專利名稱：旋覆花內酯在制備抗癡呆癥藥物制劑中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物提取物的醫(yī)藥用途，具體地說是一種旋覆花內酯的新醫(yī)藥 用途。
背景技術：
歐亞旋覆花，是一種傳統(tǒng)的中草藥，具有活血化瘀，抗炎止痛之功效。旋 覆花內酯是從歐亞旋覆花提取出的一種結構上屬于苯并呋喃酮衍生物的一組化 合物。它主要包括大花旋覆花內酯、乙酰大花旋覆花內酯(l-O-Acetylbritannilactone) 、 二乙酰大花旋覆花內酯、土木香內酯，環(huán)醚大花 旋覆花內酯。近年來，人們對旋覆花內酯的藥理活性進行了廣泛的研究。研究 發(fā)現旋覆花內酯具有抑制一氧化氮合酶的活性和抗炎活性(詳見參考文獻Je KH, Han AR ,Lee HT， et al .The inhibitory principle of lipopolysaccharide-induced nitric oxide production from Inula britannica var . chinensis . Arch Pharm Res, 2004,27:83-85.);同時也具有抑制白血病細胞毒活性和肝癌細胞毒活性(詳見 參考文南犬Liu S，Liu H,Yan W，et al .Studies on 1-O-acetylbritannilactone and its derivative，(2-0-butyloxime-3-phenyl)-propi-only-1 -O畫acetylbritannilactone ester. Bioorg Med Chem Lett, 2004,14:1101-1104.)。目前人們正在繼續(xù)研究探尋旋覆 花內酯具有更多更好的醫(yī)藥新用途。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是要提供一種旋覆花內酯的新醫(yī)藥用途。本發(fā)明的目的是這樣實現的本發(fā)明人經長期研究發(fā)現旋覆花內酯具有提高記憶力和認知能力的功能。 鑒此發(fā)明了其在制備抗癡呆癥藥物制劑中的應用。癡呆癥主要包括有老年癡呆癥和血管性癡呆癥。老年性癡呆癥(AD)是老年人的常見病之一，主要表現為記憶力減弱及識別能力障礙，是一種漸進性的神經功能退化性疾病。血管性癡呆癥(VD)是由一系列腦血管因素導致腦組織 損害而產生的癡呆癥的總稱，又稱為多梗塞癡呆癥。其占所有癡呆癥的30°/。左右。 血管性癡呆癥是以遇事善忘，不能定向，理解錯誤，計算能力差等為主要特征 的精神障礙性疾病。AD的病因至今尚未明了，其發(fā)病機制有多種學說，其中以卩-淀粉樣蛋白學說，tau蛋白過度磷酸化學說和基因突變學說為主，但這些均不能完 整地解釋AD的發(fā)生。對于癡呆癥迄今還沒有十分理想的藥物。本發(fā)明提供了旋覆花內酯的一種新的醫(yī)藥用途，它為臨床治療癡呆癥提供 了一種新的藥物選擇。本發(fā)明以旋覆花內酯為活性成分與藥學上可以接受的載體組合制備成適于 人體接受的各種藥物制劑。以上所述的藥學上可以接受的載體是指藥學領域常規(guī)的藥物載體，它包括 有稀釋劑(如水)、賦形劑(如淀粉)，黏合劑(如糊精、纖維素衍生物等)、 崩解劑、濕潤劑、吸收劑、緩釋劑、甜味劑、芳香劑等等。本發(fā)明化合物可經口服或不經口服給藥，施用量可根據給藥途徑、患者的 年齡、體重、疾病的嚴重程度等情況的不同而各有不同，對成年人來說，每天 50-一1000mg比較合適。本發(fā)明化合物用于口服給藥時，首先以該化合物為活性成分與常規(guī)的固體 輔劑如賦形劑、崩解劑、黏合劑、潤滑劑、抗氧化劑、包衣劑、著色劑、芳香 劑、表面活性劑等混合，將其制成顆粒劑、膠囊劑、片劑等固體藥物劑型；制 成口服液體制劑時，可與水或糖槳制成口服液；非經口服給藥時可以注射液、 輸液劑或栓劑等形式給藥。所有制備方法均可采用常規(guī)的藥物制劑技術。本發(fā)明所述的旋覆花內酯可以按照常規(guī)藥物提取技術從歐亞旋覆花中提取。提取旋覆花內酯的方法包括溶劑浸提法、溶劑回流法、滲漉法、溶劑超聲 法、溶劑微波提取法、水提醇沉法、醇提水沉法、透析法、鹽析法、萃取法、 水蒸汽蒸餾法、超濾法、聚酰胺吸附法、硅膠吸附法、多孔聚合物吸附法、大 孔樹脂吸附法、氧化鋁吸附法、活性碳吸附法、醋酸纖維素吸附法、葡聚糖凝 膠法和超臨界萃取法中的一種方法或兩種以上的方法相結合，優(yōu)選提溶劑浸提 法、溶劑回流法、滲漉法、溶劑超聲法、大孔樹脂吸附法，更優(yōu)選大孔樹脂吸 附法。旋覆花內酯(以下簡稱ABL)所具有的新的藥理活性通過以下試驗得到證實。 1資料與方法1. l實驗動物健康雄性SD大鼠30只(由河北省實驗動物中心提供)鼠齡10 12月齡，體重364.5士15.0g，隨機分為三組對照組(簡稱a組)、模型組(簡b組)和藥物處理組(簡稱c組)，每組10只。1.2試劑與儀器ABL由河北醫(yī)科大學藥學院提取物制備；AP^^購自 Sigma公司；NF-kB，C0X-2抗體胸自Santa Cruz公司；免疫組化試劑盒購自北京 中杉金橋生物技術公司；腦立體定向儀:江灣I型C，上海川沙花木農機廠制造。1. 3 A e 25 35的孵育用無菌生理鹽水將A P 25,稀釋成10 g丄'1， 37。C孵育72 h， 使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)的A P 25~35,放在4。C冰箱備用。1.4藥物海馬內注射步驟大鼠用質量濃度為20 g丄"烏拉坦0.3 ml.kg'腹腔 注射麻醉后，固定于腦立體定向儀上。參照大鼠腦立體定位圖譜[2]，以前囟為零 點，AP — -3.5 mm， ML = 2.0 mm， DV = 3.0mm為穿刺點，鉆孔穿顱，用 微量注射器將APm ^各1 pl(lO嗎)在5 min緩慢注入，留針5 min，對照組注射等 量的生理鹽水，退針縫合傷口。1. 5給藥方法術前3天及術后18天，藥物處理組給ABL26 mg'kg'、d"分兩 次灌胃，模型組給予等量溶劑。1.6大鼠空間學習記憶能力測試(Morris水迷宮)參照Morris實驗方法進行， 用于測量大鼠學習和記憶能力。本實驗所用水迷宮為一直徑120cm、高55cm的 圓形水池，水池內壁被漆為黑色，水深42cm，距池壁35 cm處放置一高40 cm， 直徑8cm圓臺。實驗歷時5d，第l天讓大鼠自由游泳2min，從第2天起,每天分上、 下午兩段,每段訓練4次。訓練時隨機選擇一個入水點，將大鼠面向池壁放入水中， 記錄大鼠尋找并爬上平臺時所需時間(即潛伏期)，每次訓練間隔為60 s。如果大鼠 在120 s內未找到平臺，須將其引至平臺,這時潛伏期記為120 s。在第5天最后一次 訓練后撤除水下平臺，在同一入水點將大鼠面向池壁放入水中,測其在120 s內跨 過原平臺相應位置的次數。1.7免疫組化染色法檢測NF-ic B和C0X-2參照使用說明書進行。切片常規(guī) 脫蠟至水，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，浸入EDTA緩沖液(Ph = 8.0)，電爐加熱 至92"C 9820。C分鐘，冷卻后PBS洗滌1 2次。3%過氧化氫室溫孵育5 10 min，PBS洗2 minx3次。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20 min，甩去多余液 體。加入用PBS稀釋的NF-KB抗體(1 : 100)或COX-2抗體(1 : 50)，4。C過夜，PBS 沖洗3minx3次。滴加生物素標記二抗，37。C溫育15 min。 PBS洗2minx3次。滴加 辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37。C溫育10 min 15 min， PBS洗2 minx3次。 DAB室溫顯色，鏡下控制反應時間。蘇木素復染20s，自來水洗滌。常規(guī)脫水、透明、封片，鏡檢。1.8 Western blot檢測NF-k B和C0X-2蛋白分別取20昭和200 jig總蛋白提 取物與5xSDS上樣緩沖液混合均勻，10(TC煮沸5分鐘，冰上冷卻，上樣于PAGE 凝膠加樣孔內，120V恒壓電泳節(jié)溴酚藍節(jié)凝膠底部。20V恒壓分別20 min和50 min將凝膠上蛋白轉移節(jié)PVDF膜，置于質量濃度為50 g丄'1的牛奶于37t:封閉1 h。將膜分別浸入兔多抗NF-kB (1: 400)、羊多抗C0X-2 (1: 250)溶液，4 。C結合過夜。TTBS溶液洗膜，將膜浸入辣根過氧化物酶標記的二抗溶液(h 10000) ， 37r反應h， TTBS溶液洗膠，化學發(fā)光法!S色。1.9圖像處理及統(tǒng)計學分析采用美國Kodak公司數碼成像分析軟件對 Westem印記顯色區(qū)帶的信兮強度進行相對定量分析。數據采J1J斤jSPSS13.0軟件 進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數士標準差(x士s)表示，組間資料應ffl單因素方差 分析，以PO.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。2、實驗結果2.1旋覆花內酯對大鼠學習記憶行為的影響隨著訓練時段的增加，所有動 物尋找站臺的潛伏期越來越短，表明三組大鼠通過學習，均可對水下的站臺產 生空間定位記憶。訓練第1天，模型組大鼠和藥物處理組大鼠差別不具冇統(tǒng)計學 意義(P〉0.05)，對照組大鼠與]l:兩組大鼠比較，差別有統(tǒng)計學意義(PO.05); 訓練第2、 3、 4天，模型組大鼠平均潛伏期明S延長與其他兩組比較差別具冇統(tǒng) 計學意義(P0.05)，而藥物處理組與對照組比較，兩者之間的差異不具有統(tǒng)計學 意義(PX).05);于訓練第5天，三組大鼠達穩(wěn)定水平，差別均無統(tǒng)計學意義(P X).05，Figl)。模型組大鼠最后一次跨平臺次數(7.6 ± 1.78)，較對照組(12.4 ± 2.73)藥物處理組(9.8 ± 2.23)減少(P<0.05)，提示ABL対A卩m ^所致AD大 鼠模型空間學習記憶能力障礙冇明品的改荅作用。實驗結果詳見閣l。2.2旋覆花內酯對大鼠海馬C0X-2表達的影響免疫組化染色陽性反應物為 棕黃色，位于細胞膜和胞質，細胞核不著色；對照組表達量低，兒乎不著色， 模型組著色細胞數量多，染色深；藥物處理組介于二者之間(詳見閣2a)。 Western blot顯不，對照組COX-2表達量低，模型組表達量明顯增高，是對照組2.8倍 (P〈0.05)，旋覆花內酯處理后，表達明顯下降，與模型組相比統(tǒng)計學差異具有 顯著性(PO.05),詳見閣2b。2.3旋覆花內酯抑制大鼠海馬NF-KB表達免疫組化染色陽性反應物為棕黃色，胞質與胞核均著色。對照組表達量低，模型組染色細胞數量多，染色深，旋覆花內酯藥物處理組介于二者之間(詳見圖3a) 。 Western blot顯示，對照組 NF-KB表達量低，模型組表達量增高，是對照組1.6倍(P〈0.05)，旋覆花內酯處 理后，表達明顯下降，與模型組相比統(tǒng)計學差異具有顯著性(P0.05)(詳見圖 3b)。
圖l:對大鼠學習記憶行為的影響曲線圖，其中橫坐標上的數字為試驗天數，縱坐標上的數字為潛伏期(秒)。圖中的"一為對照組的曲線圖。 "為藥物組的曲線圖。"一麗一"為模型組的曲線圖。圖2a:大鼠海馬C0X-2表達的染色切片對照圖。 圖2b:大鼠海馬C0X-2表達的對照圖。 圖3a:大鼠海馬NF-icB表達的染色切片對照圖。 圖3b:抑制大鼠海馬NF-icB表達的對照圖。
具體實施方式
實施例l旋覆花內酯的提取制備a、 將歐亞旋覆花粉碎，50-95%乙醇提取，提取液減壓濃縮至膏狀；依次用 石油醚，氯仿，乙酸乙酯和正丁醇萃取膏狀物，取氯仿萃取物；b、 取a步驟中的氯仿萃取物進行加壓硅膠柱層析，用氯仿-乙酸乙酯(10: 1一0: IO)進行梯度洗脫；將洗脫液依次等量分成3部分，濃縮；第1部分用30-95%乙醇重結晶得到二氧-二乙?；笮不▋弱ィ坏?部分用30-95%乙醇重結晶得 到l-氧-乙?；笮不▋弱?；第3部分再經硅膠柱層析得到l-羥基-大旋覆花內 酯。c、 收集合并上述提取物，獲旋覆花內酯。 實施例2旋覆花內酯口服液將250mg旋覆花內酯，溶于1000ml水中，制成O. 25%濃度的水溶液，加熱溶 解，混合均勻，裝入20ml藥瓶中，封口、消毒。 實施例3旋覆花內酯取旋覆花內酯2000mg，按注射劑常規(guī)制備方法，制成4mg/2ml/支濃度的注射液，蒸汽流通滅菌30分鐘。 實施例4旋覆花內酯片劑取旋覆花內酯2000mg，按常規(guī)片劑制備方法，加入淀粉，糊精、硬酯酸鎂 等，混合制成濕粒，機器沖壓成片，每片含旋覆花內酯25mg。本發(fā)明的藥物劑型不完全限于此，它可以制備成更多的劑型，如滴丸、膠 囊劑、軟膠囊劑、緩控釋制劑等等。
權利要求
1、旋覆花內酯在制備抗癡呆癥藥物制劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種旋覆花內酯的新醫(yī)藥用途，即旋覆花內酯在制備抗癡呆癥藥物制劑中的應用。本發(fā)明人經長期研究發(fā)現旋覆花內酯具有提高記憶力和認知能力的功能。鑒此發(fā)明了其在制備抗癡呆癥藥物制劑中的應用，它為臨床治療癡呆癥提供了一種新的用藥選擇。
文檔編號A61P25/28GK101229153SQ20071018534
公開日2008年7月30日 申請日期2007年12月10日 優(yōu)先權日2007年12月10日
發(fā)明者張嫡群, 溫進坤, 王云志, 石曉偉, 梅 韓 申請人:河北醫(yī)科大學