專利名稱：7－氮雜靛玉紅和7－氮雜異靛藍衍生物制備及其藥學用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及設計和合成一類全新結構的7-氮雜靛玉紅和7-氮雜異靛藍衍生物的方法及其藥學應用。這些分子的共同特點在于都是由7-氮雜吲哚和吲哚雙分子在不同的位置上偶合而成，通過多種機制抑制細胞的生長、增殖，包括抑制細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，簡稱細胞周期激酶，縮寫為CDKs)、誘導內(nèi)源性細胞周期激酶抑制劑(CDKIs)等生物學功能，進而具有治療因細胞生長紊亂而導致的各種疾病，包括惡性腫瘤、病毒性皮膚病、HIV、神經(jīng)退化和紊亂等神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。
背景技術：
細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，簡稱細胞周期激酶，縮寫為CDKs)家族是典型的絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)激酶，是重要的細胞生長信號傳導分子，主要作用于細胞周期的不同分期(細胞周期過程被分為G1、S、G2和M四個期)進而使細胞有序地生長、增殖(DNA復制和染色體分離)、休眠(細胞脫離細胞分裂周期，進入生長分裂受抑制的靜止期，稱為G0期)或進入凋亡(如正?？稍偕慕M織器官及癌細胞在化療藥物的作用下進入靜止期而躲避藥物的作用)，CDKs還具有調(diào)節(jié)神經(jīng)和胸腺功能等作用。CDKs不同于其它激酶，它們必須和其相應的cyclins構成一個雜合二聚體絡合物而起催化調(diào)節(jié)作用。細胞周期的調(diào)控是通過cyclins的周期性表達或降解及其與相應的CDK瞬間結合而激活CDKs。人體細胞中至少有9個CDKs家族成員(CDK1～9)和11個cyclins(A～J)已被鑒定，不同的CDKs與不同的cyclins或cyclin的亞基結合，如CDK1(cdc2)連接cyclin A和B1-B3；CDK2連接cyclin A、D1-D3和E；CDK4，CDK5和CDK6與cyclin D1-D3相結合；CDK5也主要地連接pk35；CDK7連接cyclin H；CDK6連接與D-相關的cyclin K。
研究表明，幾乎所有腫瘤細胞都具有各種各樣的細胞周期激酶異常(參見Eur JCancer，1999，35531～539；Science，1996，2741672～1677)，進而癌細胞周而復始地不斷進入S，G2和M期而無限增殖。例如，高達85％的乳腺癌病人CyclinE/CDK4/6異常(參見Proc Natl Acad Sci USA，1993，901112～1116)。于是抑制細胞周期激酶，則可有效地阻止細胞增殖(但不是殺細胞)，進而，或者促進細胞分化成熟，或者促進細胞凋亡，達到治療多種腫瘤的作用?？梢哉J為，細胞周期激酶抑制劑是一類新型的廣譜抗癌藥物。同時，由于它們是抑制細胞增殖(cytostatic)，而不是殺細胞(cytotoxic)，這類藥物應具有較低的毒副作用。因此，尋找細胞周期激酶抑制劑已成為研發(fā)抗癌藥物的合理新策略(參見Curr Med Chem，1999，6859～875；Curr Med Chem，2007，14(9)969-85；Nat Rev Cancer 2007；7(3)202-11)。
至今，已有近10種化學結構類型小分子CDKs抑制劑和/或調(diào)控劑受到關注與研究，它們主要是ATP-區(qū)域定向CDKs抑制劑(參見Angew Chem Int Ed，2003，422100～2138)。在這近10種化學結構類型的CDKs抑制劑中，我國上世紀60-70年代發(fā)現(xiàn)并已用于臨床治療的靛玉紅(indirubin)和N-1-甲基異靛藍(N-1-methylisoindigo)即為其中一種類型(參見中草藥現(xiàn)代研究，第一卷，第一版，北京北京醫(yī)科大學、中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社，1995227～257；PNAS，2005，102(17)5998～6003)，其它類型化合物絕大多數(shù)均處于臨床前研究階段，僅有兩個化合物UCN-01和美國國立癌癥研究所(NCI)研發(fā)的flavopiridol進入臨床研究(參見Curr Pharm Design，2001，7(16)1669～1687)。
綜上所述，靛玉紅類雙吲哚化合物是一類重要CDKs抑制劑，毒副作用小，但這類化合物的脂溶性和水溶性較差，在臨床應用中受到影響，近幾年來，國外不少藥物研究機構和藥業(yè)公司對靛玉紅類化合物進行了廣泛的結構修飾(WO99/62503，1999-12-9；WO01/37819 A2，2001-8-31；WO00/61555，2000-10-19；US pat2002/0132792 A1，2002-9-19)，使這類化合物溶解等性質(zhì)有不同程度的改善，為了進一步提高靛玉紅類雙吲哚化合物抗腫瘤效果，有必要對這類化合物的結構作重大改造。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供制備7-氮雜靛玉紅和7-氮雜異靛藍衍生物的方法及這類全新化合物在藥學上的用途。通過對靛玉紅和異靛藍化合物進行重大的結構改造，以改善溶解性質(zhì)，增強抗腫瘤作用。本發(fā)明徹底改變了靛玉紅和異靛藍母核分子的原子構成，形成一類新結構化合物，開辟新的研究空間，同樣也改變原分子中的電學性質(zhì)。根據(jù)吡啶可溶于水，而苯幾乎不溶于水的性質(zhì)，7-氮雜靛玉紅和7-氮雜異靛藍衍生物水溶性可望改善(以后的實施例的結果也獲得驗證)。除此以外，本發(fā)明提出合成7-氮雜靛玉紅和7-氮雜異靛藍衍生物構想還基于7-氮雜靛玉紅實質(zhì)上是一個7-氮雜吲哚分子和一個吲哚分子在2，3’-位偶聯(lián)的產(chǎn)物，7-氮雜異靛藍是一個7-氮雜吲哚分子和一個吲哚分子在3，3’-位偶聯(lián)的產(chǎn)物。氮雜吲哚中氮原子置換了其中一個吲哚苯環(huán)上單個碳原子，能得到如下四種同分異構體，經(jīng)調(diào)研，報道較多的是5-和7-氮雜吲哚，其中尤以研究7-氮雜吲哚論文最多(參見Tetrahedron，2007，631031～1064)， 4-氮雜吲哚5-氮雜吲哚6-氮雜吲哚7-氮雜吲哚同時，7-氮雜吲哚衍生物的生物活性更為突出，它們具有抗病毒(包括抗HIV，參見ProcNatl Acad Sci USA，2003，100(19)11013～11018)、抗菌和抑制腫瘤細胞增殖(參見CurrOrg Chem，2001，5471～506)的活性，故7-氮雜靛玉紅和7-氮雜異靛藍衍生物應當具有顯著的抗腫瘤等作用。
下述通式(I)和通式(II)的化合物，其中通式(I)為7-氮雜靛玉紅衍生物，通式(II)為7-氮雜異靛藍衍生物， 式中，R1和R1’可同時為H；或R1和R1’各自代表相同或不同的C1～C6烷基、芳基、芳烷基、?；?、芳?；?、?；Ｗo的糖基或二糖基、糖基或二糖基；或R1和R1’中，一個代表H，另一個為C1～C6烷基、芳基、芳烷基、?；⒎减；Ⅴ；Ｗo的糖基或二糖基、糖基或二糖基；R2、R3、R4、R5、R2’、R3’、R4’和R5’獨立地代表H、鹵素、羥基、巰基、C1～C4烷基、硝基、氨基、胺基、酰氨基、C1～C4烷氧基、甲硫基、苯基、苯氧基、芳基、芳烷基、三氟甲基、酰基、芳酰基、磺酸基、氨基磺酰基、異氰酸酯基、烷基異氰酸酯基；R為氧原子，硫原子，硒原子；或R為一個NR6基團，其中R6為H、C1～C6直鏈或支鏈烷基、芳基、芳烷基、C3～C6脂肪環(huán)基、?；?、芳?；?、磺?；?、磷?；?；或R為一個NOR7基團，其中R7為上述R6代表的基團。
上述通式(I)和通式(II)的化合物，其中較好的有其中R1和R1’同時為H；或R1和R1’各自代表相同或不同的C1～C6烷基、芳基、芳烷基、?；⒎减；?、?；Ｗo的糖基、糖基；或R1和R1’中，一個代表H，另一個為C1～C6烷基、芳基、芳烷基、酰基、芳?；Ⅴ；Ｗo的糖基、糖基；R2、R3、R4、R5、R2’、R3’、R4’和R5’分別獨立地代表H、鹵素、羥基、巰基、C1～C4烷基、氨基、胺基、酰氨基、C1～C4烷氧基、甲硫基、苯基、苯氧基、芳基、芳烷基、三氟甲基、?；?、芳?；?、磺酸基、異氰酸酯基；上述的糖基為阿拉伯糖、木糖、核糖、甘露糖和葡萄糖；R為氧原子，硫原子，硒原子；或R為一個NR6基團，其中R6為H、C1～C6直鏈或支鏈烷基、芳基、芳烷基、C3～C6脂肪環(huán)基、?；⒎减；?、磺?；?、磷?；?；R或為一個NOR7基團，其中R7為上述R6代表的基團。
本發(fā)明的化合物是細胞周期蛋白依賴性激酶(簡稱細胞周期激酶，英文是cyclin-dependent kinases，CDKs)抑制劑，并誘導內(nèi)源性細胞周期激酶抑制劑(endogenouscyclin-dependent inhibitors，CDKIs)，進而抑制細胞生長、增殖，促進腫瘤細胞的凋亡。
這類化合物改善了理化性質(zhì)，增強了細胞通透性，易于進入細胞內(nèi)，進而提高了生物利用度。
本發(fā)明所述化合物在制備用于治療因CDKs異常、細胞生長及增殖紊亂所導致的疾病藥物的應用，這類疾病包括各種惡性腫瘤、病毒性皮膚病、HIV、神經(jīng)退化和紊亂等神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。
利用本發(fā)明的化合物所制備的藥物劑型包括小容量注射劑，中容量注射劑，大容量注射劑，粉針注射劑，注射用乳劑，片劑，丸劑，膠囊劑，膏劑，霜劑，貼劑，搽劑，粉劑，噴霧劑，植入劑，滴劑，栓劑，軟膏劑；各類納米制劑；相應的脂質(zhì)體主要地制成以上所提及的注射劑。
利用本發(fā)明的化合物所制備的藥物的給藥途徑包括口服給藥，注射給藥，植入給藥，腔內(nèi)給藥，肛門給藥，透皮給藥，內(nèi)外敷。
其中注射給藥包括靜脈注射，肌肉注射，皮下注射，腔內(nèi)注射。
本發(fā)明所述化合物由藥學上可接受的無機酸和有機酸所形成的鹽，其特征在于，無機酸包括鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸；有機酸包括甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、萘二磺酸(1，5)、亞細亞酸、草酸、酒石酸、乳酸、水楊酸、苯甲酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、庚二酸、己二酸、馬來酸、蘋果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗壞血酸、煙酸、異煙酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸，以及氨基酸。
本發(fā)明所述鹽是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，并誘導內(nèi)源性細胞周期激酶抑制劑，進而抑制細胞生長、增殖，促進腫瘤細胞的凋亡。
本發(fā)明所述鹽改善了理化性質(zhì)，增強了細胞通透性，易于進入細胞內(nèi)，進而提高了生物利用度。
本發(fā)明所述鹽在制備用于治療因CDKs異常、細胞生長及增殖紊亂所導致的疾病藥物的應用，這類疾病包括各種惡性腫瘤、病毒性皮膚病、HIV、神經(jīng)退化和紊亂等神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。
利用本發(fā)明的其鹽所制備的的藥物劑型包括小容量注射劑，中容量注射劑，大容量注射劑，粉針注射劑，注射用乳劑，片劑，丸劑，膠囊劑，膏劑，霜劑，貼劑，搽劑，粉劑，噴霧劑，植入劑，滴劑，栓劑，軟膏劑；各類納米制劑；相應的脂質(zhì)體主要地制成以上所提及的注射劑。
利用本發(fā)明的其鹽所制備的藥物的給藥途徑包括口服給藥，注射給藥，植入給藥，腔內(nèi)給藥，肛門給藥，透皮給藥，內(nèi)外敷。
其中注射給藥包括靜脈注射，肌肉注射，皮下注射，腔內(nèi)注射。
本發(fā)明通式I和II所表示的化合物為本發(fā)明新合成的7-氮雜靛玉紅和7-氮雜異靛藍衍生物。所有新合成的化合物均經(jīng)過多種物理方法進行了結構鑒定，其中主要包括1H-NMR、MS和元素分析，化合物都是參考和改進已發(fā)表的方法進行合成的。
一.7-氮雜靛玉紅中間體及目標化合物(通式I)(1)中間體1-烴基-7-氮雜吲哚-2，3-二酮(A)的合成 式中R1＝CH3、C2H5、n-C3H7、n-C4H9、Ph-CH2、酰基保護的單糖基等。
以7-氮雜吲哚為原料，首先在N-1位烴基化，然后，在CrO3及CH3COOH作用下，發(fā)生氧化反應，得產(chǎn)物A為1-烴基-7-氮雜吲哚-2，3-二酮(合成方法參考Doklady，AkadNauk SSSR，1958，118302～305)。
(2)中間體1-乙酰基-3-羥基吲哚衍生物(B)的合成 式中R3’＝H、Cl、Br、F、CH3、OCH3、SCH3和Ph等。
以2-氨基苯甲酸衍生物為原料，用氯乙酸取代，在乙酸酐及乙酸鈉存在下?；檄h(huán)，還原，得產(chǎn)物B(合成方法參考Org Biomol Chem，2004，2981～988)。
(3)目標化合物7-氮雜靛玉紅衍生物(I)的合成
式中R1＝CH3、C2H5、n-C3H7、n-C4H9、Ph-CH2、?；Ｗo的單糖基等，R3’＝H、Cl、Br、F、CH3、OCH3、SCH3和Ph等。
將化合物1-烴基-7-氮雜吲哚-2，3-二酮分別與1-乙?；?3-羥基吲哚及5-鹵代-1-乙酰基-3-羥基吲哚在N2保護下酸性條件回流，可得到1-烴基-7-氮雜靛玉紅衍生物(I)。
(4)目標化合物3′-肟基-7-氮雜靛玉紅衍生物的合成 式中R1＝CH3、C2H5、n-C3H7、n-C4H9、Ph-CH2、?；Ｗo的單糖基等，R3’＝H、Cl、Br、F、CH3、OCH3、SCH3和Ph等。
(5)目標化合物7-氮雜靛玉紅-3′-肟甲醚的合成 式中R＝CH3ON、EtON，R1＝CH3、C2H5、n-C3H7、n-C4H9、Ph-CH2等，R3’＝H、Cl、Br和F等。
二.7-氮雜異靛藍目標化合物(通式II)的合成
式中R1＝CH3、C2H5、n-C3H7、n-C4H9、Ph-CH2、?；Ｗo的單糖基等，R3’＝H、Cl、Br、F、OH和OCH3等。
將化合物1-烴基-7-氮雜吲哚-2，3-二酮(A)分別與5-取代的2-羥基吲哚在堿性條件下反應，得到1-烴基-5’-取代-異靛藍(II)。
圖1為7-氮雜靛玉紅和7-氮雜異靛藍衍生物的結構通式。
圖2為7-氮雜靛玉紅和7-氮雜異靛藍衍生物對激素非依賴的人前列腺癌細胞DU145的生長抑制曲線舉例。將對數(shù)生長期的人前列腺癌細胞DU145，以不同濃度的化合物No.16、No.18、No.21、No.24等處理72小時，以MTT法測定細胞生長率。
圖3為7-氮雜靛玉紅和7-氮雜異靛藍衍生物對激素非依賴的人前列腺癌細胞DU145的CDKs抑制作用舉例。將對數(shù)生長期的人前列腺癌細胞DU145，以不同濃度的化合物No.33、No.35等處理24小時，提取細胞總蛋白，以蛋白印跡方法測定phospho-CDK2TThr160、p27、及Cyclin-D1，并以β-Actin作為內(nèi)標。
具體實施例方式
實施例一、儀器與試劑本實驗所制得的7-氮雜靛玉紅(I)和7-氮雜異靛藍(II)衍生物的熔點用Mel-TEMP熔點儀測定，溫度未經(jīng)校正。MS用HP1100LC/MSD質(zhì)譜儀測定。薄層層析(TLC)板用硅膠GF254(青島海洋化工廠生產(chǎn))與濃度為0.8％的CMC-Na蒸餾水溶液攪拌均勻后鋪成，然后再經(jīng)100-110℃活化1h，置入干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆?，于紫外燈?波長254nm和365nm)顯色；柱層析采用100-200或200-300目硅膠(青島海洋化工廠生產(chǎn))，干法裝柱。1H-NMR用Bruck AV-300型核磁共振儀測定，內(nèi)標TMS。元素分析用Elementar Vario EL III儀器測定。
試劑均為市售化學純或分析純產(chǎn)品，除特別說明外，不經(jīng)處理直接使用。
二、化合物的制備1、中間體制備①中間體1-甲基-7-氮雜-2，3-吲哚二酮(A)
1-甲基-7-氮雜吲哚(2g，15mmol)溶于70mLAcOH中，將3.2g CrO3預先懸浮于20mL水中，再加到上述乙酸溶液中，室溫反應0.5h(即小時)，混合物用水稀釋，用氯仿提取3次，有機相合并水洗，脫水后濃縮，得到橙黃色中間體A1.73g(即克)，產(chǎn)率71.3％；mp162-163℃，與文獻值一致。
②中間體5-溴-2-(N-羧甲基氨基)-苯甲酸(B-1)。
2-氨基-5-溴苯甲酸(2g，9mmol)溶于15mL的2mol/L Na2CO3溶液中；氯乙酸(0.69g，7.3mmol)溶于7.5mL的2mol/L Na2CO3溶液中，緩慢地滴加到上述溶液中。然后，混合物在80℃攪拌20h。冷卻至室溫，加入50mL乙醚和8mL的2mol/L HCl溶液。有機相分離，MgSO4干燥，濃縮得淡棕色固體，經(jīng)硅膠柱層析純化(乙酸乙酯∶甲醇＝l∶1)，得到白色固體(B-1)1.55g，產(chǎn)率60％；mp178-180℃。
③中間體1-乙?；?5-溴-3-乙酰氧基吲哚(B-2)。
5-溴-2(N-羧甲基氨基)-苯甲酸(0.84g，3.4mmol)和無水NaOAc(0.6g，7.3mmol)溶于8mL乙酸酐中，在60℃反應5h，冷卻至室溫，過濾乙酸鈉，濾液濃縮，殘留物中加入100mL乙酸乙酯溶解，再加100mL水和20mL飽和NaHCO3，有機層分離，水層用50mL×2的乙酸乙酯抽提，合并有機層用飽和的NaHCO3洗滌(100mL×2)，干燥，濃縮，得到白色固體(B-2)1.3g，產(chǎn)率25.4％④中間體1-乙?；?5-溴-3-羥基吲哚(B)1-乙?；?5-溴-3-乙酰氧基吲哚(B-2，1.0g，3.38mmol)在20mL H2O中與亞硫酸鈉(1.0g，7.94mmol)混合?；旌衔镌?0℃加熱3h，冷卻至室溫，用乙酸乙酯抽提(100mL×2)，有機層合并，干燥，濃縮，得到白色針狀固體(B)0.7g.，產(chǎn)率82％；mp180-182C。
2、目標化合物合成實施例①1-甲基-7-氮雜靛玉紅(2)將0.2g(1.23mmol)1-甲基-7-氮雜滿二酮中加入0.21g(1.2mmol)1-乙?；?3-羥基吲哚及20mL水和0.02g對甲苯磺酸，氮氣保護下回流攪拌1h，得紫紅色溶液，冷卻后，用氯仿抽提，水洗，濃縮，得一紫紅色固體，經(jīng)硅膠柱層析(氯仿∶石油醚＝3∶1)及乙酸乙酯重結晶，得0.14gl-甲基-7-氮雜靛玉紅(2)，紅色針狀晶體，收率41.1％；mp116～118℃。
ESI-MS278.1[M+H]+，C16H11N3O2(277.2)；1H NMR(AV-300，CDCl3，ppm)δ3.59(s，3H，-CH3)，7.08(m，1H，5’-H)，7.09(m，1H，6’-H)，7.16(dd，1H，J＝7.6Hz，4-H)，7.58(m，1H，5-H)，7.76(d，J＝7.6Hz，1H，7’-H)，8.21(dd，J＝5.5Hz；1H，4-H)，9.13(dd，J＝5.5Hz，1H，6-H)，10.4(bs，1H，N-H)；Anal Calcd for C16H11N3O2C，69.31 H，3.97 N，15.16；
FoundC，69.05 H，4.18 N，15.34。
②1-芐基-5’-溴-7-氮雜靛玉紅(18)與(1)方法相同，將相似于(1)中摩爾量的1-芐基-7-氮雜-2，3-二酮、1-乙?；?5-溴-3-羥基吲哚和0.02g對甲苯磺酸加到20mL水，氮氣保護下回流攪拌1h，得紫紅色溶液，冷卻后，用氯仿抽提，水洗，濃縮，得紫紅色固體，經(jīng)硅膠柱層析純化(氯仿∶石油醚＝3∶1)及乙酸乙酯重結晶，得0.14g1-芐基-5’-溴-7-氮雜靛玉紅(18)，紅色針狀晶體，收率27％；mp112～114℃。
ESI-MS433[M+H]+，C22H14Br N3O2(432.2)；1H NMR(AV-300，CDCl3，ppm)δ5.24(s，2H，N-CH2)，10.44(s，1H，N-H)，6.91～9.0(m，11H，Ar-Hs)；Anal Calcd for C22H14Br N3O2C，61.13 H，3.26 N，9.72；FoundC，60.72 H，3.57 N，9.38.
③1-丁基-7-氮雜靛玉紅-3’-肟(40)將1-丁基-7-氮雜靛玉紅(0.4g，1.25mmol，按方法(1)方法制得)溶于12mL甲醇中，加入6mL無水吡啶，0.15g鹽酸羥胺(2.2mmol)，加熱回流1h，冷卻濃縮除去大部分溶劑，剩余物傾入到100mL碎冰中，劇烈攪拌，過濾得橙色固體，硅膠柱層析純化(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)，得0.31g 1-丁基-7-氮雜靛玉紅-3’-肟(40)，橙色固體，收率87.7％；mp254-256℃.
ESI-MS335.1[M+H]+，C19H18N4O2(334.3)；1H NMR(AV-300，D6-DMSO，ppm)δ0.92(t，3H，-CH3)，1.31(m，2H，-CH2)，2.28(m，2H，-CH2)，3.32(m，2H，N-CH2)，7.03～8.81(m，7H，Ar-Hs)，11.7(s，1H，N-H)，13.7(s，1H，N-OH)；Anal.Calcd.For C19H18N4O2C，68.25 H，5.43 N，16.76；FoundC，68.09 H，5.60 N，16.58.
④1-丁基-7-氮雜靛玉紅-3’-肟甲醚(53)1-丁基-7-氮雜靛玉紅-3’-肟(1.5g，4.5mmol)加到5％KOH無水乙醇溶液50mL中，微熱溶解，過濾，不斷攪拌下向濾液中滴加5mL CH3I，反應放熱，析出暗紅色沉淀，攪拌0.5h后，抽濾，用水洗至中性，干燥后得暗紅色粗品，粗品用丙酮重結晶，得1.26g 1-丁基-7-氮雜靛玉紅-3’-肟甲醚(53)，暗紅色晶體，收率80.5％；mp212-214℃.
ESI-MS349.1[M+H]+，C20H20N4O(348.2)；1H-NMR(AV-300，D6-DMSO，ppm)δ0.98(t，3H，-CH3)，1.46(m，2H，-CH2)，2.08(m，2H，-CH2)，3..88(m，2H，N-CH2)，4.16(s，3H，O-CH3)，7.06～9.19(m，7H，Ar-Hs)，10.86(bs，1H，N-H)；Anal. Calcd.For C20H20N4O2C，68.95 H，5.79 N，16.08FoundC，68.79 H，5.59 N，15.88.
⑤1-異丙基-7-氮雜異靛藍(73)將0.4g(2.1mmol)1-異丙基-7-氮雜-2，3-二酮和0.28g(2.1mmol)2-羥基吲哚加至10mL乙醇中，用1mol/L NaOH調(diào)至pH為9，70℃反應2h，有棕色固體產(chǎn)生。冷卻后，抽濾，固體用水洗，乙醇洗，真空干燥，得0.42g1-異丙基-7-氮雜異靛藍(73)，紅棕色固體，收率63.2％；mp132～134℃。
ESI-MS306.1[M+H]+，304.2[M-H]-，C18H15N3O2(305.3)；1H NMR(AV-300，D6-DMSO，ppm)δ1.51(d，6H，-CH(CH3)2)，4.78(m，1H，-CH(CH3)2)，6.86-9.3(m，7H，Ar-Hs)，10.99(bs，1H，N-H)；Anal.Calcd.For C18H15N3O2C，70.81 H，4.95 N，13.76FoundC，70.53 H，5.04 N，13.52.
按照上述制備7-氮雜靛玉紅衍生物2、18、40和53的方法，計合成了59個7-氮雜靛玉紅類化合物(I)，它們的結構列于表1中，所有這些新化合物部分經(jīng)紅外光譜(IR)、紫外光譜(UV/VIS)，全部經(jīng)質(zhì)譜(ESI-MS)、氫譜(1H-NMR)和元素分析結構確證。
表1 7-氮雜靛玉紅類化合物(I)的結構
按照制備1-異丙基-7-氮雜異靛藍(73)的方法，計合成了30個7-氮雜異靛藍類化合物(II)，它們的結構見表1，所有這些新化合物經(jīng)紅外光譜(IR)、紫外光譜(UV/VIS)、質(zhì)譜(ESI-MS)、氫譜(1H-NMR)和元素分析結構確證。
表2 7-氮雜異靛藍類化合物(II)的結構
三、抗腫瘤活性測試(1)
1、材料與儀器(i)細胞株激素非依賴型前列腺癌細胞DU145，購于美國AmericanType Culture Collection。(ii)試劑 RPMI Medium 1640(美國GIBCOBRL公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程公司)，MTT(Sigma公司)，HEPES(上海麗珠東風生物技術有限公司)，L-谷氨酰胺(日本進口分裝)，二甲基亞砜(DMSO，分析純)；被測樣品選取部分7-氮雜靛玉紅和7-氮雜異靛藍新化合物計38個(自制)；對照品1-乙基-靛玉紅(90)，1-乙基-3’-肟基靛玉紅(91)，自制，經(jīng)結構鑒定；以及全反式維甲酸。
(iii)試劑的配制a、細胞培養(yǎng)液1640培養(yǎng)基10.4g，NaHCO32.1g，谷氨酰胺0.3g，HEPES 5.95g，青霉素10萬單位，鏈霉素10萬單位，溶于1000mL雙蒸水中，用微孔濾膜過濾除菌，分裝后在-20℃下保存，使用前加入滅活的小牛血清；b、小牛血清56℃水浴30min滅活，分裝后-20℃保存；c、MTT以PBS配制成5mg/mL，避光，4℃保存，兩周內(nèi)有效；d、PBSNaCl 8.00g，KCl 0.20g，Na2HPO4.12H2O 3.4g，KH2PO40.20g于37℃水浴下充分溶于雙蒸水中，定溶于1000mL，分裝后4℃保存；e、被測樣品38個，對照品90和91和全反式維甲酸實驗時用DMSO配成溶液，-20℃保存。
(iv)主要儀器CO2培養(yǎng)箱(GB16型，德國Heraeus公司產(chǎn)品)；凈化工作臺(SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術有限公司)；水平式離心機(LXJ-II型，上海醫(yī)療器械三廠)；酶聯(lián)免疫檢測儀(BIO RAD Model 550，美國)；倒置生物顯微鏡(XSZ-D2，重慶光學儀器廠)；快速混勻器(SK-1型，常州國華電器有限公司)；電熱恒溫水槽(DK-8D型，上海醫(yī)用恒溫設備廠)；流式細胞儀(FACSCalibur，美國B-D公司產(chǎn)品)；平板振蕩器(752-A型，上海醫(yī)用分析儀器廠)；電子天平(BS110S型，德國Sartorius公司產(chǎn)品)。
2、方法(i)細胞培養(yǎng)DU145細胞接種于含10％小牛血清的1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中，每2-3天傳代一次，實驗時取對數(shù)生長期細胞。
(ii)實驗分組實驗取對數(shù)生長期細胞，混勻后計數(shù)，苔盼藍染色，計數(shù)活細胞數(shù)在98％以上，將細胞均分為若干組1.空白對照組(細胞懸液)；2.實驗組(細胞懸液+藥)。
(iii)MTT法測定IC50值(半數(shù)抑制量)
每種藥物以DMSO配置成濃度為20mmol的儲備液(4小時內(nèi)實驗)實驗時以含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，采用無菌操作技術分別配制濃度為80μM含藥培養(yǎng)液，藥物濃度以2倍遞增(1.25-20μM)。
選擇對數(shù)生長期DU145細胞，離心，計數(shù)，用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)液稀釋，調(diào)整濃度為5×104/mL，接種于96孔板，每孔5000細胞/200μL，于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)24h后，按以上藥物濃度共接種6組(包括1個對照組)，每組設立8個復孔。孵育72小時后，進行MTT快速比色，在酶標儀上以540nm為測定波長，630nm為參比波長測定吸光度(A)值.按照下式求出抑制率
以濃度-抑制率曲線求出回歸方程，得出50％及90％抑制濃度(IC50及IC90μM)所得數(shù)據(jù)列于表3表3 7-氮雜靛玉紅和7-氮雜異靛藍衍生物等抑制DU145腫瘤細胞生長的IC50和IC90
注表中對照品90和91分子結構如下
以及，如圖2所示。
3、結果討論(i)通過MTT實驗，不難看出絕大多數(shù)7-氮雜靛玉紅和7-氮雜異靛藍衍生物具有較強的抗腫瘤活性，對腫瘤細胞抑制作用比細胞誘導分化劑全反式維甲酸強得多；更為重要的是，對于目前臨床上尚束手無策的激素非依賴型前列腺癌細胞DU-145，絕大多數(shù)7-氮雜靛玉紅和7-氮雜異靛藍衍生物表現(xiàn)出很好的抑制作用；(ii)許多7-氮雜靛玉紅和7-氮雜異靛藍衍生物的IC50都接近或小于對照品(90和91)的IC50，而91是已知的CDKs抑制劑(參見中國發(fā)明專利CN 1763005A，2006-4-26)，化合物38結構和91極為相似，它們僅存在7-位上原子種類的差別，這從一個側面提示本發(fā)明中新合成的化合物抑制腫瘤細胞生長可能存在類似的作用機制；(iii)相比較而言，3’-肟化同時5’-鹵化的7-氮雜靛玉紅抑制腫瘤細胞生長效果更為顯著，其中尤以化合物25、30和33的為較強，30和33尚有良好的安全性。
四、抗腫瘤活性測試(2)1、腫瘤細胞人肝癌細胞7701 QGY、HepG-2，人肺腺癌細胞A549，人慢性髓原白血病細胞K562，人白血病細胞CEM和小鼠黑色素瘤細胞KIII。
2、應用上述“三”中的方法，測試了新合成的部分7-氮雜靛玉紅和7-氮雜異靛藍衍生物(計20個)抑制多種腫瘤細胞生長的生物活性，所測試結果50％抑制濃度(IC50，μM)列于下表4。
表4 7-氮雜靛玉紅和7-氮雜異靛藍衍生物等抑制多種腫瘤細胞生長的IC50
以上抗腫瘤活性測試結果表明，7-氮雜靛玉紅和7-氮雜異靛藍衍生物具有抑制多種腫瘤細胞生長的生物活性，從而開拓了一個新型靛玉紅類抗腫瘤化合物研究方向，為我們研制抗腫瘤新藥提供了物質(zhì)基礎。
五、對CDKs的抑制作用試劑受試化合物來源同“三、抗腫瘤活性測試(1)”。其它化學試劑除特別說明外，均購于美國Sigma化學試劑公司。蛋白電泳用聚丙酰胺凝膠試劑、SDS、電泳緩沖液、蛋白電轉(zhuǎn)移緩沖液、硝酸纖維膜等購于美國Bio-Rad生命科學公司。蛋白印跡檢測試劑盒及膠片購于美國GE公司。Phospho-CDK2Thr160抗體、內(nèi)源性細胞周期激酶抑制劑p27抗體、CyclinD1及β-Actin抗體分別購于美國Cell Signaling公司、DAKO及Santa Cruz生化技術公司。
腫瘤細胞及培養(yǎng)同“三、抗腫瘤活性測試(1)”。
蛋白印跡法檢測Phospho-Cdc2、p27、及Cyclin D1蛋白將對數(shù)生長期的人前列腺激素非依賴癌細胞DU145以如圖3所示濃度的7-氮雜靛玉紅，和7-氮雜異靛藍衍生物#33及#35化合物處理24小時。收集細胞、洗滌、以文獻方法(Wang LG，et al.，Oncogene，2004；235175-5184)提取蛋白，定量。取50μg的蛋白進行SDS-聚丙酰胺凝膠電泳。電泳后，將蛋白電轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，以特異的Phospho-CDK2抗體、內(nèi)源性細胞周期激酶抑制劑p27抗體、及CyclinD1抗體進行蛋白印跡測定，并以β-Actin抗體作為內(nèi)標，以ECL膠片記錄實驗結果。
結果和討論已報道靛玉紅類化合物具有抑制癌細胞CDKs功能。上述實例3和4已證明，本發(fā)明的7-氮雜靛玉紅，和7-氮雜異靛藍衍生物具有較強的細胞生長抑制功能。為進一步闡明這類化合物是通過調(diào)節(jié)細胞周期激酶活性而發(fā)揮細胞生長抑制功能，我們以蛋白印跡方法，采用Cdc2磷酸化蛋白特異抗體及其他調(diào)節(jié)細胞周期的重要蛋白p27及cyclin D1蛋白抗體，觀察了本發(fā)明代表化合物#33及#35的Cdc2活性及p27和cyclin D1蛋白表達的影響。如圖3所示，人前列腺激素非依賴癌細胞DU145經(jīng)#33及#35化合物處理24小時后，CDK2酶活性(磷酸化)水平程濃度依賴性關系顯著下降。與此同時cyclin D1蛋白表達亦顯著下降。恰恰相反，在相同的實驗條件下，內(nèi)源性細胞周期激酶抑制劑p27的表達則明顯增加。這些信號蛋白變化的結果則使得細胞生長受到抑制。其中7-氮雜靛玉紅，和7-氮雜異靛藍衍生物對p27表達的誘導作用可能是通過激活AhR受體同路所致(Knockart M，et al.，Oncogene，234400-4412，2004)。
六、溶解性試驗化合物38和91結構極為相似，它們僅存在7-位上原子種類的差別(見下圖)，用它們作溶解試驗才能說明7-氮雜靛玉紅相對于靛玉紅的溶能性變化。
試驗方法在室溫下(20℃)，分別取化合物38和91各5mg，加到2mL相應溶劑中，攪拌后溶解結果見表5表5 化合物38和對照品91溶解性比較
上表結果可見，7-氮雜靛玉紅衍生物38水溶性明顯增加，而脂溶性減少；一般地，靛玉紅水溶性和脂溶性都不好，而修飾后的靛玉紅脂溶性增加，而水溶性下降，化合物91正如此。這種溶解性的變化，體現(xiàn)了研究7-氮雜靛玉紅衍生物的必要性，對藥物在體內(nèi)吸收和藥物劑型的選擇等問題都會帶來有利的一面。
權利要求
1.下述通式(I)和通式(II)的化合物，其中通式(I)為7-氮雜靛玉紅衍生物，通式(II)為7-氮雜異靛藍衍生物， 式中，R1和R1’可同時為H；或R1和R1’各自代表相同或不同的C1～C6烷基、芳基、芳烷基、?；?、芳?；?、酰基保護的糖基或二糖基、糖基或二糖基；或R1和R1’中，一個代表H，另一個為C1～C6烷基、芳基、芳烷基、?；⒎减；?、?；Ｗo的糖基或二糖基、糖基或二糖基；R2、R3、R4、R5、R2’、R3’、R4’和R5’獨立地代表H、鹵素、羥基、巰基、C1～C4烷基、硝基、氨基、胺基、酰氨基、C1～C4烷氧基、甲硫基、苯基、苯氧基、芳基、芳烷基、三氟甲基、?；?、芳?；?、磺酸基、氨基磺?；惽杷狨セ?、烷基異氰酸酯基；R為氧原子，硫原子，硒原子；或R為一個NR6基團，其中R6為H、C1～C6直鏈或支鏈烷基、芳基、芳烷基、C3～C6脂肪環(huán)基、酰基、芳?；⒒酋；?、磷?；?；或R為一個NOR7基團，其中R7為上述R6代表的基團。
2.如權利要求1所述化合物，其特征在于，這類化合物是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，并誘導內(nèi)源性細胞周期激酶抑制劑的產(chǎn)生，進而抑制細胞生長、增殖，促進腫瘤細胞的凋亡。
3.如權利要求1所述化合物，其特征還在于，這類化合物改善了理化性質(zhì)，增強了細胞通透性，易于進入細胞內(nèi)，進而提高了生物利用度。
4.如權利要求1所述化合物在制備用于治療因細胞周期激酶異常、細胞生長及增殖紊亂所導致疾病的藥物中的應用，這類疾病包括惡性腫瘤、病毒性皮膚病、HIV、神經(jīng)退化和紊亂等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
5.如權利要求4所述化合物的應用，其特征在于，所述藥物的劑型包括小容量注射劑，中容量注射劑，大容量注射劑，粉針注射劑，注射用乳劑，片劑，丸劑，膠囊劑，膏劑，霜劑，貼劑，搽劑，粉劑，噴霧劑，植入劑，滴劑，栓劑，軟膏劑；各類納米制劑；相應的脂質(zhì)體主要地制成以上所提及的注射劑。
6.如權利要求4所述化合物的應用，其特征在于，所述藥物的給藥途徑包括口服給藥，注射給藥，植入給藥，腔內(nèi)給藥，肛門給藥，透皮給藥，內(nèi)外敷。
7.如權利要求6所述化合物的應用，其特征在于，注射給藥為靜脈注射，肌肉注射，皮下注射或腔內(nèi)注射。
8.如權利要求1所述化合物由藥學上可接受的無機酸和有機酸所形成的鹽，其特征在于，所述無機酸包括鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸；有機酸包括甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、萘二磺酸(1，5)、亞細亞酸、草酸、酒石酸、乳酸、水楊酸、苯甲酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、庚二酸、己二酸、馬來酸、蘋果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗壞血酸、煙酸、異煙酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸，以及氨基酸。
9.如權利要求8所述的鹽，其特征還在于，鹽是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，并誘導內(nèi)源性細胞周期激酶抑制劑的產(chǎn)生，進而抑制細胞生長、增殖，促進腫瘤細胞的凋亡。
10.如權利要求8所述的鹽，其特征還在于，鹽改善了理化性質(zhì)，增強了細胞通透性，易于進入細胞內(nèi)，進而提高了生物利用度。
11.如權利要求8所述鹽在制備用于治療因細胞周期激酶異常、細胞生長及增殖紊亂所導致疾病藥物中的應用，這類疾病包括惡性腫瘤、病毒性皮膚病、HIV、神經(jīng)退化和紊亂等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
12.如權利要求10所述鹽的應用，其特征在于，所述藥物的劑型包括小容量注射劑，中容量注射劑，大容量注射劑，粉針注射劑，注射用乳劑，片劑，丸劑，膠囊劑，膏劑，霜劑，貼劑，搽劑，粉劑，噴霧劑，植入劑，滴劑，栓劑，軟膏劑；各類納米制劑；相應的脂質(zhì)體主要地制成以上所提及的注射劑。
13.如權利要求10所述鹽的應用，其特征在于，所述藥物的給藥途徑包括口服給藥，注射給藥，植入給藥，腔內(nèi)給藥，肛門給藥，透皮給藥，內(nèi)外敷。
14.如權利要求12所述鹽的應用，其特征在于，注射給藥為靜脈注射，肌肉注射，皮下注射，腔內(nèi)注射。
全文摘要
本發(fā)明涉及設計和合成一類全新結構的7－氮雜靛玉紅和7－氮雜異靛藍衍生物的方法及其藥學應用。通過對靛玉紅和異靛藍化合物進行重大的結構改造，本發(fā)明徹底改變了靛玉紅和異靛藍母核分子的原子構成，形成一類新結構化合物，開辟新的研究空間，同樣也改變原分子中的電學性質(zhì)。這些分子共同特點在于都是由7－氮雜吲哚和吲哚雙分子在不同的位置上偶合而成，通過多種機制抑制細胞的生長、增殖，包括抑制細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin－dependent kinases，簡稱細胞周期激酶，縮寫為CDKs)、誘導內(nèi)源性細胞周期激酶抑制劑(CDKIs)等生物學功能，進而具有治療因細胞生長紊亂而導致的各種疾病，包括惡性腫瘤、病毒性皮膚病、HIV、神經(jīng)退化和紊亂等神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。
文檔編號A61K31/4353GK101074229SQ20071002334
公開日2007年11月21日 申請日期2007年6月8日 優(yōu)先權日2007年6月8日
發(fā)明者姚其正, 王朝暉, 程景才, 華維一 申請人:無錫杰西醫(yī)藥科技有限公司