專利名稱：：槐果堿在制備治療由流感乙型病毒引起炎癥的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于藥學(xué)領(lǐng)域，涉及一種槐果堿的應(yīng)用，特別是槐果堿或其可藥用鹽在制備治療由流感乙型病毒引起的心肌炎及肺部炎癥的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：槐果堿(sophocarpine)即從豆科槐屬植物苦參及豆科槐屬植物苦豆子中的干燥根及其地面部分中提取的有效單體，分子式為C15H22ON2，熔點(diǎn)為53—54t:，其結(jié)構(gòu)式為(I):病毒性心肌炎的發(fā)病與腸道病毒有密切的關(guān)系，其中尤以柯薩奇B病毒(RNA病毒)為多見?；惫麎A具有明顯對(duì)抗柯薩奇B病毒的功能，對(duì)柯薩奇B病毒性心肌炎有明顯的效果。關(guān)于槐果堿對(duì)抗柯薩奇B病毒及其藥物的制備己經(jīng)公開在本申請(qǐng)人的一項(xiàng)已授權(quán)專利99119850.6中。此外，本申請(qǐng)的發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)了槐果堿可對(duì)抗冠狀病毒，相關(guān)技術(shù)內(nèi)容在本申請(qǐng)人的另一項(xiàng)專利申請(qǐng)03151269.0中有所描述。盡管本申請(qǐng)人先前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了槐果堿可對(duì)抗柯薩奇B病毒、冠狀病毒，但引起心肌炎尚有其它病毒，包括以下病毒1、柯薩奇A病毒，常是引起嬰兒心肌炎的原因。2、?？刹《?Echo-Virus)，其也可引起心肌炎，其中Echo9病毒目前被認(rèn)為是COXA23，感染后可引起陣發(fā)性房性心動(dòng)過速及房室傳導(dǎo)阻滯。3、腺病毒(Adeno-vims)，它是一種核內(nèi)復(fù)制的單一DNA病毒，近年來認(rèn)為它可能是病毒性心肌炎的重要原因之一。曾有學(xué)者報(bào)導(dǎo)在臨床確診的急性病毒性心肌炎患者的心肌活檢標(biāo)本中用PCR的方法可檢出腺病毒的病毒基因，其檢出率甚至比腸道病毒高1倍(而且僅為腺病毒，未發(fā)現(xiàn)其它病毒)。目前認(rèn)為腸道病毒是小兒心肌炎的主要原因，可引起非典型性肺炎或心肌炎。臨床上常無癥狀且更易持續(xù)感染，從而導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病或心內(nèi)膜彈力纖維增生癥。4、流感病毒，它是RNA呼吸道病毒，除引起呼吸道感染外，也可引起心肌炎。這都是十分重要的。本申請(qǐng)的發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，槐果堿除了可對(duì)抗柯薩奇B病毒、冠狀病毒以外，對(duì)于上述的Echo病毒、腺病毒、流感病毒(流感病毒B)都是有作用的。在病毒性心肌炎階段，炎癥細(xì)胞浸潤可分為二個(gè)時(shí)相，第一時(shí)相即病毒感染后37天，主要為巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞侵入心肌并達(dá)到高峰。第二時(shí)相即為病毒感染后714天，T細(xì)胞替代巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞成為主要浸潤細(xì)胞。NK細(xì)胞是一類和T、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞具有明顯不同的淋巴細(xì)胞，能識(shí)別多種抗原決定簇，不需致敏即可直接殺傷靶細(xì)胞，而且活性不受主要組織相容性復(fù)合物(MHC)限制，因此，NK細(xì)胞可在特異性CTL產(chǎn)生前發(fā)揮抗病毒作用。許多硏究發(fā)現(xiàn)在COXB3感染第3天時(shí)，NK細(xì)胞的非特異性細(xì)胞毒性作用增強(qiáng)，不僅可殺傷病毒感染細(xì)胞，也可直接殺傷未經(jīng)病毒感染的細(xì)胞，因此設(shè)想NK細(xì)胞可能參與了COXB3誘導(dǎo)的心肌炎發(fā)病過程。本申請(qǐng)的發(fā)明人在研究中還發(fā)現(xiàn)，槐果堿對(duì)NK細(xì)胞活性有雙向調(diào)節(jié)作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的問題在于提供槐果堿或其可藥用鹽在制備治療由流感乙型病毒引起的心肌炎及肺部炎癥的藥物中的應(yīng)用，所述槐果堿的結(jié)構(gòu)式為(1)。進(jìn)一步的，所述的槐果堿的可藥用鹽為槐果堿的溴酸鹽、或者槐果堿的鹽酸鹽或者槐果堿的氟酸鹽。進(jìn)一步的，所述的槐果堿的可藥用鹽的藥物劑型為醫(yī)學(xué)上認(rèn)可的任何一種劑型。具體的，所述的藥物劑型為粉劑、或者注射液、或者膠囊、或者片劑、或者口服液。'槐果堿不但有靜脈注射液，還有粉劑、口服液、膠囊以及片劑?？诜苿┡c靜脈用藥在人體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)及生物利用度比較，二種制劑的體內(nèi)過程均符合二室模型。口服液的血液濃度Cmax較低于靜脈注射液，達(dá)峰時(shí)間Tmax也相對(duì)延長，其參數(shù)Tl/2e、KIO、cLs、Auc等無顯著差異(P>0.05)，表明口服制劑及靜脈注射制劑二種劑型具有生物等效性，F(xiàn)為80—85%。本發(fā)明所述的槐果堿藥物的制備可參考常規(guī)的藥物配制方法，在知道了所需藥物的給藥劑量以后，藥物的配制是本
技術(shù)領(lǐng)域：
人員所熟知的?；惫麎A藥物的一種配制方法可參考本申請(qǐng)人之前的已授權(quán)專利99119850.6。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本申請(qǐng)的發(fā)明人利用兩種細(xì)胞(Hela細(xì)胞及Vero細(xì)胞)，作了槐果堿對(duì)抗Echo病毒及腺病毒的體外及體內(nèi)病毒試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)它對(duì)Echo病毒及腺病毒的增殖均有對(duì)抗作用?；惫麎A對(duì)抗Echo病毒及腺病毒的體外測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)1%槐果堿稀釋至1:8(即312ug)時(shí)，對(duì)Echo病毒發(fā)揮抗病毒作用，直至1:128(即19.5ug)時(shí)仍能抑制Echo病毒在Hela及Vero細(xì)胞上致病變作用。當(dāng)1%槐果堿稀釋至1:8(即312"g)時(shí)，對(duì)腺病毒發(fā)揮抗病毒作用，直至1:64(艮卩39yg)時(shí)仍能抑制腺病毒在Hela和Vero細(xì)胞上的致病變作用?；惫麎A對(duì)抗Echo病毒及腺病毒的體內(nèi)測(cè)定具體可見下文實(shí)施例的描述。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，驗(yàn)證了槐果堿能夠?qū)沽鞲胁《?，體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)槐果堿對(duì)于流感乙型病毒的增殖有抑制作用。當(dāng)濃度樣品在31.25ug/ml濃度時(shí)有抗流感病毒活性，抑制率為75%,樣品在15.625ug/ml濃度時(shí)有抗流感乙型病毒，抑制率為50%，樣品在7.81ug/ml濃度時(shí)有抗流感病毒活性，抑制率為25%，具體見下面實(shí)施例中的相關(guān)描述。在本發(fā)明的另一方面，本申請(qǐng)的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，槐果堿還有抗心律失常的作用。在離體豚鼠心室乳頭肌細(xì)胞動(dòng)作電位的研究中，發(fā)現(xiàn)第一，槐果堿能使0期上升速度下降，并呈濃度依賴性，可能對(duì)鈉通道有抑制作用；第二，槐果堿可使APD5Q、APD9Q、APD咖均延長，并呈濃度依賴性，可能有抑制鉀外流作用；第三，槐果堿可能使ERP延長，并呈濃度依賴性，這不僅與其延長動(dòng)作電位時(shí)程有關(guān)，可能也與其輕度抑制鈉通道有關(guān)(Vmax下降)。第四，槐果堿與鹽酸胺碘酮相比，起效快，劑量小。在槐果堿對(duì)兔竇房結(jié)細(xì)胞動(dòng)作電位的影響的研究中，發(fā)現(xiàn)第一，高濃度槐果堿可使0期上升速度下降，提示其可能對(duì)慢鈣(L)通道有抑制作用；第二，槐果堿可使4期自動(dòng)除極速率明顯下降，并呈濃度依賴性；高濃度槐果堿使APD5()明顯延長，提示有可能抑制鉀外流的作用；第三，槐果堿可使竇房結(jié)的自律性發(fā)生放頻率下降，呈濃度依賴性；第四，槐果堿與鹽酸胺碘酮相比，起效快，劑量小，且對(duì)動(dòng)作電位各參數(shù)影響程度小，易恢復(fù)。在槐果堿對(duì)冠狀動(dòng)脈阻塞——再灌注犬心律失常的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)在用10mg/kg靜脈注射并以維持量靜脈點(diǎn)滴的情況下，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后l小時(shí)，打開結(jié)扎線未見有再灌注室性顫動(dòng)，說明槐果堿具有對(duì)抗冠狀動(dòng)脈阻塞——再灌注誘發(fā)心律失常作用。而以生理鹽水取代槐果堿后再結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后1小時(shí)，打開結(jié)扎線后——都發(fā)生再灌注室性顫動(dòng)，以致死亡。在本發(fā)明的另一方面，發(fā)現(xiàn)槐果堿對(duì)腺病毒所致肺部炎癥有抑制作用，病毒組小鼠在接種腺病毒后，肺泡與肺泡間的壁增厚，小支氣管間及旁有很多炎癥細(xì)胞；而槐果堿治療組在治療后，肺泡與肺泡間的壁增厚明顯減輕，炎癥細(xì)胞減少。本申請(qǐng)的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，槐果堿能夠調(diào)節(jié)免疫功能。病毒性心肌炎的發(fā)病原因，除了病毒直接侵犯心肌以外，還有機(jī)體的免疫反應(yīng)的參與，其中T淋巴細(xì)胞的功能尤為重要，如CD3+、CD4+、CD8+等類型有明顯表現(xiàn)。CD3+為總淋巴細(xì)胞，CD8+為殺傷性淋巴細(xì)胞(Ts)，它對(duì)抗原的反應(yīng)是將耙細(xì)胞溶解，具有病毒抑制和損傷心肌的雙重作用。CD4+為輔助淋巴細(xì)胞(Th)，作用于B細(xì)胞能提高體液免疫的功能。在殺傷性T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞激活或增生過程中發(fā)揮重要作用。但兩者的活性均受主要組織相容性復(fù)合因子(MHC)所激活與限制。CD8+與MHC-I有關(guān)，CD4+與MHC-II有關(guān)。在正常情況下二者功能趨于動(dòng)態(tài)平衡。病毒感染后則發(fā)生變化。臨床所見病毒性心肌炎患者中，免疫功能低下，尤其對(duì)于反復(fù)發(fā)作者。為此，本申請(qǐng)的發(fā)明人借助Balb/c小鼠COXB3m病毒性心肌炎模型，研究感染后不同天數(shù)小鼠脾臟T細(xì)胞亞群的變化以及槐果堿對(duì)其影響，以及研究槐果堿對(duì)感染后小鼠勻漿中COXB3m病毒增殖的抑制情況。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，通過研究槐果堿對(duì)小鼠柯薩奇B3m心肌炎模型中Thy-l(CD3)、L3T4(CD4)、Ly-2(CD8)等T細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)以及對(duì)心肌內(nèi)COX3m增殖的抑制作用，進(jìn)行了槐果堿對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)及提高方面的研究，研究其是否有助于心肌炎的恢復(fù)。用單克隆抗體間接免疫熒光法測(cè)定病毒感染后不同天數(shù)小鼠脾臟T細(xì)胞亞群。結(jié)果顯示(l)病毒感染組脾臟的Thy-l(CD3)、L3丁4(CD4)及Ly-2(CD8)細(xì)胞在感染后第3天起開始明顯下降，直至第14天各點(diǎn)所測(cè)的值顯著低于正常組(P<0.05~0.001)。CD4/CD8比值從感染后7天的2.08±0.97上升到14天的2.65±0.58，明顯高于槐果堿治療組(PO.01)。CD4/CD8比值的升高說明疾病在發(fā)展，(2)槐果堿的治療組則均高于病毒感染組與正常對(duì)照組相比無差異。還測(cè)定了槐果堿對(duì)感染后模型心肌勻漿中病毒的抑制作用。病毒組在感染不同天數(shù)心肌勻漿中CVXB3mLogTCIDso未見減少，而槐果堿治療組從第3天開始，第5天、7天及14天的心肌勻漿中CVXB3mLogTCIDso明顯減少，PO.OOl。說明免疫功能提高后更有助于槐果堿對(duì)心肌內(nèi)病毒的抑制作用。本發(fā)明的另一方面，在COXB3病毒性心肌炎模型的基礎(chǔ)上，探討了槐果堿對(duì)病毒感染小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。小鼠在感染COXB3病毒后，經(jīng)組織證實(shí)均發(fā)生心肌炎，但在發(fā)病過程中，NK細(xì)胞活性有動(dòng)態(tài)變化，在病毒感染后3天，NK細(xì)胞活性顯著增高，繼之進(jìn)行性下降，12天時(shí)低于正常水平?；惫麎A對(duì)NK細(xì)胞活性有雙向調(diào)節(jié)作用。本申請(qǐng)的發(fā)明人用10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg不同劑量的槐果堿治療COXB3病毒感染的小鼠，發(fā)現(xiàn)在感染后第3天，10mg/kg組不抑制增高的NK細(xì)胞活性，20mg/kg和30mg/kg組使增高的NK細(xì)胞活性降低，在第8天時(shí)，10mg/kg組心肌壞死和炎癥浸潤較重。20mg/kg和30mg/kg組心肌壞死和炎癥浸潤明顯減輕，癥狀也有不同程度的改善。因此，早期應(yīng)用適當(dāng)劑量的槐果堿能抑制增高的NK細(xì)胞活性，減輕了NK細(xì)胞對(duì)心肌細(xì)胞的損傷。在以后的NK細(xì)胞活性進(jìn)行性下降階段可用槐果堿治療，增加NK細(xì)胞的活性，抵抗病毒的繁殖。并且，槐果堿能在心肌細(xì)胞內(nèi)抑制病毒的繁殖。在本發(fā)明的另一方面，發(fā)現(xiàn)小鼠在CoxB3病毒感染后，體內(nèi)干擾素(IFN)水平增加，這可能是由于病毒的誘導(dǎo)所致。在測(cè)試時(shí)發(fā)現(xiàn)，與其它組相比，槐果堿治療組干擾素水平更高，且隨劑量增加而顯著升高。提示槐果堿在體內(nèi)可誘生干擾素，從而參與機(jī)體抗病毒作用。此外，NK細(xì)胞常常與干擾素協(xié)同作用控制病毒感染，干擾素可能具有誘導(dǎo)NK細(xì)胞前體分化成為成熟的NK細(xì)胞，并促使NK細(xì)胞釋放更多的細(xì)胞因子等作用。圖1顯示了Echo病毒感染的Balb/c小鼠病毒性心肌炎模型的病理變化。其中，(A)顯示了Echo病毒模型組(10X10，HE染色)的情況，心膜外有鈣化、成片，并有少量炎癥細(xì)胞浸潤；(B)顯示了槐果堿30mg/kg治療組(10X10，HE染色)的情況，-僅有極少量炎癥細(xì)胞。圖2顯示了腺病毒感染的Balb/c小鼠病毒性心肌炎模型的病理變化。其中，圖2(A)顯示了腺病毒組(10X10，HE染色)的情況，管壁邊緣有一炎灶，成纖維細(xì)胞增生，心肌細(xì)胞空泡變性；圖2(B)顯示了槐果堿30mg/kg治療組(10XIO，HE染色)的情況，僅心外膜有少許炎癥細(xì)胞及少許成纖維細(xì)胞。圖3(A)顯示了10)LiM槐果堿對(duì)豚鼠心室乳頭肌細(xì)胞動(dòng)作電位的影響。圖3(B)顯示了不同濃度的槐果堿對(duì)豚鼠心室乳頭肌細(xì)胞動(dòng)作電位的影響。圖3(C)顯示了不同濃度槐果堿對(duì)豚鼠心室乳頭肌細(xì)胞動(dòng)作電位有效不應(yīng)期的影響。圖3(D)顯示了鹽酸胺碘酮對(duì)豚鼠心室肌動(dòng)作電位的影響。圖3(E)顯示了鹽酸胺碘酮對(duì)豚鼠心室肌動(dòng)作電位的有效不應(yīng)期影響。圖4(A)顯示了不同濃度的槐果堿對(duì)兔心竇房結(jié)細(xì)胞動(dòng)作電位的影響。圖4(B)顯示了50uM鹽酸胺碘酮對(duì)兔心竇房結(jié)細(xì)胞動(dòng)作電位的影響。圖5、圖6、圖7、圖8、圖9、圖10、圖11顯示了槐果堿對(duì)冠狀動(dòng)脈阻塞一再灌注犬心律失常的實(shí)驗(yàn)所測(cè)的心電圖(EKG)，圖12、圖13、圖14、圖15、圖16、圖17、圖18、圖19、圖20顯示了對(duì)空白對(duì)照的犬的相應(yīng)實(shí)驗(yàn)所測(cè)的心電圖(EKG)。圖21顯示了槐果堿對(duì)腺病毒所致肺部炎癥的影響；其中，圖21(A)顯示了病毒組小鼠(10X10，HE染色)在接種腺病毒后，肺泡與肺泡間的壁增厚，小支氣管間及旁有很多炎癥細(xì)胞；圖21(B)顯示了30mg/kg槐果堿治療組在治療后，肺泡與肺泡間的壁增厚明顯減輕，炎癥細(xì)胞減少。圖22顯示了不同劑量的槐果堿對(duì)病毒感染后8天心肌病變的影響。具體實(shí)施方式實(shí)施例l槐果堿的抗Echo病毒、腺病毒、流感乙型病毒的活性一.槐果堿注射液(在Hela及Vero細(xì)胞中)對(duì)Echo病毒及腺病毒的體外和體內(nèi)試驗(yàn)Hela及Vero細(xì)胞由上海第二醫(yī)科大學(xué)微生物教研室提供；Echo病毒9病毒株由中國科學(xué)院昆明醫(yī)學(xué)生物研究所趙樹棟提供；腺病毒7病毒株由北京302醫(yī)院病毒研究室冒盼勇提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Balb/c小鼠，34周齡，由上海中英合資西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。(證號(hào)152)1.槐果堿注射液.(在Hela及Vero細(xì)胞)抗Echo病毒及腺病毒的體外試驗(yàn)微量測(cè)定法測(cè)定槐果堿注射液(1%濃度)在Hela細(xì)胞上抗Echo病毒的作用(Echo病毒100TCID5Q)，結(jié)果見表l。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>微量測(cè)定法測(cè)定槐果堿注射液(1%濃度)在Vero細(xì)胞上抗Echo病毒的作用(Echo病毒100TCID50)，結(jié)果見表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>微量測(cè)定法測(cè)定槐果堿注射液(1%濃度)在Hela細(xì)胞上抗腺病毒的作用(腺病毒100TCID5Q)，結(jié)果見表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>微量測(cè)定法測(cè)定槐果堿注射液(1%濃度)在Vero細(xì)胞上抗腺病毒的作用(腺病毒100TCID5Q)，結(jié)果見表4。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>通過以上測(cè)定結(jié)果可見，當(dāng)1%槐果堿稀釋至i:8(即312yg)時(shí)，對(duì)Echo病毒發(fā)揮抗病毒作用，直至1:128(艮卩19.5ug)時(shí)仍能抑制Echo病毒在Hela及Vero細(xì)胞上致病變作用。當(dāng)1%槐果堿稀釋至1:8(即312ug)時(shí)，對(duì)腺病毒發(fā)揮抗病毒作用，直至1:64(即39wg)時(shí)仍能抑制腺病毒在Hela和Vero細(xì)胞上的致病變作用。2.Echo病毒性心肌炎體內(nèi)模型體內(nèi)模型的制'作Balb/c雄性小鼠34周齡50只，腹腔內(nèi)注射Echo病毒1000TCID0.1ml，造成Echo心肌炎模型。實(shí)驗(yàn)分三組正常對(duì)照組(N=10)、病毒感染組(N=10)、病毒感染+藥物組(N=30，10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg各10只，分別以0.1%、0.2%、禾卩0.3%槐果堿O.lml+生理鹽水0.1ml分二次尾靜脈注射，共七天)。感染后第8天將存活小鼠無菌眼眶取血(測(cè)中和抗體)，然后拉頸致死，取心臟做二方面實(shí)驗(yàn)，即心肌細(xì)胞懸液測(cè)TCID50，以及作病理切片檢查。(1)中和抗體的檢測(cè)用細(xì)胞病變法在Hela及Vero二種細(xì)胞上測(cè)三個(gè)不同劑量槐果堿(10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg)，結(jié)果見表5和表6。表5用Hela細(xì)胞測(cè)Echo病毒中和抗體血潔稀籽度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:512~~細(xì)胞對(duì)照病毒對(duì)照<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表6用Vero細(xì)胞測(cè)Echo病毒中和抗體<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>Echo病毒的中和抗體檢測(cè)結(jié)果表現(xiàn)為在Hela細(xì)胞測(cè)Echo病毒中和抗體，第8天是10mg/kg1:16陽性，20mg/kg1:32陽性，30mg/kg1:64陽性。與所用槐果堿劑量有關(guān)。在Vero細(xì)胞上測(cè)Echo病毒的中和抗體，第8天是10mg/kg1:16陽性，20mg/kgl:32陽性，30mg/kgl:64陽性。結(jié)果與Hela細(xì)胞相同，因?yàn)闀r(shí)間有限，僅測(cè)8天的中和抗體，估計(jì)時(shí)間延長，抗體會(huì)更高。(2)用TCID5。實(shí)驗(yàn)在Hela及Vero細(xì)胞上測(cè)Echo病毒感染心肌細(xì)胞懸液中的TCIDso，結(jié)果見表7和表8。'表7<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>Echo病毒治療組心肌勻漿中病毒滴度為10—3，病毒對(duì)照組心肌勻漿中病毒滴11度為10-5。治療組TCID5o比病毒對(duì)照組高2個(gè)稀釋度，提示槐果堿有抗Echo病毒的作用。(3)Echo病毒感染的Balb/c小鼠病毒性心肌炎模型的病理變化見圖1(A)和(B)。圖1(A)顯示了Echo病毒模型組(10X10，HE染色)的情況，心膜外由鈣化、成片，并有少量炎癥細(xì)胞浸潤；圖1(B)顯示了槐果堿30mg/kg治療組(10X10，HE染色)的情況，僅有極少量炎癥細(xì)胞。3.腺病毒性心肌炎體內(nèi)模型體內(nèi)模型的制作Balb/c雄性小鼠3~4周齡50只，腹腔內(nèi)注射腺病毒1000TCID0.1ml，造成腺病毒性心肌炎模型。實(shí)驗(yàn)分三組正常對(duì)照組(N=10);病毒感染組(N=10);病毒感染+藥物組(N=30，10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg各10只，分別以0.10/o、0.2%、和0.3%槐果堿O.lml+生理鹽水0.1ml分二次尾靜脈注射，共七天)。感染后第8天將存活小鼠無菌眼眶取血(測(cè)中和抗體)，然后拉頸致死取心臟做二方面實(shí)驗(yàn)，即心肌細(xì)胞懸液測(cè)TCID5。，以及作病理切片檢查。(1)中和抗體的檢測(cè)用細(xì)胞病變法在Hela及Vero二種細(xì)胞上測(cè)三個(gè)不同劑量槐果堿(10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg),測(cè)定結(jié)果見表9和表10。表9用Hela細(xì)胞測(cè)腺病毒中和抗體<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>_表10用Vero細(xì)胞測(cè)腺病毒中和抗體_<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>l:8陽性，20mg/kgl:16陽性，30mg/kgl:32陽性。與所用槐果堿劑量有關(guān)。在Vero細(xì)胞上測(cè)腺病毒的中和抗體，10mg/kg第8天是1:8陽性，20mg/kg1:16陽性，30mg/kgh32陽性。結(jié)果與Hela細(xì)胞相同，因?yàn)闀r(shí)間有限，僅測(cè)8天的中和抗體，估計(jì)時(shí)間延長，抗體會(huì)更高。(2)用TCID5o實(shí)驗(yàn)在Hela及Vero細(xì)胞上測(cè)腺病毒感染心肌細(xì)胞懸液中的TCID5Q，測(cè)定結(jié)果見表11和表12。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表12<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>腺病毒治療組心肌懸液中病毒滴度為10—4。病毒感染組心肌懸液中病毒滴度為10—5~10—6之間。治療組TCID5Q比病毒對(duì)照組高l-2個(gè)稀釋度，提示槐果堿對(duì)腺病毒有抑制作用。Hela細(xì)胞及Vero細(xì)胞相同。(3)腺病毒感染的Balb/c小鼠病毒性心肌炎模型的病理變化見圖2(A)和(B)。圖2(A)顯示了腺病毒組(10X10,HE染色)的情況，管壁邊緣有一炎灶，成纖維細(xì)胞增生，心肌細(xì)胞空泡變性；圖2(B)顯示了槐果堿30mg/kg治療組(10X10，HE染色)的情況，僅心外膜有少許炎癥細(xì)胞及少許成纖維細(xì)胞。二.槐果堿的抗流感甲、乙型病毒活性1.抗流感甲、乙型病毒活性篩選l以MDCK(狗腎)細(xì)胞為病毒宿主，測(cè)定樣品抑制病毒引起細(xì)胞病變程度(CPE)。選擇的毒株為流感甲型病毒(濟(jì)防190-15)、流感乙型病毒(濟(jì)防197-13)，在雞胚尿囊腔內(nèi)培養(yǎng)傳代，-8(TC保存。樣品處理樣品溶于DMSO，再用培養(yǎng)液配成適宜的初始濃度，用培養(yǎng)液作3倍稀釋，各8個(gè)稀釋度。陽性對(duì)照藥為病毒唑(RBV)，為浙江康裕藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。將MDCK細(xì)胞接種96孔培養(yǎng)板，置5%<:02，37。C培養(yǎng)24小時(shí)。MDCK細(xì)胞分別加入流感甲型病毒l(T43(10倍TCID5o)、流感乙型病毒10—23(10倍TCID5Q)，37t:吸附2小時(shí)后傾去病毒液，分別加入不同稀釋度藥物。設(shè)病毒對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照，37匸培養(yǎng)36小時(shí)。觀察結(jié)果，記錄CPE，計(jì)算各樣品抗流感病毒半數(shù)抑制濃度(IC5。)。測(cè)試結(jié)果見表13表13<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注"一"表示樣品在最大無毒劑量無抗流感病毒活性；TC5()表示藥物半數(shù)有毒濃度；1(35()表示藥物對(duì)病毒半數(shù)抑制濃度；SI表示選擇指數(shù)，SI=TC5。/IC5()。結(jié)果表明，樣品中118863有抗流感乙型病毒活性，ICM)分別為86.23，SI分別為2.68。2.抗流感甲、乙型病毒活性篩選2以MDCK(狗腎)細(xì)胞為病毒宿主，測(cè)定樣品抑制病毒引起細(xì)胞病變程度(CPE)。選擇的毒株為流感甲型病毒(濟(jì)防A/濟(jì)防/90-15)、流感乙型病毒(B/濟(jì)防/97-13)，在雞胚尿囊腔內(nèi)培養(yǎng)傳代，-8(TC保存。樣品處理樣品溶于DMSO，再用培養(yǎng)液配成適宜的初始濃度，用培養(yǎng)液作2倍稀釋，各16個(gè)稀釋度。陽性對(duì)照藥為病毒唑(RBV)，為浙江康裕藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。將MDCK細(xì)胞接種96孔培養(yǎng)板，置5%<:02，37'C培養(yǎng)24小時(shí)。MDCK細(xì)胞分別加入流感甲型病毒IO-3(10-100倍TCID50)、流感乙型病毒l(T2(10-100倍TCID5Q)，37X:吸附2小時(shí)后傾去病毒液，分別加入不同稀釋度藥物。設(shè)病毒對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照，37'C培養(yǎng)36小時(shí)。觀察結(jié)果，記錄CPE,計(jì)算各樣品抗流感病毒半數(shù)抑制濃度(IC5())。測(cè)試結(jié)果見表14。表14樣品編號(hào)TC50(Pg/ml)對(duì)流感甲型對(duì)流感乙型IC50(Pg/ml)SIIC50(lVml)SI118863231.12一—15.65614.79RBV>20001.62>1234.5718.97>105.43注"一"表示樣品在最大無毒劑量無抗流感病毒活性；TC5Q表示藥物半數(shù)有毒濃度；IQo表示藥物對(duì)病毒半數(shù)抑制濃度；SI表示選擇指數(shù)，SI=TC5。/IC5()。結(jié)果表明，樣品在31.25Pg/ml濃度時(shí)有抗流感乙型病毒活性，抑制率為75%，樣品在15.656Pg/ml濃度時(shí)有抗流感乙型病毒活性，抑制率為50%，樣品在7.81^/ml濃度時(shí)有抗流感乙型病毒活性，抑制率為25%。因此，樣品118863無抗流感甲型病毒活性，有抗流感乙型病毒活性。實(shí)施例2槐果堿的對(duì)抗心律失常的效果一.槐果堿對(duì)豚鼠心室乳頭肌動(dòng)作電位的影響運(yùn)用玻璃微電極記錄豚鼠心室乳頭肌動(dòng)作電位，觀察槐果堿對(duì)豚鼠心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的影響。受試藥物為槐果堿注射液(200mg/2ml)，在配制時(shí)，取出注射液加入適量的臺(tái)氏液，配置成不同濃度(luM、5uM、lOyM)。對(duì)照藥物為鹽酸胺碘酮注射液(0.15g/3ml)(杭州賽諾菲一圣德拉民生制藥有限公司)，在配制時(shí)，取去注射液加入適量的臺(tái)氏液，配制成100uM濃度。試驗(yàn)動(dòng)物選用200—300克，雌雄不拘，健康成年的豚鼠，由上海第二醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物部提供。豚鼠致昏后，開胸取出心臟，放在35"C臺(tái)氏液中(成分mmol/L:NaCl137;NaHC0323;MgCl20.5;KC15.4;CaCl21.8;NaH2PO40.4;葡萄糖10，pH7.4)'制備右心室乳頭肌標(biāo)本，并將其置于肌槽內(nèi)，槽內(nèi)溫度為34+0.5°C，用充以95%+5%0)2混合氣體的臺(tái)氏液灌流，pH7.4，灌流速度為5ml/min。標(biāo)本穩(wěn)定30min后，用刺激器(SEN7103,NihonKohden，JAPAN)刺激，刺激強(qiáng)度為1.5倍閾值，波寬lms，刺激頻率為lHz。用內(nèi)充3.0mol/L氯化鉀，電極電阻為15-20MQ的玻璃微電極穿剌，記錄動(dòng)作電位。ERP的測(cè)定每8個(gè)方波刺激后，加一個(gè)額外的刺激，逐漸改變其與前面正常刺激的時(shí)間間隔，測(cè)定額外刺激所引起的動(dòng)作電位與前面動(dòng)作電位之間的時(shí)間，以求ERP。信號(hào)通過微電極放大器(MEZ-7101，NihonKohden，JAPAN)放大后，分別在TEKTRONIX5al8N(USA)示波器監(jiān)視，同時(shí)輸入澳大利亞AD公司的Powerlab4s記錄系統(tǒng)進(jìn)行采樣。刺激30min，待動(dòng)作電位各參數(shù)穩(wěn)定后開始試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果由AD公司提供的Chart5分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)采用Origin統(tǒng)計(jì)軟件(Version6)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤表示。顯著性檢驗(yàn)方法采用配對(duì)t檢驗(yàn)，p<0.05即認(rèn)為有顯著性差異。試驗(yàn)結(jié)果如下a.槐樹堿對(duì)豚鼠心室乳頭肌動(dòng)作電位的影響1)槐果堿對(duì)動(dòng)作電位RP、APA、Vmax、APD5()、APD9()、APD咖的影響豚鼠乳頭肌細(xì)胞動(dòng)作電位記錄中，在灌流液內(nèi)加入濃度10uM的槐果堿后，約8min時(shí)起效應(yīng)，約15min后，作用達(dá)最大?；惫麎A使動(dòng)作電位的平臺(tái)期延長，即APD5o延長，與對(duì)照相比增加了近17.9%;同時(shí)動(dòng)作電位的-APD9()顯著延長，增加了22.3%;APD咖延長28.5%;Vmax下降29X;APA略下降，但無統(tǒng)計(jì)意義；RP無明顯變化。再用臺(tái)氏液灌洗，可使動(dòng)作電位基本恢復(fù)。圖3(A)為其中一例，具體數(shù)據(jù)見表1'5。表15不同濃度的槐果堿對(duì)豚鼠心室乳頭肌細(xì)胞動(dòng)作電位的影響表15<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>()內(nèi)為(槐果堿-control)/controlX100鬼的變化率碌示p<0.05，vscontrol氺氺表示p〈0.01，vscontrol200710129526.X勢(shì)溢齒被15/2m2)槐果堿對(duì)動(dòng)作電位不應(yīng)期的影響豚鼠乳頭肌細(xì)胞動(dòng)作電位記錄中，在灌流液內(nèi)加入濃度為10pM的槐果堿后，8min時(shí)起效應(yīng)，不應(yīng)期延長，約15min后，作用達(dá)最大。與對(duì)照相比延長25.9%，具體結(jié)果見表15。3)槐果堿的量效關(guān)系豚鼠乳頭肌細(xì)胞動(dòng)作電位記錄中，在灌流液內(nèi)依次加入濃度為l(iM、5pM、10|iM的槐果堿后，APD50、APD90、APD100均延長，Vmax下降，以上各指標(biāo)都呈濃度依賴性。具體數(shù)據(jù)見表15。圖3(B)為其中一例。在上述三個(gè)濃度中，ERP的延長也呈濃度依賴性，見圖3(C)。并且隨著濃度的增加，ERP的延長程度要略小于APD咖的延長的程度。b.鹽酸胺碘酮對(duì)豚鼠心室乳頭肌動(dòng)作電位的影響用上述同樣的方法，觀察100pM鹽酸胺碘酮對(duì)豚鼠心室乳頭肌動(dòng)作電位的RP、APA、Vmax、APD5()、APD90、APD,和ERP的影響。該藥物30分鐘后起效應(yīng)，35分鐘后效應(yīng)達(dá)到最大，APD50延長12%、APD卯延長11.7%、APDn)o延長18X、ERP延長15.6^;Vmax下降26.7%。圖3(D)，圖3(E)為其中一例。據(jù)圖數(shù)據(jù)見表16。表16鹽酸胺碘酮對(duì)豚鼠心室肌動(dòng)作電位的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>X±SE,n二5()，為(槐果堿-contr(")/controlX〗0Cm的變化率沐表示p《).05,vscontrol*水表示p<U.01，vsnonirol根據(jù)上述測(cè)定結(jié)果可見，(1)槐果堿可使O期上升速率下降，并呈濃度依賴性。提示其可能對(duì)鈉通道有抑制作用。(2)槐果堿可使APD50、APD90、APD100均延長，并呈濃度依賴性，提示其可能有抑制鉀外流的作用。(3)槐果堿可使ERP延長，呈濃度依賴性，這不僅與其延長動(dòng)作電位時(shí)程有關(guān)，可能也與其輕度抑制納通道作用有關(guān)(Vmax下降)。(4)槐果堿與鹽酸胺碘酮相比起效快、劑量小。二、槐果堿對(duì)兔竇房結(jié)細(xì)胞動(dòng)作電位的影響研究槐果堿對(duì)竇房結(jié)動(dòng)作電位波形和各測(cè)量參數(shù)的影響，同時(shí)比較其與同類藥物鹽酸胺碘酮作用的異同點(diǎn)。測(cè)試使用的槐果堿注射液為200mg/2ml，配制時(shí)，取出注射液加入適量的臺(tái)氏液，配制成不同濃度(0.02nM、0.1ixM、lnM)。同類藥物鹽酸胺碘酮產(chǎn)自杭州賽諾菲-圣德拉民主制藥有限公司，其規(guī)格為0.15g/3ml，配制時(shí)，取出注射液加入適量臺(tái)氏液，配制成50"M濃度。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用成年家兔，雌雄不拘。810周家兔，.雌雄不拘，擊昏后取出心臟，在35"C臺(tái)氏液(成分(mmol/L):NaCl140，KC15.4,CaCl21.8，MgCl21，Hepes5，葡萄糖10，pH7.4，通100%02)中制備帶有部分右心耳組織的竇房結(jié)標(biāo)本。標(biāo)本固定于恒溫(35.5±0.5°C)、恒流(3ml/min)標(biāo)本槽內(nèi)，以臺(tái)氏液灌流(成分同上)。待標(biāo)本自律性活動(dòng)穩(wěn)定后，用電阻為25MQ的內(nèi)充3mol/LKCL的玻璃微電極作竇房結(jié)細(xì)胞內(nèi)穿刺，記錄自律性動(dòng)作電位。記錄信號(hào)經(jīng)放大器(MEZ-7101，NihonKohden，JAPAN)放大后，分別在TEKTR0NIX5A18N(USA)示波器監(jiān)視，同時(shí)輸入澳大利亞AD公司的Powerlab4s記錄系統(tǒng)進(jìn)行采樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果由AD公司提供的Chart5分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)采用Origin統(tǒng)計(jì)軟件(Version6)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。顯著性檢驗(yàn)方法采用配對(duì)t檢驗(yàn)，p〈0.05即認(rèn)為有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果a.槐果堿對(duì)兔心竇房結(jié)細(xì)胞自律性動(dòng)作電位的影響兔心竇房結(jié)細(xì)胞動(dòng)作電位記錄中，在灌流液中加入不同濃度(0.02、0.1、1"M)的槐果堿后，約6分鐘后起效，IO分鐘后效應(yīng)達(dá)到最大。0.02uM槐果堿可使自律性興奮頻率(SEF)和4期自動(dòng)除級(jí)速率(SDVP4)減慢，動(dòng)作電位幅度(APA)減小，而動(dòng)作電位時(shí)程(APD5Q)、最大復(fù)級(jí)電位(MRP)、O期最大去極化速度(Vmax)均無明顯變化。O.luM槐果堿對(duì)APA、MRP、SEF、SDVP4均有抑制作用，APD50禾nV腿無明顯影響；lyM槐果堿使APD5o延長，其余各指標(biāo)均明顯減小。再用正常臺(tái)氏液灌流后，以上指標(biāo)基本可恢復(fù)，見圖4(A)，具體數(shù)據(jù)見表17。表17不同濃度的槐果堿對(duì)兔心竇房結(jié)細(xì)胞動(dòng)作電位參數(shù)的變化<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>b.鹽酸胺碘酮對(duì)兔心竇房結(jié)細(xì)胞動(dòng)作電位的影響兔心竇房結(jié)細(xì)胞動(dòng)作電位記錄中，在灌流液中加入50uM鹽酸胺碘酮后，約20分鐘后起效應(yīng)，30分鐘后效應(yīng)達(dá)到最大。該藥物使APA、MRP、SEF、SDVP4、V腿明顯減小，并使APD50明顯延長。再用臺(tái)氏液灌流后，以上制備略恢復(fù)，見圖4(B)，具體數(shù)據(jù)見表18。表1850yM鹽酸胺碘酮對(duì)兔心竇房結(jié)細(xì)胞動(dòng)作電位的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>(n=5，AP<0.05，vscontrol,*P<0.01，vscontrol)結(jié)果表明，(l)高濃度槐果堿可使O期上升速率下降，提示其可能對(duì)慢鈣(L)通道有抑制作用。(2)槐果堿可使4期自動(dòng)除極速率明顯下降，呈濃度依賴性，高濃度槐果堿使APD5o明顯延長，提示期可能有抑制鉀外流的作用。G)槐果堿可使竇房結(jié)的自律性發(fā)放頻率下降，呈濃度依賴性。(4)槐果堿與鹽酸胺碘酮相比起效快、劑量小、且對(duì)動(dòng)作電位各參數(shù)影響程度小、易恢復(fù)。三.槐果堿對(duì)冠狀動(dòng)脈阻塞——再灌注犬心律失常的實(shí)驗(yàn)1、對(duì)注射槐果堿的犬l的實(shí)驗(yàn)犬l體重10kg，麻醉后開胸，切開心包暴露心臟。靜脈注射槐果堿10mg/kg(溶于10ml生理鹽水中)，5分鐘推完，繼以每ml含0.1%槐果堿葡萄糖溶液每分鐘1.5ml的速度由靜脈恒速推注，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)^^。10分鐘后于14點(diǎn)32分結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，結(jié)扎后見心肌發(fā)紫但未見S-T段抬高反見壓低。15點(diǎn)28分心肌明顯發(fā)紫，S-T段抬高，未見心律失常。15點(diǎn)37分開放被結(jié)扎的左前降支，見到一次短室速，以后S-T短逐漸降低至正常且為室性心律。觀察至16點(diǎn)06分未見再灌流心律失常。詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見所測(cè)的心電圖(EKG)，即圖5、圖6、圖7、圖8、圖9、圖10、圖11。2、對(duì)空白對(duì)照的犬2的測(cè)定實(shí)驗(yàn)。犬2體重9,25kg，麻醉后開胸，切開心包暴露心臟。靜脈注射10ml生理鹽水，5分鐘推完，繼以每分鐘1.5ml生理鹽水的速度由靜脈恒速推注，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。10分鐘后于15點(diǎn)36分結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，見短陣室速三陣，以后S-T短逐漸抬高，出現(xiàn)室早三聯(lián)律，至16點(diǎn)11分時(shí)心肌顏色越來越紫，心臟擴(kuò)大，出現(xiàn)室壁瘤，心肌收縮呈矛盾運(yùn)動(dòng)。仍于16點(diǎn)18分開放結(jié)扎的冠狀動(dòng)脈，見室速、室顫等再灌流心律失常致死。.詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見所測(cè)的心電圖(EKG)，即圖12、圖13、圖14、圖15、圖16、圖17、圖18、圖19、圖20。實(shí)施例3槐果堿在制備治療Echo病毒、腺病毒、流感乙型病毒引起的肺部感染藥物方面的應(yīng)用引起人類肺炎的病毒主要有Echo病毒、流感病毒、副流感病毒、巨細(xì)胞病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒RSV、鼻病毒、冠狀病毒和某些腸道病毒等。腺病毒肺炎主要發(fā)病于幼兒中，主要經(jīng)呼吸道傳播。本發(fā)明的槐果堿也可對(duì)抗因Echo病毒、腺病毒和/或流感病毒引起的肺炎感染。在本發(fā)明的實(shí)施例1中，已經(jīng)詳細(xì)描述和驗(yàn)證了本發(fā)明的槐果堿注射液在體內(nèi)和體外均具有對(duì)抗腺病毒的活性。本發(fā)明還研究了槐果堿對(duì)腺病毒所致肺部炎癥的影響，發(fā)現(xiàn)病毒組小鼠(10X10，HE染色)在接種肺炎后，肺泡與肺泡間的壁增厚，小支氣管間及旁有很多炎癥細(xì)胞圖21(A);而30mg/kg槐果堿治療組在治療后，肺泡與肺泡間的壁增厚明顯減輕，炎癥細(xì)胞減少(圖21(B))。實(shí)施例4槐果堿在免疫調(diào)節(jié)方面的應(yīng)用一.槐果堿對(duì)小鼠柯薩奇B3m(COXB3m)心肌模型中Thy-l(CD3)、L3T4(CD4)、Ly-2(CD8)等T細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)以及對(duì)心肌內(nèi)COXB3m增殖的抑制作用受試藥物為100mg/2ml的槐果堿注射液，用無小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO)稀釋至1%濃度為母液，無菌低溫保存。臨用時(shí)用注射用水稀釋至所需濃度。病毒采用COXB3m，病毒為1(T4TCID5Q，一80。C保存。本例中使用的抗體為抗小鼠淋巴細(xì)胞Thy-l(CD3)、L3T4(CD4)、Ly-2(CD8)以及FITC標(biāo)記的熒光抗小鼠IgG抗體，均由北京醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室提供。1、槐果堿對(duì)T淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用1)動(dòng)物分組、病毒接種及給藥正常組N=15腹腔注射生理鹽水；病毒感染組N:34，Balb/c小鼠腹腔注射0.1mllO'4COXB3m1(T4TCID5()，于感染2小時(shí)后及第2天開始靜脈內(nèi)注射生理鹽水0.1ml二/天，共14天；槐果堿治療組N二26,Balb/c小鼠腹腔注射0.1mll(T4COXB3m10—4TCID50，于感染2小時(shí)后及第2天開始從尾靜脈內(nèi)注射30mg/kg槐果堿(0.3%，O.lml)，加等量生理鹽水分二次注射，共14天。2)淋巴細(xì)胞分離正常對(duì)照組、病毒感染組及槐果堿治療組均于接種后第3、5、7、10和14天小鼠，處死后均在無菌操作下打開腹腔，取出整個(gè)脾臟置于35mlHanks液的小皿中，用梅花針將其打成勻漿。經(jīng)銅網(wǎng)過濾后，將細(xì)胞懸液收集至圓底試管中，沿管壁緩緩注入4mlFicol-Metrizol液(比重1.088)，2000r/min離心25min，吸出"云霧層"單個(gè)核細(xì)胞，用5。/。FCS-PBS液(PH7.2~7.4)洗滌兩次，以臺(tái)盼蘭排斥試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活力，要求活力達(dá)到95%以上，最后用含10。/。FCS的RPMI-1640液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1X107/ml。3)T細(xì)胞亞群的測(cè)定采用但克隆抗體間接免疫熒光法，取上述細(xì)胞懸液0.1ml于小試管中，1000r/min離心5min，使細(xì)胞壓緊，棄上清液，分別加入單克隆抗體，充分混勻后置于4"作用30分鐘，然后用5%FSC-PBS液洗滌兩次，加熒光標(biāo)記二抗體(Thy-1用抗小鼠IgM)，再置于4。C作用30分鐘，用5%FSC-PBS液洗滌兩次，1000r/min離心7min，棄上清液，將細(xì)胞團(tuán)打散，加滴于載波片上，在Olympas萬能顯微鏡熒光油鏡下計(jì)算200只細(xì)胞中的熒光陽性細(xì)胞數(shù)。COXB3m病毒感染后T細(xì)胞亞群的變化，COXB3m病毒感染后不同天數(shù)的脾臟T細(xì)胞亞群變化見表19。表19<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>感染后第3天起脾臟的Thy-l、L3T4及Ly-2細(xì)胞均有不同程度的下降，與正常小鼠比較有顯著差異(P<0.05<0.001)。第7天以后各T細(xì)胞亞群有不同程度的回升，其中以Thy-l以及L3T4細(xì)胞較明顯，但直至第14天各T細(xì)胞亞群仍低于正常水平。CD"CDS比值在第7天起升高，第IO天與第14天雖有下降，但與正常小鼠比較仍偏高且有顯著差異(P<0.05)?；惫麎A治療組對(duì)COXB3m病毒感染后小鼠脾臟T細(xì)胞亞群在第314天間，在相應(yīng)時(shí)期所測(cè)得的T細(xì)胞亞群均比病毒對(duì)照組為高(P<0.05~0.005)，與正常對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)，而TVT8(L3T4+/LY+-2)比較則從第7天起顯著低于病毒對(duì)照組，與正常對(duì)照組比較無明顯差異(P>0.05)。說明槐果堿在COXB3m所致Balb/c病毒性心肌炎模型中能提高細(xì)胞免疫，并糾正T4/T8的比值，使免疫系統(tǒng)趨于正常，有利于心肌炎病變的控制。2、槐果堿對(duì)病毒感染后心臟中病毒抑制的影響心肌勻漿的制備病毒感染組與槐果堿治療組小鼠于第3、5、7、10和1423天處死，取出脾臟后，取第3天和第5天的病毒感染組和槐果堿治療組的心臟各5只，取出心臟稱其重量，用玻璃勻漿器將心臟碾成勻漿，每50gm心肌加MEMlml，反復(fù)凍融三次，8000rpm離心20min，取上清液經(jīng)氯仿處理滅菌，-30"保存?zhèn)溆谩Ｖ苽浼?xì)胞管將濃度為3Xl()S/ml的Hda細(xì)胞lml加入無菌的試管中，培養(yǎng)4天。標(biāo)本稀釋將上述心肌凍融液用MEM稀釋成1:10至1:1(T6。加樣將上述標(biāo)本稀釋液及原液0.1ml加入細(xì)胞管中，然后繼續(xù)培養(yǎng)。加樣每日觀察，連續(xù)觀察至第5天。半數(shù)細(xì)胞發(fā)生病變的最高稀釋度為病毒滴度(用TCIDs()表示)。結(jié)果見表20，以上二組相比，C0XB3m病毒感染組和槐果堿治療組小鼠心肌內(nèi)檢測(cè)結(jié)果顯示，病毒感染組的病毒滴度顯著高于槐果堿治療組(PO.001).表20槐果堿對(duì)心肌內(nèi)病毒復(fù)制的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>注表中數(shù)字為Log,t)TCID5o幾何平均數(shù)。上述所示槐果堿治療組第3天和第5天的心肌勻漿標(biāo)本中CVBLog1QTCID5()明顯低于病毒感染對(duì)照組，說明槐果堿對(duì)感染心肌中CVB3m的增殖有明顯的抑制作用。此次試驗(yàn)中病毒感染組第5、7天心臟的心肌壞死和炎癥細(xì)胞浸潤較重，而槐果堿治療組心臟病變較輕。因此，槐果堿除了具有抗病毒作用外，還有糾正感染CVB3m病毒小鼠的細(xì)胞免疫功能紊亂的作用，有利于病毒的控制。二.不同劑量槐果堿對(duì)小鼠病毒性心肌炎模型脾臟中自然殺傷細(xì)胞(NKcell)活性的動(dòng)態(tài)變化(調(diào)節(jié)作用)免疫功能異常是急性病毒性心肌炎的發(fā)病和轉(zhuǎn)變?yōu)閬喖毙孕募⊙谆蛐募⊙茁曰顒?dòng)期的重要原因。自然殺細(xì)胞——naturalKillcell(NK細(xì)胞)作為免疫效應(yīng)細(xì)胞，在病毒性心肌炎的發(fā)病過程中有重要作用。本例目的是借助Balb/c小鼠病毒性心肌炎模型探討槐果堿在病毒性心肌炎發(fā)病過程中對(duì)NK細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)作用觀察。本例中受試藥物為槐果堿注射液，規(guī)格為200mg/2ml，用無小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋至1%的濃度為母液，無菌低溫保存。臨用時(shí)用注射用水稀釋至0.3%、0.2%、0.1%。.本例中使用的C0XB3m病毒由上海第二醫(yī)科大學(xué)微生物教研室提供，病毒為10—6TCID5o，-S(TC保存。使用的Yac細(xì)胞由中國科學(xué)院上海細(xì)胞所提供。使用的純種Belb/c小鼠體重1822gm，由上海西普爾必凱有限公司提供。本例中使用的含5%FSC的PBS液是Gibco公司的產(chǎn)品；小牛血清由杭州四季青生物制品所提供；LDH底物混合物包含碘硝酸氨化四氮唑(INFFluka產(chǎn)品)、吩嗪二甲硝酸鹽(PMSScrva產(chǎn)品)、氧化型輔酶I(NADSigma產(chǎn)品)；使用的l%NP-40為Fluka產(chǎn)品。1、動(dòng)物分組以及病毒接種和用藥動(dòng)物分組將&5只Balb/c小鼠隨機(jī)分成5組正常對(duì)照組17只；病毒對(duì)照組17只；槐果堿治療組.-10mg/kg組17只；20mg/kg組17只；30mg/kg組17只。正常對(duì)照組腹腔注射生理鹽水0.1ml，二次/日。病毒對(duì)照組將0.1ml10—葉CID5o的COXB3m病毒一次注射小鼠腹腔，1小時(shí)后靜脈注射生理鹽水O.lml以后每日二次注射相同劑量的生理鹽水作為對(duì)照。10mg/kg組病毒接種同前，1小時(shí)后腹腔注射0.1%的槐果堿注射液O.lml加等量生理鹽水O.lml，混勻后分二次注射，以后每日二次注射同此劑量。20mg/kg組方法同10mg/kg，所不同的是槐果堿注射液的濃度改為0.2%。30mg/kg組方法同10mg/kg，將槐果堿注射液的濃度改為0.3%。在第3天時(shí)各取病毒對(duì)照組、槐果堿10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg組，各取5只小鼠處死，第8天時(shí)各處死6只，第12天時(shí)將上述各組剩余小鼠全部處死，取出脾臟及心臟備用。2、NK細(xì)胞測(cè)定主要參照王長安等介紹的乳酸脫氫酶(LDH)釋放法。小鼠處死后取出脾臟，置于35mlHanks液的小平皿中，用注射器針芯打成勻漿，銅網(wǎng)過濾，將細(xì)胞懸液沿試管管壁緩緩加入盛有4ml淋巴細(xì)胞分離液(比重1.088)的試管中，2000rpm離心20min，吸出"云霧層"單個(gè)核細(xì)胞，用含5。/。FSC的PBS液(PH7.2-7.4)洗滌細(xì)胞2次，用臺(tái)盼蘭染色檢測(cè)細(xì)胞活力，要求細(xì)胞活力》95%。用10%FSC的RPIM-1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度至3X106mi，作為效應(yīng)細(xì)胞。耙細(xì)胞用Yac細(xì)胞，效靶細(xì)胞比例為20:1。實(shí)驗(yàn)設(shè)NK測(cè)定管、自然釋放管和最大釋放管。用l%NP-40破壞靶細(xì)胞作為最大程度釋放。每個(gè)標(biāo)本作三個(gè)復(fù)孔，按表21加樣于96孔平低板。加畢混勻，1000rpm離心5min，置37。C含5%0)2孵箱中培養(yǎng)4小時(shí)，取出后每孔加冷1640培養(yǎng)液50ul，混勻，畫rpm離心5min,從各孔取上清液100ul，置另一96孔平底板中，每孔加100ul32匸預(yù)溫的LDH底物混合物，3min后加1NHC150ul中止反應(yīng)，置酶標(biāo)儀(Bio-Tek產(chǎn)品)中，在490nm波長下測(cè)各孔光密度(OD)值。表21NK細(xì)胞活性測(cè)定的加樣方法靶細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞牛血清蛋白(1640)1%NP-40NK測(cè)定管100ul100ul一一自然釋放管100ul—100ul—最大釋放管訓(xùn)ul一—訓(xùn)ul按下式計(jì)算NK細(xì)胞活性測(cè)定管OD值-自然fU文管OD值NK細(xì)胞活性°/。=-最大釋放管OD值-自然釋放OD值結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠感染COXB3m3天時(shí)，NK細(xì)胞活性顯著增加，之后進(jìn)行性下降，槐果堿治療組對(duì)NK活性有顯著影響，劑量不同，影響程度不同。10mg/kg槐果堿在感染第3天時(shí)對(duì)增高NK活性無影響，而20mg/kg和30mg/kg槐果堿組有明顯抑制作用。第8天時(shí)槐果堿對(duì)NK細(xì)胞活性影響不明顯，至第12天時(shí)，不同劑量的槐果堿均有增加NK細(xì)胞活性的作用。使NK細(xì)胞活性恢復(fù)正常水平，與正常組比較無明顯差異(P>0.05)，見表22。表22不同劑量槐果堿對(duì)小鼠感染后不同時(shí)間NK細(xì)胞活性的動(dòng)態(tài)變化_感染后天數(shù)_組另)j_^_^_^_正常對(duì)照組47.79士4.03.病毒對(duì)照組槐果堿治療組10mg/kg20mg/kg30mg/kg67.il±2.52$67.92±1.2154.88±1.2552.90±3.80卿56.28±5.5659.42±5.1057.27±5.6854.88±6.4942.26±1.61$45.91±2.51*49.37±4.0749.48±4.72注與正常對(duì)照組相比$P<0.001，與對(duì)應(yīng)天數(shù)病毒對(duì)照組相比，#P<0.05，##P<0.005，###P<0.001。3、心臟組織病毒滴度測(cè)定采用細(xì)胞致病效應(yīng)(CPE)法。將小鼠處死后，無菌操作取出心臟，每只心臟取相同重量，加入含4%FSC的1640培養(yǎng)液lml，用玻璃勻漿器將心臟碾成勻漿，1500rpm，離心15min,取上清液，-8(TC保存?zhèn)溆?，用?%FSC的1640培養(yǎng)液調(diào)Hela細(xì)胞濃度至2X105/ml，加入96孔平底板，每孔lOOul，在37'C含5%C02孵箱(Heraeus產(chǎn)品)中培養(yǎng)至細(xì)胞長成單層時(shí)，棄舊培養(yǎng)液，加入不同稀釋度(原液、1:2、1:10、1:102、1:104、1:105、1:106)的心肌勻漿，每個(gè)稀釋度作3個(gè)復(fù)孔，每孔100ul，并設(shè)細(xì)胞對(duì)照孔及病毒對(duì)照孔。在含5%(302孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。加樣后每日觀察至第5天，以50%細(xì)胞病變的最高稀釋度為心肌內(nèi)病毒滴度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，心肌內(nèi)病毒滴度(Logl()TCID50)感染后3天心肌內(nèi)病毒滴度最高，至第12天仍呈陽性，但滴度有所下降。治療組心肌內(nèi)亦呈陽性，但比對(duì)應(yīng)天數(shù)病毒對(duì)照組明顯降低，差異顯著。且劑量不同，心肌內(nèi)病毒滴度也不同。劑量越大，病毒滴度越低。10mg/kg組，在第3天的心肌病毒滴度較病毒組降低，差異有顯著性(<0.05)。在第8天和第12天時(shí)，雖亦有降低，但差異無顯著性00.05)。20mg/kg和30mg/kg槐果堿組心肌內(nèi)病毒滴度較對(duì)應(yīng)天數(shù)病毒對(duì)照組顯著降低，詳見表23。表23不同劑量槐果堿對(duì)小鼠感染后不同天數(shù)心肌內(nèi)COXB3m病毒滴度的影響感染后天數(shù)組別3812病毒對(duì)照組4.56±0.884.42±1.513.33±0.71$槐果堿治療組1Omg/kg3.44±0.88#3.67±0.502.83±0.7220mg/kg3.33±0.5##2.89±0.78#1.83±0.98##30mg/kg3.22土0.46弁湘2.56±0.88##1.19±1.33##注:$P<0.001與3天相比，#P<0.05，##P<0.005，###P<0.001與對(duì)應(yīng)天數(shù)相比。表23說明了槐果堿能抑制心肌細(xì)胞的CVB病毒的繁殖。實(shí)施例5槐果堿對(duì)感染CoxB3病毒小鼠的干擾素(IFN)水平的影響將槐果堿注射液(濃度為1%)加滅菌注射用水分別稀釋為0.3%、0.2%、0.1%三種濃度。CoxB3病毒由上海第二醫(yī)科大學(xué)微生物教研室提供，病毒原液效價(jià)為106TCID5()，-70°(:凍存。Balb/c純種雄性小鼠為8周齡，體重1820g，購自上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所純種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室。首先將動(dòng)物分組，將85只Balb/c小鼠隨即分為5組，正常對(duì)照組17只，病毒對(duì)照組17只，槐果堿治療組IO、20、30mg/kg組各17只。正常對(duì)照組用腹腔注射生理鹽水0.1ml，2次/d;病毒對(duì)照組將0.1mll03TCID50的CoxB3病毒1次《主射小鼠腹腔，lh后腹腔注射生理鹽水O.lml，以后2次/d注射生理鹽水作為對(duì)照；10mg/kg槐果堿組病毒注射同前，lh后腹腔注射O.P/。的槐果堿注射液O.lml，以后2次/d注射相同劑量的槐果堿注射液；20mg/kg槐果堿組病毒注射同前，槐果堿注射液濃度改為0.2%，其余同10mg/ml組；30mg/ml組病毒注射同前，槐果堿注射液濃度改為0.3%，其余同10mg/ml組。第3d時(shí)，每組各取5只小鼠處死。第8d時(shí)，再各取6只處。第12d時(shí)，將各組剩余鼠均處死。采用細(xì)胞致病效應(yīng)抑制法(CPE)進(jìn)行IFN測(cè)定。無菌操作下，將小鼠眼球摘除取血，置4。C冰箱數(shù)小時(shí)，離心取上清，以不同稀釋度(原液、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128)加入96孔平底板，每個(gè)稀釋度作3個(gè)復(fù)孔，每孔50P1。用含5%FCS的1640培養(yǎng)液調(diào)L929細(xì)胞濃度至4X105/ml，加入上述96孔板，每孔50iU。在37'C含5。/oC02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。棄舊培養(yǎng)液，加入水泡性口炎病毒(VSV)攻擊，每孔100ul。并設(shè)IFN標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照孔、細(xì)胞對(duì)照孔及病毒對(duì)照孔。在37X:含5%0)2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4872h。以能保護(hù)50%細(xì)胞存活的最大稀釋倍數(shù)的倒數(shù)作為IFN的活性單位(U/ml)。并且，還進(jìn)行了組織病理檢査，將心臟用10%甲醛固定，石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察結(jié)果。測(cè)定值以義土s表示，采用ANOVA檢驗(yàn)。P〈0.05為差異有顯著性。在注射相關(guān)注射液后，正常組無死亡。小鼠在病毒感染3d后開始發(fā)病，出現(xiàn)松毛、食欲減退、體重減輕等征象，第5d出現(xiàn)死亡，死亡集中在5—7d，共死亡5只?；惫麎A治療組小鼠征象有不同程度的改善，小鼠較活躍，皮毛較光滑，體重?zé)o明顯減輕；10mg/kg組在第5d死亡2只；20mg/kg組和30mg/kg組在第6d出現(xiàn)死亡，比病毒對(duì)照組推遲ld，各死亡1只。在CoxB3病毒感染后3d的IFN水平最高，之后逐漸下降，至感染12d時(shí)仍高于正常對(duì)照組(P〈0.0(H)?；惫麎A治療組IFN水平上升更為顯著，且與劑量有關(guān)。病毒感染后3d，隨槐果堿劑量增加，小鼠體內(nèi)工FN水平顯著增高，各劑量組之間差異顯著(P〈0.00D。在第12d時(shí)，槐果堿各劑量治療組的IFN水平仍高于病毒對(duì)照組(P<0.001)，見表24。表24不同劑量槐果堿對(duì)小鼠體內(nèi)干擾素水平的影響(U/ml，z±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>與健康組比較，*P<0.001;同一天與病毒感染組比較，**P<0.001。結(jié)果可知，病毒+a-干擾素為59.09u/ml。病理組織檢測(cè)可知，感染3d時(shí)心肌內(nèi)未有病變，第5d心肌內(nèi)已有炎癥浸潤，第8d病變最嚴(yán)重，心肌壞死和炎癥浸潤程度均較重，呈片狀，第12d已有減輕。第8d時(shí)槐果堿減輕心肌病變明顯，各治療組差異顯著(PO.Ol)，不同劑量的槐果堿對(duì)病毒感染后8d心肌病變的影響見圖22。權(quán)利要求1.槐果堿或其可藥用鹽在制備治療由流感乙型病毒引起的心肌炎及肺部炎癥的藥物中的應(yīng)用，其中，所述槐果堿的結(jié)構(gòu)式為(I)2.權(quán)利要求1所述的槐果堿或其可藥用鹽在制備治療由流感乙型病毒引起的心肌炎及肺部炎癥的藥物中的應(yīng)用，其中，所述的槐果堿的可藥用鹽為槐果堿的溴酸鹽、或者槐果堿的鹽酸鹽或者槐果堿的氟酸鹽。3.如權(quán)利要求1所述的槐果堿或其可藥用鹽在制備治療由流感乙型病毒引起的心肌炎及肺部炎癥的藥物中的應(yīng)用，其中，所述的藥物劑型為醫(yī)學(xué)上認(rèn)可的任何一種劑型。4.如權(quán)利要求3所述的槐果堿或其可藥用鹽在制備治療由流感乙型病毒引起的心肌炎及肺部炎癥的藥物中的應(yīng)用，其中，所述的藥物劑型為粉齊IJ、或者注射液、或者膠囊、或者片劑、或者口服液。全文摘要本發(fā)明公開了槐果堿或其可藥用鹽在制備治療由流感乙型病毒引起的心肌炎及肺部炎癥的藥物中的應(yīng)用，其中，所述的槐果堿的可藥用鹽為槐果堿的溴酸鹽、或者槐果堿的鹽酸鹽或者槐果堿的氟酸鹽，其中，所述的藥物劑型為醫(yī)學(xué)上認(rèn)可的任何一種劑型。本發(fā)明的槐果堿或其可藥用鹽能夠?qū)沽鞲胁《荆瑢?duì)流感乙型病毒的增殖有抑制作用。文檔編號(hào)A61K31/4353GK101134035SQ20071012952公開日2008年3月5日申請(qǐng)日期2004年12月10日優(yōu)先權(quán)日2004年12月10日發(fā)明者劉晶星,陳曙霞申請(qǐng)人:上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院