專利名稱：一種紅松松塔提取物及其應(yīng)用和提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種松塔提取物及其應(yīng)用和制備方法。
背景技術(shù)：
紅松(Pinus koraiensis)系松科(Pinaceae)松屬植物，材質(zhì)優(yōu)良、紋理通直，抗壓性強(qiáng)是優(yōu)質(zhì)的木材，作為高附加值經(jīng)濟(jì)樹種作被大面積栽種。但迄今為止沒有關(guān)于紅松松塔及其成分的研究和報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明對(duì)紅松松塔及其成分進(jìn)行了研究，提供了一種紅松松塔提取物及其應(yīng)用和提取方法。
紅松松塔提取物的分子式為C20H30O5，分子量為350，常溫、常壓條件下在甲醇中的熔點(diǎn)為287℃，分子結(jié)構(gòu)式如下所示 如上所述的紅松松塔提取物用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。
如上所述的紅松松塔提取物按以下步驟提取(一)紅松松塔粉碎成粒徑為150～840μm的顆粒，然后用濃度為95％的乙醇回流提取3～4次，每次回流提取2±0.1h；(二)合并提取液，減壓濃縮得到浸膏；(三)層析采用干法裝柱、干法上樣，層析柱填料是粒徑為100～200目的柱層析硅膠；(四)洗脫依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和丙酮洗脫；(五)乙酸乙酯洗脫物用硅膠干柱層析，并用體積比為9∶1的氯仿與甲醇混合液展開，并將層析柱展開區(qū)域按從上至下的順序平均分為6段，然后取第五段硅膠層析柱用甲醇洗脫完全，再將甲醇洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；(六)甲醇洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后剩下的干物質(zhì)用反相硅膠柱層析分離，洗脫液是體積比為7∶3的甲醇與水混合液，洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，即得到如上所述的紅松松塔提取物。
通過檢索美國(guó)化學(xué)文摘(CA)(1977年-2007年)可確定本發(fā)明中的紅松松塔提取物為新化合物，被命名為紅松二萜酸A(Pinkornocid A)。
本發(fā)明紅松松塔提取物(紅松二萜酸A)可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，具有細(xì)胞毒活性。本發(fā)明紅松松塔提取物(紅松二萜酸A)對(duì)常見的人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8、人肝癌細(xì)Bel-7402、人胃癌細(xì)胞BGC-823、人肺癌細(xì)胞A549和人卵巢癌細(xì)胞A2780的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，其中對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8的抑制作用最為明顯。
本發(fā)明紅松松塔提取物的提取方法簡(jiǎn)單，每千克紅松松塔可獲得紅松二萜酸A 1.67～1.84mg，獲得的紅松松塔提取物(紅松二萜酸A)的純度高達(dá)97％以上。


圖1是紅松松塔提取物(紅松二萜酸A)的電子電離(EI)質(zhì)譜圖，圖2是紅松松塔提取物(紅松二萜酸A)的高分辨質(zhì)譜圖，圖3是紅松松塔提取物(紅松二萜酸A)的氫譜圖，圖4是紅松松塔提取物(紅松二萜酸A)的碳譜圖，圖5是紅松松塔提取物(紅松二萜酸A)在甲醇(MeOH)中的紫外光譜圖，圖6是紅松松塔提取物(紅松二萜酸A)在溴化鉀(KBr)中的紅外光譜圖，圖7是紅松松塔提取物(紅松二萜酸A)的二維核磁共振譜的異核多量子相干譜HMQC譜圖，圖8是紅松松塔提取物(紅松二萜酸A)的二維核磁共振譜的異核多鍵相干譜HMBC譜圖。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式紅松松塔提取物的分子式為C20H30O5，分子量為350，常溫、常壓條件下在甲醇中的熔點(diǎn)為287℃，分子結(jié)構(gòu)式如下所示

本實(shí)施方式紅松松塔提取物(紅松二萜酸A)的比旋光度[α]D25+12.9°(c 0.35，MeOH)；紫外光譜UV(MeOH)λmax(nm)244(log 4.23)(如圖5所示)；紅外光譜IR(KBr)νmax(cm-1)3400，2937，1718，1695，1618，831(如圖6所示)；高分辨質(zhì)譜HR EI MS m/z 350.3892[M]+(calcd.350.3903)(如圖2所示)。本實(shí)施方式紅松松塔提取物(紅松二萜酸A)的氫譜如圖3所示，碳譜如圖4所示，電子電離(EI)質(zhì)譜如圖1所示，紅松二萜酸A的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)如表1所示。
表1


根據(jù)紫外光譜UV和紅外光譜IR數(shù)據(jù)顯示本實(shí)施方式紅松松塔提取物(紅松二萜酸A)含有1個(gè)羥基基團(tuán)(νmax3400cm-1)，1個(gè)α，β-不飽和酮式結(jié)構(gòu)(λmax244nm，νmax1695cm-1)，1個(gè)三取代的雙鍵(νmax1618 and 831cm-1)和1個(gè)羧基基團(tuán)(νmax2937 and 1718cm-1)。根據(jù)氫譜和碳譜數(shù)據(jù)(表1)顯示本實(shí)施方式紅松松塔提取物(紅松二萜酸A)含有2個(gè)三取代甲基，1個(gè)羥基異丙基，6個(gè)亞甲基，2個(gè)次甲基，2個(gè)季碳，2個(gè)羥基(δC72.0 and 74.2ppm)，1個(gè)α，β-不飽和酮式結(jié)構(gòu)[δH6.76(1H br s)ppm；δC136.7，142.0和200.8ppm，1個(gè)羧基(δC180.2ppm)。通過以上數(shù)據(jù)分析本實(shí)施方式紅松松塔提取物是一個(gè)二萜酸類化合物，結(jié)合二維核磁共振譜的異核多量子相干譜HMQC譜(如圖7所示)和異核多鍵相干譜HMBC譜(如圖8所示)可斷定其結(jié)構(gòu)中具有松香烷型結(jié)構(gòu)；HMBC譜顯示H-12和H-14與結(jié)構(gòu)中的C-13(δC72.0ppm)有相關(guān)信號(hào)，可斷定結(jié)構(gòu)中的1個(gè)羥基與C-13相連，同時(shí)H-16和H-17與結(jié)構(gòu)中的C-15(δC74.2ppm)有相關(guān)信號(hào)，可斷定結(jié)構(gòu)中的另一個(gè)羥基與C-15相連；根據(jù)HMBC譜還可知結(jié)構(gòu)中的羧基(-COOH)與結(jié)構(gòu)中的C-18相連；確證本實(shí)施方式紅松松塔提取物(紅松二萜酸A)的分子結(jié)構(gòu)如下

通過檢索美國(guó)化學(xué)文摘(CA)(1977年～2007年)可確定本實(shí)施方式中的紅松松塔提取物為新化合物，被命名為紅松二萜酸A(Pinkomocid A)。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式紅松松塔提取物用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。
本實(shí)施方式紅松松塔提取物(紅松二萜酸A)抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)(1)將人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8、人肝癌細(xì)Bel-7402、人胃癌細(xì)胞BGC-823、人肺癌細(xì)胞A549和人卵巢癌細(xì)胞A2780分別培養(yǎng)于含10％小牛血清、青霉素濃度為100μg/mL、鏈霉素濃度為100μg/mL的RPMI 1640培養(yǎng)基中并置于溫度為37℃，CO2濃度為5％的環(huán)境中傳代培養(yǎng)；(2)選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁腫瘤細(xì)胞，用0.6mL、濃度為0.3％的胰酶消化，之后再用含10％小牛血清的RPMI 1640液體培養(yǎng)基配成1×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種100μL(含1000個(gè)腫瘤細(xì)胞)在溫度為37℃，CO2濃度為5％的條件下培養(yǎng)24h；(3)培養(yǎng)的5種癌細(xì)胞每一種分4個(gè)劑量組加入本實(shí)施方式紅松松塔提取物(紅松二萜酸A)，濃度分別為0.5μg/mL、5μg/mL、50μg/mL和100μg/mL，每劑量組設(shè)3個(gè)平行孔，每孔加紅松二萜酸A 100μL；另設(shè)對(duì)照組只加入與紅松二萜酸A同體積(100μL)的RPMI 1640液體培養(yǎng)基，然后都置于溫度為37℃，CO2濃度為5％的條件下培養(yǎng)4天；(4)棄去上清液(培養(yǎng)液)，每孔加入200μL新鮮配制的含有0.2％MTT溶液的RPMI 1640培養(yǎng)液，再置于溫度為37℃的環(huán)境中培養(yǎng)4h，之后棄去上清液并在每孔加入150μL DMS0溶解MTT甲臜(formazan)沉淀，再用微型超聲振蕩器混勻，并用酶標(biāo)儀在參考波長(zhǎng)為450nm、檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm條件下測(cè)定光密度值(OD值)；(5)計(jì)算受試藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率

以紅松二萜酸A的不同濃度對(duì)癌細(xì)胞的抑制率作圖得到劑量反應(yīng)曲線，并從中求出紅松二萜酸A的半數(shù)抑制濃度(IC50)，如表2所示。
表2

本實(shí)施方式紅松松塔提取物(紅松二萜酸A)體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明紅松二萜酸A具有細(xì)胞毒活性，可明顯抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8、人肝癌細(xì)Bel-7402、人胃癌細(xì)胞BGC-823、人肺癌細(xì)胞A549和人卵巢癌細(xì)胞A2780生長(zhǎng)，其中對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8的抑制作用最為明顯。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式紅松松塔提取物按以下步驟提取(一)紅松松塔粉碎成粒徑為150～840μm的顆粒，然后用濃度為95％的乙醇回流提取3～4次，每次回流提取2±0.1h；(二)合并提取液，減壓濃縮得到浸膏；(三)層析采用干法裝柱、干法上樣，層析柱填料是粒徑為100～200目的柱層析硅膠；(四)洗脫依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和丙酮洗脫；(五)乙酸乙酯洗脫物用硅膠干柱層析，并用體積比為9∶1的氯仿與甲醇混合液展開，并將層析柱展開區(qū)域按從上至下的順序平均分為6段，然后取第五段硅膠層析柱用甲醇洗脫完全，再將甲醇洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；(六)甲醇洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后剩下的干物質(zhì)用反相硅膠柱層析分離，洗脫液是體積比為7∶3的甲醇與水混合液，洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，即得到如具體實(shí)施方式
一所述的紅松松塔提取物。
4.5千克紅松松塔按本實(shí)施方式提取可獲得12～12.78mg紅松二萜酸A，經(jīng)檢測(cè)本實(shí)施方式獲得的紅松二萜酸A的純度為98.7％。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是步驟(一)中每次回流提取乙醇的用量為紅松松塔質(zhì)量的5～10倍。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式三相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是步驟(一)中每次回流提取乙醇的用量為紅松松塔質(zhì)量的7倍。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式三相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是步驟(一)中紅松松塔粉碎成粒徑為175～820μm的顆粒。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式三相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是步驟(一)中紅松松塔粉碎成粒徑為180～600μm的顆粒。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式三相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是步驟(一)中紅松松塔粉碎成粒徑為200～400μm的顆粒。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式三相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是步驟(二)中合并的提取液在400～500Pa、60～80℃的條件下濃縮。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式三相同。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是步驟(四)中4種洗脫液的流速均為8～10mL/min。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式三相同。
具體實(shí)施方式
十一本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是步驟(五)中甲醇洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的溫度為50～80℃。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式三相同。
具體實(shí)施方式
十二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是步驟(五)中甲醇洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的溫度為60～70℃。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式三相同。
具體實(shí)施方式
十三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是步驟(六)中反相硅膠柱為C18反相硅膠柱。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式三相同。
本實(shí)施方式C18反相硅膠柱購(gòu)自于Sigma公司。
具體實(shí)施方式
十四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是步驟(六)中洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的溫度為50～80℃。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式三相同。
具體實(shí)施方式
十五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是步驟(六)中洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的溫度為60～70℃。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式三相同。
權(quán)利要求
1.一種紅松松塔提取物，其特征在于紅松松塔提取物的分子式為C20H30O5，分子量為350，常溫、常壓條件下在甲醇中的熔點(diǎn)為287℃，分子結(jié)構(gòu)式如下所示
2.如權(quán)利要求1所述紅松松塔提取物的應(yīng)用，其特征在于紅松松塔提取物用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。
3.如權(quán)利要求1所述紅松松塔提取物的提取方法，其特征在于紅松松塔提取物按以下步驟提取(一)紅松松塔粉碎成粒徑為150～840μm的顆粒，然后用濃度為95％的乙醇回流提取3～4次，每次回流提取2±0.1h；(二)合并提取液，減壓濃縮得到浸膏；(三)層析采用干法裝柱、干法上樣，層析柱填料是粒徑為100～200目的柱層析硅膠；(四)洗脫依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和丙酮洗脫；(五)乙酸乙酯洗脫物用硅膠干柱層析，并用體積比為9∶1的氯仿與甲醇混合液展開，并將層析柱展開區(qū)域按從上至下的順序平均分為6段，然后取第五段硅膠層析柱用甲醇洗脫完全，再將甲醇洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；(六)甲醇洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后剩下的干物質(zhì)用反相硅膠柱層析分離，洗脫液是體積比為7∶3的甲醇與水混合液，洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，即得到如權(quán)利要求1所述的紅松松塔提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述紅松松塔提取物的提取方法，其特征在于步驟(一)中每次回流提取乙醇的用量為紅松松塔質(zhì)量的5～10倍。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述紅松松塔提取物的提取方法，其特征在于步驟(一)中紅松松塔粉碎成粒徑為175～820μm的顆粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述紅松松塔提取物的提取方法，其特征在于步驟(二)中合并的提取液在400～500Pa、60～80℃的條件下濃縮。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述紅松松塔提取物的提取方法，其特征在于步驟(四)中4種洗脫液的流速均為8～10mL/min。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述紅松松塔提取物的提取方法，其特征在于步驟(五)中甲醇洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的溫度為50～80℃。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述紅松松塔提取物的提取方法，其特征在于步驟(六)中反相硅膠柱為C18反相硅膠柱。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述紅松松塔提取物的提取方法，其特征在于步驟(六)中洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的溫度為50～80℃。
全文摘要
一種紅松松塔提取物及其應(yīng)用和提取方法，它涉及一種松塔提取物及其應(yīng)用和制備方法。本發(fā)明對(duì)紅松松塔及其成分進(jìn)行了研究。紅松松塔提取物的分子式為C
文檔編號(hào)A61P35/00GK101066916SQ200710072149
公開日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2007年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月29日
發(fā)明者楊鑫, 張英春, 張華 , 王靜 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)