專利名稱：減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒、其制備以及含有它們的疫苗。更具 體而言，本發(fā)明涉及被減毒并通過將確定的突變引入其基因組來進(jìn)行遺傳
穩(wěn)定的脊髓灰質(zhì)炎病毒。作為滅活的脊髓灰質(zhì)炎疫苗種(poliovaccine seed)，這些脊髓灰質(zhì)炎病毒特別有用。
背景技術(shù)：
Sabin在二十世紀(jì)五十年代開發(fā)的活的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗已 在世界范圍內(nèi)得到廣泛使用。來源于三種脊髓灰質(zhì)炎病毒血清型(被稱為 Sabin 1、 2和3型)中的每一種的疫苗林的制備是通過在細(xì)胞培養(yǎng)物和完 整動物體中對野生型病毒進(jìn)行傳代，直至獲得減毒毒祙來實(shí)現(xiàn)。與原始的
野生型毒林相比，這些減毒病毒在人類中《1起脊髓灰質(zhì)炎的能力基本較 弱。它們通過口服給予，并在腸道復(fù)制，從而引起保護(hù)性免疫應(yīng)答。
盡管所述活的口服用脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗通常被認(rèn)為是安全的，但是 其使用會使疫苗接種者偶發(fā)麻痹。這最經(jīng)常與血清型2型和3型相關(guān)，而 極少與l型相關(guān)(如果發(fā)生)。因此，已在努力開發(fā)改進(jìn)的2型和3型疫 苗，在安全性方面，它們至少將與出色的l型疫苗林相當(dāng)。
Sabin疫苗株基本上是通過經(jīng)驗(yàn)方法來開發(fā)的。其減毒的遺傳基礎(chǔ)沒 有得到完全地了解。但是，在過去數(shù)年里，科學(xué)家們已經(jīng)采用了多種分子 生物學(xué)技術(shù)，試圖闡明這些疫苗抹的神經(jīng)毒力得到降低的機(jī)理。大部分研 究都聚焦于血清型1型和3型。對于這兩種血清型，已經(jīng)將所述疫苗林的 完整核苷酸序列與其具有神經(jīng)毒性的前身林(progenitor)的完整核苷酸 序列進(jìn)行了比較。
就1型脊髓灰質(zhì)炎病毒而言，所述疫苗株與其前身株的差異在于7441 個堿基的基因組中的47個位置(Nomoto " "/.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5793-5797,1982)。它們?nèi)际呛唵蔚狞c(diǎn)突變，并且其中有21個引起病 毒編碼蛋白中的氨基酸改變。盡管有幾個突變被認(rèn)為對所述疫苗林的減毒 表型作出了貢獻(xiàn)，但是直接證據(jù)已經(jīng)表明，所述基因組的5'非編碼區(qū)中第480位的A-G突變對該病毒有著顯著的減毒作用(Nomoto W fl/.， UCLA Symp. Mol. Cell. Biol" New Series, 54 (M.A. Brinton和R.R. Rueckert編 著):437-452， New York: Alan R. Liss Inc., 1987))。
對3型脊髓灰質(zhì)炎病毒進(jìn)行的類似研究揭示，在所述疫苗及其前身林 之間的7432個4^的基因組中僅有10個核苷酸序列差異(Stanway W fl/.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1539-1543,1984)。它們中僅有三個在病毒編 碼蛋白中引起氨基酸置換。依據(jù)Stanway等人(1984)的編號系統(tǒng)，本 申請對3型脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的5，非編碼區(qū)中堿基的位置進(jìn)行了編 號。
3型Sabin疫苗林及其前身林之間的確定的重組體的構(gòu)建已經(jīng)使得可 以識別對于減毒表型有貢獻(xiàn)的突變。這些突變中有一種是在第2034位的 突變，這使得病毒蛋白VP3中的一個絲氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?br> 另一種關(guān)注的突變是在所述基因組的5，非編碼區(qū)第472位的C(前身 林)突變?yōu)閁(疫苗林)。已觀察到這種472 U的突變會在該病毒在人腸道 中開始復(fù)制后迅速地回復(fù)為所述前身林(野生型)472C (Evans /.， Nature 314:548-550， 1985)。這種回復(fù)與神經(jīng)毒力的增加相關(guān)。還已經(jīng)證 明第472位的C對于小鼠/人脊髓灰質(zhì)炎重組病毒在小鼠腦中的生長是必 需的(La Monica "/.， J. Virol. 57:515-525， 1986)。最近又已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)2 型脊髓灰質(zhì)炎病毒在疫苗接種者的腸道中開始復(fù)制后，其第481位的A 會突變?yōu)镚 (Macadam fl/" Virology 181:451-458， 1991)。
最近提出了 一種3型脊髓灰質(zhì)炎病毒Leon抹的基因組5，非編碼區(qū)的 二級結(jié)構(gòu)模型(Skinner C "/ ，丄Mol. Biol. 207: 379-392， 1989)。對于結(jié)構(gòu) 域V (核苷酸471-538)而言，第471-473位和第477-483位的威基分別與 第538-536位和第534-528位的堿基按如下方式配對
471 477 483
...UCC …CCAUGGA ... ...AGG …GGUGCCU ... 538 534 528
為了方便起見，將所述配對區(qū)域稱作莖(a)區(qū)(471-473/538-536)和莖(b) 區(qū)(477-483/534-528)。以前，我們發(fā)現(xiàn)堿基對472-537發(fā)生回轉(zhuǎn)(即第472 位為G，第537位為C)的3型脊髓灰質(zhì)炎病毒是減毒的。此外，這種減毒的病毒與其相應(yīng)的僅第472位C突變?yōu)镚而第537位仍為野生型G的 脊髓灰質(zhì)炎病毒相比，LDsn值略低。在EP-A-0383433中公開了結(jié)構(gòu)域V 的莖(a)區(qū)或莖(b)區(qū)的一個堿基對發(fā)生回轉(zhuǎn)的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒。然而， 后續(xù)的實(shí)驗(yàn)表明，472537位的堿基對發(fā)生回轉(zhuǎn)的3型脊髓灰質(zhì)炎病毒并 未像3型Sabin疫苗林那樣具有減弱的毒性。
在以前，我們還已經(jīng)報(bào)道了生產(chǎn)這樣的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒，即與 Sabin疫苗林相比，這些減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒減毒程度基本相同或更高 (從而使得它們可被安全地使用)，并且在遺傳上更加穩(wěn)定。這些減毒脊 髓灰質(zhì)炎病毒在脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的5，非編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)域V的莖(a) 區(qū)或莖(b)區(qū)中并不含有U-G堿基對或其他的堿基對錯配。(不符合 Watson-Crick堿基配對規(guī)則的威基配對被認(rèn)為是錯配)。更具體而言，我 們制備了含有下列U-A堿基對的3型脊髄灰質(zhì)炎病毒
(a) S15:第472位與第537位為U-A,第480位與第531位為U-A, 并且第481位與第530位也為U-A;或
(b) S16:第4"位與第537位為U-A,第480位與第531位為U-A, 并且第482位與第529位為A-U。
在能夠快速篩選Sabin3的具有神經(jīng)毒力的變體的條件下，上述脊髓 灰質(zhì)炎病毒林的減毒表型是穩(wěn)定的(W098/41619)。
由于全球根除脊髓灰質(zhì)炎計(jì)劃的成功，使用疫苗毒株進(jìn)行接種的比例 急劇增加，并且這一比例仍將持續(xù)增加，直至人們不再使用活病毒疫苗接 種時(shí)為止。部分地鑒于上述情況，許多發(fā)達(dá)國家已經(jīng)轉(zhuǎn)而使用滅活的脊髓 灰質(zhì)炎疫苗(IPV),這種疫苗目前是由野生型毒林來產(chǎn)生。當(dāng)野生型脊髓 灰質(zhì)炎被根除時(shí)，野生型毒林將會需要高水平的生物遏制，這可能難以與 IPV所需要的生產(chǎn)規(guī)模相適應(yīng)，由此使得應(yīng)用減毒疫苗林來進(jìn)行IPV制 備變得很有吸引力，但是也有爭論認(rèn)為野生型毒林和減毒毒株都會具有相 同的生物遏制問題。
仍然需要這樣一種脊髓灰質(zhì)炎病毒毒林，即它在疫苗生產(chǎn)設(shè)施中可能 出現(xiàn)的暴露水平下對人類沒有感染性。這樣將會顯著降低泄漏至環(huán)境中的 可能性，并且即使在活病毒接種停止以后，這種泄漏的后果也仍然可以忽 略不計(jì)。這種毒林可以在疫苗生產(chǎn)商所允許的遏制水平下生長。

發(fā)明內(nèi)容
我們現(xiàn)已設(shè)計(jì)并構(gòu)建了可解決現(xiàn)有IPV種的安全性和遏制問題的脊 髓灰質(zhì)炎病毒抹。這些毒林可在細(xì)胞培養(yǎng)物中于33C下生長至與Sabin 毒林的滴度一樣高的滴度，但是在37。C下的感染性卻顯著降低，在一個 實(shí)例中，降低到一百萬分之一以下。該3型毒林顯示出被完全減毒，在以 比使50%小鼠麻瘠所需的Sabin 3劑量高5,000倍的劑量通過脊柱內(nèi)方式 接種到TgPVR小鼠體內(nèi)時(shí)，根本不會引起臨床癥狀。還使用涉及操縱5， 非編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)域V中的RNA二級結(jié)構(gòu)的方法，將該毒林設(shè)計(jì)為遺傳穩(wěn) 定的毒株。在這些毒林中，衣殼蛋白的序列并未發(fā)生改變，因而滅活制劑 的免疫原性有望沒有受到損害。
因此，本發(fā)明提供了一種在脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組5'非編碼區(qū)的結(jié) 構(gòu)域V的莖(a )或(b )區(qū)中沒有U-G堿基對或其他堿基對錯配的減毒 脊髓灰質(zhì)炎病毒，并且其中在莖(a)和(b)區(qū)中至少有七個堿基對為 U-A或A-U堿基對。優(yōu)選地，莖(b)區(qū)中至少有五個堿基對為U-A或 A-U堿基對。脊髓灰質(zhì)炎病毒可為l型、2型或3型脊髄灰質(zhì)炎病毒。優(yōu) 選在脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組5，非編碼區(qū)472-537位、478-533位、480-531 位和481-530位具有U-A堿基對的3型減毒脊髄灰質(zhì)炎病毒。具體而言， 優(yōu)選的是在482-529位或477-534位或在這兩個位置同時(shí)額外含有A-U堿 基對的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒。"減毒，，指相對于野生型脊髓灰質(zhì)炎病毒即相 關(guān)Sabin疫苗林的前身林(每個疫苗林都有其自己的前身林)而言的減毒， 也指相對于相關(guān)Sabin疫苗林而言的減毒?？傮w而言，病毒必須被充分減 毒，從而使其對人沒有感染性。
本發(fā)明還提供了
-一種本發(fā)明的經(jīng)滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒； -一種本發(fā)明的用于疫苗的脊髓灰質(zhì)炎病毒；
- 一種疫苗，含有本發(fā)明的脊髓灰質(zhì)炎病毒以及可藥用載體或稀釋
劑；
-本發(fā)明的脊髓灰質(zhì)炎病毒作為滅活的脊髓灰質(zhì)炎疫苗種的用途；和
- 一種制備滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的方法，包括
(i) 培養(yǎng)本發(fā)明的減毒脊M質(zhì)炎病毒；
(ii) 將所述脊MA質(zhì)炎病毒滅活，和(iii)用可藥用載體或稀釋劑來將所述滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒制備為制劑。


圖1示出3型Sabin林的結(jié)構(gòu)域V (核苷酸471-538 )的預(yù)測RNA 二級結(jié)構(gòu)。第471-473位與第536-538位的威基配對莖區(qū)為莖(a)區(qū)， 第477-483位與第528-534位的戚基配對莖區(qū)為莖(b)區(qū)。
圖2示出每一類型的脊髓灰質(zhì)炎病毒的Sabin疫苗林的結(jié)構(gòu)域V的 莖(a)和(b)區(qū)的序列。3型脊髓灰質(zhì)炎病毒的結(jié)構(gòu)域V貫穿第471-538位。 2型或1型脊髓灰質(zhì)炎病毒的結(jié)構(gòu)域V貫穿第468-535位。
圖3示出現(xiàn)有技術(shù)中的被命名為S15的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒林的結(jié) 構(gòu)域V (核苦酸471-538)的預(yù)測RNA二級結(jié)構(gòu)。
圖4示出被命名為S17的本發(fā)明的減毒林的結(jié)構(gòu)域V (核苷酸 471-538 )的預(yù)測RNA 二級結(jié)構(gòu)。
圖5示出被命名為S18的本發(fā)明的減毒林的結(jié)構(gòu)域V (核苦酸 471-538)的預(yù)測RNA二級結(jié)構(gòu)。
圖6示出被命名為S19的本發(fā)明的減毒林的結(jié)構(gòu)域V (核苷酸 471-538 )的預(yù)測RNA 二級結(jié)構(gòu)。
圖7示出使用脊髄灰質(zhì)炎病毒林Sabin 3、 S15、 S17和S18進(jìn)行溫度 敏感度測試的結(jié)果。示出當(dāng)在L20B、 Vero和Hep2C細(xì)胞中培養(yǎng)時(shí)，與 33。C下噬斑數(shù)目相比，噬斑數(shù)目的減少與溫度的函數(shù)關(guān)系。
圖8示出當(dāng)在HEp2C細(xì)胞中于33r下培養(yǎng)時(shí)，Sabin3 (S3)、 S15、 S17和S18的一步生長曲線。TCIDsn: 50%組織培養(yǎng)物感染劑量。
圖9示出當(dāng)在不同細(xì)胞系中進(jìn)行傳代時(shí)，Sabin3中472U的穩(wěn)定性。 將Sabin 3在不同細(xì)胞中于37°C下傳代十次。然后通過PCR和限制性內(nèi) 切核酸酶消化(MAPREC )測量472C含量。符號令，L20B細(xì)胞；*， Vero 細(xì)胞▲ MRC-5細(xì)胞。L20B細(xì)胞為表達(dá)人脊髓灰質(zhì)炎病毒受體的小鼠L 細(xì)胞。Vero細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞用于疫苗生產(chǎn)。
圖IO示出當(dāng)在不同細(xì)胞系中進(jìn)行傳代時(shí)，Sabin 2和Sabin 1結(jié)構(gòu)域 V中的減毒突變的穩(wěn)定性。將病毒在不同細(xì)胞中于37X:下傳代十次，然 后通過PCR和限制性核酸內(nèi)切酶消化(MAPREC)測量突變體比例。(A)Sabin 2在L加B細(xì)胞(A)和Vero細(xì)胞(—中傳代期間第站l位核苷酸的突 變。(B) Sabin 1在Vero細(xì)胞中傳代期間第4洲或525位核苷酸的突變(▲) 和第476位核苷酸的突變(一。(C) Sabin 1在L20B細(xì)胞傳代期間第480 或525位核苷酸的突變(A)和第476位核苷酸的突變(畫)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供了一種在其基因組5，非編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)域V的莖(a)或(b)區(qū) 中沒有堿基對錯配的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中莖(a)和(b)區(qū)中至少有七 個堿基對為U-A或A-U堿基對。優(yōu)選地，莖(b)區(qū)中至少有五個(例 如六個或七個堿基對)為U-A或A-U堿基對。優(yōu)選地，在莖(a)區(qū)至少 有兩個堿基對為U-A或A-U堿基對，例如，莖(a)中有三個堿基對可能 會為U-A或A-U堿基對。
已對本發(fā)明的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒進(jìn)行改造，從而使得結(jié)構(gòu)域V的 莖(a)和(b)區(qū)不含U-G堿基對或其他的堿基對錯配，例如1型Sabin疫苗 林中的U-U錯配。優(yōu)選地，莖(c)和(d)區(qū)還不含U-G堿基對或其他的堿基 對錯配。提供了可供選擇的A-U或U-A堿基對來代替堿基錯配。因而， U-A堿基對優(yōu)選存在于3型脊髄灰質(zhì)炎病毒結(jié)構(gòu)域V的472-537位和 480-531位，以及2型脊髓灰質(zhì)炎病毒的527-478位，代替了U-G堿基對 (參見圖2)。
另外，已對結(jié)構(gòu)域V的莖(a)和/或(b)區(qū)進(jìn)行改造，用A-U或U-A堿 基對代替兩個或多個G-C或C-G威基對。Sabin 3的莖(b)區(qū)在477-534 位和478-533位含有C-G堿基對，并且在481-530位和482-529位含有 G-C堿基對。將這些4^對中的兩個、三個或四個用U-A、 A-U或A-U 和U-A堿基對的混合替代。還可對莖(a)區(qū)進(jìn)行改造，用A-U或U-A堿 基對(優(yōu)選A-U堿基對)來替代473-536位的C-G堿基對。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒含有3型脊髓灰質(zhì) 炎病毒的5'非編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)域V，其中U-A堿基對存在于莖(a)區(qū)中的 472-537位以及莖(b)區(qū)中的478-533位、480-531位和481-530位。另外的 A-U堿基對可能會存在于莖(b)區(qū)中的482-529位和/或莖(b)區(qū)中的 477-534位。
1型和2型脊髓灰質(zhì)炎病毒可以相應(yīng)地來源自具有神經(jīng)毒性的野生型l型和2型脊髓灰質(zhì)炎病毒的莖U)區(qū)和莖(b)區(qū)的序列。所有毒林均優(yōu) 選地為Sabin?；蛘?，可用本發(fā)明的3型脊髄灰質(zhì)炎病毒的整個結(jié)構(gòu)域V 替代1型或2型脊髓灰質(zhì)炎病毒的整個結(jié)構(gòu)域V。例如，可用本發(fā)明的3 型脊髓灰質(zhì)炎病毒的整個5'非編碼區(qū)替代1型或2型脊髓灰質(zhì)炎病毒的 整個5，非編碼區(qū)。
本發(fā)明的脊髓灰質(zhì)炎病毒中的突變削弱了病毒的毒力，并且在遺傳方 面穩(wěn)定了現(xiàn)有的活的減毒疫苗病毒林，由此使它們不太可能回復(fù)毒力。這 些突變也l吏得可以以比下述遏制水平更^f氐的遏制水平來安全產(chǎn)生病毒用 于產(chǎn)生滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的野生型病毒所需要的遏制水平，以及培養(yǎng)現(xiàn) 有的用于滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗生產(chǎn)的減毒Sabin林所必需的遏制水平。 可將前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活。 本發(fā)明提供了一種用于制備本發(fā)明的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒的方法，所 述方法包括
(i) 通過定點(diǎn)誘變將所述或每個所需突變引入脊髓灰質(zhì)炎病毒基 因組的一個DNA拷貝的亞克隆區(qū)域，該區(qū)域含希望突變的所 述或每個位置；
(ii) 將由此得到改造的區(qū)域再次引入一個所述區(qū)域所來源的完整 拷貝DNA中；和
(iii) 從由此獲得的拷貝DNA中收獲活的病毒。
因而，通過對與脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因組RNA相對應(yīng)的拷貝DNA 進(jìn)行定點(diǎn)誘變，可將突變引入脊髓灰質(zhì)炎病毒林，通常為Sabin林。此舉 可通過將來自脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的感染性DNA拷貝的恰當(dāng)區(qū)域亞克 隆至噬菌體(例如M13)的單鏈DNA中來實(shí)現(xiàn)。
在引入所述或每個突變之后，將所述經(jīng)改造的被亞克隆的拷貝DNA 再次引入所述作為它們來源的完整的拷貝DNA中。通過產(chǎn)生正義RNA (通常使用T7啟動子來指導(dǎo)體外轉(zhuǎn)錄)，從所述被突變的全長拷貝DNA 回收活病毒(Van der Werf C /.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2330-2334， 1986)。
可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將回收得到的RNA加到組織培養(yǎng)物中(Koch， Curr. Top. Microbiol. Immunol. 61:89-138, 1973)。培養(yǎng)二至三天后，可從所述 組織培養(yǎng)物的上清回收病毒。然后可使用在小鼠中進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)LDsQ測試 或在猴中進(jìn)行的上述WHO批準(zhǔn)的疫苗安全性測試，來將所述經(jīng)改造的病毒的神經(jīng)毒力水平和所得減毒水平與未經(jīng)改造病毒的相比較。還已發(fā)現(xiàn)，由于弱化結(jié)構(gòu)域V所引起的減毒與BGM細(xì)胞(Macadam ""/.， Virology 181:451-458， 1991)或L20B細(xì)胞(如Macadam " Virology 189:415-422,1992中對CM-1細(xì)胞的描述)中的溫度敏感度大致 相關(guān)。因而，經(jīng)改造的病毒的溫度敏感度可被確定為用于確定預(yù)期減毒水 平的初步篩查指標(biāo)。這可表示為這樣的溫度(T):在此溫度下，噬斑形 成單位(pfu )的數(shù)目比在相同細(xì)胞中于例如33X:或35*C獲得的數(shù)目減少 了 10的冪次方(1.01ogn))。 T值越低，減毒程度越高。減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒可用作活疫苗。因而，它們可被制備為進(jìn)一步含 有可藥用載體或稀釋劑的藥物組合物。可采用任何通常用于活疫苗制劑中 的載體或稀釋劑。例如，可將減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒在l M MgCl2水溶液 中穩(wěn)定，并以三種血清型的混合物形式給藥。因此，減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒可用于預(yù)防病人患上脊髓灰質(zhì)炎。基于此 目的，它們可以通過口服、作為鼻噴霧劑或經(jīng)胃腸外(例如通過皮下或肌 內(nèi)注射)來給予?？梢越o予與常規(guī)Sabin疫苗林的給藥量相當(dāng)?shù)膭┝?，?如104國106 TCID50。減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒可用作滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗(IPV)種。因此， 本發(fā)明提供了 一種本發(fā)明的滅活減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒以及本發(fā)明的脊髓 灰質(zhì)炎病毒作為滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗(IPV)種的用途。本發(fā)明還提供了 一種用于制備滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的方法，包括(i) 培養(yǎng)本發(fā)明的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒；(ii) 滅活所述脊髓灰質(zhì)炎病毒；和(iii) 用可藥用載體或稀釋劑將所述滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒配制為制 劑?？赏ㄟ^任何合適的方法將脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活。通常采用用于在目前 使用的IPV中滅活野生型脊髓灰質(zhì)炎病毒的方法。例如，可通過曱醛處 理來滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒?？蓪⒈景l(fā)明的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒林滅活，并與可藥用載體或稀釋劑 結(jié)合?？刹捎萌魏瓮ǔＳ糜跍缁畈《局苿?例如IPV制劑)中的載體或 稀釋劑。IPV制劑可包括滅活的l型、2型和3型脊髓灰質(zhì)炎病毒。因此，本發(fā)明的減毒滅活脊髄灰質(zhì)炎病毒可用于疫苗接種以預(yù)防病人 的脊髓灰質(zhì)炎?；诖四康?，它們可通過任何合適的途徑例如胃腸外途徑來給藥。胃腸外給藥可通過皮下注射或肌內(nèi)注射來進(jìn)行?？梢越o予與常規(guī)IPV的給藥量相當(dāng)?shù)膭┝?，例?-40D抗原單位。 通過以下實(shí)施例闡述本發(fā)明。實(shí)施例定點(diǎn)突變體的構(gòu)建和回收S15、 S17、 S18和S19是口服用3型脊髓灰質(zhì)炎疫苗林Sabin3的衍 生物。此前已有對Sabin 3 cDNA克隆的衍生以及對S15的構(gòu)建的記載 (Westrop " "/， J. Virol. 63:1338-1344， 1989; WO 98/419619)。圖3-6以黑 體示出了被突變的核苷酸，其他序列與Sabin 3相同。用U-A或A-U堿 基對替代C-G堿基對逐漸降低了結(jié)構(gòu)域V的熱動力學(xué)穩(wěn)定性；除去所有 U-G堿基對會使結(jié)構(gòu)在遺傳學(xué)上穩(wěn)定，因?yàn)槿魏螁蝹€的突變都會弱化相 關(guān)的堿基對。需要兩個同時(shí)進(jìn)行的突變來強(qiáng)化所述結(jié)構(gòu)，這只能通過將 U-A堿基對突變?yōu)镃-G (或G-C )堿基對來實(shí)現(xiàn)。通過標(biāo)準(zhǔn)方法來構(gòu)建并回收病毒。更具體而言，通過PCRi秀變來構(gòu) 建S17、 S18和S19。對于每種質(zhì)粒而言，使用摻入了必要的序列變化(如 圖4-6所示)的引物通過PCR擴(kuò)增Sabin 3的5'非編碼區(qū)的三個片段， 所述序列變化處于(a) 31-50位和471-489位的核苷酸、(b) 471-489位和 522-540位的核苷酸以及(c) 522-540位和755-778位的核苷酸。將這三個 重疊片段(a)-(c)進(jìn)行凝膠純化、混在一起并用外引物再次擴(kuò)增，隨后，將 該含有突變的5'非編碼區(qū)的747 bp片段克隆到pCR2.1 (Invitrogen)中并 測序。將具有正確序列的Mlul-Sacl (279-751)片段連接到?jīng)]有Sacl-Sacl (751-1卯0)片段的Sabin3克隆中。通過引入部分的Sacl/Smal (2768)片段 來形成全長的感染性克隆。在快速篩選Sabin3的具有神經(jīng)毒性的變體的條件下，脊髓灰質(zhì)炎病 毒林S15和S16的減毒表型是穩(wěn)定的(W098/41619)。為了形成全部三種 血清型的在遺傳學(xué)上穩(wěn)定的毒林，將Sabin 1的整個5，非編碼區(qū)用毒林 S15的整個5，非編碼區(qū)嚴(yán)格置換從而形成S15/1，并將Sabin 2的整個5， 非編碼區(qū)用毒林S15的整個5'非編碼區(qū)嚴(yán)格置換從而形成S15/2。點(diǎn)通過PCR擴(kuò)增，用Sacl和AatII消化，并進(jìn)行凝膠純化。將質(zhì)粒pT7/S15 用EcoRI和Sacl消化，并將含有T7啟動子和基因組的前751個核苷酸 的0.78-kb片段進(jìn)行凝膠純化。將這些片段一起連接到經(jīng)EcoRI-AatII消 化的pT7/SlF中，從而產(chǎn)生全長的質(zhì)?？寺T7/S15/1，該克隆含有S15 的整個5，NCR以及Sabinl的編碼區(qū)和3，NCR,這可通it^J"基因組的前 1，200個核苷酸進(jìn)行測序得到確認(rèn)。所述誘變策略的結(jié)果是，與Sabin 1 相比， 一個沉默T—A變化被引入到了 pT7/S15/l編碼區(qū)的第二個密碼子 中。為制備S15/2,通過重疊PCR將T7/S15的5，非編碼區(qū)準(zhǔn)確地剪接到 Sabin 2的編碼區(qū)上。擴(kuò)增pT7/S15的5， NCR以及Sabin 2克隆pS2的編 碼區(qū)的起點(diǎn)；將重疊片段進(jìn)4亍凝膠純化，混合并用外引物NP7和AM13 再次擴(kuò)增；并將所得到的片段用NotI和SacI消化、進(jìn)行凝膠純化，并連 接到經(jīng)Notl-Sacl消化的pS2中，從而產(chǎn)生全長的質(zhì)?？寺T7/S15/2, 所述克隆含有S15的整個5， NCR以及Sabin 2的編碼區(qū)和3， NCR,這 可通過對基因組的前1,500個核苷酸進(jìn)行測序得到確認(rèn)。除了被交換的5， 非編碼區(qū)外，在Sabin2序列中沒有引入突變。還構(gòu)建了另外兩個S18毒林，所述毒林含有來自脊髓灰質(zhì)炎疫苗株 Sabin 1(S18/l)和Sabin 2 (S18/2)的序列。通過將S18的含有T7啟動子和 基因組前751個核苷酸的0.78 kb EcoRI-SacI片段換到S15/1中來形成 S18/l。 S18/1含有精確剪接到Sabin 1的編碼區(qū)和3，非編碼區(qū)上的S18 的5'非編碼區(qū)。為制備S18/2，將S18的MluI-BamHI (674)片段換到S15/2 的亞克隆中，隨后，使用S15/2中的獨(dú)特MluI和SacI(1318)位點(diǎn)來形成 全長克隆。S18/2含有精確剪接到Sabin2的編碼區(qū)和3，非編碼區(qū)上的S18 的5'非編碼區(qū)。病毒的回收是通過用^2將T7轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)染HEp2C細(xì)胞單層(Van der Werf "fl/， Proc. Natl. Acad. Sci. USA83:2330-2334， 1986),然后在33。C下 培養(yǎng)24-48小時(shí)來進(jìn)行的，此時(shí)完全的細(xì)胞病變作用很明顯。在進(jìn)行RNA 提取和RT-PCR之后確認(rèn)所有突變體5'非編碼區(qū)的序列。溫度敏感度之前我們已發(fā)現(xiàn)，對于僅在5，非編碼區(qū)的RNA結(jié)構(gòu)域V中有差異、在遺傳學(xué)上很明確的脊髓灰質(zhì)炎病毒林而言，生長的溫度敏感度與所述折疊RNA的預(yù)期穩(wěn)定性在量上相關(guān)(Macadam Virology 189:415-22，1992)。如上述出版物中所描述的那樣，使用L20B、 Hep2C和Vero細(xì)胞進(jìn) 行溫度敏感度分析。簡而言之，通過在不同溫度下的噬斑形成來分析病毒。 這些分析的控制可通過以下方式實(shí)現(xiàn)，即在浸沒于溫度波動小于O.Ol匸的 水浴中的密封塑料盒中孵育經(jīng)接種的細(xì)胞培養(yǎng)板。圖7中的圖示出代表在 三種不同的細(xì)胞系中與33X:時(shí)相比噬斑數(shù)目的減少與溫度的函數(shù)關(guān)系的 曲線。結(jié)果表明，弱化結(jié)構(gòu)域VRNA二級結(jié)構(gòu)，對于病毒于人的體溫下在 所有被測試的細(xì)胞系中復(fù)制的能力有著顯著的影響。在L20B細(xì)胞中，甚 至在使用含5x 105感染單位的接種物的情況下，S18在37"C下也根本沒 有出現(xiàn)復(fù)制。一步生長曲線將多份HEp2C細(xì)胞層用不同的病毒同時(shí)進(jìn)行感染，其感染復(fù)數(shù)為 10,在33。C下培養(yǎng)不同時(shí)間，然后在-70匸下冷凍收集。通過標(biāo)準(zhǔn)方法測 定細(xì)胞裂解液中的病毒滴度(在33i:下)。對于每一種病毒而言，復(fù)制動力 學(xué)和病毒產(chǎn)量沒有顯著差異。結(jié)果示于圖8。減毒表型在過去的15年里，已經(jīng)建立并驗(yàn)證了使用表達(dá)人脊髓灰質(zhì)炎病毒受 體的轉(zhuǎn)基因小鼠來評估脊髓灰質(zhì)炎病毒的毒力的方法。對表達(dá)脊髓灰質(zhì)炎病毒受體的轉(zhuǎn)基因小鼠(TgPVR小鼠)進(jìn)行脊柱 內(nèi)接種是一種測量體內(nèi)感染性的高度敏感的方法，因?yàn)椴《緩?fù)制會導(dǎo)致神 經(jīng)元喪失和明顯的臨床上的麻痹征候。使用這種接種方法，不到十個PFU 的野生型病毒通常就足以使50o/o的小鼠麻痹(Chiimakov W "/， Dev. Biol. (Basel) 105:171-177， 2001)。在本文中，我們使用Tg66-CBA品系的小鼠 ——其對于3型毒林特別敏感——來評估病毒S15、 S17、 S18和S19的 感染力。通過兩種敏感度有差異的途徑即肌內(nèi)途徑和脊柱內(nèi)途徑，對Sabin3、 S15、 S17和S18病毒進(jìn)行了評估。使用這些病毒的初始結(jié)果示于表1。兩個系列的初始實(shí)驗(yàn)都表明，與現(xiàn)有的3型疫苗抹和S15相比，S17和 S18減毒程度更高(毒力更低)。S18似乎被完全減毒，在將S18以比Sabin 3的PDso高3000倍以上的劑量通過脊柱內(nèi)方式接種到小鼠體內(nèi)時(shí)，它根 本不會引起臨床癥狀。
使用脊柱內(nèi)途徑并用Sabinl、 Sabin 2、 Sabin 3、 S15、 S17、 S18、 S19、 S18/l和S18/2進(jìn)行了進(jìn)一步測試。這些測試的結(jié)果示于表2。在這 些測試中，毒株S15與Sabin 3沒有差異(表1 )。毒林S17的結(jié)果表明， 一個額外的C-G至U-A堿基對的交換將PD鄰增加了 3000倍以上。毒抹 S18和S19比S17多出一個和兩個C-G至U-A (或A-U)的交換，并且似 乎被完全減毒，甚至在劑量比Sabin 3的PD50高出近100,000倍時(shí)。
S18/1的PDso比Sabin 1的PDso高出一百萬倍以上(表2 ),僅僅是 因?yàn)?'非編碼區(qū)的交換所致。S18/1的數(shù)據(jù)與兩個額外的C-G至U-A堿 基對的交換將PDso值增加了 106倍以上相一致。
Sabin 2是三種口服用脊髓灰質(zhì)炎疫苗林中減毒程度最高的，并且在 TgPVR小鼠中有著相對較高的PDso(Dragimsky " "/， Bull. World Health Organ. 81:251-60, 2003)。在Tg66-CBA小鼠中，通過脊柱內(nèi)途徑接種的 S18/2的PD50比Sabin 2的PDso要高(表2 )。毒林S18和S18/1的數(shù)據(jù) 表明它比10"要高出幾個數(shù)量級，但是產(chǎn)生滴度高到足以對此進(jìn)行測試 的病毒制劑是不切實(shí)際的。
所有三種脊髓灰質(zhì)炎病毒血清型的在遺傳上穩(wěn)定的毒林
使用有利于減毒核苷酸快速回復(fù)的細(xì)胞培養(yǎng)模型，以與用于毒林S15 的相同方式，比較了 S15/l和S15/2毒林的穩(wěn)定性和相關(guān)Sabin林的穩(wěn)定 性(圖9 )。
Sabin 2的5，非編碼區(qū)中主要的減毒突變是核苷酸481上的A (等同 于圖1中的核苷酸484)，該位置上A至G的突變一一該突變導(dǎo)致減毒作 用顯著喪失——可在Sabin 2于37t:下在L20B細(xì)胞和Vero細(xì)胞中傳代 期間被快速篩選出來(圖10A)。到在L20B細(xì)胞中第三次傳代時(shí)，60% 以上的Sabin 2群體的481位核苷酸都為G,并在四次傳代后篩選基本完 成。在Vero細(xì)胞中，傳代五次后，60%以上的Sabin 2群體的481位核 苷酸都為G，并在8-9次傳代后篩選基本完成。在L20B細(xì)胞或Vero細(xì) 胞中，經(jīng)十次傳代后均沒有在S15/2林的結(jié)構(gòu)域V中觀察到核苷酸發(fā)生改變。
在Sabin 1在人腸道中復(fù)制期間對其結(jié)構(gòu)域V中的三種不同突變進(jìn)行 了篩選，這些突變均加強(qiáng)了威基配對480位的G突變?yōu)锳、 525位的U 突變?yōu)镃,以及476位的U突變?yōu)锳 (參見圖2)。 480位和525位的核苷 酸形成了一個堿基對，因而突變出現(xiàn)在病毒的一個位置或另一個位置，但 不同時(shí)出現(xiàn)在兩個位置。在Vero細(xì)胞中，以穩(wěn)定的速率對Sabin 1中所 有三個位置的突變進(jìn)行了篩選(圖IOB)，從而使在六次傳代后，有一半 的病毒群體在480位或525位具有突變，并且有40%以上的病毒群體在 476位具有突變。在最后四次傳代期間，在480位或585位具有突變的病 毒群體的比例增加至約100%,這主要是由于480位核苷酸的突變所致。 還在Sabin 1在L20B細(xì)胞中傳代期間對其所有三個位置上的突變進(jìn)行了 篩選(圖10C)，然而，與在Vero細(xì)胞中的結(jié)果相反，476位突變的篩選 速率比480和525位突變的要高，從而使在六次傳代之后，大約有60% 的病毒群體在476位核苷酸具有突變，并且有30%在480位或525位具 有突變。在L20B細(xì)胞或Vero細(xì)胞中，經(jīng)十次傳代后均沒有在S15/1林 的結(jié)構(gòu)域V中觀察到核苷酸發(fā)生改變。
表l TgPVR小鼠中的減毒/神經(jīng)毒力表型 TgPVR小鼠中的Logl0 PD鄰值
Sabin 39.653.6
S158.9n.d.
S17>9.3 (0/8)1>7.1 (1/8)
S18>9.4 (0/8)>7.1 (0/8)
肌內(nèi)途徑
". 脊柱內(nèi)途徑
n.d. 未檢觀'J
PD5o麻痹劑量(50%)
1 (最大劑量下麻痹的小鼠比例)表2在TgPVR小鼠中的減毒/神經(jīng)毒力表型
病毒 PD50 ". /log10 CCID鄰
Sabin 1 2.25
S18/1 > 8.6 (1/16)*
Sabin 2 6.4
S18/2 > 8.1 (0/8)*
Sabin 3 3.6 S15 3.7
517 > 7.1 (4/16)*
518 > 8.4 (0/16)*
519 > 8.2 (0/16)*
i. s. 脊柱內(nèi)途徑
PDso麻痹劑量(50%)
* 最高劑量下，麻痹小鼠/小鼠總數(shù)
權(quán)利要求
1. 一種在其基因組5’非編碼區(qū)的V結(jié)構(gòu)域的莖(a)或(b)區(qū)中沒有堿基對錯配的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中莖(a)和(b)區(qū)中至少有七個堿基對為U-A或A-U堿基對。
2. 權(quán)利要求l的脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中莖(b)區(qū)中至少有五個 堿基對為U-A或A-U堿基對。
3. 權(quán)利要求1或2的脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中莖(b)區(qū)中有六個 堿基對為U-A或A-U堿基對。
4. 權(quán)利要求1或2的脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中莖(b)區(qū)中有七個 堿基對為U-A或A-U堿基對。
5. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中莖U)區(qū)中有 兩個堿基對為U-A或A-U堿基對。
6. 權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)的脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中莖(a)區(qū)中有 三個堿基對為U-A或A-U堿基對。
7. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒，含有3型脊髓灰 質(zhì)炎病毒5，非編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)域V,其中在莖(a)區(qū)472-537位以及莖(b) 區(qū)478-533位、480-531位和481-530位存在U-A堿基對。
8. 權(quán)利要求7的脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中在莖(b)區(qū)482-529位 存在A-U堿基對。
9. 權(quán)利要求7或8的脊MA質(zhì)炎病毒，其中在莖(b )區(qū)477-534 位存在A-U堿基對。
10. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒，所述病毒被滅活。
11. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的脊髓灰質(zhì)炎病毒，用于疫苗中。
12. —種疫苗，含有權(quán)利要求l-10任一項(xiàng)定義的脊髓灰質(zhì)炎病毒， 以及可藥用載體或稀釋劑。
13. 權(quán)利要求l-9任一項(xiàng)的脊髓灰質(zhì)炎病毒作為滅活脊髓灰質(zhì)炎疫 苗(IPV)種的用途。
14. 一種制備滅活脊M質(zhì)炎疫苗的方法，包括(i) 培養(yǎng)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒；(ii) 滅活所述脊髓灰質(zhì)炎病毒；和(iii)用可藥用載體或稀釋劑將所述滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒配制為制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在其基因組5’非編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)域V的莖(a)或(b)區(qū)中沒有堿基對錯配的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒，其中在莖(a)和(b)區(qū)中至少有七個堿基對為U-A或A-U堿基對。
文檔編號A61K39/13GK101522216SQ200780037083
公開日2009年9月2日 申請日期2007年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月10日
發(fā)明者A·麥克亞當(dāng) 申請人:英國國家生物標(biāo)準(zhǔn)委員會