專利名稱：：丹參酮ⅱa靜脈乳劑在治療腦部疾病中的應用的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及丹參酮IIA靜脈乳劑在治療腦部疾病中的應用，屬醫(yī)藥領域。
背景技術(shù)：
：乃參酮IIA(tanshinoneIIA)是中藥丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)的主要有效成分，也是中國藥典2005年版一部收載的丹參藥材的指標成分。丹參酮IIA具有廣泛的藥理活性，如保護內(nèi)皮細胞、抗心肌缺血、改善血液代謝、抗氧化、降低自由基水平、抗動脈粥樣硬化、預防心絞痛與心肌梗塞等，近年來研究發(fā)現(xiàn)丹參酮nA還具有保護神經(jīng)細胞與抗腫瘤作用。丹參酮IIA為脂溶性成分，水中難溶，因此難以將其直接制備成可供臨床使用的注射液。20世紀70年代末錢名堃等人將其化學結(jié)構(gòu)改造成水溶性的丹參酮nA磺酸鈉(圖1)，解決了其水中難溶的問題。此后上海制藥-廠將其研制成注射液，臨床上用于冠心病、心絞痛的輔助治療已近30年，與復方丹參注射液療效相似。在2002年丹參酮IIA磺酸鈉注射液i地標升為國家標準，2005年收入全國醫(yī)保目錄乙類(命名為丹參酮IIA注射劑，實應為丹參酮IIA磺酸鈉注射液)，至今仍在應用。顯而易見，丹參酮IIA磺酸鈉的臨床療效源自丹參酮IIA所具有的藥理活性。O丹參酮IIA:R=H丹參酮IIA磺酸鈉R=S03Na圖1丹參酮IIA與丹參酮I1A磺酸鈉的化學結(jié)構(gòu)式然而丹參酮IIA磺酸鈉注射液的穩(wěn)定性較差，熱壓滅菌后降解產(chǎn)物明顯增加，易導致不良反應的發(fā)生，嚴重影響了該藥品使用的安全性和有效性。另一方面，特別應值得注意的是丹參酮IIA磺酸鈉在化學結(jié)構(gòu)上并非丹參酮IIA的鹽形式。發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮IIA分子化學耦聯(lián)磺酸基團改造成丹參酮IIA磺酸鈉后，由于磺酸基團具有強吸電子性，不但嚴重影響了乃參酮IIA分子自身原有的抗氧化能力，從而顯著減弱了丹參酮IIA的藥理活性；而且丹參酮IIA磺酸鈉的極性較丹參酮IIA相比顯著增大，難以透過血腦屏障(BBB)，使其在腦部疾病的治療應用方面受到限制。由此可見，丹參酮IIA磺酸鈉并非丹參酮IIA最理想的給藥形式。發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮IIA口服吸收差、首過效應嚴重、生物利用度極低(23%);結(jié)合其適用于腦缺血等急癥治療的實際及其脂溶性特點，將其溶解于注射用油中，經(jīng)磷脂乳化分散.制備成亞微乳注射液，不僅可解決其水中難溶與靜脈注射的可行性問題，而且可直接地利用丹參酮IIA的藥理活性充分發(fā)揮療效。據(jù)此，發(fā)明人優(yōu)選了丹參酮IIA靜脈乳劑的處方與制備工藝，于本發(fā)明前申請了藥用組合物專利(申請?zhí)朇N200610005271.1)。本發(fā)明是在上述發(fā)明的基礎上，通過動物體內(nèi)分布及藥效學研究，發(fā)現(xiàn)與丹參酮IIA磺酸鈉注射液相比，丹參酮IIA靜脈乳劑極易透過血腦屏障，可在更低劑量下達到治療腦部疾病的效果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及丹參酮IIA靜脈乳劑在治療腦部疾病中的應用。所述的腦部疾病包括缺血性腦血管疾病、出血性腦血管疾病、腦腫瘤。發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)分布研究中，丹參酮IIA靜脈乳劑極易透過血腦屏障進入腦組織，具有腦趨向分布特性；在藥效學研究中，丹參酮IIA靜脈乳劑對缺rfll性腦損傷、出血性腦損傷均具有顯著的治療作用；在細胞培養(yǎng)實驗中，丹參酮IIA靜脈乳劑對腦腫瘤細胞株具有明顯的抑制和殺傷作用。丹參酮1IA靜脈乳劑在治療腦部疾病中的藥效明顯優(yōu)于同劑量(摩爾量)的丹參酮IIA磺酸鈉注射液。參照《中藥藥理實驗方法》(陳奇主編，人民衛(wèi)生出版社出版)一書中第205頁所載"實驗動物與人用藥量的換算"及靜脈脂肪乳劑的常規(guī)用量，發(fā)明人根據(jù)動物i式驗結(jié)果推算出了丹參酮IIA靜脈乳劑的臨床人用劑量，并將其作為權(quán)利要求的一部分。以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進步的詳細說明。但不應將其理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。其中試驗例2和實施例14所述的丹參酮IIA靜脈乳劑均為試驗例1所制得。試驗例1丹參酮IIA靜脈乳劑的制備將12g注射用磷脂、3g帕洛沙姆188及22g注射用甘油溶解分散于700ml預熱至80°C的注射用水中，制備成均勻分散的水相；另取1000mg丹參酮IIA及300rng油酸加入200g預熱至8(TC的注射用油中，溶解完全后得油相；將油相緩慢加入高速攪拌(IOOOO轉(zhuǎn)/分鐘)的水相中，保持攪拌10分鐘，制備得橙黃色初乳；將初乳加注射用水至l(XX)ml，置高壓乳勻機內(nèi)勻化3次(5O150MPa)，充氮灌裝，滅菌，即得丹參酮IIA靜脈乳劑。試驗例2丹參酮IIA靜脈乳劑與丹參酮IIA磺酸鈉注射液在動物體內(nèi)的分布研究昆明種小鼠84只(體重1822g，雌雄各半)，隨機分為2組丹參酮nA靜脈乳劑組、丹參酮nA磺酸鈉注射液組(經(jīng)適當稀釋后給藥，上海第一生化藥業(yè)有限公司牛產(chǎn)，下同)。按組別尾靜脈注射給藥，分別于給藥后5、15、30、60、120、240、480分鐘每組各取6只，取血、處死、取腦稱重，加等量生理鹽水勻漿，HPLC法測定血中及腦組織中藥物含量，結(jié)果見表1。表1丹參酮IIA靜脈乳劑與丹參酮IIA磺酸鈉注射液在小鼠體內(nèi)的分布<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>—:未檢出與丹參酮IIA磺酸鈉組比較"<0.05"P<0.01結(jié)果表明在本實驗條件下，丹參酮IIA靜脈乳劑的生物利用度和腦靶向性明顯優(yōu)于同劑量(摩爾量)的丹參酮IIA磺酸鈉注射液。實施例1丹參酮IIA靜脈乳劑對大鼠腦缺血/再灌注損傷的治療作用SD大鼠24只(體重190230g，雌雄各半)，隨機分為4組(偽手術(shù)組、模型組、丹參酮IIA靜脈乳劑組、丹參酮IIA磺酸鈉注射液組)，參照Longa法制作右側(cè)大腦中動脈栓塞(MiddleCerebralArteryOcclusion,MCAO)模型。缺血2小時后，將尼龍線輕輕拔出并縫合皮下筋膜及皮膚，即為再灌注模型，再灌注時間為24小時。偽手術(shù)組除不插尼龍線阻塞血管外，其他操作與其他三組相同。缺血1小時后，按組別尾靜脈注射給藥一次，之后每隔12小時再給藥一次，共給藥3次。末次給藥30分鐘后觀察大鼠神經(jīng)行為并參考文獻進行評分無異常0分；豎毛、輕度運動低下0.5分；前肢屈曲、運動障礙l分；運動不協(xié)調(diào)、旋轉(zhuǎn)運動2分；偏癱、不能站立和行走3分；痙攣、昏睡4分；死亡5分。再灌注24小時后斷頭取腦，將腦組織沿冠狀面切成厚度基本相同的5片，固定、染色，用Premier3.1MEGAPIXELSTS-3給每個組的腦片照相，再通過Imagepro-plus4.5軟件測量梗死面積，按下式計算梗死百分比，結(jié)果見表2。蒼白區(qū)面積梗死百分比(％)蒼白區(qū)面積+非蒼白區(qū)面積5:100%表2丹參酮IlA靜脈乳劑對大鼠腦缺血/再灌注的保護作用組別給藥量神經(jīng)行為分值梗死百分比(％)偽手術(shù)組模型組丹參酮IIA靜脈乳劑組丹參酮IIA磺酸鈉組1.0ml/kg(生理鹽水)1.0ml/kg(生理鹽水)1.0ml/kg(1.0mg/kg)1.0ml/kg(1.4mg/kg)O.OO士O.OO2.67±0.370.38±0.342.43±0.805.88±1.9219.43±5.357.6U3.8918.65±5.56與偽手術(shù)組比較"P〈0.01與模型組比較*<0.01與丹參酮IIA磺酸鈉組比較"P〈0.01結(jié)果表明在本實驗中，丹參酮IlA靜脈乳劑對大鼠腦缺血/再灌注損傷具有明顯的治療作用，且明顯優(yōu)于同劑量(摩爾量)的丹參酮IIA磺酸鈉注射液。實施例2丹參酮IIA靜脈乳劑對大鼠缺血性腦損傷的保護作用Wistar大鼠40只(體重220280g，雌雄各半)，隨機分為四組(偽手術(shù)組、模型組、丹參酮IIA靜脈乳劑組、丹參酮IIA磺酸鈉注射液組)，按組別每天尾靜脈注射給藥一次，連續(xù)3天，第3次給藥30min后造模，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉30mg/kg麻醉，剝離雙側(cè)頸總動脈，置手術(shù)線，尾靜脈注射伊文思蘭50mg/kg，除偽手術(shù)組外其他大鼠均于5分鐘后結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，結(jié)扎3小時后斷頭取腦，稱重，浸泡于10毫升甲酰胺中，于45'C恒溫箱中溫育72小時，取溫育液，用分光光度計于620納米處測定吸收度，根據(jù)標準曲線計算腦內(nèi)伊文思蘭含量，結(jié)果見表3。表3丹參酮IIA靜脈乳劑對腦缺血大鼠腦血管通透性的影響組別腦組織伊文思蘭含量(嗎/g)偽手術(shù)組模型組丹參酮IIA靜脈乳劑組丹參酮IIA磺酸鈉組1.0ml/kg(生理鹽水)1.0ml/kg(生理鹽水)1.0ml/kg(1.0mg/kg)1.0ml/kg(1.4mg/kg)3.47±1.015.67±0.86A3.66±0.97*.5.54±1.05與偽手術(shù)組比較^<0.05與模型組比較<0.05與丹參酮IIA磺酸鈉組比較'P〈0.05Wistar大鼠40只(體重220280g，雌雄各半)，分組、給藥及造模均同前，戊巴比妥鈉麻醉后，剝離雙側(cè)頸總動脈，結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈(除偽手術(shù)組外)3小時，斷頭取腦，稱濕腦重，計算腦指數(shù)(腦指數(shù)=濕腦重><100/體重)。然后在110。C烤箱中烤至恒重，稱干腦重，按下式計算腦含水量，結(jié)果見表4。腦含水量(％)=濕腦重7=腦重x100%濕腦重表4丹參酮IIA靜脈乳劑對腦缺血大鼠腦指數(shù)及腦含水量的影響組別腦指數(shù)腦含水量(％)偽手術(shù)組模型組丹參酮IIA靜脈乳劑組丹參酮IIA磺酸鈉組1.0ml/kg(生理鹽水)1.0ml/kg(生理鹽水)1.0ml/kg(1.0mg/kg)1.0ml/kg(1.4mg/kg)0.6722±0.04990.7879±0.0777A0.6792±0.0471*'0.7775±0.060972.70±3.2478.34±1.95A73.71士2.8"77.92±2.87與偽手術(shù)組比較Ap〈0.05與模型組比較*<0.05與丹參酮IIA磺酸鈉組比較"P〈0.05結(jié)果表明在本實驗中，丹參酮IIA靜脈乳劑能減輕大鼠腦缺血所致的血管通透性增加，緩解腦水腫，且明顯優(yōu)于同劑量(摩爾量)的丹參酮IIA磺酸鈉注射液。實施例3丹參酮IIA靜脈乳劑對大鼠出血性腦損傷的保護作用Wistar大鼠40只(體重290330g，雌雄各半)，隨機分為4組(偽手術(shù)組、模型組、丹參酮IIA靜脈乳劑組、丹參酮IIA磺酸鈉注射液組)，按組別每天尾靜脈注射給藥一次，連續(xù)3天，末次給藥30分鐘后，采用枕大池注入自體股動脈血法制作蛛網(wǎng)膜下腔出血(SubarachnoidHemorrhage,SAH)模型。將HDL-500電腦超聲儀的912MHz探頭置于SAH大鼠枕大孔處，探測顱內(nèi)動脈收縮期血流速度及舒張期血流速度，并計算出阻力指數(shù)(RI)，RI值高提示血管阻力高，亦反映血管痙攣的程度。經(jīng)斜坡開骨窗暴露基底動脈(BA)的全程，用顯微鏡測微尺及顯微攝影法測量基底動脈的椎基底動脈交匯處、腦橋中部和分叉處直徑，取其均值。結(jié)果見表5。表5丹參酮IIA靜脈乳劑對SAH大鼠腦血管阻力指數(shù)及基底動脈直徑的影響組別給藥量阻力指數(shù)基底動脈直徑(nm)術(shù)前術(shù)后24小時偽手術(shù)組模型組丹參酮IIA靜脈乳劑組丹參酮IIA磺酸鈉組1.0ml/kg(生理鹽水)1.0ml/kg(生理鹽水)1.0ml/kg(1.0mg/kg)1.0ml/kg(1.4mg/kg)0.56±0.050.84±0.08A0.62±0.07**0.8U0.06183.4±29.6178.3±19.5182.7士2.8177.2±27.8182.7±14.6122.6士19.8血67.3±35.4*'137.2±29.8與偽手術(shù)組比較Ap〈0.05與模型組比較，P〈0.05與丹參酮1IA磺酸鈉組比較'P〈0.05結(jié)果表明在本實驗中，丹參酮IIA靜脈乳劑能減輕SAH大鼠腦血管阻力，預防出血性腦損傷所致的基底動脈狹窄，防治蛛網(wǎng)膜下腔出血所致的腦血管痙攣，且明顯優(yōu)于同劑量(摩爾量)的丹參酮IIA磺酸鈉注射液。實施例4丹參酮IIA靜脈乳劑對人膠質(zhì)瘤的增殖抑制作用人膠質(zhì)瘤細胞株U251，常規(guī)培養(yǎng)于含10%新生牛血清，青霉素、鏈霉素各100U/ml的RPMI-1640(Gibco)培養(yǎng)基中，37°C、飽和濕度、5%C02條件下常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗，實驗細胞起始接種濃度為107/L，加入圓底細胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔0.2ml，置于37°C、飽和濕度、5。/。C02條件下常規(guī)培養(yǎng)24小時后，棄培養(yǎng)上清液，用預熱至37。C的RPMI-1640沖洗1次。實驗組加入丹參酮IIA靜脈乳劑至最終濃度為0.5mg/L、2.0mg/L、8.0mg/L，每個濃度做6個重復，對照組除不加丹參酮IIA靜脈乳劑外，其他條件完全一致。分別于培養(yǎng)24、48、72小時后，加入pH7.4PBS配制的5g/LMTT20^1/孔，再置37。C、飽和濕度、5%C02條件下4小時，取出、吸取上清液，加入DMSO0.2ml/L，混勻30分鐘后在酶聯(lián)檢測儀上570nm處測定吸收度A57Q，按下式計算丹參酮IIA靜脈乳劑對U251細胞的抑制率，結(jié)果見表6。抑制率(%)=八對照組二給藥組><100%A對照組表6丹參酮IIA靜脈乳劑對U251細胞增殖的抑制作用抑制率(％)給藥量-24小時48小時72小時0.5mg/L8.3±1.622.4±4.237.5±8.22.0mg/L16.4±3.539.2±8.443.1±8.68.0mg/L30.3±6.45.9±10.065.9±13.4結(jié)果表明在本實驗中，丹參酮IIA靜脈乳劑能明顯抑制人膠質(zhì)瘤細胞U251的增殖，并在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。權(quán)利要求1.丹參酮IIA靜脈乳劑在治療腦部疾病中的應用，其特征在于所述的腦部疾病包括缺血性腦血管疾病、出血性腦血管疾病、腦腫瘤；所述的丹參酮IIA靜脈乳劑是以式1所示的丹參酮IIA為有效成分，包含注射用油、乳化劑、注射用水及其它藥學上可接受的輔料所制成的供靜脈直接注射或經(jīng)其它注射液稀釋后經(jīng)靜脈輸注的乳劑。式12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于治療所述的缺血性腦血管疾病、出血性腦血管疾病的臨床用藥劑量為成人0.12毫克/公斤體重/天。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于治療所述的腦腫瘤的臨床用藥劑量為成人0.58毫克/公斤體重/天。全文摘要本發(fā)明涉及丹參酮IIA靜脈乳劑在治療腦部疾病中的應用。將丹參酮IIA靜脈乳劑直接靜脈注射或經(jīng)其它注射液稀釋后經(jīng)靜脈輸注至患者體內(nèi)，能迅速透過血腦屏障，可用于治療缺血性腦血管疾病、出血性腦血管疾病、腦腫瘤。文檔編號A61K31/34GK101428013SQ200710050459公開日2009年5月13日申請日期2007年11月9日優(yōu)先權(quán)日2007年11月9日發(fā)明者婷儲,宇吳,臻梁,毛聲俊,輝金申請人:四川思達康藥業(yè)有限公司