用于診斷和/或監(jiān)測(cè)結(jié)核病的生物標(biāo)記的制作方法
【專利說明】用于診斷和/或監(jiān)測(cè)結(jié)核病的生物標(biāo)記 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物標(biāo)記，所述生物標(biāo)記用于同時(shí)在具有免疫活性的和免疫缺損的個(gè) 體中診斷和/或監(jiān)測(cè)結(jié)核病，監(jiān)測(cè)個(gè)體對(duì)抗分枝桿菌化學(xué)治療的反應(yīng)，監(jiān)測(cè)潛伏性結(jié)核病 向活動(dòng)性結(jié)核病的發(fā)展，區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病與潛伏性結(jié)核病和類似結(jié)核?。═B)的其它臨 床病況。本發(fā)明還涉及使用所述生物標(biāo)記來診斷、治療和監(jiān)測(cè)結(jié)核病的方法。以上在所有 方面同時(shí)涉及肺部和肺外結(jié)核分枝桿菌感染，其中結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的致病微生物。
[0002] 發(fā)明背景 結(jié)核分枝桿菌可論證為世界范圍的最成功的病原性微生物之一，并且是潛在致命的感 染性疾病結(jié)核病的病原體。它也是全世界內(nèi)從潛在可治愈的感染性疾病所致死亡的主要原 因，估計(jì)每年有兩百萬相關(guān)死亡。
[0003] TB的發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，最初發(fā)生感染是吸入氣溶膠化感染性結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果。 針對(duì)桿菌損害的免疫應(yīng)答影響了受感染個(gè)體是否將會(huì)繼續(xù)發(fā)展局部肺部疾病、潛伏性疾病 (LTBI)或作為血源性擴(kuò)散的結(jié)果的散播性疾病。那些獲得性潛伏性疾病保持無癥狀，但保 留演變?yōu)榛顒?dòng)性疾病的可能性（這在一生中在所有病例的大約10%中發(fā)生）。
[0004] 估計(jì)大約三分之一的世界人口感染了潛伏性或活動(dòng)性結(jié)核病。來自2011年的近 來Health Protection Agency (HPA)數(shù)據(jù)報(bào)告在UK總共有9, 042例活動(dòng)性結(jié)核病。這代 表了在上一年度有5. 3%增加，并且表明在UK在流行率上呈上升趨勢(shì)。耐受抗生素的結(jié)核 分枝桿菌分離物的數(shù)量也在不斷上升。
[0005] 肺TB是結(jié)核分枝桿菌感染的最常見臨床表現(xiàn)。癥狀典型地包括慢性咳嗽伴有或 不伴有咯血、發(fā)熱、盜汗和體重減輕。僅患有活動(dòng)性肺病的個(gè)體才保持感染性，因?yàn)樗麄兙?有將桿菌氣溶膠化的能力。幾乎任何其他器官系統(tǒng)的感染都可能發(fā)生，并具有不同的伴隨 臨床表現(xiàn)。免疫缺損個(gè)體可能具有非典型表現(xiàn)。
[0006] 該病原體已經(jīng)表現(xiàn)出極大的復(fù)燃，這部分地由在撒哈拉以南非洲地區(qū)的HIV流行 所驅(qū)動(dòng)，因?yàn)檫@些個(gè)體的免疫應(yīng)答受損。這具有雙重影響。首先，個(gè)體更可能從已有的潛伏 性疾病發(fā)展為活動(dòng)性疾病，第二，原發(fā)感染更可能表現(xiàn)為活動(dòng)性疾病的形式，具有增加的感 染性。隨著增加的全球化，該氣溶膠化病原體的檢測(cè)、預(yù)防和早期合適治療正在成為日益重 要的公共衛(wèi)生中優(yōu)先考慮的問題。
[0007] 盡管有廣泛研宄，但目前對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫應(yīng)答和發(fā)病機(jī)理的理解仍然不完 全。此外，現(xiàn)有的診斷和治療方法是欠佳的。結(jié)核病是通過在臨床標(biāo)本中的致病微生物（結(jié) 核分枝桿菌）的鑒定而確診。這通過長(zhǎng)時(shí)間的微生物培養(yǎng)或通過PCR分析完成。確診的輔 助方法包括：診斷用成像（X射線或放射掃描）、結(jié)核菌素皮試（Mantoux/Heaf?試驗(yàn)）和干 擾素Y釋放測(cè)定法（IGRA)。
[0008] 對(duì)于快速確診TB的現(xiàn)有障礙包括難以在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)這種生長(zhǎng)緩慢的微生物， 這會(huì)耗費(fèi)大約3-12周，或難以獲得用于PCR的含有分枝桿菌DNA的合適樣品。后者在肺外 TB的情況下可能需要有創(chuàng)性采樣，這是昂貴的并且可能包括對(duì)患者的額外風(fēng)險(xiǎn)。
[0009] National Institute for Health and Clinical Excellence (NICE)目前正在評(píng) 價(jià)基于PCR的測(cè)定法（稱為"Xpert MTB/RIF試驗(yàn)"），用于痰樣品，以診斷疑似活動(dòng)性肺結(jié) 核病的病例，并檢測(cè)利福平抗性突變，這類突變是多重耐藥性結(jié)核病的標(biāo)記。然而，該方法 學(xué)取決于所獲得的PCR-陽(yáng)性樣品。
[0010] 作為欠佳的診斷工具的結(jié)果，抗微生物聯(lián)合化學(xué)治療的治療通常是根據(jù)臨床懷疑 以及輔助診斷試驗(yàn)結(jié)果，憑經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行。該方法的原理是雙重的。患者接受抗微生物化學(xué)治 療的治療試驗(yàn)，并且在肺結(jié)核病的情況下，通過降低痰中的桿菌載量而減少傳播。
[0011] 目前診斷的輔助方法包括：放射性成像、IGRA和結(jié)核菌素皮試（TST)。成像提供 了典型特征是否出現(xiàn)的指導(dǎo)，而IGRA和TST通過查詢針對(duì)TB-相關(guān)抗原的免疫應(yīng)答，提供 了可能之前暴露給結(jié)核分枝桿菌（I (Mercy/iosis)的相關(guān)信息。IGRA試驗(yàn)和TST試驗(yàn) 的解釋是復(fù)雜的并且混雜許多因素。這些包括若干其它因素：在暴露前（潛伏性疾?。?，在 用BCG接種前，和免疫抑制。然而，IGRA在TB低流行國(guó)家中已經(jīng)日益成為可接受的輔助工 具，用于評(píng)價(jià)存在結(jié)核病的可能性?？上У氖牵上?、TST和IGRA試驗(yàn)都不能確診活動(dòng)性疾 病的存在。
[0012] 近來出版物已經(jīng)強(qiáng)調(diào)了使用生物標(biāo)記的組合作為結(jié)核病的診斷工具的潛力。W0 03/075016描述了在血中可檢測(cè)的可溶性蛋白水平，即可溶性⑶抗原（"s⑶"）s⑶15、 s⑶23、s⑶27和s⑶54,在結(jié)核病患者中可能被改變。來自美國(guó)胸科協(xié)會(huì)（American Thoracic Society，ATS) 2010 國(guó)際會(huì)議的 Medscape Medical News 文章表明，IL-15 和 MCP-1的組合將84%患者準(zhǔn)確地分類為具有活動(dòng)性或潛伏性結(jié)核病。Chegou (第二屆IGRA 全球會(huì)議（2nd Global Symposium on IGRAs)，2009年5-6月）描述了相比單個(gè)分析物，分析 物組合是更有希望的TB診斷學(xué)并提出測(cè)量EGF、sCD40L、MIP-1 0、VEGF、TGF- a或IL-1 a 作為活動(dòng)性TB的快速檢驗(yàn)。Wu等人（2007) J Immunol 178，3688-3694指出IL-8、F0XP3 和IL-12 0提供了區(qū)分潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染和活動(dòng)性結(jié)核病疾病的手段。
[0013] 因?yàn)槟壳癟B的診斷方法學(xué)欠佳，所以對(duì)于該病可用太多的治療選項(xiàng)。作為該病原 體的胞內(nèi)性質(zhì)的結(jié)果，以及在TB治療學(xué)領(lǐng)域缺乏足夠的創(chuàng)新的結(jié)果，TB治療基礎(chǔ)仍然是在 最簡(jiǎn)單情況下在幾個(gè)月的延長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的聯(lián)合抗微生物化學(xué)治療。然而，對(duì)治療的部分依從 性可導(dǎo)致抗微生物劑的欠佳治療性水平，和抗生素抗性突變的微小進(jìn)化。因此，患者可能在 較長(zhǎng)的期限內(nèi)保持感染性，并且增加了傳播頻率。這些抗性突變的發(fā)展（其中有些對(duì)所有 已知抗TB藥物無反應(yīng)（多重耐藥性））近來在印度已經(jīng)引起高度關(guān)注。
[0014] 因此非常需要鑒定更有效的和高效的方法，用于同時(shí)確診活動(dòng)性和潛伏性TB，尤 其是活動(dòng)性和潛伏性TB的鑒別診斷。
[0015] 發(fā)明概沐 依據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供SCD170作為生物標(biāo)記的用途，用于診斷和/或監(jiān)測(cè)結(jié)核 病。
[0016] 依據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供IFN-y和S⑶170作為生物標(biāo)記的用途，用于診斷和 /或監(jiān)測(cè)結(jié)核病。
[0017] 依據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供診斷和/或監(jiān)測(cè)結(jié)核病的方法，包括在采自試驗(yàn) 受試者的臨床樣品中檢測(cè)和/或定量測(cè)定SCD170,任選地與IFN-Y和/或本文中定義的一 種或多種另外的分析物生物標(biāo)記組合。
[0018] 依據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供在個(gè)體中診斷結(jié)核病的方法，包括： (a) 從個(gè)體獲得試驗(yàn)生物樣品； (b) 定量測(cè)定SCD170的量，任選地與IFN-Y和/或本文中定義的一種或多種另外的 分析物生物標(biāo)記組合； (c) 比較所述試驗(yàn)生物樣品中的所述分析物生物標(biāo)記的量與一種或多種對(duì)照樣品中 存在的量，使得所述試驗(yàn)生物樣品中的所述分析物生物標(biāo)記水平的差異表明結(jié)核病的診 斷。
[0019]依據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供在患有或疑似患有結(jié)核病的受試者中監(jiān)測(cè)抗微 生物治療功效的方法，包括在所述受試者的樣品中檢測(cè)和/或定量測(cè)定SCD170,任選地與 IFN-y和/或本文中定義的一種或多種另外的分析物生物標(biāo)記組合。
[0020] 依據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供在單個(gè)受試者中確定抗微生物結(jié)核病治療功效的 方法，包括： (a) 從個(gè)體獲得生物樣品； (b) 定量測(cè)定SCD170的量，任選地與IFN-y和/或本文中定義的一種或多種另外的 分析物生物標(biāo)記組合； (c) 比較所述試驗(yàn)生物樣品中的所述分析物生物標(biāo)記的量與一種或多種對(duì)照樣品中 存在的量，使得所述試驗(yàn)生物樣品中的所述分析物生物標(biāo)記水平的差異表明結(jié)核病的診 斷。
[0021] 依據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供在有需要的個(gè)體中治療結(jié)核病的方法，其中所述 方法包括以下步驟： (a) 依據(jù)本文所述的方法在個(gè)體中診斷結(jié)核??；然后 (b) 在結(jié)核病陽(yáng)性診斷的情況下將抗結(jié)核病藥物給予所述個(gè)體。
[0022] 本發(fā)明的進(jìn)一步方面提供能夠與分析物生物標(biāo)記特異性結(jié)合的配體，例如天然發(fā) 生的或化學(xué)合成的化合物。本發(fā)明的配體可包含能夠與分析物生物標(biāo)記特異性結(jié)合的肽、 抗體或其片段、或適體或寡核苷酸。所述抗體可以是能夠與分析物生物標(biāo)記特異性結(jié)合的 單克隆抗體或其片段。本發(fā)明的配體可以用可檢測(cè)標(biāo)記來標(biāo)記，例如發(fā)光、熒光或放射性標(biāo) 記；或者或此外，本發(fā)明的配體可以用親和標(biāo)簽來標(biāo)記，所述標(biāo)簽例如生物素、抗生物素蛋 白、鏈霉抗生物素或His (例如hexa-His)標(biāo)簽。
[0023] 本發(fā)明的生物傳感器可包含能夠與針對(duì)分析物生物標(biāo)記的抗體特異性結(jié)合的分 析物生物標(biāo)記或其結(jié)構(gòu)/形狀模擬物。還提供了陣列，其包含本文所述的配體或模擬物。
[0024] 本發(fā)明還提供能夠識(shí)別分析物生物標(biāo)記的本文所述的一種或多種配體的用途，所 述配體可以是天然存在的或化學(xué)合成的，并且適宜地為肽、抗體或其片段、適體或寡核苷 酸、或任何其它天然或人工化學(xué)實(shí)體；或提供本發(fā)明生物傳感器、本發(fā)明的陣列、或本發(fā)明 的試劑盒的用途，用于檢測(cè)和/或定量檢測(cè)分析物。在這些用途中，可在生物樣品上進(jìn)行 檢測(cè)和/或定量測(cè)定，所述樣品例如來自全血、血清、血漿、組織液、腦脊液（CSF)、滑液、濾 泡液、精液、羊水、乳汁、尿、胸水、腹水、支氣管肺泡灌洗液、唾液、痰、淚、汗水、淋巴液、吸出 物、骨髓吸出物和粘液，或從其中的提取物或純化物，或其稀釋液。
[0025]提供診斷或監(jiān)測(cè)試劑盒，以進(jìn)行本發(fā)明的方法。這樣的試劑盒將適宜地包含用于 檢測(cè)和/或定量測(cè)定分析物生物標(biāo)記的本發(fā)明的配體，和/或本文所述的生物傳感器和/ 或陣列，任選連同試劑盒使用說明書。
[0026] 本發(fā)明的進(jìn)一步方面是試劑盒，包括生物傳感器，其能夠檢測(cè)和/或定量測(cè)定本 文定義的一種或多種分析物生物標(biāo)記，用于監(jiān)測(cè)或診斷結(jié)核病。
[0027] 結(jié)核病的生物標(biāo)記是發(fā)現(xiàn)新靶標(biāo)和藥物分子的主要靶標(biāo)，所述藥物減少或預(yù)防所 述病癥相關(guān)癥狀的發(fā)展。因?yàn)榉治鑫锷飿?biāo)記水平表明病癥的診斷和藥物反應(yīng)的可能性， 所以生物標(biāo)記可用于在體外和/或在體內(nèi)測(cè)定