具有增強(qiáng)的光學(xué)信號(hào)的微流體傳感器的制造方法
【專利說明】具有增強(qiáng)的光學(xué)信號(hào)的微流體傳感器
[0001] 交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年10月1日提交的序列號(hào)為61/708, 314的美國臨時(shí)申請(qǐng)的權(quán) 益，通過本文中的提述收錄該申請(qǐng)用于所有目的。
[0003] 關(guān)于得到聯(lián)邦政府資助的研宄的聲明
[0004] 本發(fā)明是在美國政府的支持下由（美國）國防部高級(jí)研宄計(jì)劃局（DARPA)授予的 基金號(hào)FA9550-08-1-0222資助而做出的。美國政府對(duì)本發(fā)明具有某些權(quán)利。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 人們對(duì)于增強(qiáng)發(fā)光信號(hào)（例如熒光信號(hào)）和檢測(cè)靈敏度及縮短生物學(xué)和化學(xué)測(cè)定 法的測(cè)試時(shí)間存在強(qiáng)烈的需求。本申請(qǐng)涉及用于實(shí)現(xiàn)性能增強(qiáng)（即冷發(fā)光放大和檢測(cè)靈敏 度改進(jìn)）和測(cè)定時(shí)間縮短的微結(jié)構(gòu)/納米結(jié)構(gòu)和分子層和微流體通道和方法，它們的制造 和應(yīng)用。
[0007]發(fā)明概述
[0008] 本公開提供，除其他事項(xiàng)之外，用于檢測(cè)液體中的分析物的微流體裝置，其包括： 基片；所述基片的表面上的流體通道；和位于所述通道的某一位置的納米傳感器，該納米 傳感器包括：納米結(jié)構(gòu)，該納米結(jié)構(gòu)包括至少一個(gè)納米結(jié)構(gòu)元件，每個(gè)元件包括至少兩個(gè)由 間隙分開的金屬結(jié)構(gòu)；和沉積于該納米結(jié)構(gòu)的表面上的捕捉劑，其中該捕捉劑特異性結(jié)合 分析物。當(dāng)分析物結(jié)合于或接近于捕捉劑時(shí)，該納米傳感器放大去往和/或來自分析物或 附接于分析物的光標(biāo)記物的光信號(hào)。本公開還提供能與移動(dòng)智能電話集成的便攜式測(cè)定系 統(tǒng)。微流體裝置還提供比沒有微流體通道的裝置更短的測(cè)定時(shí)間和更小的樣品體積。
[0009] 附圖簡(jiǎn)述
[0010] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，如下所述的附圖僅用于說明目的。所述附圖并不意圖 以任何方式限制本文教導(dǎo)的范圍。有些附圖并未依比例給出。
[0011] 圖1A-1I示意性地示出了納米流體裝置的一些實(shí)施方案的各種特征。
[0012] 圖2示意性地示出了一種示例性的抗體檢測(cè)測(cè)定。
[0013] 圖3示意性地示出了一種示例性的核酸檢測(cè)測(cè)定。
[0014] 圖4示意性地示出了另一實(shí)施方案的核酸檢測(cè)測(cè)定。
[0015] 圖5示意性地示出了一種示例性的自組裝單層。
[0016] 圖6不意性地不出系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方案。
[0017] 圖7示意性地示出了系統(tǒng)的另一實(shí)施方案。
[0018] 圖8示意性示出智能手機(jī)的實(shí)施方案。
[0019] 圖9:裝置結(jié)構(gòu)及其制造過程。（a-b)裝置架構(gòu)；（c)通過納米壓印制造的鉻（Cr) 點(diǎn)陣列的電子掃描顯微鏡（SEM)圖像；（d-e)底部傳感器和通道層的制造；（f)中間的聚二 甲基硅氧烷（PDMS)入口和出口層；（g)金（Au)蒸鍍和全部三個(gè)層的接合。
[0020] 圖10 : (a)模型免疫測(cè)定實(shí)驗(yàn)的光學(xué)機(jī)構(gòu)。激光束掃描面積為100 ymX 100 ym ; (b)-(c)熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系。五參數(shù)邏輯回歸模型顯示，微流體通道裝置中的D2PA的 檢測(cè)極限為850aM;玻璃參比的檢測(cè)極限為2nM，96孔板測(cè)定中的D2PA的檢測(cè)極限為lfM。
[0021] 圖11A和11B :流體通道中的金納米點(diǎn)的納米壓印形成圖案的原理圖。（a)涂覆有 底層的二氧化硅（Si02)/抗反射膜（ARC)的熔融石英基片；(b)通過光刻定義出的微流體通 道；（c)在底層的二氧化娃/抗反射膜和恪融石英中圖案化（patterning)的微通道，在這 里光刻膠被除去；（d)涂覆在基片上的二氧化硅/抗反射膜的中間層；(e)第二次光刻，以 定義出用于金納米點(diǎn)的納米結(jié)構(gòu)窗口（nano-featuring patterning window) ;(f)通過反 應(yīng)離子刻蝕（RIE)轉(zhuǎn)印到中間層二氧化硅/抗反射膜的納米結(jié)構(gòu)窗口； (g)基片上涂覆并 平坦化的壓印膠層；(h)通過納米柱壓印模具在壓印膠中圖案化覆蓋以鉻掩模的納米孔； (i)通過蒸鍍和剝離納米柱在流體通道中圖案化金納米點(diǎn)。
[0022] 圖12A :DNA分子的熒光增強(qiáng)。（a)等離激元（Plasmonic)納米結(jié)構(gòu)增強(qiáng)熒光以實(shí) 現(xiàn)增強(qiáng)熒光激發(fā)和輻射發(fā)射的示意圖；(b)流體通道中的等離激元D2PA結(jié)構(gòu)同時(shí)拉伸DNA 和增強(qiáng)熒光的原理圖，其中圓點(diǎn)指示出強(qiáng)熒光增強(qiáng)的熱點(diǎn)。
[0023] 圖12B:圖案化流體通道中的等離激元金D2PA的原理圖。a-b，通道中的D2PA陣 列的設(shè)計(jì)橫截面幾何尺寸：（a)密封之前；(b)為增強(qiáng)DNA熒光而接合之后。c-j，制造示意 圖：（c)涂覆有二氧化硅/抗反射膜底層的熔融石英基片；（d)熔融石英中定義的微流體通 道；（e)二氧化硅/抗反射膜的中間層；（f)第二次光刻和反應(yīng)離子刻蝕，以在二氧化硅（中 間疊層）中定義出D2PA結(jié)構(gòu)窗口；（g)壓印膠中UV壓印出的納米孔；(h)剝離后熔融石英 上圖案化的Cr納米點(diǎn)；（i)熔融石英中的納米柱蝕刻；（j)蒸鍍金之后的D2PA陣列。
[0024] 圖12C:流體通道中制造的納米柱和D2PA納米結(jié)構(gòu)。a至b，在流體通道中選擇 性地圖案化并且與通道邊緣自對(duì)齊的納米柱的側(cè)視（45° )SEM圖像，納米柱的尺寸為高 60nm、直徑115nm。（c)連接到入口 /出口及附屬通道的通道中的納米柱區(qū)域的光學(xué)圖像。 d-e，制造的D2PA陣列的SEM圖像：（d)具有10nm的垂直腔間隙、直徑為145nm的D2PA陣 列的高倍率45°側(cè)視圖，剖視圖作為嵌入圖顯示；和（e)低倍率頂視圖，顯示出大面積均勻 的納米結(jié)構(gòu)（patterning)。（f)金沉積之后流體通道中的D2PA陣列的光學(xué)圖像。
[0025] 相應(yīng)的附圖標(biāo)記在附圖的全部若干圖面中均指示相應(yīng)的部件。應(yīng)當(dāng)理解的是，附 圖用于示出本公開中給出的構(gòu)思，并且不是依比例給出的。
[0026] 在詳細(xì)解釋本發(fā)明的任何實(shí)施方案之前應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的應(yīng)用不限于下文 描述中陳述的或附圖中圖示的構(gòu)造細(xì)節(jié)和部件布置。
[0027] 定義
[0028] 在更詳細(xì)地描述例示性實(shí)施方案之前，列出下述定義，以說明并界定說明書中使 用的術(shù)語的含義和范圍。
[0029] 術(shù)語"分子粘附層"或"粘附/間隔層"指具有確定厚度的一層或多層分子，其包 括附接于納米傳感器的內(nèi)表面和能結(jié)合至捕捉劑的外表面。它還控制從金屬至發(fā)光分子或 材料的距離。
[0030] 術(shù)語"捕捉劑反應(yīng)性基團(tuán)"指分子中具有化學(xué)功能的部分，其對(duì)捕捉劑具有反應(yīng) 性，即，能與捕捉劑中的部分（例如羥基、硫氫基、羧基或胺基團(tuán)）反應(yīng)生成穩(wěn)定的強(qiáng)（例如 共價(jià)）鍵。
[0031] 如本文中使用的，術(shù)語"捕捉劑"指經(jīng)由相互作用結(jié)合靶分析物的藥劑，該相互作 用足以允許該藥劑結(jié)合該靶分子并從不同分子的異質(zhì)混合物中濃縮該靶分子。結(jié)合相互作 用通常由捕捉劑的親和力區(qū)介導(dǎo)。典型的捕捉劑包括任何能特異性結(jié)合靶分析物的部分。 某些捕捉劑以小于約1(T6M(例如小于約1(T7M、小于約1(T 8M、小于約1(T9M、小于約lO^M、小 于約l(TnM、小于約1(T12M、至低達(dá)1(T16M)的解離常數(shù)（K D)特異性結(jié)合靶分子，而與其它分子 沒有顯著結(jié)合。例示性捕捉劑包括但不限于蛋白質(zhì)（例如抗體）和核酸（例如寡核苷酸、 DNA、RNA，包括適體）。
[0032] 術(shù)語"特異性結(jié)合"和"選擇性結(jié)合"指捕捉劑優(yōu)先結(jié)合存在于不同靶分子的異質(zhì) 混合物中的特定靶分子的能力。特異性或選擇性結(jié)合相互作用會(huì)區(qū)分樣品中想要的（例如 有活性的）和不想要的（例如無活性的）靶分子，通常大于約10至1〇〇倍或更多（例如大 于約1000或10, 000倍）。
[0033] 術(shù)語"蛋白質(zhì)"指任何長度的氨基酸聚合物形式，即大于2個(gè)氨基酸、大于約5個(gè) 氨基酸、大于約10個(gè)氨基酸、大于約20個(gè)氨基酸、大于約50個(gè)氨基酸、大于約100個(gè)氨基 酸、大于約200個(gè)氨基酸、大于約500個(gè)氨基酸、大于約1000個(gè)氨基酸、大于約2000個(gè)氨基 酸，通常不大于約10, 〇〇〇個(gè)氨基酸，可以包括編碼和非編碼的氨基酸、化學(xué)或生物化學(xué)修 飾或衍生化的氨基酸，和具有經(jīng)過修飾的肽主鏈的多肽。該術(shù)語包括融合蛋白，包括但不限 于：具有異源氨基酸序列的融合蛋白；具有異源或同源前導(dǎo)序列、帶有或不帶有N端甲硫氨 酸殘基的融合物；帶免疫學(xué)標(biāo)簽的蛋白質(zhì)；具有可檢測(cè)的融合配偶的融合蛋白，例如包含 熒光蛋白、半乳糖苷酶、螢光素酶等作為融合配偶的融合蛋白；等等。這些術(shù)語還包括 在細(xì)胞中經(jīng)過翻譯后修飾（例如糖基化、切割、分泌、異戊二烯化、羧基化、磷酸化、等）的多 肽，具有二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽，和與其它部分（例如其它多肽、原子、輔因子等）強(qiáng)結(jié)合 (例如共價(jià)或非共價(jià)）的多肽。
[0034]術(shù)語"抗體"意圖指免疫球蛋白或其任何片段，包括能夠結(jié)合抗原的單鏈抗體和噬 菌體展示抗體。
[0035] 術(shù)語"核酸"和"多核苷酸"在本文中可互換使用，描述由核苷酸（例如脫氧核糖核 苷酸或核糖核苷酸）構(gòu)成的任何長度的聚合物，或合成生成的、能夠與天然存在的核酸以 類似于兩種天然存在的核酸的序列特異性方式雜交（例如能參與Watson-Crick堿基配對(duì) 相互作用）的化合物（例如美國專利No. 5, 948, 902及其引用的參考文獻(xiàn)中記載的PNA)。
[0036] 如本文中使用的，術(shù)語"互補(bǔ)"指核苷酸序列通過氫鍵與感興趣的靶核酸堿基配 對(duì)。在規(guī)范的Watson-Crick堿基配對(duì)中，在DNA中，腺嘌呤（A)與胸腺嘧啶（T)形成堿基 對(duì)，鳥嘌呤（G)與胞嘧啶（C)形成堿基對(duì)。在RNA中，胸腺嘧啶被尿嘧啶（U)替換。如此，A 與T互補(bǔ)，而G與C互補(bǔ)。通常，"互補(bǔ)"指核苷酸序列與感興趣的靶完全互補(bǔ)，使得序列中 的每一個(gè)核苷酸與靶核酸中對(duì)應(yīng)的位置上的每一個(gè)核苷酸互補(bǔ)。當(dāng)核苷酸序列與非靶序列 不是完全互補(bǔ)（100%互補(bǔ)性），但由于核苷酸序列的某些區(qū)段與非靶序列的互補(bǔ)性而仍然 可以與非靶序列進(jìn)行堿基配對(duì)時(shí)，可以計(jì)算百分比互補(bǔ)性以評(píng)估非特異性（脫靶）結(jié)合的 可能性。一般而言，50%或更低的互補(bǔ)性不引起非特異性結(jié)合。另外，70%或更低的互補(bǔ)性 在嚴(yán)格雜交條件下可能不引起非特異性結(jié)合。
[0037] 如本文中使用的，術(shù)語"核糖核酸"和"RNA"表示由核糖核苷酸構(gòu)成的聚合物。
[0038] 如本文中使用的，術(shù)語"脫氧核糖核酸"和"DNA"表示由脫氧核糖核苷酸構(gòu)成的聚 合物。
[0039] 如本文中使用的，術(shù)語"寡核苷酸"表示長約10個(gè)至200個(gè)核苷酸，直至300個(gè)核 苷酸或更長，例如長至500nt或更長的單鏈核苷酸多聚體。寡核苷酸可以是合成的，而且在 某些實(shí)施方案中，長度小于300個(gè)核苷酸。
[0040] 如本文中使用的，術(shù)語"附接"指一個(gè)分子與另一個(gè)分子的強(qiáng)（例如共價(jià)或非共 價(jià)）鍵連接。
[0041] 如本文中使用的，術(shù)語"表面附接"指分子強(qiáng)附接于表面。
[0042] 如本文中使用的，術(shù)語"樣品"涉及含有一種或多種感興趣的分析物的材料或材料 混合物。在特定實(shí)施方案中，樣品可以是自生物學(xué)樣品獲得的，生物學(xué)樣品例如細(xì)胞、組織、 體液、和大便。感興趣的體液包括但不限于羊水、房水、玻璃狀液、血（例如全血、成分血、血 漿、血清、等）、母乳、腦脊液（CSF)、耵聹（耳垢）、乳糜、食糜（chime)、內(nèi)淋巴、外淋巴、糞、 胃酸、胃液、淋巴、粘液（包括鼻涕（nasal drainage)和體內(nèi)痰（phlegm))、心包液、腹膜液、 胸膜液、膿、稀粘液（rheum)、唾液、皮脂（皮膚油）、精液、咳出痰（sputum)、汗、滑液、淚、嘔 吐物、尿和呼氣冷凝液。在特定實(shí)施方案中，樣品可以是自受試者（例如人）獲得的，而且 可以在用于主題測(cè)定法之前進(jìn)行加工。例如，在分析之前，可以在使用之前自組織樣品提取 蛋白質(zhì)/核酸，提取方法是已知的。在特定實(shí)施方案中，樣品可以是臨床樣品，例如自患者 收集的樣品。
[0043]術(shù)語"分析物"指能被捕捉劑結(jié)合和檢測(cè)的分子（例如蛋白質(zhì)、核酸、聚合物或其 它分子、它們的復(fù)合物或顆粒）。
[0044]術(shù)語"測(cè)定"指測(cè)試樣品以檢測(cè)分析物的存在和/或豐度。
[0045]如本文中使用的，術(shù)語"確定"、"測(cè)量"、"評(píng)估"和"測(cè)定"可互換使用，包括定量和 定性測(cè)定二者。
[0046] 如本文中使用的，術(shù)語"發(fā)光標(biāo)記物"指當(dāng)處于外部激發(fā)下時(shí)能發(fā)出光的標(biāo)記物。 這可以是冷發(fā)光（luminescence)。焚光標(biāo)記物（其包括染料分子或量子點(diǎn)）和冷發(fā)光標(biāo)記 物（例如電致發(fā)光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物）是發(fā)光標(biāo)記物的類型。外部激發(fā)對(duì)于熒光而言是光 (光子）、對(duì)于電致發(fā)光而言是電流，對(duì)于化學(xué)發(fā)光而言是化學(xué)反應(yīng)。外部激發(fā)可以是上述 的組合。
[0047] 短語"帶標(biāo)記的分析物"指這樣的分析物，該分析物被發(fā)光標(biāo)記物可檢測(cè)地標(biāo)記， 使得該分析物能夠通過評(píng)估該標(biāo)記物的存在來加以檢測(cè)。帶標(biāo)記的分析物可以是被直接標(biāo) 記的（即，可以將分析物自身直接綴合于標(biāo)記物，例如通過強(qiáng)的鍵，如共價(jià)或非共價(jià)鍵直接 綴合于標(biāo)記物），或者，帶標(biāo)記的分析物可以是被間接標(biāo)記的（即，分析物被次級(jí)捕捉劑所 結(jié)合，而次級(jí)捕捉劑是被直接標(biāo)記的）。
[0048] 術(shù)語"雜交"指核酸與互補(bǔ)核酸經(jīng)Watson-Crick堿基配對(duì)的特異性結(jié)合。因而， 術(shù)語"原位雜交"指核酸與中期或間期染色體的特異性結(jié)合。
[0049]就核酸而言，術(shù)語"雜交"和"結(jié)合"可互換使用。
[0050]術(shù)語"捕捉劑/分析物復(fù)合物"是捕捉劑與分析物的特異性結(jié)合所導(dǎo)致的復(fù)合物。 捕捉劑和該捕捉劑所針對(duì)的分析物通常會(huì)在"特異性結(jié)合條件"或"適合于特異性結(jié)合的條 件"下彼此特異性結(jié)合，其中此類條件為那些容許捕捉劑和溶液中要結(jié)合的分析物之間發(fā) 生結(jié)合的條件（在鹽濃度、PH、洗滌劑、蛋白質(zhì)濃度、溫度等方面）。此類條件（特別是就抗 體及其抗原和核酸雜交而言）是本領(lǐng)域公知的（參見例如Harlow and Lane(Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) 和Ausubel，et al, Short Protocols in Molecular Biology, 5th ed.，Wiley&Sons, 2002) 〇
[0051] 如本文中使用的，術(shù)語"特異性結(jié)合條件"指生成包含彼此特異性結(jié)合的成對(duì)分子 的核酸雙鏈體或蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)（例如抗體/抗原）復(fù)合物，同時(shí)不利于并非彼此特異性 結(jié)合的分子之間形成復(fù)合物的條件。特異性結(jié)合條件是雜交和清洗條件二者的總和或組合 (全體），而且在必要時(shí)可以包括清洗和封閉步驟。
[0052] 對(duì)于核酸雜交，特異性結(jié)合條件可以如下實(shí)現(xiàn)：于42°C在50%甲酰胺、5x 55〇（150禮似(：1，151111檸檬酸三鈉）、5〇1111磷酸鈉（?117.6)、51〇6111^『肚氏溶液、10%硫酸 右旋糖酐、和20 y g/ml經(jīng)變性、剪切的鮭魚精DNA的溶液中溫育，接著于約65°C在0. lx SSC 中清洗濾膜。
[0053] 對(duì)于抗體結(jié)合抗原，特異性結(jié)合條件可以如下實(shí)現(xiàn)：在封閉溶液（例如含3% BSA 或脫脂奶的PBS)中封閉含有抗體的基片，接著與在封閉緩沖液中稀釋的含有分析物的樣 品一起溫育。在該溫育之后，在清洗溶液（例如PBS+TWEEN 20)中清洗基片并與捕捉第二 抗體（檢測(cè)抗體，它識(shí)別抗原中的另一位點(diǎn)）一起溫育。捕捉第二抗體可以綴合有光學(xué)可 檢測(cè)標(biāo)記物，例如熒光團(tuán)，諸如IRDye800CW、Alexa 790、Dylight 800。再次清洗之后，可以 檢測(cè)結(jié)合的捕捉第二抗體的存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道可加以修改以提高檢測(cè)到的信號(hào) 及降低背景噪聲的參數(shù)。
[0054] 術(shù)語"次級(jí)捕捉劑"（也可稱作"檢測(cè)劑"）指對(duì)抗原具有高度特異性親和力的一 組生物分子或化合物。次級(jí)捕捉劑可以與光學(xué)可檢測(cè)標(biāo)記物，例如酶、熒光標(biāo)記物等強(qiáng)連 接，或者次級(jí)捕捉劑自身可以被另一通過生物綴合而連接有光學(xué)可檢測(cè)標(biāo)記物的檢測(cè)劑所 檢測(cè)（Hermanson, "Bioconjugate Techniques"Academic Press, 2nd Ed. ,2008)。
[0055] 術(shù)語"生物素部分"指包含生物素或生物素類似物如脫硫生物素、氧代生物素、 2' _亞氨基生物素、二氨基生物素、生物素亞砜、生物胞素等的親和劑。生物素部分以至 少1(T8M的親和力結(jié)合鏈霉親合素。生物素親和劑還可以包含接頭，例如一 LC-生物素、 一LC-LC-生物素、一SLC-生物素或一 PEGn-生物素，其中n為3-12。
[0056] 術(shù)語"鏈霉親合素"指鏈霉親合素和親合素二者，以及它們的任何以高親和力結(jié)合 生物素的變體。
[0057] 術(shù)語"標(biāo)志物"指這樣的分析物，它在生物學(xué)樣品中的存在或豐度與某種疾病或狀 況相關(guān)。
[0058] 術(shù)語"鍵"包括共價(jià)和非共價(jià)鍵，包括氫鍵、離子鍵和由范德華力生成的鍵。
[0059] 術(shù)語"放大"指信號(hào)的量級(jí)（magnitude)的增大，例如信號(hào)增大至少10倍、增大至 少100倍、、增大至少1，000倍、增大至少10, 000倍、或增大至少100, 000倍。