專利名稱：：槐果堿在制備治療腺病毒引起炎癥的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于藥學領(lǐng)域，涉及槐果堿的應(yīng)用，特別是槐果堿或其可藥用鹽在制備治療由腺病毒引起的心肌炎及肺部炎癥的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：槐果堿(sophocarpine)即從豆科槐屬植物苦參及豆科槐屬植物苦豆子中的干燥根及其地面部分中提取的有效單體，分子式為C15H22ON2，熔點為53—54"C，其結(jié)構(gòu)式為(I):病毒性心肌炎的發(fā)病與腸道病毒有密切的關(guān)系，其中尤以柯薩奇B病毒(RNA病毒)為多見?；惫麎A具有明顯對抗柯薩奇B病毒的功能，對柯薩奇B病毒性心肌炎有明顯的效果。關(guān)于槐果堿對抗柯薩奇B病毒及其藥物的制備已經(jīng)公幵在本申請人的一項己授權(quán)專利99119850.6中。此外，本申請的發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)了槐果堿可對抗冠狀病毒，相關(guān)技術(shù)內(nèi)容在本申請人的另一項專利申請03151269,0中有所描述。盡管本申請人先前己經(jīng)發(fā)現(xiàn)了槐果堿可對抗柯薩奇B病毒、冠狀病毒，但引起心肌炎尚有其它病毒，包括以下病毒1、柯薩奇A病毒，常是引起嬰兒心肌炎的原因。2、?？刹《?Echo-Vims)，其也可引起心肌炎，其中Echo9病毒目前被認為是COXA23，感染后可引起陣發(fā)性房性心動過速及房室傳導阻滯。3、腺病毒(Adeno-virus)，它是一種核內(nèi)復制的單一DNA病毒，近年來認為它可能是病毒性心肌炎的重要原因之一。曾有學者報導在臨床確診的急性病毒性心肌炎患者的心肌活檢標本中用PCR的方法可檢出腺病毒的病毒基因，其檢出率甚至比腸道病毒高1倍(而且僅為腺病毒，未發(fā)現(xiàn)其它病毒)。目前認為腸道病毒是小兒心肌炎的主要原因，可引起非典型性肺炎或心肌炎。臨床上常無癥狀且更易持續(xù)感染，從而導致擴張型心肌病或心內(nèi)膜彈力纖維增生癥。4、流感病毒，它是RNA呼吸道病毒，除引起呼吸道感.染外，也可引起心肌炎。這都是十分重要的。本申請的發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，槐果堿除了可對抗柯薩奇B病毒、冠狀病毒以外，對于上述的Echo病毒、腺病毒、流感病毒(流感病毒B)都是有作用的。在病毒性心肌炎階段，炎癥細胞浸潤可分為二個時相，第一時相即病毒感染后37天，主要為巨噬細胞和NK細胞侵入心肌并達到高峰。第二時相即為病毒感染后714天，T細胞替代巨噬細胞和NK細胞成為主要浸潤細胞。NK細胞是一類和T、B細胞和巨噬細胞具有明顯不同的淋巴細胞，能識別多種抗原決定簇，不需致敏即可直接殺傷靶細胞，而且活性不受主要組織相容性復合物(MHC)限制，因此，NK細胞可在特異性CTL產(chǎn)生前發(fā)揮抗病毒作用。許多研究發(fā)現(xiàn)在COXB3感染第3天時，NK細胞的非特異性細胞毒性作用增強，不僅可殺傷病毒感染細胞，也可直接殺傷未經(jīng)病毒感染的細胞，因此設(shè)想NK細胞可能參與了COXB3誘導的心肌炎發(fā)病過程。本申請的發(fā)明人在研究中還發(fā)現(xiàn)，槐果堿對NK細胞活性有雙向調(diào)節(jié)作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的問題在于提供槐果堿或其可藥用鹽在制備治療由腺病毒引起的心肌炎及肺部炎癥的藥物中的應(yīng)用，所述槐果堿的結(jié)構(gòu)式為(1)。進一步的，所述的槐果堿的可藥用鹽為槐果堿的溴酸鹽、槐果堿的鹽酸鹽或者槐果堿的氟酸鹽。進一步的，所述的槐果堿的可藥用鹽的藥物的劑型為醫(yī)學上認可的任何一種劑型。.具體的，所述的藥物的劑型為粉劑、或者注射液、或者膠囊、或者片劑、或者口服液?；惫麎A不但有靜脈注射液，還有粉劑、口服液、膠囊以及片劑?？诜苿┡c靜脈用藥在人體內(nèi)藥代動力學及生物利用度比較，二種制劑的體內(nèi)過程均符合二室模型?？诜旱难簼舛菴max較低于靜脈注射液，達峰時間Tmax也相對延長，其參數(shù)T1/2P、KIO、cLs、Auc等無顯著差異(P〉0.05)，表明口服制劑及靜脈注射制劑t種劑型具有生物等效性，F(xiàn)為80—85%。本發(fā)明所述的槐果堿藥物的制備可參考常規(guī)的藥物配制方法，在知道了所需藥物的給藥劑量以后，藥物的配制是本
技術(shù)領(lǐng)域：
人員所熟知的?；惫麎A藥物的一種配制方法可參考本申請人之前的已授權(quán)專利99119850.6。在本發(fā)明的一個方面，本申請的發(fā)明人利用兩種細胞(Hela細胞及Vero細胞)，作了槐果堿對抗Echo病毒及腺病毒的體外及體內(nèi)病毒試驗，發(fā)現(xiàn)它對Echo病毒及腺病毒的增殖均有對抗作用?；惫麎A對抗Echo病毒及腺病毒的體外測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當1%槐果堿稀釋至1:8(即312ug)時，對Echo病毒發(fā)揮抗病毒作用，直至1:128(即19.5ug)時仍能抑制Echo病毒在Hela及Vero細胞上致病變作用。當1%槐果堿稀釋至1:8(即312ug)時，對腺病毒發(fā)揮抗病毒作用，直至1:64(即3'9、g)時仍能抑制腺病毒在Hela和Vero細胞上的致病變作用。槐果堿對抗Echo病毒及腺病毒的體內(nèi)測定具體可見下文實施例的描述。在本發(fā)明的另一個方面，驗證了槐果堿能夠?qū)沽鞲胁《?，體外試驗發(fā)現(xiàn)槐果堿對于流感乙型病毒的增殖有抑制作用。當濃度樣品在31.25ug/ml濃度時有抗流感病毒活性，抑制率為75%，樣品在15.625ug/ml濃度時有抗流感乙型病毒，抑制率為50%，樣品在7.81ug/ml濃度時有抗流感病毒活性，抑制率為25%，具體見下面實施例中的相關(guān)描述。在本發(fā)明的另一方面，本申請的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，槐果堿還有抗心律失常的作用。在離體豚鼠心室乳頭肌細胞動作電位的研究中，發(fā)現(xiàn)第一，槐果堿能使0期上升速度下降，并呈濃度依賴性，可能對鈉通道有抑制作用；第二，槐果堿可使APD5。、APD9Q、APD,均延長，并呈濃度依賴性，可能有抑制鉀外流作用；第三，槐果堿可能使ERP延長，并呈濃度依賴性，這不僅與其延長動作電位時程有關(guān)，可能也與其輕度抑制鈉通道有關(guān)(Vmax下降)。第四，槐果堿與鹽酸胺碘酮相比，起效快，劑量小。在槐果堿對兔竇房結(jié)細胞動作電位的影響的研究中，發(fā)現(xiàn)第一，高濃度槐果堿可使0期上升速度下降，提示其可能對慢鈣(L)通道有抑制作用；第二，槐果堿可使4期自動除極速率明顯下降，并呈濃度依賴性；高濃度槐果堿使APD50明顯延長，提示有可能抑制鉀外流的作用；第三，槐果堿可使竇房結(jié)的自律性發(fā)生放頻率下降，呈濃度依賴性；第四，槐果堿與鹽酸胺碘酮相比，起效快，劑量小，且對動作電位各參數(shù)影響程度小，易恢復。在槐果堿對冠狀動脈阻塞——再灌注犬心律失常的實驗中，發(fā)現(xiàn)在用10mg/kg靜脈注射并以維持量靜脈點滴的情況下，結(jié)扎冠狀動脈后l小時，打開結(jié)扎線未見有再灌注室性顫動，說明槐果堿具有對抗冠狀動脈阻塞——再灌注誘發(fā)心律失常作用。而以生理鹽水取代槐果堿后再結(jié)扎冠狀動脈后1小時，打開結(jié)扎線后——都發(fā)生再灌注室性顫動，以致死亡。在本發(fā)明的另一方面，發(fā)現(xiàn)槐果堿對腺病毒所致肺部炎癥有抑制作用，病毒組小鼠在接種腺病毒后，肺泡與肺泡間的壁增厚，小支氣管間及旁有很多炎癥細胞；而槐果堿治療組在治療后，肺泡與肺泡間的壁增厚明顯減輕，炎癥細胞減少。本申請的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，槐果堿能夠調(diào)節(jié)免疫功能。病毒性心肌炎的發(fā)病原因，除了病毒直接侵犯心肌以外，還有機體的免疫反應(yīng)的參與，其中T淋巴細胞的功能尤為重要，如CD3+、CD4+、CD8+等類型有明顯表現(xiàn)。CD3+為總淋巴細胞，CD8+為殺傷性淋巴細胞(Ts)，它對抗原的反應(yīng)是將靶細胞溶解，具有病毒抑制和損傷心肌的雙重作用。CD4+為輔助淋巴細胞(Th)，作用于B細胞能提高體液免疫的功能。在殺傷性T細胞和巨噬細胞激活或增生過程中發(fā)揮重要作用。但兩者的活性均受主要組織相容性復合因子(MHC)所激活與限制。CD8+與MHC-I有關(guān)，CD4+與MHC-II有關(guān)。在正常情況下二者功能趨于動態(tài)平衡。病毒感染后則發(fā)生變化。臨床所見病毒性心肌炎患者中，免疫功能低下，尤其對于反復發(fā)作者。為此，本申請的發(fā)明人借助Balb/c小鼠COXB3m病毒性心肌炎模型，研究感染后不同天數(shù)小鼠脾臟T細胞亞群的變化以及槐果堿對其影響，以及研究槐果堿對感染后小鼠勻漿中COXB3m病毒增殖的抑制情況。在本發(fā)明的一個實施方式中，通過研究槐果堿對小鼠柯薩奇B3m心肌炎模型中Thy-l(CD3)、L3T4(CD4)、Ly-2(CD8)等T細胞免疫的調(diào)節(jié)以及對心肌內(nèi)COX3m增殖的抑制作用，進行了槐果堿對免疫功能的調(diào)節(jié)及提高方面的研究，研究其是否有助于心肌炎的恢復。用單克隆抗體間接免疫熒光法測定病毒感染后不同天數(shù)小鼠脾臟T細胞亞群。結(jié)果顯示(l)病毒感染組:脾臟的Thy-l(CD3)、L3T4(CD4^Ly-2(CD8)細胞在感染后第3天起開始明顯下降，直至第14天各點所測的值顯著低于正常組(P<0.050.001)。CD4/CD8比值從感染后7天的2.08±0.97上升到14天的2.65±0.58，明顯高于槐果堿治療組(P〈0.01)。CD4/CD8比值的升高說明疾病在發(fā)展，(2)槐果堿的治療組則均高于病毒感染組與正常對照組相比無差異。還測定了槐果堿對感染后模型心肌勻漿中病毒的抑制作用。病毒組在感染不同天數(shù)心肌勻漿中CVXB3mLogTCIDso未見減少，而槐果堿治療組從第3天開始，第5天、7天及14天的心肌勻漿中CVXB3mLogTCIDso明顯減少，PO.OOl。說明免疫功能提高后更有助于槐果堿對心肌內(nèi)病毒的抑制作用。本發(fā)明的另一方面，在COXB3病毒性心肌炎模型的基礎(chǔ)上，探討了槐果堿對病毒感染小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。小鼠在感染COXB3病毒后，經(jīng)組織證實均發(fā)生心肌炎，但在發(fā)病過程中，NK細胞活性有動態(tài)變化，在病毒感染后3天，NK細胞活性顯著增高，繼之進行性下降，12天時低于正常水平?；惫麎A對NK細胞活性有雙向調(diào)節(jié)作用。本申請的發(fā)明人用10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg不同劑量的槐果堿治療COXB3病毒感染的小鼠，發(fā)現(xiàn)在感染后第3天，10mg/kg組不抑制增高的NK細胞活性，20mg/kg和30mg/kg組使增高的NK細胞活性降低，在第8天時，10mg/kg組心肌壞死和炎癥浸潤較重。20mg/kg和30mg/kg組心肌壞死和炎癥浸潤明顯減輕，癥狀也有不同程度的改善。因此，早期應(yīng)用適當劑量的槐果堿能抑制增高的NK細胞活性，減輕了NK細胞對心肌細胞的損傷。在以后的NK細胞活性進行性下降階段可用槐果堿治療，增加NK細胞的活性，抵抗病毒的繁殖。并且，槐果堿能在心肌細胞內(nèi)抑制病毒的繁殖。在本發(fā)明的另一方面，發(fā)現(xiàn)小鼠在CoxB3病毒感染后，體內(nèi)干擾素(IFN)水平增加，這可能是由于病毒的誘導所致。在測試時發(fā)現(xiàn)，與其它組相比，槐果堿治療組干擾素水平更高，且隨劑量增加而顯著升高。提示槐果堿在體內(nèi)可誘生干擾素，從而參與機體抗病毒作用。此外，NK細胞常常與干擾素協(xié)同作用控制病毒感染，干擾素可能具有誘導NK細胞前體分化成為成熟的NK細胞，并促使NK細胞釋放更多的細胞因子等作用。圖1顯示了Echo病毒感染的Balb/c小鼠病毒性心肌炎模型的病理變化。其中，(A)顯示了Echo病毒模型組(10X10，HE染色)的情況，心膜外有鈣化、成片，'并有少量炎癥細胞浸潤；(B)顯示了槐果堿30mg/kg治療組(10X10，HE染色)的情況，僅有極少量炎癥細胞。圖2顯示了腺病毒感染的Balb/c小鼠病毒性心肌炎模型的病理變化。其中，圖2(A)顯示了腺病毒組(10X10，HE染色)的情況，管壁邊緣有一炎灶，成纖維細胞增生，心肌細胞空泡變性；圖2(B)顯示了槐果堿30mg/kg治療組(10XIO，HE染色)的情況，僅心外膜有少許炎癥細胞及少許成纖維細胞。圖3(A)顯示了10pM槐果堿對豚鼠心室乳頭肌細胞動作電位的影響。圖3(B)顯示了不同濃度的槐果堿對豚鼠心室乳頭肌細胞動作電位的影響。圖3(C)顯示了不同濃度槐果堿對豚鼠心室乳頭肌細胞動作電位有效不應(yīng)期的影響。圖3(D)顯示了鹽酸胺碘酮對豚鼠心室肌動作電位的影響。圖3(E)顯示了鹽酸胺碘酮對豚鼠心室肌動作電位的有效不應(yīng)期影響。圖4(A)顯示了不同濃度的槐果堿對兔心竇房結(jié)細胞動作電位的影響。圖4(B)顯示了50uM鹽酸胺碘酮對兔心竇房結(jié)細胞動作電位的影響。圖5、圖6、圖7、圖8、圖9、圖10、圖11顯示了槐果堿對冠狀動脈阻塞一再灌注犬心律失常的實驗所測的心電圖(EKG)，圖12、圖13、圖14、圖15、圖6、圖7、圖18、圖19、圖20顯示了對空白對照的犬的相應(yīng)實驗所測的心電圖(EKG)。圖21顯示了槐果堿對腺病毒所致肺部炎癥的影響；其中，圖21(A)顯示了病毒組小鼠(10X10，HE染色)在接種腺病毒后，肺泡與肺泡間的壁增厚，小支氣管間及旁有很多炎癥細胞；圖21(B)顯示了30mg/kg槐果堿治療組在治療后，肺泡與肺泡間的壁增厚明顯減輕，炎癥細胞減少。圖22顯示了不同劑量的槐果堿對病毒感染后8天心肌病變的影響。具體實施方式實施例l槐果堿的抗Echo病毒、腺病毒、流感乙型病毒的活性—.槐果堿注射液(在Hela及Vero細胞中)對Echo病毒及腺病毒的體外和體內(nèi)試驗Hela及Vero細胞由上海第二醫(yī)科大學微生物教研室提供；Echo病毒9病毒株由中國科學院昆明醫(yī)學生物研究所趙樹棟提供；腺病毒7病毒株由北京302醫(yī)院病毒研究室冒盼勇提供。實驗動物Balb/c小鼠，34周齡，由上海中英合資西普爾必凱實驗動物有限公司提供。(證號152)1.槐果堿注射液(在Hda及Vero細胞)抗Echo病毒及腺病毒的體外試驗微量測定法測定槐果堿注射液(1%濃度)在Hda細胞上抗Echo病毒的作用(Echo病毒100TCID5O)，結(jié)果見表1。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>微量測定法測定槐果堿注射液(1%濃度)在Vero細胞上抗腺病毒的作用(腺病毒100TCID5Q)，結(jié)果見表4。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>通過以上測定結(jié)果可見，當1%槐果堿稀釋至1:8(即312tig)時，對Echo病毒發(fā)揮抗病毒作用，直至1:128(即19.5ug)時仍能抑制Echo病毒在Hela及Vero細胞上致病變作用。當1%槐果堿稀釋至1:8(即312ng)時，對腺病毒發(fā)揮抗病毒作用，直至1:64(即39ug)時仍能抑制腺病毒在Hela和Vero細胞上的致病變作用.。2.Echo病毒性心肌炎體內(nèi)模型體內(nèi)模型的制作Balb/c雄性小鼠34周齡50只，腹腔內(nèi)注射Echo病毒1000TCID0.1ml，造成Echo心肌炎模型。實驗分三組正常對照組(N-IO)、病毒感染組(N=10)、病毒感染+藥物組(N-30,10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg各10只，分別以0.1%、0.2%、和0.3%槐果堿O.lml+生理鹽水O.lml分二次尾靜脈注射，共七天)。感染后第，天將存活小鼠無菌眼眶取血(測中和抗體)，然后拉頸致死，取心臟做二方面一實驗，即心肌細胞懸液測TCID5Q，以及作病理切片檢査。(1)中和抗體的檢測用細胞病變法在Hela及Vero二種細胞上測三個不同劑量槐果堿(10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg)，結(jié)果見表5和表6。表5用Hela細胞測Echo病毒中和抗體<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表6用Vero細胞測Echo病毒中和抗體血潔稀稈皮~~1:21:4j:81:161:321:641:1281:2561:512細胞對照病毐對照10mg/kg——++++一+20mg/kg——+一+++—+Echo病毒的中和抗體檢測結(jié)果表現(xiàn)為在Hela細胞測Echo病毒中和抗體，第8天是10mg/kg1:16陽性，20mg/kgh32陽性，30mg/kgl:64陽性。與所用槐果堿劑量有關(guān)。在Vero細胞上測Echo病毒的中和抗體，第8天是10mg/kg1:16陽性，20mg/kgl:32陽性，30mg/kgl:64陽性。結(jié)果與Hela細胞相同，因為時間有限，僅測8天的中和抗體，估計時間延長，抗體會更高。(2)用TCID.so實驗在Hela及Vero細胞上測Echo病毒感染心肌細胞懸液中的TCIDs。，結(jié)果見表7和表8。表7Hela細胞病變孔數(shù)標本稀釋度總細胞孔數(shù)10-2l(T3l(T4l(T5l(T610-7l(T810mg/kg4/42/40/40/40/40/40/420mg/kg4/42/40/40/40/40/40/430mg/kg4/42/40/40/40/40/40/4Echo病毒組4/44/44/42/40/40/40/4正常對照組0/40/40/40/40/40/40/4表8Vero細胞病變孔數(shù)標本稀釋度總細胞孔數(shù)l(T2l(T310-4l(T5l(T610-710-810mg/kg4/42/40/40/40/4,0/40/420mg/kg4/42/40/40/40/40/40/430mg/kg4/42/40/40/40/40/40/4Echo病毒組4/44/44/42/40/40/40/4正常對照組0/40/40/40/40/40/40/4Echo病毒治療組心肌勻漿中病毒滴度為l(T3，病毒對照組心肌勻漿中病毒滴度為l(T5。治療組TCID5o比病毒對照組高2個稀釋度，提示槐果堿有抗Echo病毒的作用。(3)Echo病毒感染的Balb/c小鼠病毒性心肌炎模型的病理變化見圖1(A)和(B)。圖1(A)顯示了Echo病毒模型組(10X10，HE染色)的情況，心膜外由鈣化、成片，并有少量炎癥細胞浸潤；圖1(B)顯示了槐果堿30mg/kg治療組(10X10，HE染色)的情況，僅有極少量炎癥細胞。3.腺病毒性心肌炎體內(nèi)模型體內(nèi)模型的制作Balb/c雄性小鼠3~4周齡50只，腹腔內(nèi)注射腺病毒1000TCID0.1ml，造成腺病毒性心肌炎模型。實驗分三組正常對照組(N-10);病毒感染組(N-10);病毒感染+藥物組(N-30，10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg各10只，分別以0.1%、0.2%、禾卩0.3%槐果堿O.lml+生理鹽水O.lml分二次尾靜脈注射，共七天)。感染后第8天將存活小鼠無菌眼眶取血(測中和抗體)，然后拉頸致死取心臟做二方面實驗，即心肌細胞懸液測TCID5。，以及作病理切片檢査。(1)中和抗體的檢測用細胞病變法在Hda及Vero二種細胞上測三個不同劑量槐果堿(10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg)，測定結(jié)果見表9和表10。表9用Hda細胞測腺病毒中和抗體<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表10用Vero細胞測腺病毒中和抗體_<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>腺病毒的中和抗體檢測結(jié)果在Hda細胞測腺病毒中和抗體，10mg/lcg第8天是h8陽性，20mg/kgl:16陽性，30mg/kgh32陽性。與所用槐果堿劑量有關(guān)。在Vero細胞上測腺病毒的中和抗體，10mg/kg第8天是h8陽性，20mg/kg1:16陽性，30mg/kgl:32陽性。結(jié)果與Hda細胞相同，因為時間有限，僅測8天的中和抗體，估計時間延長，抗體會更高。(2)用TCID5o實驗在Hela及Vero細胞上測腺病毒感染心肌細胞懸液中的TCID5Q，測定結(jié)果見表11和表12。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>腺病毒治療組心肌懸液中病毒滴度為io'4。病毒感染組心肌懸液中病毒滴度為10—5~10—6之間。治療組TCID5o比病毒對照組高12個稀釋度，提示槐果堿對腺病毒有抑制作用。Hda細胞及Vero細胞相同。(3)腺病毒感染的Balb/c小鼠病毒性心肌炎模型的病理變化見圖2(A)和(B)。圖2(A)顯示了腺病毒組(10X10，HE染色)的情況，管壁邊緣有一炎灶，成纖維細胞增生，心肌細胞空泡變性；圖2(B)顯示了槐果堿30mg/kg治療組(10X10，HE染色)的情況，僅心外膜有少許炎癥細胞及少許成纖維細胞。二.槐果堿的抗流感甲、乙型病毒活性I.抗流感甲、乙型病毒活性篩選l以MDCK(狗腎)細胞為病毒宿主，測定樣品抑制病毒引起細胞病變程度(CPE)。選擇的毒株為流感甲型病毒(濟防190-15)、流感乙型病毒(濟防197-13)，在雞胚尿囊腔內(nèi)培養(yǎng)傳代，-S(TC保存。樣品處理樣品溶于DMSO，再用培養(yǎng)液配成適宜的初始濃度，用培養(yǎng)液作3倍稀釋，各8個稀釋度。陽性對照藥為病毒唑(RBV)，為浙江康裕藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。將MDCK細胞接種96孔培養(yǎng)板，置5%<:02，37"C培養(yǎng)24小時。MDCK細胞分別加入流感甲型病毒10—43(10倍TCID5o)、流感乙型病毒10—23(10倍TCID5Q)，37'C吸附2小時后傾去病毒液，分別加入不同稀釋度藥物。設(shè)病毒對照和細胞對照，37。C培養(yǎng)36小時。觀察結(jié)果，記錄CPE，計算各樣品抗流感病毒半數(shù)抑制濃度(IC50)。測試結(jié)果見表13___________樣品編號TC50(Pg/ml)對流感甲型___對流感乙型IC50(Pg/ml)SIIC50(Mg/ml)SI118863231.12—一86.232.68RBV〉1000_^_>342.46_^_〉263.16注"一"表示樣品在最大無毒劑量無抗流感病毒活性；TC5Q表示藥物半數(shù)有毒濃度；IC5。表示藥物對病毒半數(shù)抑制濃度；SI表示選擇指數(shù)，SI=TC5G/IC50。結(jié)果表明，樣品中118863有抗流感乙型病毒活性，IQo分別為86.23，SI分別為2.68。2.抗流感甲、乙型病毒活性篩選2以MDCK(狗腎)細胞為病毒宿主，測定樣品抑制病毒引起細胞病變程度(CPE)。選擇的毒株為流感甲型病毒(濟防A/濟防/90-15)、流感乙型病毒(B/濟防/97-13)，在雞胚尿囊腔內(nèi)培養(yǎng)傳代，-S(TC保存。樣品處理樣品溶于DMSO，再用培養(yǎng)液配成適宜的初始濃度，用培養(yǎng)液作2倍稀釋，各16個稀釋度。陽性對照藥為病毒唑(RBV)，為浙江康裕藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。將MDCK細胞接種96孔培養(yǎng)板，g5%C02，37T:培養(yǎng)24小時。MDCK細胞分別加入流感甲型病毒10—3(10-100倍TCID50)、流感乙型病毒l(T2(10-100倍TCID5Q)，37。C吸附2小時后傾去病毒液，分別加入不同稀釋度藥物。設(shè)病毒對照和細胞對照，37'C培養(yǎng)36小時。觀察結(jié)果，記錄CPE，計算各樣品抗流感病毒半數(shù)抑制濃度(IC5Q)。測試結(jié)果見表14。__樣品編號TC5o(Pg/ml)對流感甲型_對流感乙型IC50(Pg/ml)SIIC50((Vml)SI118863231.12—一15.65614.79RBV_〉20001.62>1234.5718.97>105.43注"一"表示樣品在最大無毒劑量無抗流感病毒活性；TC5Q表示藥物半數(shù)有毒濃度；IC5o表示藥物對病毒半數(shù)抑制濃度；SI表示選擇指數(shù)，SI=TC5Q/IC5Q。結(jié)果表明，樣品在31.25Pg/ml濃度時有抗流感乙型病毒活性，抑制率為75%，樣品在15.656Pg/iiil濃度時有抗流感乙型病毒活性，抑制率為&%，樣品在7.81P名/ml濃度時有抗流感乙型病毒活性，抑制率為25%。因此，樣品118863無抗流感甲型病毒活性，有抗流感乙型病毒活性。實施例2槐果堿的對抗心律失常的效果一.槐果堿對豚鼠心室乳頭肌動作電位的影響運用玻璃微電極記錄豚鼠心室乳頭肌動作電位，觀察槐果堿對豚鼠心肌細胞動作電位的影響。受試藥物為槐果堿注射液(200mg/2mi:)，在配制時，取出注射液力卩入適量的臺氏液，配置成不同濃度(luM、5uM、10uM)。對照藥物為鹽酸胺碘酮注射液(0.15g/3ml)(杭州賽諾菲一圣德拉民生制藥有限公司)，在配制時，取去注射液加入適量的臺氏液，配制成100uM濃度。試驗動物選用200—300克，雌雄不拘，健康成年的豚鼠，由上海第二醫(yī)科大學試驗動物部提供。豚鼠致昏后，開胸取出心臟，放在35X:臺氏液中(成分mmol/L:NaCl137;NaHC0323;MgCl20.5;KC15.4;CaCl21.8;NaH2PO40.4;葡萄糖10，pH7.4)'制備右心室乳頭肌標本，并將其置于肌槽內(nèi)，槽內(nèi)溫度為34+0.5°C，用充以95%+5%<:02混合氣體的臺氏液灌流，pH7.4，灌流速度為5ml/min。標本穩(wěn)定30min后，用刺激器(SEN7103，NihonKohden，JAPAN)刺激，刺激強度為1.5倍閾值，波寬lms，刺激頻率為lHz。用內(nèi)充3.0mol/L氯化鉀，電極電阻為15-20MD的玻璃微電極穿刺，記錄動作電位。ERP的測定每8個方波刺激后，加一個額外的刺激，逐漸改變其與前面正常剌激的時間間隔，測定額外刺激所引起的動作電位與前面動作電位之間的時間，以求ERP。信號通過微電極放大器(MEZ-7101，NihonKohden，JAPAN)放大后，分別在TEKTRONIX5al8N(USA)示波器監(jiān)視，同時輸入澳大利亞AD公司的Powerlab4s記錄系統(tǒng)進行采樣。刺激30min，待動作電位各參數(shù)穩(wěn)定后開始試驗。試驗結(jié)果由AD公司提供的Chart5分析軟件進行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)釆用Origin統(tǒng)計軟件(Version6)進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)土標準誤表示。顯著性檢驗方法采用配對t檢驗，p<0.05即認為有顯著性差異。試驗結(jié)果如下a.槐樹堿對豚鼠心室乳頭肌動作電位的影響1)槐果堿對動作電位RP、APA、Vmax、APD50、APD90、APD100的影口向豚鼠乳頭肌細胞動作電位記錄中，在灌流液內(nèi)加入濃度10uM的槐果堿后，約8min時起效應(yīng)，約15min后，作用達最大?；惫麎A使動作電位的平臺期延長，即APD5o延長，與對照相比增加了近17.9%;同時動作電位的APD90顯著延長，增加了22.3%;APD畫延長28.5^;Vmax下降29X;APA略下降，但無統(tǒng)計意義；RP無明顯變化。再用臺氏液灌洗，可使動作電位基本恢復。圖3(A)為其中一例，具體數(shù)據(jù)見表15。表15不同濃度的槐果堿對豚鼠心室乳頭肌細胞動作電位的影響表15controlluM5uM10uMwashoutRP(mV)90.5士0.6689.84±0.568S.70土1.2489.60±1.3991.38±〗.()0(-0.71%)(-1.98%)(-1，)APA(mV)1〗8.10土"5119.50±1.59117.50±2.22115.18±2.7188±2.93(.21%)(-1).50%)(-2.43%)L、(V/s)177.32±30.80164.80土28.56'136.44±27.26*121.28±17.18*33.52±13.引(-7.41)(-24.52)(-29.38%)APD;"ms)2CM.32土22.72215.H土23.82"231.94±25.46"240.42±26.32"226,50土2L6r(5.29%)(13.62%)U7.圃APDcm(nis)252.76±25.27268.44土26,98*'290.47±28.12"308.08±29.11"273.70±22.62(6.15%)(i5.13%)(22.29%)262.50士24.17282.04±26.04"306.00土29.44**336.50±29.49"286,24±20.72'(7.44%)(16.56%)(28,45V)ERP(ms)257.89±26.52275.72±27.80"296.93土30.56"324.11±32,89"285.84±27.23(7.00%)(15.蔑)(25.99%)ERP/APD0.98士0.0i0.97±0.010.97±0.010.96土0.030,99±0.02(1,01%)(0.97%)(0.96%)X土SE，n=5()內(nèi)為(槐果堿-control)/control^100%的變化率碌示p〈0.05，vscontrol沐碌示p〈0.01,vscontrol200710129525.5§.h,pg2)槐果堿對動作電位不應(yīng)期的影響豚鼠乳頭肌細胞動作電位記錄中，在灌流液內(nèi)加入濃度為10|iM的槐果堿后，8min時起效應(yīng)，不應(yīng)期延長，約15min后，作用達最大。與對照相比延長25.9%，具體結(jié)果見表15。3)槐果堿的量效關(guān)系豚鼠乳頭肌細胞動作電位記錄中，在灌流液內(nèi)依次加入濃度為lfiM、5pM、lO)iM的槐果堿后，APD50、APD90、APD100均延長，Vmax下降，以上各指標都呈濃度依賴性。具體數(shù)據(jù)見表15。圖3(B)為其中一例。在上述三個濃度中，ERP的延長也呈濃度依賴性，見圖3(C)。并且隨著濃度的增加，ERP的延長程度要略小于APD咖的延長的程度。b.鹽酸胺碘酮對豚鼠心室乳頭肌動作電位的影響用上述同樣的方法，觀察IO(VM鹽酸胺碘酮對豚鼠心室乳頭肌動作電位的RP、APA、Vmax、APD5()、APD90、APD,。o和ERP的影響。該藥物30分鐘后起效應(yīng)，35分鐘后效應(yīng)達到最大，APD50延長12%、APDw延長11.7%、APD麵延長18X、ERP延長15.6X;Vmax下降26.7%。圖3(D)，圖3(E)為其中一例。據(jù)圖數(shù)據(jù)見表16。表16鹽酸胺碘酮對豚鼠心室肌動作電位的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>()內(nèi)為(槐果堿-contro)/controlX00"*的變化率承-炎示p<().05，vscontrol*承農(nóng)示p<(,.0l，vsr.cmtrol根據(jù)上述測定結(jié)果可見，(1)槐果堿可使O期上升速率下降，并呈濃度依賴性。提示其可能對鈉通道有抑制作用。(2)槐果堿可使APD5o、APD9o、APDI00均延長，并呈濃度依賴性，提示其可能有抑制鉀外流的作用。(3)槐果堿可使ERP延長，呈濃度依賴性，這不僅與其延長動作電位時程有關(guān)，可能也與其輕度抑制納通道作用有關(guān)(Vmax下降)。(4)槐果堿與鹽酸胺碘酮相比起效快、劑量小。二、槐果堿對兔竇房結(jié)細胞動作電位的影響研究槐果堿對竇房結(jié)動作電位波形和各測量參數(shù)的影響，同時比較其與同類藥物鹽酸胺碘酮作用的異同點。測試使用的槐果堿注射液為200mg/2ml，配制時，取出注射液加入適量的臺氏液，配制成不同濃度(0.02uM、0.1nM、lyM)。同類藥物鹽酸胺碘酮產(chǎn)自杭州賽諾菲-圣德拉民主制藥有限公司，其規(guī)格為0.15g/3m，配制時，取出注射液加入適量臺氏液，配制成50uM濃度。實驗動物選用成年家兔，雌雄不拘。810周家兔，雌雄不拘，擊昏后取出心臟，在35。C臺氏液(成分(mmol/L):NaCl140，KC15.4，CaCl21.8，MgCl21，Hepes5，葡萄糖10，pH7.4，通100%02)中制備帶有部分右心耳組織的竇房結(jié)標本。標本固定于恒溫(35.5±0.5°C)、恒流(3ml/min)標本槽內(nèi)，以臺氏液灌流(成分同上)。待標本自律性活動穩(wěn)定后，用電阻為25MQ的內(nèi)充3mol/LKCL的玻璃微電極作竇房結(jié)細胞內(nèi)穿刺，記錄自律性動作電位。記錄信號經(jīng)放大器(MEZ-7101,NihonKohden，JAPAN)放大后，分別在TEKTR0NIX5A18N(USA)示波器監(jiān)視，同時輸入澳大利亞AD公司的Powerlab4s記錄系統(tǒng)進行采樣，實驗結(jié)果由AD公司提供的Chart5分析軟件進行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)采用Origin統(tǒng)計軟件(Version6)進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準誤差表示。顯著性檢驗方法采用配對t檢驗，p〈0.05即認為有顯著性差異。實驗結(jié)果a.槐果堿對兔心竇房結(jié)細胞自律性動作電位的影響兔心竇房結(jié)細胞動作電位記錄中，在灌流液中加入不同濃度(0.02、0.1、luM)的槐果堿后，約6分鐘后起效，IO分鐘后效應(yīng)達到最大。0.02nM槐果堿可使自律性興奮頻率(SEF)和4期自動除級速率(SDVP4)減慢，動作電位幅度(APA)減小，而動作電位時程(APD5。)、最大復級電位(MRP)、O期最大去極化速度(Vmax)均無明顯變化。O.lyM槐果堿對APA、MRP、SEF、SDVP4均有抑制作用，APDso和V隱無明顯影響；1PM槐果堿使APDso延長，其余各指標均明顯減小。再用正常臺氏液灌流后，以上指標基本可恢復，見圖4(A)，具體數(shù)據(jù)見表17。表17不同濃度的槐果堿對兔心竇房結(jié)細胞動作電位參數(shù)的變化<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>b.鹽酸胺碘酮對兔心竇房結(jié)細胞動作電位的影響兔心竇房結(jié)細胞動作電位記錄中，在灌流液中加入50uM鹽酸胺碘酮后，約20分鐘后起效應(yīng)，30分鐘后效應(yīng)達到最大。該藥物使APA、MRP、SEF、SDVP4、V麵明顯減小，并使APD50明顯延長。再用臺氏液灌流后，以上制備略恢復，見圖4(B)，具體數(shù)據(jù)見表18。表18.50iiM鹽酸胺碘酮對兔心竇房結(jié)細胞動作電位的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>結(jié)果表明，(l)高濃度槐果堿可使O期上升速率下降，提示其可能對慢鈣(L)通道有抑制作用。(2)槐果堿可使4期自動除極速率明顯下降，呈濃度依賴性，高濃度槐果堿使APD5o明顯延長，提示期可能有抑制鉀外流的作用。(3)槐果堿可使竇房結(jié)的自律性發(fā)放頻率下降，呈濃度依賴性。(4)槐果堿與鹽酸胺碘酮相比起效快、劑量小、且對動作電位各參數(shù)影響程度小、易恢復。三.槐果堿對冠狀動脈阻塞——再灌注犬心律失常的實驗1、對注射槐果堿的犬l的實驗犬1體重10kg，麻醉后開胸，切開心包暴露心臟。靜脈注射槐果堿10mg/kg(溶于10ml生理鹽水中)，5分鐘推完，繼以每ml含0.iy。愧果堿葡萄糖溶液每分鐘1.5ml的速度由靜脈恒速推注，直至實驗結(jié)束。10分鐘后于14點32分結(jié)扎冠狀動脈左前降支，結(jié)扎后見心肌發(fā)紫但未見S-T段抬高反見壓低。15點28分心肌明顯發(fā)紫，S-T段抬高，未見心律失常。15點37分開放被結(jié)扎的左前降支，見到一次短室速，以后S-T短逐漸降低至正常且為室性心律。觀察至16點06分未見再灌流心律失常。詳細的實驗結(jié)果見所測的心電圖(EKG)，即圖5、圖6、圖7、圖8、圖9、圖10、圖11。2、對空白對照的犬2的測定實驗。犬2體重9.25kg，麻醉后開胸，切開心包暴露心臟。靜脈注射10ml生理鹽水，5分鐘推完，繼以每分鐘1.5ml生理鹽水的速度由靜脈恒速推注，直至實驗結(jié)束。IO分鐘后于15點36分結(jié)扎冠狀動脈前降支，見短陣室速三陣，以后S-T短逐漸抬高，出現(xiàn)室早三聯(lián)律，至16點11分時心肌顏色越來越紫，心臟擴大，出現(xiàn)室壁瘤，心肌-收縮呈矛盾運動。仍于16點18分開放結(jié)扎的冠狀動脈，見室速、室顫等再灌流心律失常致死。詳細的實驗結(jié)果見所測的心電圖(EKG),即圖12、圖13、圖14、圖15、圖16、圖17、圖18、圖19、圖20。實施例3槐果堿在制備治療Echo病毒、腺病毒、流感乙型病毒引起的肺部感染藥物方面的應(yīng)用引起人類肺炎的病毒主要有Echo病毒、流感病毒、副流感病毒、巨細胞病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒RSV、鼻病毒、冠狀病毒和某些腸道病毒等。腺病毒肺炎主要發(fā)病于幼兒中，主要經(jīng)呼吸道傳播。本發(fā)明的槐果堿也可對抗因Echo病毒、腺病毒和/或流感病毒引起的肺炎感染。在本發(fā)明的實施例1中，已經(jīng)詳細描述和驗證了本發(fā)明的槐果堿注射液在體內(nèi)和體外均具有對抗腺病毒的活性。本發(fā)明還研究了槐果堿對腺病毒所致肺部炎癥的影響，發(fā)現(xiàn)病毒組小鼠00X10，HE染色)在接種肺炎后，肺泡與肺泡間的壁增厚，小支氣管間及旁有很多炎癥細胞圖21(A);而30mg/kg槐果堿治療組在治療后，肺泡與肺泡間的壁增厚明顯減輕，炎癥細胞減少(圖21(B))。實施例4槐果堿在免疫調(diào)節(jié)方面的應(yīng)用一.槐果堿對小鼠柯薩奇B3m(COXB3m)心肌模型中Thy-l(CD3)、L3T4(CD4)、Ly-2(CDS)等T細胞免疫的調(diào)節(jié)以及對心肌內(nèi)COXB3m增殖的抑制作用受試藥物為100mg/2ml的槐果堿注射液，用無小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO)稀釋至1%濃度為母液，無菌低溫保存。臨用時用注射用水稀釋至所需濃度。病毒采用COXB3m，病毒為1(T4TCID5()，一8(TC保存。本例中使用的抗體為抗小鼠淋巴細胞Thy-l(CD3)、L3T4(CD4)、Ly-2(CD"以及FITC標記的熒光抗小鼠IgG抗體，均由北京醫(yī)科大學免疫學教研室提供。1、槐果堿對T淋巴細胞的調(diào)節(jié)作用1)動物分組、病毒接種及給藥正常組N=15腹腔注射生理鹽水；病毒感染組N^34，Balb/c小鼠腹腔注射0.1mll0-4cOXB3m10-4TCID50，于感染2小時后及第2天開始靜脈內(nèi)注射生理鹽水0.1ml二沃，共14天；槐果堿治療組-N-26，Balb/c小鼠腹腔注射0.1mll(T4COXB3ml(T4TCID5o，于感染2小時后及第2天開始從尾靜脈內(nèi)注射30mg/kg槐果堿(0.3%，O.lml)，加等量生理鹽水分二次注射，共14天。2)淋巴細胞分離正常對照組、病毒感染組及槐果堿治療組均于接種后第3、5、7、10和14天小鼠，處死后均在無菌操作下打開腹腔，取出整個脾臟置于35mlHanks液的小皿中，用梅花針將其打成勻漿。經(jīng)銅網(wǎng)過濾后，將細胞懸液收集至圓底試管中，沿管壁緩緩注入4mlFicol-Metrizo1液(比重1.088)，2000r/min離心25min，吸出"云霧層"單個核細胞，用5。/。FCS-PBS液(PH7.2~7.4)洗滌兩次，以臺盼蘭排斥試驗測定細胞活力，要求活力達到95%以上，最后用含10%FCS的RPMI-1640液調(diào)節(jié)細胞濃度至1X107/ml。3)T細胞亞群的測定.采用但克隆抗體間接免疫熒光法，取上述細胞懸液0.1ml于小試管中，1000r/min離心5min，使細胞壓緊，棄上清液，分別加入單克隆抗體，充分混勻后置于4r作用30分鐘，然后用5%FSC-PBS液洗滌兩次，加熒光標記二抗體(Thy-1用抗小鼠IgM)，再置于4。C作用30分鐘，用5%FSC-PBS液洗滌兩次，1000r/min離心7min，棄上清液，將細胞團打散，加滴于載波片上，在Olympas萬能顯微鏡熒光油鏡下計算200只細胞中的熒光陽性細胞數(shù)。COXB3m病毒感染后T細胞亞群的變化，COXB3m病毒感染后不同天數(shù)的脾臟T細胞亞群變化見表19。表19<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>*注P值為病毒感染組與槐果堿治療組比較。感染后第3天起脾臟的Thy-l、L3T4及Ly-2細胞均有不同程度的下降，與正常小鼠比較有顯著差異(P<0.05<0.001)。第7天以后各T細胞亞群有不同程度的回升，其中以Thy-l以及L3丁4細胞較明顯，但直至第14天各T細胞亞群仍低于正常水平。CD"CDS比值在第7天起升高，第IO天與第14天雖有下降，但與正常小鼠比較仍偏高且有顯著差異(P<0.05)?；惫麎A治療組對COXB3m病毒感染后小鼠脾臟T細胞亞群在第314天間，在相應(yīng)時期所測得的T細胞亞群均比病毒對照組為高(PO.05~0.005)，與正常對照組相比無顯著差異(P>0.05)，而丁4/丁8(L3T4+/LY+-2)比較則從第7天起顯著低于病毒對照組，與正常對照組比較無明顯差異(P〉0.05)。說明槐果堿在COXB3m所致Balb/c病毒性心肌炎模型中能提高細胞免疫，并糾正T4/T8的比值，使免疫系統(tǒng)趨于正常，有利于心肌炎病變的控制。2、槐果堿對病毒感染后心臟中病毒抑制的影響心肌勻漿的制備病毒感染組與槐果堿治療組小鼠于第3、5、7、10和14天處死，取出脾臟后，取第3天和第5天的病毒感染組和槐果堿治療組的心臟各5只，取出心臟稱其重量，用玻璃勻漿器將心臟碾成勻漿，每50gm心肌加MEMlml，反復凍融三次，8000rpm離心20min，取上清液經(jīng)氯仿處理滅菌，-30卩保存?zhèn)溆谩Ｖ苽浼毎軐舛葹?X10Vml的Hela細胞lml加入無菌的試管中，培養(yǎng)4天。標本稀釋將上述心肌凍融液用.MEM稀釋成1:10至1:1(X6。加樣將上述標本稀釋液及原液0.1ml加入細胞管中，然后繼續(xù)培養(yǎng)。加樣每日觀察，連續(xù)觀察至第5天。半數(shù)細胞發(fā)生病變的最高稀釋度為病毒滴度(用TCIDso表示)。結(jié)果見表20，以上二組相比，C0XB3m病毒感染組和槐果堿治療組小鼠心肌內(nèi)檢測結(jié)果顯示，病毒感染組的病毒滴度顯著高于槐果堿治療組(PO.001)表20槐果堿對心肌內(nèi)病毒復制的影響感染天數(shù)35N=5N=5病毒感染組》6.OOLog,o》6.OOLog,o槐果堿治療組2.60±0.55Log102.20±0.84Log10p值<0.001O.OOl注表中數(shù)字為Log,oTCID5o幾何平均數(shù)。上述所示槐果堿治療組第3天和第5天的心肌勻漿標本中CVBLog1()TCID50明顯低于病毒感染對照組，說明槐果堿對感染心肌中CVB3m的增殖有明顯的抑制作用。此次試驗中病毒感染組第5、7天心臟的心肌壞死和炎癥細胞浸潤較重，而槐果堿治療組心臟病變較輕。因此，槐果堿除了具有抗病毒作用外，還有糾正感染CVB3m病毒小鼠的細胞免疫功能紊亂的作用，有利于病毒的控制。二.不同劑量槐果堿對小鼠病毒性心肌炎模型脾臟中自然殺傷細胞(NKcell)活性的動態(tài)變化(調(diào)節(jié)作用)免疫功能異常是急性病毒性心肌炎的發(fā)病和轉(zhuǎn)變?yōu)閬喖毙孕募⊙谆蛐募⊙茁曰顒悠诘闹匾?。自然殺細胞——naturalKillcell(NK細胞)作為免疫效應(yīng)細胞，在病毒性心肌炎的發(fā)病過程中有重要作用。本例目的是借助Balb/c小鼠病毒性心肌炎模型探討槐果堿在病毒性心肌炎發(fā)病過程中對NK細胞活性的調(diào)節(jié)作用觀察。本例中受試藥物為槐果堿注射液，規(guī)格為200mg/2ml，用無小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋至1%的濃度為母液，無菌低溫保存。臨用時用注射用水稀釋至0.3%、0.2%、0.1%。本例中使用的COXB3m病毒由上海第二醫(yī)科大學微生物教研室提供，病毒為10—6TCID5()，-S(TC保存。使用的Yac細胞由中國科學院上海細胞所提供。使用的純種Belb/c小鼠體重1822gm，由上海西普爾必凱有限公司提供。本例中使用的含5%FSC的PBS液是Gibco公司的產(chǎn)品；小牛血清由杭州四季青生物制品所提供；LDH底物混合物包含碘硝酸氨化四氮唑(INFFluka產(chǎn)品)、吩嗪二甲硝酸鹽(PMSScrva產(chǎn)品)、氧化型輔酶I(NADSigma產(chǎn)品)；使用的l%NP-40為Fluka產(chǎn)品。1、動物分組以及病毒接種和用藥動物分組將85只Balb/c小鼠隨機分成5組正常對照組17只；病毒對照組17只；槐果堿治療組10mg/kg組17只；20mg/kg組17只；30mg/kg組17只。正常對照組腹腔注射生理鹽水0.1ml，二次/日。病毒對照組將0.1mll(^TCID5o的COXB3m病毒一次注射小鼠腹腔，1小時后靜脈注射生理鹽水O.lml以后每日二次注射相同劑量的生理鹽水作為對照。10mg/kg組病毒接種同前，1小時后腹腔注射0.1%的槐果堿注射液O.lml加等量生理鹽水O.lml，混勻后分二次注射，以后每日二次注射同此劑量。20mg/kg組方法同10mg/kg，所不同的是槐果堿注射液的濃度改為0.2%。30mg/kg組方法同10mg/kg，將槐果堿注射液的濃度改為0.3%。在第3天時各取病毒對照組、槐果堿10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg組，各取5只小鼠處死，第8天時各處死6只，第12天時將上述各組剩余小鼠全部處死，取出脾臟及心臟備用。2、NK細胞測定主要參照王長安等介紹的乳酸脫氫酶(LDH)釋放法。小鼠處死后取出脾臟，置于35mlHanks液的小平皿中，用注射器針芯打成勻漿，銅網(wǎng)過濾，將細胞懸液沿試管管壁緩緩加入盛有4ml淋巴細胞分離液(比重1.088)的試管中，2000rpm離心20min，吸出"云霧層"單個核細胞，用含5y。FSC的PBS液(PH7.27.4)洗滌細胞2次，用臺盼蘭染色檢測細胞活力，要求細胞活力》95%。用10%FSC的RPIM-1640培養(yǎng)液調(diào)細胞濃度至3X106ml，作為效應(yīng)細胞。靶細胞用Yac細胞，效靶細胞比例為20:1。實驗設(shè)NK測定管、自然釋放管和最大釋放管。用1。/。NP-40破壞耙細胞作為最大程度釋放。每個標本作三個復孔，按表21加樣于96孔平低板。加畢混勻，1000rpm離心5min，置37'C含5%C02孵箱中培養(yǎng)4小時，取出后每孔加冷1640培養(yǎng)液50ul，混勻，1000rpm離心5min，從各孔取上清液100ul，置另一96孔平底板中，每孔加100ul32"C預溫的LDH底物混合物，3min后加1NHC150ul中止反應(yīng)，置酶標儀(Bio-Tek產(chǎn)品)中，在490nm波長下測各孔光密度(OD)值。表21NK細胞活性測定的加樣方法<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>按下式計算NK細胞活性測定管OD值-自然釋放管OD值NK細胞活性％=-最大釋放管OD值-自然釋放OD值結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠感染COXB3m3天時，NK細胞活性顯著增加，之后進行性下降，槐果堿治療組對NK活性有顯著影響，劑量不同，影響程度不同。10mg/kg槐果堿在感染第3天時對增高NK活性無影響，而20mg/kg和30mg/kg槐果堿組有明顯抑制作用。第8天時槐果堿對NK細胞活性影響不明顯，至第12天時，不同劑量的槐果堿均有增加NK細胞活性的作用。使NK細胞活性恢復正常水平，與正常組比較無明顯差異(P〉0.05)，見表22。表22不同劑量槐果堿對小鼠感染后不同時間NK細胞活性的動態(tài)變化<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>病毒對照組槐果堿治療組10mg/kg20mg/kg30mg/kg67.11±2.52$67.92±1.2154.88±1.2552.90±3.80###56.28±5.5659.42±5.1057.27±5.6854.88±6.4942.26±1.6145.91±2.5149.37士4.07'49.48±4.72;'絲絲注與正常對照組相比$P<0.001，與對應(yīng)天數(shù)病毒對照組相比，#P<0.05，##P<0.005，###P<0.001。3、心臟組織病毒滴度測定采用細胞致病效應(yīng)(CPE)法。將小鼠處死后，無菌操作取出心臟，每只心臟取相同重量，加入含4V。FSC的1640培養(yǎng)液lml，用玻璃勻槳器將心臟碾成勻漿，1500rpm，離心15min，取上清液，-8(TC保存?zhèn)溆茫煤?%FSC的1640培養(yǎng)液調(diào)Hela細胞濃度至2X105/ml，加入96孔平底板，每孔lOOul，在37。C含5%C02孵箱(Heraeus產(chǎn)品)中培養(yǎng)至細胞長成單層時，棄舊培養(yǎng)液，加入不同稀釋度(原液、1:2、1:10、1:102、1:104、1:105、1:106)的心肌勻漿，每個稀釋度作3個復孔，每孔100ul，并設(shè)細胞對照孔及病毒對照孔。在含5%002孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。加樣后每日觀察至第5天，以50%細胞病變的最高稀釋度為心肌內(nèi)病毒滴度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，心肌內(nèi)病毒滴度(LogH)TCIDso)感染后3天心肌內(nèi)病毒滴度最高，至第12天仍呈陽性，但滴度有所下降。治療組心肌內(nèi)亦呈陽性，但比對應(yīng)天數(shù)病毒對照組明顯降低，差異顯著。且劑量不同，心肌內(nèi)病毒滴度也不同。劑量越大，病毒滴度越低。10mg/kg組，在第3天的心肌病毒滴度較病毒組降低，差異有顯著性(<0.05)。在第8天和第12天時，雖亦有降低，但差異無顯著性(〉0.05)。20mg/kg和30mg/kg槐果堿組心肌內(nèi)病毒滴度較對應(yīng)天數(shù)病毒對照組顯著降低，詳見表23。表23不同劑量槐果堿對小鼠感染后不同天數(shù)心肌內(nèi)C0XB3m病毒滴度的影響感染后天數(shù)組別;3812病毒對照組4.56±0.884.42±1.513.33±0.71$槐果堿治療組10mg/kg3.44±0.88#3.67±0.502.83±0.7220mg/kg3.33±0.5##2.89±0.78#1.83±0.98##30mg/kg3.22±0.46#糊2.56±0.88##1.19±1.33##注$P<0.001與3天相比，#P<0.05，##P<0.005，###P<0,001與對應(yīng)天數(shù)相比。表23說明了槐果堿能抑制心肌細胞的CVB病毒的繁殖。實施例5槐果堿對感染CoxB3病毒小鼠的干擾素(IFN)水平的影響將槐果堿注射液(濃度為1%)加滅菌注射用水分別稀釋為0.3%、0.2%、0.1%三種濃度。CoxB3病毒由上海第二醫(yī)科大學微生物教研室提供，病毒原液效價為106TCID5Q，-7(rC凍存。Balb/c純種雄性小鼠為8周齡，體重1820g，購自上海市計劃生育科學研究所純種實驗動物室。首先將動物分組，將85只Balb/c小鼠隨即分為5組，正常對照組17只，病毒對照組17只，槐果堿治療組IO、20、30mg/kg組各17只。正常對照組用腹腔注射生理鹽水0.1ml，2次/d;病毒對照組將0.1mll03TCID5()的CoxB3病毒1次注射小鼠腹腔，lh后腹腔注射生理鹽水O.lml，以后2次/d注射生理鹽水作為對照；10mg/kg槐果堿組病毒注射同前，lh后腹腔注射0.iy。的槐果堿注射液0.1ml，以后2次/d注射相同劑量的槐果堿注射液；20mg/kg槐果堿組病毒注射同前，槐果堿注射液濃度改為0.2%，其余同10mg/ml組；30mg/ml組病毒注射同前，槐果堿注射液濃度改為0.3%，其余同10mg/ml組。第3d時，每組各取5只小鼠處死。第8d時，再各取6只處。第12d時，將各組剩余鼠均處死。采用細胞致病效應(yīng)抑制法(CPE)進行IFN測定。無菌操作下，將小鼠眼球摘除取血，置4。C冰箱數(shù)小時，離心取上清，以不同稀釋度(原液、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128)加入96孔平底板，每個稀釋度作3個復孔，每孔50y1。用含5%FCS的1640培養(yǎng)液調(diào)L929細胞濃度至4X105/ml，加入上述96孔板，每孔50iU。在37i:含5呢C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。棄舊培養(yǎng)液，加入水泡性口炎病毒(VSV)攻擊，每孔100"1。并設(shè)IFN標準品對照孔、細胞對照孔及病毒對照孔。在37'C含5%0)2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4872h。以能保護50%細胞存活的最大稀釋倍數(shù)的倒數(shù)作為IFN的活性單位(U/ml)。并且，還進行了組織病理檢查，將心臟用10%甲醛固定，石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察結(jié)果。測定值以Z土s表示，采用ANOVA檢驗。P〈0.05為差異有顯著性。在注射相關(guān)注射液后，正常組無死亡。小鼠在病毒感染3d后開始發(fā)病，出現(xiàn)松毛、食欲減退、體重減輕等征象，第5d出現(xiàn)死亡，死亡集中在5—7d，共死亡5只。槐果堿治療組小鼠征象有不同程度的改善，小鼠較活躍，皮毛較光滑，體重無明顯減輕；10mg/kg組在第5d死亡2只；20mg/kg組和30mg/kg組在第6d出現(xiàn)死亡，比病毒對照組推遲ld，各死亡1只。在CoxB3病毒感染后3d的IFN水平最高，之后逐漸下降，至感染12d時仍高于正常對照組(P〈0.00D。槐果堿治療組IFN水平上升更為顯著，且與劑量有關(guān)。病毒感染后3d，隨槐果堿劑量增加，小鼠體內(nèi)IFN水平顯著增高，各劑量組之間差異顯著(P<0.001)。在第12d時，槐果堿各劑量治療組的IFN水平仍高于病毒對照組(P<0.001)，見表24。表24不同劑量槐果堿對小鼠體內(nèi)干擾素水平的影響(U/ml，x±s)組感染天數(shù)3d8d12d健康'16.22±1.4415.78±2.0116.45±1.28病毒感染284.05±1.6685.04±1.8235.05±1.41*10mg/kg槐果堿317.37±2.04**89.14±2.38**85.04±2.04**20mg/kg槐果堿364.56±1.74**90.51±2.48**85.04±2.25**30mg/kg槐果堿418.77±1.56**95.67±3.03**76.11±1.43**與健康組比較，*P<0.001;同一天與病毒感染組比較，**P<0.001。結(jié)果可知，病毒+a-干擾素為59.09u/ml。病理組織檢測可知，感染3d時心肌內(nèi)未有病變，第5d心肌內(nèi)已有炎癥浸潤，第8d病變最嚴重，心肌壞死和炎癥浸潤程度均較重，呈片狀，第12d已有減輕。第8d時槐果堿減輕心肌病變明顯，各治療組差異顯著(P<0.01)，不同劑量的槐果堿對病毒感染后8d心肌病變的影響見圖22。權(quán)利要求1.槐果堿或其可藥用鹽在制備治療由腺病毒引起的心肌炎及肺部炎癥的藥物中的應(yīng)用，其中，所述槐果堿的結(jié)構(gòu)式為(I)2.如權(quán)利要求1所述的槐果堿或其可藥用鹽在制備治療由腺病毒引起的心肌炎及肺部炎癥的藥物中的應(yīng)用，其中，所述的槐果堿的可藥用鹽為槐果堿的溴酸鹽、或者槐果堿的鹽酸鹽或者槐果堿的氟酸鹽。3.如權(quán)利要求1所述的槐果堿或其可藥用鹽在制備治療由腺病毒引起的心肌炎及肺部炎癥的藥物中的應(yīng)用，其中，所述的藥物的劑型為醫(yī)學上認可的任何一種劑型。4.如權(quán)利要求3所述的槐果堿或其可藥用鹽在制備治療由腺病毒引起的心肌炎及肺部炎癥的藥物中的應(yīng)用，其中，所述的藥物的劑型為粉劑、或者注射液、或者膠囊、或者片劑、或者口服液。全文摘要本發(fā)明公開了槐果堿或其可藥用鹽在制備治療由腺病毒引起的心肌炎及肺部炎癥的藥物中的應(yīng)用，其中，所述的槐果堿的可藥用鹽為槐果堿的溴酸鹽、或者槐果堿的鹽酸鹽或者槐果堿的氟酸鹽，所述的藥物的劑型為醫(yī)學上認可的任何一種劑型。本發(fā)明的槐果堿或其可藥用鹽對腺病毒能發(fā)揮抗病毒作用。文檔編號A61P11/00GK101116662SQ20071012952公開日2008年2月6日申請日期2004年12月10日優(yōu)先權(quán)日2004年12月10日發(fā)明者劉晶星,陳曙霞申請人:上海第二醫(yī)科大學附屬仁濟醫(yī)院