專利名稱：：抗體純化的制作方法抗體純化相關(guān)申請本申請要求2006年4月5日提交的美國臨時申請系列號60/789,725的優(yōu)先權(quán)和2006年4月6日提交的美國臨時申請系列號60/790,414的優(yōu)先權(quán)，每個臨時申請的內(nèi)容通過引用整體結(jié)合到本文中。
背景技術(shù)：
：大規(guī)模且經(jīng)濟地純化蛋白質(zhì)對于生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)來說是一個曰益重要的問題。通常，蛋白質(zhì)是使用經(jīng)工程改造能產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的哺乳動物細胞系或細菌細胞系通過細胞培養(yǎng)產(chǎn)生的，所述工程改造是將包含編碼該蛋白質(zhì)的基因的重組質(zhì)粒插入到該細胞系中。由于所用的細胞系是活的生物，必需給它們喂養(yǎng)包含糖類、氨基酸和生長因子的復(fù)雜生長培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基通常從動物血清的制品(preparation)供應(yīng)。要將所需的蛋白質(zhì)與喂養(yǎng)細胞的化合物混合物和與細胞本身的副產(chǎn)物進行分離，至足夠作為人類治療劑使用的純度，這是一個極大的難題。發(fā)明概述對于改進的、用以獲得宿主細胞蛋白質(zhì)(包括組織蛋白酶L酶原(procathepsinL))含量P爭低的抗體制品的方法，人們是有需求的。本發(fā)明提供用以純化宿主細胞表達系統(tǒng)中所表達的抗體的方法，其中所得抗體制品包含的宿主細胞蛋白質(zhì)(包括組織蛋白酶L酶原)的含量降低。本發(fā)明的改進方法還包括準確檢測宿主細胞蛋白質(zhì)的可再現(xiàn)方法的開發(fā)，以及動力學(xué)測定法。本發(fā)明提供用以從包含抗體和至少一種宿主細胞蛋白質(zhì)(HCP)的混合物生產(chǎn)HCP降低的抗體制品的方法，所述方法包括離子交換步驟，其中將該混合物施加到第一離子交換材料，由此獲得HCP降低的抗體制品。在一個實施方案中，該離子交換分離步驟包括使該混合物通過第一離子交換材料，由此獲得HCP水平降低的第一洗脫物(eluate)。在一個實施方案中，本發(fā)明的該方法還包括第二離子交換分離步驟，其中將第一洗脫物施加到第二離子交換材料，由此獲得HCP水平降低的第一流通物(flowthrough)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的該方法還包括疏水相互作用分離步驟，其中將第一流通物施加到第一疏水相互作用材料，由此獲得HCP水平降低的第二洗脫物。在本發(fā)明的一個實施方案中，該離子交換分離步驟包括第一離子交換層析步驟，其中將該混合物荷載到包含第一離子交換材料的柱子上，由此獲得HCP水平降低的第一洗脫物。在一個實施方案中，本發(fā)明還包括第二離子交換層析步驟，該步驟包括將第一洗脫物荷載到包含第二離子交換材料的柱子上，由此獲得第一流通物。在一個實施方案中，本發(fā)明還包括疏水相互作用分離步驟，該步驟包括將第一流通物荷載到包含第一疏水相互作用材料的柱子上，由此獲得第二洗脫物。在一個實施方案中，疏水相互作用分離步驟包括疏水相互作用層析。在一個實施方案中，疏水相互作用層析是苯基瓊脂糖凝膠層析。在又另一個實施方案中，荷載到疏水相互作用材料上的抗體量為約20至約40克抗體/升疏水相互作用材料。在還另一個實施方案中，荷載到疏水相互作用材料上的抗體量為約30至約36克抗體/升疏水相互作用材料。在一個實施方案中，離子交換層析步驟是陽離子交換層析。在另一個實施方案中，陽離子交換層析是與磺酸基連接的基于合成的甲基丙烯酸酯的聚合物樹脂。在又另一個實施方案中，本發(fā)明還包括以多個洗滌步驟洗滌該離子交換材料。在一個實施方案中，該多個洗滌步驟包括電導(dǎo)率的增加。在一個實施方案中，該離子交換材料用包含約40-50%洗脫緩沖液和約50-60%水(例如注射用水(WFI))的洗液進^f亍洗滌。在一個實施方案中，該洗脫緩沖液是20mMNa2P04,150mM氯化鈉，pH7。在一個實施方案中，將第一洗脫物在進行第一離子交換層析步驟前先進行病毒滅活。在一個實施方案中，該病毒滅活是通過pH病毒滅活(例如降低第一洗脫物的pH，從而使病毒滅活)來實現(xiàn)。在本發(fā)明的一個實施方案中，第二離子交換層析步驟包括陰離子交換層析。在一個實施方案中，該陰離子交換層析是Q瓊脂糖凝膠層析。本發(fā)明還提供用以從包含抗體和至少一種宿主細胞蛋白質(zhì)(HCP)的混合物生產(chǎn)HCP降低的抗體制品的方法，其中該HCP水平降4氐如下來實現(xiàn)改變第一洗脫物的pH和電導(dǎo)率，使得第一洗脫物的pH和電導(dǎo)率與第二離子交換材料的pH和電導(dǎo)率基本上相似。在一個實施方案中，第二離子交換材料的pH為約7.7至約8.3。在另一個實施方案中，將第一洗脫物的pH改變至約7.7至約8.3。在又另一個實施方案中，將第一洗脫物的pH改變至約8.0。在一個實施方案中，第二離子交換材料的電導(dǎo)率為約3.5mS/cm至約5.2mS/cm，或者約3.5mS/cm至約4.9mS/cm。在一個實施方案中，將第一洗脫物的電導(dǎo)率改變至約3.5mS/cm至約5.2mS/cm或者約3.5mS/cm至約4.9mS/cm。在本發(fā)明的一個實施方案中，經(jīng)HCPELISA測定，第一洗脫物包含的HCP比該混合物少約90至約100倍。在另一個實施方案中，經(jīng)HCPELISA測定，第一流通物包含的HCP比第一洗脫物少約840至約850倍。在還另一個實施方案中，經(jīng)HCPELISA測定，第二洗脫物包含的HCP比第一流通物少約3至約5倍。本發(fā)明提供用以從包含抗體和組織蛋白酶L酶原的混合物生產(chǎn)組織蛋白酶L酶原降低的抗體制品的方法，所述方法包括離子交換分離步驟，其中將該混合物施加到第一離子交換材料，由此獲得組織蛋白酶L酶原降4氐的抗體制品o在一個實施方案中，該離子交換分離步驟包括使該混合物通過第一離子交換材料，由此獲得組織蛋白酶L酶原水平降低的第一洗脫物。在一個實施方案中，該離子交換分離步驟包括第一離子交換層析步驟，其中將該混合物荷載到包含第一離子交換材料的柱子上，由此獲得組織蛋白酶L酶原水平降低的第一洗脫物。在一個實施方案中，本發(fā)明還包括第二離子交換分離步驟，其中將第一洗脫物施加到第二離子交換材料，由此獲得組織蛋白酶L酶原水平降低的第一流通物。在一個實施方案中，本發(fā)明還包括第二離子交換層析步驟，該步驟包括將第一洗脫物荷載到包含第二離子交換材料的柱子上，由此獲得第一流通物。在一個實施方案中，本發(fā)明還包括疏水相互作用分離步驟，該步驟包括將第一流通物荷載到包含第一疏水相互作用材料的柱子上，由此獲得組織蛋白酶L酶原水平降低的第二洗脫物。在另一個實施方案中，本發(fā)明還包括疏水相互作用分離步驟，該步驟包括將第一流通物荷載到包含第一疏水相互作用材料的柱子上，由此獲得第二洗脫物。在一個實施方案中，離子交換層析步驟是陽離子交換層析，包括但不限于與磺酸基連接的基于合成的曱基丙烯酸酯的聚合物樹脂。在另一個實施方案中，離子交換層析步驟還包括以多個洗滌步驟洗滌該離子交換材料。在一個實施方案中，該多個洗滌步驟包括電導(dǎo)率的增加。在一個實施方案中，該離子交換材料用包含約40-50%洗脫緩沖液和約50-60%水(例如注射用水(WFI))的洗滌緩沖液進行洗滌。在又另一個實施方案中，該洗脫緩沖液是20mMNa2P04,150mM氯化鈉，pH7。在本發(fā)明的一個實施方案中，將第一洗脫物在進行離子交換層析步驟前先進行病毒滅活。在一個實施方案中，該病毒滅活是通過pH病毒滅活(例如降低第一洗脫物的pH，從而使病毒滅活)來實現(xiàn)。在一個實施方案中，該離子交換層析步驟包括陰離子交換層析。在一個實施方案中，該陰離子交換層析是Q瓊脂糖凝膠層析。本發(fā)明還描述了這樣的方法，其中組織蛋白酶L酶原水平降低如下來實現(xiàn)改變第一洗脫物的pH和電導(dǎo)率，使得第一洗脫物的pH和電導(dǎo)率與第二離子交換材料的pH和電導(dǎo)率基本上相似。在一個實施方案中，第二離子交換材料的pH為約7.7至約8.3。在另一個實施方案中，將第一洗脫物的pH改變至約7.7至約8.3。在又另一個實施方案中，將第一洗脫物的pH改變至約8.0。在還另一個實施方案中，第二離子交換材料的電導(dǎo)率為約3.5mS/cm至約5.2mS/cm，或者約3.5mS/cm至約4.9mS/cm。在一個實施方案中，將第一洗脫物的電導(dǎo)率改變至約3.5mS/cm至約5.2mS/cm，或者約3.5mS/cm至約4.9mS/cm。在本發(fā)明的一個實施方案中，該疏水相互作用分離步驟包括疏水相互作用層析。在一個實施方案中，疏水相互作用層析是苯基瓊脂糖凝膠層析。在又另一個實施方案中，荷載到疏水相互作用材料上的抗體量為約20至約40克抗體/升疏水相互作用材料。在還另一個實施方案中，荷載到疏水相互作用材料上的抗體量為約30至約36克抗體/升疏水相互作用材料。在一個實施方案中，經(jīng)組織蛋白酶L動力學(xué)測定法測定，第一洗脫物包含的組織蛋白酶L活性為約25至約60RFU/s/mg抗體。在另一個實施方案中，經(jīng)組織蛋白酶L動力學(xué)測定法測定，第一流通物包含的組織蛋白酶L活性為約0.4至約4RFU/s/mg抗體。在又另一個實施方案中，經(jīng)組織蛋白酶L動力學(xué)測定法測定，第二洗脫物包含的組織蛋白酶L活性為約0.5至約1.5RFU/s/mg抗體在本發(fā)明的一個實施方案中，組織蛋白酶L酶原的水平有重現(xiàn)性地低下(reproduciblylow)。在一個特別優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供這樣的抗體純化方法，其中可將高含量的抗體-HCP混合物荷載到離子交換樹脂上，以實現(xiàn)混合物中HCP的降低。這個方法的優(yōu)點是，它可用于這樣的抗體-HCP混合物，該混合物在被施加到離子交換樹脂前未曾被施以A蛋白捕捉。A蛋白捕捉通常被用作抗體純化程序中的初始純化步驟，作為除去HCP的手段，其中將抗體-HCP混合物施加到A蛋白柱，使得抗體與A蛋白結(jié)合，而HCP則流過。因此，本發(fā)明的方法可用來純化大載量的抗體-HCP混合物，而無需執(zhí)行A蛋白層析作為初始步驟。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供用以>(人包含抗體和至少一種宿主細胞蛋白質(zhì)(HCP)的混合物生產(chǎn)HCP降4氐的抗體制品的方法，所述方法包括以下步驟(a)將該混合物施加到在平衡緩沖液中的第一離子交換樹脂，其中施加量大于30克抗體/升樹脂；(b)以多個洗滌步驟從該樹脂洗滌HCP;和(c)用該洗脫緩沖液從該樹脂洗脫該抗體形成第一洗脫物，由此獲得該HCP降低的抗體制品。在另一個實施方案中，施加量約為35-70克抗體/升樹脂。在還另一個實施方案中，施加量約為70克抗體/升樹脂。在一個優(yōu)選的實施方案中，包含抗體和至少一種HCP的該混合物，在被施加到第一離子交換樹脂前，沒有被施以A蛋白捕捉(例如沒有凈皮施加到A蛋白柱)。優(yōu)選地，該多個洗滌步驟包括至少第一次洗滌和第二次洗滌，其中從第一次洗滌到第二次洗滌電導(dǎo)率有增加。更優(yōu)選地，第一次洗滌是用平衡緩沖液進行，第二次洗滌是用洗脫緩沖液和水(例如WFT)的混合物進行。例如，洗脫緩沖液和水的混合物可包含約40-50%洗脫緩沖液和約50-60%水。更優(yōu)選地，洗脫緩沖液和水的混合物可包含約45%洗脫緩沖液和約55%水。在一個優(yōu)選的實施方案中，洗脫緩沖液包含20mM磷酸鈉和150mM氯化鈉。在這個情況中，其中含45%洗脫緩沖液和約55°/。水的洗脫緩沖液和水混合物，是9mM磷酸鈉和68mM氯化鈉。在一個優(yōu)選的實施方案中，第一次洗滌是用包含20mM磷酸鹽、25mM氯化鈉的平衡緩沖液進行，第二次洗滌是用包含9mM磷酸鹽、68mM氯化鈉的緩沖液(45%洗脫緩沖液、55%水)進行，洗脫緩沖液包含20mM磷酸鹽、150mM氯化鈉。15在一個實施方案中，該使用第一離子交換樹脂的方法在pH7下進行。在另一個實施方案中，該使用第一離子交換樹脂的方法在pH5下進行。在還另一個實施方案中，該使用第一離子交換樹脂的方法在約pH5至約pH7范圍內(nèi)或者pH5至pH7范圍內(nèi)的某pH下進行。如使用pH7，優(yōu)選施加約35克抗體/升樹脂。如使用pH5，優(yōu)選施加約70克抗體/升樹脂。如使用在約pH5至約pH7范圍內(nèi)(例如pH5至pH7)的某pH，優(yōu)選施加的抗體量為約35至約70克抗體/升樹脂(例如35-70克抗體/升樹脂)。在一個優(yōu)選的實施方案中，通過將較多的抗體荷載到樹脂上(例如約70克抗體/升樹脂)，來實現(xiàn)(例如在pH5下)更好地從抗體-HCP混合物清除HCP，這比將較少的抗體荷載到樹脂上(例如約30克抗體/升樹脂)所實現(xiàn)的清除更好。據(jù)認為這是由于當使用這樣的條件時抗體將HCP從樹脂上置換下來的結(jié)果，在該條件下抗體對樹脂的結(jié)合親和力顯著大于HCP對樹脂的結(jié)合親和力。優(yōu)選地，第一離子交換樹脂是陽離子交換樹脂。優(yōu)選地，將該陽離子交換樹脂形成柱子，將包含抗體和至少一種HCP的混合物施加到該柱子。優(yōu)選地，該陽離子交換樹脂包含與磺酸基連接的基于合成的曱基丙烯酸酯的聚合物樹脂(例如FractogelS)。或者，該陽離子交換樹脂可包含例如與磺酸基(如锍離子或磺乙基)連接的如下樹脂基于曱基丙烯酸酯或聚苯乙烯的合成聚合物、二氧化硅、帶葡聚糖表面延伸劑(dextransurfaceextender)的高度交聯(lián)瓊脂糖、烯丙基葡聚糖與N,N-亞甲基雙丙烯酸樹脂的交聯(lián)共聚物。在本發(fā)明的另一個方面，在進行上述的使用第一離子交換樹脂的方法后，該方法還包括將第一洗脫物進行病毒滅活步驟。例如，其中病毒滅活可通過pH病毒滅活來實現(xiàn)，以形成病毒滅活制品(例如，將第一洗脫物施以低pH條件，如pH約3.5，從而使病毒滅活)。優(yōu)選地，將病毒滅活制品施加到第二離子交換樹脂，其中在將病毒滅活制品施加到第二離子交換樹脂前，將病毒滅活制品的pH和電導(dǎo)率調(diào)整到與第二離子交換樹脂的pH和電導(dǎo)率基本相似。例如，第二離子交換樹脂的pH可在約pH7.7至約pH8.3的范圍，可將病毒滅活制品的pH調(diào)整到約pH7.7至約pH8.3的范圍。在另一個實施方案中，第二離子交換樹脂的pH可在約pH7.8至約pH8.2的范圍，可將病毒滅活制品的pH調(diào)整到約pH7.8至約pH8.2的范圍。更優(yōu)選地，第二離子交換樹脂的pH為約pH8.0,將病毒滅活制品的pH調(diào)整到約pH8.0。此外，第二離子交換樹脂的電導(dǎo)率可在約3.5mS/cm至約5.2mS/cm的范圍，將病毒滅活制品的電導(dǎo)率調(diào)整到約3.5mS/cm至約5.2mS/cm的范圍。優(yōu)選地，第二離子交換樹脂的電導(dǎo)率為約5.0mS/cm，將病毒滅活制品的電導(dǎo)率調(diào)整到約5.0mS/cm。在一個優(yōu)選的實施方案中，第二離子交換樹脂是陰離子交換樹脂。例如，陰離子交換樹脂可以是Q瓊脂糖凝膠樹脂。優(yōu)選地，將第二離子交換樹脂形成柱子，將病毒滅活制品施加到該柱子上，由此獲得第一流通物。在本發(fā)明的另一個方面，從第二離子交換樹脂獲得第一流通物后，可將第一流通物施加到疏水相互作用柱，由此獲得第二洗脫物。在一個優(yōu)選的實施方案中，該疏水相互作用柱是苯基瓊脂糖凝膠柱。在一個實施方案中，施加到疏水相互作用柱的第一流通物包含約20至約40克抗體/升疏水相互作用柱材料。在另一個實施方案中，施加到疏水相互作用柱的第一流通物包含約30至約36克抗體/升疏水相互作用柱材料。由于純化過程中的初始步驟的效率，已發(fā)現(xiàn)沒有必要將從疏水相互作用柱獲得的第二洗脫物進行產(chǎn)物峰分級分離。因此，在一個實施方案中，沒有將第二洗脫物進行產(chǎn)物峰分級分離。在特別優(yōu)選的一個實施方案中，本發(fā)明的用以從包含抗體和至少一種宿主細胞蛋白質(zhì)(HCP)的混合物生產(chǎn)HCP降低的抗體制品的方法，包括以下步驟(a)將該混合物施加到在平衡緩沖液中的陽離子交換樹脂，其中該混合物在施加到該陽離子交換樹脂前未曾被施以A蛋白捕捉，且其中施加量大于30克抗體/升樹脂；(b)以多個洗滌步驟從該陽離子交換樹脂洗滌HCP;(c)用該洗脫緩沖液從該陽離子交換樹脂洗脫該抗體，以形成第一洗脫物；(d)將第一洗脫物進行病毒滅活步驟；(e)將所得病毒滅活制品施加到陰離子交換樹脂，以獲得第一流通物；和(f)將第一流通物施加到疏水相互作用柱，由此獲得第二洗脫物；從而獲得HCP降低的抗體制品。在一個實施方案中，該陽離子交換樹脂為pH7,施加量約為35克抗體/升樹脂。在另一個實施方案中，該陽離子交換樹脂為pH5，施加量約為70克抗體/升樹脂。在還另一個實施方案中，pH在約pH5至約pH7(例如pH5topH7)的范圍，施加的抗體量為約35至約70克抗體/升樹脂(例如35-70克抗體/升樹脂)。優(yōu)選地，該多個洗滌步驟包括用釆用平衡緩沖液的第一洗液和采用洗脫緩沖液和水混合物的第二洗液來洗滌該樹脂。例如，該洗脫緩沖液和水混合物可包含約40-50%洗脫緩沖液和約50-60%水(例如WFI)，更優(yōu)選約45%洗脫緩沖液和約55%水(例如WFI)。在一個優(yōu)選的實施方案中，洗脫緩沖液包含20mM磷酸鈉和150mM氯化鈉。在這個情況中，其中含45%洗脫緩沖液和約55%水的洗脫緩沖液和水混合物，是9mM磷酸鈉和68mM氯化鈉。在一個優(yōu)選的實施方案中，第一次洗滌是用包含20mM磷酸鹽、25mM氯化鈉的平衡緩沖液進行，第二次洗滌是用包含9mM磷酸鹽、68mM氯化鈉的緩沖液(450/0洗脫緩沖液、55%水)進行，洗脫緩沖液包含20mM磷酸鹽、150mM氯化鈉。優(yōu)選地，在上述的包括步驟(a)到(f)的方法中，在將病毒滅活制品施加到該陰離子交換樹脂前(即在步驟(d)和(e)之間)，將病毒滅活制品的pH和電導(dǎo)率調(diào)整到與該陰離子交換樹脂的pH和電導(dǎo)率基本相似。例如，第二離子交換樹脂的pH可在約pH7.7至約pH8.3的范圍，將病毒滅活制品的pH調(diào)整到約pH7.7至約pH8.3的范圍。在另一個實施方案中，第二離子交換樹脂的pH可在約pH7.8至約pH8.2的范圍，將病毒滅活制品的pH調(diào)整到約pH7.8至約pH8.2的范圍。更優(yōu)選地，第二離子交換樹脂的pH為約pH8.0，將病毒滅活制品的pH調(diào)整到約pH8.0。此外，第二離子交換樹脂的電導(dǎo)率可在約3.5mS/cm至約5.2mS/cm的范圍，將病毒滅活制品的電導(dǎo)率調(diào)整到約3.5mS/cm至約5.2mS/cm的范圍。優(yōu)選地，第二離子交換樹脂的電導(dǎo)率為約5.0mS/cm，將病毒滅活制品的電導(dǎo)率調(diào)整到約5.0mS/cm。在上述的包括步驟(a)到(f)的方法中，優(yōu)選地該陽離子交換樹脂是與磺酸基連接的基于合成的曱基丙烯酸酯的聚合物樹脂(例如Fractogel),該陰離子交換樹脂是Q瓊脂糖凝膠樹脂，該疏水相互作用柱是苯基瓊脂糖凝膠柱。優(yōu)選地，經(jīng)HCPELISA測定，第一洗脫物包含的HCP比該混合物少約90至約100倍。優(yōu)選地，經(jīng)HCPELISA測定，第一流通物包含的HCP比第一洗脫物少約840至約850倍。優(yōu)選地，經(jīng)HCPELISA測定，第二洗脫物包含的HCP比第一流通物少約3至約5倍。在特別優(yōu)選的一個實施方案中，本發(fā)明的用以從包含抗體和至少一種宿主細胞蛋白質(zhì)(HCP)的混合物生產(chǎn)HCP降低的抗體制品的方法，包括以下步驟(a)將該混合物施加到在平衡緩沖液中的陽離子交換樹脂，其中該陽離子交換樹脂為pH7且施加量大于35克抗體/升樹脂，或者該陽離子交換樹脂的pH在pH5至pH7的范圍且施加量約為35至約70克抗體/升樹脂，或者該陽離子交換樹脂為pH5且施加量大于70克抗體/升樹脂；(b)以包括第一次洗滌和第二次洗滌的洗滌步驟>^人該陽離子交換樹脂洗滌HCP,該第一次洗滌采用平衡緩沖液，該第二次洗滌采用洗脫緩沖液和水的混合物；(C)用該洗脫緩沖液從該陽離子交換樹脂洗脫該抗體，以形成第一洗脫物；(d)將第一洗脫物進行病毒滅活步驟，其中病毒滅活是通過pH病毒滅活來實現(xiàn)，以形成病毒滅活制品；(e)將所得病毒滅活制品施加到陰離子交換樹脂，其中在將該病毒滅活制品施加到陰離子交換樹脂前，將該病毒滅活制品的pH和電導(dǎo)率調(diào)整到與該陰離子交換樹脂的pH和電導(dǎo)率基本相似，由此獲得第一流通物；和(f)將第一流通物施加到疏水相互作用柱，由此獲得第二洗脫物；從而獲得HCP降低的抗體制品。優(yōu)選地，該抗體混合物在凈皮施加到該陽離子交換樹脂前未曾#皮施以A蛋白捕捉。優(yōu)選地，洗脫緩沖液和水的混合物包含約40-50%洗脫緩沖液和約50-60°/。水，更優(yōu)選約45%洗脫緩沖液和約55%水(例如WFI)。在一個優(yōu)選的實施方案中，洗脫緩沖液包含20mM磷酸鈉和150mM氯化鈉。在這個情況中，其中含45%洗脫緩沖液和約55%水的洗脫緩沖液和水混合物，是9mM磷酸鈉和68mM氯化鈉。在一個優(yōu)選的實施方案中，第一次洗滌是用包含20mM磷酸鹽、25mM氯化鈉的平衡緩沖液進行，第二次洗滌是用包含9mM磷酸鹽、68mM氯化鈉的緩沖液(45%洗脫緩沖液、55%水)進行，洗脫緩沖液包含20mM磷酸鹽、150mM氯化鈉。優(yōu)選地，經(jīng)HCPELISA測定，第一洗脫物包含的HCP比該混合物少約90至約100倍。優(yōu)選地，經(jīng)HCPELISA測定，第一流通物包含的HCP比第一洗脫物少約840至約850倍。優(yōu)選地，經(jīng)HCPELISA測定，第二洗脫物包含的HCP比第一流通物少約3至約5倍。在任何上述純化方法的一個優(yōu)選方面，HCP包含組織蛋白酶L酶原，由此獲得組織蛋白酶L酶原降低的抗體制品。優(yōu)選地，經(jīng)組織蛋白酶L動力學(xué)測定法測定，洗脫物包含的組織蛋白酶L活性為約25至約60RFU/s/mg抗體。優(yōu)選地，經(jīng)組織蛋白酶L動力學(xué)測定法測定，第一流通物包含的組織蛋白酶L活性為約0.4至約4RFU/s/mg抗體。優(yōu)選地，經(jīng)組織蛋白酶L動力學(xué)測定法測定，第二洗脫物包含的組織蛋白酶L活性為約0.5至約1.5RFU/s/mg抗體。優(yōu)選地，組織蛋白酶L酶原的水平有重現(xiàn)性地低下。在還另一方面，本發(fā)明涉及用以從包含抗體和至少一種宿主細胞蛋白質(zhì)(HCP)的混合物生產(chǎn)HCP降低的抗體制品的方法，所述方法包括以下步驟(a)將該混合物施加到陽離子交換樹脂，以獲得第一洗脫物；(b)將第一洗脫物施加到陰離子交換樹脂，以獲得第一流通物；和(c)使第一流通物通過疏水相互作用柱，由此獲得第二洗脫物；從而獲得HCP降低的抗體制品。優(yōu)選地，包含抗體和至少一種HCP的該混合物在被施加到第一離子交換樹脂前不被施以A蛋白捕捉。優(yōu)選地，該方法還包括在將第一洗脫物施加到該陰離子交換樹脂前，將第一洗脫物進行病毒滅活步驟。例如，病毒滅活可通過pH病毒滅活來實現(xiàn)。優(yōu)選地，該陽離子交換樹脂包含與磺酸基連接的基于合成的曱基丙烯酸酯的聚合物樹脂(例如該陽離子交換樹脂可以是FractogelS柱)。例如，F(xiàn)ractogelS柱可用包含20mM磷酸鈉、25mM氯化鈉的平衡緩沖液平衡，可將該混合物施加到該柱，該柱可用平衡緩沖液至少洗滌一次，第一洗脫物可通過用包含20mM磷酸鈉、150mM氯化鈉的洗脫緩沖液洗脫來獲得。優(yōu)選地，陰離子交換樹脂是Q瓊脂糖凝膠柱。例如，Q瓊脂糖凝膠柱可用包含25mM三乙醇胺、40mM氯化鈉(pH7.6)的平衡緩沖液平衡。優(yōu)選地，該疏水相互作用柱是苯基瓊脂糖凝膠柱。例如，苯基瓊脂糖凝膠柱可用包含20mM磷酸鈉、1.1M(NH4)2S04(pH7)的平衡緩沖液平衡，可將第一流通物施加到該柱，該柱可用平衡緩沖液至少洗滌一次，第二洗脫物可通過進行鹽不連續(xù)梯度至11mM磷酸鈉、0.62521M(NH4)2S04(pH7.0)來獲得。優(yōu)選地，pH病毒滅活是通過將第一洗脫物維持在pH3.5大約1小時來實現(xiàn)。在還另一方面，本發(fā)明涉及用以從包含阿達木單抗和至少一種宿主細胞蛋白質(zhì)(HCP)的混合物生產(chǎn)HCP降低的阿達木單抗制品的方法，所述方法包括以下步驟(a)將該混合物施加到陽離子交換樹脂，其中該混合物在被施加到第一離子交換樹脂前不被施以A蛋白捕捉，以獲得第一洗脫物；，(b)將第一洗脫物施以pH病毒滅活，以獲得病毒滅活制品；(c)將該病毒滅活制品施加到陰離子交換樹脂，以獲得第一流通物；和(d)使第一流通物通過疏水相互作用柱，由此獲得第二洗脫物；從而獲得HCP降低的阿達木單抗制品。優(yōu)選地，該陽離子交換樹脂是FractogelS柱，該陰離子交換樹脂是Q瓊脂糖凝膠柱，該疏水相互作用柱是苯基瓊脂糖凝膠柱。例如，F(xiàn)ractogelS柱可用包含20mM磷酸鈉、25mM氯化鈉的平衡緩沖液平衡，可將該混合物施加到該柱，該柱可用平衡緩沖液至少洗滌一次，第一洗脫物可通過用包含20mM磷酸鈉、150mM氯化鈉的洗脫緩沖液洗脫來獲得。還例如，Q瓊脂糖凝膠柱可用包含25mM三乙醇胺、40mM氯化鈉(pH7.6)的平衡緩沖液平衡。還例如，苯基瓊脂糖凝膠柱可用包含20mM磷酸鈉、1.1M(NH4)2S04(pH7)的平衡緩沖液平衡，可將第一流通物施加到該柱，該柱可用平衡緩沖液至少洗滌一次，第二洗脫物可通過進行鹽不連續(xù)梯度至11mM磷酸鈉、0.625M(NH4)2SO4(pH7.0)來獲得。還例如，pH病毒滅活可通過將第一洗脫物維持在pH3.5大約1小時來實現(xiàn)。對于所有上述純化方法，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，該抗體是抗腫瘤壞死因子-a(TNFa)抗體或其抗原結(jié)合部分。在一個實施方案中，抗TNPa抗體或其抗原結(jié)合部分是嵌合抗體、人源化抗體或多價抗體。在一個實施方案中，抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是英夫利昔單抗(infliximab)或golimumab。在另一個實施方案中，抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是人抗體。在一個實施方案中，抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是這樣的分離人抗體，它以1xl(T8M或以下的Kd和1xl(T3s"或以下的Koff速率常數(shù)(均用表面等離振子共振進行測定)乂AATNFa上解離下來，在標準的體外L929測定中以1x10_7M或以下的ICso中和人TNFa細胞毒性。在另一個實施方案中，抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是具有以下特征的分離人抗體a)以1x1(^s"或以下的Koff速率常數(shù)從人TNFa上解離下來，該參數(shù)是由表面等離振子共振法測出；b)具有包含SEQIDNO:3氨基酸序列或者從SEQIDNO:3修飾而成的氨基酸序列的輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，該修飾是位置1、4、5、7或8處的單一丙氨酸置換或者位置1、3、4、6、7、8和/或9處的一至五個保守氨基酸置換；c)具有包含SEQIDNO:4氨基酸序列或者從SEQIDNO:4修飾而成的氨基酸序列的重鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，該修飾是位置2、3、4、5、6、8、9、10或11處的單一丙氨酸置換或者位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12處的一至五個保守氨基酸置換。在又另一個實施方案中，抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是這樣的分離人抗體，它的輕鏈可變區(qū)(LCVR)包含SEQIDNO:1氨基酸序列，重鏈可變區(qū)(HCVR)包含SEQIDNO:2氨基酸序列。在還另一個實施方案中，抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是阿達木單抗。本發(fā)明提供用本發(fā)明的任何方法生產(chǎn)的、經(jīng)HCPELISA測定基本上不含HCP的抗體制品。本發(fā)明還提供包含用本發(fā)明的任何方法生產(chǎn)的HCP降低的抗體制品和藥物可接受載體的藥物組合物。本發(fā)明包括包含HCP降低的抗體和藥物可接受載體的藥物組合物，其中經(jīng)HCPELISA測定，HCP的水平不超過約70ngHCP/mg抗體。在一個實施方案中，經(jīng)HCPELISA測定，HCP的水平不超過約13ngHCP/mg抗體。在另一個實施方案中，經(jīng)HCPELISA測定，HCP的水平不超過約5ngHCP/mg抗體。本發(fā)明提供包含抗體的組合物，其中經(jīng)HCPELISA測定，所述組合物沒有可#全測水平的HCP。本發(fā)明還提供用本文描述的任何方法生產(chǎn)的、基本上不含組織蛋白酶L酶原的抗體制品。本發(fā)明還包括包含用本文描述的任何方法生產(chǎn)的組織蛋白酶L酶原降低的抗體制品和藥物可接受載體的藥物組合物。本發(fā)明提供包含組織蛋白酶L酶原降低的抗體和藥物可接受載體的藥物組合物，其中組織蛋白酶L酶原的水平不超過約3.0RFU/s/mg抗體的組織蛋白酶活性。對于所有上述抗體制品和藥物組合物，優(yōu)選的該抗體是抗腫瘤壞死因子-a(TNFa)抗體或其抗原結(jié)合部分。在一個實施方案中，抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分選自人源化抗體、嵌合抗體或多價抗體的抗體。在一個實施方案中，抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是英夫利昔單抗或golimumab。在另一個實施方案中，抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是人抗體。在一個實施方案中，抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是這樣的分離人抗體，它以1x10-8M或以下的Kd和1xl(T3s"或以下的K。ff速率常數(shù)(均用表面等離振子共振進行測定)從人TNFa上解離下來，在標準的體外L929測定中以1x10-7M或以下的IC5o中和人TNFa細胞毒性。在另一個實施方案中，抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是具有以下特征的分離人抗體a)以lxl(T、"或以下的Koff速率常數(shù)從人TNFa上解離下來，這是由表面等離振子共振測出；b)具有包含SEQIDNO:3氨基酸序列或者從SEQIDNO:3修飾24而成的氨基酸序列的輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，該修飾是位置1、4、5、7或8處的單一丙氨酸置換或者位置1、3、4、6、7、8和/或9處的一至五個保守氨基酸置換；c)具有包含SEQIDNO:4氨基酸序列或者從SEQIDNO:4修飾而成的氨基酸序列的重鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，該修飾是位置2、3、4、5、6、8、9、10或11處的單一丙氨酸置換或者位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12處的一至五個保守氨基酸置換。在又另一個實施方案中，抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是這樣的分離人抗體，它的輕鏈可變區(qū)(LCVR)包含SEQIDNO:1氨基酸序列，重鏈可變區(qū)(HCVR)包含SEQIDNO:2氨基酸序列。在還另一個實施方案中，抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是阿達木單抗。本發(fā)明包括治療其中TNFa活性有害的疾病的方法，所述方法包括將包含用本發(fā)明任何方法獲得的抗體的藥物組合物給予人受試者。在一個實施方案中，將該制劑長時間給予人受試者。在一個實施方案中，該長時間包括至少約3個月，至少約4個月或至少約5個月。在一個實施方案中，該其中TNFa活性有害的疾病選自自身免疫疾病、腸道疾病和皮膚疾病。在一個實施方案中，自身免疫疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性脊推炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、過敏癥、多發(fā)性硬化、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、自身免疫性糖尿病、自身免疫性色素層炎、腎病綜合征和青年期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在另一個實施方案中，腸道疾病是節(jié)段性回腸炎。在又另一個實施方案中，皮膚疾病是牛皮癬。在一個實施方案中，將該藥物組合物與另外的治療劑進行組合給予。在一個實施方案中，該另外的治療劑是曱氨喋呤。本發(fā)明包括治療其中TNFa活性有害的疾病的方法，所述方法包括將包含用本發(fā)明任何方法獲得的抗體的藥物組合物給予人受試者。在一個實施方案中，將該制劑長時間給予人受試者。在一個實施方案中，該長時間包括至少約3個月，至少約4個月或至少約5個月。在一個實施方案中，該其中TNFa活性有害的疾病選自自身免疫疾病、腸道疾病和皮膚疾病。在一個實施方案中，自身免疫疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性脊推炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、過敏癥、多發(fā)性硬化、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、自身免疫性糖尿病、自身免疫性色素層炎、腎病綜合征和青年期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在一個實施方案中，腸道疾病是節(jié)段性回腸炎。在一個實施方案中，皮膚疾病是牛皮癬。在一個實施方案中，將該藥物組合物與另外的治療劑進行組合給予。在一個實施方案中，該另外的治療劑是曱氨喋呤。本發(fā)明提供包含包裝材料、阿達木單抗和標簽或包裝插頁的制造品(articleofmanufacture),該標簽或包裝插頁裝在該包裝材料當中，說明該阿達木單抗制劑(formulation)包含不超過約70ngHCP/mg阿達木單抗。在一個實施方案中，該約70ngHCP/mg阿達木單抗是通過HCPELISA來測量。本發(fā)明還提供包含包裝材料、阿達木單抗和標簽或包裝插頁的制造品，該標簽或包裝插頁裝在該包裝材料當中，說明該阿達木單抗制劑包含不超過約13ngHCP/mg阿達木單抗。在一個實施方案中，該約13ngHCP/mg阿達木單抗是通過HCPELISA來測量。本發(fā)明還提供包含包裝材料、阿達木單抗和標簽或包裝插頁的制造品，該標簽或包裝插頁裝在該包裝材料當中，說明該阿達木單抗制劑包含不超過約5ngHCP/mg阿達木單抗。在一個實施方案中，該約5ngHCP/mg阿達木單抗是通過HCPELISA來測量。本發(fā)明還提供包含包裝材料、阿達木單抗和標簽或包裝插頁的制造品，該標簽或包裝插頁裝在該包裝材料當中，說明該阿達木單抗制劑包含的組織蛋白酶L酶原水平不超過約3.0RFU/s/mg阿達木單抗的組織蛋白酶L活性所指示的水平。在一個實施方案中，組織蛋白酶L活性是通過組織蛋白酶L動力學(xué)測定法來測量。本發(fā)明還提供用以測定衍自哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的材料中組織蛋白酶L酶原的量的動力學(xué)測定法，該測定法包括使該衍自哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的材料與酶接觸，以將組織蛋白酶L酶原加工成活性組織蛋白酶L形式，由此獲得組織蛋白酶L樣品；將該組織蛋白酶L樣品與組織蛋白酶L的底物接觸；和測定該組織蛋白酶L樣品中的組織蛋白酶L活性，作為該衍自哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的材料中組織蛋白酶L酶原的量的指標。在一個實施方案中，該哺乳動物細胞表達系統(tǒng)是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在另一個實施方案中，該加工組織蛋白酶L酶原的酶是肽鏈內(nèi)切酶。在又另一個實施方案中，該組織蛋白酶L的底物包含標記(label)。在又另一個實施方案中，該標記是熒光劑。在一個實施方案中，該熒光劑包含熒光7-氨基-4-曱基香豆素(AMC)基團。在一個實施方案中，該組織蛋白酶L的底物包含Z-亮氨酸-精氨酸。在又另一個實施方案中，該Z-亮氨酸-精氨酸包含AMC基團。附圖簡述圖1A和1B顯示了每個工藝的FractogelS層析步驟的典型洗脫曲線，包括本發(fā)明的工藝(圖1A)和工藝A(圖1B)。圖2A和2B顯示了Q瓊脂糖凝膠FF層析步驟的流通物洗滌曲線的比較，包括本發(fā)明的工藝(圖2A)和工藝A(圖2B)。圖3A和3B顯示了苯基瓊脂糖凝膠HP層析步驟的洗脫曲線的比較，包括工藝B(圖3A)和工藝A(圖3B)。圖4圖示了平均工藝B(菱形)和平均工藝A(正方形)的組織蛋白酶L酶原逐步降低。圖5圖示了平均工藝B(菱形)和工藝A(正方形)的HCP逐步降^f氐。圖6顯示出活化的工藝中(in-process)樣品的動力學(xué)讀數(shù)指示了反應(yīng)時間與熒光信號的線性關(guān)系。發(fā)明詳述I.定義為了更容易地理解本發(fā)明，首先對某些術(shù)語進行定義。本文所用的術(shù)語"混合物"指待進行純化的有粘度材料，該材料中包含有待從可能也存在于其中的其他物質(zhì)中純化出來的至少一種目的抗體。材料可以是例如水溶液、有機溶劑體系或者水/有機溶劑混合物或溶液?；旌衔锿前S多生物分子(如蛋白質(zhì)、抗體、激素和病毒)、小分子(如鹽、糖、脂質(zhì)等)甚至顆粒狀物質(zhì)的復(fù)雜混合物或溶液。雖然生物來源的典型混合物可能一開始是水溶液或水懸浮液，但它也可能含有在較早的分離步驟如溶劑沉淀、提取等中使用到的有機溶劑?？赡芎幸子谕ㄟ^本發(fā)明各個實施方案進行純化的有價值生物物質(zhì)的混合物的實例，包括但不限于生物反應(yīng)器的培養(yǎng)物上清液、均化后的細胞懸浮液、血漿、血漿級^f分和奶。所謂從包含抗體和一種或多種物質(zhì)的混合物中"純化"該抗體，是指通過將至少一種物質(zhì)從該混合物中(完全或部分)除去來增加該抗體在該混合物中的純度。該物質(zhì)可以是雜質(zhì)或污染物，如但不限于宿主細胞蛋白質(zhì)(HCP)。術(shù)語"宿主細胞蛋白質(zhì)"或"HCP"指該混合物中的、與目的抗體不同但通常發(fā)源于抗體生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。宜將HCP排除出最終抗體制品。術(shù)語"降低(的)(reduced)"指減少或縮d、物質(zhì)的數(shù)量。降低的制品包括與初始數(shù)量相比具有較少的某物質(zhì)如HCP或組織蛋白酶L酶原的制品。在一個實施方案中，該物質(zhì)是雜質(zhì)或污染物。在一個實施方案中，術(shù)語"降低(的)"是指該物質(zhì)顯著少(substantiallyless)。在另一個實施方案中，術(shù)語"降低(的)"是指沒有該物質(zhì)。在一個實施方案中，沒有某物質(zhì)包括用本文描述的測定法得出"沒有可檢測的量"。術(shù)語"基本上沒有"包括沒有某物質(zhì)，但也可包括有極微量的某物質(zhì)。在一個實施方案中，沒有某物質(zhì)的數(shù)量包括用本文描述的測定法得出"沒有可檢測的量"。術(shù)語"宿主細胞蛋白質(zhì)(HCP)降低的"指這樣的組合物(包括^f旦不限于洗脫物、制品、流通物)，其在一個或多個純化步驟后包含抗體和減少或縮小數(shù)量的HCP。在一個實施方案中，術(shù)語"HCP降低的"是指在包含抗體的組合物中HCP顯著少。在另一個實施方案中，術(shù)語"HCP降低的，，是指在包含抗體的組合物中沒有HCP。在一個實施方案中，術(shù)語"HCP降低的"是指經(jīng)本文描述的測定法測定，在包含抗體的組合物中沒有可檢測量的HCP。術(shù)語"組織蛋白酶L酶原降低的"指這樣的組合物(包括但不限于洗脫物、制品、流通物)，其在一個或多個純化步驟后包含抗體和減少或縮小數(shù)量的組織蛋白酶L酶原。在一個實施方案中，術(shù)語"組織蛋白酶L酶原降低的"是指在包含抗體的組合物中HCP顯著少。在另一個實施方案中，術(shù)語"組織蛋白酶L酶原降低的"是指在包含抗體的組合物中沒有HCP。在一個實施方案中，術(shù)語"組織蛋白酶L酶原降低的"是指經(jīng)本文描述的測定法測定，在包含抗體的組合物中沒有可檢測量的組織蛋白酶L酶原。術(shù)語"有重現(xiàn)性地低下"指一貫地實現(xiàn)減少或縮小的數(shù)量的能力，如至少80%的時間、更優(yōu)選至少90°/。的時間、更優(yōu)選至少95%的時間、甚至更優(yōu)選至少98%的時間實現(xiàn)減少或縮小的數(shù)量的能力。術(shù)語"離子交換分離步驟"指這樣的步驟，在該步驟中，根據(jù)目的抗體和不需要的物質(zhì)或雜質(zhì)(例如HCP或組織蛋白酶L酶原)分別與帶電材料的離子相互作用的差異，將該不需要的物質(zhì)或雜質(zhì)與該目的抗體分離開來。離子交換分離步驟的實例包括但不限于離子交換層析，包括陰離子交換層析和陽離子交換層析。"離子交換材料"指作為將該不需要的物質(zhì)或雜質(zhì)(例如HCP或組織蛋白酶L酶原)與該抗體進行分離的基礎(chǔ)來使用的離子材料。離子交換材料的實例包括陰離子樹脂和陽離子樹脂。"陽離子交換材料"指這樣的離子交換材料，它具有共價結(jié)合的帶負電的配體，并因此具有游離陽離子可供與它所接觸到的溶液中的陽離子進行交換。有多種陽離子交換樹脂為本領(lǐng)域所公知，例如其中共價結(jié)合基團是羧酸根或磺酸根的那些陽離子交換樹脂。市售的陽離子交換樹脂包括CMC-纖維素、SP-SephadexTM和FastS-SepharoseTM(后兩者為Pharmacia市售)。"陰離子交換材料"指具有共價結(jié)合的帶正電基團如季氨基基團的離子交換樹脂。市售的陰離子交換樹脂包括DEAE纖維素、TMAE、QAESephadexTM和FastQ球脂糖凝股tm(后兩者為Pharmacia市售)。所謂將某分子"結(jié)合"到離子交換材料，是指將該分子在適當?shù)臈l件(pH/電導(dǎo)率)下暴露于該離子交換材料，該適當?shù)臈l件會使得該分子借助其與該離子交換材料的(一個或多個)帶電基團之間的離子相互作用可逆地固定化在該離子交換材料之中或之上。術(shù)語"疏水相互作用步驟"指這樣的步驟，在該步驟中，根據(jù)目的抗體和不需要的物質(zhì)或雜質(zhì)(例如HCP或組織蛋白酶L酶原)分別與疏水材料的疏水相互作用的差異，將該不需要的物質(zhì)或雜質(zhì)與該目的抗體分離開來。"疏水相互作用材料"指作為將該不需要的物質(zhì)或雜質(zhì)(例如HCP或組織蛋白酶L酶原)與該抗體進行分離的基礎(chǔ)來使用的疏水材料。疏水相互作用材料的實例包括疏水配體，如具有約2至約8個碳原子的烷基基團，或者芳基基團如苯基。術(shù)語"洗滌"或"洗滌步驟，，包括使適當?shù)木彌_液從給定材料(例如離子交換材料或疏水相互作用材料)之中或之上流過。術(shù)語"多個洗滌步驟"包括超過一個的接連洗滌步驟。接連的緩沖液可具有不同的特性如pH、電導(dǎo)率、溶劑濃度等，這些特性是設(shè)計來將各種類型的與給定材料(例如離子交換材料或疏水相互作用材料)非特異性締合的雜質(zhì)進行解離和除去。在一個實施方案中，該多個洗滌步驟包括中間洗滌，該中間洗滌還包含約40-50°/。洗脫緩沖液。所謂將某分子(例如抗體或污染物質(zhì))從某材料中"洗脫"下來，是指通過改變該材料周圍的緩沖液從而降低該分子與該材料的相互作用，來將該分子從該材料除去。在一個實施方案中，將抗體從離子交換柱上洗脫下來，其中緩沖液與該抗體竟爭該離子交換材料上的帶電30位點。術(shù)語"洗脫物"指這樣的包含分子(例如抗體或污染物質(zhì))的液體，它是在使目的抗體與層析材料結(jié)合并加入洗脫緩沖液來解離該抗體后獲得的。洗脫物可針對純化過程中的步驟來說明。例如，術(shù)語"第一洗脫物"指第一層析步驟的洗脫物，術(shù)語"第二洗脫物"指第二層^"步驟的洗脫物，依此類4偉。術(shù)語"流通物"指這樣的包含分子(例如抗體或污染物質(zhì))的液體，它是通過使包含該分子的混合物通過層析材料以使該分子通過該材料而不發(fā)生結(jié)合來獲得的。"緩沖液"指這樣的物質(zhì)，由于它在溶液中的存在，使得為引起單位pH變化所必需加入的酸或堿的數(shù)量要增加。緩沖溶液是通過其酸-堿共輒物成分的作用來抵抗pH變化的。用于生物試劑的緩沖溶液通常能夠維持恒定濃度的氫離子，4吏得溶液的pH在生理范圍內(nèi)。傳統(tǒng)的緩沖成分包括但不限于有機和無機的鹽、酸和堿。示例性的用于純化生物分子(例如抗體)的緩沖液，包括兩性離子緩沖液或"Good"緩沖液，參見例如Goodetal.(1966)所oc/zew/s吵5:467和GoodandIzawa(1972)MeAoA五"^ywo/.24:62。示例性的緩沖液包括但不限于TES、MES、PIPES、HEPES、MOPS、MOPSO、TRIC腿和BIC躍。本文所用的"洗滌緩沖液"在本文中均指用以從結(jié)合有抗體的給定材料(例如離子交換材料或疏水相互作用材料)帶走雜質(zhì)的物質(zhì)。"洗脫緩沖液"指用以將抗體從經(jīng)一種或多種洗滌物質(zhì)洗滌過的給定材料(例如離子交換材料或疏水相互作用材料)解離下來的物質(zhì)。洗脫緩沖液起到解離抗體的作用。典型的洗脫物質(zhì)是本領(lǐng)域公知的，它們可具有較高濃度的鹽、游離親和配體或類似物或者其他能促進靶物質(zhì)(例如抗體)從給定材料的解離的物質(zhì)。洗脫緩沖液的電導(dǎo)率和/或pH使得該抗體從該離子交換材料或疏7K相互作用材料洗脫下來。術(shù)語"電導(dǎo)率"指水溶液在兩個電極之間傳導(dǎo)電流的能力。在溶液中，電流是通過離子運輸而流動。因此，水溶液中存在越多的離子，31溶液就會有越高的電導(dǎo)率。電導(dǎo)率的測量單位是mmhos(mS/cm)，可用例如Orion出售的電導(dǎo)率儀進行測量。溶液的電導(dǎo)率可通過改變其中的離子濃度來改變。例如，可改變?nèi)芤褐械木彌_劑的濃度和/或鹽(e.g.NaCl或KC1)的濃度，以達到所需的電導(dǎo)率。在一個實施方案中，對層析中所用的洗滌緩沖液或任何其他水溶液的鹽濃度進行改變，以達到縮小的電導(dǎo)率。多肽如抗體的"pl"或"等電點"指該多肽的正電荷與其負電荷平衡時的pH，可從該多肽的氨基酸殘基的凈電荷來計算，或者可通過等電聚焦來測定。術(shù)語"病毒滅活，，包括使混合物中所含的病毒失去功能，或者將病毒從待純化的混合物中除去。該病毒可發(fā)源于抗體生產(chǎn)、下游加工步驟或制造環(huán)境。使病毒失去功能或除去病毒的方法包括熱滅活、pH滅活、化學(xué)滅活劑等。術(shù)語"pH病毒滅活，，包括使病毒經(jīng)受某足以使它失去功能的pH。本文所用的術(shù)語"人TNFa"(本文縮寫為hTNFa,或簡稱hTNF)，意指以17kD分泌形式和26kD膜締合形式存在的人細胞因子，其生物活性形式由非共價結(jié)合的17kD分子的三聚體構(gòu)成。hTNFa的結(jié)構(gòu)在例如Pennica，D.等，(1984)Nature312:724-729;Davis,J.M.等，(1987)Biochemisty26:1322-1326和Jones，E,Y.等，(1989)Nature338:225-228中有進一步的描述。術(shù)語人TNFa意在包括重組人TNFa(rhTNFa)，其能通過標準重組表達方法來制備或者能商業(yè)購得(R&DSystems,CatalogNo,210畫TA，Minneapolis,MN)。TNFot也《爾作TNF。本文所用的術(shù)語"抗體"意指由四個多肽鏈即兩個重鏈(H)和兩個輕鏈(L)通過二硫鍵相互連接構(gòu)成的免疫球蛋白分子。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(本文縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)構(gòu)成。重鏈恒定區(qū)由CH1、CH2和CH3三個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)構(gòu)成。輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域CL構(gòu)成。VH區(qū)和VL區(qū)可以進一步細分為稱作互補決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)，這些高變區(qū)被稱作構(gòu)架區(qū)(FR)的更為保守的區(qū)所中斷。每個VH和VL由三個CDR和四個FR構(gòu)成，從氨基末端至羧基末端按以下順序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本發(fā)明的抗體在美國專利6,090,382、6,258,562和6,509,015中有進一步詳細描述，每個專利通過引用整體結(jié)合到本文中。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體是能干擾TNFa活性的抗TNFa抗體?？筎NFa抗體的實例包括但不限于抗TNFa人抗體和本文描述的抗體部分，以及美國專利6,090,382、6,258,562和6,509,015和美國專利申請系列號09/801185和10/302356中描述的那些抗體和抗體部分，每個專利和專利申請通過引用結(jié)合到本文中。在一個實施方案中，用于本發(fā)明的TNFa抑制劑是抗TNPa抗體或其片段，包括英夫利昔單抗(Remicade⑧，JohnsonandJohnson;在美國專利5,656,272中描述，該專利通過引用結(jié)合到本文中)、CDP571(人源化的單克隆抗TNFa抗體片段)、抗TNFdAb(Peptech)、CNTO148(golimumab;MedarexandCentocor)、WO02/12502中描述的抗體，和阿達木單抗(Humira⑧AbbottLaboratories,一種人抗TNFmAb,在US6,090,382中描述為D2E7)?？捎糜诒景l(fā)明的另外的抗體或其片段描述于美國專利6,593,458、6,498,237、6,451,983和6,448,380,每個專利通過引用結(jié)合到本文中。該術(shù)語包括"目的抗體"，是作為本發(fā)明方法的目標的抗體。本文所用的術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"(或簡稱"抗體部分")，指抗體的一個或幾個保留與抗原(例如hTNPot)特異性結(jié)合的能力的片段。已經(jīng)證明抗體的抗原結(jié)合功能可通過全長抗體的片段來實現(xiàn)?？贵w的"抗原結(jié)合部分"這個術(shù)語所涵蓋的結(jié)合片段的例子包括(i)Fab片段，是由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，是由兩個Fab片段通過鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接而構(gòu)成的二價片段；(iii)由VH和CHI結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature341:544-546)，由VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；和(vi)分離的互補決定區(qū)(CDR)。此外，雖然Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域VL和VH是由不同的基因所編碼，但是可使用重組方法通過合成的接頭將它們連接起來，所述接頭使得它們變成為單一的蛋白質(zhì)鏈，其中VL區(qū)和VH區(qū)配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv);參見例如Bird等(1988)Science242:423-426和Huston等(1988)Proc.Nat1.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。這樣的單鏈抗體也要被涵蓋在抗體的"抗原-結(jié)合部分"這個術(shù)語中。其他形式的單鏈抗體如雙抗體(diabody)也涵蓋在內(nèi)。雙抗體是二價的雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域在單一多肽鏈上表達，但是所使用的接頭短得不能讓同一鏈上的這兩個結(jié)構(gòu)域之間發(fā)生配對，從而迫使這兩個結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域發(fā)生配對，產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點(參見例如Holliger,P.等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448;Poljak,R.J.等，(1994)Structure2:1121-1123)。本發(fā)明的抗體部分在美國專利6,090,382、6,258,562和6,509,015中有進一步的詳細描述，每個專利通過引用結(jié)合到本文中。結(jié)合片段是通過重組DNA技術(shù)來生產(chǎn)，或者通過完整免疫球蛋白的酶促或化學(xué)切割來產(chǎn)生。結(jié)合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc、Fv、單鏈和單鏈抗體。與"雙特異性"或"雙功能，，免疫球蛋白或抗體不同，免疫球蛋白或抗體祐Li人為其每個結(jié)合位點是相同的。"雙特異性"或"雙功能抗體"是人造雜合抗體，具有兩個不同的重鏈/輕鏈對和兩個不同的結(jié)合位點。雙特異性抗體可通過多種方法來制備，包括雜交瘤的融合或Fab'片l殳的連4妄。參見例如Songsivilai&Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990);Kostelny等，J.Immunol.148，1547-1553(1992)。本文所用的"保守的氨基酸置換"是其中一個氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的另一個氨基酸殘基所置換的置換作用。本領(lǐng)域已經(jīng)確定了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族，包括堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，P-分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。"嵌合抗體"指這樣的抗體，其中重鏈和輕鏈的每個氨基酸序列的一部分與衍自特定物種或?qū)儆谔囟悇e的抗體中的相應(yīng)序列同源，而所述鏈的其余區(qū)段與另一物種的相應(yīng)序列同源。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及這樣的嵌合抗體或抗原結(jié)合片段，其中輕鏈和重鏈的可變區(qū)都模擬衍自一種哺乳動物物種的抗體的可變區(qū)，而恒定區(qū)則與衍自另一種物種的抗體中的序列同源。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，嵌合抗體是通過將小鼠抗體的CDR嫁接到人抗體的構(gòu)架區(qū)上而制備的。"人源化抗體"指包含至少一條這樣的鏈的抗體，該鏈包含基本上來自人抗體鏈(稱為受體方免疫球蛋白或抗體)的可變區(qū)構(gòu)架殘基和至少一個基本上來自非人抗體(例如小鼠)的互補決定區(qū)(CDR)。除了CDR的嫁接外，人源化抗體通常進行進一步的改造以改進親和力和/或免疫原性。術(shù)語"多價抗體"指包含超過一個抗原識別位點的抗體。例如，"二價，，抗體具有兩個抗原識別位點，而"四價，，抗體具有四個抗原識別位點。術(shù)語"單特異性"、"雙特異性"、"三特異性"、"四特異性，，等指多價抗體中存在的不同抗原識別位點特異性的數(shù)量(與抗原識別位點的數(shù)量相對)。例如，"單特異性"抗體的抗原識別位點都結(jié)合相同的表位。"雙特異性"或"二元特異性，，抗體具有至少一個結(jié)合第一表位的抗原識別位點，和至少一個結(jié)合不同于第一表位的第二表位的抗原識別位點。"多價單特異性"抗體具有都結(jié)合相同的表位的多個抗原識別位點。"多價雙特異性"抗體具有多個抗原識別位點，其中一些結(jié)合第一表位，另一些結(jié)合不同于第一表位的第二表位。本文所用的術(shù)語"人抗體，，意在包括具有衍自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可以包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨機或位點特異性誘變引入的突變或者通過體內(nèi)體細胞突變引入的突變)，例如在CDR中，特別是在CDR3中。然而，本文所用的術(shù)語"人抗體"不意在包括其中衍自另一個哺乳動物物種(如小鼠)的種系的CDR序列已被嫁接到人構(gòu)架序列上的抗體。本文所用的術(shù)語"重組人抗體"意在包括所有通過重組方法制備、表達、產(chǎn)生或分離的人抗體，例如使用轉(zhuǎn)染到宿主中的重組表達載體表達的抗體(下文進一步描述)，從重組、組合人抗體文庫分離的抗體(下文進一步描述)，從轉(zhuǎn)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)分離的抗體(參見例如Taylor,L.D.等，(1992)Nucl.AcidsRes.20:6287),或者通過涉及到將人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他方法來制備、表達、產(chǎn)生或分離的抗體。這樣的重組人抗體具有衍自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。但是在某些實施方案中，將這種人抗體進行體外誘變(或者當使用轉(zhuǎn)人Ig序列的轉(zhuǎn)基因動物時，進行體內(nèi)體細胞誘變)，因此重組抗體的VH區(qū)和VL區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列，它們雖然衍自人種系VH和VL序列或與之有關(guān)，但可能不天然存在于體內(nèi)人抗體種系庫(antibodygermlinerepertoire)當中。這種嵌合的、人源化的、人的和二元特異性的抗體可通過本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)生產(chǎn)，例如使用以下專利和文獻中描述的方法來生產(chǎn)PCT國際申請PCT/US86/02269;歐洲專利申請184,187;歐洲專利申請171,496;歐洲專利申請173,494;PCT國際公開WO86/01533;美國專利4,816,567;歐洲專利申請125,023;Betteretal(1988)Science240:1041-1043;Liuetal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sd.USA84:3439-3443;Liuetal.(1987)J.Immunol139:3521-3526;Sunetal.(1987)Proc.Natl.Acad.ScLUSA84:214-218;Nishimuraetal.(1987)CancerRes.47:999-1005;Woodetal.(1985)Nature314:446-449;Shawetal.(1988)J.Natl.CancerInst.80:1553-1559);Morrison(1985)Science36229:1202-1207;Oietal.(1986)BioTechniques4:214;美國專利5,225,539;Jonesetal.(1986)Nature321:552-525;Verhoeyanetal.(1988)Science239:1534;和Beidleretal.(1988)J.Immunol.141:4053-4060，Queenetal.，Proc.Natl.Acad.Sd.USA86:10029-10033(1989),US5,530,101、US5,585,089、US5,693,761、US5,693,762、Selicketal，WO90/07861和Winter,US5，225，539。本文所用的"分離抗體"意指基本上脫除了具有不同的抗原特異性的其他抗體的抗體(例如特異性結(jié)合hTNFa的分離抗體基本上脫除了特異性結(jié)合hTNFa之外的抗原的抗體)。但是，特異性結(jié)合hTNFa的分離抗體可能與其他抗原有交叉反應(yīng)性，例如與來自其他物種的TNFa分子(下面進一步詳細討論)。此外，分離抗體可以基本上脫除了其他細胞材料和/或化學(xué)品。本文所用的"中和抗體"(或者"中和hTNFa活性的抗體")意指其與hTNFa的結(jié)合導(dǎo)致hTNFa的生物活性被抑制的抗體。這一對hTNFa的生物活性的抑制，可通過測量hTNFa生物活性的一個或幾個指標來評價，所述指標例如hTNFa誘導(dǎo)的細胞毒性(體外或體內(nèi))、hTNFa諸導(dǎo)的細胞激活和hTNFa與hTNFa受體的結(jié)合。這些hTNFa生物活性的指標可通過本領(lǐng)域公知的幾個標準體外或體內(nèi)測定中的一個或幾個來評價(參見美國專利6,090,382)。優(yōu)選地，通過對L929細胞的hTNFa誘導(dǎo)細胞毒性的抑制，來評價抗體中和hTNFa活性的能力。作為hTNFa活性的附加的或另選的參數(shù)，可評價抗體抑制ELAM-1在HUVEC上的hTNFa誘導(dǎo)表達的能力，作為hTNFa誘導(dǎo)細胞激活的一個量度。本文所用的術(shù)語"表面等離振子共振"指這樣的光學(xué)現(xiàn)象，該現(xiàn)象4吏得可以例如寸吏用BIAcore系統(tǒng)(PharmaciaBiosensorAB,Uppsala,Sweden和Piscataway，NJ)對生物傳感器矩陣當中的蛋白質(zhì)濃度的變化進行檢測，從而對實時生物特異性相互作用進行分析。更多的描述參見美國專利6,258,562的實施例1和Jonsson等(1993)Ann.Biol.Clin.3751:19;J&isson等,(1991)Biotechniques11:620-627;Johnsson等(1995)J.Mol.Recognit.8:125和Johnnson等(1991)Anal.Biochem.198:268。本文所用的術(shù)語"Koff"意指抗體從抗體/抗原復(fù)合體解離的離開(Off)速度常數(shù)。本文所用的術(shù)語"Kd"意指特定抗體-抗原相互作用的解離常數(shù)。本文所用的術(shù)語"IC50"意指抑制生物學(xué)目的終點(如中和細胞毒性活性)所需的抑制劑的濃度。本文所用的術(shù)語"核酸分子"意在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但是優(yōu)選雙鏈DNA。本文針對編碼能結(jié)合hTNFoc的抗體或抗體部分(例如VH、VL、CDR3)的核酸所使用的術(shù)語"分離核酸分子"，意指這樣的核酸分子，其中編碼抗體或抗體部分的核苷酸序列脫除了編碼能結(jié)合hTNFot之外的抗原的抗體或抗體部分的其他核苷酸序列，該其他序列可天然地位于人基因組DNA中的核酸的側(cè)翼。因此例如，本發(fā)明的編碼抗hTNFa抗體的VH區(qū)的分離核酸，不含有編碼能與hTNFa之外的抗原結(jié)合的其他VH區(qū)的其他序列。本文所用的術(shù)語"載體"意指能轉(zhuǎn)運其所連接的另一個核酸的核酸分子。一種類型的載體是"質(zhì)粒"，指的是其中可以連接上另外的區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，其中另外的DNA區(qū)段可以被連接到病毒基因組中。某些載體在其被引入的宿主細胞中能自主復(fù)制(例如具有細菌復(fù)制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如非附加型哺乳動物載體)在導(dǎo)入宿主細胞時能被整合到宿主細胞的基因組中，從而隨宿主基因組被復(fù)制。此外，某些載體能指導(dǎo)其所操作性連接的基因的表達。這樣的載體在本文稱作"重組表達載體"(或者簡稱"表達載體")。一般情況下，適用于重組DNA技術(shù)的表達載體經(jīng)常是質(zhì)粒的形式。在本說明書中，"質(zhì)粒"和"載體，，可以互換使用，因為質(zhì)粒是最常用的載體形式。但是，本發(fā)明意在包括能起著同等功能的其他形式的表達載體，如病毒載體(例如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。本文所用的術(shù)語"重組宿主細胞"(或者簡稱"宿主細胞")，意指其中導(dǎo)入重組表達載體的細胞。應(yīng)認識到，這些術(shù)語意在不僅指特定的受試者細胞，而且還指這樣的細胞的后代。因為由于突變或環(huán)境影響而在后續(xù)世代中可能發(fā)生某些修飾，事實上這樣的后代可能與親代細胞不同，但是仍然包括在本文所用的術(shù)語"宿主細胞"的范圍內(nèi)。本文所用的術(shù)語"藥盒"指包含各成分的包裝產(chǎn)品或制造品。藥盒優(yōu)選包括盛有藥盒的各成分的盒子或容器。盒子或容器中附加有標簽或食品和藥物管理部的批準方案。盒子或容器裝有本發(fā)明的各成分，優(yōu)選裝在塑料、聚乙烯、聚丙烯、乙烯或丙烯容器中。容器可以是帶蓋子的管或瓶。藥盒還可以包括施用本發(fā)明的TNFct抗體的說明書。在一個實施方案中，本發(fā)明的藥盒包括包含有如PCT/IB03/04502和美國申請第10/222140號所述的人抗體D2E7的制劑。本文進一步描述本發(fā)明的各個方面。IL抗體生產(chǎn)本發(fā)明提供從包含抗體和一種或多者HCP的混合物中純化該抗體的方法。初始混合物通常是由抗體的重組生產(chǎn)得到的混合物?；蛘撸跏蓟旌衔锟傻米酝ㄟ^肽合成(或其他合成方法)進行的抗體生產(chǎn)，或者該抗體可從其天然來源純化。為表達本發(fā)明的抗體或抗體部分，將編碼部分或全長輕鏈或重鏈的DNA插入到表達載體中，使得基因被操作性連接到轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。在這個情形中，術(shù)語"操作性連接"指的是抗體基因連接到載體中，使得載體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列能發(fā)揮其調(diào)節(jié)抗體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的預(yù)定功能。選擇表達載體和表達控制序列使之與所用的表達宿主細胞相容?？贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因可以插入單獨的載體中，或者更典型的是兩種基因都插入同一個表達載體中?？贵w基因通過標準的方法插入到表達載體中(如將抗體基因片段上的互補限制性酶切位點與載體相連"l妄，或者如果沒有限制性酶切位點，則進4亍鈍末端連接)。在插入抗體或抗體相關(guān)輕鏈或重鏈序列之前，表達載體可能已經(jīng)攜帶有抗體恒定區(qū)序列。例如，一種將阿達木單抗或阿達木單抗相關(guān)VH序列和VL序列轉(zhuǎn)變成全長抗體基因的方法，就是將它們分別插入到已編碼重鏈恒定區(qū)的表達載體和已編碼輕鏈恒定區(qū)的表達載體中，使得VH區(qū)段操作性連接到載體當中的CH區(qū)段，而VL區(qū)段操作性連接到載體當中的CL區(qū)段。另外，重組表達載體可編碼有助于抗體鏈從宿主細胞中分泌出來的信號肽。可將抗體鏈基因克隆到載體中，使得信號肽符合讀框地連接到(linkedin-frameto)抗體鏈基因的氨基末端。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽，也可以是異源信號肽(即非免疫球蛋白的信號肽)。除了抗體鏈基因外，本發(fā)明的重組表達載體還攜帶能調(diào)控抗體鏈基因在宿主細胞中的表達的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"意指包括能控制抗體鏈基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的啟動子、增強子以及別的表達控制元件(如多聚腺苷酸信號)。這些調(diào)節(jié)序列在例如Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中有描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，表達載體的設(shè)計，包括調(diào)節(jié)序列的選擇，要取決于諸如所選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞、所需蛋白的表達水平等因素。用于哺乳動物宿主細胞表達的優(yōu)選調(diào)控序列，包括能指導(dǎo)蛋白在哺乳動物細胞中的高水平表達的病毒元件，如衍自巨細胞病毒(CMV)(如CMV啟動子/增強子)、猿病毒40(SV40)(如SV40啟動子/增強子)、腺病毒(如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))以及多瘤病毒的啟動子和/或增強子。有關(guān)病毒調(diào)節(jié)元件及其序列的進一步介紹參看例如Stinski的美國專利5,168,062，Bell等的美國專利4,510,245以及Schaffiiet等的美國專利4,968,615。除了抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列外，本發(fā)明的重組表達載體還可攜帶別的序列，如能調(diào)節(jié)載體在宿主細胞中復(fù)制的序列(如復(fù)制起點)以及選擇性標記基因。選擇性標記基因有助于挑選出其中已導(dǎo)入載體的宿主細胞(參看美國專利4,399,216、4,634,665和5,179,017,這三個專利都是Axel等人的)。例如，通常選擇性標記基因能給其中已導(dǎo)入了載體的宿主賦予對藥物如G418、潮霉素或氨曱蝶呤的抗性。優(yōu)選的選擇性標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主細胞中用于氨曱蝶呤選擇/擴增)和neo基因(進行G418選擇)。為了表達輕鏈和重鏈，用標準技術(shù)將編碼重鏈和輕鏈的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞中。不同形式的術(shù)語"轉(zhuǎn)染"意在涵蓋多種常用于將外源DNA導(dǎo)入到原核或真核宿主細胞中的技術(shù)，例如電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染等。盡管從理論上說，本發(fā)明的抗體可以在原核或真核宿主細胞中表達，但最優(yōu)選的是在真核細胞、最優(yōu)選哺乳動物宿主細胞中表達抗體，真核細胞尤其是哺乳動物細胞比原核細胞更可能裝配和分泌正確折疊并具有免疫活性的抗體?？贵w基因在原核細胞中的表達據(jù)報道不能有效地高產(chǎn)率生產(chǎn)活性抗體(Boss,M.A和Wood,C.R(1985)，ImmunologyToday6:12-13)。適用于克隆和表達本文所述載體中的DNA的宿主細胞，是原核生物細胞、酵母細胞或上述的高等真核生物細胞。適用于此目的的原核生物包括真細菌如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌，例如腸桿菌科細菌如埃希氏菌屬細菌(例如大腸桿菌)、腸桿菌屬細菌、歐文氏菌屬細菌、克雷伯氏菌屬細菌、變形菌(Proteus)屬細菌、沙門氏菌屬細菌(例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium))、沙雷氏菌屬細菌(例如Serratiamarcescans)和志賀氏菌屬細菌以及芽孢桿菌屬細菌(如B.subtilis和B.licheniformis(例如1989年4月12日公布的DD266,710中所公開的B.licheniformis41P)、假單胞桿菌屬細菌(如P,aeruginosa),和鏈霉菌。一種優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是E.coli294(ATCC31,446)，不過其他的菌抹E.coliB、E.coliXI776(ATCC31,537)和E.coliW3110(ATCC27,325)如也適合。這些實例是說明性的而非限制性的。除了原核生物外，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是適用于多肽編碼載體的克隆或表達宿主。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或者說普通面包酵母是低等真核宿主微生物當中最常用的。但是，有多種其他的屬、種和抹是易于得到并可用于本發(fā)明的，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe);克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主,例如K.lactis、K.fragilis(ATCC12,424)、K.bulgaricus(ATCC16,045)、K.wickeramii(ATCC24,178)、K.waltii(ATCC56,500)、K.drosophilarum(ATCC36,906)、K.thermotolerans和K.marxianus;亞羅酵母屬(yarrowia)(EP402,226);巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)(EP183,070);假絲酵母屬(Candida);Trichoderraareesia(EP244,234);Neurospomcrassa;許旺酵母屬(Schwanniomyces)如Schwanniomycesoccidentalis,和絲狀真菌如脈孢菌屬(Neurospora)、青霉菌屬(Penicillium)、彎頸霉屬(Tolypocladium)和曲霉屬(Aspergillus)宿主如A.nidulans和A.niger。適用于表達糖基化抗體的宿主細胞衍自多細胞生物。無脊推動物細胞的實例包括植物和昆蟲細胞。在諸如草地貪夜蛾(Spodopterafmgiperda)(毛蟲)、》矣及J趕蟲文(Aedesaegypti)(蟲文子)、白纟丈j尹蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果繩(Drosophilamelanogaster)(果錄)和家蠶(Bombyxmori)的宿主中，已鑒定出多種桿狀病毒毒林和變體及相應(yīng)的允許(permissive)昆蟲宿主細胞。有多種轉(zhuǎn)染用病毒抹可公開獲得，例如苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)NPV的L-I抹和家蠶(Bombyxmori)NPV的Bm-5株，這種病毒可用作本發(fā)明的病毒，特別是用于轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)細胞。棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、西紅柿和煙草的植物細胞培養(yǎng)物也可用作宿主?！鰞?yōu)選用于表達本發(fā)明重組抗體的哺乳動物宿主細胞，包括中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)(包括dhfr-CHO細胞，在UrlaubandChasin，(1980)PNASUSA77:4216-4220中描述，與例如KaufmanandSharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中描述的DHFR選4奪性標記一起4吏用)、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞和SP2細胞。當編碼抗體基因的重組表達載體被導(dǎo)入到哺乳動物宿主細胞中時，通過將宿主細胞培養(yǎng)一段時間來生產(chǎn)抗體，該段時間足以使抗體得以在宿主細胞中表達，或者更優(yōu)選地使抗體得以分泌到宿主細胞生長的培養(yǎng)基中。有用的哺乳動物宿主細胞系的其他實例有被SV40(COS-7，ATCCCRL1651)轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細胞系；人胚胎腎細胞系(被亞克隆以在懸浮培養(yǎng)物中生長的293或293細胞，Grahametal"J,GenVirol.36:59(1977》;幼倉鼠腎細胞(BHK,ATCCCCL10);中國倉鼠卵巢細胞ADHFR(CHO,Urlaubetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980));小鼠Sertoli細胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980));猴腎細胞(CVlATCCCCL70);非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宮頸癌細胞(HELA,ATCCCCL2);犬腎細胞(MDCK,ATCCCCL34);布法羅大鼠肝細胞(BRL3A,ATCCCRL1442);人肺細胞(W138，ATCCCCL75);人肝細胞(HepG2,HB8065);小鼠乳腺腫瘤細胞(MMT060562，ATCCCCL51);TRI細胞(Matheretal"AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982));MRC5細胞；FS4細胞和人肝癌細胞系(HepG2)。用上述抗體生產(chǎn)用的表達或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，并將宿主細胞在經(jīng)適當改進而可誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴增編碼所需序列的基因的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。用來生產(chǎn)抗體的宿主細胞可在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。市售的培養(yǎng)基如Ham'sFIO(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基((MEM),(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改進分Eagle培養(yǎng)基((DMEM),Sigma)適用于培養(yǎng)宿主細胞。另外，在以下文獻和專利中描述的任何培養(yǎng)基都可用作宿主系的培養(yǎng)基Hametal.,Meth.Enz.58:44(1979),Barnesetal.,Anal.Biochem.102:255(1980),美國專利4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655或5,122,469;WO90/03430;WO87/00195或美國專利Re.30,985。任何這些培養(yǎng)基都可按需補充激素和/或其他生長因子(如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(如氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂和磷酸鹽)、緩沖液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如慶大霉素藥物)、痕量元素(定義為通常以毫摩爾級的最終濃度存在的無機化合物)和葡萄糖或等價的能源。任何其他必需的補充物也可按本領(lǐng)域技術(shù)人員會知道的適當濃度加入。培養(yǎng)條件如溫度、pH等是之前用于選定進行表達的宿主細胞的那些條件，它們是普通技術(shù)人員顯而易見的。宿主細胞也可用來產(chǎn)生完整抗體的部分，如Fab片段或scFv分子。應(yīng)認識到，上述方法的修改方案也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，可能宜用編碼本發(fā)明抗體的輕鏈或重鏈(但不是同時編碼兩者)的DNA來轉(zhuǎn)染宿主細胞。也可利用重組DNA技術(shù)，來去掉編碼輕鏈或重鏈或兩者的DNA中對結(jié)合hTNFa沒有必要的一些部分或全部。從這種截短的DNA分子表達的分子也涵蓋在本發(fā)明的抗體范圍之內(nèi)。此外，可通過標準的化學(xué)交聯(lián)方法將本發(fā)明的抗體與另一抗體交聯(lián)，來產(chǎn)生雙功能抗體，其中一條重鏈和一條輕鏈屬本發(fā)明的抗體，而另外一條重鏈和輕鏈對hTNFa之外的抗原有特異性。在一個優(yōu)選的進行本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分的重組表達的系統(tǒng)中，通過磷酸4丐介導(dǎo)轉(zhuǎn)染將編碼抗體重鏈和輕鏈的重組表達載體導(dǎo)入dhfr-CHO細胞中。在這個重組表達載體當中，抗體重鏈和輕鏈各自操作性連接到CMV增強子/AdMLP啟動子調(diào)節(jié)元件，以驅(qū)動高水平的基因轉(zhuǎn)錄。重組表達載體還攜帶有DHFR基因，該基因使得可以采用氨甲蝶呤選擇/擴增來選出轉(zhuǎn)染了載體的CHO細胞。將選出的轉(zhuǎn)化宿主細胞進行培養(yǎng)，以使抗體重鏈和輕鏈得以表達，而后從培養(yǎng)基中回收完整抗體。用標準的分子生物學(xué)技術(shù)來制備重組表達載體，轉(zhuǎn)染宿主細胞，選擇轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)宿主細胞和從培養(yǎng)基中回收抗體。本文公開的本發(fā)明重組人抗體，包括阿達木單抗或其抗原結(jié)合部分，或者阿達木單抗相關(guān)抗體，可以通過篩選用人VL和VHcDNA制備的重組組合抗體文庫(優(yōu)選scFv噬菌體展示文庫)進行分離，該人VL和VHcDNA是從衍自人淋巴細胞的mRNA制備的。制備和篩選44這樣的文庫的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。除了市售的用以產(chǎn)生噬菌體展示文庫的試劑盒(例如Pharmacia重組噬菌體抗體系統(tǒng)，目錄號27-9400-01;和StratageneSw/^Z4尸TM噬菌體展示試劑盒，目錄號240612)外，特別適用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫的方法和試劑的實例可見于例如Ladner"美國專利5,223,409;Kang"a/.PCT公開說明書WO92/18619;Dowerda/.PCT公開說明書WO91/17271;WinterdPCT公開說明書WO92/20791;Markland"a/.PCT公開說明書WO92/15679;Breitling"PCT公開說明書WO93/01288;McCaffertyWPCT公開說明書WO92/01047;GarrardWa/.PCT公開說明書WO92/09690;Fuchsda/.(1991)所o/Tec/wo/ogy2:1370-1372;Hay"a/.(1992)//wm^w"6od//j^Wcfowos2:81-85;Huseda/.(1989)5"c/e腳,:1275-1281;McCafferty""/.,淑騰(19卯)M§:552-554;Griffiths"a/.(1993)/1^:725-734;Hawkinsda/.(1992)/Afo/5/o/，:889-896;Clacksonda/.(1991)Atowre巡:624畫628;Gram"a/.(1992)iWAS巡:3576畫3580;Garrard"a/.(1991)所o/7W7"o/，2:1373-1377;Hoogenbooma/.(1991)爿cW12:4133-4137;和Barbas"a/.(1991)/WJS巡:7978-7982。當使用重組技術(shù)時，抗體可胞內(nèi)產(chǎn)生，在周質(zhì)間隙，或者可直4妄分泌到培養(yǎng)基中。如果抗體是胞內(nèi)產(chǎn)生，作為第一個步驟，將顆粒碎片例如通過離心或超濾除去，該顆粒碎片可以是宿主細胞或裂解細胞(例如來自均化操作)。在抗體被分泌到培養(yǎng)基的情況中，通常首先用市售的蛋白質(zhì)濃縮濾器如Amicon或MilliporePellicon超濾組件，將得自這種表達系統(tǒng)的上清液進行濃縮。在進行本發(fā)明方法之前，從細胞碎片純化抗體的程序最初決定于抗體的表達位點。可以使一些抗體直接從細胞分泌到周圍生長培養(yǎng)基中；其他抗體則是胞內(nèi)產(chǎn)生。對于后一類抗體，純化方法的第一個步驟涉及到裂解細胞，這可通過多種方法來進行，包括機械剪切、滲透沖擊或酶法處理。這種破壞作用會使細胞的全部內(nèi)容物釋放到勻漿(homogenate)中，另外還會產(chǎn)生因尺寸小而難以除去的亞細胞碎片。這些通常是通過差速離心或通過過濾來除去。在抗體不分泌到培養(yǎng)基的情況中，通常首先用市售的蛋白質(zhì)濃縮濾器如Amicon或MilliporePellicon超濾組件，將得自這種表達系統(tǒng)的上清液進行濃縮。在抗體被分泌到培養(yǎng)基的情況中，也可例如通過切向流過濾將重組宿主細胞從細胞培養(yǎng)基中分離出來。還可進一步使用本發(fā)明的抗體純化方法，從培養(yǎng)基中回收抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括能以高親和力和低離開速率(offrate)結(jié)合人TNFa、且具有高中和能力的人抗體或其抗原結(jié)合部分。優(yōu)選地，人抗體是重組中和性人抗hTNFa抗體。最優(yōu)選用于本發(fā)明方法的重組中和性抗體在本文中稱為阿達木單抗、Humira⑧和D2E7(D2E7VL區(qū)的氨基斷列如SEQIDNO:1所示；D2E7VH的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示)。D2E7(阿達木單抗；Humira③)的特性在Salfeld等的美國專利6，090，382、6,258,562和6，509，015中已有描述，這三個專利通過引用結(jié)合到本文中。抗TNFa抗體的其他實例包括已進行了有關(guān)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療的臨床試驗的嵌合和人源化的鼠抗hTNFa抗體(參見例如ElliottWa/.(1994)M4:l125-1127;Elliot"a/.(1994)2^4:1105-1110;Rankin"a/.(1995)/i//eMwato/.M:334-342)。在另一個實施方案中，用于本發(fā)明的抗TNFa抗體是英夫利昔單抗(Remicade,JohnsonandJohnson;描述于美國專利5,656,272(通過引用結(jié)合到本文中))、CDPWl(人源化單克隆抗TNF-alphaIgG4抗體)、CDP870(人源化單克隆抗TNF-alpha抗體片l殳)、抗TNFdAb(Peptech)和CNTO148(golimumab;MedarexandCentocor,另參見WO02/12502)。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括阿達木單抗抗體和抗體部分、阿達木單抗相關(guān)抗體和抗體部分以及具有與阿達木單抗同等特性的其他人抗體和抗體部分，所述特性如以低解離動力學(xué)高親和力結(jié)合hTNFa和高中和能力。在一個實施方案中，本發(fā)明提供用這樣的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分進行的治療，該分離人抗體或其抗原結(jié)合部分以1x10-SM或更低的Kd和1x10-3s-l或更低的Koff速率常數(shù)從人TNFa解離下來(這兩個參數(shù)均用表面等離振子共振法測定)，且在體外L929測定中能以1x10_7M或更低的IC50中和人TNFa細胞毒性。更優(yōu)選地，該分離人抗體或其抗原結(jié)合部分以5x10-4s-l或更j氐的Koff、更優(yōu)選1x10_4s-l或更低的K0ff從人TNFa解離下來。更優(yōu)選地，該分離人抗體或其抗原結(jié)合部分在體外L929測定中，以lx10-8m或更低的ic50、甚至更優(yōu)選以1x10-9m或更低的IC50、還更優(yōu)選以1x10-10M或更低的IC50中和人TNFa細胞毒性。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體是分離的人重組抗體或其抗原結(jié)合部分。本領(lǐng)域公知，抗體重鏈和輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域在抗體對抗原的結(jié)合特異性/親和力中起到重要的作用。因此，在另一個方面，本發(fā)明涉及其中該抗體與hTNFa締合的解離動力學(xué)緩慢，且他們所具有的輕鏈和阿達木單抗VLCDR3的位置9可被Ala或Thr占據(jù)而基本上不影響K。ff。因此，阿達木單抗VLCDR3的共有基序包含以下氨基酸序列Q國R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A)(SEQIDNO:3)。另外，阿達木單抗VHCDR3的位置12可被Tyr或Asn占據(jù)而基本上不影響K0ff。因此，阿達木單抗VHCDR3的共有基序包含以下氨基酸序列V-S-Y-L-S-T-A-S曙S-L-D-(Y/N)(SEQIDNO:4)。此外，如美國專利6，090，382的實施例2所證明，阿達木單抗重鏈和輕鏈的CDR3結(jié)構(gòu)域易于進行單一丙氨酸殘基置換(在在VLCDR3當中的位置l、4、5、7或8或者在VHCDR3當中的位置2、3、4、5、6、8、9、lO或ll)而基本上不影響Koff。還進一步地，技術(shù)人員會認識到，鑒于阿達木單抗VL和VHCDR3結(jié)構(gòu)域易于被丙氨酸置換，在CDR3結(jié)構(gòu)域當中還可能進行其他氨基酸置換，同時還保持抗體的低離開(off)速率常數(shù)，所述其他氨基酸置換特別是保守氨基酸置換。優(yōu)選地，在阿達木單抗VL和/或VHCDR3結(jié)構(gòu)域當中進行的保守氨基酸置換不超過一個至五個。更優(yōu)選地，在阿達木單抗VL和/或VHCDR3結(jié)構(gòu)域當中進行的保守氨基酸置換不超過一個至三個。另外，不應(yīng)在對于與hTNFa的結(jié)合而言關(guān)鍵的氨基酸位置進行保守氨基酸置換。阿達木單抗VLCDR3的位置2和5及阿達木單抗VHCDR3的位置1和7似乎對于與hTNFa的相互作用是關(guān)鍵的，因此優(yōu)選不在這些位置進行保守氨基酸置換(盡管如上所述，在阿達木單抗VLCDR3的位置5進行丙氨酸置換是可接受的)(參見美國專利6，090，382)。因此，在另一個實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分優(yōu)選具有以下特征a)以1x10-3s-l或更低的K0ff速率常數(shù)從人TNFa解離下來，該參數(shù)是用表面等離振子共振法測定；b)具有包含SEQIDNO:3氨基酸序列或者從SEQIDNO:3修飾而成的氨基酸序列的輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，該修飾是位置1、4、5、7或8處的單一丙氨酸置換或者位置1、3、4、6、7、8和/或9處的一至五個保守氨基酸置換；c)具有包含SEQIDNO:4氨基酸序列或者從SEQIDNO:4修飾而成的M酸序列的重鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，該修飾是位置2、3、4、5、6、8、9、10或11處的單一丙氨酸置換或者位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12處的一至五個保守氨基酸置換。更優(yōu)選地，該抗體或其抗原結(jié)合部分以5x10-4s-l或更低的K。ff從人TNFa解離下來。甚至更優(yōu)選地，該抗體或其抗原結(jié)合部分以lx10-4s-l或更低的Koff從人TNFa解離下來。在又一個實施方案中，該抗體或其抗原結(jié)合部分優(yōu)選含有這樣的輕鏈可變區(qū)(LCVR)和重鏈可變區(qū)(HCVR)，該LCVR具有包含SEQIDNO:3氨基酸序列或者從SEQIDNO:3修飾而成的氨基酸序列的CDR3結(jié)構(gòu)域，該修飾是位置l、4、5、7或8處的單一丙氨酸置換；該HCVR具有包含SEQIDNO:4氨基酸序列或者從SEQIDNO:4修飾而成的氨基酸序列的CDR3結(jié)構(gòu)域，該修飾是位置2、3、4、5、6、8、9、10或11處的單一丙氨酸置換。優(yōu)選地，LCVR還具有包含SEQIDNO:5氨基酸序列的CDR2結(jié)構(gòu)域(即阿達木單抗VLCDR2),HCVR還具有包含SEQIDNO:6氨基酸序列的CDR2結(jié)構(gòu)域(即阿達木單抗VHCDR2)。甚至更優(yōu)選地，LCVR還具有包含SEQIDNO:7氨基酸序列的CDR1結(jié)構(gòu)域(即阿達木單抗VLCDR1)，HCVR還具有包含SEQIDNO:8氨基酸序列的CDR1結(jié)構(gòu)域(即阿達木單抗VHCDRl)。VL的構(gòu)架區(qū)優(yōu)選來自VkI人神系家族，更優(yōu)選來自A20人種系Vk基因，最優(yōu)選來自美國專利6,090,382的圖IA和IB中所示的阿達木單抗VL構(gòu)架序列。VH的構(gòu)架區(qū)優(yōu)選來自VH3人種系，更優(yōu)選來自DP-31人種系VH基因，最優(yōu)選來自美國專利6,090,382的圖2A和2B中所示的阿達木單抗VH構(gòu)架序列。因此，在另一個實施方案中，該抗體或抗原結(jié)合部分優(yōu)選含有這樣的輕鏈可變區(qū)(LCVR)和重鏈可變區(qū)(HCVR)，該LCVR包含SEQIDNO:1氨基酸序歹'J(即阿達木單抗VL)，該HCVR包含SEQIDNO:2氨基酸序列(即阿達木單抗VH)。在某些實施方案中，該抗體包含重鏈恒定區(qū)，如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)。優(yōu)選地，重鏈恒定區(qū)是IgGl重鏈恒定區(qū)或IgG4重鏈恒定區(qū)。此外，該抗體可包含輕鏈恒定區(qū)，其為kappa輕鏈恒定區(qū)或lambda輕鏈恒定區(qū)。優(yōu)選地，該抗體包含kappa輕鏈恒定區(qū)?；蛘?，該抗體部分可以是例如Fab片段或單鏈Fv片段。在又一個實施方案中，該抗體或其抗原結(jié)合部分優(yōu)選含有阿達木單抗相關(guān)VL和VHCDR3結(jié)構(gòu)域，例如是具有這樣的輕鏈可變區(qū)(LCVR)或具有這樣的重鏈可變區(qū)(HCVR)的抗體或其抗原結(jié)合部分，該LCVR具有包含選自以下的氨基酸序列的CDR3結(jié)構(gòu)域SEQIDNO:3、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25和SEQIDNO:26;該HCVR具有包含選自以下的氨基酸序列的CDR3結(jié)構(gòu)域SEQIDNO:4、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34和SEQIDNO:35。用于本發(fā)明TNFa抗體可進行修飾。在一些實施方案中，TNFa抗體或者其抗原結(jié)合片段進行化學(xué)修飾，以提供期望的效果。例如，本發(fā)明抗體和抗體片^爻的PEG化可以通過本領(lǐng)域公知的任何PEG化反應(yīng)來進行，所述反應(yīng)描述于例如以下參考文獻Focwo"OowA尸actow3:4-10(1992);EP0154316和EP0401384(每篇文獻通過引用整體結(jié)合到本文中)。優(yōu)選地，PEG化是通過與反應(yīng)性聚乙二醇分二醇(PEG)。本文所用的"聚乙二醇，，意指涵蓋任何形式的已被用來將其他蛋白質(zhì)衍生化的PEG，例如單(Cl-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇。制備本發(fā)明PEG化抗體和抗體片段的方法一般會包括以下步驟(a)在能使本發(fā)明抗體或抗體片段與一個或多個PEG基團發(fā)生連接的條件下，使所述抗體或抗體片段與聚乙二醇(如PEG的反應(yīng)性酯或醛衍生物)進行反應(yīng)，和(b)獲得反應(yīng)產(chǎn)物。根據(jù)已知的參數(shù)和期望的結(jié)果來選擇最佳反應(yīng)條件或?；磻?yīng)，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。PEG化抗體和抗體片段一般可以用來治療本發(fā)明TNFa相關(guān)疾病，做法是施用本文所述的TNFot抗體和抗體片段。一般地，與非PEG化抗體和抗體片段相比，PEG化抗體和抗體片段的半壽期延長。各個PEG化抗體和抗體片段可以單獨使用，一起使用，或者與其他藥物組合物聯(lián)合施用。在本發(fā)明的又一個實施方案中，可對TNFa抗體或抗體片段加以50改變，其中對抗體的恒定區(qū)加以修飾，以相對于未修飾抗體減少至少一個恒定區(qū)介導(dǎo)的生物效應(yīng)物功能。為修飾本發(fā)明抗體以使它顯示出與Fc受體的結(jié)合降低，可將抗體的免疫球蛋白恒定區(qū)段在Fc受體(FcR)相互作用所必需的特定區(qū)域進行突變(參見例如CanfieldandMorrison(1991)/￡xp.MW.HI:1483-1491;和LundWa/.(1991)Jo//www朋/.JiZ:2657-2662)?？贵w的FcR結(jié)合能力的降低也會降低依賴于FcR相互作用的其他效應(yīng)子功能，例如調(diào)理作用和吞噬作用及抗原依賴性細胞毒性。本發(fā)明的抗體或抗體部分可進行衍生化或者與另一個功能分子(例如另一個肽或蛋白質(zhì))連接。因此，本發(fā)明的抗體或抗體部分意指包括本文所述人抗hTNFa抗體的衍生化形式和別的修飾形式，包括免疫粘附分子。例如，可將本發(fā)明的抗體或抗體部分功能性地連接(通過化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價締合或者其他方式)到一個或多個其他分子實體，如另一個抗體(例如雙特異性抗體或雙抗體)、可才企測試劑、細胞毒性劑、藥物物質(zhì)和/或能介導(dǎo)抗體或抗體部分與另一個分子(例如鏈霉親和素核心區(qū)或聚組氨酸標簽)締合的蛋白質(zhì)和/或肽。一種類型的衍生化抗體是通過使兩個或多個抗體(相同或不同類型，例如以產(chǎn)生雙特異性抗體)交聯(lián)來制備的。合適的交聯(lián)劑包括異雙功能(heterobiflmctional)交聯(lián)劑和同雙功能(homobiflmctional)交聯(lián)劑，前者具有兩個被適當間隔區(qū)隔開的反應(yīng)性不同的基團，例如是間-馬來酰亞胺苯曱酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯，后者例如是二琥珀酰亞胺辛二酸酯。這種交聯(lián)劑可從PierceChemicalCompany,Rockford,IL獲得。括熒光化合物。示例性的熒光可4全測試劑包括熒光素、熒光素異石危氰酸酯、羅丹明、5-二曱胺-l-備璜酰氯、藻紅蛋白等等?？贵w還可以用可檢測的酶衍生化，例如堿性磷酸酶，辣根過氧化物酶，葡萄糖氧化酶等等。當用可檢測的酶將抗體衍生化時，該抗體是通過加入該酶用來產(chǎn)生可檢測反應(yīng)產(chǎn)物的另外試劑來進行檢測。例如，當存在辣根過氧化物酶這種可^r測試劑時，過氧化氫和二氨基聯(lián)苯胺的加入導(dǎo)致產(chǎn)生可檢測的有色反應(yīng)產(chǎn)物?？贵w還可以用生物素衍生化，并通過間接測量親和素或鏈霉親和素結(jié)合來進行檢測。本發(fā)明的抗體或抗體部分可通過在宿主細月包中重組表達免疫王求蛋白輕鏈和重鏈基因來制備。為重組表達抗體，用一個或多個攜帶編碼抗體的免疫球蛋白輕鏈和重鏈的DNA片段的重組表達載體轉(zhuǎn)染宿主細胞，使得輕鏈和重鏈在宿主細胞中表達，并優(yōu)選地被分泌到培養(yǎng)宿主細胞的培養(yǎng)基中，從培養(yǎng)基可回收抗體。應(yīng)用標準的重組DNA方法來獲得抗體重鏈和輕鏈基因，將這些基因并入到重組表達載體中，并將栽體導(dǎo)入宿主細胞，這些方法如以下文獻所述Sambrook,FritschandManiatis(eds),M/ecw/arC7簡'"g;Z^orafc^Ma"wa/，5feco"(i五淑ow，ColdSpringHarbor,N.Y.,(1989),Ausubela/,(eds.)Cwrrewf/Votoco/s/"Afo/ecw/arBz.o/ogy,GreenePublishingAssociates,(1989)和Boss等的美國專利4，816，397。為表達阿達木單抗或阿達木單抗相關(guān)抗體，首先獲得編碼輕鏈和重鏈可變區(qū)的DNA片段。這些DNA可通過采用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，對種系輕鏈和重鏈可變序列進行擴增和修飾來獲得。人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列是本領(lǐng)域公知的(參見例如"Vbase，，人種系序列數(shù)據(jù)庫；另參見Kabat"a/.(1991)5^we"ceso/尸TO/e/m1o/7w,"o/og/ca//她m^,F舜U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242;Tomlinsona(1992)"TheRepertoireofHumanGermlineVhSequencesRevealsaboutFiftyGroupsofVhSegmentswithDifferentHypervariableLoops"/Mo/.5fo/.22Z:776-798和Cox"a/.(1994)"ADirectoryofHumanGerm-line力gSegmentsRevealsaStrongBiasintheirUsage"J/mmw"o/.^:827-836;每個文獻的內(nèi)容通過引用明確結(jié)合到本文中)。為獲得編碼阿達木單抗或阿達木單抗相關(guān)抗體的重鏈可變區(qū)的DNA片段，通過標準PCR來擴增人種系VH基因VH3家族的成員。最優(yōu)選地，擴增DP-31VH種系序列。為獲得編碼阿達木單抗或阿達木單抗相關(guān)抗體的輕鏈可變區(qū)的DNA片段，通過標準PCR來擴增人種系VL基因VKI家族的成員。最優(yōu)選地，擴增A20VL種系序列。適用于擴增DP-31種系VH序列和A20種系VL序列的PCR引物，可根據(jù)以上參考文獻中公開的核苷酸序列，用標準的方法來設(shè)計。一旦獲得種系VH片段和VL片段，可將這些序列誘變成編碼本文公開的阿達木單抗或阿達木單抗相關(guān)氨基酸序列。首先將種系VH和VLDNA序列編碼的氨基酸序列與阿達木單抗或阿達木單抗相關(guān)VH和VL氨基酸序列進行比較，以鑒定阿達木單抗或阿達木單抗相關(guān)序列中與種系不同的氨基酸殘基。然后，將種系DNA序列的適當核苷酸進行突變，使得突變的種系序列編碼阿達木單抗或阿達木單抗相關(guān)的氨基酸序列，應(yīng)作哪些核苷酸變化是用遺傳密碼來確定。種系序列的誘變是通過標準方法進行，例如PCR介導(dǎo)的誘變(其中誘變的核香酸被并入到PCR引物中，使得PCR產(chǎn)物包含突變)或定點誘變。一旦獲得編碼阿達木單抗或阿達木單抗相關(guān)VH和VL區(qū)段的DNA片段(如上所述通過擴增和誘變種系VH和VL基因來獲得)，可通過標準的重組DNA技術(shù)對這些DNA片段進一步進行操作，以例如將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)變成全長抗體鏈基因、轉(zhuǎn)變成Fab片段基因或轉(zhuǎn)變成scFv基因。在這些操作中，將編碼VL或VH的DNA片段操作性連接到編碼另一蛋白質(zhì)(例如抗體恒定區(qū)或柔性接頭)的另一DNA片段。在這個情形中所用的術(shù)語"操作性連接"意思是將兩個DNA片段連接，使得這兩個DNA片段所編碼的氨基酸序列保持符合讀框(remainin-frame)。可通過將編碼VH區(qū)的DNA與編碼重鏈恒定區(qū)(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子操作性連接，將編碼VH區(qū)的分離DNA轉(zhuǎn)變成全長重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域公知的(參見例如Kabatef(1991)Se《we"ceso/iVofe/m1o/7mmw"o/og/ca/F辨/z五力Y/ow,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)，且包含這些區(qū)域的DNA片段可通過標準的PCR擴增來獲得。重鏈恒定區(qū)可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)，但最優(yōu)選是IgGl或IgG4恒定區(qū)。對于Fab片段重鏈基因，可將編碼VH的DNA與只編碼重鏈CH1恒定區(qū)的另一DNA分子操作性連接?？赏ㄟ^將編碼VL的DNA與編碼輕鏈恒定區(qū)CL的另一DNA分子操作性連接，將編碼VL區(qū)的分離DNA轉(zhuǎn)變成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域公知的(參見例如Kabat(1991)5fe《we"ceso/iVofez>w。/7附附wwo/og/ca//"ferey/'Fz^/z五淑ow，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)，且包含這些區(qū)域的DNA片段可通過標準的PCR擴增來獲得。輕鏈恒定區(qū)可以是K或人恒定區(qū)，但是最優(yōu)選是K恒定區(qū)。為獲得scFv基因，將編碼VH和VL的DNA片段操作性連接到編碼柔性接頭(例如編碼氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另一片段，使得VH序列和VL序列能被表達為連續(xù)的單鏈蛋白質(zhì)，其中VL區(qū)和VH區(qū)通過柔性接頭連接(參見例如Bird"a/.(1988)5We"ce242:423-426;Hustonda/.(1988)Prac.iVw/.JcM.Sd.H:5879-5883;McCaffertyd,淑鮮(1，)348:552-554)。為表達本發(fā)明的抗體或抗體片段，將如上所述獲得的編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA插入到表達載體中，使得基因與轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列操作性連接。在這個情形中，術(shù)語"操作性連接"指的是抗體基因連接到載體中，使得載體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列能發(fā)揮其調(diào)節(jié)抗體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的預(yù)定功能。選擇表達載體和表達控制序列使其與所用的表達宿主細胞相容?？蓪⒖贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因插入到不同的載體中，或者更通常是將兩個基因插入到相同的表達載體中?？贵w基因通過標準的方法插入到表達載體中(如將抗體基因片段上的互補限制性酶切位點與載體相連接，或者如果沒有限制性酶切位點，則進行鈍末端連接)。在插入阿達木單抗或阿達木單抗相關(guān)輕鏈或重鏈序列之前，表達載體可能已經(jīng)攜帶抗體恒定區(qū)序列。例如，一種將阿達木單抗或阿達木單抗相關(guān)VH序列和VL序列轉(zhuǎn)變成全長抗體基因的方法，就是將它們分別插入到已編碼重鏈恒定區(qū)的表達載體和已編碼輕鏈恒定區(qū)的表達載體中，使得VH區(qū)段操作性連接到載體當中的CH區(qū)段，而VL區(qū)段操作性連接到載體當中的CL區(qū)段。另外，重組表達載體可編碼有助于抗體鏈從宿主細胞中分泌出來的信號肽?？蓪⒖贵w鏈基因克隆到載體中，使得信號肽符合讀框地連接到(linkedin-frameto)抗體鏈基因的氨基末端。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即來自非免疫球蛋白的信號肽)。除了抗體鏈基因外，本發(fā)明的重組表達載體還攜帶能調(diào)控抗體鏈基因在宿主細胞中的表達的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"意指包括能控制抗體鏈基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的啟動子、增強子以及別的表達控制元件(如多聚腺苷酸信號)。這些調(diào)節(jié)序列在例如Goeddel;五;c/m^'owrec/zwo/ogy.'Me決cxis/"五，wo/ogv185,AcademicPress,SanDiego，CA(1990)中有描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，表達載體的設(shè)計，包括調(diào)節(jié)序列的選擇，要取決于諸如所選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞、所需蛋白的表達水平等因素。用于哺乳動物宿主細胞表達的優(yōu)選調(diào)控序列，包括能指導(dǎo)蛋白在哺乳動物中的高水平表達的病毒元件，如衍自巨細胞病毒(CMV)(如CMV啟動子/增強子)、猿病毒40(SV40)(如SV40啟動子/增強子)、腺病毒(如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))以及多瘤病毒的啟動子和/或增強子。有關(guān)病毒調(diào)節(jié)元件及其序列的進一步介紹參看例如Stinski的美國專利5,168,062，Bell等的美國專利4,510,245以及Schaffoet等的美國專利4,968,615。除了抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列外，本發(fā)明的重組表達載體還可攜帶別的序列，如能調(diào)節(jié)載體在宿主細胞中復(fù)制的序列(如復(fù)制起點)以及選擇標記基因。選擇性標記基因有助于挑選出其中已導(dǎo)入載體的宿主細胞(參看美國專利4,399,216、4,634,665和5,179,017,這三個專利都是Axel等人的)。例如，通常選擇性標記基因能給其中已導(dǎo)入了載體55的宿主賦予對藥物如G418、潮霉素或氨曱蝶呤的抗性。優(yōu)選的選擇性標記基因包括二氬葉酸還原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主細胞中用于氨曱蝶呤選擇/擴增)和neo基因(進行G418選擇)。為了表達輕鏈和重鏈，用標準技術(shù)將編碼重鏈和輕鏈的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞中。不同形式的術(shù)語"轉(zhuǎn)染"意在涵蓋多種常用于將外源DNA導(dǎo)入到原核或真核宿主細胞中的技術(shù)，例如電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染等。盡管從理論上說，本發(fā)明的抗體可能在原核或真核宿主細胞中表達，但最優(yōu)選的是在真核細胞、最優(yōu)選哺乳動物宿主細胞中表達抗體，真核細胞尤其是哺乳動物細胞比原核細胞更可能裝配和分泌正確折疊并具有免疫活性的抗體?？贵w基因在原核細胞中的表達據(jù)報道不能有效地高收率生產(chǎn)活性抗體(Boss,M.A和Wood,C.R(1985),ImmunologyToday12-13)。優(yōu)選用于表達本發(fā)明重組抗體的哺乳動物宿主細胞，包括中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)(包括dhfr-CHO細胞，在UrlaubandChasin，(1980)PNASUSA77:4216-4220中描述，與例如KaufinanandSharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中描述的DHFR選擇性標記一起使用)、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞和SP2細胞。當編碼抗體基因的重組表達載體被導(dǎo)入到哺乳動物宿主細胞中時，通過將宿主細胞培養(yǎng)一^:時間來生產(chǎn)抗體，該段時間足以使抗體得以在宿主細胞中表達，或者更優(yōu)選地使抗體得以分泌到宿主細胞生長的培養(yǎng)基中?？捎玫鞍踪|(zhì)純化方法將抗體從培養(yǎng)基中回收。宿主細胞也可用來產(chǎn)生完整抗體的部分，如Fab片段或scFv分子。應(yīng)認識到，上述方法的修改方案也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，可能宜用編碼本發(fā)明抗體的輕鏈或重鏈(但不是同時編碼兩者)的DNA來轉(zhuǎn)染宿主細胞。也可利用重組DNA技術(shù)，來去掉編碼輕鏈或重鏈或兩者的DNA中對結(jié)合hTNFa沒有必要的一些部分或全部。從這種截短的DNA分子表達的分子也涵蓋在本發(fā)明的抗體范閨之內(nèi)。此外，可通過標準的化學(xué)交聯(lián)方法將本發(fā)明的抗體與另一抗體交聯(lián)，來產(chǎn)生雙功能抗體，其中一條重鏈和一條輕鏈屬本發(fā)明的抗體，而另外一條重鏈和輕鏈對hTNFa之外的抗原有特異性。在一個優(yōu)選的進行本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分的重組表達的系統(tǒng)中，通過磷酸鈣介導(dǎo)轉(zhuǎn)染將編碼抗體重鏈和輕鏈的重組表達載體導(dǎo)入dhfr-CHO細胞中。在這個重組表達載體當中，抗體重鏈和輕鏈各自操作性連接到CMV增強子/AdMLP啟動子調(diào)節(jié)元件，以驅(qū)動高水平的基因轉(zhuǎn)錄。重組表達載體還攜帶有DHFR基因，該基因使得可以采用氨曱蝶呤選擇/擴增來選出轉(zhuǎn)染了載體的CHO細胞。將選出的轉(zhuǎn)化宿主細胞進行培養(yǎng)，以使抗體重鏈和輕鏈得以表達，而后從培養(yǎng)基中回收完整抗體。用標準的分子生物學(xué)技術(shù)來制備重組表達載體，轉(zhuǎn)染宿主細胞，選擇轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)宿主細胞和從培養(yǎng)基中回收抗體。本發(fā)明的重組人抗體，除了本文公開的阿達木單抗或其抗原結(jié)合部分或者阿達木單抗相關(guān)抗體外，也可以通過篩選用人VL和VHcDNA制備的重組組合抗體文庫(優(yōu)選scFv噬菌體展示文庫)進行分離，該人VL和VHcDNA是從衍自人淋巴細胞的mRNA制備的。制備和篩選這樣的文庫的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。除了市售的用以產(chǎn)生噬菌體展示文庫的試劑盒(例如Pharmacia重組噬菌體抗體系統(tǒng)，目錄號27-9400-01;和StratageneSw^/Z4PTM噬菌體展示試劑盒，目錄號240612)外，特別適用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫的方法和試劑的實例可見于例如Ladneretal.美國專利5,223,409;Kangetal.PCT公開說明書WO92/18619;Doweretal.PCT公開說明書WO91/17271;Winteretal.PCT公開說明書WO92/20791;Marklandetal.PCT公開說明書WO92/15679;Breitlingetal.PCT公開說明書WO93/01288;McCaffertyetal.PCT公開說明書WO92/01047;Garrardetal.PCT公開說明書WO92/09690;Fuchsetal.(1991)Bio/Technology9:1370-1372;Hayetal.(1992)HumAntibodHybridomas3:81-85;Huseetal.(1989)Science246:1275-1281;McCaffertyetal.，Nature(1990)348:552-554;Griffithsetal.(1993)EMBOJ12:725-734;Hawkinsetal.(1992)JMolBiol226:889-896;Clacksonetal.(1991)Nature352:624-628;Grametal.(1992)PNAS89:3576-3580;Garrardetal.(1991)Bio/Technology9:1373-1377;Hoogenboometal.(1991)NucAcidRes19:4133-4137;和Barbasetal.(1991)PNAS88:7978-7982。在一個優(yōu)選的實施方案中，為分離對hTNFa有高親和力和低離開(off)速率常數(shù)的人抗體，首先使用Hoogenboom等人的PCT公開說明書WO93/06213中描述的表位印記法，利用對hTNFa有高親和力和低離開速率常數(shù)的鼠源抗hTNFa抗體(如MAK195雜交瘤，其寄存號是ECACC87050801),來選出有相似的hTNFa結(jié)合活性的人重鏈和述制備和篩選scFv文庫McCafferty等人的PCT公開說明書WO92/01047;McCaffertyda/.iVaft^e(1990)巡:552畫554;和Griffiths^a/.(1993)￡M50/12:725-734。scFv抗體文庫優(yōu)選的是用重組人TNFa為抗原來進行篩選。一旦選出初始人VL區(qū)段和VH區(qū)段，就進行"混合與匹配"實驗來選擇優(yōu)選的VL/VH配對組合，在該實驗中，將初選的VL區(qū)段和VH區(qū)段進行不同的配對后進行TNFa結(jié)合能力的篩選。另外，為進一步改善TNFa結(jié)合親和力和/或降低TNFa結(jié)合離開速率常數(shù)，可將優(yōu)選的VL/VH對中的VL區(qū)段和VH區(qū)段進行隨機突變，優(yōu)選的是在VH和/或VL的CDR3區(qū)當中進行突變，突變過程和在天然免疫反應(yīng)中負責(zé)抗體親和力成熟的體內(nèi)體細胞突變過程類似。這個體外親和力成熟可用分別與VHCDR3或VLCDR3互補的PCR引物擴增VH區(qū)和VL區(qū)來實現(xiàn)，所述引物在某些位置已被隨機"摻入，，了四種核苷酸，使得所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物能編碼在其CDR3區(qū)中已導(dǎo)入了隨機突變的VH區(qū)段和VL區(qū)段?？蓪@些隨機突變的VH區(qū)段和VL區(qū)段進行hTNFa結(jié)合能力的再篩選，并可選出顯示高hTNFa結(jié)合親和力和低hTNFa結(jié)合離開速率的序列。58從重組的免疫球蛋白展示文庫篩選和分離本發(fā)明的抗hTNFa抗體后，可將編碼選定抗體的核酸從展示包裝(displaypackage)(例如從噬菌體基因組)中回收，并通過標準的重組DNA技術(shù)亞克隆到別的表達載體中。如果有需要，可以對核酸作進一步操作，以產(chǎn)生其他形式的本發(fā)明抗體(如連接到編碼別的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域如別的恒定區(qū)的核酸上)。為表達通過篩選組合文庫分離到的重組人抗體，如上文所詳述，將編碼抗體的DNA克隆到重組表達載體中并導(dǎo)入哺乳動物宿主細胞。分離具有高hTNFa親和力和低hTNFgt離開速率常數(shù)的人抗體的方法，在美國專利6,090,382、6，258，562和6，509，015中也有描述,每個專利都通過引用結(jié)合到本文中。III.抗體純化本發(fā)明提供從包含抗體和至少一種HCP的混合物生產(chǎn)HCP降低的抗體制品的方法。本發(fā)明還提供從包含抗體和至少一種組織蛋白酶L酶原的混合物生產(chǎn)組織蛋白酶L酶原降低的抗體制品的方法。當用II章節(jié)中描述的方法和本領(lǐng)域的常規(guī)方法生產(chǎn)出了抗體時，本發(fā)明的純化過程從分離步驟開始。通常在本領(lǐng)域，將抗體-HCP混合物施以A蛋白捕捉(例如A蛋白柱)作為初始分離步驟，因為抗體會結(jié)合A蛋白，而HCP則會流過。本發(fā)明的純化方法其優(yōu)點是，沒有必要將包含抗體和至少一種HCP的混合物施以A蛋白捕捉步驟(例如A蛋白柱)作為初始步驟，或者作為純化方法中的任何步驟。一旦獲得了包含抗體的澄清溶液或混合物，用不同純化技術(shù)的組合來進行抗體與細胞所產(chǎn)生的其他蛋白質(zhì)的分離，這些技術(shù)包括離子交換分離步驟和疏水相互作用分離步驟。分離步驟是根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷、疏水程度和/或大小來分離蛋白質(zhì)的混合物的。在本發(fā)明的一個實施方案中，用層析法進行分離，包括陽離子層析，陰離子層析和疏水層析。每種這些技術(shù)都有幾種不同的層析樹脂可供使用，這使得能使純化方案準確地適合于所涉及的特定蛋白質(zhì)。每種分離方法的實質(zhì)在于，可使蛋白質(zhì)以不同的速度沿長柱子向下移動，從而實現(xiàn)物理分離，分離的程度隨著蛋白質(zhì)向下通過柱子而增加，或者可使蛋白質(zhì)選擇性地吸附到分離介質(zhì)，然后用不同的溶劑進行差分洗脫。在一些情況中，如果雜質(zhì)特異性粘附于柱子上，而抗體不會粘附，即抗體存在于流通物中，則抗體得以與雜質(zhì)分離。將抗體從不需要的蛋白質(zhì)中純化出來的方法在下文中沖是供，例如工藝A。在一個實施方案中，本發(fā)明包括下文工藝A中描述的步驟，這些步驟要么是單獨的，要么組合在一起。工藝A提供了用離子交換分離(陽離子交換層析和陰離子交換層析)和疏水相互作用分離純化包含抗體的混合物，從而獲得適用于藥物組合物的抗體制品的方法。工藝A的優(yōu)點是，無需在抗體純化中進行A蛋白捕捉作為初始步驟，就可執(zhí)行它。在一個實施方案中，用工藝A純化的抗體是阿達木單抗。工藝A—般包括以下將包含抗體和雜質(zhì)(例如HCP)的混合物荷載到離子交換柱如陽離子交換柱上。該混合物可以以約530g抗體/升/循環(huán)的荷載量荷載。隨后用洗滌緩沖液(平衡緩沖液)洗滌荷載到陽離子柱上的混合物。然后將抗體從柱子洗脫下來，獲得第一洗脫物。第一洗脫物然后常常進行病毒滅活和pH調(diào)節(jié)，以準備進行陰離子交換層析。第一洗脫物是通過將pH調(diào)節(jié)到相對于洗脫緩沖液而言的低pH來進行病毒滅活的(在下文IIIC章節(jié)中進一步描述)。隨后將病毒滅活洗脫物的pH在超過一個步驟中調(diào)節(jié)到約7.6的最終pH，這個pH是后面跟著的陰離子交換柱的pH。第一洗脫物進行了病毒滅活后，常常進行第二離子交換分離步驟，其中將第一洗脫物荷載到陰離子交換柱(例如Q瓊脂糖凝膠柱)。用洗滌緩沖液洗滌該柱，獲得包含抗體的笫一流通物。該流通物通過荷載到疏水相互作用柱(苯基瓊脂糖凝膠)作進一步的純化。將該柱洗滌，從該柱洗脫出抗體，由此獲得第二洗脫物。下文描述工藝B，它提供了從包含抗體的混合物生產(chǎn)宿主細胞蛋白(HCP)降低的抗體制品的改進方法。詞語"降低的"指HCP或組織蛋白酶L酶原時，包括對工藝A中可比較點(comparablepoint)處的HCP或組織蛋白酶L酶原水平(例如濃度或活性)的改進。在一個實施方案中，與工藝A的第一洗脫物相比，工藝B的第一洗脫物包含水平降低的HCP或組織蛋白酶L酶原。在一個實施方案中，與工藝A的第一流通物相比，工藝B的第一流通物包含水平降低的HCP或組織蛋白酶L酶原。在一個實施方案中，與工藝A的第二洗脫物相比，工藝B的第二洗脫物包含水平降低的HCP或組織蛋白酶L酶原。在另一個實施方案中，與工藝A獲得的抗體制品相比，工藝B獲得的抗體制品包含水平降低的HCP或組織蛋白酶L酶原。工藝B—^殳包括以下將包含抗體和雜質(zhì)(例如HCP)的混合物荷載到離子交換柱如陽離子交換柱上。該混合物可以在pH7下以約535g抗體/升/循環(huán)的荷載量荷載，或者在pH5下以約570g抗體/升/循環(huán)的荷載量荷載。隨后用洗滌緩沖液(平衡緩沖液)洗滌荷載到陽離子柱上的混合物。在平衡洗滌緩沖液之后，進行中間洗滌步驟，其中該柱子用電導(dǎo)率與洗脫緩沖液相似的中間緩沖液進行洗滌。這個中間洗滌步驟能改進工藝相關(guān)雜質(zhì)(process-relatedimpurities)的清除。然后用洗脫緩沖液將抗體從柱子上洗脫下來，獲得第一洗脫物。第一洗脫物然后常常進行病毒滅活和pH調(diào)節(jié)，以準備進行陰離子交換層析。第一洗脫物是通過將pH調(diào)節(jié)到相對于洗脫緩沖液而言的低pH來進行病毒滅活的。隨后將病毒滅活洗脫物的pH和電導(dǎo)率在一個步驟中調(diào)節(jié)到約7.8-8.2的最終pH，這個pH是后面跟著的平衡陰離子交換柱的pH。第一洗脫物進行了病毒滅活后，進行第二離子交換分離步驟，其中將第一洗脫物荷載到陰離子交換柱(例如Q瓊脂糖凝膠柱)。用洗滌緩沖液洗滌該柱，獲得包含抗體的第一流通物。該流通物通過荷載到疏水相互作用柱(苯基瓊脂糖凝膠)作進一步的純化。將該柱洗滌，從該柱洗脫出抗體，由此獲得第二洗脫物。工藝B的結(jié)果是HCP(包括組織蛋白酶L酶原)降^[氐的制品。工藝B的進一步結(jié)果包括通過將HCP清除操作移到工藝的前部分來消除工藝瓶頸(例如在細胞培養(yǎng)放大中得到更高的生產(chǎn)率)，并使抗體產(chǎn)率總體得到改進。關(guān)于本發(fā)明的改進工藝的另外細節(jié)在下文中提供。///.A庠子爻換為、岸本發(fā)明涉及從包含抗體和至少一種HCP的混合物生產(chǎn)HCP降低的抗體制品的方法，做法是將該混合物進行至少一個離子交換分離步驟，由此獲得包含該抗體的第一洗脫物。離子交換分離包括任何據(jù)以根據(jù)兩種物質(zhì)各自的離子電荷的差異而將它們分離開的方法。在進行該分離中，可使用例如批式純化技術(shù)或?qū)游龇?，使抗體混合物與離子交換材料相接觸。例如，對于批式純化，將離子交換材料在所需的起始緩沖液中制備，或者使其與所需的起始緩沖液平衡。獲得離子交換材料的漿液。使抗體溶液與該漿液接觸，以將待分離抗體吸附到離子交換材料上。將包含不結(jié)合離子交換材料的HCP的溶液與該漿液分離開，例如通過讓該漿液沉淀和除去上清液來分離?？蓪υ摑{液進行一個或多個洗滌步驟。如果需要，可將該漿液與更高電導(dǎo)率的溶液接觸，以使已結(jié)合離子交換材料的HCP脫附。為洗脫出結(jié)合的多肽，可提高鹽濃度。離子交換層析也可用作離子交換分離技術(shù)。離子交換層析是根據(jù)各分子總體電荷之間的差異來分離分子的。對于抗體的純化，抗體所具有的電荷必需與連接到離子交換材料(例如樹脂)的官能團的電荷相反才能發(fā)生結(jié)合。例如，在緩沖液pH下其總正電荷通常低于其pI的抗體，會很好地結(jié)合含有帶負電官能團的陽離子交換材料。在離子交換層析中，倘若周圍緩沖液的離子強度低，則溶質(zhì)的表面上的帶電部分(patch)被連接到層析基質(zhì)的相反電荷所吸引。洗脫通常是通過增加緩沖液的離子強度(即電導(dǎo)率)以與溶質(zhì)竟爭離子交換基質(zhì)的帶電位點來實現(xiàn)的。改變PH從而改變?nèi)苜|(zhì)的電荷，是實現(xiàn)溶質(zhì)的洗脫的另一種方法。電導(dǎo)率或pH的改變可以是漸進改變(梯度洗脫)或者是分步改變(分步洗脫)?？蓪㈥庪x子或陽離子取代基連接到離子交換基質(zhì)上，以形成陰離子或陽離子層析載體。陰離子交換取代基包括二乙基氨基乙基(DEAE)基團、季氨基乙基(QAE)基團和季胺(Q)基團。陽離子取代基包括羧甲基(CM)、磺基乙基(SE)、磺基丙基(SP)、硫酸根(P)和磺酸根(S)。纖維素離子交換樹脂如DE23、DE32、DE52、CM-23、CM-32和CM-52可獲自WhatmanLtd.Maidstone,Kent,英國。SEPHADEX⑧基和低交聯(lián)離子交才吳劑(SEPHADEX-basedand畫locross-linkedionexchangers)也是公知的。例如DEAE-、QAE-、CM-和SP-SEPHADEX⑧及DEAE-、Q-CM-和S-SEPHAROSE⑧及SEPHAROSEFastFlow均可獲自PharmaciaAB。此外，DEAE和CM衍生的乙二醇曱基丙烯酸共聚物如TOYOPEARLDEAE-650S或M和TOYOPEARLCM-650S或M,可獲自TosoHaasCo.，Philadelphia,Pa。在本發(fā)明的一個實施方案中，將包含抗體和至少一種HCP的混合物荷載到陽離子交換(CEX)層析柱上。該混合物是在荷載緩沖液中荷載到CEX柱上的，該荷載緩沖液可以是與用以平衡該柱的平衡緩沖液相同。隨著包含HCP的混合物通過CEX柱，目標蛋白質(zhì)被吸附到CEX樹脂，而各種HCP(如宿主細胞蛋白，其中目標蛋白質(zhì)是在重組宿主細胞中產(chǎn)生，或者其他工藝衍生雜質(zhì))則流過或者微弱或非特異性地結(jié)合CEX樹脂。在各個實施方案中CEX樹脂是與磺酸基連接的基于合成的曱基丙烯酸酯的聚合物樹脂(FractogelS03_(FractogelS))。在一個實施方案中，平衡緩沖液包含20mMNa2P04,25mMNaCl,pH6.8。其他合適的平衡緩沖液包括例如BIS和HEPES，它們在生理濃度下，例如約0.5mM至約100mM范圍內(nèi)(例如10mM、20mM、50mM等)的濃度和生理鹽濃度(例如約0.15mMNaCl)，和在5.0-9.0的pH下。在示例性的實施方案中，CEX層析是用FractogelS柱。在一個實施方案中，將約30克抗體/升樹脂至約40克抗體/升樹脂荷載到FractogelS柱上。在另一個實施方案中，在pH7下將約35克抗體/升樹脂荷載到FractogelS柱上。已發(fā)現(xiàn)在pH7下約35克抗體/升樹脂的荷載量能增加雜質(zhì)(例如HCP和組織蛋白酶L酶原)的清除。下表1說明用于本發(fā)明方法的FractogelS柱的可接受操作范圍。表1:pH7下FractogelS層析的可接受搡作范圍操作錄AOR樹脂容量S35g蛋白質(zhì)/L樹脂荷載樣品pH6.5-7.5有效荷載稀釋1:1-1:2洗滌2洗脫緩沖液濃縮1:3-1:4物與WFI之比線性速率75-300cm/hr還進一步發(fā)現(xiàn)，在pH5下進行層析可增加柱的荷載容量。具體的說，發(fā)現(xiàn)在pH5下約70克抗體/升樹脂的荷載量能增加雜質(zhì)(例如HCP和組織蛋白酶L酶原)的清除。因此，在約pH5至約pH7的pH范圍內(nèi)，可使用約35g至約70g抗體/升樹脂的荷載量。在將該抗體混合物荷載到該柱上后，用洗滌緩沖液洗滌CEX樹脂。具體的說，發(fā)現(xiàn)用不同的洗滌緩沖液進行多個洗滌步驟，能產(chǎn)生HCP進一步降低的抗體制品。更具體的說，發(fā)現(xiàn)通過采用分別用洗滌緩沖液和中間洗滌緩沖液進行的第一洗滌步驟和中間洗滌步驟，可使組織蛋白酶L酶原水平降低。在一個實施方案中，將CEX樹脂首先用與平衡緩沖液相同的洗滌緩沖液進行洗滌。在某些實施方案中，洗滌緩沖液是20mMNa2P04,25mMNaCl,pH6.8。其他合適的洗滌緩沖液包括例如BIS和HEPES,它們在生理濃度下，例如約0.5mM至約100mM范圍內(nèi)(例如10mM、20mM、50mM等)的濃度和生理鹽濃度(例如約0.15mMNaCl)，和在5.0-9.0的pH下。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，進行中間洗滌步驟。已發(fā)現(xiàn)通過使用部分上包含與CEX洗滌緩沖液相同的緩沖液的中間洗滌緩沖液，可實現(xiàn)HCP(—般來說)和組織蛋白酶L酶原(具體來說)的水平降低。HCP(—般來說)和組織蛋白酶L酶原(具體來說)的降低的改進，部分上是由中間洗滌緩沖液的電導(dǎo)率增加所致。增加中間洗滌緩沖液的電導(dǎo)率，會造成HCP(其pl低于抗體的pl)的電荷置換，從而造成結(jié)合力弱的HCP被洗滌流過柱子。結(jié)合力弱的雜質(zhì)(例如HCP,包括組織蛋白酶L酶原)的清除的增加，又給目標物質(zhì)(例如抗體)提供更多的結(jié)合面積。在其他實施方案中，中間洗滌緩沖液含有約40%至約50%洗脫緩沖液和約50%至約60%注射用水。在更多的實施方案中，中間洗滌緩沖液含有45%洗滌緩沖液和55°/。注射用水。在一個實施方案中，用于中間洗滌的洗滌緩沖液是20mMNa2P04,150mM氯化鈉，pH7。在進行多次洗滌后，將抗體從第一陽離子交換材料中洗脫下來，由此獲得HCP水平降低的第一洗脫物。由于中間洗滌步驟，第一洗脫物的組織蛋白酶L酶原水平也降低。在一個實施方案中，相比于工藝A的對等步驟，用本發(fā)明方法獲得的第一洗脫物其HCP水平降低約3至約5倍。在另一個實施方案中，相比于工藝A的對等步驟，用本發(fā)明方法獲得的第一洗脫物其組織蛋白酶L活性降低約2至約3倍。在一個實施方案中，經(jīng)HCPELISA測定，第一洗脫物所包含的HCP比混合物少約90至約100倍。在另一個實施方案中，經(jīng)組織蛋白酶L動力學(xué)測定法測定，第一洗脫物包含的組織蛋白酶L活性在約25至約60RFU/s/mg抗體的范圍。在一個優(yōu)選的實施方案中，將包含抗體的初始洗脫物通過第二離子交換材料，獲得HCP水平進一步降低的流通物。在一些實施方案中，第二離子交換步驟可以是下文所述的批式純化。在其他實施方案中，第二離子交換步驟包括將第一洗脫物荷載到第二離子交換層析柱上，洗滌該柱和獲得第一流通物。第二離子交換材料可以是陰離子交換(AEX)樹脂，例如Q瓊脂糖凝膠柱。在一些實施方案中，將約30g抗體/樹脂至約40g抗體/樹脂荷載到陰離子交換柱上。增加荷載量到約40g抗體/樹脂至約50g抗體/樹脂會造成雜質(zhì)(例如HCP)的清除降低。隨著含HCP的緩沖液通過AEX柱，各種HCP會與AEX樹脂發(fā)生結(jié)合，而抗體流過或非特異性地結(jié)合AEX柱。在某些實施方案中，陰離子交換樹脂是Q瓊脂糖凝膠。待純化的抗體混合物往往會存在于前面純化步驟的緩沖液中。有許多緩沖液可用，可通過常規(guī)實驗進行選4奪。例如，可使用25mM三乙醇胺，40mMNaCl，pH8的平衡緩沖液。在一個實施方案中，在將初始洗脫物通過第二離子交換材料之前，可用平衡緩沖液平衡第二離子交換材料。這可例如這樣來進行改變第一洗脫物的pH和電導(dǎo)率，使得第一洗脫物的pH和電導(dǎo)率基本上類似于或相當于平衡的第二離子交換材料的pH和電導(dǎo)率，即改變第一洗脫物的pH和電導(dǎo)率，使得其相當于平衡的第二離子交換材料的pH和電導(dǎo)率。在一些實施方案中，用平衡緩沖液將AEX材料(例如Q瓊脂糖凝膠)的pH調(diào)節(jié)到約7.7至約8.3的范圍。在更多的實施方案中，將CEX洗脫物(例如初始洗脫物)的pH調(diào)節(jié)到約7.7至約8.3的范圍。在某些實施方案中，AEX材料和初始洗脫物的pH均為8。在一些實施方案中，AEX材料的電導(dǎo)率在約3.5mS/cm至約4.9mS/cm的范圍。在更多的實施方案中，初始洗脫物的電導(dǎo)率在約3.5mS/cm至約4.9mS/cm的范圍。已發(fā)現(xiàn)將荷載物電導(dǎo)率和pH調(diào)節(jié)到第二離子交換材料的電導(dǎo)率和pH,能提高雜質(zhì)的清除。對于工藝A,已發(fā)現(xiàn)第一洗脫物和/或平衡的第二離子交換材料的電導(dǎo)率總體下降和/或pH增加，會導(dǎo)致HCP的清除增加。在將抗體混合物荷載到柱上后，用洗滌緩沖液洗滌AEX樹脂。洗滌緩沖液可以是與平衡緩沖液相同，例如25mM三乙醇胺，40mMNaCl,pH8。在一個實施方案中，可將洗滌物與流通物匯集(pooled),由此獲得包含抗體且HCP水平降低的第一流通物。在更多的實施方案中，第一流通物的組織蛋白酶L酶原水平降低。在一個實施方案中，與工藝A的對等步驟相比，用本發(fā)明方法獲得的第一流通物其HCP水平降低約7至約700倍。在另一個實施方案中，相比于工藝A的對等步驟，用本發(fā)明方法獲得的第一流通物其組織蛋白酶L活性降低約6至約25倍。在其他實施方案中，由HCPELISA測出，第一流通物的HCP比第一洗脫物少約840至約850倍。在又一個實施方案中，經(jīng)組織蛋白酶L動力學(xué)測定法測定，第一流通物包含的組織蛋白酶L活性為約0.4至約4RFU/s/mg抗體之間。下表2說明用于本發(fā)明方法的Q瓊脂糖凝膠層析的可接受操作范圍。表2:0瓊脂糖凝膠FF層析的可接受搡作范圍<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>如上所述，是用陽離子交換材料還是用陰離子交換材料，取決于蛋白質(zhì)的總體電荷。因此，在使用陽離子交換材料前先采用陰離子交換材料，這是落入本發(fā)明的范圍內(nèi)的。此外，只采用陽離子交換材料或只采用陰離子交換材料，也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的方法可任選包括更多的純化步驟?？稍谶M行離子交換層析方法之前、過程中或之后進行的另外的純化程序的實例，包括在疏水相互作用層析上的分級分離(例如在苯基瓊脂糖凝膠上)、乙醇沉淀、等電聚焦、反相HPLC、硅膠層析、肝素瓊脂糖凝膠層析、進一步的陰離子交換層析和/或進一步的陽離子交換層析、層析聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沉淀、羥磷灰石層析、凝力交電泳、透析和親和層析(例如使用A蛋白、G蛋白、抗體、特異性底物、配體或抗原作為捕捉試劑)。本發(fā)明還涉及這樣的從包含抗體和至少一種HCP的混合物生產(chǎn)HCP降低的抗體制品的方法，該方法還包括疏水相互作用分離步驟，其中將第一流通物施與第一疏水相互作用材料，由此獲得HCP水平降低的第二洗脫物。在進行分離時，可將多肽混合物與HIC材料進行接觸，例如使用批式純化技術(shù)或使用柱子來進行。在進行HIC純化前，可能宜于例如使該混合物通過前置柱(precolum)來除去任何離液劑或非常疏水的物質(zhì)。例如，對于批式純化，將HIC材料在所需的平衡緩沖液中制備，或者與所需的平衡緩沖液平衡。獲得HIC材料的漿液。使抗體溶液與該漿液接觸，以將待分離抗體吸附到HIC材料上。將包含不結(jié)合HIC材料的HCP的溶液與該漿液分離開，例如通過讓該漿液沉淀和除去上清液來分離?？蓪υ摑{液進行一個或多個洗滌步驟。如果需要，可將該漿液與更低電導(dǎo)率的溶液接觸，以使已結(jié)合HIC材料的抗體脫附。為洗脫出結(jié)合的多肽，可降低鹽濃度。在其他實施方案中，疏7jc相互作用分離步驟包括將第一流通物荷載到包含第一疏水相互作用材料的柱子上和洗滌第一疏水相互作用材料，由此獲得第二洗脫物。疏水相互作用分離步驟可包括疏水相互作用層析(HIC)步驟。而離子交換層析是依靠蛋白質(zhì)(例如抗體)的電荷來分離它們，而疏水相互作用層析則是利用一些蛋白質(zhì)(例如抗體)的疏水性質(zhì)?？贵w上的疏水基團能結(jié)合柱子上的親水基團。蛋白質(zhì)越疏水，它結(jié)合柱子就越強。HIC步驟能除去例如宿主細胞衍生雜質(zhì)(例如DNA和其他高分子量和4氐分子量產(chǎn)物相關(guān)的物質(zhì))。疏水相互作用在高離子強度下最強，因此這種形式的分離可便利地在鹽沉淀或離子交換程序后進行。高鹽濃度能有助于抗體吸附到68fflC柱上，但是取決于抗體的性質(zhì)和所選的具體HIC配體，實際濃度可在很廣的范圍內(nèi)變動。根據(jù)各種離子是否促進疏水相互作用(鹽析效應(yīng))或破壞水的結(jié)構(gòu)(離液效應(yīng))和導(dǎo)致疏水相互作用的弱化，可將它們排列成所謂的溶疏系列(soluphobicseries)。陽離子按鹽析效應(yīng)遞增順序排列為Ba++<;Ca討《；Mg++<;Li+<;Cs+<;Na+<;K+<;Rb+<;NH/,而陰離子按離液效應(yīng)遞增順序排列為PO—<;S04—<;CH3COOCT<;Cr<;<;NCV<;Cl(V<;I_<;SCN-。一般來說，硫酸鈉、硫酸鉀或硫酸銨能有效促進HIC中的配體-蛋白質(zhì)相互作用?？膳渲瞥瞿苡绊懴嗷プ饔玫膹姸鹊柠}，順序如下(NH4)2S04>;Na2S04>;NaCl"NH4CI>;NaBr>;NaSCN。一般來說，約0.75至約2M疏酸銨或約1-4MNaCl的鹽濃度是適用的。HIC柱通常包含偶聯(lián)有疏水配體(例如烷基或芳基基團)的基質(zhì)(例如交聯(lián)的瓊脂糖或合成的共聚物材料)。優(yōu)選的HIC柱包含有被苯基基團取代的瓊脂糖樹脂(例如苯基瓊脂糖凝膠tm柱)。許多HIC柱可市售獲得。實例包括但不限于低取代或高取代的苯基瓊脂糖凝膠tm6FastFlow柱(PharmaciaLKBBiotechnology,AB,Sweden);苯基瓊脂斗唐凝月交tmHighPerformance柱(PharmaciaLKBBiotechnology,AB,Sweden);OctylSepharoseTMHighPerformance柱(PharmaciaLKBBiotechnology,AB，Sweden);FractogelTMEMDPropyl或FractogelTMEMDPhenyl柱(E.Merck,Germany);Macro-PrepM勿l或Macro-Prept-ButylSupports(Bio-Rad，California);WPHI畫Propyl(C.sub.3)tm柱(J.T.Baker，NewJersey)和Toyopear丄tm醚、苯基或丁基柱(TosoHaas，PA)。包含目的抗體和HCP的混合物在進行任何初步純化步驟后，可進行HIC。待純化的抗體組合物往往會存在于前面純化步驟的緩沖液中。但是，在進行HIC步驟前可能有必要向抗體組合物加入緩沖液。有許多緩沖液可獲得，可通過常規(guī)實驗進行選擇。在一個實施方案中，將在荷載緩沖液中的、包含待純化抗體和至少一種HCP的混合物，用酸或石威(視起始pH而定)調(diào)節(jié)pH到約7,并調(diào)到約136至約158mS/cm的電導(dǎo)率。在一個實施方案中，用包含40mM磷酸鈉，2.2M(NH4)2S04,pH7的緩沖液稀釋抗體混合物。在荷載抗體混合物前，可用平衡緩沖液平衡柱子。在一些實施方案中，平衡緩沖液是20mM磷酸鈉，1.1M(NH4)2S04,pH7。在一個實施方案中，將包含抗體的混合物例如第一流通物荷載到苯基瓊脂糖凝膠HIC柱上。在某些實施方案中，此步驟的蛋白質(zhì)荷載量為約20至約40克蛋白質(zhì)/L樹脂。在其他實施方案中，此步驟的蛋白質(zhì)荷載量為約35克蛋白質(zhì)/L樹脂。在一些實施方案中，可能需要兩個或三個層析循環(huán)來處理全部的可利用材料。蛋白質(zhì)與疏水相互作用柱結(jié)合后，可用洗滌緩沖液洗滌該柱，該洗滌緩沖液可與平衡緩沖液相同，例如1.1M(NH4)2S04，pH7。用洗脫緩沖液將抗體>^人柱子上洗脫下來，由此獲得第二洗脫物。洗脫緩沖液可用常規(guī)試驗進行選擇。洗脫緩沖液pH為約6至約8之間，且具有低硫酸銨濃度(即小于約1M(NH4)2S04)。洗脫緩沖液的電導(dǎo)率為約87至約101mS/cm之間。在一個實施方案中，洗脫緩沖液含有11mM磷酸鈉，0.625M(NH4)2S04),pH7。已發(fā)現(xiàn)較低的鹽濃度導(dǎo)致較少的阿達木單抗結(jié)合到樹脂。將抗體從第二離子交換材料洗脫下來，由此獲得HCP水平降低的第二洗脫物。第二洗脫物其組織蛋白酶L酶原水平也P爭低。在一個實施方案中，與工藝A的對等步驟相比，用本發(fā)明方法獲得的第二洗脫物其HCP水平降低約10至約96倍。在另一個實施方案中，與工藝A的對等步驟相比，用本發(fā)明方法獲得的第二洗脫物其組織蛋白酶L活性降低約5至約15倍。在一個實施方案中，經(jīng)HCPELISA測定，第二洗脫物所包含的HCP比第一流通物低約3至約5倍。在另一個實施方案中，經(jīng)組織蛋白酶L動力學(xué)測定法測定，第二洗脫物包含的組織蛋白酶L活性在約0.5至約1.5RFU/s/mg抗體之間。下表3顯示用于本發(fā)明方法的苯基瓊脂糖凝膠層析柱的可接受操作范圍。表3:苯基瓊脂糖凝膠HP層析的可接受操作范圍操作錄AOR柱荷載量20-40g/L荷載樣品稀釋0.9:1-1.1:1線性速度25-125cm/hr更多的純化步驟可包括病毒除去步驟以及納濾(nanofiltration)、超濾和/或滲濾步驟，這在本文中有描述。瓜C.為提供安全余地，在純化過程中將潛在的未檢測到的病毒滅活。病毒滅活的方法是本領(lǐng)域公知的，包括熱滅活(巴氏滅菌)、pH滅活、溶劑/去污劑處理、紫外光和伽瑪射線輻射及加入某些化學(xué)滅活劑如卩-丙內(nèi)酯或者例如美國專利4,534,972等中所述的菲咯啉銅。在一些實施方案中，混合物的病毒滅活可包括pH病毒滅活。pH病毒滅活技術(shù)的方法也是本領(lǐng)域公知的。例如，典型的病毒滅活方法包括將混合物在低pH下溫育一段時間，隨后中和pH和過濾除去顆粒物。pH水平的選定主要取決于抗體產(chǎn)物的穩(wěn)定性特征和緩沖液成分。已知在低pH病毒滅活過程中目標抗體的質(zhì)量受pH和低pH溫育時間的影響。病毒滅活除了取決于蛋白質(zhì)濃度外還取決于上述這些參數(shù)，而蛋白質(zhì)在高濃度下會降低滅活作用。因此，可通過常規(guī)實驗選擇正確的蛋白質(zhì)濃度、pH和滅活時間參數(shù)?；旌衔锏膒H可通過任何合適的酸來降低，包括但不限于檸檬酸、乙酸、辛酸或其他合適的酸。在優(yōu)選的實施方案中，用1M檸檬酸調(diào)節(jié)混合物的pH。在一些實施方案中，將混合物在約2.9至約3.9的pH下溫育約15分鐘至約180分鐘。在更多的實施方案中，將混合物在約pH3.571下溫育約60分鐘至約120分鐘。在還更多的實施方案中，將混合物在約pH3.5下溫育約60分鐘至約180分鐘。在一個實施方案中，將包含抗體和HCP的混合物在進^f亍離子交換分離前先進行病毒滅活。在其他實施方案中，將初始洗脫物在進行離子交換分離前先進行病毒滅活。在某些實施方案中，將初始洗脫物在進行陰離子交換層析前先進行病毒滅活。在病毒滅活后，將混合物按需進行調(diào)整，以進行進一步的純化步驟。例如，可將pH調(diào)節(jié)過的匯集物(pool)進行過濾。在一個實施方案中，在低pH病毒滅活和/或過濾后，通常將混合物的pH調(diào)節(jié)至更為中性的pH,例如約6.5至約8.5。例如，可用注射用水(WFI)沖洗混合物以獲得所需的pH。下表4顯示本發(fā)明方法中所用的低pH病毒滅活參數(shù)表4:低oH病毒滅活的可接受搡作參數(shù)操作參數(shù)AOR溫育pH3.0-3.7溫育時間60-180min蛋白質(zhì)濃度23g/L本發(fā)明包括這樣的方法，其中來自離子交換柱的第一洗脫物在進行第二離子交換層析步驟前先進行病毒滅活。在一個實施方案中，病毒滅活是通過pH病毒滅活來實現(xiàn)。IV.測定宿主細胞蛋白質(zhì)(HCP)水平的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還提供測定純化的抗體組合物中的宿主細胞蛋白質(zhì)(HCP)濃度的殘余水平的方法。如上所述，宜將HCP從最終目標物質(zhì)產(chǎn)物(例如抗體)中除去。示例性的HCP包括發(fā)源于抗體生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。若不能從目標抗體中鑒定出并充分除去HCP，可能會導(dǎo)致出現(xiàn)功效降低和/或不利患者反應(yīng)。本文所用的術(shù)語"HCPELISA"指這樣的ELISA,在測定中使用的第二抗體對從用以產(chǎn)生抗體(例如阿達木單抗)的細胞(例如CHO細胞)所產(chǎn)生的HCP具有特異性。第二抗體可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法產(chǎn)生。例如，第二抗體可用通過假裝的生產(chǎn)和純化操作獲得的HCP來產(chǎn)生，該假裝的生產(chǎn)和純化操作即是使用相同的用以產(chǎn)生目的抗體的細胞系，但該細胞系沒有轉(zhuǎn)染抗體DNA。在一個示例性的實施方案中，第二抗體用與在所選的細胞表達系統(tǒng)(即用以產(chǎn)生目標抗體的細胞表達系統(tǒng))中表達的那些HCP類似的HCP來產(chǎn)生。一般來說，HCPELISA包括將包含HCP的液體樣品夾在兩層抗體(即第一抗體和第二抗體)之間。將樣品進行溫育，期間樣品中的HCP被第一抗體(例如親和純化的山羊抗CHO抗體(Cygnus))捕捉。加入對從用以產(chǎn)生該抗體的細胞所產(chǎn)生的HCP有特異性的標記第二抗體(例如生物素?；目笴HOHCP抗體)，該第二抗體會結(jié)合樣品當中的HCP。使用適當?shù)幕诘诙贵w的標記的試驗，就測定出樣品中所含的HCP的量。HCPELISA可用以測定抗體組合物(如用上文III章節(jié)中描述的方法獲得的洗脫物或流通物)中的HCP水平。本發(fā)明還提供包含抗體的組合物，其中經(jīng)HCP酶聯(lián)免疫吸附測定法("ELISA")測定，該組合物沒有可^r測水平的HCP。在一個實施方案中，第一洗脫物包含約12,000至約19,500ng/mg的HCP。在一個實施方案中，第二洗脫物包含約1.0和約0.0ng/mg的HCP。V.測定組織蛋白酶L酶原水平的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供用測定樣品中的組織蛋白酶L酶原的量的動力學(xué)測定(或組織蛋白酶L動力學(xué)測定)。組織蛋白酶L酶原是衍自某些表達系統(tǒng)的宿主細胞蛋白質(zhì)，已知它在被激活成組織蛋白酶L時能造成包括抗體(如阿達木單抗)在內(nèi)的蛋白質(zhì)的分裂。研究已證明，組織蛋白酶L酶原是作為無活性的酶原而被合成，后來被加工成活性的組織蛋白酶L形式。通過其他蛋白酶如組織蛋白酶D，或者通過在溶酶體的酸性條件中的自身催化激活，來對N末端前肽(pro-peptide)區(qū)域進行蛋白水解去除，就發(fā)生組織蛋白酶L酶原的激活(Turk"a/.(1999)JB/ocAem259:929)。jt匕夕卜，MasonWa/,(seeMason"a/.(1992)Bz'oc/zem所o//^/ca/Comw189:1659)報道說，在較低的pH條件下加入帶負電荷的分子如硫酸葡聚糖，可在pH5.5下實現(xiàn)更高程度的組織蛋白酶L激活。之前的檢測組織蛋白酶L酶原(或其活性形式組織蛋白酶L)的水平的方法，包括分析方法如弱陽離子交換層析。但是，若是測試工藝中樣品，即由以上III章節(jié)描述的工藝獲得的樣品，由于緩沖體系干擾和基質(zhì)影響，這種方法是有限的。因此，本發(fā)明提供高通量的熒光酶促方法，來例如為了工藝監(jiān)測目的對組織蛋白酶L酶原進行更好的監(jiān)測。發(fā)明的動力學(xué)測定提供了測定組織蛋白酶L酶原的方法，這種方法測定到的組織蛋白酶L酶原水平是標準的終點測定所不容易檢測到的。該動力學(xué)測定還提供了確定組織蛋白酶L酶原的水平是否是有重現(xiàn)性地低下的手段。在一個實施方案中，可從III章節(jié)中描述的工藝的任何時間點獲得樣品，以證實或確定在整個工藝中組織蛋白酶L酶原的水平得到降低。組織蛋白酶L酶原是通過從蛋白質(zhì)中除去tt末端來激活的。在一個實施方案中，激活是用肽酶如但不限于組織蛋白酶D實現(xiàn)的。組織蛋白酶L一旦激活，就可選擇性地水解底物。將底物與樣品接觸，并根據(jù)底物的變化監(jiān)測組織蛋白酶L活性。在一個優(yōu)選的實施方案中，組織蛋白酶L的底物包含標記。標記可包括任何能讓組織蛋白酶活性得以測定的物質(zhì)。組織蛋白酶L能選擇性水解的標記底物的實例包括合成底物如Z-亮氨酸-精氨酸-AMC(R&DSystems)。肽底物可含有熒光7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)基團，該基團會被AMC的氨基和精氨酸的羧基之間的酰胺鍵所猝滅。組織蛋白酶L切割酰胺鍵時，釋放出的AMC基團是發(fā)熒光的，可通過分別為380nm和460nm的激發(fā)波長和發(fā)射波長來測量。這一激發(fā)可進行測量并用以測定組織蛋白酶L活性水平。底物的周轉(zhuǎn)速率與樣品中存在的組織蛋白酶L的量成正比。這個測量是結(jié)合具有已知的組織蛋白酶L活性和已知的組織蛋白酶L數(shù)量的參比樣品來使用的。然后將樣品中的組織蛋白酶L活性與樣品中存在的抗體數(shù)量建立關(guān)聯(lián)。在一個實施方案中，第一洗脫物包含的組織蛋白酶L活性在約25至約60RFU/s/mg抗體之間。在另一個實施方案中，第一流通物包含的組織蛋白酶L活性在約0.4至約4RFU/s/mg抗體之間。在一個實施方案中，第二洗脫物包含的組織蛋白酶L活性在約0.5至約1.5RFU/s/mg抗體之間。在一個實施方案中，動力學(xué)測定法包括測定書f自哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的材料中的組織蛋白酶L酶原的數(shù)量，而這個測定是通過使該材料與能將組織蛋白酶L酶原加工成活性組織蛋白酶L形式的酶相接觸來進行，由此獲得組織蛋白酶L樣品。組織蛋白酶L一旦激活，就能選擇性地水解底物，包括合成底物如Z-亮氨酸-精氨酸-AMC。然后將底物加到樣品，包括例如含有熒光7-氨基-4-曱基香豆素(AMC)基團的Z-亮氨酸-精氨酸-AMC，該基團會被AMC的氨基和精氨酸的羧基之間的酰胺鍵所猝滅。組織蛋白酶L切割酰胺鍵時，釋放出的AMC基團是發(fā)熒光的，可通過分別為380nm和460nm的激發(fā)波長和發(fā)射波長來測量。測出的組織蛋白酶L活性浮皮用作衍自哺乳動物細胞表達系統(tǒng)(例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)的材料中的組織蛋白酶L酶原含量的指標。在一個實施方案中，第一洗脫物包含的組織蛋白酶L活性在約25至約60RFU/s/mg抗體之間。在另一個實施方案中，第一流通物包含的組織蛋白酶L活性在約0.4至約4RFU/s/mg抗體之間。在一個實施方案中，第二洗脫物包含的組織蛋白酶L活性在約0.5至約1.5RFU/s/mg抗體之間。本發(fā)明還涵蓋介于上述數(shù)量之間范圍，即這些范圍也是本發(fā)明的一部分。例如，用作為上限和/或下限的任何上述數(shù)值的組合得到的凄t值范圍，以及所述范圍間的任何數(shù)量，都要被包括在本發(fā)明中。本發(fā)明包括任何上述的修改，無論是單獨的還是互相組合在一起。VI.藥物組合物可將用本發(fā)明方法獲得的抗體摻入到適合給予受試者的藥物組合物中。通常，所述藥物組合物包含抗體或其抗原結(jié)合部分和藥物可接受載體。本文所用的術(shù)語"藥物可接受載體"包括任何和所有的生理學(xué)上相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和延遲吸收劑等。藥物可接受載體的實例包括下面的一種或幾種水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等以及它們的組合。在很多情況下，組合物中優(yōu)選含有等滲劑，例如糖，多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇，或氯化鈉。藥物可接受載體可以進一步包含少量的能提高抗體或其抗原結(jié)合部分的貯存期或有效性的輔助物質(zhì)，例如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩沖劑。包含用本發(fā)明方法純化的抗體或其抗原結(jié)合部分的藥物組合物，可以是各種各樣的形式。這些包括例如液體、半固體和固體劑型，如液體溶液劑(例如可注射和可灌注溶液劑)、分散劑或混懸劑、片劑、丸劑、粉末劑、脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選形式取決于想要的給藥方式和治療應(yīng)用。典型的優(yōu)選的組合物是可注射或可灌注溶液劑形式，例如與用來以其他抗體或其他TNFa抑制劑對人進行被動免疫的那些組合物類似的組合物。優(yōu)選的給藥方式是腸胃夕卜(例如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi))。在一個優(yōu)選的實施方案中，通過靜脈內(nèi)灌注或注射施用抗體。在另一個優(yōu)選的實施方案中，通過肌內(nèi)或皮下注射施用抗體。治療組合物通常在制備和貯存條件下必須是無菌且穩(wěn)定的。組合物可配制成溶液劑、微乳液劑、分散體、脂質(zhì)體或者適合高藥物濃度的其他有序結(jié)構(gòu)。無菌可注射溶液劑可以這樣制備將所需量的活性化合物(即抗體或其抗原結(jié)合部分)與以上所列的一種或多種成分(按需)摻入到適當?shù)娜軇┲校缓筮^濾滅菌。通常，分散體是通過將活性化合物摻入到含有^5出分散介質(zhì)和以上所列的其他所需成分的無菌介質(zhì)來制備。在供制備無菌可注射溶液劑的無菌粉末劑的情況中，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，從之前過濾過的活性成分與任何其他所需成分的、溶液產(chǎn)生出這些成分的粉末。溶液的合適流動性，可例如通過使用包衣如卵磷脂，通過保持必需的顆粒度(在M體情況中)和通過使用表面活性劑來保持。可注射組合物的長時間吸收，可通過在組合物中包含能延遲吸收的物質(zhì)(例如單硬脂酸鹽和明膠)來造成。組合物中還可以摻入補充的活性化合物。在某些實施方案中，將用于本發(fā)明方法的抗體或其抗原結(jié)合部分與一種或多種另外的治療藥物共同配制和/或共同給藥。例如，可將本發(fā)明的抗hTNFoc抗體或抗體部分與一種或多種下面的物質(zhì)共同配制和/或共同給藥一種或多種DMARD或者一種或多種NSAID或者一種或多種能結(jié)合其他靶物的另外的抗體(例如能結(jié)合其他細胞因子或者能結(jié)合細胞表面分子的抗體)，一種或多種細胞因子、可溶性TNFa受體(參見例如PCT公開號WO94/06476)和/或一種或多種能抑制hTNFa產(chǎn)生或活性的化學(xué)物質(zhì)(例如PCT公開號WO93/19751中描述的環(huán)己烷-亞基(cyclohexane-ylidene)衍生物)或者它們的任何組合。此外，可將本發(fā)明的一種或多種抗體與兩種或多種上述治療物質(zhì)聯(lián)合使用。這種聯(lián)合治療可以有利地采用較低劑量的所施用治療藥物，從而避免與各種單一治療有關(guān)的可能副作用、并發(fā)癥或者低水平患者反應(yīng)。在一個實施方案中，本發(fā)明包括包含有效量的TNFot抗體或其抗原結(jié)合部分和藥物可接受載體的藥物組合物，其中該有效量的TNFa抗體可以有效治療TNFa-相關(guān)病癥，包括例如克羅恩氏病。在一個實施方案中，將抗體或抗體部分如PCT/IB03/04502和美國申請?zhí)?0/222140所述摻入到藥物制劑中，這兩個專利通過引用結(jié)合到本文中。這個制劑包含濃度50mg/ml的抗體阿達木單抗，其中一個預(yù)填充注射器含有40mg的抗體供皮下注射。用本發(fā)明方法獲得的抗體或抗體部分可通過多種本領(lǐng)域公知的方法給藥，但是對于很多治療性應(yīng)用來說，優(yōu)選的給藥途徑/方式是皮下注射。在另一個實施方案中，給藥是通過靜脈內(nèi)注射或灌注。技術(shù)人員會認識到，給藥途徑/方式要根據(jù)期望的結(jié)果的不同而異。在某些實施方案中，活性化合物可與能使化合物免于快速釋;^文的載體一起制備成例如控釋制劑，包括植入物、透皮貼和微膠嚢送遞系統(tǒng)?？?吏用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚肝類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。很多制備這種制劑的方法已申請了專利或者是本領(lǐng)域技術(shù)人員7^知的。參見例如5Wto/"edam/Co"fra〃e(iie/easeZ)n/gZ)e//ve^yS少他ms,J.R.Robinson,ed.,MarcelDekker，Inc.,NewYork,1978。制劑的形式給藥，這種制劑包括幾種蛋白質(zhì)晶體包嚢在聚合物載體當中形成包衣顆粒。蛋白質(zhì)晶體制劑的包衣顆?？梢跃哂星蛐涡螤睿侵睆阶畲?00微米的微球體，或者它們可以具有一些其他形狀，是微顆粒。提高的蛋白質(zhì)晶體濃度使得本發(fā)明的抗體可進行皮下遞送。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體通過蛋白質(zhì)送遞系統(tǒng)進行送遞，其中將一種或多種蛋白質(zhì)晶體制劑或組合物給予患有TNFa相關(guān)病癥的患者。WO02/072636中還描述了完整抗體晶體或抗體片段晶體的穩(wěn)定化制劑組合物及制備方法，該專利通過引用結(jié)合到本文中。在一個實施方案中，采用本發(fā)明的多可變劑量(multiple-variabledose)方法，使用PCT/IB03/04502和美國申請?zhí)?0/222140(這兩個專利通過引用結(jié)合到本文中)中描述的包含結(jié)晶化抗體片段的制劑，來治療TNFot相關(guān)病癥。在某些實施方案中，用本發(fā)明方法獲得的抗體或其抗原結(jié)合部分可以例如用惰性稀釋劑或可同化可食用載體進行口服給藥?；衔?如需要的話，還有其他的成分)還可以密封在硬殼或軟殼明膠膠嚢中壓成片劑，或者直接摻入到患者飲食中。對于口服治療給藥，可將化合物與賦形劑一起摻入，以可攝取的片劑、口腔片劑、糖錠(troche)、膠嚢劑、酏劑、懸浮劑、糖漿劑、糯米紙嚢劑等形式使用。為了通過腸胃外給藥之外的途徑施用本發(fā)明的化合物，可能有必要將化合物用能防止其失活的材料包衣，或者將化合物與該材料共同施用。本發(fā)明的藥物組合物可以包括"治療有效量"或"預(yù)防有效量"的本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分。"治療有效量，，指在必需的劑量下和時間內(nèi)能有效實現(xiàn)期望的治療結(jié)果的量。抗體或其抗原結(jié)合部分的治療有效量可因各種因素而異，所述因素如個體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重，以及抗體、抗體部分、其他TNFa抑制劑在個體中引起期望的反應(yīng)的能力。治療有效量還是這樣的量，在該量下治療有益效果超過抗體或其抗原結(jié)合部分的任何毒性或有害效果。"預(yù)防有效量，，指在必需的劑量下和時間內(nèi)能有效實現(xiàn)期望的預(yù)防結(jié)果的量。通常，由于預(yù)防劑量是在疾病之前或早期對受試者使用，預(yù)防有效量要小于治療有效量?？梢詫┝糠桨高M行調(diào)整，以提供最優(yōu)的期望反應(yīng)(例如治療或預(yù)防反應(yīng))。例如，可以施用單一推注劑(bolus),可以將幾個分開的劑量隨時間推移而施用，或者可根據(jù)治療情況的緊急程度的指示而按比例減少或增加劑量。特別有利的是將腸胃外用組合物配制成單位劑量形式，使容易給藥并且劑量均勻。本文所用的單位劑量形式是指適合作為單元劑量用于待治療哺乳動物受試者的物理上分立單位；每個單位包含經(jīng)計算能產(chǎn)生期望的治療作用的預(yù)定量活性化合物和必需的藥學(xué)載體。本發(fā)明的單位劑量形式的規(guī)格受支配于和直接取決于(a)活性化合物的獨特特性和所要實現(xiàn)的特定治療或預(yù)防效果，和(b)將這種活抗體或其抗原結(jié)合部分的治療或預(yù)防有效量的示例性非限制性范圍是10-200mg，更優(yōu)選20-160mg,更優(yōu)選40-80mg,最優(yōu)選大約80mg。在一個實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分的治療有效量是約20mg。在另一個實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分的治療有效量是約40mg。在又一個實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分的治療有效量是約80mg。在一個實施方案中，用于本發(fā)明方法的抗體或其抗原結(jié)合部分的治療有效量是約120mg。在又一個實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分的治療有效量是約160mg。上述劑量范圍的中間范圍，例如約78.5至約81.5;約15至約25;約30至約50;約60至約100;約90至約150;約120至約200，也認為是本發(fā)明的一部分。例如，用作為上限和/或下限的任何上述數(shù)值的組合得到的數(shù)值范圍，也認為被包括在本發(fā)明中。要指出的是，劑量值可隨所要減輕的病癥的類型和嚴重程度的不同而異。還要知道，對于任何特定患者，具體劑量方案應(yīng)該根據(jù)個體的需要和進行給藥或進行組合物給藥管理的人員的專業(yè)判斷而隨時間調(diào)節(jié)，本文提出的劑量范圍只是示例性的，并不意在限制所要求保護的組合物的范圍或?qū)嵤?。用本發(fā)明方法獲得的抗體或其抗原結(jié)合部分，可以如wo02/100330所述以雙周給藥方案來施用，如WO04/037205所述以低劑量方案來施用，和如WO05/110452所述以多變給藥方案來施用，每個專利都通過引用結(jié)合到本文中。的經(jīng)包裝藥物組合物、制造品或藥盒。制造品可包含用本發(fā)明方法獲得的抗體或其抗原結(jié)合部分和包裝材料。制造品還可包含標簽或包裝插頁，該標簽或包裝插頁說明包含抗體或其抗原結(jié)合部分的制劑或組合物具有降低的HCP和/或組織蛋白酶L酶原水平。制造品可包含裝在包裝材料當中的標簽或包裝插頁，該標簽或包裝插頁說明阿達木單抗制劑包含不超過約70ng/mg的HCP，或者制造品可包含裝在包裝材料當中的標簽或包裝插頁，該標簽或包裝插頁說明阿達木單抗制劑包含不超過約13ng/mg的HCP。制造品可包含裝在包裝材料當中的標簽或包裝插頁，該標簽或包裝插頁說明阿達木單抗制劑包含不超過約5ng/mg的HCP。制造品還可包含這樣的包裝材料，它說明阿達木單抗制劑所包含的組織蛋白酶L酶原的水平不超過約3.0RFU/s/mg阿達木單抗的組織蛋白酶L活性所指示的水平。VII.治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)HCP或組織蛋白酶L酶原降低的抗體制品的方法，該抗體制品可用于抑制患有其中TNFa活性有害的病癥的受試者中的TNFoc活性。TNFa被指涉及眾多病癥的病理生理(參見例如Moeller，A.,&(1990)Cy。h,"e2:162-169;Moeller"a/.的美國專利5，231，024;Moeller，A.的歐洲專利公開號260610Bl)。TNFa被指涉及眾多TNFa相關(guān)病癥的病理生理，包括膿毒癥、感染、自身免疫性疾病、移植排斥和移植物抗宿主病(參見例如Moeller,A.，Wa/.(1990)Cy。h"e2:162-169;Moellerda/.的美國專利5,231,024;Moeller，A.^a/,的歐洲專利公開號260610Bl;Vasilli，P.(1992)j朋w.Wev./附m朋o/.辺:411-452;Tracey，K丄andCerami，A.(1994)iev.Med.4i:491-503)。本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)HCP或組織蛋白酶L酶原降低的抗體制品的方法，該抗體制品有利于抑制患有TNFoc相關(guān)病癥的受試者中的TNFa活性，所述方法包括對受試者給予起始誘導(dǎo)劑量的抗體或其抗原結(jié)合片段，隨后給予治療劑量的抗體或其抗原結(jié)合片段，使得TNFoc活性被抑制。優(yōu)選低，TNFot為人TNFa，受試者為人受試者。在一個實施方案中，TNFa抑制劑為阿達木單抗，也稱111^11^@(D2E7)。本文所用的術(shù)語"其中TNFa活性有害的病癥"用以包括這樣的疾病或其他病癥，其中TNFa在患有該病癥的受試者中的存在已被證明或正被懷疑是造成該病癥的病理生理的原因或者是促使該病癥惡化的因素。因此，其中TNFa活性有害的病癥是這樣的病癥，對其中TNFa活性的抑制預(yù)期能緩解其癥狀和/或進展。這種病癥可例如由患有它的受試者的生物流體中TNFa濃度的增力口(例如受試者血清、血漿、滑膜液等中TNFa濃度的增力口)來證實，所述增加可例如用上文所述的抗TNFoc抗體來檢測。其中TNFa活性有害的病癥的實例有很多。以下進一步討論用本發(fā)明方法獲得的TNFot抗體和抗體部分用于治療具體病癥的用途。A.,#癥腫瘤壞死因子在膿毒癥的病理生理中具有確立的作用，其生物作用包括低血壓、心肌抑制、血管滲漏綜合征、器官壞死、毒性二次介導(dǎo)物釋放的刺激和凝血級聯(lián)的激活(參見例如Moeller，A.，&(19卯)Cj油."e2:162-169;Moeller"a/.的美國專利5,231,024;Moeller,A.的歐洲專利7>開號260610Bl;Tracey,K丄andCerami,A.(1994)Wev.M^/.M:491-503;Russell，DandThompson,R.C.(1993)Cwr.qp/w.4:714-721)。本發(fā)明的多變劑量方法可以用于治療任意臨床情形的膿毒癥，包括膿毒性休克、內(nèi)毒素性休克、革蘭氏陰性膿毒癥和中毒性休克綜合征。此外，為了治療膿毒癥，可將用本發(fā)明方法獲得的抗hTNFa抗體或抗體部分，與一種或多種可進一步緩解膿毒癥的另外的治療劑聯(lián)合給藥，所述另外的治療劑例如白細胞介素-1抑制劑(如PCT公開號WO92/16221和WO92/17583中所述的)、細胞因子白細胞介素-6(參見例如PCT公開號WO93/11793)或血小板活化因子拮抗劑(參見例如歐洲專利申請公開號EP374510)。在一個優(yōu)選的實施方案中，將抗TNFa抗體或抗體部分給予這樣的人受試者，他屬于在治療時血清或血漿IL-6濃度高于500pg/ml、更優(yōu)選1000pg/ml的膿毒癥患者亞群(參見PCT公開號WO95/20978byDaum,L.,"a/.)。B.腫瘤壞死因子被指涉及在多種自身免疫性疾病的病理生理中起作用。例如，TNFa被指涉及在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中激活組織炎癥和造成關(guān)節(jié)破壞(參見例如Moeller,A.，"a/.(1990)Cy。hVze2:162-169;MoellerWa/.的美國專利5，231,024;Moeller,A.的歐洲專利公開號260610Bl;TraceyandCerami,出處同上；Arend,W.P.andDayer，J畫M.(1995)JW/z.^:151-160;Fava,R.A.，"a/.(1993)C//"./mm柳o/.24:261-266)。TNFot還被指涉及在糖尿病中促進胰島細胞死亡和介導(dǎo)胰島素抗性(參見例如TraceyandCerami，出處同上；PCT公開號WO94/08609)。TNFa還被指涉及在多發(fā)性硬化中介導(dǎo)對少突膠質(zhì)細胞的細胞毒性和誘導(dǎo)炎性斑塊(參見例如TraceyandCerami,出處同上)。TNF(還被指涉及在多發(fā)性硬化中介導(dǎo)對少突膠質(zhì)細胞的細胞毒性和諸導(dǎo)炎性斑塊(參見例如TraceyandCerami,出處同上)。已對嵌合和人源化的鼠抗hTNFoc抗體進行了治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎方面的臨床測試(參見例如Elliott,M丄，Wa/.(1994)344:1125-1127;Elliot,M丄，da/.(1994)星:l105-1110;Rankin,E.C.，"a/.(1995)/i^ewmato/.M:334國342)。TNFoc抗體如阿達木單抗可用來治療自身免疫性疾病，特別是那些與炎癥相關(guān)的自身免疫性疾病。這類自身免疫性疾病的實例包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性脊推炎、骨關(guān)節(jié)炎和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、變態(tài)反應(yīng)、多發(fā)性硬化、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎和腎病綜合征。自身免疫性疾病的其它實例包括多系統(tǒng)自身免疫性疾病和自身免疫性聽覺缺失。通常是經(jīng)全身給予抗體或抗體部分，不過就某些病癥而言，在炎癥部位局部給予抗體或抗體部分可能是有益的(例如單獨或與如PCT發(fā)明者G·扎比斯-帕帕斯托伊特西斯,G·阿夫格尼諾斯,M·W·萬申請人:艾博特生物技術(shù)有限公司