專利名稱：β-抑制蛋白1在調節(jié)T細胞存活和自身免疫中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，具體涉及(3抑制蛋白1的抑制劑在制備用于治療或 預防對象的與CD4+T細胞凋亡異常相關的疾病中的用途。
背景技術：
在生物體內，T細胞和B細胞構成了獲得性免疫系統(tǒng)保護著機體免受病原體的 侵害。為保證機體正常的免疫應答，這些細胞的凋亡是被精確地調控著的。在胸腺 中，根據TCR信號的強弱，大部分T細胞經過陰性選擇和陽性選擇凋亡了。生存 下來的T細胞進入外周血系統(tǒng)形成外周血CD4+和CD8+ T細胞庫。外周血中的 CD4+ T細胞由于胸腺中的新細胞輸入和外周血中CD4+ T的細胞凋亡維持著其的動 態(tài)平衡(1， 2)。當CD4+T細胞接觸到其特異抗原時，細胞開始分裂、分化成有功 能的CD4+ T細胞。這些有功能的CD4+ T細胞在清除了外來抗原后需要及時凋亡， 否則會對正常機體產生傷害。參與這些有功能的CD4+T細胞凋亡的信號通路主要 有激活引起的細胞凋亡(AICD)和激活細胞的自發(fā)凋亡(ACAD)。在所有這些 CD4+ T細胞發(fā)育過程中，控制CD4+ T細胞凋亡的調節(jié)分子的表達異?？赡芷茐?CD4+ T細胞平衡，使針對自身抗原的CD4+ T細胞存活下來或者延長CD4+ T細胞的 免疫應答，從而導致很多免疫疾病，如自身免疫病和淋巴細胞增多癥等(3-6)。
在哺乳動物中，CD4+T細胞的凋亡主要由兩條通路來介導(1， 6)。 一條是通 過細胞表面受體，如TNF和Fas等受體。它們主要介導激活CD4+T細胞的凋亡。 這些受體的激活能直接通過招募和活化caspase來誘導細胞凋亡(7-11)。與這條通 路對應的介導CD4+T細胞凋亡的途徑是Bd-2家族蛋白介導的線粒體通路。這個蛋 白家族包括抗凋亡和促凋亡兩大類分子，這些分子協(xié)同地調控著線粒體膜的完整性 以及存在于線粒體中促調亡蛋白的釋放(12， 13)。實驗表明Bcl-2家族蛋白主要 介導因細胞因子缺少，脅迫或激活的CD4+T細胞的自發(fā)凋亡(1， 14-17)。 Bcl-2是 這個蛋白家族的原型蛋白。在5cZ-2敲除小鼠中，T細胞很容易凋亡并且當小鼠變老 的時候，出現白細胞減少癥(18)。而在Sd-2過表達的小鼠中，T細胞對很多凋亡 刺激不敏感(15， 16)，機體的免疫應答時間變長并且小鼠會自發(fā)出現一些自身免 疫病的癥狀(19)。
(3抑制蛋白家族(parrs)包含p抑制蛋白1G3arrl)、 (3抑制蛋白2(13arr2)等。它們是具有多種功能的信號分子(20)， 一方面，它們能介導多種受體的內吞(21-24)。另 一方面，它們通過和很多信號分子的結合調節(jié)這些信號通路，如Src家族激酶的 活性， 一些MAPK信號通路(20， 25， 26)。卩-抑制蛋白l(基因號NM-004041)是 GPCRs的重要調節(jié)蛋白，在細胞質與細胞核中都有分布。近來，人們又發(fā)現，(3arrl 不僅在細胞質里調節(jié)著信號通路，在核里它能直接調控基因的轉錄(27)。表明 卩arrl的有些功能是通過影響基因的表達來實現的。Parrs是一類泛表達的蛋白，但 它的蛋白水平在神經細胞和免疫細胞中相對更高，如(28， 29)報道和圖2A所示。 最近的研究發(fā)現，Parr2在初級免疫細胞中負調節(jié)Toll-like受體的信號傳導。而另一 實驗室發(fā)現，A^d;小鼠在哮喘模型中的發(fā)病及病情顯著低于其野生型(30， 31)。 但是到現在為止，人們仍然沒有發(fā)現(3arrl在免疫細胞中的功能。

發(fā)明內容
經過研究，本發(fā)明者發(fā)現，parrl正調控CD4+T細胞的存活和其在體內的動態(tài) 平衡。Parrl的這個功能很可能是通過其核內功能實現的，在核內它能促進基 因區(qū)組蛋白H4的乙?；胶驮摶虻谋磉_。本申請實施例中進一步闡明了(3arrl 調節(jié)〔04+ T細胞存活的重要生理意義l)在自身免疫脫髓鞘疾病小鼠模型EAE的 實驗中，A^r/敲除小鼠對EAE的誘導很不敏感而^Ar/轉基因小鼠的發(fā)病相對野生 型有明顯的增加；2)在自身免疫脫髓鞘疾病MS的病人外周血CD4+T細胞中，parrl 和Bcl-2的表達顯著地高于正常對照。而這種庫rr/和的高表達對CD4+T細胞 的存活是重要的。因此，本發(fā)明提供了一種新的調控CD4+T細胞生理功能的分子 機制，并且為利用這種分子機制來治療自身免疫疾病提供了基礎。
具體而言，本發(fā)明一方面涉及(3抑制蛋白1的抑制劑在制備藥物中的用途，其 特征在于，所述P抑制蛋白l的抑制劑選自(i)抑制(3抑制蛋白l活性的物質；(ii)抑制 編碼(3抑制蛋白1的基因轉錄、翻譯或這兩者的物質，所述藥物用于治療或預防哺 乳動物對象的與CD4+T細胞凋亡異常相關的疾病。
本發(fā)明另一方面提供了用于治療或預防對象的與CD4+T細胞凋亡異常相關的 疾病的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含有效量的(3抑制蛋白1的抑 制劑作為活性組分，以及藥學上可接受的載體，其中所述P抑制蛋白1的抑制劑選 自(i)抑制P抑制蛋白l活性的物質；(ii)抑制編碼P抑制蛋白1的基因轉錄、翻譯或這 兩者的物質。
本發(fā)明還有一方面還提供了一種從候選物質中篩選出用于治療或預防與CD4+ T細胞凋亡異常相關的疾病的藥物的方法，該方法包括a)使所述候選物質與表達 P-抑制蛋白1的細胞接觸；b)鑒定(3-抑制蛋白1在所述細胞的細胞核內的表達水平，并將該表達水平與未接觸所述候選物質的細胞的細胞核內(3-抑制蛋白1表達水平相
比較；c)選出使細胞核內P-抑制蛋白1表達水平降低的物質作為治療或預防與004+ T細胞凋亡異常相關的疾病藥物。
本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點可以通過下文的詳細描述和具體實施例來獲知。


圖1顯示了 P-抑制蛋白1正調控CD4+ T細胞的動態(tài)平衡和存活。圖中(A) 分離ySa"尸-(1K0), P ;rWg (1TG)和野生型(WT)小鼠脾細胞(上)以及淋巴細胞 (下)，流式細胞分析CD4和CD8分子在這些細胞上的表達。FACS圖是每組10 只小鼠中的代表。數字顯示的是每個區(qū)域的細胞百分比。(B,C)從^W7-,~廳&和 野生型小鼠中分離CD4+和CD8+T細胞，這些細胞用CD3和CD28的抗體激活(C) 或不激活(B)。隨后，細胞培養(yǎng)在單純的培養(yǎng)液里。活細胞的數量是通過排除PI 和膜聯(lián)蛋白V陽性的細胞得到。三次平行實驗，* P<0.05, ** PO.01和相應對照比 較。(D,E) y5^r,-， y^rW g和野生型小鼠每組5只腹腔注射100 pg SEB。尾靜脈取 血，外周血中TCRVp8，或Vp"陽性的。04+和CD8+T量用流式細胞分析得到。 數據從三次平行實驗得到，*P<0.05，**P<0.01和相應對照比較。
圖2顯示了p-抑制蛋白l在小鼠不同組織的表達以及A^,-小鼠的淋巴細胞的 發(fā)育。(A)免疫印跡的方法檢測小鼠不同組織中(3arrl和(3arr2的表達，肌動蛋白 作為上樣量的內參。(B)流式細胞分析Awr,-和M小鼠(13-18周)來源的脾臟 細胞和淋巴細胞中CD3和B220的表達，FACS圖是每組5只小鼠中的代表。數字 顯示的是每個區(qū)域的細胞百分比。脾臟細胞(上)和淋巴細胞(下)中特異細胞群的 細胞數也顯示了。 (C)流式細胞分析/ fl廳,-和*小鼠(13-18周)來源的胸腺細 胞中CD4禾n CD8的表達。FACS圖是每組大于5只小鼠中的代表。數字顯示的是每 個區(qū)域的細胞百分比。特異細胞群的細胞數也顯示了。 DP表示雙陽性，DN表示雙 陰性，SP表示單陽性。**P<0.05和相應對照比較。
圖3顯示了 p-抑制蛋白1對CD4+T細胞中IL-2分泌、Akt和Erk激活的影響。 (A)脾臟CD4+ T細胞用相應量的CD3和CD28的抗體激活，24小時后用ELISA 檢測培液中IL-2的水平。數據來源于三次平行實驗。(B)^^,-和w〃j、鼠來源的 脾臟CD4+T細胞用相應量的CD3和CD28的抗體激活或不激活，免疫印跡實驗檢 測磷酸化的(p-) Akt, (p-) Erk和所有的Akt, Erk水平。圖是兩次次平行實驗中的代表。
圖4顯示了不同處理后，(3-抑制蛋白和p300的表達以及p-抑制蛋白1對&/-2 家族基因的轉錄影響。(A) Jurkat細胞中轉染如圖所示的質粒后，免疫印跡實驗檢 測其對這些蛋白表達的影響。(B) Jurkat細胞中轉染如圖所示的質粒后，RT-qPCR 實驗檢測&/-2，5似,說'附，萬^/和萬cZ-;c/的轉錄水平，7ff7 r來歸一化上樣量。數據來源于三次平行實驗，**P<0.01和相應對照比較。
圖5顯示了 P-抑制蛋白1促進CD4+ T細胞中的表達。(A)脾臟CD4+ T 細胞用CD3和CD28的抗體激活相應的時間，免疫印跡實驗分析(3arrl,Bcl-2和Bax 的表達。肌動蛋白用作上樣的內參。(B,C，D)從〃aAT,-(C)， y5fl"/g(B)， / an^-(D)和 野生型小鼠脾臟中分離004+ T細胞，并按上所述方法激活相應的時間。細胞取樣 后，用RT-qPCR和免疫印跡分別檢測Bcl-2和Bax的mRNA水平和Bcl-2， Bax及 Parrl的蛋白水平。m/Z/^r是RT-qPCR實驗的內參，而肌動蛋白是免疫印跡實驗的 內參。所有的免疫印跡和RT-qPCR實驗平行做三次以上，**P<0.01和相應對照比 較。
圖6顯示了P-抑制蛋白1通過轉錄促進&/-2的表達以及卩-抑制蛋白1對CREB 和NF-kappa B報告基因的影響。(A)Jurkat細胞中轉染如圖所示的質粒后，RT-qPCR 和免疫印跡實驗檢測萬c/-2和^ox的表達水平。(B， C) Jurkat細胞中轉染y5ga/或 y5"rr/ 33小時后，用0, 5, 10 pg放線菌酮(CHX) (B)或0, 2, 4 pM放線菌素D (Act)
(C)處理細胞15小時，RT-qPCR和免疫印跡實驗檢測￡c/-2和的表達水平。 數據來源于三次平行實驗，** PO.01和相應對照比較。(D)HEK293細胞中，單轉 染CREB-luciferase報告基因質?；蚝筒煌康腁^W質粒共轉。數據用相對于對照 的上調倍數表示。10 毛喉素(FK)是陽性對照。數據來源于三次平行實驗。(E) HEK293細胞中，單轉染NF-kappaB-熒光素酶報告基因質?；蚝筒煌康腲庁7質 粒共轉。數據用相對于對照的上調倍數表示。TNF-a是陽性對照。數據來源于三次 平行實驗。* PO.05, ** PO.01和相應對照比較。
圖7顯示了 (3-抑制蛋白1促進CD4+ T細胞中基因座組蛋白H4乙?；?水平。脾臟CD4+ T細胞用CD3和CD28的抗體激活，細胞在不同時間取樣后用 CHIP實驗分析。在CHIP實驗中用了組蛋白H3乙?；虷4乙酰化的抗體。在上 樣中和抗體染色質沉淀中和5ax基因啟動子區(qū)的序列用qPCR分析。數據用 上樣中的量來歸一化。(A)使用了 >^小鼠的。04+ T細胞，并且分析了組蛋白H4
(左)乙?；虷3 (右)乙酰化的水平。(B)使用了/ a廳"g和w〃j、鼠的CD4+T 細胞。(C)使用了^〃,-和^小鼠的€04+ T細胞。(D)用CHIP-qPCR實驗分析 / ^r/;和M小鼠的CD4+T細胞中萬cZ-2基因區(qū)的組蛋白H3乙?；虷4乙?；?平。圖上給出了同一位點M和/ fl廳,-組蛋白乙?；降谋戎怠?0"代表轉錄起始 位點，"u"代表轉錄起始位點上游。數據來源于三次平行實驗，**P<0.01和相應對 照比較。
圖8顯示了 p300在(3-抑制蛋白1上調5c/-2轉錄中的作用。 (A-D)轉染有如圖所示質粒的Jurkat細胞用CHIP實驗分析組蛋白H4(A,C)和 H3(B，D)的乙酰化水平。在上樣和免疫沉淀復合物中(A，B，C，D)和5欲(A，B)啟動子區(qū)的DNA序列用qPCR檢測。(E，F)轉染有如圖所示質粒的Jurkat細胞用 RT-qPCR實驗分析萬c/J(E)和萬似(F)的轉錄水平。數據來源于三次平行實驗，** PO.01和相應對照比較。
圖9顯示了 (3-抑制蛋白1促進小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎。(A)在6-S周的 A^r,-,々wr/《和vv/小鼠中誘導EAE,誘導后每天觀察小鼠的發(fā)病情況。數據是4 次實驗的總和，包括10只y5a〃,-， 10只^wr"g禾卩14只w〃J、鼠。(B)從EAE小 鼠中取出脊髓，固定并用蘇木精曙紅觀察炎性侵染以及Luxol fast blue觀察脊髓的 脫髓鞘程度。圖中所示是3-4只小鼠中的典型。(C)小鼠誘導EAE 8天以后，用 MOG肽段重刺激小鼠脾臟細胞檢測細胞增殖。數據來源于三次平行實驗，^P0.01 和相應對照比較。(D)小鼠誘導EAE 8天以后，從脾臟細胞中分離得到CD4+和CD8+ T細胞。無血清培液誘導這些細胞凋亡，存活的細胞通過排除PI和膜聯(lián)蛋白V陽 性的細胞得到。數據來源于三次平行實驗，**P<0.01和相應對照比較。
圖10顯示了(3-抑制蛋白l和多發(fā)性硬化疾病相關。(A,B)從14位多發(fā)性硬化 病人和14位健康人的外周血中分離得到CD4+T細胞，用RT-qPCR檢測/ a廳7 (A) 和5c/-2 (B)的轉錄水平。*P<0.05， **P<0.01和相應對照比較。(C)從多發(fā)性硬 化病人來源的MBP特異的CD4+ T細胞克隆中，用帶有y ^W siRNA慢病毒千擾 (3arrl的表達。免疫印跡試驗檢測~〃/和萬c/-2的表達水平。圖中所示是三次實驗 中的典型。(D)用帶有y ^W siRNA的慢病毒感染MBP特異的CD4+T細胞克隆。 無血清培液誘導這些細胞凋亡，存活并帶有GFP的細胞是通過排除PI陽性的細胞 得到的。數據來源于三次平行實驗，**P<0.01和相應對照比較。
圖ll顯示了在EAE誘導后(3-抑制蛋白1在CD4+T細胞中的表達，以及CD4+ 和CD8+T細胞中，p-抑制蛋白1的亞細胞定位。(A)免疫印跡實驗檢測誘導了 EAE 八天的小鼠脾CD4+T細胞中的(3arrl水平。圖是兩次平行實驗中的典型。(B)免疫 印跡實驗檢測CD4+和CD8+T細胞中的(3-抑制蛋白1水平。圖是三次平行實驗中的 典型。(C，D) CD4+和CD8+T細胞如前所述激活0 (C)或72 (D)小時，卩arrl在核 內和細胞漿中的水平用免疫印跡實驗檢測。圖是三次平行實驗中的典型。
具體實施例方式
CD4+ T在獲得性免疫中起著重要的功能，對這類細胞凋亡的不正常調節(jié)可能 導致自身免疫的發(fā)生。(3arrl是一已發(fā)現的在G蛋白偶聯(lián)受體信號通路中起多種功 能的蛋白，并且它亦有在核內直接調控基因轉錄的功能。在本發(fā)明中，發(fā)明人發(fā)現 Parrl正調控CD4+T細胞的存活。在yaw7敲除小鼠中，幼稚和激活的CD4+T在體 內和體外實驗條件下都比其野生型易于凋亡。Parrl在CD4+ T細胞中調控著萬d-2 基因區(qū)組蛋白H4的乙?；讲⒂绊懫浠虮磉_。在多發(fā)性硬化的小鼠模型EAE中，A^rJ敲除小鼠的病理嚴重程度明顯低于其野生型，而A^r/轉基因小鼠的病理 嚴重程度卻明顯增加。多發(fā)性硬化病人外周血CD4+T細胞中沐/r/的表達顯著高于 正常人。而從病人來源并與自身抗原反應的CD4+T細胞中導入^w/ siRNAi降低其 表達，這類CD4+T細胞在細胞因子脅迫的情況下凋亡顯著增加，從而揭示了parrl 在調控CD4+T細胞存活和自身免疫中的一個新功能，并且為自身免疫病的治療提 供了新的靶點。
因此，本發(fā)明第一方面涉及(3抑制蛋白1的抑制劑在制備藥物中的用途，其特 征在于，所述p抑制蛋白l的抑制劑選自(i)抑制P抑制蛋白l活性的物質；(ii)抑制編 碼(3抑制蛋白1的基因轉錄、翻譯或這兩者的物質，所述藥物用于治療或預防哺乳 動物對象的與CD4+T細胞凋亡異常相關的疾病。
(I) (3抑制蛋白1的抑制劑
本文的術語"P抑制蛋白1的抑制劑"具有較廣的含義，其包括直接或間接(例
如通過反應性中間物、代謝物等)作用于P抑制蛋白i從而抑制或降低P抑制蛋白i
的生物活性的物質，具體包括(i)在蛋白質水平上通過相互作用直接抑制(3抑制蛋 白l的生物活性的物質；(ii)抑制編碼(3抑制蛋白l的基因轉錄和/或翻譯的物質。此
處所述的"P抑制蛋白1的(生物)活性"指的是(3抑制蛋白1促進CD4+T細胞存活的 活性、促進Bcl-2表達的活性或促進Bcl-2基因座區(qū)組蛋白乙?；降幕钚?。
本領域技術人員應當理解，本文的(3抑制蛋白1的范圍不僅包括(3-抑制蛋白1 的全長序列，而且還包括了所述蛋白的各種變異形式、片段、衍生物或類似物，只 要所述變異形式、片段、衍生物或類似物具有上述相同或相似的活性。這些變異形 式包括(但并不限于)相對于所述多肽的氨基酸序列有若干個(較佳地1-10個，更佳 為1-5個，最佳為l-3個)氨基酸的缺失、插入和/或取代的蛋白，或是與其相同(同 源)或基本上相同(同源)且有相同或相似生物活性或功能的多肽，例如有至少60%、 更佳70%、還要佳80%、 90%、甚至95%以上的同源性或相同性的多肽。這些類 似物或衍生物與天然蛋白的差別可以是氨基酸序列上的差異和/或不影響序列的修 飾形式上的差異。
在一個較佳的實施方案中，可抑制P抑制蛋白1活性的物質是特異性結合P抑制 蛋白l從而抑制其活性的物質，例如，對(3抑制蛋白l有特異性的多克隆抗體和單克 隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，"特異性"是指該抗體能結合于P抑制蛋白l但 不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。該抗體的范圍內還包括了抗體的各種 修飾形式、及其片段如Fab'或(Fab)2片段等。所述抗體可以通過本領域內技術人員 已知的各種技術制備，如免疫動物產生多克隆抗體或雜交瘤生產單克隆抗體。另外，除抗體外的其它已知能和(3抑制蛋白1特異性結合的其受體、配體也在所述"可抑 制J3抑制蛋白l活性的物質"的范圍內。
在另一實施方案中，可抑制P抑制蛋白1活性的物質是本領域技術人員已知的 具有此抑制效果的化合物，例如，放線菌素、放線菌酮或其藥學上可接受的鹽、衍 生物或類似物。本領域技術人員也完全能夠根據本發(fā)明所述的篩選方法來從候選物
中選出其它可抑制P抑制蛋白l活性的物質。另外，已知一些G蛋白偶聯(lián)受體的激 動劑也能通過影響(3arrl在細胞核和細胞質的分布從而間接影響(3arrl的活性。這些 G蛋白偶聯(lián)受體的激動劑例如包括，但不局限于，如5阿片受體和K阿片受體的激動 劑等。因此，這些G蛋白偶聯(lián)受體的激動劑也包括在本發(fā)明的范圍內。
"抑制編碼I3抑制蛋白1的基因轉錄和/或翻譯的那些物質"主要指的是在基因 水平上通過間接作用于P抑制蛋白1的基因來影響(3抑制蛋白1的表達，從而抑制其 活性的那些物質，通常是核酸類物質。
在一個實施方案中，這些物質例是P抑制蛋白l的編碼基因(基因號:NM-004041) 的全部或部分序列的反義序列。該反義序列的長度通?？稍?-200、較佳為10-100、 更佳為20-50個堿基之間。此種反義核酸分子可用化學方法來合成，采用的是天然 的核苷酸或設計成可提高分子生物穩(wěn)定性或增高與P抑制蛋白1 mRNA或(3抑制蛋 白1基因形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性的各種修飾的核苷酸。該反義序列也可用生物 學方法制得，用表達載體以重組質粒，嗜菌?；驕p毒病毒形式引入細胞內，在該細 胞內反義序列在高度有效的調節(jié)區(qū)之控制下產生，其活性可由引入載體的細胞類型 決定。
在另一實施方案中，抑制編碼(3抑制蛋白1的基因轉錄和/或翻譯的那些物質是 小干擾RNA(siRNA)。 RNA干擾是一種新近發(fā)現的體內基因沉默現象。小干擾RNA 是外源性雙鏈RNA的加工產物，其在細胞內能介導RNA干擾效應，識別特異性 mRNA，沉默同源基因表達。在針對哺乳動物細胞設計siRNA時，較為有效的siRNA 具有20-30個堿基、更佳為21-25個堿基大小，其3'端宜有兩個突出堿基。siRNA 的序列專一性要求非常嚴謹，與耙mRNA之間一個堿基錯配都會顯著削弱基因沉默 的效果。本領域技術人員通常可采用以下幾個步驟來設計siRNA : (l)選擇siRNA 靶位點；(2)序列同源性分析；(3)設計陰性對照。設計出的siRNA也同樣可以用化 學合成方法或體外轉錄法來合成。關于(3抑制蛋白1 siRNA的構建的具體例子，可 以參見Parruti, G.等人，J Biol Chem 268, 9753-61 (1993)。
在還有一個實施方案中，抑制編碼P抑制蛋白l的基因轉錄和/或翻譯的那些物 質是核酶。核酶是能夠特異性地與靶RNA分子配對，繼而在特定的位點切割后者， 中止相應蛋白產生的核糖核酸分子。目前已知有七大類自然存在的核酶，即一類內 含子、二類內含子、RNaseP的RNA亞基、錘頭狀核酶、發(fā)夾型核酶、肝炎S病毒核酶、和VS核酶。在核酶家族中，錘頭狀核酶為最小(長約40-50個核苷酸)， 有結構簡單和設計簡易的優(yōu)點。例如，可直接用化學方法合成DNA序列，然后利 用DNA重組技術連接到重組質粒中轉錄制得所述核酶，然后在試管內對所設計的 核酶對RNA底物分子的剪切特異性和效率的驗證。另外，可用PCR技術來擴增 RNA(Saiki， et al. Science 1985;230:1350-1354)。將核酶的基因克隆到質粒、腺病毒、 或逆轉錄病毒載體中。
在獲得上述抑制編碼I3抑制蛋白1的基因轉錄和/或翻譯的核酸序列(如反義序 列、核酶或小干擾RNA)后，就可用常規(guī)技術例如轉化、轉染、感染及物理技術(如 電穿孔及微量注射)將其引入對象細胞內。另外也可用化學方法例如DNA共同沉淀 及摻入脂質體的方法或是以氣溶膠或灌洗形式來輸送。用來轉移核酸分子的適當的 病毒載體、質?；蚩寺≥d體為本領域所知。適當的病毒載體的例子包括逆轉錄病毒 載體、慢病毒載體、腺病毒載體及DNA病毒載體等。這些技術對于本領域技術人 員而言均是熟知的。
另外，在本發(fā)明中，也可考慮通過基因變換方法(如用等位基因置換、插入失 活及缺失形成進行定向基因誘變)來干擾編碼P抑制蛋白1的基因的轉錄，從而選擇 性地抑制P抑制蛋白1的活性。
(II)用途
本發(fā)明的(3抑制蛋白1的抑制劑可用于治療對象體內與CD4+ T細胞凋亡異常 相關的疾病。本發(fā)明適用的哺乳動物對象包括人、家畜和農場動物、非人靈長類、 以及動物園、運動場動物，或寵物，如狗、馬、貓、奶牛等。在一個較佳的實施方 案中，所述哺乳動物是人。
本文所述的"CD4+ T細胞凋亡異常"的含義是，與正常對象的004+ T細胞 相比，CD4+T細胞凋亡水平降低、存活能力提高。所述CD4+T細胞凋亡尤指外周 血中的發(fā)生CD4+T細胞凋亡。
與CD4+T細胞凋亡異常相關的疾病具體包括自身免疫疾病、淋巴細胞增多癥。 自身免疫病是指機體所產生的自身抗體或致敏淋巴細胞破壞、損傷自身的組織和細 胞成分，導致組織損害和器官功能障礙而引起的疾病。導致自身免疫疾病的根本機 制是免疫耐受性的終止和破壞。自身免疫性疾病往往同時具有以下特點①患者血 液中可測行高效價自身抗體和(或)自身組織成分起反應的致敏淋巴細胞。②自身 抗體和(或)自身致敏淋巴細胞作用于靶抗原所在組織、細胞，造成相應組織器官 的病理性損傷和功能障礙。③在動物實驗中可復制出相似的病理模型，并能通過患 者的血清或淋巴細胞使疾病被動轉移。④病情轉歸與自身免疫反應強度密切相關。 ⑤除一些病因明了的繼發(fā)性自免疫性疾病可隨原發(fā)疾病的治愈而消退外，多數原因不明的自身免疫常呈反復發(fā)作和慢性遷延。
適合用本發(fā)明來進行治療或預防的自身免疫疾病包括，但不局限于，類風濕關 節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎、硬皮病、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、脫髓鞘疾 病、原發(fā)性腎上腺皮質萎縮、慢性甲狀炎、I型糖尿病、慢性非特異性潰瘍性結腸 炎、慢性活動性肝炎、惡習性貧血與萎縮性胃炎、自身免疫性腎小球腎炎、肺腎出 血性綜合癥、自身免疫性溶血性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜、特發(fā)性白細胞減 少癥等。
在較佳的實施方案中，適合用本發(fā)明來進行治療或預防的自身免疫疾病包括脫 髓鞘疾病、多發(fā)性硬化或I型糖尿病。
(HI)藥物組合物
本發(fā)明還提供了一種用于治療或預防哺乳動物對象的與CD4+T細胞凋亡異常 相關的疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含有效量的(3抑制蛋白1的抑制劑作 為活性組分，以及藥學上可接受的載體，其中所述p抑制蛋白1的抑制劑選自(i)抑制 P抑制蛋白l活性的物質；(ii)抑制編碼P抑制蛋白1的基因轉錄、翻譯或這兩者的物 質。
本發(fā)明的藥物組合物含有本文詳細描述的抑制(3抑制蛋白1的物質或用本發(fā)明 的方法鑒定出的物質。該活性物質可以單獨給予，但是通常是和藥物載體等一同給 予，這可根據所選的給藥途徑和標準醫(yī)藥實踐來選擇。給藥劑量應當是"有效量"， 即治療、緩解或預防目標疾病或狀況的量，或是表現出可檢測的治療或預防效果的 量。給藥劑量隨用途及已知因素(例如特定物質的藥效學特性及其給藥方式及途徑； 接受者的年齡、健康情況及體重；病情性質及程度；伴隨治療種類，治療頻度及期 望效果)而異。對于某一對象的精確有效量取決于該對象的體型和健康狀況、病癥的 性質和程度、以及選擇給予的治療劑和/或治療劑的組合。因此，預先指定準確的有 效量是沒用的。然而，對于某給定的癥狀而言，可以用常規(guī)實驗來確定該有效量， 臨床醫(yī)師是能夠判斷出來的。
術語"藥學上可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體或賦形劑，其應當與本 發(fā)明的P抑制蛋白1的抑制劑相容，即能與其共混而不會在通常情況下大幅度降低 藥物組合物的效果?？勺鳛樗帉W上可接受的載體或賦形劑或其組分的一些物質的具 體例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及 其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末；麥芽； 明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉 籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween;潤濕劑，如月桂基硫酸鈉；著 色劑；調味劑；壓片劑、穩(wěn)定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和 磷酸鹽緩沖液等。另夕卜，在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co. ， N.J.
1991)中可找到關于藥學上可接受的賦形劑的充分討論。
本文詳細描述的或用本發(fā)明方法鑒定的一種以上的物質還可以和其它藥劑聯(lián) 合使用。它們可以作為單獨分開的劑型同時或并行給藥，或作為各組分治療劑的物 理組合物以單獨或組合的劑型給藥。本發(fā)明的物質可經口、經外用、直腸、胃腸外、 局部、吸入方式使用。該物質也可經由控釋或緩釋膠囊系統(tǒng)及其它藥物輸送技術給 藥。
例如，對于以片劑或膠囊劑形式的口服給藥，可將活性物質與藥學上可接受的 無毒、口服、惰性載體(如乳糖，淀粉，蔗糖，葡萄糖，甲基纖維素，硬脂酸鎂，磷
酸二鈣，硫酸鈣，甘露糖醇，山梨糖醇等)合用；對于液體劑型的經口給藥，口服活
性物質可與任一種藥學上可接受的口服、無毒惰性載體(如乙醇，甘油，水等)合并。 如果需要，也可將合適的粘合劑，潤滑劑，崩解劑，及著色劑攙混于劑型中。合適 的粘合劑包括淀粉，明膠，天然糖類如葡葡糖或p-乳糖，玉米增甜劑，天然及合成 的樹膠如阿拉伯膠、西黃蓍膠或海藻酸鈉，羧甲基纖維素，聚乙二醇，蠟類等?？?用于這些劑型的合適的潤滑劑包括油酸鈉，硬脂酸鈉，硬脂酸鎂，苯甲酸鈉，乙酸 鈉，氯化鈉等。崩解劑的例子包括淀粉，甲基纖維素，瓊脂，皂土，黃原膠等。本 發(fā)明所述的藥物組合物也可以脂質體輸藥系統(tǒng)形式給藥，例如小的單層囊，大的單 層囊及多層囊。脂質體可由各種磷脂(如膽固醇，硬脂基胺或磷脂酰膽堿)形成。本 發(fā)明詳細描述的以及用本發(fā)明方法鑒別的物質也可與可溶性聚合物偶合，這些聚合 物為可定向的藥物載體。這些聚合物的例子包括聚乙烯吡咯垸酮，吡喃共聚物，聚 羥丙基甲基丙烯酰胺-酚，聚羥乙基天冬酰胺酚，或被棕櫚?；〈木郗h(huán)氧乙垸-聚賴氨酸。這些物質也可與用于控制藥物釋放的可生物降解的聚合物偶合。合適的
聚合物包括聚乳酸，聚乙醇酸，聚乳酸及聚乙醇酸的共聚物，聚s-己內酯，聚羥丁
酸，聚原酸酯類，聚縮醛類，聚二氫吡喃類，聚氰基丙烯酸酯類，水凝膠的交聯(lián)或
兩親性嵌段共聚物。合適的藥物載體及藥物的制法在《雷明頓醫(yī)藥科學》Mack Publishing Company中有所描述，這是本領域的標準參考文獻。
(IV)鑒定方法
技術領域：
本發(fā)明另一方面還提供了一種從候選物質中篩選出用于治療或預防與CD4+ T 細胞凋亡異常相關的疾病的藥物的方法，該方法包括 a)使所述候選物質與表達(3-抑制蛋白1的細胞接觸；b) 鑒定p-抑制蛋白1在所述細胞的細胞核內的表達水平，并將該表達水平與未
接觸所述候選物質的細胞的細胞核內P-抑制蛋白1表達水平相比較；
c) 選出使細胞核內P-抑制蛋白1表達水平降低的物質作為治療或預防與CD4+T 細胞凋亡異常相關的疾病藥物。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。除非另有描述，本發(fā)明的實施將采用分子生物學、 微生物學、重組DNA和免疫學的常規(guī)技術，這些均是本領域技術人員所知的。這 些技術在下列文獻中有完整的描述例如，Sambrook《分子克隆實驗指南》第2版 (1989);《DNA克隆》第I和II巻(D.N. Glover編輯1985);《寡核苷酸合成》(M丄Gait 編輯，1984);《核酸雜交》(B.D.Hames和S丄Higgins編輯.1984);《蛋白質純化 原理和實踐》第2版(Springer-Verlag， N.Y.)，以及《實驗免疫學手冊》I-IV巻(D.C. Weir和C.C.Blackwell編輯1986)?；蛘?，可按照試劑生產商所提供的說明書進行。
實施例 材料和方法
1. 病人樣品
在該研究中，明確診斷是復發(fā)緩和型多發(fā)性硬化的病人志愿者來自復旦大學華 山醫(yī)院和交通大學瑞金醫(yī)院神經內科門診部。按照當地醫(yī)院條例經過病人的知情同 意以后，抽取病人的外周血液樣品。此研究中的健康人志愿者來自中科院上海分院 生化細胞所的員工或學生，部分來自上海市血液中心。他們如前所述也經過知情同思。
2. 人T細胞樣品制備
T細胞用鼠源抗人的抗CD4的抗體標記后，用山羊抗鼠IgG磁珠，分離柱以及 AutoMACS分離裝置進行分離純化，通過FACS檢驗得到純度大于90%的CD4+ T細 胞。
3. 小鼠
C57BL/6小鼠是從中科院上海實驗動物中心購得。具有C57BL/6背景的yft^r,-和A^r2;小鼠是由美國杜克大學醫(yī)學中心Robert J. Lefkowitz博士惠贈。^rr^g 小鼠如Rapid xenograft tumor growth in beta-arrestinl transgenic mice due to the elevation of tumor angiogenesis Lin Zoul, 2, Rongxi Yangl, 3 and Gang Peil描述產生， 并且和C57BL/6回交9代以上。動物的詞養(yǎng)和操作是按照中科院上海生命科學院實驗動物委員會的條例進行。所用的動物在無病原體的環(huán)境下飼養(yǎng)，并且在實驗之前 進行基因組的鑒定。
4. 抗體、試劑、質粒和干擾siRNA
鼠源的抗Bcl-2和Bax的抗體，PE偶聯(lián)的抗鼠CD4、 CD8、 B220、和VpS的抗 體以及FITC偶聯(lián)的抗鼠CD4、 CD8、 CD3和Vp8的抗體購于BD Biosciences公司。 抗(3arrs (A1CT)的兔源多克隆抗體由Robert J. Lefkowitz博士惠贈?？挂阴；M蛋 白H4和組蛋白H3的抗體購自Upstate Biotechnology公司。IRDyeTM800CW偶聯(lián) 的抗鼠IgG和抗兔IgG純化的抗體是從Rockland公司購得?？辜拥鞍椎目贵w和 試劑放線菌素D以及地塞米松是從Sigma公司購得?？笶rk和抗ser217/221磷酸化 的Erk的抗體是Cell Signaling公司的產品，而抗Akt和抗ser473磷酸化的Akt的抗 體是從上海KANGCHEN公司購得。SEB是由北京Biotinge Biomedicine公司生產。 編碼"gfl/， ii4-yftwr/ (如前所述)(29)、 /W-y6^r2、 y6^W0^化的質粒是按照先 前描述構建的(32)。 /7^S/C/6/A^W siRNA、 /755/Wy6^r2 siRNA和/755/t/6/非特異 siRNA的質粒是如前描述構建的(29)。 p300野生型和其活性區(qū)突變體(C/H1缺 失)質粒是從Upstate公司購得。人MBP小肽是由安德生癌癥中心小肽中心實驗 室合成并純化的。小肽的純度大于90%。
5. 流式細胞分析
細胞重懸在含有1%BSA的PBS緩沖液中。用相應細胞表面抗原的熒光抗體 如CD4、 CD8、 CD3、 B220、 TCR V,和Vp6等抗體在推薦的緩沖液中4度孵育1 小時。標記了的細胞經過洗滌后用BD公司的FACSAria儀器分析。
6. 細胞純化、激活和培養(yǎng)
小鼠的脾臟細胞用純化的兔源抗鼠的CD4抗體或兔源抗鼠的CD8抗體標記后， 用山羊抗兔的IgG磁珠，分離柱以及AutoMACS分離裝置進行分離純化，通過FACS 檢驗，得T細胞的純度大于95%。分離純化后的T細胞在包被有大頰鼠源抗鼠的 CD3 (CD3s鏈)單克隆抗體培養(yǎng)皿中和CD28單克隆抗體共同刺激下激活。培養(yǎng)用 的是RPMI1640培液加上10%的胎牛血清，2mM L-glutamine,5 mM 2-ME,和100單 位/ml的青霉素。髓磷脂基質蛋白(MBP)特異的CD4+T細胞是培養(yǎng)在含有20ng/ml 的MBP小肽(33)禾P 100U/ml的人重組IL-2的RPMI1640培養(yǎng)液中。
7. 逆轉錄和實時定量PCR
實驗中所有的總RNA都按照Invitrogen使用指南用TRIzol提取。在逆轉錄的實驗中，使用了 oligo(dT)引物和superscript II系統(tǒng)。所有定量的基因轉錄實驗都由 qPCR完成。使用的qPCR系統(tǒng)主要包括:Brilliant SYBR Green QPCR Master MIX 和一個Light Cycler檢測儀(Stratagene)。使用的引物有鼠&/-2-sense， 5，-TTC TCC TTC CAG CCT GAG AGC AA-3' (SEQ ID NO: 1), antisense, 5，-ATG ACC CCA CCG AAC TCA AAG-3 (SEQ ID NO: 2)，；鼠5ax-sense, 5，-AGG ATG CGT CCA CCA AG-3， (SEQ ID NO: 3)， antisense, 5'陽AAG TAG AAG AGG GCA ACC AC-3， (SEQ ID NO: 4);鼠朋燈-sense, 5，-CCT GCT GGA TTA CAT TAA AGC ACT G-3， (SEQ ID NO: 5), antisense, 5，-TTC AAC ACT TCG AGA GGT CCT-3， (SEQ ID NO: 6);鼠 //尸i r作為cDNA輸入對照；人i/尸Ar-sense, 5，-CCT GCT GGA TTA CAT CAA AGC ACT G-3， (SEQ ID NO: 7), antis畫，5'陽TCC AAC ACT TCG TGG GGT CCT-3， (SEQ ID NO: 8);人to-sense 5，-ATC CAG GAT CGA GCA GGG CG-3， (SEQ ID NO: 9)， antisense, 5，陽ACT CGC TCA GCT TCT TGG TG-3， (SEQ ID NO: 10);人所m-sense, 5，-CAA TGG CTA ACT GGG ACT A-3， (SEQ ID NO: 11), antisense, 5,-TCT TCG GCT GCT TGG TAA -3' (SEQ ID NO: 12);人5ad-sense, 5，-CCA GAG TTT GAG CCG AGT GAG-3' (SEQ ID NO: 13)， antisense, 5，-GCT GTG CTG CCC AGA GGT T-3， (SEQ ID NO: 14);人ScZ-xZ-sense, 5，陽CAA CCC ATC CTG GCA CCT陽3， (SEQ ID NO: 15)， antisense, 5，-CGA TCC GAC TCA CCA ATA CC-3， (SEQ ID NO: 16);人^a^W-sense, 5，-GGG ACG CGA GTG TTC AAG AA-3， (SEQ ID NO: 17)， antisense, 5，- AC A AAC AGG TCC TTG CGA AAG-3 ， (SEQ ID NO: 18)。人5c/-2的 轉錄水平使用Tagman探針來完成的5c/-2-sense， 5，-CCT GTG GAT GAC TGA GTA CCT GAA-3， (SEQ ID NO: 19), antisense, 5'國CAG CCA GGA GAA ATC AAA CAG A-3， (SEQ ID NO: 20), Taqman探針，5'{AGG ATA ACG GAG GCT GGG ATG CCT TTf-3，(SEQ ID NO: 21)。
8.EAE的誘導和評估
在EAE誘導中使用的MOG抗原35-55位的氨基酸殘基序列為Met-Glu-Val陽Gly陽Trp-Tyr陽Arg陽Ser-Pro-Phe-Ser陽Arg-Val-Val-His陽Leu-Tyr-Arg-Asn陽Gly-Lys。該肽 段是從BioAsia Biotechnology公司購得，其純度大于95%。急性的EAE誘導是這 樣進行的第一天，皮下注射含有300嗎MOG肽段和5mg/ml熱滅活的肺結核分 支桿菌H37Ra肽鏈(BD公司生產)的CFA,以及尾靜脈注射200ng/小鼠的百日咳 毒素。第三天，再次尾靜脈注射200ng/小鼠的百日咳毒素。誘導了EAE的小鼠每天 進行稱量和病情觀察。按照發(fā)病的嚴重程度對小鼠進行打分，具體是O,沒有任何 病情的癥狀；l，尾巴無力；2，一條或兩條后肢輕癱；3,兩后肢癱瘓；4,前肢輕癱；5， 垂死或死亡。9. 細胞存活分析
T細胞養(yǎng)在無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中。按圖上顯示的時間點，用膜聯(lián)蛋 白-V-FLUOS標記試劑盒(Roche Molecular Biochemicals)通過排除PI和膜聯(lián)蛋白 (annxin) V陽性的細胞得到存活細胞的百分比。在檢測GFP陽性細胞存活的實驗 中，單通過排除PI陽性的細胞得到存活細胞的百分比。
10. 組織化學觀察
從誘導20天的EAE小鼠中取出組織，4%福爾馬林固定，石蠟包埋。然后用 Luxol fast blue或者H&E進行染色。最后，用光學顯微鏡進行觀察照相。共有3-4 只小鼠的脊髓，每只小鼠取3段樣品進行脫髓鞘程度和感染程度的定量檢測(34)。
11. 染色質免疫共沉淀
染色質免疫共沉淀(CHIP)是根據Upstate生物公司的CHIP試劑盒進行的9 在上樣中和免疫沉淀復合物中特異基因啟動子區(qū)的序列是通過qPCR來檢測的。特 異基因啟動子區(qū)引物的設計選在轉錄起始位點上游1000到下游500的堿基區(qū)域內。 所得到的結果是由沉淀中的量用上樣量規(guī)一化得到。使用的基因啟動子區(qū)和萬c/-2 基因位點的引物有鼠5c/-2啟動子sense, 5'-GGC AAA CCC TCC CCC ACC ACC TC-3， (SEQ ID NO: 22), antisense, 5，-CCA CCG GAC CGC TTC AGA CCT C-3， (SEQ ID NO: 23);鼠5ax啟動子，sense, 5，-GGG GAA ACA ACC AAC TCT GG-3， (SEQ ID NO: 24), antisense 5，-CAT CAC TGC CGC TGC CTC T-3， (SEQ ID NO: 25);鼠 5c/-2基因位點u25,000 sense, 5，-GCT GTT TAT CAG TTA GTG GGT C-3， (SEQ ID NO: 26), antisense 5，-GGG TCA GAA GTG GGA GTG-3， (SEQ ID NO: 27); u20,000 sense, 5，-TGC CAA GGT TAG CAG GAC-3， (SEQ ID NO: 28)， antisense, 5，-CCA GAG GAC AAA TGA GGG-3' (SEQ ID NO: 29); ul5,000 sense, 5，-CAT TTG TCT GCC CTA TCT-3， (SEQ ID NO: 30)， antisense, 5，-TTA ACT GGG AAC ACC TCA-3， (SEQ ID NO: 31); ulO,OOO sense, 5，-AGT GCT TAT CGC TCT TCC-3， (SEQ ID NO: 32), antisense, 5'隱CTC CAA ACC TGA CCC TCT-3， (SEQ ID NO: 33); u5,000 sense, 5'陽GCA GCA AAC AAT CTT CAT-3' (SEQ ID NO: 34)， antisense, 5，-ACA CCA ATA CCA ACC CTA-3， (SEQ ID NO: 35); 50,000 sense, 5，-CCT TCT CAA TCA GCC AGC AT-3， (SEQ ID NO: 36), antisense, 5，-AAG CAA GCC TCC TCA CCC-3， (SEQ ID NO:
37) ; 100,000 sense, 5，-CAC TCA GAG AAG AAT TCA CAC AGA A-3， (SEQ ID NO:
38) ， antisense 5，-TTC TGT GTG AAT TCT TCT CTG AGT G-3， (SEQ ID NO: 39); 150,000 sense, 5，-CCC CAG AAC TCA TGT CTC-3， (SEQ ID NO: 40), antisense, 5，-TTC CAA TGC TCT CCC AAA-3' (SEQ ID NO: 41); 175,000 sense, 5，-CAG AGT GAG TAT TGG AGG AG-3' (SEQ ID NO: 42), antisense, 5'-AAA GAC AGT GGT GGG AAA-3， (SEQ ID NO: 43); 176,000 sense, 5，-TGA CCC TGA GGA GAT GGA-3， (SEQ ID NO: 44), antisense, 5，-GGT ATG ACC TGG GCT TCG-3， (SEQ ID NO: 45); 181,000 sense, 5,-AGG AGC AAA CTC AGG AAT-3' (SEQ ID NO: 46)， antisense, 5，-AGT CAC AAA GAT GGC AGA-3， (SEQ ID NO: 47); 186,000 sense, 5，-CAG ACG CAC CAC TGA TTT-3' (SEQ ID NO: 48), antisense, 5，-AGC AGC CAG CAG ACT TAC-3 ， (SEQ ID NO: 49); 191,000 sense, 5，-TAC GAG CGA TAC ATA CAA C陽3， (SEQ ID NO: 50), antisense, 5，-CTA GAG CCA GTC CTT CTT-3， (SEQ ID NO: 51). 人啟動子區(qū)5c/-2 sense, 5，-GCG ACT CCT GAT TCA TTG-3， (SEQ ID NO: 52), antisense 5，-AGG TGC GTT TCC CTG TA-3， (SEQ ID NO: 53); Box sense, 5，-TAT CGG GAG ATG CTC ATT GGA-3' (SEQ ID NO: 54), antisense, 5，-CCC TCG GGA GGT TTG GTC-3， (SEQ ID NO: 55)。
12. 免疫印跡
在免疫印跡實驗中，蛋白條帶通過增強的化學發(fā)光方法檢測。在一些實驗中， 采用了IRDye800CW偶聯(lián)二抗熒光定量的方法。這些實驗中的圖片由Odyssey遠紅 外圖像系統(tǒng)(Li-CorBioscience公司)取得。
13. 細胞增殖實驗
在細胞增殖實驗中，5 x 10S的鼠脾臟細胞培養(yǎng)在含有MOG或不含MOG的 DMEM完全培養(yǎng)基中72小時。在進行細胞分析前16—18個小時的時候，加入lpCi 的[3H]胸苷。DNA中慘入的[3H]胸苷用(3板檢測儀進行檢測。
14. 細胞系
Jurkat和HEK293細胞是從American Type Culture Collection公司購得，并分 別在RPMI1640或者MEM (Gibco-BRL公司)培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。Jurkat細胞用 Amaxa的轉染試劑盒進行轉染，而HEK293細胞用磷酸鈣的方法進行轉染。
15. 細胞因子的檢測
2 x 105的CD4+ T細胞如前所述用CD3和CD28抗體激活24小時，細胞上清 收集后根據PIERCE公司的使用指南用IL-2 ELISA試劑盒進行檢測。同時，用純 化并已知濃度的重組鼠IL-2做定量用的標準線。16. 細胞核組分的提取
細胞核組分按照以前的描述經過一些改動進行提取(27)。具體地用各種方
法處理后的細胞洗滌后重懸于400^1的低滲緩沖液中，冰浴10分鐘。后加3|^10% 的NP-40混勻，繼續(xù)冰浴5分鐘。短暫離心后，所得沉淀即為細胞核組分粗提物。 該組分經洗滌，重懸于低滲緩沖液中4度搖晃1小時。再經離心，得到的上清即為 細胞核組分。
17. 報告基因實驗
HEK293細胞中共轉染Clontech公司的pNF-kappa-B-Luc或pCREB-TA-Luc， 和pRL-TK，以及一些圖中所顯示的質粒。轉染36小時以后，用雙熒光素酶報告分 析系統(tǒng)檢測熒光素酶的活性。用10ng/ml毛喉素(FK)處理和10ng/ml rhTNF-a
處理的細胞作為實驗的陽性對照。
18. 數據處理和統(tǒng)計
定量實驗數據用平均數土s.e.m表示。用one-way ANOVA檢測數據間是否有統(tǒng) 計學差異，然后再用Bonferroni post-hoc對多組數據或tow-tailed Student's f檢測兩
組數據間的顯著性差異。
實驗結果
1. parrl正調節(jié)外周血CD4+ T細胞的動態(tài)平衡和存活
在研究A^r/敲除(^廳,-)小鼠免疫系統(tǒng)的時候發(fā)現當小鼠在13周以后外 周淋巴系統(tǒng)中CD4+ T細胞的數量明顯變少(圖1A和2B)。 CD4+ T細胞的數量是由 胸腺中進入的CD4+ T細胞和外周CD4+ T細胞的凋亡來維持的。發(fā)明人檢測了 y6^r,-小鼠和野生型(w。小鼠中胸腺細胞CD4+T細胞和CD8+T細胞的數量，發(fā) 現并沒有改變(圖2C)。隨后，發(fā)明人檢測了外周血004+ T細胞的凋亡。從A^r產-小鼠，~〃/轉基因(y^廳"g)小鼠和M小鼠脾臟分離得到CD4+T細胞，用抗-CD3 和抗-CD28抗體激活或者不激活,然后在無血清也無細胞因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。圖 1B和1C顯示，激活了的;&wt/《CD4+ T細胞生存能力比其野生型明顯增加，而 yferr,-的CD4+ T細胞無論是在其幼稚還是激活狀態(tài)下都明顯比其野生型對凋亡更 敏感。這些數據表明(3arrl促進CD4+T細胞體外的生存能力。
為了進一步表明體內的情況，發(fā)明人用SEB來注射小鼠。SEB在體內能特異 地激活CD4+ Vp8.1/2 T細胞而對CD4+ Vp6.1 T細胞沒有影響(16)。如圖ID和IE 所示各基因型的小鼠中，CD4+Vp8.1/2T細胞的數量在SEB注射三天后顯著增加， 而在注射七天后有明顯的下降。在此后的幾天中觀察到/3^r7,g的CD4+Vp8.1/2T細胞凋亡明顯少于wf的，而^/^-/-小鼠的〔04+Vp8.1/2 T細胞凋亡比wf增多。這 些結果表明在體內Parrl也能促進CD4+T細胞的存活。IL-2是促進幼稚和激活的 CD4+T細胞的一個重要細胞因子(55-57)。當CD4+T細胞在體外激活后，它們產 生大量的IL-2 (1)。然而，如圖3A所示yQbAT,-CD4+T細胞產生IL-2的能力比其 M要略強。因此，(3arrl不可能是通過影響CD4+T細胞IL-2的產生來調節(jié)這些細胞 存活的。
2.parrl促進BcI-2的表達
進一步研究了 (3arrl促進CD4+T細胞存活可能的分子機制。考慮到Akt(38) 和Erk (39)的激活能促進CD4+ T細胞存活，并且(3arrl本身能正調節(jié)Akt和Erk 的活性(20)，因此，研究了是否是由于Parrl上調Akt或Erk的活性從而促進CD4+ T細胞的存活能力。^w/;和M的CD4+T細胞如前所述那樣在體外激活，用Akt 和Erk的磷酸化抗體來檢測它們的活性。如圖3B所示，在幼稚和激活了的CD4+T 細胞中，^廳,-并沒有影響Erk的磷酸化水平；而Akt的磷酸化水平在激活狀態(tài)下 的CDf T細胞中有所下降。因為，Parrl能同時促進幼稚和激活了的004+ T細胞 的存活，而Parrl并沒有影響幼稚CD4+ T細胞中Akt和Erk的磷酸化水平，所以， 推測(3arrl促進CD4+ T細胞的存活還有其他的機制。Affymetrix基因芯片數據表明 通過siRNA抑制parrl的表達能降低抗凋亡分子Bc/-2的表達，但并不影響B(tài)cl-2家 族其他蛋白的表達，如所m, 5ax和ScZ-x/等。在Jurkat T細胞中進一步驗證了這 些結果(圖4),并且發(fā)現是核內的parrl調控著5c/-2的表達，因為(3arr2和 (3arrlQ394L(Parrl不進核的突變體)(32， 40)并沒有此功能。
Bcl-2是調節(jié)幼稚和激活T細胞存活的一個重要分子(1， 16)，因此進一步檢 測了在CD4+ T細胞中Parrl和Bcl-2的表達情況丄04+ T細胞如上述方法激活以后， Parrl和Bcl-2的蛋白水平在前兩天中逐步下降，而在激活后第三天升高并在隨后保 持該水平(圖5A)。當進一步在激活40到64小時這段時間內檢測f3arrl和Bcl-2的 表達情況，發(fā)現Parrl蛋白水平的升高早于Bcl-2 (圖5A)。是不是在CD4+T細胞 中，(3arrl調節(jié)著Bcl-2的表達呢？發(fā)明人同時激活A^r/《小鼠和M的CD4+ T細 胞，并檢測(3arrl和的mRNA和蛋白水平。結果發(fā)現.'yftw^g小鼠來源的CD4+ T細胞在激活48小時后Parrl的水平明顯比其野生型高，和此一致的是Sc/-2的 mRNA和蛋白水平也在該時間有顯著升高(圖5B)。當^w"和wf小鼠來源的CD4+ T細胞在體外激活后，萬d-2的mRNA和蛋白水平在激活后沒有變化并保持在野生 型里最低的水平(圖5C)。在實驗中發(fā)現，Parr2的蛋白水平也在CD4+T細胞激活 過程中有跟Parrl類似的變化。發(fā)明人在/5b/r2;的CD4+ T細胞檢測了 的mRNA 和蛋白水平，發(fā)現5^-2表達正常(圖5D)。這些結果表明(3arrl而不是Parr2調節(jié)著CD4+ T細胞中的表達，這可能是導致yft^,-和/5^r/g的CD4+ T細胞存活 能力異常的原因，因為這跟&/-2敲除和轉基因的〔04+丁細胞存活能力很類似(18)。 因為在CD4+ T細胞激活過程中的mRNA和蛋白水平同時變化，所以發(fā) 明人用JurkatT細胞來證明Parrl是否通過影響^0/-2的轉錄來調節(jié)它的表達。和 圖4 一致(圖6A)，在Jurkat T細胞中過表達或用siRNA下調parrl能促進或抑制 石C/-2的mRNA和蛋白水平。進一步，發(fā)明人用轉錄抑制劑和蛋白合成抑制劑，發(fā) 現它們都能有效地抑制(3arrl對Bcl-2表達的上調(圖6B和6C)。由此可見，Parrl是 通過促進5^/-2的轉錄來調節(jié)它的表達的。有報道發(fā)現CREB (41)禾n NF-kappaB (42)是影響5cW表達的轉錄因子。但發(fā)明人發(fā)現Parrl并不能在報告基因系統(tǒng)中 影響CREB禾口 NF-kappaB報告基因的活性(圖6D和6E)。由此可見，f3arrl可能是 通過其他方式來調控表達的。
3. 卩arrl促進5c/-2基因座區(qū)組蛋白乙?；?br> 另一條(3arrl調控基因表達的方式是通過上調特異基因啟動子區(qū)的組蛋白H4 的乙?；?27)。在CD礦T細胞激活過程中，發(fā)明人發(fā)現5^/-2基因啟動子區(qū) 的組蛋白H4乙?；降淖兓Ｊ胶捅磉_很相似(圖7A)。 &/-2基因啟動 子區(qū)的組蛋白H4乙酰化水平在CD4+ T細胞激活后逐漸下降，到48小時的時候達 到最低，隨后到72小時的時候又上升。而作為組蛋白H4乙?；降膶φ盏鞍?H3乙?；讲]有改變。進一步發(fā)明人發(fā)現，禾叩arrl對表達影響一致， Parrl也影響著萬d-2基因啟動子區(qū)的組蛋白H4乙?；?。在Az"hg CD4+ T細 胞激活48時，基因啟動子區(qū)的組蛋白H4乙?；较鄬τ谝吧陀酗@著的 升高(圖7B)。而當^庁,-CD4+ T細胞激活后，5"-2基因啟動子區(qū)的組蛋白H4 乙?；揭恢北３衷谙喈斢谝吧椭凶畹偷乃?圖7C)。進一步，發(fā)明人發(fā)現 (3arrl影響著5c/-2基因座區(qū)從轉錄起始點上游lO,OOObp到下游186,000bp染色體區(qū) 的組蛋白H4乙?；?圖7D)。這些實驗表明Parrl很可能是通過促進 基因座區(qū)組蛋白H4乙?；絹砩险{5cZ-2基因表達的。
4. p300在Parrl上調表達中的是必需的
細胞內組蛋白的乙酰化水平是由組蛋白去乙?；负徒M蛋白乙?；刚{控著 的。以前的研究發(fā)現parrl促進組蛋白H4的乙?；绞峭ㄟ^結合組蛋白乙?；?酶p300 (43)并把它募集到特異基因的啟動子區(qū)實現的(27)。因此，發(fā)明人檢測 了p300在Parrl上調5cW表達中的作用。和前面結果一致的是在Jurkat細胞中， Parrl而不是parr2或(3arrlQ394L促進5c/-2基因啟動子區(qū)的組蛋白H4乙酰化水平 (圖8A)。進一步，發(fā)明人發(fā)現p300也能促進Sd-2基因啟動子區(qū)的組蛋白H4乙?；胶蚼RNA水平，而且這種促進能被共表達(3arrl進一步加強而被共表達 yftwr/ siRNA所抑制(圖8C和8E)。 p300DN (p300的無活性突變體)能顯著降低 &/-2基因啟動子區(qū)的組蛋白H4乙酰化水平和5cZ-2mRNA水平，并也能阻斷parrl 對其的促進作用(圖8C和8E)。這些結果顯示p300在(3arrl介導的5^-2基因啟動 子區(qū)H4乙?；降纳吆娃D錄的增加中起重要作用。
5. Parrl在自身免疫病多發(fā)性硬化的作用
信號調控分子對CD4+ T細胞凋亡的精細調控能使CD4+ T細胞不至于產生自身 免疫性?？紤]到Parrl在CD4+T細胞凋亡調控中的重要作用，發(fā)明人進一步研究其 是否會影響自身免疫。小鼠的EAE模型是多發(fā)性硬化(MS)的一個很好的動物模 型(44)。在該模型中，人們認為CD4+T細胞起了主導作用并且它的發(fā)病機理比較 清楚。發(fā)明人用MOG35-55來免疫三種不同基因型的小鼠，誘導其產生EAE。隨后 觀測20天如圖9A所示，發(fā)現/5b廳/-〃小鼠的發(fā)病起始點比M小鼠有顯著后延(M: 9.7±2.9天vs.戶wW;: 16.3±3.0天)并且病的嚴重程度也顯著下降(最大平均病情評 分wt 3.2±0.27 vs. yft^,-: 1.4±0.4)。而在/5kwr/,g小鼠中，雖然發(fā)病起始點跟w〃J、 鼠沒有顯著差別(教9.7±2.9天vs. yfer^g: 8.7±0.8天)，但是病的嚴重程度卻明顯 增力卩(最大平均病情評分"fl〃"g:4.2士0.3vs.鍵3.2士0.2)。與此結果一致的是，當發(fā) 明人檢測小鼠脊髓病變程度的時候發(fā)現，/5^W;小鼠的炎性細胞侵染和脊髓脫髓鞘 程度較輕；而Awhg小鼠卻剛好相反(圖9B)。這些數據表明(3arrl在這個EAE模 型中起著正調節(jié)的作用。因為，Parrl能促進CD4+T細胞的存活，是否該機制參與 到Parrl對自身免疫的正調控中了呢？發(fā)明人首先用MOG35-55來重新刺激EAE小 鼠的脾淋巴細胞，發(fā)現^whg小鼠脾淋巴細胞的增殖明顯高于野生型的，而P『W-M、鼠的則較低(圖9C)。進一步，發(fā)明人用MOG35-55重刺激EAE小鼠脾淋巴細 胞中純化得到的MOG特異的CD4+ T細胞，并觀察在細胞因子脅迫下這些CD4+ T 細胞的存活。和圖1B和1C一致的是從/5^W,g小鼠來的MOG特異的CD4+T細 胞明顯比野生型的存活能力強，而從y&廳,-小鼠中來的CD4+ T細胞存活能力則較 差(圖9D)。這些結果表明Pairl在EAE模型中起著正調節(jié)的作用，這可能是由于 促進CD4+ T細胞的存活能力來實現的。
幾年前，Annevroon和他的同事們發(fā)現在小鼠誘導EAE以后，parrl在外周血 中的水平顯著升高了 (45)。發(fā)明人進一步發(fā)現從￡八6小鼠中來的004+ T細胞中 的Parrl的蛋白水平有顯著升高(圖IIA)。鑒于這些發(fā)現，發(fā)明人檢測了f3arrl在多發(fā) 性硬化病人CD4+T細胞中的表達，如圖10A和IOB所示多發(fā)性硬化病人CD4+T 細胞中^廳/和5c/-2的轉錄水平明顯高于健康人。進一步，用帶有^廳7siRNA的 逆轉錄病毒感染從多發(fā)性硬化病人來源的MBP特異的CD4+ T細胞(46)，發(fā)現Bcl-2的表達顯著下調了 (圖10C)。而當這些MBP特異的CD4+T細胞被感染帶有A^/ siRNA的逆轉錄病毒后經受細胞因子脅迫時，這些細胞明顯比感染了帶有空載體的 逆轉錄病毒更易凋亡(圖IOD)。這些結果表明，在多發(fā)性硬化病人中，針對自身抗 原的CD4+ T細胞有較高的A^r/表達水平，這可能促進了這些細胞的存活能力從而 使它們逃脫機體的監(jiān)管機制促進多發(fā)性硬化的發(fā)展。
討論
在哺乳動物中，免疫系統(tǒng)是體內最動態(tài)的系統(tǒng)之一。而免疫系統(tǒng)中免疫細胞的 調亡受很多胞外和胞內信號的調控以維持其正常的生理功能。Parrl是一個具有多種
功能的信號分子，參與很多信號通路的調節(jié)。此外，它還具有直接進核調控特異基 因轉錄的能力。發(fā)明人在本發(fā)明中發(fā)現，(3arrl能特異地調節(jié)CD4+T細胞的存活和 動態(tài)平衡，從而影響機體的獲得性免疫應答。雖然，在激活的CD4+ T細胞中Akt 的活性受到一定抑制，但是，Parrl影響CD4+T細胞存活的這個能力主要還是通過 其核內功能實現的。在無論是幼稚的還是激活了的CD4+ T細胞核內，)3arrl上調 &/-2基因啟動子區(qū)組蛋白H4乙?；乃?，從而促進5cZ-2基因的表達。進一步 的研究發(fā)現(3arrl在自身免疫引起的脫髓鞘疾病和鏈唑霉素引起的I型糖尿病中起 著重要的作用。在自身免疫引起的脫髓鞘疾病中，那些特異致腦炎的CD4+T細胞 中/3brW的高表達促進這些細胞在體內的存活能力。因此，發(fā)明人的結果表明，|3arrl 在CD4+T細胞存活以及人和鼠的自身免疫疾病中起著重要的調節(jié)作用。
細致的機制分析發(fā)現J3arrl在CD4+T細胞中對表達的調控是通過影響 表觀遺傳修飾來實現的。Bcl-2是通過調控線粒體膜的完整性和存在于線粒體中促調 亡蛋白的釋放來調節(jié)細胞存活的(12)。在T細胞中，Bcl-2必須維持在適當的水平， 否則就會引起T細胞動態(tài)平衡的打破和免疫應答的混亂。然而到目前為止，對于 Bd-2在T細胞中的調控機制，人們還不是很清楚。發(fā)明人發(fā)現不管在幼稚的還是 激活的004+ T細胞中，parrl促進&/-2基因區(qū)組蛋白乙?；乃胶?amp;/-2基因 的轉錄水平。也發(fā)現f3arrl在CD4+T細胞中的這種功能在人和鼠中是保守的。因此， 這些實驗在揭示了一個新穎的調控CD4+T細胞存活的機制以外，還發(fā)現了一種調 節(jié)基因表達的表觀遺傳機制。而這種機制以前是沒有被報道過的。
在這個研究中，(3arrl促進T細胞的存活功能主要針對于外周血的CD4+而不 是008+ T細胞或是胸腺T細胞。在胸腺T細胞中，如圖2A中顯示的那樣(3arrl 的表達水平明顯要低于其在脾臟細胞或是淋巴結細胞的表達水平。這種表達水平的 差異可能是導致Parrl在胸腺T細胞中作用小的原因。然而，從圖11B中可以看到， Parrl表達水平在CD4+和CD8+T細胞中的差異不是很明顯。但是，(3arrl對CD4+和 CD8+ T細胞存活的影響卻有顯著的差異。和野生型細胞比較，A^r^CDf T細胞的存活能力顯著降低，而/5b庁,-CD8+T細胞卻沒有明顯差別。細致的機制顯示是 核內的f3arrl上調了 5c/-2基因區(qū)組蛋白的乙?；胶推滢D錄水平，因為過表達 Parrl的不進核內突變體ParrlQ394L并不影響5c/-2的表達。因此，發(fā)明人猜想是否 (3arrl在004+和CD8+T細胞的亞細胞定位有區(qū)別。如圖IIC和IID所示，不論在 幼稚的還是激活的CD4+T細胞中，Parrl在核內的表達水平都比CD8+T細胞的高。 因此，可能是(3arrl在CD4+和CD8+T細胞中亞細胞水平分布的不一樣導致了(3arrl 對CD4+和CD8+ T細胞存活影響的不一樣。
以前的研究表明當GPCR激活以后，Parrl和Parr2被招募到細胞膜上；在那 里它們和磷酸化的GPCR結合引起受體的內吞和信號的終止(47)。然而，現在越 來越多的證據表明這兩個f3arr在功能上和受體的特異性上有很多差別。在發(fā)明人這 個研究中，(3arrl而不是(3arr2促進基因區(qū)的乙?；胶推滢D錄水平。發(fā)明 人的這個結果和先前的結論是一致的(27)，這可能是這兩個(3arr在亞細胞水平的分 布上不一樣導致的。雖然，在此功能上這兩個l3arr不一樣，但是，從動物水平來看 它們都能調控免疫反應。在這個研究中，發(fā)明人發(fā)現(3arrl能促進CD4+T細胞的存 活和自身免疫；而另一個早先的研究表明，(3arr2敲除的小鼠在哮喘模型實驗中其癥 狀明顯低于野生型小鼠，而這可能是由于Parr2影響了免疫細胞的遷移導致的。從這 些結果可以看出雖然l3arrs影響的細胞機制不一樣，但都在免疫系統(tǒng)中起著促進免 疫反應的功能。
發(fā)明人實驗室最近的研究表明Parrl具有在核內直接調控基因轉錄的功能； 而該功能是受一些GPCRs影響的(27)。另外，在體外激活的CD4+T細胞中，Nguyen K.和Miller B.C.發(fā)現有delta阿片受體(DOR)的表達(48)。有趣的是，發(fā)明人 在體外的實驗中發(fā)現:DOR的激活能)3arrl依賴地上調5c/-2的表達。這些數據顯示， (3arrl可能作為一個重要的信號調節(jié)分子介導外界促進CD4+ T細胞存活的信號從 而影響獲得性免疫應答?？紤]到(3arrl在CD4+T細胞中內在的生理功能，這些結果 不僅揭示了在正常生理條件下調節(jié)免疫系統(tǒng)的一種機制，也為自身免疫病如多發(fā)性 硬化提供了一種可能的治療靶點。
盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點對于本領域技術人員來說是明顯 的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對本發(fā)明作各種變化和改動。因此， 所附權利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內的變動。本文引用的所有出版物、專 利和專利申請均納入本文作參考。
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<400> 1
ttctccttcc agcctgagag caa 23
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc—feature
<223〉 引物—
<400> 2
3tg3ccccac cgaactca犯g 21
<210> 3
<211> 17
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc—feature
<223> 引物—
<400> 3
aggatgcgtc caccaag 17
<210> <211> <212> <213>
4 20
DNA
人工序列
<220>
<221> misc—feature
<223> 引物—
<400> 4
aagtagaaga gggcaaccac 20
<210> 5
<211> 25
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc一feature
<223〉 引物—<400> 5
cctgctggat tacattaaag cactg 25
<210> 6
<211> 21
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc一feature
<223〉 引物—
<400> 6
ttcaacactt cgagaggtcc t 21
<210> 7
<211> 25
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223〉 引物_
<400> 7
cctgctggat tacatcaaag cactg 25
<210> 8
<211> 21
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc一feature
<223〉 引物—
<400> 8
tceaacactt cgtggggtcc t
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物_
<400> 9
atecaggatc gagcagggcg
<210> 10
<211> 20
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221 > misc一feature
<223〉 引物—
<400> 10 actcgctcag cttcttggtg
<210> 11
<211> 19
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物_
21
20
20<400> 11
caatggctaa ctgggacta 19
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物_
<400> 12
tcttcggctg cttggtaa 18
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc—fea加re
<223> 引物—
<400> 13
ccagagtttg agccgagtga g 21
<210> 14
<211> 19
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc—feature
<223〉 引物—
<400> 14
gctgtgctgc ccagaggtt 19
<210> 15
<211> 18
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc—feature
〈223〉 引物—
<400> 15
caacccatcc tggcacct 18
<210> 16
<211> 20
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc一feature
〈223〉 引物—
<■> 16
cgatccgact caccaatacc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc feature<223> 引物
<400> 17
gggacgcgag tgttcaagaa 20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221 > misc—feature
<223> 引物—
<400> 18
acaaacaggt ccttgcgaaa g 21
<210> 19
<211> 24
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223〉 引物_
<400> 19
cctgtggatg actgagtacc tgaa 24
<210> <211> <212> <213>
<220>
<221 > misc一feature
<223> 引物—
<400> 20
cagccaggag aaatcaaaca ga 22
<210> 21
<211> 26
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc—feature
<223> T叫ii^n探針
<400> 21
aggataacgg aggctgggat gccttt 26
<210> 22
<211> 23
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221 > misc—feature
<223> 引物—
<400> 22
ggcaaaccct cccccaccsc etc 23
<210> 23
<211> 22
<212> DNA <213>人工序列
<220>
序
，
o 2邗v
2 2<221> misc_feature
<223> 引物_
<400> 23
ccaccggacc gcttcagacc tc 22
<220>
<221> misc—feature
<223> 引物—
<400> 24
ggggaaacaa ccaactctgg 20
<210> 25
<211> 19
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc—feature
<223> 引物—
<400> 25
catcactgcc gctgcctct 19
<220>
<221> misc—feature
〈223> 引物—
<400> 26
gctgtttatc agttagtggg tc 22
<210> 27
<211> 18
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc—feature
<223> 引物—
<400> 27
gggtcagaag tgggagtg 18
<210> 28
<211> 18
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc一feature
<223〉 引物—
<400> 28
tgccaaggtt agcaggac 18
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<210> <211> <212> <213>
<210> <211> <212> <213>
序
4" o丌、
2 2 Dls
序
6 2開、
2 2
32<220>
<221> misc—feature
<223〉 引物—
<400> 29 ccagaggaca aatgaggg
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc—feature
<223> 引物—
<400> 30
catttgtctg ccctatct 18
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
〈223> 引物_
<400> 31
ttaactggga acacctca 18
<210> 32
<2U> 18
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc一feature
<223〉 引物—
<400> 32
agtgcttatc gctcttcc 18
<210> 33
<211> 18
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc一feature
<223> 引物—
<400> 33
ctccaaacct gaccctct 18
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc一feature
<223〉 引物—
<400> 34
gcagcaaaca atcttcat 18
<210> 35
<211> 18
<212> DNA <213>人工序列<formula>formula see original document page 34</formula><213>人工序列 <220>
<221> misc一feature
<223〉 引物—
<400> 41 ttocaatgct ctcccaaa
<210> 42
<211> 20
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223〉 引物—
<400> 42 cagagtgagt attggaggag
<210> 43
<211> 18
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物—
<400> 43 aaagacagtg gtggg咖
<210> 44
<211> 18
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc_feature
〈223> 引物_
<400> 44 tgaccctgag gagatgga
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物_
<400> 45 ggtatgacct gggcttcg
<210> 46
<211> 18
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc—feature
〈223〉 引物—
18
20
18
18
18
<400> 46 aggagcaaac tcaggaat
<210> 47 <211> 18
18<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物—
<400> 47 agtc3C3asg 3tggcag3
18
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc—feature
<223> 引物—
<400> 48 cagscgcscc 3ctgattt
<210> 49
<211> 18
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc一feature
<223〉 引物—
18
<400> 49 agcagccagc agacttac
18
<210> 50
<211> 19
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc一feature
<223> 引物—
<400> 50 tacgagcgat acatacaac
19
<210> 51
<211> 18
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc—feature
〈223〉 引物—
<400> 51 ctagagccag tccttctt
<210> 52
<211> 18
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc—feature
<223> 引物—
18
<400> 52 gcgactcctg attcattg
<210> 53
18<211> 17
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc—feature
<223〉 引物—
<400> 53
aggtgcgttt ccctgta 17
<210> 54
<211> 21
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc—feature
<223> 引物—
<400> 54
tatcgggaga tgctcattgg a 21
<210> 55
<211> 18
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc—feature
<223> 引物—
<400> 55
ccctcgggag gtttggic 18
權利要求
1.β抑制蛋白1的抑制劑在制備藥物中的用途，其特征在于，所述β抑制蛋白1的抑制劑選自(i)抑制β抑制蛋白1活性的物質；(ii)抑制編碼β抑制蛋白1的基因轉錄、翻譯或這兩者的物質，所述藥物用于治療或預防哺乳動物對象的與CD4+T細胞凋亡異常相關的疾病。
2. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述抑制(3抑制蛋白1活性的物質選 自放線菌素、放線菌酮或P抑制蛋白1的特異性抗體。
3. 如權利要求l所述的用途，其特征在于，所述抑制編碼(3抑制蛋白l的基因轉 錄、翻譯或這兩者的物質是小干擾RNA、 (3抑制蛋白l的編碼基因全部或部分序列的 反義序列或核酶。
4. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述抑制編碼P抑制蛋白1的基因轉 錄、翻譯或這兩者的物質負載于載體內。
5. 如權利要求4所述的用途，其特征在于，所述載體選自逆轉錄病毒載體、慢 病毒載體、腺病毒載體或DNA病毒載體。
6. 如權利要求5所述的用途，其特征在于，所述哺乳動物是人。
7. 如權利要求l所述的用途，其特征在于，所述與CD4+T細胞凋亡異常相關 的疾病選自自身免疫疾病或淋巴細胞增多癥。
8. 如權利要求7所述的用途，其特征在于，所述自身免疫疾病選自類風濕關節(jié) 炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎、硬皮病、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、脫髓鞘疾病、 原發(fā)性腎上腺皮質萎縮、慢性甲狀炎、I型糖尿病、慢性非特異性潰瘍性結腸炎、慢 性活動性肝炎、惡習性貧血與萎縮性胃炎、自身免疫性腎小球腎炎、肺腎出血性綜合 癥、自身免疫性溶血性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜、特發(fā)性白細胞減少癥。
9. 一種用于治療或預防對象的與004+T細胞凋亡異常相關的疾病的藥物組合 物，其特征在于，所述藥物組合物包含有效量的P抑制蛋白1的抑制劑作為活性組分， 以及藥學上可接受的載體，其中所述P抑制蛋白l的抑制劑選自(i)抑制(3抑制蛋白l活 性的物質；(ii)抑制編碼(3抑制蛋白1的基因轉錄、翻譯或這兩者的物質。
10. —種從候選物質中篩選出用于治療或預防與CD4+T細胞凋亡異常相關的疾 病的藥物的方法，該方法包括-a) 使所述候選物質與表達P-抑制蛋白1的細胞接觸；b) 鑒定(3-抑制蛋白l在所述細胞的細胞核內的表達水平，并將該表達水平與未接 觸所述候選物質的細胞的細胞核內(3-抑制蛋白1表達水平相比較；C)選出使細胞核內P-抑制蛋白1表達水平降低的物質作為治療或預防與CD4+ T 細胞凋亡異常相關的疾病藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及β-抑制蛋白1在調節(jié)T細胞存活和自身免疫中的應用。具體地說，本發(fā)明涉及β抑制蛋白1的抑制劑在制備藥物中的用途，所述β抑制蛋白1的抑制劑選自(i)抑制β抑制蛋白1活性的物質；(ii)抑制編碼β抑制蛋白1的基因轉錄、翻譯或這兩者的物質，所述藥物用于治療或預防哺乳動物對象的與CD4⁺T細胞凋亡異常相關的疾病。
文檔編號A61P21/04GK101318012SQ200710041559
公開日2008年12月10日 申請日期2007年6月4日 優(yōu)先權日2007年6月4日
發(fā)明者施裕豐, 臧敬五, 鋼 裴 申請人:中國科學院上海生命科學研究院