專利名稱：：Rs7抗體的制作方法RS7抗體本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?3809918.7、發(fā)明名稱為"RS7抗體"的專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及單價(jià)和多價(jià)的，單特異性結(jié)合蛋白和涉及多價(jià)的，多特異性結(jié)合蛋白。這些結(jié)合蛋白的一個(gè)實(shí)施方案含有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其中每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與靶抗原或靶抗原上的表位結(jié)合。這些結(jié)合蛋白的另一實(shí)施方案含有兩個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其中每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)具本發(fā)明還涉及用于在宿主中表達(dá)這些功能性結(jié)合蛋白的重組載體。更具體地，本發(fā)明涉及名為RS7的腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合蛋白。本發(fā)明還涉及人源化RS7抗原結(jié)合蛋白，以及該結(jié)合蛋白在診斷和治療中的用途。2.發(fā)明背景人造結(jié)合蛋白，尤其是單克隆抗體和工程化處理抗體或抗體片段已經(jīng)得到廣泛測(cè)試并顯示出在多種人類疾病，包括癌癥、自身免疫病、感染性疾病、炎癥疾病和心血管疾病的檢測(cè)和治療中的價(jià)值(Filpula和McGuire,Exp.Opin.Ther.Patents(1999)9:231-245)。例如放射性同位素標(biāo)記的抗體已經(jīng)檢測(cè)可用于在使用本領(lǐng)域可用的檢測(cè)劑注射患者后使腫瘤可視化?？贵w或抗體來源的試劑的臨床應(yīng)用主要依賴于其與特異性靶抗原的結(jié)合能力。選擇能力對(duì)于在人疾病的檢測(cè)和治療期間將診斷劑或治療劑，如同位素、藥物、毒素、細(xì)胞因子、激素、生長(zhǎng)因子、酶、綴合物、放射性核素或金屬遞送至靶位，特別是如果診斷劑或治療劑對(duì)體內(nèi)的正常組織有毒性的情況下是有用的。Goldenberg，TheAmericanJournalofMedicine(1993)94:298-299中公開了抗體系統(tǒng)的潛在局限性。檢測(cè)和治療技術(shù)中的重要參數(shù)是注射劑量特別是靶細(xì)胞存在位點(diǎn)的劑量的量和攝取率，即特異性結(jié)合的抗體的濃度與周圍正常組織中存在的放射性的比率。當(dāng)將抗體注射至血流中時(shí)，其要通過多個(gè)區(qū)室而被代謝和排泄。抗體在通過身體的其它部分時(shí)，必須能夠定位和結(jié)合靶細(xì)胞抗原?？刂瓶乖邢虻囊蛩匕ㄎ恢茫笮?，抗原密度，抗原可達(dá)性，病理組織的細(xì)胞組成和靶向抗體的藥代動(dòng)力學(xué)。其它能特別影響抗體對(duì)腫瘤靶向的因素包括靶抗原在腫瘤和其它組織中的表達(dá)和由放射性標(biāo)記的抗體的緩慢血液清除率所導(dǎo)致的骨髓毒性。附著于被耙定的腫瘤細(xì)胞的靶向抗體的量收到血管化和肺瘤抗體透過屏障，以及瘤內(nèi)壓力的影響。非靶器官如肝、腎或骨髓的非特異性的攝取是該技術(shù)，特別是用于發(fā)射免疫治療時(shí)的另一個(gè)潛在的局限性，其中骨髓的照射通常會(huì)導(dǎo)致劑量限制性毒性。一個(gè)建議的方法，指直接靶向，是為用攜帶診斷性或治療性放射性同位素的抗體靶向抗原而設(shè)計(jì)的技術(shù)。在腫瘤領(lǐng)域中，直接靶向方法使用通過其抗原識(shí)別肺瘤的發(fā)射性標(biāo)記的抗-肺瘤單特異性抗體。該技術(shù)包括將標(biāo)記的單特異性抗體注射給患者然后使得抗體定位于靶腫瘤從而獲得診斷性或治療性效果。未結(jié)合的抗體被身體清除。該方法可用于診斷或治療另外的哺乳動(dòng)物疾病。另一種建議的溶液，指特別為克服攜帶診斷性或治療性放射性同位素的抗體靶向腫瘤的缺陷而設(shè)計(jì)的"親和力增強(qiáng)系統(tǒng)"(AES)，(US-5，256，395(1993)，Barbet等，CancerBiotherapy&Radiopharmaceuticals(1999)14:153-166)。AES采用放射性標(biāo)記的半抗原和識(shí)別靶腫瘤和放射性半抗原的抗-肺瘤/抗-半抗原雙特異性結(jié)合蛋白。具有較高效價(jià)的半抗原和具有較高特異性的結(jié)合蛋白也可用于該方法。該方法包括將將結(jié)合蛋白注射給患者然后使其定位于靶肺瘤。在經(jīng)過足夠長(zhǎng)的未結(jié)合的結(jié)合蛋白被從血流中清除的時(shí)間后，給予放射性標(biāo)記的半抗原。半抗原于位于靶細(xì)胞位點(diǎn)的抗體-抗原復(fù)合物結(jié)合從而獲得診斷性或治療性效果。未結(jié)合的半抗原被身體清除。Barbet描述了二價(jià)半抗原可與雙特異性抗體在后者結(jié)合在肺瘤表面上時(shí)發(fā)生交聯(lián)的可能性，。結(jié)果，放射性標(biāo)記的復(fù)合物更穩(wěn)定且在腫瘤中保持更長(zhǎng)的時(shí)間。該系統(tǒng)可用于診斷或治療哺乳動(dòng)物疾病。本領(lǐng)域中仍需要制備可用于直接靶向系統(tǒng)中的多價(jià)，單特異性結(jié)合蛋白和制備可用于親和力增強(qiáng)系統(tǒng)中的多價(jià)，多特異性結(jié)合蛋白。特別是，仍需要表現(xiàn)出定向抗原處的增強(qiáng)的攝取，血濃度降低，和能最佳保護(hù)正常組織和細(xì)胞免受毒性藥物損害的結(jié)合蛋白。發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原，由抗人非小細(xì)胞肺癌的鼠MAbRS7-3G11所限定的上皮糖蛋白-1(EGP-1)的單特異性單克隆抗體及其片段。根據(jù)第三屆國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)(IASLC)研討會(huì)對(duì)腫瘤和分化抗原的建議，已將RS7抗原命名為EGP-1(上皮糖蛋白-l)。至少一種與EGP-1相關(guān)的表位在文獻(xiàn)中也稱為TR0P2。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體片段結(jié)合的表位與Stein(如下)和其它在先研究所披露的鼠RS7抗體結(jié)合的表位相同?；蛘?，抗體或片段結(jié)合的表位可與Stein所披露的鼠RS7抗體結(jié)合的表位不同。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗-EGP-1或抗-TR0P2抗體或其片段是嵌合、人源化或完整人RS7抗體或其片段。例如本發(fā)明中涉及了人源化抗體或其片段，其中人源化RS7MAb的輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)包括含有KASQDVSIAVA氨基酸序列的CDR1;含有SASYRYT氨基酸序列的CDR2;和含有QQHYITPLT氨基酸序列的CDR3。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是人源化抗體或其片段，其中人源化RS7MAb的重鏈可變區(qū)的CDR包括含有NYGMN氨基酸序列的CDR1;含有WINTYTGEPTYTDDFKG氨基酸序列的CDR2和含有GGFGSSYWYFDV氨基酸序列的CDR3。而且優(yōu)選，人源化抗體或其片段包括鼠RS7MAb的CDR和人抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)(FR)，其中人源化RS7MAb的輕鏈可變區(qū)的CDR包括含有KASQDVSIAVA氨基酸序列的CDR1;含有SASYRYT氨基酸序列的CDR2;和含有QQHYITPLT氨基酸序列的CDR3;和人源化RS7MAb的重鏈可變區(qū)的CDR包括含有NYGMN氨基酸序列的CDR1;含有WINTYTGEPTYTDDFKG氨基酸序列的CDR2和含有GGFGSSYWYFDV氨基酸序列的CDR3。還優(yōu)選，人源化抗體或其片段還包括人抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)的FR。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，人源化RS7抗體或片段包括含有至少一個(gè)被在鼠RS7抗體中相應(yīng)位置上發(fā)現(xiàn)的氨基酸殘基所替換的氨基酸的輕鏈和/或重鏈的FR。例如其中至少一個(gè)被替換的氨基酸殘基優(yōu)選位于選自圖.3B的鼠重鏈可變區(qū)的氨基酸殘基38、46、68和91的位置和/或至少一個(gè)被替換的氨基酸殘基優(yōu)選位于選自圖.3A的鼠輕鏈可變區(qū)的氨基酸殘基20，85和100的位置。本發(fā)明還描述了一種包括至少兩種抗-EGP-lMAb或其片段的抗體融合蛋白或其片段，其中MAb或其片段選自本發(fā)明的抗-EGP-lMAb或其片段。在相關(guān)靜脈中，抗體融合蛋白或其片段包括至少一種任何本發(fā)明的抗-EGP-1抗體的第一抗-EGP-1MAb或其片段和至少一種本發(fā)明的抗-EGP抗體以外的第二MAb或其片段。例如第二抗體或其片段可以是癌-相關(guān)抗體或其片段。另一優(yōu)選的實(shí)施方案是包括兩個(gè)不同表位結(jié)合性抗-EGP-l抗體或其片段的融合蛋白或其片段。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供識(shí)別多于一個(gè)RS7抗原上的表位的或具有對(duì)RS7抗原和對(duì)半抗原分子親和力的多特異性抗體及其片段。后一結(jié)合蛋白適于預(yù)靶定靶抗原。因此，還描述了一種將診斷劑、治療劑或其組合遞送至靶位的方法，包含(i)對(duì)個(gè)體給予多價(jià)，多特異性MAb或其片段；(ii)等待足夠長(zhǎng)的時(shí)間以便使非結(jié)合蛋白的量從個(gè)體血流中清除；和(iii)對(duì)所述個(gè)體給予可與所述個(gè)體的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的診斷劑、治療劑或其組合。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供將診斷劑或治療劑遞送至表達(dá)EGP-1抗原的定向疾病的方法。例如描述了一種將診斷劑或治療劑或其組合遞送至靶位的方法，包括(i)提供一種包含與至少一種治療劑和/或診斷劑結(jié)合的抗-EGP-1抗體或其片段的組合物和(ii)對(duì)有此需要的所述個(gè)體給予所述組合物。優(yōu)選地，診斷劑或治療劑選自同位素、藥物、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑，激素、酶、生長(zhǎng)因子、放射性核素、金屬、造影劑和檢測(cè)劑。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，將診斷劑、治療劑或其組合遞送至靶位的方法包括(i)對(duì)個(gè)體給予包含一個(gè)或多個(gè)具有對(duì)EGP-1靼抗原親和力的抗原-結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)或多個(gè)具有對(duì)半抗原分子親和力的半抗原結(jié)合位點(diǎn)的多價(jià)，多特異性抗體或片段；(ii)等待足夠長(zhǎng)的時(shí)間以便使非結(jié)合蛋白的量從個(gè)體血流中清除；和(iii)對(duì)所述個(gè)體給予包含診斷劑、治療劑或其組合。本發(fā)明的另一目的是提供癌細(xì)胞靶向的包括抗-EGP-lMAb或其片段或本發(fā)明任一種抗體的抗體融合蛋白或其片段的診斷綴合物或治療綴合物而其中抗-EGP-1抗體或其片段與至少一種診斷劑或治療劑結(jié)合。適用的治療劑是具有選自抗有絲分裂，烷化，抗代謝物，抗血管生成，細(xì)胞凋亡，生物堿和抗生素藥劑及其組合的藥理特性的藥物。同樣優(yōu)選的治療劑選自氮芥類，氮丙啶衍生物，烷基磺酸酯類，亞硝基脲類，三氮烯類，葉酸類似物，蒽環(huán)類抗生素，紫杉烷類藥，C0X-2抑制劑，酪氨酸激酶抑制劑，嘧啶類似物，噪呤類似物，抗生素，酶，表鬼臼毒素類，鉑配位絡(luò)合物，長(zhǎng)春花生物堿，取代的脲類，甲肼衍生物，腎上腺皮質(zhì)激素抑制劑，拮抗劑，內(nèi)皮生長(zhǎng)抑素，紫杉醇，喜樹堿，阿霉素，阿霉素類似物，及其組合。優(yōu)選地，診斷劑選自光活化性放射性核素，優(yōu)選25~4000keV，和造影劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNA序列包含一種核酸，所述核酸編碼包含本發(fā)明的抗-EGP-lMAb或其片段的MAb或片段；包含至少兩種所述MAb或其片段的抗體融合蛋白或其片段；包含至少一種含有本發(fā)明的抗-EGP-l抗體和片段的MAb或其片段的第一抗-EGP-1MAb或其片段和至少一種本文所描述的抗-EGP-lMAb或其片段以外的第二MAb或其片段的抗體融合蛋白或其片段；或包含至少一種包含本文描述的任何抗體的所述MAb或其片段的第一MAb或其片段和至少一種本文描述的任何抗體的所述MAb或其片段以外的第二MAb或其片段的抗體融合蛋白或其片段，其中第二MAb可與選自EGP-2、MUC1-4、A33、CSAp、CEA、Le(y)、Tn、Tag-72、PSMA、PSA、EGFR、HER2/織、AFP、HCG、HCG-j3、鐵蛋白、PAP、PLAP、EGP-2、組蛋白、細(xì)胞角蛋白、腱生蛋白、CanAg、腎癌G250、VGFR1、VGFR2、PAM4-抗原、致癌基因產(chǎn)物，及其組合的抗原反應(yīng)。第二Mab可替代性地與腫瘤相關(guān)性血管內(nèi)皮抗原，如VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)和P1GF(胎盤生長(zhǎng)因子)反應(yīng)。第二抗體的選擇依賴于腫瘤細(xì)胞類型。例如抗-PSMA或抗-PSA抗體可用于治療或診斷前歹'J腺癌，抗一CEA或抗一MUCL，MUC2，MUC3和MUC4抗體用于乳癌、卵巢癌、肺癌和結(jié)腸癌，EGFR用于結(jié)腸癌和頭頸癌，抗-CSAp抗體用于結(jié)腸癌和卵巢癌，而抗-HER/neu用于乳癌、卵巢癌和其它癌癥。這些僅用以示例性說明，而并非意在限制。含有該DNA序列的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞也是本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案。本文還提供了診斷和治療惡性腫瘤的方法。例如診斷和治療癌癥的方法，包括(i)對(duì)有此需要的個(gè)體給予包含一個(gè)或多個(gè)具有對(duì)EGP-1靶抗原親和力的抗原-結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)或多個(gè)具有對(duì)半抗原分子親和力的半抗原結(jié)合位點(diǎn)的多價(jià)，多特異性抗體或片段；(ii)等待足夠長(zhǎng)的時(shí)間以便使非結(jié)合蛋白的量從個(gè)體血流中清除；和(iii)對(duì)所述個(gè)體給予包含診斷劑、治療劑或其組合，可與所述抗體的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的半抗原。同樣地，診斷和治療惡性腫瘤的方法可包括施用治療有效量的抗-EGP-l融合蛋白或其片段或包含EGP-1MAb或其片段的治療綴合物，其中EGP-1MAb或其片段或抗體融合蛋白或其片段在藥學(xué)上適用的賦形劑中與至少一種治療劑結(jié)合。在相關(guān)靜脈中，棵抗-EGP-l抗體及其片段，包括棵抗-EGP-1融合蛋白及其片段，也可用于治療惡性腫瘤?？每?EGP-1抗體可用于體外診斷惡性肺瘤，例如采用免疫測(cè)試法或免疫組織化學(xué)法，但不能用于體內(nèi)診斷，除非其包括預(yù)靶向技術(shù)，如AES。但是，標(biāo)記的EGP-1抗體可用于體內(nèi)診斷和治療惡性腫瘤。例如本文描述了治療個(gè)體中癌細(xì)胞的方法，包括(i)對(duì)所述個(gè)體給予治療有效量的包含抗-EGP-lMAb或其片段或抗體融合蛋白或其片段的組合物，(ii)將所述EGP-lMAb或其片段或抗體融合蛋白或其片段在藥學(xué)上適用的賦形劑中配制。相似地，本發(fā)明還包括用于診斷和治療的棵MAb及其片段和綴合的MAb或其片段或融合蛋白或其片段的組合。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示了mRS7，cAb-V"23(cRS7)，和CAB-Vk井1在竟?fàn)幮越Y(jié)合檢測(cè)法中的比較。將不同濃度的竟?fàn)幮訟b用于與生物素化mRS7抗體常量的結(jié)合竟?fàn)帯＝Y(jié)果顯示Vi^l輕鏈不結(jié)合RS7抗原。圖2顯示了編碼(A)由RACE克隆的RS7Vk和(B)由RT-PCR克隆的RS7VH的DM和氨基酸序列。推定的CDR區(qū)用下劃線顯示。核苷酸殘基連續(xù)編號(hào)。將Kabat'sIg分子編號(hào)法用于氨基酸殘基。在(B)中，用字母(頂部)對(duì)殘基的編號(hào)是用在前殘基的數(shù)字加字母，例如N52后的T的編號(hào)是52A;182后的N，N和L的編號(hào)分別是82A，82B和82C。圖3顯示了(A)人SA-lA，cl，鼠RS7，和hRS7VK鏈和(B)人RF-TS3,鼠RS7，和hRS7vh鏈的氨基酸序列比對(duì)。在(A)中，圓點(diǎn)表示RS7中與SA-lA'cl中相應(yīng)殘基相同的殘基。短橫線表示引入以幫助比對(duì)的缺口?？虮硎綜DR區(qū)。hRS7的N-和C-末端殘基(下劃線標(biāo)出)均由所使用的staging載體固定。因此，RS7的相應(yīng)的末端殘基不能與人序列中的比較。使用Kabat's編號(hào)方案。在(B)中，圓點(diǎn)顯示RS7中與RF-TS3中的相應(yīng)殘基相同的殘基。短橫線表示引入以幫助比對(duì)的缺口?？虮硎綜DR區(qū)。hRS7的N-和C-末端殘基(下劃線標(biāo)出)均由所使用的staging載體固定。因此，RS7的相應(yīng)的末端殘基不能與人VH序列中的比較。圖4顯示了(A)人源化RS7Vk和(B)人源化RS7Vh的DNA和氨基酸序列。氨基酸序列的粗體和下劃線部分表示用Kabat's編號(hào)方案所確定的CDR。圖5顯示(A)人源化RS7vk的輕鏈cDM和氨基酸序列和人源化rs7vh的重鏈cDNA和氨基酸序列。氨基酸序列的下劃線部分表示用于分泌的前導(dǎo)肽序列。"*"表示終止密碼子。圖6顯示了mRS7，cRS7和hRS7在竟?fàn)幮越Y(jié)合檢測(cè)法中的比較。不同濃度的竟?fàn)幮訟b用于與生物素化RS7抗體常量對(duì)Ag包被的96-孔ELISA板的結(jié)合竟?fàn)?。hRS7顯示出與RS7和cRS7相當(dāng)?shù)淖铚钚?。圖7顯示了人源化RS7vk的輕鏈cDNA和氨基酸序列。氨基酸序列的下劃線標(biāo)出的部分表示用于分泌的前導(dǎo)肽序列。"*，，表示終止密碼子。賴氨酸殘基也用下劃線標(biāo)出。圖8顯示了人源化RS7vk的重鏈cDNA和氨基酸序列。氨基酸序列的下劃線標(biāo)出的部分表示用于分泌的前導(dǎo)肽序列。表示終止密碼子。賴氨酸殘基也用下劃線標(biāo)出。圖9顯示剩余部分IMP-R4，IMP-R5和IMP-R8的結(jié)構(gòu)。圖10是由于放射性碘化的hRS7在MDA-MB-468腫瘤模型中的劑量確定法的棒形圖。圖ll提供了表明放射性免疫治療對(duì)乳癌異種移植物在棵鼠中的腫瘤生長(zhǎng)的影響的組圖。圖12是放射性免疫治療棵鼠中乳癌異種移植物后，評(píng)價(jià)毒性的組圖。圖13是表明相對(duì)平均腫瘤體積(MTV)的圖。優(yōu)選實(shí)施方案詳述除非另有特指，術(shù)語(yǔ)"a"或"an"是指"一個(gè)或多個(gè)"。RS7抗體(以前被稱為RS7-3G11)是抗人原發(fā)肺鱗狀細(xì)胞癌的粗制膜制備物而產(chǎn)生的鼠IgG!。參見Stein等，CancerRes.50:1330(1990),其全文引入作為參考。RS7抗體識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原，其由抗人非細(xì)胞肺癌而產(chǎn)生的鼠MAbRS7-3G11所確定。Stein等披露了識(shí)別46-48kDa糖蛋白的RS7抗體，特征為聚簇13。Stein等，Int.J.CancerSupp.8:98-102(1994)。同樣參見，Basu等，Int.J.Cancer52:472-479(1995)。根據(jù)3"國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)(IASLC)研討會(huì)對(duì)腫瘤和分化抗原的建議，已將該抗原命名為EGP-l(上皮糖蛋白-1)。參見，例如DeLeij等，Int.J.CancerSupp.，8:60-63(1994)。因此，如本文所述，RS7和EGP-1抗原具有相同含義。EGP-1抗原還指現(xiàn)有技術(shù)中的TR0P2，但可能是EGP-1和TR0P2二者的多表位。流式細(xì)胞儀和免疫組織化學(xué)染色研究已經(jīng)顯示出RS7Mab可檢測(cè)多種肺瘤類型上的抗原，而其僅有限地與正常人組織結(jié)合。(Stein等，(1990)，如上)。RS7抗體與可被快速內(nèi)在化的EGP-1糖蛋白反應(yīng)。EGP-1主要由癌如肺癌，胃癌，膀胱癌，乳癌，卵巢癌，子宮癌和前列腺癌表達(dá)。使用放射性標(biāo)記的鼠RS7Mab在動(dòng)物模型中的定位和治療研究已經(jīng)證明了腫瘤靶向和治療的效能(Stein等，(1990)，如上。Stein等，(1991)，如上)。更為近來的研究已證明在來自肺，乳，膀胱，卵巢，子宮，胃和前列腺的腫瘤中存在RS7強(qiáng)染色。參見Stein等，Int.J.Cancer55:938(1993)，將其全文引入作為參考。而且，該研究中的肺癌癥病例鱗狀細(xì)胞癌和腺癌。同前。兩種細(xì)胞類型均強(qiáng)染色，顯示RS7抗體不能從非小細(xì)胞肺癌地組織學(xué)分類上區(qū)分。如上所述，RS7Mab被快速內(nèi)在化至耙細(xì)胞(Stein等(1993)，如上)。RS7MAb的內(nèi)在化速度常數(shù)介于其它兩種快速內(nèi)在化Mab的內(nèi)在化速度常數(shù)之間，所述其它兩種快速內(nèi)在化已經(jīng)被證明可用于免疫毒素制備。同前。已有大量報(bào)道指出免疫毒素綴合物的內(nèi)在化是抗-腫瘤活性絕對(duì)必須的。(PASTAN等，Cell47.641(1986))。藥物免疫綴合物的內(nèi)在化也已經(jīng)被描述為抗-腫瘤效能中的主要因素。(Yang等，Proc.Nat，l.AcacLSci.USA85:1189(1988))。因此，RS7抗原可能是這些需要治療劑內(nèi)在化的免疫治療類型的重要的靶位。因此，用RS7Mab的研究顯示了抗體表現(xiàn)出某些重要的特性，其使其可作為臨床診斷和治療應(yīng)用的候選。因?yàn)镽S7抗原提供了診斷和治療的有用的靶位，就需要獲得識(shí)別RS7抗原的表位的Mab。而且，嵌合，人源化和人RS7抗體的有效性是雙決定子酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)發(fā)展的根本，所述測(cè)定需要在倆那創(chuàng)樣品中檢測(cè)RS7抗原，且是人類體內(nèi)應(yīng)用的根本。為此目的，本發(fā)明描述了可結(jié)合RS7抗原并可用于診斷和治療方法的嵌合，人源化和人抗體及其片段。人源化抗體和抗體片段已被描述于名為"抗-CD20抗體和其融合蛋白及使用方法"的，代理人巻號(hào)18733/1073的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)，美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/356,132，美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/416，232和代理人巻號(hào)18733/1155中；hMN-14抗體，如美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?，874，540中公開的那些抗體，其是III類抗-癌胚抗原抗體(抗-CEA抗體)；Mu-9抗體，如美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?10/116,116/>開的那些抗體；AFP抗體，如美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/399，707公開的那些抗體；PAM4抗體，如名為"單克隆抗體cPAM4"的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)，代理人巻號(hào)18733/1102/>開的那些抗體；RS7抗體，如美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/360，2297^開的那些抗體；和CD22抗體，如美國(guó)專利5，789，554和6，187，287和美國(guó)申請(qǐng)09/741，843和09/988，013公開的那些抗體，上述全部文件均全文引入此處作為參考。本文所描述的嵌合抗體是一種重組蛋白，其包含含有來源于一種物種的抗體優(yōu)選是嚙齒動(dòng)物抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的可變區(qū)，而抗體分子的恒定區(qū)則來源于人抗體。為了獸醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用，嵌合抗體的恒定區(qū)可來源于其它物種。人源化抗體是一種重組蛋白，其中將來自一種物種的抗體例如嚙齒動(dòng)物抗體的CDR從嚙齒動(dòng)物抗體的重鏈和可變輕鏈轉(zhuǎn)移至人重鏈和輕鏈可變區(qū)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，RS7抗體是人源化的。因?yàn)榉?人類單克隆抗體可由人宿主作為外源蛋白而識(shí)別，而且重復(fù)注射會(huì)導(dǎo)致有害的過敏性反應(yīng)，故鼠RS7序列的人源化能降低患者經(jīng)受的不利免疫應(yīng)答。對(duì)于基于鼠的單克隆抗體，其通常是指人抗-小鼠抗體(HAMA)應(yīng)答。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是抗-EGF-1抗體或其片段，其是低于人的靈長(zhǎng)類抗-EGP-l抗體，鼠單克隆抗-EGP-l抗體(限于獸醫(yī)應(yīng)用)，嵌合抗-EGP-l抗體，人抗-EGP-1抗體，和人源化抗-EGP-1抗體。優(yōu)選地，人源化RS7抗體或其片段的構(gòu)架區(qū)中的某些人殘基被鼠的相似物置換。還優(yōu)選地，聯(lián)合來自兩個(gè)不同人抗體的框架序列而用于Vh。抗體分子的恒定區(qū)源自人抗體的那些。本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案是人RS7抗體。人抗體是獲自已經(jīng)被"工程化處理，，以響應(yīng)抗原性激發(fā)而制備特異性人抗體的轉(zhuǎn)基因鼠的抗體。在該方法中，將人重和輕鏈基因座的元件導(dǎo)入源自包含內(nèi)源重鏈和輕鏈基因座的靶向斷裂的胚胎干細(xì)胞系的小鼠品系中。該轉(zhuǎn)基因鼠能合成特異性針對(duì)人抗原的人抗體，該小鼠可用于制備分泌人抗體的雜交瘤。Green等NatureGenet.7:13(1994)，Lonberg等Nature368:856(1994)和Taylor等Int.Immun.6:579(1994)描述了從轉(zhuǎn)基因鼠中獲得人抗體的方法。完全人抗體還可以用基因或染色體轉(zhuǎn)染法，以及喧菌體顯示技術(shù)(phagedisplaytechnology)進(jìn)行構(gòu)建，所有這些方法均為本領(lǐng)域已知的。例如參見McCafferty等，Nature348:552-553(1990)從來自未免疫的供者的免疫球蛋白可變區(qū)基因庫(kù)中于體外制備人抗體及其片段。在該方法中，將抗體可變區(qū)基因框架內(nèi)克隆至絲狀噬菌體的主要或次要外膜蛋白質(zhì)基因，并被顯示為噬菌體微粒表面上的功能性抗體片段。因?yàn)榻z狀微粒包含噬菌體基因組的單股DNA拷貝，基于抗體功能特性的選擇還會(huì)導(dǎo)致選擇選擇編碼表現(xiàn)出這些特性的抗體的基因。在該方法中，噬菌體模擬了B細(xì)胞的某些特性?？捎枚喾N形式實(shí)施噬菌體展現(xiàn)，對(duì)其的綜述可參見例如Johnson和Chiswell,CurrentOpinioninStructuralBiology3:5564-571(1993)。本發(fā)明的抗體及其片段優(yōu)選抵抗來自人原發(fā)鱗狀細(xì)胞肺癌的粗制膜制備物而產(chǎn)生。還優(yōu)選，RS7抗體及其片段抵抗來自人卵巢癌細(xì)胞系的活細(xì)胞的膜制備物而產(chǎn)生。還優(yōu)選，RS7抗原由活Co10316細(xì)胞提供。在相關(guān)靜脈中，RS7抗體可使用RS7抗原基本上純的制劑而獲得?；旧霞兊牡鞍资腔旧喜缓谔烊粻顟B(tài)下與所述蛋白相伴隨的污染性細(xì)胞成分的蛋白。如此處所述，術(shù)語(yǔ)"RS7抗體"還包括嵌合、人和人源化RS7抗體。嵌合，人源化和人RS7抗體的制備可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法獲得針對(duì)特異性抗原的單克隆抗體。例如參見Kohler和Milstein，Nature256:495(1975)，和Coligan等(eds.)，CURRENTPROTOCOLSIN國(guó)U鼠0GY，Vol.l，2.5.1-2.6.7頁(yè)(JohnWiley&Sons1991)(在下文中"Coligan")。簡(jiǎn)言之，RS7抗原MAb，如RS7的制備可以通過用包含RS7抗原的組合物注射小鼠，通過取血清樣品鑒定抗體制備的存在，取脾獲得B-淋巴細(xì)胞，融合B-淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞來制備雜交瘤，克隆雜交瘤，選擇產(chǎn)生針對(duì)RS7抗原的抗體的陽(yáng)性克隆，培養(yǎng)該產(chǎn)生針對(duì)RS7抗原的抗體的克隆，和從雜交瘤培養(yǎng)物中分離RS7抗體。在針對(duì)抗原的抗體初始生成后，可對(duì)抗體進(jìn)行測(cè)序并隨后用重組技術(shù)進(jìn)行制備。鼠抗體和抗體片段的人源化和嵌合化是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。例如將小鼠互補(bǔ)決定區(qū)通過從小鼠免疫球蛋白的重和輕可變鏈將轉(zhuǎn)移至人可變區(qū)中，然后用鼠相似物置換構(gòu)架區(qū)中的人類殘基從而制備人源化單克隆抗體。源自人源化單克隆抗體的抗體成分的應(yīng)用避免了與鼠恒定區(qū)免疫原性相關(guān)的潛在問題。本發(fā)明的用于和人源化、嵌合或人RS7抗體聯(lián)合治療的人抗體，即，人EGP-1MAb或其它人抗體，如抗-EGP-2，MUC1-4，CEA，CC49，CSAp，PSMA，PSA，EGFR，A33和腿2/neuMAb，可獲自轉(zhuǎn)基因的非人類動(dòng)物。例如參見Mendez等，NatureGenetics,15:146-156(1997);美國(guó)專利5,633,425，其全文引入此處作為參考。本發(fā)明的可用于聯(lián)合治療的人抗體還可與選自Le(y)、Tn、Tag-72、AFP、HCG、HCG-(3、鐵蛋白、PAP、EGP-2、組蛋白、細(xì)胞角蛋白、腱生蛋白、CanAg、腎癌G250、VGFR1、VGFR2或其組合的抗原反應(yīng)。例如人抗體可從含有人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠中回收。通過滅活內(nèi)源免疫球蛋白基因和導(dǎo)入人免疫球蛋白基因座將該小鼠體液免疫系統(tǒng)人源化。人免疫球蛋白基因座非常復(fù)雜且包含大量的不連續(xù)區(qū)段，其總共幾乎占人基因組的0.2%。為確保轉(zhuǎn)基因小鼠能夠產(chǎn)生足夠抗體庫(kù)，必須將大部分人重鏈和輕鏈基因座導(dǎo)入小鼠基因組。這要用分步法來完成，開始要構(gòu)建含有以種系構(gòu)型的或者人重鏈或者輕鏈的免疫球蛋白基因座酵母人工染色體(YAC)。因?yàn)闆]插入的大小大約是1Mb，故構(gòu)建YAC需要免疫球蛋白基因座重復(fù)片段的同源重組。將兩種YAC，一種含有重鏈基因座而一種含有輕鏈基因座，經(jīng)由含有YAC-酵母球芽與小鼠胚胎干細(xì)胞的融合而分別導(dǎo)入小鼠。然后將胚胎干細(xì)胞克隆顯微注射至小鼠嚢胚。根據(jù)經(jīng)由其生殖腺傳輸YAC的能力篩選結(jié)果得到的嵌合雄性然后將其與鼠抗體制備缺陷的小鼠進(jìn)行繁殖。培養(yǎng)這兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系，一個(gè)含有人重鏈基因座而另一個(gè)含有人輕鏈基因座，產(chǎn)生響應(yīng)免疫而生成人抗體的子代?？寺∈竺庖咔虻鞍卓勺儏^(qū)的一般方法描述于，例如Orlandi等Proc.Nat，lAcad.SciUSA86-3833(1989)的公開內(nèi)容中，其全文引入作為參考。制備人源化MAbs的方法描述于，例如Carter等，Proc.Nat，lAcad.SciUSA89:4285(1992)，和Singer等J.Immun.150:2844(1992)，Mountain等Biotechnol.Genet.Eng.Rev.10:1(1992)，和Coligan10.19.1-10.19.11頁(yè)，由此將上述每一文件均引入作為參考。通常，RS7抗體的Vk(可變輕鏈)和(可變重鏈)序列可通過多種分子克隆方法，如RT-PCR，5'-RACE和cDNA文庫(kù)篩選獲得。具體地，MAbRS7的VH和vk基因通過來自雜交瘤細(xì)胞的PCR擴(kuò)增分別通過RT-PCR和5'-RACE而進(jìn)行克隆，并用DNA測(cè)序確定其序列。為證實(shí)其可靠性，將克隆的W和Vh基因在細(xì)胞培養(yǎng)物中作為嵌合Ab表達(dá)，如0rlandi等，(Proc.Nat，lAcad.SciUSA,86:3833(1989))所述，其引入作為參考。根據(jù)V基因序列，然后設(shè)計(jì)和構(gòu)建人源化RS7抗體，如Leung等(Mo1.Immunol.，32:1413(1995))所述，其引入作為參考?？蓮娜魏我阎ㄟ^一般的分子克隆技術(shù)(Sambrook等，MolecularCloning,Alaboratoryma纖l，2薦(1989))制備鼠或嵌合RS7抗體的雜交瘤系或轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中制備cDNA。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用RS7雜交瘤系。用于mAb的Vk序列可使用引物VK1BACK和VKI魔(Orlandi等，1989)或如Leung等(BioTechniques，15:286(1993)，其引入作為參考)所描述的擴(kuò)展引物組進(jìn)4亍擴(kuò)增，而Vb序列可4吏用引物對(duì)VH1BACK/VH1F0R(Orlandi等，1989above)，或與Leung等(Hybridoma，13:469(1994)，將其引入作為參考)所描述的與鼠IgG恒定區(qū)退火的引物進(jìn)行擴(kuò)增。將包含10fil第一鏈cDNA產(chǎn)物，10nl10xPCR緩沖液[500mMKCl，100mMTris-HC1(pH8.3)，15mMMgCL和0.01%(W/V)明膠〗(PerkinElmerCetus，Norwalk，CT)，250fiM各麗P，200nM引物，和5單位Taq腿聚合酶(PerkinElmerCetus)的PCR反應(yīng)混合物實(shí)施30個(gè)PCR循環(huán)。每個(gè)PCR循環(huán)優(yōu)選包括94C變性1分鐘，5(TC退火1.5分鐘，和721C聚合1.5分鐘。擴(kuò)增的Vk和VH片段可在2%瓊脂糖上純化(BioRad，Richmond,CA)。相似地，可通過長(zhǎng)寡核苷酸模板合成和PCR擴(kuò)增聯(lián)合(如Leung等(Mol.Immunol,32:1413(1995)所述)構(gòu)建人源化V基因?？蓪k的PCR產(chǎn)物亞克隆至staging載體，如基于pBR327的staging載體VKpBR，其包含Ig啟動(dòng)子，信號(hào)肽序列和便于VkPCR產(chǎn)物的框架內(nèi)連接方便的限制性位點(diǎn)?？蓪H的PCR產(chǎn)物亞克隆至相似staging載體，如基于pBluescript的VHpBS。包含各PCR產(chǎn)物的各克隆可用，被引入作為參考的Sanger等Proc.Nat1.Acad.Sci-USA，74:5463(1977)的方法進(jìn)行測(cè)序。本文所述DNA序列應(yīng)被理解為包括所有其等位基因，突變體和變體，無論是天然存在的還是誘導(dǎo)的。含有Vk和VH，和啟動(dòng)子和信號(hào)肽序列的表達(dá)盒分別從VKpBR和VHpBS剪切，經(jīng)雙限制性酶切為HindIII-BamHI片段。然后將Vk和VH表達(dá)盒分別連接至適宜的表達(dá)載體，如pKh和pGlg中(Leung等，Hybridoma，13:469(1994))?？蓪⒈磉_(dá)載體共轉(zhuǎn)染至適宜的細(xì)胞中，例如骨髓瘤Sp2/0-Agl4(ATCC，VA)，選擇潮霉素抗性的集落，和采用例如ELISA檢測(cè)法，如下述檢測(cè)上清液中嵌合抗體或人源化RS7MAb的制備?；蛘撸蓪K和VH表達(dá)盒組裝至改良的staging載體，VicpBR2和VHpBS2中，分另'J剪切為Xbal/BamHI和XhoI/BamHI片段，然后亞克隆至單個(gè)表達(dá)載體，如pdHL2，如Gilles等(JImmunol.Methods125:191(1989)所述和還可參加Losman等，癌癥，80:2660(1997))而在SP2/0-AGL4細(xì)胞中表達(dá)。適用于本發(fā)明的另一載體是GS載體，如Barnes等，Cytotechnology32:109-123(2000)中所述，所述載體優(yōu)選在NS0細(xì)胞系和CH0細(xì)胞中表達(dá)。Werner等，Arzneim.-Forsch./DrugRes.48(11)，Nr.8，870-880(1998)中描述了其它適宜的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。然后按下述實(shí)施共轉(zhuǎn)染和用ELISA檢測(cè)分泌抗體的克隆。根據(jù)被引入作為參考的Co等JImmunol.，148:1149(1992)的描述，可將約lO^igVKpKh(輕鏈表達(dá)載體)和20ngVHpGIG(重鏈表達(dá)載體)通過電穿孔而用于轉(zhuǎn)染5xl06SP2/0骨髄瘤細(xì)胞(BioRad,Richmond,CA)。轉(zhuǎn)染后，可在96-孔微量滴定板上于完全HSFM培養(yǎng)基(LifeTechnologies,Inc.,GrandIsland,NY)中以37匸，5%C02培養(yǎng)細(xì)胞?？稍诩尤虢K濃度500單位/ml潮霉素的潮霉素選擇培養(yǎng)基(Calbiochem，SanDiego，CA)2日后開始選擇步驟?？寺⊥ǔＴ陔姶┛缀?~3周出現(xiàn)。然后將培養(yǎng)物擴(kuò)展以用于進(jìn)一步的分析。適用的宿主細(xì)胞包括微生物的或哺乳動(dòng)物的宿主細(xì)胞。優(yōu)選的宿主是人細(xì)胞系，PER.C6，其為制備Mab而構(gòu)建，和其它融合蛋白。因此，本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是包含編碼抗-EGP-lMAb、綴合物、融合蛋白或其片段的DNA序列的宿主細(xì)胞。PER.C6細(xì)胞(WO97/00326)是通過使用含有在人磷酸甘油酸酯激酶(PGK)啟動(dòng)子的控制下Adserotype5(Ad5)E1A和E1B編碼序歹'J(Ad5nucleotides459-3510)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞而產(chǎn)生。E1A和E1B分別是腺病毒早期基因活化蛋白1A和1B。該方法和組合物特別適用于生成發(fā)生翻譯前修飾的，例如通過糖基化修飾的所需人重組蛋白的穩(wěn)定表達(dá)。某些特性使得PER.C6特別適用于作為重組蛋白制備的宿主，如PER.C6是被完全定性的人細(xì)胞系且其已經(jīng)發(fā)展了非常好的實(shí)驗(yàn)室操作。而且，PER.C6可在無血清缺乏任何人或動(dòng)物來源的蛋白的培養(yǎng)基中以懸浮培養(yǎng)物生長(zhǎng)且其生長(zhǎng)適合滾瓶，搖瓶、旋轉(zhuǎn)瓶和生物反應(yīng)器，其倍增時(shí)間為約35小時(shí)。最后，ElA的存在導(dǎo)致上調(diào)CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子調(diào)控下的基因表達(dá)而E13的存在防止了可能由于重組轉(zhuǎn)基因的過表達(dá)而增強(qiáng)的p53-依賴的凋亡。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞能夠產(chǎn)生比常規(guī)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系高2200倍的重組蛋白和/或蛋白性物質(zhì)。用ELISA測(cè)試法鑒別分泌嵌合或人源化重鏈的陽(yáng)性轉(zhuǎn)染瘤克隆。簡(jiǎn)言之，將來自轉(zhuǎn)染瘤培養(yǎng)物的上清樣品(100nl)以三份加入用山羊抗-人(GAH)-IgG，F(xiàn)(ab')2片段-特異性抗體(JacksonImm畫research，WestGrove,PA)預(yù)包被的ELISA微量滴定板上。滴定板室溫下孵育1小時(shí)。用洗滌緩沖液(含0.05%聚山梨醇酯-20的PBS)洗板三次以除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。將辣根過氧化物酶(HRP)綴合的GAH-IgG，F(xiàn)c片段-特異性抗體(JacksonImmunoResearch，WestGrove，PA)加入孔內(nèi)，(100jil抗體稀釋儲(chǔ)存液x104，用未結(jié)合的抗體補(bǔ)充至終濃度1.0g/ml)。孵育1小時(shí)后，通常洗板三次。每孔加入反應(yīng)液[100fi1含有167ng鄰笨二胺(OPD)(Sigma,St.Louis,M0)，0.025%過氧化氫的PBS]。在黑暗中顯色30分鐘。在每孔中加入50nl4MHC1溶液終止反應(yīng)，然后用自動(dòng)化ELISA讀數(shù)儀(Bio-Tekinstruments,Wi畫ski，VT)測(cè)定490nm處吸光度。然后相對(duì)于無關(guān)聯(lián)嵌合抗體標(biāo)準(zhǔn)(可獲自Scotgen，Ltd.,Edinburg,Scotland)測(cè)定結(jié)合的嵌合抗體?？贵w可按下述方法從細(xì)胞培養(yǎng)基中分離。轉(zhuǎn)染瘤培養(yǎng)物適于無血清培養(yǎng)基。為制備嵌合抗體，利用HSFM在滾瓶中將細(xì)胞生長(zhǎng)為500ml培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物離心使細(xì)胞成團(tuán)，上清液經(jīng)0.2nm膜過濾。使過濾的培養(yǎng)基以lml/分的速度通過A蛋白柱(1x3cm)。然后用約10個(gè)柱體積的PBS洗柱，用含lOmMEDTA的0.1M甘氨酸的緩沖液(pH3.5)從柱上洗脫蛋白A結(jié)合的抗體。在lOjil3MTris(pH8.6)的存在下，搜集lml洗脫級(jí)分，測(cè)定280/260nm處吸光度確定蛋白質(zhì)濃度。將峰值洗脫級(jí)分集中，對(duì)PBS透析，用例如Centricon30(Amicon，Beverly,MA)濃縮蛋白質(zhì)。用ELISA測(cè)定抗體濃度，如前，用PBS將其濃度調(diào)整至約1mg/ml。在樣品中益于加入0.01%(w/v)的疊氮化鈉作為保存劑。用于制備RS7抗體的引物的核苷酸序列如下述實(shí)施例2所列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，人源化RS7抗體或抗體片段包括鼠RS7Mab的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRS)和人抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)的框架區(qū)(FR)和人抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)，其中人源化RS7的輕鏈可變區(qū)的CDR包括含有氨基酸序列KASQDVSIAVA的CDR1;含有氨基酸序列SASYRYT的CDR2;和含有氨基酸序列QQHYITPLT的CDR3;而人源化RS7MAb的重鏈可變區(qū)的CDR包括含有氨基酸序列NYGMN的CDR1;含有氨基酸序歹'JWINTYTGEPTYTDDFKG的CDR2和含有氛基酸序列GGFGSSYWYFDV的CDR3。同樣優(yōu)選的，人源化抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)的FR包括至少一種被鼠RS7Mab的所述相應(yīng)FR置換的氨基酸?？刹捎枚喾N已良好建立的方法從雜交瘤培養(yǎng)物中分離和純化MAb。所述分離方法包括使用A蛋白瓊脂糖凝膠的親和層析，大小排阻層析和離子交換層析。例如參見Coligan2.7.1-2.7.12頁(yè)和2.9.1_2.9.3頁(yè)。還可參見，METHODSINMOLECULARBIOLOGY,VOL.10，79-104頁(yè)(TheH畫naPress,Inc.1992)中的Baines等"PurificationofImmunoglobulinG(IgG)，，。RS7MAb可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的多種方法進(jìn)行特征描述。例如可使用非直接免疫熒光檢測(cè)，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析或Western分析鑒別RS7MAb結(jié)合RS7抗原的能力。RS7抗體片段的制備本發(fā)明涉及RS7和hRS7抗體片段的用途。識(shí)別特異性表位的抗體片段可用已知方法制備?？贵w片段是抗體的抗原結(jié)合部，如F(aV)2，F(xiàn)ab、Fab，F(xiàn)v，sFv等。其它抗體片段包括，但不限于通過抗體分子的胃蛋白酶消化制備的F(ab)。片段，和可通將F(ab)。片段的二硫鍵還原而制備的FaV片段。這些方法描述于，例如Goldenberg，美國(guó)專利4，036，945和4，331,647和本文所包含的參考文獻(xiàn)中，將所述專利全文引入此處作為參考。同樣，參見Nisonoff等，ArchBiochem.Biophys.89:230(1960);Porter,Biochem.J73:119(1959)，Edelman等，METHODSINENZYM0L0GYVol.1，422頁(yè)(AcademicPress1967)，和Coligan2.8.1-2.8.10和2.10.-2.10.4頁(yè)。或者，可構(gòu)建Fab'表達(dá)文庫(kù)(Huse等，1989，Science,246:1274-1281)從而可以快速且簡(jiǎn)便地鑒別具有所需特異性的單克隆Fab'片段。本發(fā)明包括抗體和抗體片段。單鏈Fv分子(scFV)包括VL區(qū)和VH區(qū)。VL和VH區(qū)聯(lián)合形成耙位結(jié)合位點(diǎn)。這兩個(gè)區(qū)還可通過肽連接子(L)而共價(jià)相連。scFV分子可被表示為或者VL-L-VH若VL區(qū)是scFV分子的N-末端部分，或者VH-L-VL若VH區(qū)是scFV分子的N-末端部分。制備scFV分子和設(shè)計(jì)適用的肽連接子的方法描述于美國(guó)專利4,704,692，美國(guó)專利號(hào)4,946,778，R.Raag和M.Whitlow,"SingleChainFvs."FASEBVol9:73-80(1995)和R.E.Bird和B.W.Walker,"SingleChainAntibodyVariableRegions,"TIBTECH，Vol9:132-137(1991)中。這些參考文件全文引入此處作為參考。可通過全長(zhǎng)抗體的蛋白水解作用或編碼片段的DNA在大腸桿菌(E.coli)中或另一宿主中的表達(dá)來制備抗體片段。可采用常規(guī)方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全長(zhǎng)抗體而獲得抗體片段。例如抗體片段可通過用胃蛋白酶酶法裂解抗體而提供表示為F(at/)2的5S片段而制備。該片段還可用巰基還原劑，和可任選地由二硫鍵的裂解而產(chǎn)生的巰基的阻斷劑進(jìn)一步裂解，以產(chǎn)生3.5SFaV單價(jià)片段?；蛘撸褂媚竟系鞍酌傅拿感粤呀饪芍苯赢a(chǎn)生兩個(gè)單價(jià)Fab片段和Fc片段。這些方法描述于，例如Goldenberg，美國(guó)專利4,036,945和4，331，647，和本文包括的參考文件，所述專利全文引入此處作為參考。并且，參見Nisonoff等，ArchBiochem.Biophys.89:230(1960);Porter,Biochem.J.73:119(1959)，EDELMAN等，METHODSINENZYM0L0GYVol.1,422頁(yè)(AcademicPress1967)，和Coligan2.8.1-2.8.10和2.10.-2.10.4頁(yè)。抗體片段的另一形式是編碼單個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的肽。CDR是抗體的可變區(qū)的片段，其與抗體結(jié)合的表位在結(jié)構(gòu)上互補(bǔ)且比可變區(qū)的其它部分更具可變性。因此，CDR有時(shí)是指高可變區(qū)?？勺儏^(qū)包括三個(gè)CDR?？赏ㄟ^構(gòu)建編碼所需要抗體的CDR的基因而獲得CDR肽。例如可通過采用多聚酶鏈反應(yīng)從產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的RNA合成可變區(qū)制備所述基因。例如參見Larrick等，Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology2:106(1991)^Courtenay-Luck，"GeneticManipulationofMnonoclonalAntibodises，，，MONOCLONALANTIBODIES:廳UCTIONENGINEERINGANDCLINICALAPPLICATION中，Ritter等(eds.)，166-179頁(yè)(CambridgeUniversityPress1995);和Ward等，"GeneticManipulationandExpressionofAntibodies,"MONOCLONALANTIBODIES:PRODUCTION,ENGINEERINGANDCLINICALAPPLICATIONS中，Birch等，(eds.),137-185頁(yè)(Wiley-Liss，Inc.1995)。其它裂解抗體的方法，如分離重鏈以便形成單價(jià)輕鏈-重鏈片段，片段的進(jìn)一步裂解，或其它酶，化學(xué)或遺傳技術(shù)也是可以使用的，只要片段能與被完整抗體識(shí)別的抗原結(jié)合。嵌合、人源化和人RS7抗體融合蛋白的制備抗體融合蛋白及其片段可通過多種常規(guī)方法制備，所述方法包括兩個(gè)官能團(tuán)間的戊二醛連接直至更特別的連接?？贵w和/或抗體片段優(yōu)選彼此直接或經(jīng)由連接部分，經(jīng)由抗體或片段上的一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)例如胺基、羧基、苯基、巰基或羥基而共價(jià)結(jié)合。可以使用戊二醛以外的多種常規(guī)連接劑，例如二異氰酸酯，二異硫氰酸酯，二(羥基琥珀酰亞胺)酯，碳二亞胺，馬來酰亞胺鞋基琥珀酰亞胺酯等。制備嵌合，人源化和人RS7抗體融合蛋白的簡(jiǎn)單方法是將抗體或片段在存在戊二醛的條件下混合以形成抗體融合蛋白。初始希夫堿連接基團(tuán)可通過例如硼氫化物還原成仲胺而被穩(wěn)定。二異氰酸酯或碳二亞胺可用于代替戊二醛而作為非位點(diǎn)特異性連接子?？贵w融合蛋白被預(yù)期含有高于Mab的結(jié)合特異性，因?yàn)槿诤系鞍装ńY(jié)合RS7抗原的至少兩種表位的部分。因此，抗體融合蛋白是RS7抗原結(jié)合蛋白用于治療的優(yōu)選形式。在本文中，抗體融合蛋白包括至少兩種嵌合、人源化或人RS7MAb，或其片段，其中至少兩種MAb或片段與RS7抗原的不同表位結(jié)合或抗RS7表位和完全不同的抗原的表位。例如雙特異性RS7抗體融合蛋白可包括CEA抗體或其片段和RS7MAb或其片段。所述雙特異性RS7抗體融合蛋白可以，例如通過從CEA獲得F(aV)2片段如上述而得以制備。抗體F(aV)2片段的鏈間二硫鍵被半胱氨酸輕微還原，謹(jǐn)慎地以便避免輕-重鏈連接，從而形成Fab'-SH片段。巰基被過量二馬來酰亞胺連接劑活化(1,1，-(亞甲基二-4，1-亞苯基)雙馬來酰亞胺)。將RS7Mab轉(zhuǎn)變?yōu)镕aV-SH然后與活化的CEAFab'-SH片段反應(yīng)從而獲得雙特異性RS7抗體融合蛋白。多特異性RS7抗體融合蛋白可通過將RS7抗原結(jié)合部分加至雙特異性嵌合、人源化或人RS7抗體融合蛋白獲得。例如雙特異性抗體融合蛋白可與2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷反應(yīng)而導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)用于將雙特異性融合蛋白偶連至第三個(gè)RS7抗原MAb或片段的巰基，其中使用上述雙馬來酰亞胺活化方法。這些用于制備抗體復(fù)合物的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如參見美國(guó)專利4，925，648，其全文引入作為參考。雙特異性抗體可通過多種常規(guī)方法制備，例如二硫化物裂解和完整IgG混合物的重建或，優(yōu)選F(ab')2片段，融合多于一個(gè)雜交瘤從而形成能產(chǎn)生具有多于一種特異性的抗體的多瘤，和通過遺傳工程。已經(jīng)通過對(duì)來自不同抗體還原裂解的Fab'片段的氧化裂解而制備雙特異性抗體融合蛋白。其可方便的通過如下方法實(shí)施，通過混合兩種不同的用胃蛋白酶消化兩種不同抗體而制備的F(ab')2片段，還原裂解從而形成FaV片段的混合物，然后氧化重建二硫鍵從而制備包括含有特異性針對(duì)每個(gè)原始表位的Fab'部分的雙特異性抗體融合蛋白的F(ab')2片段的混合物。制備抗體融合蛋白的一般方法可見于，例如Nisonoff等，ArchBiochem.Biophys.93:470(1961)，Hammering等，J.Exp.Med.128:1461(1968)，和美國(guó)專利4,331,647中。本發(fā)明涉及包含至少一種第一抗-EGP-1MAb或其片段和至少一種除外本發(fā)明的抗-EGP-lMAb或其片段的第二MAb或其片段的抗體融合蛋白或其片段。通過使用異雙功能連接劑如馬來酰亞胺羥基琥珀酸亞胺酯可實(shí)現(xiàn)高選擇性連接。酯和抗體或片段的反應(yīng)將在抗體或片段衍生胺基，然后將該衍生物與，例如抗體Fab片段具有游離巰基(或，采用例如添加了巰基的較大片段或完整抗體的Traut氏試劑)反應(yīng)。所述連接劑不太可能在相同抗體內(nèi)交聯(lián)基團(tuán)并提供了連接的選擇性。將抗體或片段在遠(yuǎn)離抗原結(jié)合位點(diǎn)的位點(diǎn)連接是有益的。其可通過，例如連接至裂解的鏈內(nèi)巰基而實(shí)施，如上述。另一方法包括將具有氧化糖部分的抗體與具有至少一個(gè)游離胺官能團(tuán)的另一抗體反應(yīng)。這形成了希夫堿(亞胺)鍵，其優(yōu)選通過還原成仲胺，例如通過硼氫化物還原，形成最終的綴合物而穩(wěn)定。對(duì)于小分子，所述位點(diǎn)特異性連接描述于美國(guó)專利4,671,958中，而對(duì)大附加物則見美國(guó)專利4,699,784-引入作為參考。具有長(zhǎng)度多于12個(gè)氨基酸殘基的連接子(例如15-或18-殘基連接子)的ScFv能產(chǎn)生同鏈上VH和VL區(qū)間的相互作用而通常形成單體、二聚體(稱為雙抗體)和少量高分子量多聚物的混合物(Kortt等，Eur.J.Biochem.(1994)221:151-157)。然而，具有長(zhǎng)度多于5個(gè)或少于5個(gè)氨基酸殘基的連接子的ScFv，阻止了同鏈上VH和VL區(qū)的分子內(nèi)配對(duì)，強(qiáng)制不同鏈上VH和VL區(qū)的配對(duì)。3-12個(gè)殘基的連接子主要形成二聚體(Atwell等，ProteinEngineering(1999)12:597-604)。用0~2個(gè)殘基的連接子，會(huì)形成scFv的三聚體(稱為三抗體)，四聚體(稱為四抗體)或更高的低聚體；然而，低聚反應(yīng)的精確模式顯示出除了連接子長(zhǎng)度以外還依賴組成和V-區(qū)的方向。例如用0個(gè)殘基的連接子，抗-神經(jīng)氨酸酶抗體NC10的scFv主要形成三聚體(VH至VL方向)或四聚體(VL至VH方向)(Dolezal等，ProteinEngineering(2000)13:565-574)。對(duì)于用卜和2-殘基連接子從NC10構(gòu)建scFV，VH至VL方向主要形成二聚體(Atwell等，ProteinEngineering(1999)12:597-604);相反地，VL至VH方向形成四聚體，三聚體，二聚體和更高分子量多聚體的混合物(Dolezal等，ProteinEngineering(2000)13:565_574)。對(duì)于抗-CD19抗體HD37以VH~VL方向構(gòu)建scFV，0-殘基連接子只形成三聚體而1-殘基連接子只形成四聚體(LeGall等，F(xiàn)EBSLetters(1999)453:164-168)。本發(fā)明的RS7抗體及其片段還可用于制備抗原-特異性雙抗體，三抗體和四抗體，其是多價(jià)的但具有單特異性。兩個(gè)或多個(gè)scFv分子的非共價(jià)聯(lián)合可形成功能性雙抗體，三抗體和四抗體。單特異性雙抗體相同scFv的同型二聚體，其中每個(gè)scFv包括來自選擇的抗體的VH區(qū)，所述選擇的抗體通過短連接子而與相同抗體相連。二體是通過非共價(jià)聯(lián)合兩個(gè)scFV形成的二價(jià)二聚體，產(chǎn)生兩個(gè)Fv結(jié)合位點(diǎn)。三體來自三個(gè)scFv的三價(jià)三聚體的形成，產(chǎn)生三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，而四體來自四個(gè)scFvs的四價(jià)四聚體，產(chǎn)生四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。某些單特異性二體是通過使用包含重組基因構(gòu)建體的表達(dá)載體而制備的，所述重組基因構(gòu)建體包含VH1-連接子-Vu。參見Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993);Atwell等，MolecularImmunology33:1301-1302(1996);Holliger等，NatureBiotechnology15:632-631(1997);Helfrich等，Int.J.Cancer76:232-239(1998);Kipriya磨等，Int.J.Cancer77:763-772(1998);Holiger等，CancerResearch59:2909-2916(1999))。構(gòu)建scFVs的方法7>開于US-4,946,778(1990)和US-5，132，405(1992)中。根據(jù)scFV而制備多價(jià)，單特異性結(jié)合蛋白的方法公開于US-5，837，242(1998)，US-5，844，094(1998)和WO-98/44001(1998)中。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是包含一個(gè)或多個(gè)具有對(duì)EGP-1靶抗原親和力的抗原結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)或多個(gè)具有對(duì)半抗原分子親和力的半抗原結(jié)合位點(diǎn)的多價(jià)，多特異性抗體或其片段。測(cè)定抗體結(jié)合親和力由此分離的mRS7，cRS7和hRS7抗體的相對(duì)結(jié)合親和力可通過直接放射免疫法測(cè)定。RS7可用'3'1或mI以氯胺-T法進(jìn)行標(biāo)記(例如參見Greenwood等，Biochem.J.，89:123(1963)，其引入作為參考)。通常將碘化抗體的比活調(diào)整至約10fiCi/[ig。未標(biāo)記的和標(biāo)記的抗體用反應(yīng)培養(yǎng)基(添加了1。/。馬血清和lOOjig/ml慶大霉素的HSFM)稀釋至適宜濃度。將適宜濃度的標(biāo)記的和未標(biāo)記的抗體一起加入反應(yīng)管，總體積為100nl。取樣ME180細(xì)胞(人頸癌細(xì)胞系)并測(cè)定細(xì)胞濃度。離心培養(yǎng)物然后收集于反應(yīng)培養(yǎng)基中洗滌一次的細(xì)胞，然后在反應(yīng)培養(yǎng)基中混旋至終濃度約10'細(xì)胞/ml。所有步驟均在41C冷條件下實(shí)施。將lOOjil細(xì)胞懸液加入反應(yīng)管。4"C冷條件下實(shí)施反應(yīng)2小時(shí)，期間定期輕微震蕩反應(yīng)管以便使細(xì)胞重懸。反應(yīng)期后，每管加入5ml洗滌緩沖液(含有1%BSA的PBS)。離心懸液然后用5ml洗滌緩沖液第二次洗滌細(xì)胞片狀沉淀物。離心后，在Y計(jì)數(shù)器(Minaxi，PackardInstruments,Sterling,Va.)中計(jì)數(shù)殘留在細(xì)胞片狀沉淀物中的殘留放射性的量。表達(dá)載體表達(dá)載體是包含在宿主細(xì)胞中表達(dá)的基因的DNA分子。通常，將基因表達(dá)置于包括組成型或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，組織-特異性調(diào)節(jié)元件和增強(qiáng)子的特定調(diào)節(jié)元件的調(diào)控之下。所述基因被稱為"操作性連接于"調(diào)節(jié)元件。啟動(dòng)子是引導(dǎo)結(jié)果基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列。結(jié)構(gòu)基因是轉(zhuǎn)錄成信使RNA(mRNA)，后者然后翻譯成特定多肽的特征性氨基酸序列的DNA序列。典型地，啟動(dòng)子位于基因的5'區(qū)，近似于結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。如果啟動(dòng)子是一個(gè)可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，那么響應(yīng)誘導(dǎo)劑轉(zhuǎn)錄速率增加。相反，如果啟動(dòng)子是一個(gè)組成型啟動(dòng)子，則轉(zhuǎn)錄速率不受誘導(dǎo)劑的調(diào)控。增強(qiáng)子是一種DNA調(diào)節(jié)元件，其可提高轉(zhuǎn)錄效率，而不論增強(qiáng)子相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離或方向如何。分離的DNA分子是未整合至生物體的基因組DNA中的DNA片段。例如克隆的RS7抗原基因是從哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA中分離的DNA片段。分離的DNA分子的另一實(shí)例是未整合至生物體的基因組DNA中的化學(xué)合成,分子?；パa(bǔ)DNA(cDNA)是通過酶逆轉(zhuǎn)錄酶從mRNA模板形成的單鏈DNA分子。通常，與mRNA的部分互補(bǔ)的引物用于啟動(dòng)反轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域技術(shù)人員還使用術(shù)語(yǔ)"cDM"來指由所述單鏈DNA分子和其互補(bǔ)DNA鏈組成的雙鏈DNA分子?？寺』d體載體是一種DNA分子，如質(zhì)粒、粘性質(zhì)?；蚴删w，其具有在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的能力。克隆化載體典型地包含一個(gè)或少量限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，在該識(shí)別位點(diǎn)，外源性DNA序列可以可確定的方式插入而不失去載體的基本生物功能，還包含一個(gè)標(biāo)記基因，其適用于鑒別和選擇用克隆化載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。標(biāo)記基因典型地包括提供四環(huán)素抗性或氨千西林抗性的基因。重組宿主可以是含有克隆化載體或表達(dá)載體地任何原核或真核細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ)的意義還包括經(jīng)i核細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)表達(dá)是指基因產(chǎn):"生物合成。例如在i構(gòu)基因^i青況下，表達(dá)涉及結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄為mNA和mRNA翻譯為一個(gè)或多個(gè)多肽。人源化、人和嵌合RS7抗體在治療和診斷中的用途本發(fā)明涉及一種診斷或治療個(gè)體中惡性腫瘤的方法，包括對(duì)個(gè)體給予治療有效量的包含EGP-1MAb或其片段或抗體融合蛋白或其片段的治療綴合物，其中EGP-1MAb或其片段或抗體融合蛋白或其片段與至少一種治療劑結(jié)合并隨后在藥學(xué)上適用的賦形劑中配制。其還預(yù)期了未綴合的(棵)EGP-1MAb或與其它抗原-結(jié)合部分的融合構(gòu)建體還可用于治療表達(dá)EGP-1的癌細(xì)胞。這些未結(jié)合的抗體可方便地與其它治療模式，如化療，放療和/或免疫治療，或一起或與多種次序和程序聯(lián)合。還優(yōu)選的是一種診斷或治療癌癥的方法，包含對(duì)有此需要的個(gè)體給予包含一個(gè)或多個(gè)針對(duì)EGP-1抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)或多個(gè)半抗原結(jié)合位點(diǎn)的多價(jià)，多特異性抗體或其片段，等待足夠長(zhǎng)的時(shí)間以便使非結(jié)合蛋白的量從個(gè)體血流中清除；然后對(duì)所述個(gè)體給予包含診斷劑、治療劑或其組合，與所述抗體的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的載體分子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，癌癥是肺癌、乳癌、頭頸癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌或結(jié)腸癌。用于制備單克隆抗體(MAb)的雜交瘤技術(shù)已經(jīng)通過了一種用于制備能定位或殺死癌細(xì)胞的分子探針的方法。使用放射性標(biāo)記的MAb的腫瘤顯像技術(shù)已經(jīng)被用于描述多種惡性腫瘤中的癌浸潤(rùn)。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類中，抗體和其它靶向抗體已被用于在多種表達(dá)癌胚的肺瘤中癌胚抗原的放射免疫測(cè)定，以及腫瘤如黑素瘤，結(jié)腸癌和乳癌。Goldenberg等，CancerRes.40:2984(1980);Hwang等，CancerRes.45:4150(1985);Zalcberg等，J.Nat，l.CancerInst.71:801(1983)5Colcher等，CancerRes.43:736(1983);(Urson等，J.Nucl.Med.24:123(1983)jDeUnd等，CancerRes.40:3046(1980)JEpenetos等，Lancet2:999(1982)。MAb在體外診斷中的用途是眾所周知的。例如參見Carlsson等，Bio/Technology7(6):567(1989)。例如MAb可用于檢測(cè)生物樣組織中腫瘤相關(guān)抗原的存在。MAb還可采用如放射性免疫測(cè)試法，酶中腫瘤相關(guān)抗原的量。肺瘤-靶向MAb和毒素的綴合物可用于選擇性在體內(nèi)殺死癌細(xì)胞(Spalding,Bio/Technology9(8):701(1991)^Goldenberg，ScientificAmericanScience&Medicine1(1):64(1994))。例如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中的治療研究已經(jīng)證實(shí)了攜帶細(xì)胞毒性放射性核素的抗體的抗-腫瘤活性。(Goldenberg等，CancerRes.41:4354(1981)，Cheung等，J.Nat"lCancerInst.77:739(1986)，和Senekowitsch等，J.Nucl.Med.30:531(1989))。還參見Stein等，AntibodyImmunoconj.Radiopharm.4:703(1991)，其全文引入作為參考。而且，已經(jīng)開始關(guān)于治療淋巴瘤，黑素瘤，和其它惡性腫瘤的使用某些該Mabs的I期治療試驗(yàn)。例如參見DeNardo等，Int.J.CancerSuppl.3:96(1988)，和Goldenberg等，J.CIin.Oncol.9:548(1991)。人源化，嵌合和完整人抗體及其片段適用于診斷方法和治療方法中。因此，本發(fā)明包括將診斷劑或治療劑，或其組合遞送至靶位的方法，包括(i)提供包括抗-EGP-1抗體的組合物和(ii)對(duì)有此需要的個(gè)體給予診斷性或治療性抗體綴合物。優(yōu)選地，將本發(fā)明的嵌合，人源化和完整人類RS7抗體及其片段用于治療惡性腫瘤的方法中。本文還描述了靶向癌細(xì)胞的診斷綴合物或治療綴合物，其包含含有可與癌細(xì)胞結(jié)合的抗-EGP-lMAb或其片段或抗體融合蛋白或其片段的抗體成分，其中抗體成分與至少一種診斷劑或至少一種治療劑結(jié)合。優(yōu)選地，診斷綴合物至少包括光活化性診斷劑或MRI造影劑。更優(yōu)選地，診斷劑是能量為60~4，000keV的放射性標(biāo)記物。用于治療的組合物包含至少一種單獨(dú)棵或結(jié)合的人源化、嵌合或人RS7抗體，或與本發(fā)明的其它棵或結(jié)合的人源化，嵌合，人類或其它抗體聯(lián)合，或與本文未公開的其它棵或結(jié)合的人源化、嵌合或人抗體聯(lián)合。本發(fā)明還包括將結(jié)合的或棵抗體與不與抗-EGP-1抗體結(jié)合的治療劑如免疫調(diào)節(jié)劑，或診斷劑一起給藥。針對(duì)相同或不同的表位或抗原的棵或結(jié)合的抗體還可與一種或多種本發(fā)明的抗體聯(lián)合。因此，本發(fā)明涉及單獨(dú)施用抗-EGP-1抗體及其片段，作為棵抗體或抗體片段，或作為多元治療的施用。優(yōu)選地，抗體是人源化、嵌合或完整人RS7抗體或其片段。部分的多元治療還包括增加了以棵抗體，融合蛋白，或免疫綴合物的形式施用其它抗體的使用棵抗-EGP-l抗體的免疫治療。例如人源化，嵌合或完整人RS7抗體可與另一棵人源化，嵌合RS7或其它抗體，或與同位素、一個(gè)或多個(gè)化療劑、細(xì)胞因子、毒素或其組合結(jié)合的人源化，嵌合RS7或其它抗體位素聯(lián)合。例如本發(fā)明預(yù)期了棵或結(jié)合的EGP-1或RS7抗體或其片段在其它實(shí)體腫瘤/癌相關(guān)的抗體如抗-EGP-2，CEA，CSAp，MUCl-4，EGFR，HER2/廳，PSA，CC49(抗-Tag72抗體)和PSMA抗體的施用之前，與之聯(lián)合或之后的治療。這些實(shí)體癌抗體可以是棵或與尤其，藥物、酶、激素、毒素，同位素或免疫調(diào)節(jié)劑綴合的。人源化，嵌合或完整人RS7抗體和毒素的融合蛋白或也可用于本發(fā)明?？蓸?gòu)建多種不同的抗體組合，或作為棵抗體或作為部分棵和部分與治療劑或免疫調(diào)節(jié)劑結(jié)合的?；蛘?，不同的棵抗體組合可用于與其它治療劑，如細(xì)胞毒類藥物或與放射聯(lián)合施用。所述抗體的組合還可用，有利地，如本領(lǐng)域已知的反義寡核苷酸制備。照這樣，治療綴合物還包括優(yōu)選可用于對(duì)B-細(xì)胞惡性腫瘤的抗癌基因和致癌基因產(chǎn)物的寡核苷酸，尤其是反義寡核苷酸。例如抑制bcl-2表達(dá)的反義分子，其被描述于美國(guó)5，734，033(Reed)，將其全文引入作為參考，其也綴合于或形成抗體融合蛋白的治療劑部分或與本發(fā)明的人源化RS7抗體一起施用。本文所描述的連于診斷劑或治療劑的單特異性結(jié)合蛋白的直接靶向RS7陽(yáng)性腫瘤。單特異性分子選擇性結(jié)合靶定抗原并且隨著分子上結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目的增加，對(duì)靶細(xì)胞親和力就增加并在所需位置觀察到更長(zhǎng)的停留時(shí)間。而且，非-抗原結(jié)合的分子可快速?gòu)捏w內(nèi)清除而將正常組織暴露量最小化。多特異性結(jié)合蛋白的使用為隨后的診斷劑或治療劑的特異性遞送預(yù)靶定了RS7陽(yáng)性腫瘤。藥劑由含有肽的琥珀酰甘氨酰組胺(HSG)攜帶。名為679(IgGl，K)鼠單克隆抗體以高親和性與含有三肽部分HSG結(jié)合(Morel等，Molecularimmunology,27，995-1000，1990)。679MAb可以和可結(jié)合HSG和靼抗原的hRS7結(jié)合而形成雙特異性結(jié)合蛋白。也可使用選擇性半抗原。這些結(jié)合蛋白選擇性地與靶定抗原結(jié)合以便產(chǎn)生增高的親和力和在所需位置上較長(zhǎng)的停留時(shí)間。而且，非-抗原結(jié)合的二抗體可從體內(nèi)快速地清除而將正常組織暴露量最小化。RS7抗體及其片段可用于治療哺乳動(dòng)物病癥如癌癥。癌癥包括，但不限于肺癌、乳癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌和結(jié)腸癌癥。根據(jù)本發(fā)明將診斷劑或治療劑遞送至靶位用于診斷或治療包括提供含有診斷劑或治療劑的抗-EGP-l抗體或其片段并將結(jié)合蛋白給予有此需要的個(gè)體。診斷還需要采用已知技術(shù)檢測(cè)結(jié)合蛋白的步驟。本發(fā)明的抗體及其片段和診斷劑或治療劑施用可采用靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、胸膜內(nèi)、鞘內(nèi)、經(jīng)區(qū)域性導(dǎo)管的輸注或直接傷口內(nèi)注射施用于哺乳動(dòng)物。當(dāng)注射施用結(jié)合蛋白時(shí)，可以連續(xù)輸注或單次或多次快速濃注。用于治療，20~800mg/m2的劑量是適宜的，優(yōu)選100-500mg/m2，而同量低劑量為診斷成4象推薦的，如0.5mg-100mg/患者。所述劑量可按不同的頻率重復(fù)，這依賴于臨床情況和患者的耐受程度?？贵w和診斷劑或治療劑可作為試劑盒在藥學(xué)可用的載體中，優(yōu)選磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)以生理pH和濃度而提供給人類或哺乳動(dòng)物治療和診斷用途。制劑優(yōu)選是無菌的，特別是如果其意在用于人類時(shí)。所述試劑盒的可選的組分包括穩(wěn)定劑，緩沖液，標(biāo)記劑，放射性同位素，順磁性化合物，用于增強(qiáng)清除率的第二抗體和常規(guī)的注射器，柱，瓶等?？每贵w治療治療有效量的棵嵌合，人源化和完整人RS7抗體，或其片段，可在藥學(xué)可用的賦形劑中配制?？们逗希嗽椿屯暾薘S7抗體的效能可通過對(duì)這些棵抗體補(bǔ)充一種或多種其它棵抗體，一種或多種嵌合，人源化和完整人RS7抗體與如藥物，毒素，免疫調(diào)節(jié)劑、激素、生長(zhǎng)因子、酶、寡核苷酸或治療性放射性核素的治療劑綴合的免疫綴合物，或一種或多種包含藥物、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、生長(zhǎng)因子、酶、寡核苷酸或治療性放射性核素的治療劑，與RS7抗體或其片段同時(shí)或次序或根據(jù)處方劑量方案施用，而得以增強(qiáng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的棵或結(jié)合的RS7抗體與至少一種癌癥藥物聯(lián)合。所述聯(lián)合治療能提高藥物或需要的較低藥物劑量的效能。例如測(cè)定Dox-RS7和2P-Dox-RS7分別對(duì)肺癌細(xì)胞系，Calu3，和兩種乳癌細(xì)胞系，MDA468和T47D的ICs。值。Calu3和T47D細(xì)胞具有EGP-1抗原陽(yáng)性而具有CEA抗原陰性，而MDA468對(duì)EGP-1和CEA抗原均是陽(yáng)性的。結(jié)果顯示Dox-RS7的ICs。值是0.04ng/ml而2P-Dox-RS7的ICs。值是0.023jtg/ml。因此，將本發(fā)明的棵、人類、人源化或嵌合抗-EGP-l抗體或片段與特定藥物，如2P-Dox綴合可幫助克服多藥物抗性。但抗體與特定藥物聯(lián)合時(shí)，如上述，其也是可能的。RS7免疫綴合物本發(fā)明還涉及人源化，嵌合和人RS7抗體及其片段用于治療的用途。免疫治療的目的是對(duì)靶細(xì)胞遞送細(xì)胞毒性劑量的放射、毒素、細(xì)胞因子、酶、或激素或藥物，同時(shí)要將非靶位組織的暴露量最小化。本發(fā)明的RS7抗原結(jié)合蛋白可用于治療多種腫瘤，如肺，乳腺，膀胱，卵巢，子宮，胃和前列腺的胂瘤。本發(fā)明的任何抗體或抗體融合蛋白及其片段都可以和一種或多種治療劑或診斷劑綴合。通常，一種治療劑或診斷劑與每種抗體或抗體片段結(jié)合而超過一種治療劑或診斷劑可與相同的抗體或抗體片段綴合。如果Fc區(qū)不存在(例如當(dāng)用作免疫綴合物抗體成分的抗體是抗體片段時(shí))，可能會(huì)將糖部分引入全長(zhǎng)抗體或抗體片段的輕鏈可變區(qū)中。例如參見Leung等，RImmunol.154:5919(1995);Hansen等，美國(guó)專利5，443，953(1995)，Leung等，美國(guó)專利6,254,868，其均全文引入此處作為參考。工程化處理的糖部分可用于綴合治療劑或診斷劑。將肽經(jīng)由抗體糖部分而與抗體成分綴合的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如參見Shih等，Int.J.Cancer41:832(1988)jShih等，Int.J.Cancer46:1101(1990);和Shih等，美國(guó)專利5，057，313，其均全文引入此處作為參考。一般方法包括將含有氧化糖部分的抗體成分與含有至少一種游離胺官能團(tuán)的載體聚合物反應(yīng)然后加載多種肽。該反應(yīng)形成了希夫堿(亞胺)鍵，其可通過還原成仲胺形成最終的綴合物而穩(wěn)定。且，可將抗體與螯合劑如DTPA(如Mx-DTPA)、D0TA、TETA或麗A綴合。本發(fā)明的抗體融合蛋白包括兩種或多種抗體或其片段且構(gòu)成該融合蛋白的每種抗體或片段可包含治療劑或診斷劑。此外，一種或多種抗體融合蛋白的抗體或片段可含有多于一種的綴合的治療劑或診斷劑。此外，治療劑無須相同而可以是不同的治療劑，例如可將藥物和放射性同位素與相同的融合蛋白結(jié)合。特別地，IgG可以是用13'1放射性標(biāo)記的并結(jié)合至藥物。"'I可被摻至IgG的酪氨酸和與IgG賴氨酸的s氨基連接的藥物。治療劑和診斷劑均還可與還原的巰基結(jié)合和與糖側(cè)鏈結(jié)合。多種診斷和治療試劑可方便地與本發(fā)明的抗體結(jié)合。此處引用的治療劑是也可用于與上述棵抗體分開施用的那些試劑。治療劑包括，例如化學(xué)治療藥物如長(zhǎng)春花生物堿，蒽環(huán)類抗生素，表鬼臼毒素，紫杉烷類，抗代謝物，烷化劑，抗生素，Cox-2抑制劑，抗有絲分裂物，抗血管生成劑和調(diào)亡劑，特別是阿霉素，甲氨蝶呤，紫杉醇，CPT-ll，喜樹堿和來自這些及其它類抗癌藥等的其它藥物，曱肼衍生物，腎上腺皮質(zhì)抑制劑，拮抗物，內(nèi)皮生長(zhǎng)抑素，紫杉醇等。其它適用于制備免疫綴合物和抗體融合蛋白癌癥化學(xué)治療藥物包括氮芥類，氮丙啶衍生物，烷基磺酸酯類，亞硝基脲類，三氮烯類，葉酸類似物，蒽環(huán)類抗生素，紫杉烷類藥，C0X-2抑制劑，嘧啶類似物，噪呤類似物，鉑配位絡(luò)合物，激素，酪氨酸激酶抑制劑如抑制EGF-受體酪氨酸激酶，BCRABL酪氨酸激酶或VEGF-體酪氨酸激酶等的那些。適用的化學(xué)治療劑描述于REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,19THEd。(MackPublishingCo.1995)，在GOODMAN和GILMAN'STHEPHARMACOLOGICALBASISOFTHERAPEUTICS，7thEd.中(MacMillanPublishingCo.1985)中以及這些出版物的子務(wù)訂版。其它適宜的化學(xué)治療劑，如實(shí)驗(yàn)藥物，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。還可將毒素，如假單胞菌外毒素復(fù)合于或形成本發(fā)明的RS7和hRS7抗體的免疫綴合物的治療劑部分。其它適用于制備所述綴合物或其它融合蛋白的的毒素包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒素、核糖核酸酶(RNase)、DNaseI，葡萄球菌腸毒素-A，美洲商陸抗病毒蛋白、白樹毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。例如參見Pastan等CELL47:641(1986)，和Goldenberg，CA-ACancerJournalForClinicians44:43(1994)。適用于本發(fā)明的其它毒素是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并被描述于美國(guó)專利6,077,499中，所述美國(guó)專利全文引入作為參考。還可將免疫調(diào)節(jié)劑，如細(xì)胞因子結(jié)合于或形成EGP-1，RS7和hRS7免疫綴合物的治療劑部分，或不與本發(fā)明的嵌合、人源化或人RS7抗體或其片段結(jié)合而施用。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"免疫調(diào)節(jié)劑"包括細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、淋巴毒素，如腫瘤壞死因子(TNF)和造血因子，如白細(xì)胞介素(例如白細(xì)胞介素-l(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-IO、IL-12、IL-18和IL-21)，集落刺激因子(例如粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF))，干擾素(例如干擾素-a、-P和-y)，促紅細(xì)胞生成素、促血小板生成素或其組合。適宜的免疫調(diào)節(jié)劑部分的實(shí)例包括IL-2、IL-3、IL-6、IL-IO、IL-12、IL-18、IL_21，及其組合，和干擾素-y，TNF-a等?；蛘撸瑐€(gè)體可接受棵EGP-1或RS7抗體和單獨(dú)施用的細(xì)胞因子，其可在施用棵RS7抗體之前、同時(shí)或之后進(jìn)行施用。如上所述，RS7抗體還可與免疫調(diào)節(jié)劑結(jié)合。免疫調(diào)節(jié)劑還可以與含有可與不同抗原結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)抗體的雜合抗體結(jié)合。治療劑或診斷劑可通過二硫鍵的形成在還原抗體成分的鉸鏈區(qū)連接。作為一種選擇，還可利用異雙官能交聯(lián)劑，如N-琥珀酰3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)將所述肽合抗體連接。Yu等，Int.J.Cancer.，56:244(1994)。用于所述結(jié)合的一般方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如參見Wong，CHEMISTRYOFPROTEINCONJUGATIONANDCROSS-LINKING(CRCPress1991);Upeslacis等，"ModificationofAntibodiesbyChemicalMethods，"在MONOCLONALANTIBODIES:PRINCIPLESANDAPPLICATIONS,Birch等(eds.)中，187-230頁(yè)(Wiley-Liss，Inc.1995);Price,"Production和CharacterizationofSyntheticPeptide-DerivedAntibodies,M0N0C固ALANTIBODIES:PRODUCTION,ENGI羅R-INGANDCUNICALAPPLICATION中，Ritter等(eds.)中，60-84頁(yè)(CambridgeUniversityPress1995)。或者，治療劑或診斷劑可經(jīng)由抗體Fc區(qū)中的糖部分進(jìn)行結(jié)合。糖基團(tuán)可用于增加肽與巰基結(jié)合的相同肽的加載，或糖基團(tuán)可用于結(jié)合不同的肽。此外，放射性標(biāo)記的抗體，免疫綴合物，或其片段可包括用于診斷性影像學(xué)的y發(fā)射性同位素或正電子發(fā)射體。適用的放射性同位素，特別是能量為25~4，000keV，包括'311，'231，124I，86Y，"Cu，"Cu，67Ga，68Ga，"mTc，94mTc，18F，HC，13N，150,76Br等。例如參見名為"LabelingTargetingAgentswithGallium-68"發(fā)明人為G.L.Griffiths和W.J.McBride的美國(guó)專利申請(qǐng)(美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/342，104)，其公開了為了成像目的的正電子發(fā)射體，如18F，68Ga，99mTc等，所述申請(qǐng)全文引入作為參考。優(yōu)選地，診斷性和治療性放射性核素的能量為25-4，OOOkeV。其它適用的放射性核素包括9°Y，"'In，125I,3H，35S,14C，'86Re，mRe，'"Re,'"Lu，67Cu，212Bi，2l3Bi，川At，mAu，"4Ac，126I，l33I，"Br，''3mIn，95Ru，"Ru，'。3Ru，'。5RU，'。7Hg，2。3Hg，9"Tc，m，e，122mTe，，25mTe，"5Tm，"7Tm，，"Tm，lllAg，mpt，，pd，"p，33P，47Sc，'"Sm，177Lu，'。5Rh，'42Pr，"3Pr，l61Tb，166Ho，199Au，"CO，58Co，5'Cr，59Fe，58F,75Se，2"T1，225Ac，76Br，86Y，169Yb，166Dy，212Pb和223Ra。例如"Cu，由于61.5小時(shí)半衰期和豐富的p粒子和y射線的供應(yīng)而被認(rèn)為是一個(gè)更佳的用于免疫治療的放射性同位素，可用螯合劑對(duì)溴乙酰氨基-節(jié)基-四乙基胺四乙酸(TETA)而與RS7抗原結(jié)合蛋白結(jié)合。Chase,如上。或者，發(fā)射高能(3粒子的90Y可用二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)與RS7抗原結(jié)合蛋白偶聯(lián)。而且，用于直接用'3'I放射性標(biāo)記RS7Mab的方法描述于Stein等(1991)，如上，和Govindan等，WO9911294A1名為"StableRadioiodineConjugates和MethodsforTheirSynthesis,"的專利，其全文引入此處作為參考。含有用于熱中子活化治療的硼附加物-加載的載體的本發(fā)明的RS7抗體或其片段將以相似的方式受到正常的作用。然而，在實(shí)施中子輻照前等待直至為靶定的免疫綴合物清除將是有益的。使用與RS7抗體結(jié)合的抗體能夠加速清除。參見美國(guó)專利4,624,846對(duì)該一般原理的描述。例如硼附加物如碳硼烷可與RS7抗體連接。碳硼烷可利用側(cè)鏈上的羧基官能團(tuán)而制備，如本領(lǐng)域所熟知的。碳硼烷與載體，如氨基葡聚糖的連接可通過活化碳硼烷的羧基并與載體上的胺縮聚產(chǎn)生中間體綴合物而獲得。然后該中間體綴合物與RS7抗體結(jié)合。在給予RS7抗體綴合物之后，硼附加物被惹中子輻照活化而轉(zhuǎn)化放射性原子，其通過a發(fā)射而衰變從而產(chǎn)生高毒性，短程的作用。此外，本發(fā)明包括在個(gè)體中診斷癌癥的方法。可通過施用診斷上有效量的在藥學(xué)上適用的賦形劑配制的診斷綴合物，然后檢測(cè)所述標(biāo)記物實(shí)施診斷。例如放射性和非放射性試劑可用作診斷劑。適用的非放射性診斷劑是適用于磁共振成像，計(jì)算機(jī)控制斷層掃描術(shù)或超聲的造影劑。磁成像劑包括，例如非放射性金屬，如錳，鐵和釓，當(dāng)與本發(fā)明的抗體一起使用時(shí)，其與包括2-千基-DTPA及其一甲基和環(huán)己基類似物的金屬-螯合劑組合物復(fù)合。參見與2001年10月10日提交的美國(guó)序號(hào)09/921，290，其全文引入作為參考。因此，描述了在個(gè)體中診斷惡性肺瘤的方法，包括(i)用包含棵抗-EGP-lMAb或其片段或棵抗體融合蛋白或其片段的組合物對(duì)來自個(gè)體的樣品實(shí)施體外診斷。例如RT-PCR和免疫檢測(cè)體外診斷方法可作為有用的診斷/檢測(cè)方法用于檢測(cè)組織，血液和其它體液中EGP-1瞬間量的存在。免疫組織化學(xué)可用于檢測(cè)細(xì)胞或組織中EGP-1的存在。優(yōu)選地，進(jìn)行診斷的惡性腫瘤是癌癥。最優(yōu)選地，癌癥選自肺癌、前列腺癌、卵巢癌、乳癌、結(jié)腸癌和膀胱癌。此外，可檢測(cè)的標(biāo)記，如熒光分子、或細(xì)胞毒害劑，如重金屬或放射性核素可結(jié)合于螯合劑如DTPA、D0TA、TETA或N0TA或適用的肽。例如治療有效的免疫綴合物可通過使光活化劑或染料與抗體融合蛋白結(jié)合而得到。熒光組合物，如焚光染料，和其它色原，或染料，如對(duì)可見光敏感的外啉已經(jīng)通過將適宜的光對(duì)準(zhǔn)損害處而用于檢測(cè)和治療損害。在治療中，其被稱為光輻射，光照療法或光動(dòng)力療法(Jori等(eds.)，PH0T0DYNAMICTHERAPYOFT腦RSANDOTHERDISEASES(LibreriaProgetto1985);vandenBergh，Chem.Britain22:430(1986))。此外，單克隆抗體還可與光活化的染料偶聯(lián)以實(shí)施光治療。Mew等，J.Immunol.130:1473(1983);idem.,CancerRes.45:4380(1985);Oseroff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:8744(1986);idem.，Photochem.Photobiol.46:83(1987);Hasan等，Prog.Clin.Biolres.288:471(1989);Tatsuta等，LasersSurg.Med.9:422(1989);Pelegrin等，Cancer67:2529(1991)。然而，這些早期的研究未包括內(nèi)窺鏡療法的使用，特別是抗體片段或亞片段的使用。因此，本發(fā)明涉及含光活化劑或染料的免疫綴合物的治療用途。本發(fā)明還預(yù)期了造影劑如MRI造影劑，順磁來自和超聲增強(qiáng)劑。例如釓離子、鑭離子、錳離子或其它可比的標(biāo)記物，CT造影劑，和超聲造影劑適用于本發(fā)明。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，超聲增強(qiáng)劑是包括人源化RS7IgG或其片段的脂質(zhì)體。同樣優(yōu)選地，脂質(zhì)體被氣體填充。為了治療的目的，將本發(fā)明的RS7抗體及其片段以治療有效量施用于病人。如果所施用的量具有生理學(xué)上的顯著意義，則抗體被稱為以"治療有效量，，進(jìn)行施用。如果一種藥劑的存在導(dǎo)致受體哺乳動(dòng)物生理學(xué)上可檢測(cè)的變化，則該藥劑具有生理學(xué)上的顯著意義。體外診斷本發(fā)明涉及RS7抗體，包括RS7和hRS7抗體及其片段，用于體外檢測(cè)生物樣品的RS7抗原存在的用途。在所述免疫測(cè)定中，RS7抗體可用在液相中或與固相載體結(jié)合，如下述。同樣，參見Stein等(1993)，如上，和Stein等，CancerRes.49:32(1989)，期全文引入作為參考。測(cè)定生物樣品釋放包含RS7抗原的檢測(cè)方法的一個(gè)實(shí)例是放射免疫測(cè)定(RIA)。例如在RIA的一個(gè)形式中，將測(cè)試物在存在放射性標(biāo)記的RS7抗原的情況下與RS7抗原混合。在該方法中，測(cè)試物濃度將與結(jié)合Mab的標(biāo)記的RS7抗原的量成反比并直接相關(guān)于游離標(biāo)記的RS7抗原的量。其它適用的檢測(cè)方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。或者，可實(shí)施包含與固相載體結(jié)合的RS7抗原結(jié)合蛋白的體外測(cè)定。例如可將Mab連接于聚合物，如氨基葡聚糖，以便將Mab連至不溶性支持物如多聚物包被的珠、平板或管。其它適用的體外測(cè)定法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。可檢測(cè)地標(biāo)記的RS7抗原結(jié)合蛋白和RS7抗原的具體濃度，孵育溫度和時(shí)間，已經(jīng)其它測(cè)定條件可根據(jù)包含樣品中的RS7抗原濃度，樣品的性質(zhì)等的多種因素而改變。RS7抗原結(jié)合蛋白樣品的結(jié)合活性可根據(jù)熟知的方法進(jìn)行測(cè)定。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)將能確定用于每一測(cè)定的操作性和最佳的條件。根據(jù)習(xí)慣或特定環(huán)境需要，可將其它如洗滌，攪拌，震蕩，過濾等的步驟加入測(cè)定法?？墒褂妹嘎?lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)定生物樣品中RS7抗原的存在。在直接竟?fàn)幮訣LISA中，將純的或半純的抗原制劑結(jié)合于在液體或欲檢測(cè)的細(xì)胞提取物中不溶解的固體支持物然后加入一定量的可檢測(cè):^也標(biāo)i己的可溶性抗體以4更檢測(cè)和/或定量固相抗原和標(biāo)i己的抗體間形成的二元復(fù)合物。相反地，"雙決定子"ELISA，還已知為"兩位點(diǎn)ELISA"或"三明治測(cè)定法"，需要少量抗原且該測(cè)定法不需要抗原的大量純化。因此，用于檢測(cè)臨床樣品中抗原的直接竟?fàn)幮訣LISA優(yōu)選雙決定子ELISA。例如參見"theuseofthedouble-determinantELISAforquantitationoftheC-MYConcoproteninbiopsyspecimens"，F(xiàn)ield等，Oncogene4._1463(1989);Spandidos等，AnticancerRes.9。821(1989)。在雙決定子ELISA中，將一定量的未標(biāo)記的MAb或抗體片段("俘獲抗體")結(jié)合于固體支持物，將測(cè)試樣品與俘獲抗體接觸，然后加入一定量的可檢測(cè)地標(biāo)記的可溶性抗體(抗體片段)以便檢測(cè)和/或定量抗體，抗原，和標(biāo)記的抗體之間形成的三元復(fù)合物。抗體片段是抗體的部分如F()2，F(xiàn)(ab)2，F(xiàn)ab'，F(xiàn)ab等。在本文中，抗體片段是與RS7抗原的表位結(jié)合的RS7Mab的部分。術(shù)語(yǔ)"抗體片段"還包括任何合成的或遺傳工程化處理的通過與特定抗原結(jié)合形成復(fù)合物而以類似抗體的方式發(fā)揮作用的蛋白。例如抗體片段包括包含輕鏈可變區(qū)，含有重或輕鏈的可變區(qū)的"Fv"片段，和重組單鏈多肽分子，其中輕鏈和重鏈可變區(qū)經(jīng)由肽連接子相連，的分離的片段?？贵w融合蛋白是包含至少兩種基本上單特異性抗體或抗體片段的多特異性抗體組合物，其中至少兩種抗體或抗體片段與RS7抗原不同的表位結(jié)合。RS7融合蛋白還包括抗體融合蛋白與診斷劑或治療劑的綴合物。術(shù)語(yǔ)RS7抗體包括人源化，嵌合，人和鼠抗體，其抗體片段，免疫綴合物及其片段和抗體融合蛋白及其片段。實(shí)施雙決定子ELISA的方法是熟知的。例如參見Field等，如上，Spandidos等，如上，和Moore等，"Twin-SiteELISAsforfosandmycOncoproteinsUsingtheAMPAKSystem",METHOSINMOLECULARBIOLOGY,Vol.10，273-281頁(yè)(TheHumanaPress,Inc.1992)。例如在一種使用雙決定子ELISA檢測(cè)RS7抗原的方法中，就來自活組織樣品的細(xì)組織糜凍干然后在含有l(wèi)%nonidet-p40(NP40),0.6nl/ml抑酞酶，0.2mM苯基曱基磺酰氟，0.lfig/ml亮肽酶素和1mMEDTA的裂解緩沖液(100mMNaCl，50mMTris-HCl，pH7.4)中以10~20mg組織(濕干)/500nl溶液的濃度重懸。懸液于冰上孵育60分鐘，然后對(duì)其進(jìn)行約6次10-秒間隔的聲波處理。通過離心除去不溶性物質(zhì)。就可溶性提取物加入微量滴定板的含有吸收的RS7抗原Mab作為俘獲抗體的孔中。然后通過已經(jīng)與堿性磷酸酶偶聯(lián)的第二RS7抗原MAb識(shí)別俘獲的RS7抗原。結(jié)合的堿性磷酸酶的量，與提取物中RS7抗原的比例，可采用顯色底物如對(duì)硝基苯基磷酸酯以顏色計(jì)量的方法進(jìn)4亍檢測(cè)?；蛘?，可采用辣根過氧化物酶實(shí)施用于RS7抗原的雙決定子ELISA。樣品制備和雙決定子ELISA的其它變化可由本領(lǐng)域^支術(shù)人員根據(jù)例行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。在雙決定子ELISA中，可溶性抗體或抗體片段必須與和被俘獲抗體識(shí)別的表位不同的RS7表位結(jié)合。例如可溶性抗體可以是RS7MAb，而俘獲抗體可以是MR23。或者，可溶性抗體可以是MR23，而俘獲抗體可以是RS7MAb?？蓪?shí)施雙決定子ELISA以^更確定RS7抗原是否存在于活組織樣品中。或者，可實(shí)施該分析以便定量存在于體液的臨床樣品中的RS7抗原的量。可通過包括稀釋純化的RS7抗原而實(shí)施定量分析。下面描述了純化RS7抗原的方法。本發(fā)明的RS7MAb及其片段還適用于檢測(cè)試劑盒的制劑。所述試劑盒可包含被區(qū)分為緊密接受的一個(gè)或多個(gè)容器工具如瓶，管等的載體，每個(gè)所述容器工具包含免疫測(cè)定的各元件。例如可有一個(gè)含有固定在固相支持物上的俘獲抗體的容器工具，和另一個(gè)含有溶液中可檢測(cè)地標(biāo)記的抗體的容器工具。另一個(gè)容器工具可包括含有系列稀釋RS7抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液。RS7抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液可用于產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中RS7抗原的濃度標(biāo)繪于橫坐標(biāo)而和檢測(cè)信號(hào)位于縱坐標(biāo)。從含有RS7抗原的樣品獲得的結(jié)果可以從所述曲線中以內(nèi)插值替換從而給出生物樣品中RS7抗原的濃度。本發(fā)明的RS7抗體及其片段還可用于檢測(cè)從免疫組織化學(xué)樣品制備的切片中RS7抗原的存在。所述原位檢測(cè)可用于確定RS7抗原的存在和用于確定RS7抗原在受試組織中的分布。原位檢測(cè)可通過將可檢測(cè)地-標(biāo)記的RS7抗原結(jié)合蛋白用于對(duì)冷凍樣品切片的而實(shí)施。研究顯示RS7抗原不能在石蠟包埋的切片中保存。Stein等(1993)，如上。原位檢測(cè)的一般技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如參見Ponder，"CellMarkingTechniquesandTheirApplication",MAMMALIANDEVELOPMENT:APRACTICALAPPROACH中113-38Monk(ed.)(IRLPress1987)，和Coligan5.8.1-5.8.8頁(yè)。還可參見Stein等(1989)，如上，和Stein等(1993)，如上。RS7抗體及其片段可用任何適宜的檢測(cè)劑例如放射性同位素，酶，焚光標(biāo)記，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，生物發(fā)光標(biāo)記和順磁標(biāo)記進(jìn)行可檢測(cè)地標(biāo)記。制備和檢測(cè)所述可檢測(cè)地-標(biāo)記的RS7抗原結(jié)合蛋白的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并在下面給出更詳細(xì)的描述。標(biāo)記物部分可以是通過使用y計(jì)數(shù)器或閃爍計(jì)數(shù)器或放射自顯影的方式而檢測(cè)的放射性同位素。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，診斷綴合物是Y發(fā)射性、P發(fā)射性或正電子發(fā)射性同位素。本說明書中的標(biāo)記物部分涉及在預(yù)先確定的條件下將產(chǎn)生信號(hào)的分子。標(biāo)記物部分的實(shí)例包括放射性同位素，酶，熒光標(biāo)記，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，生物發(fā)光標(biāo)記和順磁標(biāo)記。如本說明書所使用的，診斷劑或治療劑與抗體結(jié)合從而產(chǎn)生能用于診斷和治療的綴合物的分子和原子。診斷劑或治療劑的實(shí)例包括藥物，毒素，螯合劑，染料，發(fā)色團(tuán)，硼化合物和標(biāo)記物部分。特別適用于本發(fā)明目的的同位素是311，131I，31S，14C，和優(yōu)選的1251。其它放射性核素的實(shí)例是，例如"Y，mInN，99mTc，186Re,188Re，'"Lu，67Cu，2'2Bi，213Bi，和"lt。其它放射性核素也可用作診斷劑和治療劑。適用的診斷性成〗象的同位素通常為25~4，000keV，而適用的治療性放射性核素通常為60-700keV。本發(fā)明的RS7抗體及其片段還可用熒光化合物進(jìn)行標(biāo)記。通過將RS7抗原結(jié)合蛋白暴露于適宜波長(zhǎng)的光下和檢測(cè)生產(chǎn)的熒光來確定焚光標(biāo)記的Mab的存在。萸光標(biāo)記化合物包括異硫氰酸熒光素，羅丹明，藻紅蛋白，藻藍(lán)蛋白，別藻藍(lán)蛋白，鄰苯二曱醛和熒胺。熒光標(biāo)記的RS7抗原結(jié)合蛋白特別適用于流式細(xì)胞術(shù)?；蛘?，將RS7抗原結(jié)合蛋白與化學(xué)發(fā)光化合物偶聯(lián)而就RS7抗體及其片段進(jìn)行可檢測(cè)的標(biāo)記。通過檢測(cè)在化學(xué)反應(yīng)中產(chǎn)生的發(fā)光來確定化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的Mab的存在。化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的實(shí)例包括魯米諾，異氨基苯二酰肼，芳香族吖啶酯，咪唑，吖啶酯鹽和草酸酯。相似地，生物發(fā)光化合物可用于標(biāo)記本發(fā)明的RS7抗體及其片段。生物發(fā)光是一類在生物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的生物發(fā)光物，其中催化蛋白增加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效能。通過檢測(cè)發(fā)光來確定生物發(fā)光蛋白的存在。用于標(biāo)記的生物發(fā)光化合物包括螢光素，螢光素酶和水母素?；蛘撸琑S7抗體及其片段通過將RS7抗體與酶連接而被可檢測(cè)的標(biāo)記。當(dāng)RS7抗體-酶綴合物在存在適宜底物的情況下孵育時(shí)，酶部分與地物反應(yīng)從而產(chǎn)生可被檢測(cè)的化學(xué)部分，例如被光鐠光度測(cè)量、熒光計(jì)或視覺工具檢測(cè)。可用于可檢測(cè)地標(biāo)記RS7抗體的酶的實(shí)例包括蘋果酸脫氫酶，葡萄球菌核酸酶，5-V-類固醇異構(gòu)酶，酵母乙醇脫氫酶，a-磷酸甘油脫氫酶，磷酸丙糖異構(gòu)酶，辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，門冬酰胺酶，葡萄糖氧化酶，p-半乳糖苷酶，核糖核酸酶，脲酶，過氧化氫酶，6-磷酸葡萄糖脫氫酶，葡萄糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。RS7抗體，融合蛋白，及其片段還可用順磁性離子標(biāo)記為了體內(nèi)診斷的目的。特別適用于磁共振成像的造影劑包括Gd、Mn、Dy或Fe離子。RS7抗體及其片段還可與超聲造影劑/增強(qiáng)劑結(jié)合。例如超聲造影劑是包含人源化RS7IgG或其片段的脂質(zhì)體。更優(yōu)選地，超聲造影劑是被氣體填充的脂質(zhì)體。在相關(guān)靜脈中，雙特異性抗體可與造影劑綴合。例如雙特異性抗體可包括多于一種用于超聲成像的影像-增強(qiáng)劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，造影劑是脂質(zhì)體。優(yōu)選地，脂質(zhì)體包括與脂質(zhì)體外層面共價(jià)結(jié)合的二價(jià)DTPA-肽。更優(yōu)選地，脂質(zhì)體被氣體填充。本領(lǐng)域技術(shù)人員將可知曉其它可根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的適用的標(biāo)記。記物部分與RS7抗體的結(jié)合可采用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)施。與其有關(guān)的典型方法描述于Kennedy等，CIin.Chim.Acta70:1(1976),Schurs等，Clin.Chim.Acta81:1(1977),Shih等，Int'1J.Cancer46:1101(1990)，Stein等(1990)，如上，和Stein等(1993)，如上。同樣，一般參見，Coligan。上述體外和原位檢測(cè)方法可用于輔助病理裝體的診斷和分期。例如所述方法可用于檢測(cè)表達(dá)RS7抗原的肺瘤，包括肺，乳腺，膀胱，卵巢，子宮，胃和前列腺的腫瘤。體內(nèi)診斷本發(fā)明還預(yù)期了RS7抗體在體內(nèi)診斷中的用途。使用放射性標(biāo)記的Mab的診斷性成像的方法是眾所周知的。在免疫閃爍成像術(shù)中，例如用y發(fā)射性同位素標(biāo)記抗體并導(dǎo)入患者。使用y照相機(jī)檢測(cè)y放射性同位素的定位和分布。例如參見Srivastava(ed.)，RADIOLABELED誦OC固ALANTIBODIESFORIMAGINGANDTHERAPY(PlenumPress1988)，Chase,"MedicalApplicationsofAadioisotopes"，在REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,18THEdition,Ge纖ro等(eds.)中，624-652頁(yè)(MackPublishingCo.，1990)，和Brown，"ClinicalUseofM議oclonalAntibodies",BIOTECHNOLOGY和PHARMACY227-49，Pezzuto等(eds.)(Chapman&Hall1993)。為了診斷性成像，放射性同位素可與RS7抗體或直接地，或使用媒介官能團(tuán)間接地結(jié)合。適用的媒介官能團(tuán)包括螯合劑如乙二胺四醋酸和二亞乙基三胺五乙酸。例如參見Shih等，如上，和美國(guó)專利5,057，313。經(jīng)由選擇最小半衰期，體內(nèi)的最少保留和能允許檢測(cè)和準(zhǔn)確測(cè)定的同位素的最低量最佳組合的同位素而將遞送給患者的輻射劑量保持盡可能低的水平。放射性同位素可與RS7抗體結(jié)合并適宜于診斷成像的實(shí)例包括^TC和"'In。藥學(xué)上適用的賦形劑可使用額外的藥學(xué)方法控制RS7抗體在治療應(yīng)用中的作用時(shí)間。通過使用聚合物來復(fù)合或吸收RS7抗體可制成控釋劑。例如生物相容性聚合物包括聚(乙烯-共聚-乙酸乙烯酯)基質(zhì)和硬脂酸二聚物和癸二酸的聚酐共聚物基質(zhì)。Sherwood等，Bio/Technology10:1446(1992)。Sherwood等，BiolTechnology10:1446(1992)。RS7抗體從所述基質(zhì)中釋放的速率取決于RS7抗體的分子量、基質(zhì)內(nèi)RS7抗體的量和分散的顆粒的大小。Saltzman等，Biophys.J.55:163(1989);Sherwood等，如上。其它固體劑型描述于REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,18THed.(1990)中。將被遞送給個(gè)體的人源化，嵌合和人RS7抗體可僅包含mAb，免疫綴合物，抗體融合蛋白或可包含一種或多種藥學(xué)上適用的賦形劑，一種或多種附加成分，或這些的某些組合。本發(fā)明的免疫綴合物、棵抗體、融合蛋白及其片段可按已知方法配方制成藥學(xué)上有用的組合物，由此免疫綴合物或棵抗體和藥學(xué)上適用的賦形劑在混合物中組合。磷酸鹽緩沖無菌鹽水是藥學(xué)上適用的賦形劑的一個(gè)實(shí)例。其它適用的賦形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。例如參見Ansel等PHARMACEUTICALDOSAGEFORMS和藥物DELIVERYSYSTEMS,5THEditionUea&Febiger1990)，和GENNAR0(ed.)，REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,18THEdition(MackPublishingCompany1990)和其修訂版。本發(fā)明的免疫綴合物或棵抗體可被配制成借助，例如彈丸注射或連續(xù)輸注的靜脈內(nèi)給藥。用于注射的配方可以是單位劑型，例如安瓿中或多劑量容器中，和附加的保存劑。組合物可采用所述劑型如在油性或水性在中的懸液，溶液或乳液，并可包含配方劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，使用前，活性成分可以是在用于與適宜的載體，例如無熱原滅菌水組成的粉劑形式?？墒褂妙~外的藥學(xué)方法控制治療性或診斷性綴合物或棵抗體的作用時(shí)間。通過使用聚合物來復(fù)合或吸收免疫綴合物或棵抗體可制成控釋劑。例如生物相容性聚合物包括聚(乙烯-共聚-乙酸乙烯酯)基質(zhì)和硬脂酸二聚物和癸二酸的聚酐共聚物基質(zhì)。Sherwood等，Bio/Technology10:1446(1992)。免疫綴合物或抗體從所述基質(zhì)中釋放的速率取決于免疫綴合物或抗體的分子量、基質(zhì)內(nèi)免疫綴合物，抗體的量和分散的顆粒的大小。Saltzman等，Biophys.J.55:163(1989);Sherwood等，如上。其它固體劑型描述于Ansel等，PHARMACEUTICALDOSAGEFORMSAND藥物DELIVERYSYSTEMS,5THEdition(Lea&Febiger1990)和Ge纖ro(ed.),REMINGT0『SPHARMACEUTICALSCIENCES,18THEdition(MackPublishingCompany1990)和其修訂版中。免疫綴合物，抗體融合蛋白，棵抗體及其片段還可采取皮下或甚至是其它胃腸外途徑而施用于哺乳動(dòng)物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將抗-EGP-l抗體或其片段以10-2000毫克蛋白/每劑的劑量進(jìn)行施用。而且，可采取連續(xù)輸注，或單次或多次快速濃注進(jìn)行施用。通常，免疫綴合物，融合蛋白或棵抗體對(duì)人的施用劑量根據(jù)諸如患者年齡、體重、身高、性別、一般醫(yī)學(xué)狀況和既往醫(yī)學(xué)史等因素而改變。典型地，合乎需要的是將免疫綴合物，抗體融合蛋白或棵抗體以劑量約1mg/kg-20mg/kg，單次靜脈內(nèi)輸注提供給受者，但也可以根據(jù)環(huán)境需要施用較低或較高的劑量。該劑量可按需重復(fù)施用，例如一周一次持續(xù)4~10周，優(yōu)選一周一次持續(xù)8周，更優(yōu)選地，一周一次持續(xù)4周。其還可以以較低頻率給予，如隔周一次持續(xù)數(shù)月。劑量可用多種胃腸外途徑給予，可對(duì)劑量和方案進(jìn)行適宜的調(diào)整。本發(fā)明的RS7抗體可按已知方法配制成藥學(xué)上有用的組合物，由此RS7抗體和藥學(xué)上適用的賦形劑在混合物中組合。如果組合物的施用可被接受治療的患者耐受，則這種組合就被稱為"藥學(xué)上可用的載體，，。無菌磷酸鹽-緩沖鹽水是藥學(xué)上適用的賦形劑的一個(gè)實(shí)例。其它適用的賦形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。例如參見REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,18THEd.(1990)。為了治療的目的，將免疫綴合物、融合蛋白或棵抗體以治療有效量施用于哺乳動(dòng)物。本發(fā)明所針對(duì)的適宜個(gè)體一般是人類，但非人類的動(dòng)物個(gè)體也是可預(yù)期的。如果所施用的量是生理學(xué)上顯著的，則抗體制劑被稱為以"治療有效量，，進(jìn)行施用。如果一種藥劑的存在導(dǎo)致受體哺乳動(dòng)物生理學(xué)上可檢測(cè)的變化，則該藥劑就是生理學(xué)上的顯著的。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，可對(duì)本發(fā)明的組合物和方法作出多種修飾和改變是顯而易見的。因此，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明涵蓋了所述修飾和改變，只要其落在所附權(quán)利要求和其等效形式的范圍之內(nèi)。上面所引用的所有出版物，專利和專利申請(qǐng)均以其全部引入此處作為參考，其全文引入的程度與若將其單獨(dú)引入作為參考時(shí)的程度相同。下述實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明實(shí)施方案的說明，而并非在任何形式上用于限制權(quán)利要求的范圍。實(shí)施例1.構(gòu)建嵌合RS7抗體RS7Vk和VH基因的分子克隆從產(chǎn)生RS7的雜交瘤細(xì)胞中制備總細(xì)胞質(zhì)RNA和mRNA。采用RT-PCR和5'RACE克隆編碼Vic和VH序列的基因然后用DNA測(cè)序法確定序列。對(duì)多個(gè)克隆測(cè)序以消除由PCR反應(yīng)導(dǎo)致的可能誤差。序列分析顯示存在兩個(gè)Vk(#1和#23)和一個(gè)VH(RS7VH)轉(zhuǎn)錄物。聯(lián)合各潛在鼠VK與VH，生成兩個(gè)含有人恒定區(qū)的嵌合Ab(cAb)，然后通過轉(zhuǎn)染將其在Sp2/0細(xì)胞中表達(dá)。通過用ELISA篩選轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液從而鑒定產(chǎn)生cAb的克隆。擴(kuò)大陽(yáng)性克隆然后從細(xì)胞培養(yǎng)物上清中純化cAb。Ag-結(jié)合測(cè)定顯示cAb由Vk#23和VH組成，cAb-vk井23結(jié)合在用ME180，人頸癌細(xì)胞(ATCC，Rockville，MD)的粗制膜部分包#_的微孔上(圖1)。cAb聯(lián)合Vk#1和VH,cAb-Vk#1未顯示出與Ag-包被的孔結(jié)合。因此，將免疫反應(yīng)的cAb(含有Vk23)命名為cRS7。將作為PCR產(chǎn)物的克隆的鼠VH和功能性Vk(#23)序列產(chǎn)物分別命名為RS7Vk(圖2A)和RS7VH(圖2B)。RS7Ab結(jié)合活性檢測(cè)將竟?fàn)幮訣LISA結(jié)合測(cè)定用于評(píng)價(jià)工程化處理的cRS7的結(jié)合親和力。簡(jiǎn)言之，將恒量的生物素化鼠RS7與變化濃度(0.01~10(Hig/ml)的檢測(cè)Ab(RS7或cRS7)混合，然后加至Ag-包被的微孔，然后在室溫下孵育l小時(shí)。洗滌后，加入HRP綴合的鏈霉抗生物素蛋白然后然后在室溫下孵育1小時(shí)。在加入含有4mM鄰苯二胺二鹽酸鹽和0.04%H2(L的底物溶液后通過讀取OD"。而顯示出HRP-綴合的鏈霉抗生物素蛋白與Ag-結(jié)合的生物素化RS7結(jié)合的量。通過該類竟?fàn)幮訟g-結(jié)合檢測(cè)，顯示出cRS7和鼠RS7對(duì)生物素化鼠RS7與抗原包被孔的結(jié)合的竟?fàn)幫耆嗤?，因此證實(shí)了所獲得的Vk和VH序列的可靠性(圖.l)。實(shí)施例2.hRS7抗體的構(gòu)建方法hRS7V基因的序列設(shè)計(jì)通過研究Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)中人VK和VH序列，發(fā)現(xiàn)RS7Vk和VH的FRs分別表現(xiàn)出與人SA-lA'clVk和RF-TS3VH高度的序列同一性。一個(gè)例外是RS7VH的FR4，其顯示出與NEWMVH最高的同一性。因此將人SA-lA'cl框架序列用作移植RS7Vk的CDR的支架(圖3A)，并將RF-TS3和NEWM框架序列聯(lián)合用于RS7Vh(圖4)。當(dāng)與起始人抗體框架比較時(shí)，在每個(gè)鏈CDR區(qū)外都存在大量的氨基酸改變。鼠FR中側(cè)接潛在CDR的某些氨基酸殘基保留在基于由Qu,Z.，Losman，M.J.，Eliassen，K.C.，Hansen,H.J.，Goldenberg，D.M.，和Leung，S.0.(1999)Humanzizationofmmu31，alpha-fetoprotein-specificantibody。Clin.CancerRes.5，3095s-3100s在先建立的指導(dǎo)而重建的hRS7Fv中。這些殘基是S20,D60，V85，和RS7Vk和K38的AIOO，RS7VH的K46，A78和F91(圖3A和3B)。hRS7V序列的構(gòu)建Leung等Leung，S.0.，Shevitz，J.，Pellegrini,M.C.，Dion,A.S.，Shih，L.B.，Goldenberg，D.M.，和Hansen,H.J.(1994)Chimerizationof1X2arapidlyinternalizingantibodyspecificforBcelllymphoma.Hybridoma，13:469-476)公開了一種修飾策略，采用如圖4所示的長(zhǎng)寡核苷酸合成和PCR，將該策略用于構(gòu)建為hRS7所-沒計(jì)的VL和VH基因。為了構(gòu)建hRS7VH區(qū)，兩個(gè)長(zhǎng)寡核苦酸，hRS7VHA(176-MER)和hRS7濯(168-MER)在自動(dòng)化DNA合成儀(AppliedBiosystem)上合成。hRS7VHA代表hRS7VH區(qū)的23~198nt5,-GGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACAAACTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCCCCTGGACAAGGGCTTAAATGGATGGGCTGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATATACTGATGACTTCAAGGGA-3，hRS7VHB代表與174~340nt互補(bǔ)的hRS7VH區(qū)的負(fù)鏈。5'-ACCCTTGGCCCCAGACATCGAAGTACCAGTAGCTACTACCGAACCCCCCTCTTGCACAGAAATACACGGCAGTGTCGTCAGCCTTTAGGCTGCTGATCTGGAGATATGCCGTGCTGACAGAGGTGTCCAAGGAGAAGGCAAACCGTCCCTTGAAGTCATCAGTATATG-3'hRS7VHA和B的3，末端序列(23nt殘基)彼此互補(bǔ)。在所述PCR條件下，hRS7VHA和B3'-末端退火而形成由長(zhǎng)寡核苷酸的剩余部分所側(cè)接的短雙鏈DM。每個(gè)退火的末端均作為單鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物，結(jié)果得到包含hRS7VH的23~340nt的雙鏈DNA。該DNA在存在兩個(gè)短寡核苷酸，hRS7VHBACK和hRS7VHF0R下進(jìn)一步擴(kuò)增以形成全長(zhǎng)hRS7VH。hRS7VHBACK5，-GTGGTGCTGCAGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCC-3，hRS7VHF0R5，-TGAGGAGACGGTGACCAGGGACCCTTGGCCCCAGACAT-3，以10nl10xPCR緩沖液(500mMKC1，100mMTris.HCL緩沖液，pH8.3，15mMMgCL)，2,1hLLl濯ACK和hLLlVHFOR,和2.5單位TaqDNA聚合酶(PerkinElmerCetus，Norwalk，Ct)擴(kuò)增hRS7VHA和B的最小量(經(jīng)驗(yàn)確定的)。將該反應(yīng)混合物進(jìn)行3個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)94。C變性l分鐘，45X:退火l分鐘，和72X:聚合1.5分鐘，然后進(jìn)行27個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)94X:變性l分鐘，55'C退火1分鐘，和72"C聚合1分鐘。凝膠純化hRS7VH的雙鏈PCR-擴(kuò)增的產(chǎn)物，用Pstl和BstEII限制性酶切然后克隆至重鏈staging載體，VHpBS2的互補(bǔ)Pstl/BstEI1位點(diǎn)。為構(gòu)建人源化VK序列的全長(zhǎng)DNA，如上述合成hRS7VKA(156-mer)和hRS7VKB(155-mer)。通過上述短寡核苦酸hRS7VKBACK和hRS7VKF0R擴(kuò)增hRS7VKA和B。hRS7VKA代表證S7Vk區(qū)的20-175nt。5，-CTCCATCCTCCCTCTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGAGTATTGCTGTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACTCGGCATCCTACCGGTACACTGGAGTCC-3,hRS7VKB代表與155-320nt互補(bǔ)的hRS7VK區(qū)的負(fù)鏈。5，-CCTTGGTCCCAGCACCGAACGTGAGCGGAGTAATATAATGTTGCTGACAGTAATAAACTGCAAAATCTTCAGGTTGCAGACTGCTGATGGTGAGAGTGAAATCTGTCCCAGATCCACTGCCACTGAACCTATCAGGGACTCCAGTGTACCGGTAG-3'hRS7VKBACK5，-GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTG-3，hRS7VKFOR5，-ACGTTAGATCTCCACCTTGGTCCCAGCACCG-3'凝膠純化hRS7VK的雙鏈PCR-擴(kuò)增的產(chǎn)物，用PvuII和BGLIII限制性酶切然后克隆至輕鏈staging載體，VKpBR2的PvuI/BcII的互才卜位,泉。通過將HRS7Vk和VH的XBAI-BAMHI和XhoI/BamHI片段分另'J次序亞克隆至pdHL2如上述而構(gòu)建最終的表達(dá)載體。hRS7抗體的轉(zhuǎn)染和表達(dá)將約30pg的用于hRS7的表達(dá)載體通過Sail酶切消化而線性化然后用電穿孔(450V和25PF)轉(zhuǎn)染至SP2/0-AGL4細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞鋪于96-孔板2日然后通過加入MTX至終濃度為0.025jiM而選擇藥物抗性。MTX-抗性集落在2-3周內(nèi)出現(xiàn)于孔中。用ELISA測(cè)試法檢測(cè)來自存活于用于篩選人Ab分泌的選擇的克隆的上清。簡(jiǎn)言之，將100nl上清樣品加入用GAH-IgG，F(xiàn)(ab')2片段-特異性Ab預(yù)包被的ELISA微量滴定板上，然后孵育l小時(shí)。用洗滌緩沖液(含O.05%聚山梨醇酯20的PBS)洗板三次以除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。將HRP-結(jié)合的GAH-IgG，F(xiàn)c片段-特異性Ab加入孔。在孵育1h后，洗滌平板。在加入含有4mM0PD和0.04%H202的底物溶液后通過讀取A憎而顯示結(jié)合HRP-結(jié)合。擴(kuò)展陽(yáng)性細(xì)胞克隆然后通過A蛋白柱親和層析從細(xì)胞培養(yǎng)物上清中純化hRS7IgG。人源化RS7抗體的結(jié)合活性使用ME180細(xì)胞膜提取物包被平板將ELISA竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定用于評(píng)價(jià)hRS7的免疫反應(yīng)性如所述(Stein等，Int.J.Cancer55:938-946(1993))。ME180細(xì)胞膜部分通過聲裂法和離心制備。通過離心用粗制膜提取物包被96孔平底PVC板然后用0.1%戊二醛固定。將恒量的生物素化鼠RS7與變化濃度的mRS7，cRS7或hRS7混合，然后加至包被的微孔，然后在室溫下孵育l小時(shí)。洗滌后，加入HRP-綴合的鏈霉抗生物素蛋白，然后在室溫下孵育l小時(shí)。在加入含有4mM鄰苯二胺二鹽酸鹽和0.04%H202的底物溶液后通過讀取A"。而顯示與膜結(jié)合的生物素化mRS7結(jié)合的HRP-綴合的鏈霉抗生物素蛋白的量。如圖6中的竟?fàn)幮苑治鏊?，hRS7IgG表現(xiàn)出與mRS7和cRS7相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合活性，證實(shí)了RS7的結(jié)合親和力在人源化中得以保存。實(shí)施例3.使用殘留性標(biāo)記物的人源化RS7的放射性碘標(biāo)記殘留性部分(IMP-R4，IMP-R5或IMP-R8)進(jìn)4亍放射性碘標(biāo)記，并與二硫化物還原的hRS7按別處所述方法偶聯(lián)(GovindanSV，等.BioconjugateChem.1999;10:231-240)。參見圖9。在殘留性放射性硪標(biāo)記中，使用1251，制備'"I-IMP-Rx-hRS7其中x=4，5或8)，分別使用IMP-R4，IMP-R5和IMP-R8獲得總產(chǎn)率和比活性(括弧內(nèi))的87.1%(3.38mCi/mg)，34.3%(0.97mCi/mg)，和76.6%(2.93mCi/mg)。在大規(guī)模1311標(biāo)記中，使用13'1-IMP-R4體，獲得下述結(jié)果。使用20.4mCi'3'1，35.7mnolIMP-R4和3.22mgDTT-還原的RS7，獲得60°/?？偖a(chǎn)率(3.80mCi/mg)。使用30.3mCi1311，IMP-R4和還原的hRS7另一操作得到69.7%產(chǎn)率(3.88mCi/mg)。13.97mCi'311的第三次操作得到71.8%摻合度(4.42mCi/mg)。用13.6mCi'3'1和非特異性人源化抗體，hLL2標(biāo)記的'3'I-IMP-R4得到64.4%產(chǎn)率(3.67mCi/mg)。實(shí)施例4.乳癌動(dòng)物模型中的臨床前實(shí)驗(yàn)為了腫瘤靶向?qū)嶒?yàn)，通過皮下注射約2.3xl(T個(gè)培養(yǎng)的MDA-MB-468細(xì)胞在5~8周齡雌性棵鼠中繁殖腫瘤，在1個(gè)月后，當(dāng)腫瘤大小達(dá)到~0.1至~0.2cm3時(shí)使用動(dòng)物。對(duì)小鼠靜脈注射-10fiCi1251-[IMP-Rx]-hRS7其中x=4、5或8,和20-25jiCi1311-Mab(CT法)。因此，每個(gè)實(shí)驗(yàn)都是用1251廣'I配對(duì)標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)。在所示時(shí)間，測(cè)定多種器官和血液中的生物分布，然后表示為。/。注射劑量/g。在確定'251生物分布時(shí)，校正'"I反散射入'"I窗的量。為治療研究，研究多種形式下的腫瘤生長(zhǎng)模式以便確定用于腫瘤穩(wěn)定生長(zhǎng)的最佳方法?？偨Y(jié)出腫瘤生長(zhǎng)約8-周后用于靶向?qū)嶒?yàn)的方法是最佳的，并30-50"/。的動(dòng)物可根據(jù)腫瘤生長(zhǎng)模式而使用。為治療研究，對(duì)帶有腫瘤的動(dòng)物靜脈注射是檢測(cè)藥劑的131I_IMPR4-hRS7,并與直接放射性碘化的物質(zhì)l31I-hRS7進(jìn)行比較。將基線體重與每周檢測(cè)的體重和腫瘤體積比較。當(dāng)腫瘤達(dá)到3cm3時(shí)處死動(dòng)物。根據(jù)IACUC-批準(zhǔn)的方法實(shí)施所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物體內(nèi)生物分布在NIHSwiss棵鼠的生長(zhǎng)的胂瘤中使用雙-標(biāo)記的hRS7制劑(1251-IMP-Rx-hRS7其中x=4、5或8，每個(gè)試劑與直接標(biāo)記131I-hRS7混合)實(shí)施這些實(shí)驗(yàn)。表1A，1B和1C描述了具體的生物分布顯示出使用殘留性標(biāo)記具有非常好的表現(xiàn)。例如'"I-IMP-IMP-R4-RS7,'25I-IMP-R5-hRS7和'"I-IMP-R8-hRS7在第7日的°/。注射劑量/每克肺瘤分別是41.6±3.0%，32.2±11.6%和24.7±8.5%，而對(duì)于直接標(biāo)記的131I-HRS7在各雙-標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)中相同時(shí)間點(diǎn)為5.9±0.9%,6.2±2.1%和6.7±2.3%。在相同時(shí)間點(diǎn)，腫瘤-比-非肺瘤的比率是125I-IMP-R4-hRS71.7-7.6倍，125I_IMP-R5-hRS71.7~6.0倍和'25I-IMP-R8-hRS72.04.8倍高于"'I-hRS7(數(shù)據(jù)未顯示)。表1.用'25I_IMP-R(R4或R5或R8)和"'I-hRST(CT法)雙_標(biāo)記的人源化RS7在載有MDA-MB-468腫瘤異種移植物的NIHSwiss棵鼠中的生物分布<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>表1C:'"I-IMP-R8-hRS7對(duì)131I-hRS7(CT法)<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>放射量測(cè)定計(jì)算，根據(jù)生物分布使用1251替換'311，使用Siegel，JA和Stabin，MG(JournalofNuclearMedicine1994;35:152-156)的方法實(shí)施。表-2比較了殘留性和常規(guī)放射性捵標(biāo)記，而圖10用圖形描述了數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)所有殘留性藥劑以遞送給腫瘤劑量和腫瘤-比-非腫瘤比例的方式表現(xiàn)最佳；考慮到有益放射化學(xué)產(chǎn)生和相同藥劑可獲得的比活性而選擇13'I-IMP-R4-HRS7用于治療實(shí)驗(yàn)。表2:在MDA-MB-468腫瘤模型中由于變化放射性碘化的hRS7而計(jì)算的輻射劑<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>棵鼠中MDA-MB-468人乳癌異種移植物的治療最大耐受劑量(MTD):從劑量確定數(shù)據(jù)(表-2，1組)中，131I-IMP-R4-hRS7和'3'I-hRS7的mCi量，對(duì)血液產(chǎn)生輻射劑量1500cGy(估計(jì)的MTD)分別計(jì)算為0.231mCi和0.285mCi。在Swiss棵鼠中采用增加的每個(gè)藥劑的劑量實(shí)施MTD的實(shí)驗(yàn)確定。對(duì)于'31I-IMP-R4-HRS7，給予動(dòng)物組200，225，250，275，300和325jiCij250jiCi的劑量組的5只動(dòng)物中的1只在4個(gè)月后死亡，而300fiCi的劑量組的4只動(dòng)物中的3只在2周~4周間死亡。雖然275和325fiCi的劑量組中的動(dòng)物在第5周均存活是未料到的，我們?nèi)钥偨Y(jié)了231jiCi(從劑量確定數(shù)據(jù)中計(jì)算的)和250nCi給藥劑量組間的MTD。對(duì)于131I-HRS7(基于"CT"的放射性碘標(biāo)記)，用250，280，310，340,370和徹nCi注射動(dòng)物組；2周-3周間，340pCi劑量組的6只動(dòng)物中的6只，370pCi劑量組的6只動(dòng)物中的3只，和400^Ci劑量組的4只動(dòng)物中的4只死亡。才艮據(jù)這些，將MTD設(shè)為280-310^Ci。治療研究-1對(duì)于該用于將'311-IMP-R4-hRS7的效能與131I-hRS7(CT法)的效能相比較的第一治療實(shí)驗(yàn)，每種試劑使用其最大耐受劑量的~70%。單劑175nCi殘留性試劑顯示出效能顯著高于200pCi的常規(guī)放射性碘劑。在該包括未治療對(duì)照的實(shí)驗(yàn)中，每組使用lO或ll只動(dòng)物，全部三組為隨機(jī)分組以便使其起始腫瘤大小非常相似。在治療前(第2曰)三個(gè)組的平均腫瘤體積為0.312±0.181，0.308±0.203和0.303土0.212。在該實(shí)驗(yàn)中，第49日的過渡數(shù)據(jù)顯示于圖-11下方。圖-11中上方的圖顯示了每組中各動(dòng)物的腫瘤體積(CM3)，而下方的圖顯示了兩種格式的平均腫瘤體積。未治療組中死亡三只動(dòng)物。殘留性標(biāo)記組的肺瘤生長(zhǎng)控制要顯著好于傳統(tǒng)標(biāo)記和未治療組，如對(duì)平均腫瘤體積(MTV)直至49日的曲線下面積(AUC)的student-t檢驗(yàn)所測(cè)定的。在49日，由于用'311-IMP-R4-hRS7治療，MTV的AUC出現(xiàn)的顯著性差異(p值)，括弧內(nèi)給出治療前(第2日)各腫瘤體積差異p值，如下。對(duì)于未治療0.05(0.78);對(duì)于'311—hRS7(CT):0.03(0.98);對(duì)于131I-hRS7(CT)對(duì)未治療0.14(0.81)。在49日，平均肺瘤體積在常規(guī)的和殘留性放射性碘組間出現(xiàn)持續(xù)的離散，后一組導(dǎo)致持續(xù)的降低。在治療后8-周，在用'3'1-IMP-R4-hRS7治療的組中11只小鼠中5只完全緩解，MTV為起始值的20。/。。未治療的和13'1-hRS7-治療的小鼠在8周的MTV分別為各起始值的280%和163%，131I-hRS7組中11只小鼠中1只完全緩解。治療被良好耐受。IMP-R4組在第2日時(shí)的平均體重為21.93±2.03和而在第49日時(shí)為23.68±1.81;對(duì)于"CT，，組，平均體重在第2日和49日分別為21.77±2.21和23.90±2.64。治療組的骨髓中毒性，如通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)所確定的，顯示于圖-12中。簡(jiǎn)言之對(duì)于使用131I-IMP-R4-HRS7，在施用藥劑1周后對(duì)于WBC，淋巴細(xì)胞和中性白細(xì)胞計(jì)數(shù)，達(dá)到分別為對(duì)照水平的34°/。，7%和61%的最低值。在第5周，這些分別恢復(fù)到對(duì)照水平的74%,58°/。和92%，并在第49日保持在對(duì)照水平的45%，36%和51%;而對(duì)于131I-hRS7(CT):在施用藥劑l周后對(duì)于WBC，淋巴細(xì)胞和中性白細(xì)胞計(jì)數(shù)，達(dá)到分別為對(duì)照水平的41%,13%和67%的最低值。在第5周，這些分別恢復(fù)到對(duì)照水平的85%,67%和103%，并在第49日保持在對(duì)照水平的42%,32%和49°/。。治療研究-2在MDA-MB-468腫瘤模型中使用131I-IMP-R4-hRS7的RAIT的特異性將"'I-IMP-R4-hRS7的效能與非特異性用'3'1-IMP-R4標(biāo)記的對(duì)照人源化抗體，hLL2(抗-CD-22MAb)的效能進(jìn)行比較。在該實(shí)驗(yàn)中，施用175fiCi的各試劑。這代表mI-IMP-R4-hRS7最大耐受劑量的~70%。在該包括未治療的對(duì)照的實(shí)驗(yàn)中，每組使用7~8只動(dòng)物，如治療實(shí)驗(yàn)1參照起始腫瘤體積分布而隨機(jī)分組。圖13，顯示了三個(gè)組的相對(duì)平均腫瘤體積(MTV)(治療前MTV:IOO)，顯示出特異性的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)。實(shí)施例5.用Y-90人源化RS7mAb和棵人源化RS7mAb治療乳癌患者某女，56歲，有乳腺癌復(fù)發(fā)史，表現(xiàn)為頸部淋巴結(jié)和左側(cè)肺轉(zhuǎn)移的。該患者在化療和激素治療后復(fù)發(fā)兩次。該患者隨后接受了兩次治療性注射(間隔2周)Y-90-綴合的人源化RS7mAbi.v.，每次的劑量為抗體蛋白劑量IOOmg中20mCiY-90。治療后四周，該患者白血細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)降低了約50%，但在治療后9周恢復(fù)。在治療后12周的再腫瘤分類，計(jì)算機(jī)斷層攝影檢測(cè)到肺和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移降低30%。此后，該患者接受了4次一周一次的輸注(每次超過3小時(shí))被良好耐受的棵人源化RS7，除了某些短暫的僵直和寒戰(zhàn)，沒有對(duì)其血液計(jì)數(shù)或血液化學(xué)產(chǎn)生任何不良作用。每次輸注的棵抗體為400mg/m2。大約8周后，經(jīng)由計(jì)算機(jī)斷層攝影的再腫瘤分類顯示出在可檢測(cè)的損害中的額外降低了約20%。在隨訪檢測(cè)3個(gè)月后，該患者的疾病表現(xiàn)穩(wěn)定(即，沒有表現(xiàn)出附加的或進(jìn)展性的生長(zhǎng))。序列表〈110〉IMMUNOMEDICS,INC.<120〉RS7抗體<130〉018733/1164<140〉PCT/GB02/00885<141〉2003-03-03<150〉60/360,229〈151〉2002-03-01〈160〉28〈170〉PatentlnVer.2.1〈210〉1<211〉324〈212〉DNA〈213〉Mussp.〈220〉〈221〉CDS〈222〉(1)..(324)〈400〉1gacattcagctgacccagtctcacaaattcatgtecacateagtagga48AsplieGinLeuThrGinSerHisLysPheMetSerThrSerValGly151015gacagggtcageateacctgcaaggecagtcaggatgtgagtattget96AspArgValSerlieThrCysLysAlaSerGinAspValSerlieAla202530gtagectggtatc幼cagaaaccaggacaatctcctaaaetactgatt144ValAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinSerProLysLeuLeulie354045tactcggcatectaceggtacactggagtccctgatcgcttcactggc192TyrSerAlaSerTyrArgTyrThrGlyValProAspArgPheThrGly505560agtggatctgggacggatttcactttcaccateageagtgtgcagget240SerGlySerGlyThrAspPheThrPheThrlieSerSerValGinAla65707580gaagacctggcagtttattactgtcagcaacattatattactccgetc288GluAspLeuAlaValTyrTyrCysGinGinHisTyrlieThrProLeu859095acgttcThrPheggtGlygetAla100gggGlyaccThr肌gctggagLysLeuGlu105ctgLeuaaaeggLysArg324〈210〉2<211〉108〈212〉PRT〈213〉Mussp.〈■〉2AsplieGinLeuThrGinSerHisLysPheMetSerThrSerValGly151015AspArgValSerlieThrCysLysAlaSerGinAspValSerlieAla202530ValAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinSerProLysLeuLeulie354045TyrSerAlaSerTyrArgTyrThrGlyValProAspArgPheThrGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrPheThrlieSerSerValGinAla65707580GluAspLeuAlaValTyrTyrCysGinGinHisTyrlieThrProLeu859095ThrPheGlyAlaGlyThrLysLeuGluLeuLysArg100105〈210〉3<211〉360<212〉腿〈213〉Mussp.〈220〉〈221〉CDS〈222〉(1)..(360)〈400〉3gtgaagctgcaggagteaggacctgagctgaagaagcctggsg3gaca48ValLysLeuGinGluSerGlyProGluLeuLysLysProGlyGluThr151015gtcaagatetectgcaaggettctggatataccttcacaaactatgga96ValLyslieSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyrGly202530atg肪ctgggtgaagcaggetcc3ggaaagggtttaaagtggatgggc144MetAsnTrpValLysGinAlaProGlyLysGlyLeuLysTrpMetGly354045tggata朋cacctecactggagsgccaacatatactgatgacttcaag192TrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrThrAspAspPheLys505560ggaeggtttgccttctctttggaaacctctgccaccactgcctatttg240GlyArgPheAlaPheSerLeuGluThrSerAlaThrThrAlaTyrLeu65707580cagateaacaacetcaaaagtgagg￡icatggetacatatttctgtgca288GinlieAsnAsnLeuLysSerGluAspMetAlaThrTyrPheCysAla859095agaggggggttcggtagtagetactggtacttcgatgtctggggccaa336ArgGlyGlyPheGlySerSerTyrTrpTyrPheAspValTrpGlyGin100105110gggaccacggtcaccgtctectea360GlyThrThrValThrValSerSer115120〈210〉4〈211〉120〈212〉PRT〈213〉Mussp.<40()〉4ValLysLeuGinGluSerGlyProGluLeuLysLysProGlyGluThr151015ValLyslieSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyrGly202530MetAsnTrpValLysGinAlaProGlyLysGlyLeuLysTrpMetGly354045TrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrThrAspAspPheLys505560GlyArgPheAlaPheSerLeuGluThrSerAlaThrThrAlaTyrLeu65707580GinlieAsnAsnLeuLysSerGluAspMetAlaThrTyrPheCysAla859095ArgGlyGlyPheGlySerSerTyrTrpTyrPheAspValTrpGlyGin100105110GlyThrThrValThrValSerSer115120<210>5〈211〉106〈212〉PRT〈213〉人類〈400〉5AsplieGinMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrlieThrCysArgAlaSerGinSerlieSerSerTyr202530LeuAsnTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysLeuLeulie354045TyrAlaA]aSerSerLeuGinSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinSerTyrSerThrProLeu859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGlulie100105<210>6〈211〉119<212〉PRT<213〉人類〈400〉6ValGinLeuValGinSerGlySerGluLeuLysLysProGlyAlaSer151015ValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyrAla202530MetAsnTrpValArgGinAlaProGlyGinGlyLeuGluTrpMetGly354045TrplieAsnThrAsnThrGlyAsnProThrTyrAlaGinGlyPheThr505560GlyArgPheValPheSerLeuAspThrSerValSerThrAlaTyrLeu65707580GinlieSerSerLeuLysAlaAspAspThrAlaValTyrTyrCysAla859095ArgGluAspSerAsnGlyTyrLysliePheAspTyrTrpGlyGinGly100105110SerLeuV'alThrValSerSer115〈210〉7〈211〉324〈212〉腿<213〉人工序列〈220〉<223〉人工序列的描述人源化hRS7Vk序列〈220>〈221〉CDS〈222〉(1)..(324)〈400〉7gacatecagctgacccagtctccatectecctgtctgcatctgtagga48AsplieGinLeuThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015gacagagtcageateacctgcaaggccagtcaggatgtgagtattget96AspArgValSerlieThrCysLysAlaSerGinAspValSerlieAla202530gtagcctggtatcagcag犯accagggaaagcccctaagetcctgate144ValAlaTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysLeuLeulie354045tactcggcatectaceggtacactggagtccctgataggttcagtggc192TyrSerAlaSerTyrArgTyrThrGlyValProAspArgPheSerGly505560agtggatctgggacagatttcactetcaccateageagtctgcaacctSerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580240gaagattttgcagtttattactgtcagcaacattatattactccgetcGluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinHisTyrlieThrProLeu859095288acgttcThrPheggtGlygetAla100gggaccGlyThrLysgtgValg恥Glu105ateliea肌cgtLysArg324〈210〉8〈211>108<212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述人源化hRS7Vk氨基酸序列〈400〉8AsplieGinLeuThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValSerlieThrCysLysAlaSerGinAspValSerlieAla202530ValAlaTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysLeuLeulie354045TyrSerAlaSerTyrArgTyrThrGlyValProAspArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinHisTyrlieThrProLeu859095ThrPheGlyAlaGlyThrLysValGlulieLysArg100105〈210〉9〈211〉363〈212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223〉人工序列的描述人源化hRS7VH序列〈220〉〈221〉CDS〈222〉(1)..(363)<400>9caggtccaactgcagcaatctgggtctgagttgaagaagcctggggcc48GinValGinLeuGinGinSerGlySerGluLeuLysLysProGlyAla151015teagtgaa.ggtttectgcaaggettctggata.caccttca_ca肌ctat96SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530ggaatgaactgggtgaagcaggcccctggacaagggcttaa_atggatg144GlyMetAsnTrpValLysGinAlaProGlyGinGlyLeuLysTrpMet354045ggctggataaacacetacactggagagccaacatatactgatgacttc192GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrThrAspAspPhe505560aagggaeggtttgccttctecttggacacctctgtcageacggcatat240Lys〔;lyArgPheA〗.aPheSerLeuAspThrSerValSerThrAlaTyr65707580etccagateageageetaaaggetgacgacactgccgtgtatttctgt288LeuGinlieSerSerLeuLysAlaAspAspThrAlaValTyrPheCys859095gca卿ggggggttcggtagtagetactggtacttcgatgtctggggc336AlaArgGlyGlyPheGlySerSerTyrTrpTyrPheAspValTrpGly100105110caagggtecctggtcaccgtctectea363G]nGlySerLeuValThrValSerSer115t20〈210>10〈211〉121〈212〉PRT<213>人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述人源化hRS7VH氨基酸序列〈400〉10GinValGinLeuGinGinSerGlySerGluLeuLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrpValLysGinAlaProGlyGinGlyLeuLysTrpMet354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrThrAspAspPhe505560LysGlyArgPheAlaPheSerLeuAspThrSerValSerThrAlaTyr65707580LeuGinlieSerSerLeuLysAlaAspAspThrAlaValTyrPheCys859095AlaArgGlyGlyPheGlySerSerTyrTrpTyrPheAspValTrpGly100105110GinGlySerLeuValThrValSerSer115120<210>11〈211〉702〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述人源化hRS7k序列<220>〈221〉CDS〈222〉(1).(699)〈400〉11atgggatggagetgtsiteateetcttcttggtagcaacagetacaggt48MetGlyTrpSerCyslielieLeuPheLeuValAlaThrAlaThrGly151015gtccactecgacatecagctgacccagtctccatectecctgtctgca96ValHisSerAsplieGinLeuThrGinSerProSerSerLeuSerAla202530tctgtsggsgsc3g3gtc3gc3tcseetgcMggcc3gtC3gg3tgtg144SerValGlyAspArgValSerlieThrCysLysAlaSerGinAspVal354045agtattgetgtagcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaag192SerlieAlaValAlaTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLys505560etcctgatetactcggcatectaceggtacactggagtccctgatagg240LeuLeulieTyrSerAlaSerTyrArgTyrThrGlyValProAspArg65707580ttcagtggcagtggatctgggacagatttcactetcaccateageagt288PheSerGlySerGlySer*GlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSer859095ctgcaacctgaagattttgcagtttattactgtcagcaacattatatt336LeuGinProGluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinHisTyrliel()O105110actccgetcacgttcggtgetgggaccaaggtggagateaaacgtact384ThrProLeuThrPheGlyAlaGlyThrLysValGlulieLysArgThr115120125gtggetgcaccatctgtcttcatettcccgccatctgatgagcagttg432ValAlaAlaProSerValPheliePheProProSerAspGluGinLeu130135140aaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatccc480LysSerGlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrPro145150155160Eigagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccetccaatcgggt528ArgGluAlaLysValGinTrpLysValAspAsnAlaLeuGinSerGly165170175aacteccaggagagtgtcacagagcaggacageaaggacageacctac576AsnSerGinGluSerValThrGluGinAspSerLysAspSerThrTyr180185190ageetcageageaccctgacgctgageaaagcagactacgagaaacac624SerLeuSerSerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLysHis195200205aaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagetcgcccgtc672LysValTyrAlaCysGluValThrHisGinGlyLeuSerSerProVal210215220已caa已gagettcaacaggggagagtgttag702ThrLysSerPheAsnArgGlyGluCys225230〈210〉〈211〉〈212〉〈213〉<220〉〈223〉12233PRT人工序列〈柳〉MetGly1人工序列的描述人源化hRS7k氨基酸序列12TrpSerCyslielieLeuPheLeuValAlaThrAlaThrGly51015ValHisSerAsplieGinLeuThrGinSerProSerSerLeuSerAla202530SerValGlyAspArgValSerlieThrCysLysAlaSerGinAspVal354045SerlieAlaValAlaTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLys505560LeuLeulieTyrSerAlaSerTyrArgTyrThrGlyValProAspArg65707580PheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSer859095LeuGinProGluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinHisTyrlie100105110ThrProLeuThrPheGlyAlaGlyThrLysValGlulieLysArgThr115120125ValAlaAlaProSerValPheliePheProProSerAspGluGinLeu130135140LysSerGlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrPro145150155160ArgGluAlaLysValGinTrpLysValAspAsnAlaLeuGinSerGly165170175AsnSerGinGluSerValThrGluGinAspSerLysAspSerThrTyr180185190SerLeuSerSerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLysHis195200205LysValTyrAlaCysGluValThrHisGinGlyLeuSerSerProVal210215220ThrLysSerPheAsnArgGlyGluCys225230〈210〉13<211〉1410〈212〉腿〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述人源化hRS7H序列〈220〉〈221>CDS〈222〉(1)..(1407)〈400〉13atgggatggagetgtateateetcttcttggtagcaacagetacaggt48MetGlyTrpSerCysI〗elieLeuPheLeuValAlaThrAlaThrGly1.51015gtccactecgtccaactgcagcaatctgggtctgagttg朋gaagcct96ValHisSerValGinLeuGinGinSerGlySerGluLeuLysLysPro202530ggggccteagtgaaggtttectgcaaggettctggatacaccttcaca144GlyAlaSerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThr354045肌ctatggaatgaactgggtgaagc恥gcccctggacaagggcttaaa192AsnTyrGlyMetAsnTrpValLysG]nAlaProGlyGinGlyLeuLys505560tgg3tgggctgg3ta朋cacetacactggagagccaacatatactgat240TrpMetGlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrThrAsp65707580gacttcaagggaeggtttgccttctecttggacacctctgtcageacg288AspPheLysGlyArgPheAlaPheSerLeuAspThrSerValSerThr859095gcatatetccagateageageetaaaggetgacgacactgccgtgtat336AlaTyrLeuGinlieSerSerLeuLysAlaAspAspThrAlaValTyr100105110ttctgtgcaagaggggggttcggtagtagetectggtacttcgatgtc384PheCysAlaArgGlyGlyPheGlySerSerTyrTrpTyrPheAspVal115120125tggggccaagggtecctggtcaccgtctecteagcctecaccaagggc432TrpGlyGinGlySerLeuValThrValSerSerAlaSerThrLysGly130135140ccatcggtcttccccctggcaccctectecaagageacctctgggggc480ProSerValPheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGly145150155160acagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtg528ThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluProVal165170175acggtgtcgtggaacteaggcgccctgaccageggcgtgcacaccttc576ThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPhe180185190ccggetgtcetacagtecteaggaetctactecetcageagegtggtg624ProAlaValLeuGinSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValVal195200205accgtgccctecageagettgggcacccagacctacatetgcaacgtg672ThrValProSerSerSerLeuGlyThrGinThrTyrlieCysAsnVal210215220aatcacaagcccageaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaa720AsnHisLysProSerAsnThrLysValAspLysArgValGluProLys225230235240tcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaaetc768SerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluLeu245250255ctggggggaccgteagtcttcetcttccccccaaaacccaaggacacc816LeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThr260265270etcatgateteceggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtg864LeuMetlieSerArgThrProGluValThrCysValValValAspVal275280285agecacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtecgtggacggcgtg912SerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyVal290295300gaggtgcataatgccaagacaaagccgegggaggagcagtacaacage960GluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGinTyrAsnSer305310315320acgtaccgtgtggtcagegtcetcaccgtcctgcaccaggactggctg1008ThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGinAspTrpLeu325330335aatggc肌ggagtecaagtgcaaggtctecaac肌agccetcccagcc1056AsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAla340345350cccateg兆aaaaccatetecaaagccaaagggcagccccgagaacca1104ProlieGluLysThrlieSerLysAlaLysGlyGinProArgGluPro355360365caggtgtacaccctgcccccatecegggaggagatgaccaagaaccag1152GinValTyrThrLeuProProSerArgGluGluMetThrLysAsnGin370375380gtcagectgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagegacategcc1200ValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAsplieAla385390395400gtggagtgggagageaatgggcagccggag￡iacaactacaagaccacg1248ValGluTrpGluSerAsnGlyGinProGluAsnAsnTyrLysThrThr405410415cctcccgtgctggactecgacggctecttcttcetctatageaagetc1296ProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeu420425430accgtggac已a(bǔ)gageaggtggcagcaggggaacgtcttcteatgctec1344ThrValAspLysSerArgTrpGinGinGlyAsnValPheSerCysSer435440445gtgatgcatgaggetctgcacaaccactacacgcagaagageetctec1392ValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGinLysSerLeuSer450455460ctgtctccgggtaaatga1410LeuSerProGlyLys465〈210〉14〈211〉469〈212〉PRT6<formula>formulaseeoriginaldocumentpage69</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>〈211〉11〈212〉PRT〈213〉人工序列〈220>〈223〉人工序列的描述合成肽<400〉15LysAlaSerGinAspValSerlieAlaValAla1510〈210>16〈211〉7〈212〉PRT〈213〉人工序列〈220〉<223〉人工序列的描述合成肽〈400〉16SerAlaSerTyrArgTyrThr15〈210〉17〈211〉9〈212〉PRT<213〉人工序列〈220〉<223〉人工序列的描述〈400〉17GinGinHisTyrlieThrProLeuThr15〈210〉18<211〉5〈212〉PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述合成肽〈400〉18AsnTyrGlyMetAsn15〈210〉19〈211〉17<212〉PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述合成肽<400〉19TrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrThrAspAspPheLys151015Gly〈210〉20〈211〉12<212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述合成肽〈400〉20GlyGlyPheGlySerSerTyrTrpTyrPheAspVal1510〈210〉21〈211〉176〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述合成寡核苷酸<400>21ggtctgagttgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcttctggataca60ccttcacEiEmctatggEiEitgaactgggtgaagcaggcccctggac朋gggcttaaatgga120tgggctggataaacacctacactggagagccaacatatactgatgacttcaaggga176〈210〉22〈211〉168<212>DNA〈213〉人工序列<220〉<223〉人工序列的描述合成寡核苷酸〈400〉22acccttggccccagacatcg犯gtaccagtagctecteccgaacccccctcttgcacaga60aatacacggcagtgtcgtcagcctttaggctgctgatctggagatatgccgtgctgacag120aggtgtccaaggagaaggcaaaccgtcccttgaagtcatcagtatatg168〈210〉23<211〉38〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述合成寡核苷酸〈400〉23gtggtgctgcagcaatctgggtctgagttgaagaagcc38<210〉24〈211〉38〈212〉廳〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述合成寡核苷酸<400〉24tgaggagacggtgaccagggacccttggccccagacat38〈210〉25<211>156〈212〉醒〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述合成寡核苷酸〈■〉25ctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcagcatcacctgcaaggccagtc60aggat,gtgagtattgctgtagcctggtatcagcagaaacc3gggaaagcccctaagctcc120tgatctactcggcatcctaccggtacactggagtcc156〈210〉26〈211〉155<212〉DNA<213>人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述合成寡核苷酸〈400〉26ccttggtcccagcaccgaacgtgagcggagtaatataatgttgctgacagtaataaactg60caaaatcttcaggttgcagactgctgatggtgagagtgaaatctgtcccagatccactgc120cactgaacctatcagggactccagtgtaccggtag155〈210〉27〈211〉37〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<223〉人工序列的描述合成寡核苷酸〈400〉27gacattcagctgacccagtctccatcctccctgtctg37〈210〉28〈211〉31〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述合成寡核苷酸〈400>28acgttagatctccaccttggtcccagcaccg3111權(quán)利要求1.嵌合、人源化或人抗-EGP-1抗體或其片段在制備用于治療其中患病細(xì)胞表達(dá)EGP-1抗原的疾病的藥物中的應(yīng)用，其中所述抗體或片段是裸抗體或其片段或者與除Rnase之外的治療劑綴合。2.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述抗-EGP-1抗體或其片段是棵抗體或其片段。3.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述抗-EGP-l抗體或其片段與除Rnase之外的治療劑綴合。4.權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中所述治療劑選自藥物、毒素、放射性核素、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、酶、生長(zhǎng)因子和反義寡核苦酸。5.權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中所述毒素是假單胞菌內(nèi)毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒素、DNaseI、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、白樹毒素、白喉毒素或假單胞菌外毒素。6.權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑是細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、淋巴毒素、肺瘤壞死因子(TNF)、造血因子、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-IO、IL-12、IL-18、IL-21、集落刺激因子、粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-a、干擾素-(3、干擾素-y、稱為"S1因子，，的干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促紅細(xì)胞生成素、血小板生成素或其組合。7.權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中所述治療劑具有選自抗有絲分裂、烷化、抗代謝物、抗血管生成、細(xì)胞凋亡、生物堿、抗生素劑及其組合的藥理特性。8.權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中所述治療劑選自氮芥類、氮丙啶衍生物、烷基磺酸酯類、亞硝基脲類、三氮烯類、葉酸類似物、蒽環(huán)類抗生素、紫杉烷類藥、C0X-2抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑、嘧啶類似物、噤呤類似物、抗生素、酶、表鬼臼毒素類、鉑配位絡(luò)合物、長(zhǎng)春花生物堿、取代的脲類、曱肼衍生物、腎上腺皮質(zhì)激素抑制劑、拮抗劑、內(nèi)皮生長(zhǎng)抑素、紫杉醇、喜樹堿、阿霉素、阿霉素類似物及其組合。9.權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中所述放射性核素選自1311、1231、1241、86Y、62Cu、64Cu、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、90Y、mIn、125I、186Re、188Re、189Re、177Lu、67Cu、212Bi、213Bi、211At、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Ag、mAg、197Pt、109Pd、32P、33P、47Sc、153Sm、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、18F、75Se、201T1、225Ac、76Br、86Y、169Yb、166Dy、21^1)和223^。10.權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中所述抗-EGP-l抗體或其片段是融合蛋白的一部分。11.權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中所述融合蛋白包括笫二抗體或其片段或治療性蛋白或肽。12.權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中所述第二抗體或其片段與包含一個(gè)或多個(gè)半抗原的靶向構(gòu)建體結(jié)合。13.權(quán)利要求ll的應(yīng)用，其中所述第二抗體或其片段與除EGP-l之外的肺瘤相關(guān)抗原結(jié)合。14.權(quán)利要求ll的應(yīng)用，其中所述腫瘤相關(guān)抗原是CD20、CD22、CEA、CSAp、AFP或MUC-1，或者其中所述第二抗體或其片段是hMN-14、Mu-9、Immu31或PAM4。15.權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中所述抗-EGP-1抗體或其片段與第二抗體或其片段共價(jià)相連。16.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述抗-EGP-l抗體或其片段是嵌合、人源化或人RS7抗體或其片段。17.權(quán)利要求16的應(yīng)用，其中所述嵌合、人源化或人RS7抗體或其片段包括RS7抗體輕鏈可變區(qū)CDR1(KASQDVSIAVA，SEQIDNO:28);CDR2(SASYRYT，SEQIDNO:29);和CDR3(QQHYITPLT，SEQIDNO:30)和RS7重鏈可變區(qū)CDR1(NYGMN，SEQIDNO:31);CDR2(WINTYTGEPTYTDDFKG，SEQIDNO:32)和CDR3(GGFGSSYWYFDV，SEQIDNO:33)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。18.權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中所述抗-EGP-l抗體或其片段包括人IgGl恒定區(qū)序列。19.權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中所述疾病是癌癥。20.權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中所述癌癥是肺、乳腺、膀胱、卵巢、子宮、胃或前列腺的腫瘤。21.權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中所述肺腫瘤是鱗狀細(xì)胞癌或腺癌。22.與治療劑綴合的嵌合、人源化或人抗-EGP-l抗體或其片段在制備用于治療其中患病細(xì)胞表達(dá)EGP-1抗原的疾病的藥物中的應(yīng)用，其中所述抗-EGP-l抗體或其片段包括人IgGl恒定區(qū)。23.權(quán)利要求22的應(yīng)用，其中所述治療劑選自同位素、藥物、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、酶、Rnase、抗體、抗體片段、生長(zhǎng)因子、放射性核素和反義寡核苷酸。24.權(quán)利要求23的應(yīng)用，其中所述放射性核素選自1311、1231、1241、86Y、62Cn、64Cu、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、90Y、mIn、125I、186Re、188Re、189Re、177Lu、67Cu、212Bi、213Bi、211At、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Ag、mAg、197Pt、109Pd、32P、33P、47Sc、153Sm、105Rh、142Pr、"3Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、18F、75Se、201T1、225Ac、76Br、86Y、169Yb、166Dy、、和2、。25.權(quán)利要求23的應(yīng)用，其中所述Rnase是o歸nase。全文摘要本發(fā)明涉及單價(jià)和多價(jià)的，單特異性結(jié)合蛋白和涉及多價(jià)的，多特異性結(jié)合蛋白。這些結(jié)合蛋白的一個(gè)實(shí)施方案含有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其中每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與靶抗原或靶抗原上的表位結(jié)合。這些結(jié)合蛋白的另一實(shí)施方案含有兩個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其中每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)具有對(duì)靶抗原上不同表位的親和性或具有對(duì)靶抗原或半抗原的親和性。本發(fā)明還涉及用于在宿主中表達(dá)這些功能性結(jié)合蛋白的重組載體。更具體地，本發(fā)明涉及名為RS7的腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合蛋白和其它EGP-1結(jié)合蛋白。本發(fā)明還涉及人源化，人和嵌合RS7抗原結(jié)合蛋白，以及該結(jié)合蛋白在診斷和治療中的用途。文檔編號(hào)A61K51/10GK101264325SQ20071018516公開日2008年9月17日申請(qǐng)日期2003年3月3日優(yōu)先權(quán)日2002年3月1日發(fā)明者D·M·戈登伯格,H·J·漢森,S·戈文丹,Z·屈申請(qǐng)人:免疫醫(yī)療公司