNA cDNA模板。本試劑盒可對樣品中的miRNA及其它 微小非編碼RNA進行Poly (A)加尾反應，從而引入Uni-miR qPCR Primer結(jié)合位點，可對樣 品中的任意miRNA進行定量PCR反應。具體操作過程如下： 1. 配置如下體系：
【主權(quán)項】
1. 一種Hsa-miR-182的異常表達在作為非小細胞肺癌病人肺癌組織miRNA標記的應 用。
2. -種Hsa-miR-182在制備篩選和診斷血清中非小細胞肺癌的試劑盒中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種Hsa-miR-182基因的新用途。miRNA的表達水平變化與肺癌分期有著一定的關(guān)聯(lián)性。miR-182在NSCLC早期患者的血清中的表達量較其它分期具有顯著提升，從而可能成為NSCLC血清檢測的潛在標記。其中所公開的為Hsa-miR-182-5p作為肺癌病人血清循環(huán)miRNA標記的首次報導，該發(fā)明在臨床上為肺癌檢測提供了一定的應用價值。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104862395
【申請?zhí)枴緾N201510238477
【發(fā)明人】金由辛, 袁天蔚, 王德韜, 王強, 夏雨晴, 馬中良, 韋嘉勵
【申請人】上海大學
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年5月12日