專利名稱：用d114拮抗劑抑制腫瘤生長的治療方法
用D114拮抗劑抑制腫瘤生長的治療方法 發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及用5樣配體4(D114)拮抗劑抑制肺瘤生長的方 法。D114拮抗劑尤其可用于治療對其它抗腫瘤劑無反應(yīng)的腫瘤中的腫 瘤生長。相關(guān)技術(shù)的描述
Notch信號途徑是各種真核生物在許多生物過程如分化、 增生和體內(nèi)平衡中使用的細胞間交流的系統(tǒng)。5樣4(D114)或5樣配 體4(D114)(以下稱"D114")是Notch配體的5族成員，其通過血管 內(nèi)皮顯示出高選擇性表達(Shutter等，(2000) Genes Develop. 14: 1313-1318) 。Dl 14是一種Notch受體的配體，包括Notch 1和Notch 4。人和小鼠D114的核酸和氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 1-2和SEQ ID N0:3-4所示。已經(jīng)產(chǎn)生了基因乾向的D114小鼠(Duarte等，(2004) Genes & Dev. 18: doi: 10. 1101/gad. 1239004; Krebs等，(2004) Genes & Dev. 18: doi: 10. 1101/gad. 1239204: Gale等,(2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:15949-15954)。發(fā)明概述
下文中描述的實驗表明D114拮抗劑在抑制腫瘤生長中是 有效的，尤其在對其它抗腫瘤治療劑如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)拮抗 劑不敏感的腫瘤中。
—方面，本發(fā)明特征在于能夠抑制D114的D114拮抗劑。 在一實施方案中，D114拮抗劑為特異性結(jié)合D114和阻斷D114與Notch 受體例如Notchl結(jié)合的抗體或抗體片段。在另一實施方案中，本發(fā)明的D114拮抗劑為包含與多聚化成分融合的D114胞外域或其片段的融 合蛋白。
用于本發(fā)明方法中的抗體或抗體片段可以是多克隆的或 單克隆的，并且可以是人源化的、嵌合的或完全人的。優(yōu)選地該抗體 完全是人的單克隆抗體或單克隆抗體片段?？贵w片段可以是例如單鏈 抗體、Fab、或F(ab02。
當(dāng)D114拮抗劑為融合蛋白時，D114的胞外域或其片段或 經(jīng)修飾的片段與多聚化成分融合。多聚化成分優(yōu)選為免疫球蛋白功能 區(qū)，如Fc功能域，例如，人Fc(SEQ ID NO: 20)。融合蛋白任選地可 包含信號序列，其可以是細胞天生的、重組的或合成的。
在第二方面，本發(fā)明的特征為用于抑制血管生長或發(fā)展的 藥物組合物，包含能夠抑制D114活性的治療劑和可藥用載體。在一實 施方案中，治療劑為阻斷D114與Notch受體結(jié)合的抗體或抗體片段。 優(yōu)選地，D114拮抗劑為能抑制D114與Notchl受體結(jié)合的完全人抗體 或其片段。在另一實施方案中，治療劑為能結(jié)合其Notch受體的經(jīng)修 飾的D114蛋白，但這種結(jié)合不導(dǎo)致受體的激活。
在第三方面，'本發(fā)明的特征為治療D114介導(dǎo)的病癥的方 法，包括施用能夠抑制D114活性或表達的治療劑。D114介導(dǎo)的病癥 是一種需要抑制血管生長或發(fā)展的病癥。本發(fā)明的D114拮抗劑可以尤 其用于治療對其它治療劑無反應(yīng)的腫瘤或?qū)ζ渌委焺┑陀谧罴衙舾?的腫瘤。D114拮抗劑可阻斷功能血管的產(chǎn)生和氧輸送至腫瘤。在具體 的實施方案中，拮抗劑為抗D114抗體或抗體片段或融合蛋白?？笵114 抗體或抗體片段優(yōu)選地抑制D114與Notchl受體的結(jié)合。本發(fā)明的融 合蛋白包含保留與Notch受體結(jié)合能力和缺少D114跨膜區(qū)和胞質(zhì)尾區(qū) 的天然胞外區(qū)。在一實施方案中，本發(fā)明的D114拮抗劑在治療上應(yīng)用 以治療對用VEGF拮抗劑治療不敏感的腫瘤。
在其它方面，本發(fā)明的特征是能抑制5樣配體4(D114)活 性的治療劑為需要這種洽療的患者抑制肺瘤發(fā)展或生長的用途。在一 實施方案中，治療劑為抗體或抗體片段，或為多克隆或為單克隆。當(dāng)治療劑為抗體或抗體片段時，可以是人源化的、嵌合的或完全人抗體或抗體片段。在一些實施方案中，抗體片段為單鏈抗體、Fab或F (ab') 2。 在一實施方案中，DU4拮抗劑為與多聚化成分融合的D114片段。一 方面，本發(fā)明的特征為如上定義的能抑制D114活性的治療劑作為第一 治療劑，與另 一種治療劑f制備抑制腫瘤發(fā)展或生長的藥物中的用途， 所述另一種治療劑為血管'內(nèi)皮生長因子(VEGF)抑制劑。優(yōu)選地，VEGF 抑制劑為抗VEGF抗體或VEGF捕捉劑。當(dāng)VEGF抑制劑為VEGF捕捉劑 時，治療劑為具有如SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列的蛋白。 [OOll]其它目的和優(yōu)點將在閱讀詳細的說明之后變得明了。附圖概述
圖l顯示C6腫瘤細胞的D114-Fc過表達導(dǎo)致C6腫瘤變小。
圖2顯示全身給藥的D114-Fc相對于受體型的VEGF拮抗 劑在減少HT1080腫瘤中是高效的。左側(cè)在肺瘤植入時施予D114-Fc 或VEGF捕捉劑蛋白，在第25天采集腫瘤；右側(cè)在植入后15天施予 D114-Fc或VEGF捕捉劑(Trap)蛋白，在第25天采集腫瘤。
圖3顯示純&的D114-Fc蛋白或多克隆D114抗體抑制 HT1080腫瘤生長。
圖4顯示在表面胞質(zhì)團共振(BiaCore逸)試驗中，針對D114 的多克隆抗體對Dl 14與Notchl受體結(jié)合的抑制。詳細說明
在描述本發(fā)明的方法之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不局限于所描 述的特定方法和實驗條件，因為這些方法和條件可以變化。還應(yīng)當(dāng)理 解本文中所用的術(shù)語只是為了描述特定的實施方案，而不是為了限制，因為本發(fā)明的范圍將只受所附權(quán)利要求書的限制。
如說明書和所附權(quán)利要求書所使用的，單數(shù)形式"一種U，an)"和"該(the)"包括所指代的復(fù)數(shù)，除非上下文中另有明確規(guī)定。因而，例如"一種方法"包括本文中所述類型的一種或多種方法、和/或步驟，它們是在閱讀本發(fā)明內(nèi)容以及諸如此類的內(nèi)容之后對本領(lǐng) 域技術(shù)人員是明了的。
除非另有定義，本文中所有的工業(yè)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所 屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。盡管任何與本文中描述 的相似或等效的方法和材料都可用于本發(fā)明的實施或試驗，但本申請 描述了優(yōu)選的方法和材料。定乂
術(shù)語"D114相關(guān)的"或"D114介導(dǎo)的"病癥或疾病指受 D114活性調(diào)節(jié)直接或間接影響的病癥。更具體而言，D114表現(xiàn)出與血 管生長和發(fā)展有關(guān)。因此，在一實施方案中，能通過本發(fā)明方法治療 的D114相關(guān)病癥是一種需要抑制或減少D114介導(dǎo)的血管生長或發(fā)展 或成熟例如為抑制腫瘤發(fā)展的病癥。
術(shù)語"抑制劑"或"拮抗劑"指延遲或阻止化學(xué)或生理反 應(yīng)或響應(yīng)的物質(zhì)?？梢灾苯拥?，例如通過以封閉性抗體抑制受體激活， 或者是間接的，由干擾編碼D114基因的表達，抑制的D114活性。常 見的抑制劑包括但不限于反義分子、抗體、可溶性受體以及它們的衍 生物、和結(jié)合其Notch受體但不能通過這種結(jié)合激活信號的經(jīng)修飾的 D114配體。
"中和"或"阻斷"抗體，用來指結(jié)合D114導(dǎo)致D114生 物活性的抑制的抗體。這種D114生物活性的抑制可通過測量D114生 物活性的一種或多種指示物來評價。這類D114生物活性的指示物可通 過本領(lǐng)域已知的若干標(biāo)準(zhǔn)'的體外或體內(nèi)檢測中的一種或多種檢測來評 價(參見下面的實施例)。優(yōu)選地，對抗體通過抑制D114結(jié)合Notch 受體如Notchl來中和D114活性的能力進行評價。一般描述
5樣/Notch信號途徑在發(fā)展期間對建立有組織的和分級 的脈管系統(tǒng)是必要的。各種5樣/Notch基因包括D114的靶向缺失， 會導(dǎo)致小鼠在胚胎發(fā)育期間由于嚴(yán)重的血管缺損而死亡。利用#:陣列分析，我們在小鼠異種移植腫瘤模型中發(fā)現(xiàn)5樣配體4(D114)是一種 VEGF-調(diào)節(jié)的基因。另外，在這類肺瘤模型中還發(fā)現(xiàn)，與相鄰的正常皮 膚中的D1M表達相比在肝瘤血管中D1M表達顯著較高。為了探究阻 斷肺瘤中D114/Notch信號的作用，在小鼠中進行異種移植研究，其中 可溶性D114-Fc分子由肺瘤細胞中逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的過表達局部釋放 或釆用腺病毒方法或通過注射純化蛋白全身釋放。與對照相比所有釋 放D114-Fc的方法都導(dǎo)致腫瘤生長減少。另外，D114-Fc治療的腫瘤 血管比對照具有更多的多支，形成具有密集血管發(fā)展的精細網(wǎng)絡(luò)，但 這類血管比對照腫瘤的血管的效力差。如陣列和TaqmanTM分析所表明 的，這類作用與Notch信號降低有關(guān)。采用全身地注入到小鼠體內(nèi)的 多克隆抗體溶液也觀測到對腫瘤生長的類似作用。還發(fā)現(xiàn)這類多克隆 抗體溶液抑制D114與Notchl受體的結(jié)合。另外，還發(fā)現(xiàn)D114-Fc比 受體型的VEGF阻斷劑("VEGF捕捉劑"，美國專利7， 070, 959)在減少 某些腫瘤的生長方面更有效。這些發(fā)現(xiàn)表明D114在腫瘤生長中起關(guān)鍵 作用，并支持D114作為靶子用于抗血管生成治療的發(fā)展。D114拮抗劑
D114抗體。本文中所用的術(shù)語"免疫球蛋白或抗體"指 哺乳動物包括人多的肽，其包含特異性結(jié)合和識別抗原的免疫球蛋白 基因或其片段的框架區(qū)，就本發(fā)明而言，其為D114蛋白或其部分。如 果所期望的抗體或抗體樣蛋白將作為哺乳動物治療劑使用，免疫球蛋 白結(jié)合區(qū)應(yīng)當(dāng)由相應(yīng)的哺乳動物免疫球蛋白衍化而來。若該分子打算 用于非治療劑應(yīng)用，如診斷和ELISA，則免疫球蛋白結(jié)合區(qū)可由人或 非人哺乳動物如小鼠衍化而來。人免疫球蛋白基因或基因片段包括K ， 入，oc, y， 5， e和iLi恒定區(qū)，以及種種免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分類為K或入。重鏈分類為Y， M， ct, 5或s，其依次分別定 義免疫球蛋白類型，IgG， IgM， IgA， IgD和IgE。在各IgG類中，存 在各種同型(例如IgGn IgG2， IgG3， IgG,)以及它們的異型。
示例性的人IgG的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元包含四聚 體。每個四聚體包括兩個相同的多肽鏈對，每一多肽鏈對具有一條輕 鏈(約25 kD)和一條重鏈(約50-70kD)。每條鏈的N-末端定義約 100-110或更多氨基酸的可變區(qū)，主要負責(zé)抗原識別。術(shù)語"可變輕鏈"(V,)和可變重鏈(VH)分別指這類輕鏈和重鏈。
抗體以完好的免疫球蛋白形式存在，或以許多充分表征的 通過各種肽酶消化產(chǎn)生的片段形式存在。例如，胃蛋白酶消化在絞鏈 區(qū)中的二硫鍵下的抗體產(chǎn)生F(ab)、 一種Fab的二聚體，它本身是通 過二硫鍵與VfCH連接的輕鏈。F(ab)、在溫和的條件下可被還原以使 絞鏈區(qū)中的二硫鍵斷裂，從而將F (ab) 、二聚體轉(zhuǎn)化為FaV單體。Fab' 單體基本上是具有部分絞鏈區(qū)的Fab。盡管各種抗體片段根據(jù)完整抗 體的消化而定義，但技術(shù)人員更愿意這種片段可以從頭化學(xué)合成或釆 用重組DNA方法合成。因此，本文中所用的術(shù)語抗體，還包括通過整 體抗體經(jīng)修飾產(chǎn)生的抗體片段，或采用重組DNA方法從頭合成的抗體 片段(例如，單鏈Fv (scFv)單可變域(Dabs))或采用顯示庫如噬菌體大 腸桿菌或酵母菌顯示庫鑒定的抗體片段(參見，例如，McCafferty等 (1990) Nature 348:552—554)。
制備抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。參見，例如，Kohler& Milstein (1975) Nature 256:495-497; Harlow & Lane (1988) Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab.， Cold Spring Harbor, NY)。從非人的生物體如小鼠、大鼠、兔、奶牛分離 出的抗體，可通過嵌合或人源化使其更類似人。
非人(例如，鼠)抗體的"人源化"或嵌合的形式為由非人 免疫球蛋白衍化的含有結(jié)合抗原所需最小序列的免疫球蛋白、免疫球 蛋白鏈或其片段(如Fv， Fab, Fab'， F(ab')2或其它結(jié)合抗原的抗體 序列)。它們與小鼠或其它非人抗體具有相同或相似的結(jié)合特異性和親8和性，其提供構(gòu)建嵌合的或人源化的抗體的起始原料。嵌合抗體為其 輕鏈和重鏈基因已經(jīng)典型地通過遺傳工程由屬于不同物種的免疫球蛋白基因片段構(gòu)建的抗體。例如，源自小鼠單克隆抗體的基因的可變(v)片段可與人恒定(C)片段如IgGl和IgG4連接。因此典型的嵌合抗體為 由小鼠抗體中的V或抗原結(jié)合區(qū)域和人抗體中的C或效應(yīng)器功能域構(gòu) 成的雜化蛋白。人源化的抗體具有基本上源自人抗體的可變區(qū)框架殘 基(稱為受體抗體)和基本上源自小鼠抗體的互補決定區(qū)(CDR區(qū))(稱 為供體免疫球蛋白)。參見，Queen等，Proc. Natl. Acad Sci. USA 86:10029-10033 (1989)和WO 90/07861， U. S.專利5, 693, 762 、 5, 693, 761、 5, 585, 089、 5， 530， 101和5， 225, 539。恒定區(qū)，若存在， 也基本上或完全來自人免疫球蛋白。人可變域通常選自人抗體，其框 架序列顯示出與獲得CDR的鼠可變區(qū)功能域高度的序列同一性。重鏈 和輕鏈可變區(qū)框架殘基可源自相同或不同的人抗體序列。人抗體序列 可以是天然的人抗體序列或可以是若干人抗體的共有序列。參見WO 92/22653。基于其對CDR構(gòu)建和/或?qū)乖Y(jié)合的可能影響，選擇源自 人可變區(qū)框架殘基的某些氨基酸用以置換。這種可能影響的研究是通 過模擬、檢驗特定位點的氨基酸特性或者經(jīng)驗性觀察特定氨基酸的置 換或突變的效應(yīng)進行的。例如，當(dāng)鼠可變區(qū)框架殘基和經(jīng)選擇的人可 變區(qū)框架殘基之間氨基酸不同時，通常人框架氨基酸將被來自小鼠抗 體的等效框架氨基酸置換，條件是合理預(yù)期氨基酸(l)非共價直接結(jié) 合抗原；(2)與CDR區(qū)鄰接；(3)否則與CDR區(qū)(例如在約6A的CDR區(qū) 之內(nèi))相互作用，或(4)參與Vl-Vh界面。其它用于置換的候選者是在該 位置上對于人免疫球蛋白稀有的受體人框架氨基酸。這類氨基酸可被 來自小鼠供體抗體的等效位置或來自更典型的人免疫球蛋白等效位置 的氨基酸置換。其它用于置換的候選者是在該位置上對于人免疫球蛋 白稀有的受體人框架氨基酸。人源化的免疫球蛋白的可變區(qū)框架通常 顯示與人可變區(qū)框架序列至少85%序列同一性或與這樣的序列的一 致性。
產(chǎn)生人抗體的方法包括，例如，VelocImmuneTM(RegeneronPharmaceuticals), XenoMouseTM技術(shù)(Abgenix) ， "mini locus"方法 和噬菌體展示。VelocImmuneTM技術(shù)(US 6， 596， 541)包括產(chǎn)生對選定抗 原具有高特異性的完全人抗體的方法。該技術(shù)涉及具有包含可操作性 連接至內(nèi)源性小鼠恒定區(qū)位點的人重鏈和輕鏈可變區(qū)的基因組的轉(zhuǎn)基 因小鼠的產(chǎn)生，使得小鼠響應(yīng)抗原刺激產(chǎn)生包含人可變區(qū)和小鼠恒定 區(qū)的抗體。編碼該抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)的DNA經(jīng)分離并可操作 性連接至編碼人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的DNA。然后在能表達完全人抗體 的細胞中表達所述DNA。在具體的實施方案中，細胞為CH0細胞。
XenoMouse 技術(shù)(Green等(1994) Nature Genetics 7: 13-21)產(chǎn)生同時具有源自重鏈和K輕鏈位點的人可變區(qū)和恒定區(qū)的 小鼠。在另一方法中，其他人已經(jīng)使用了 'minilocus"方法，其中通 過包含源自Ig位點的各個基因模擬外源性Ig位點(參見，例如，US 5， 5"， 80"。編碼人重蜂和輕鏈恒定區(qū)的DNA可操作性連接或不連接 編碼可變區(qū)的DNA地被分離。
或者，噬菌體展示或相關(guān)展示技術(shù)可用于鑒定特異性結(jié)合 D114的抗體、抗體片段，如可變域和異側(cè)的(heteromeric)Fab片段。 (例如參見美國專利公開2003/0229023)。
優(yōu)選免疫球蛋白(抗體)的篩析和選擇可通過本領(lǐng)域已知 的各種方法進行。例如，對于特異性針對D114的單克隆抗體的存在的 初步篩選可通過使用基于ELISA的方法或噬菌體展示進行。優(yōu)選地進 行第二道篩選以鑒定和選擇所需的單克隆抗體。第二道篩選可用本領(lǐng) 域已知的任何適宜的方法進行。 一種優(yōu)選的方法，稱為"Biosensor Modification-Assisted Profiling" ( "BiaMAP")描述于美國專利 申請公開2004/101920。 BiaMAP可以迅速識別產(chǎn)生具有所需特性的單 克隆抗體的雜交瘤克隆。更具體而言，基于抗體抗原相互作用的評 價將單克隆抗體分類為性質(zhì)不同的表位相關(guān)組?；蛘?，基于ELISA型、 珠型或Biacore忠型的竟?fàn)幏治隹捎糜阼b定結(jié)合對，所述結(jié)合對結(jié)合不 同的D114表位并因此可能以高親和性協(xié)作結(jié)合配體。[Q033]D114融合蛋白。當(dāng)D114拮抗劑為融合蛋白時，多聚化成分可選自(i)免疫球蛋白功能區(qū)，(n)截斷的多聚化成分，(iii)長度 為1-約500個氨基酸的氨基酸序列，任選地包含至少一個半胱氨酸殘 基，(iv)亮氨酸拉鏈，(v)螺旋環(huán)基序和(vi)巻曲螺旋基序。在優(yōu)選的 實施方案中，多聚化成分優(yōu)選為免疫球蛋白功能區(qū)，優(yōu)選為Fc功能域， 例如，人Fc(SEQ IDN0:20)。融合蛋白可任選地包含信號序列，它可 包括技術(shù)人員已知的有關(guān)細胞直接分泌多肽或蛋白質(zhì)的任何序列，包 括天然的或合成的序列。通常，信號序列位于本發(fā)明融合蛋白的開始 或氨基末端。這種信號序列可以是細胞天生的、重組的或合成的。本 發(fā)明的融合蛋白的成分可相互直接連接或通過一個或多個間隔序列連 接。在一優(yōu)選的實施方案中，這些成分相互直接融合。在另一優(yōu)選的 實施方案中，這些成分與編碼1-200個氨基酸的間隔區(qū)的核酸序列連 接。任何本領(lǐng)域已知的間隔區(qū)都可用來連接蛋白質(zhì)成分。間隔區(qū)序列 也可包括用于增加融合蛋白表達的序列，提供限制位點，和允許成分 功能域形成最佳的三級和四級結(jié)構(gòu)和/或增加成分與其受體相互作用。 在一實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含一種或多種成分(在1-25個 氨基酸之間)之間的 一 個或多個肽序列。
Dl 14的胞外域由5 /Serrate/Lag-2 (DSL)功能域和八個表 皮生長因子(EGF)樣重復(fù)單元的串聯(lián)體構(gòu)成。通常，EGF功能域被認為 是出現(xiàn)在大約218-251 (功能域1)， 252-282 (功能域2), 284-322 (功 能域3), 324-360 (功能域4)，和362-400 (功能域5)的位置，DSL功 能域出現(xiàn)在大約173-217的位置，N-末端功能域出現(xiàn)在大約hD114 (SEQ ID NO: 2)的27-172的位置。在具體的實施方案中，能抑制D114 活性的hD114拮抗劑為與hFc(SEQ ID NO:20)融合的包含SEQ ID NO: 2 的約氨基酸27至約172的DSL-hFc(SEQ ID NO: 21)，與hFc融合的包 含SEQ ID NO: 2的約27-217的N-末端功能域-DSL-hFc (SEQ ID NO: 22)， 與hFc融合的包含約218-400的EGF功能域1-5-hFc (SEQ ID NO: 23)， 與hFc融合的包含約218-360的EGF功能域1-4-hFc (SEQ ID NO: 24)， 與hFc融合的包含約218-322的EGF功能域1-3-hFc (SEQ ID NO: 25)， 與hFc融合的包含約218-282的EGF功能域1-2-hFc (SEQ ID NO: 26)，或在功能域成分之間任選地包含連接子的其變體。融合蛋白的成分在保留其充當(dāng)D114性能的同時還可以是各種構(gòu)型排列。 給藥方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供治療方法，包括給患者施用有效量的本發(fā)明的 治療劑。優(yōu)選地，治療劑基本上被純化(例如，基本上不含限制其作用 或產(chǎn)生不希望的副作用的物質(zhì))?；颊邇?yōu)選為動物，例如，奶牛、豬、 馬、小雞、貓、狗等，且優(yōu)選為哺乳動物，最優(yōu)選為人。
各種給藥系統(tǒng)是已知的且可用于施用本發(fā)明的治療劑，例 如脂質(zhì)體形式的包嚢、微粒、微囊、能表達化合物的重組細胞、受體 介導(dǎo)的胞吞(參見，例如，Wu and Wu， 1987， J. Biol. Chem. 262: 4429-4432)、作為逆轉(zhuǎn)錄病毒的一部分的核酸的構(gòu)建或其它載體 等。引入的方法可以經(jīng)腸道或腸胃外的，包括但不限于真皮內(nèi)、肌內(nèi)、 腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)、表皮下、鼻內(nèi)、硬膜外和口服的途徑?；衔锟赏?過任何方便的途徑給藥，例如通過輸注或快速推注、通過上皮或皮粘 膜的內(nèi)膜層吸收(例如，口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)，且可與其它生 物活性劑一起給藥。施用可以是全身的或局部的。此外，將本發(fā)明的 藥物組合物通過任何適宜的途徑引入中樞神經(jīng)系統(tǒng)可能是合乎需要 的，所述途徑包括心室內(nèi)和鞘內(nèi)注射；心室內(nèi)注射通過心室內(nèi)導(dǎo)管變 得更為方便，例如連接儲液器，如Ommaya儲液器。也可以釆用肺部給 藥，例如，通過利用吸入器或噴霧器和含霧化劑的制劑給藥。
在具體的實施方案中，將本發(fā)明的藥物組合物局部施用于 需要治療的部位可能是合乎需要的；例如，這可非限制性地通過下述 方式實現(xiàn)在外科手術(shù)期間通過局部輸注，局部施用，例如，通過注 射，借助導(dǎo)管，或通過植入，所述植入物為多孔的、無孔的、或凝膠 狀的材料，包括膜，如sialastic膜，纖維，或商品化的皮膚替代物。
在另一實施方案中，活性劑可以以嚢泡(vesicle)、特別 是脂質(zhì)體的形式遞送(參見Langer (1990) Science 249:1527-1533)。 在另一實施方案中，活性劑可以以控釋系統(tǒng)的形式遞送。在一實施方案中，可以使用泵(參見Langer(1990)上文)。在另一實施方案中，可 以使用聚合材料(參見Howard等(1989) J. Neurosurg. 71:105)。在 另一實施方案中，其中本發(fā)明的活性劑為編碼蛋白的核酸，核酸可體 內(nèi)施用以促進其編碼的蛋白的表達，通過將其構(gòu)建為適宜的核酸表達 載體的一部分并將其施用使其成為細胞內(nèi)，例如通過利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見，例如，美國專利4, 980, 286)，或通過直接注射，或通過 利用微粒轟擊(例如，基因槍；Biolistic， Dupont),或以脂質(zhì)或細胞 表面受體或轉(zhuǎn)染劑包衣，或通過以與已知會進入細胞核的同源異型框 樣肽連接的形式將其施用(參見例如，Joliot等，1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868)。作為選擇，可通過同源重組將核酸 引入細胞內(nèi)和并入宿主細胞DNA用于表達。藥物組合物
本發(fā)明還提供藥物組合物。這種組合物包含治療有效量的 活性劑和可藥用載體。術(shù)語"可藥用的"指經(jīng)聯(lián)邦或州政府管理機構(gòu) 批準(zhǔn)的或者列在美國藥典或其它公認的藥典上的供動物尤其是人用 的。術(shù)語"負載劑，，指與治療劑一起給藥的稀釋劑、輔助劑、賦形劑 或載體。這類藥用負載劑可以是無菌液體，如水和油，包括石油、動 物、植物或合成來源的油，如花生油、豆油、礦物油、芝麻油等。適 宜的藥用賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥酒、大米、 面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石粉、氯化鈉、 脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，組合物還 可以含少量的濕潤劑或乳化劑或pH緩沖劑。這類組合物可采取溶液、 混懸液、乳劑、片劑、丸劑、膠嚢、粉劑、緩釋制劑等形式。組合物 可與常規(guī)的粘合劑和負載劑如甘油三酯一起配制成栓劑?？诜苿┛?包括標(biāo)準(zhǔn)的負載劑如藥用級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精 鈉、纖維素、碳酸鎂等。適宜的藥物負載劑的實例描述于E.W. Martin 的 "Remington's Pharmaceutical Sciences"。
在優(yōu)選的實施方案中，組合物按常規(guī)方法配制成適合于靜脈給藥于人的藥物組合物。必要時，組合物還可包括增溶劑和局部麻 醉劑如利多卡因以在注射部位鎮(zhèn)痛。在組合物要輸注給藥的情況下， 它可省去裝有無菌藥用級水或鹽水的輸液瓶。在組合物注射給藥的情 況下，可提供一安瓿的滅菌注射水或鹽水以便在給藥之前各成分可以 混合。
本發(fā)明的活性劑可以中性或鹽的形式配制?？伤幱名}包括 與游離氨基形成的鹽，如由鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等獲得 的鹽。以及與自由羧基形成的鹽，如由氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化 銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、 普魯卡因等獲得的鹽。
本發(fā)明的活性劑在治療D114介導(dǎo)的病癥中有效的量可基 于本申請的說明通過標(biāo)準(zhǔn)的臨床技術(shù)來確定。此外，體外試驗可任選 地運用以幫助確定最佳的劑量范圍。用于制劑中的精確劑量還將取決 于給藥途徑和病癥的嚴(yán)重程度，并根據(jù)醫(yī)師的判斷和每個患者的情況 來決定。不過，靜脈給藥的適宜劑量范圍通常為每公斤體重約0. 5至 20毫克的活性化合物。鼻內(nèi)給藥適宜的劑量范圍通常為約0. 01 pg/kg 體重至1 mg/kg體重。有效劑量可由從體外或動物模型試驗系統(tǒng)獲得 的劑量-反應(yīng)曲線來外推。聯(lián)合治療
在許多實施方案中，本發(fā)明的D114可與一種或多種另外 的化合物或治療聯(lián)合應(yīng)用。例如，多重融合蛋白或抗D114抗體可共同 給藥或與連同一種或多種治療化合物一起給藥。在優(yōu)選的實施方案中， 本發(fā)明的D114抑制劑與,VEGF拮抗劑，如抗VEGF抗體或VEGF捕捉劑 一起給藥。VEGF捕捉劑的優(yōu)選實施方式(按照WO 00/75319中的描述) 為VEGFR1R2 - FcACl(a)。
本文中所用的術(shù)語"細胞毒劑"指抑制或阻止細胞的功能 和/或?qū)е录毎茐牡奈镔|(zhì)。該術(shù)語是指包括放射性同位素(例如I131、 I125、 Y"和Re186)、化療劑、以及毒素如細菌、霉菌、植物或動物來源的酶活性毒素、或其片段。
聯(lián)合治療包括含本發(fā)明的D114拮抗劑和一種或多種VEGF 拮抗劑的單一藥物劑量配制劑的給藥；以及D114拮抗劑和一種或多種 另外的治療劑以其各自獨立的藥物劑量配制劑的給藥。例如，D114拮 抗劑和細胞毒劑、化療劑或生長抑制劑可以單一劑量組合物如聯(lián)合配 制劑 一起施用于患者，或者每種治療劑可以獨立的劑量配制劑施用。 在應(yīng)用獨立的劑量配制劑的情況下，本發(fā)明的融合蛋白和一種或多種 另外的治療劑可同時給藥、或在錯開的時間給藥即順次給藥。
"化療劑"為用于治療癌癥的化合物?；焺┑膶嵗?烷化劑如塞替派和環(huán)磷酰胺(CYTOXAN );烷基磺酸酯類如白消安、英 丙舒凡和旅泊舒凡；氛丙咬:ft口 benzodopa、卡S皮酉昆、meturedopa和 uredopa ; 亞乙基亞胺類 (ethylenimines )和甲基蜜胺類 (methylamelamines )包括六甲蜜胺、曲他胺、三亞乙基磷酰胺 (trietylenephosphoramide )、 三亞乙基硫代磷酰胺和 trimethylolomelamine;氮芥類如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯代磷酰胺、 雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、氮芥、氧化氮芥鹽酸化物、美法侖、新氮芥、 苯芥膽甾醇、潑尼莫司汀、曲磷胺、烏拉莫司汀；硝基脲類如卡莫司 汀、吡葡亞硝脲、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司??；如 aclaci誦ysins、放線菌素、authramycin、偶氮絲氨酸、博來霉素、 放線菌素C、 calicheamicin、 carabicin、洋紅霉素、嗜癌素、色霉 素、放線菌素D、柔紅霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨 酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊達比星、麻西羅霉素、絲裂 霉素、麥考酚酸、諾拉霉素、橄欖霉素、培洛霉素、potfiromycin、 噪羅霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑霉素、鏈佐星、殺結(jié)核菌素、 烏苯美司、凈司他丁、佐乘比星,；抗代謝物如曱氨蝶呤和5-氟尿嘧啶 (5-FU);葉酸類似物如三甲葉酸、甲氨蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌 呤類似物如氟達拉濱、6-巰嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物 如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮尿苷卡莫氟、卡莫氟、阿糖胞苷、雙脫 氧脲苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷；雄激素如卡普睪酮、屈他雄酮丙酸酯、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯；抗腎上 腺素類如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補充劑如frolinic酸； 醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil;比生 群；依達曲沙；def of amine;秋7jc仙胺；地吖醌；elf orni thine;依 利醋銨；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達明；米托胍 腙；米托蒽醌；莫哌達醇；二胺硝吖啶；噴司他丁；蛋氨氮芥；吡柔 比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK ;雷佐生；西佐喃；鍺 螺胺；細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2， 2、 2"-三氯三乙胺；氨基曱酸 乙酯；長春地辛；達卡巴溱；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇； 哌泊溴烷；gacytosine;阿糖胞苷("Ara-C");環(huán)磷酰胺；塞替派； 紫杉烷類，例如紫杉醇(TAXOL , Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)和多西紫杉醇(TAXOTERE ; Aventis Antony, France);苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-疏鳥嘌呤；巰噪呤；曱氨蝶呤； 鉑類似物如順鉑和卡鉑；長春堿；鉑；依托泊苷(VP-16);異環(huán)磷酰 胺；絲裂霉素C;米托蒽醌；長春新堿；長春瑞濱；諾維本；諾消靈； 替尼泊苷；柔紅霉素；氨基蝶呤；希羅達；伊班膦酸鹽；CPT-11;拓 樸異構(gòu)酶抑制劑RFS 2000; 二氟甲基鳥氨酸(DMF0);視黃酸； esperamicins;卡培他濱；以及上述任何藥物的可藥用鹽、酸或矛汙生 物。在該定義中還包括起作用調(diào)節(jié)或抑制胂瘤活動的抗激素劑如抗雌 激素，例如包括他莫昔芬，雷洛昔芬，抑制芳香酶的4(5)-咪唑，4-羥泰米芬，曲沃昔芬，keoxifene， LY 117018，奧那司酮和托瑞米芬 (Fareston);以及抗雄激素如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞 林和戈舍瑞林；以及上述任何藥物的可藥用鹽、酸或衍生物。
"生長抑制劑"在本文中使用時指在體外或在體內(nèi)抑制細 胞、尤其是癌細胞生長的化合物或組合物。生長抑制劑的實例包括阻 斷細胞周期進展的治療劑(在非S期的位置)，如誘導(dǎo)Gl停止和M-相 停止的治療劑。典型的M-相阻斷劑包括長春胺(長春新堿和長春堿)、 TAX0I^，和topo II抑制劑如多柔比星、表柔比星、柔紅霉素、依托泊 苷和博來霉素。那些停止G1的治療劑還過剩進入S相停止，例如DNA烷化劑如他莫昔芬，潑尼松，達卡巴溱，氮芥，順鉑，曱氨蝶呤，5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。實施例
給出以下實施例是為給本領(lǐng)域普通技術(shù)人員就如何制備 和應(yīng)用本發(fā)明的方法和組合物提供完全的公開和說明，而不旨在限制 發(fā)明人對其發(fā)明考慮的范圍。已經(jīng)努力地確保所用數(shù)字(例如，量，溫 度等)的正確性，但應(yīng)說明存在一些實驗誤差和偏差。除非另有說明， 份數(shù)為重量份數(shù)，分子量為平均分子量，溫度為攝氏度，壓力為大氣 壓或接近大氣壓。實施例1:在小鼠中靶向D114基因。
基因?qū)?。使用VelocigeneTM技術(shù)(Valenzuela等(20(J3) Nat. Biotechnol. 21: 652-9)產(chǎn)生精確的DIM編碼區(qū)的缺失和交換， 從開始到終止密碼子(相當(dāng)于包含所有編碼外顯子和插入內(nèi)含子的 8.1 kB區(qū))延伸，含b-半乳糖苷酶指示基因以及新霉素選擇盒 (selection cassette)。簡單地說，對含8. 1 kb Dl 14編碼區(qū)和140Kb 的側(cè)翼序列(源自由Incyte基因組獲得的129/SvJ BAC庫的克隆475d4) 的細菌人工染色體(BAC)進行修飾以產(chǎn)生BAC型的把栽體，然后將其線 化并用作靶載體以置換F1H4 (C57BL/6: 129雜交種)小鼠胚胎干(ES)細 胞中的Dl 14基因。采用天然等位基因損失(LONA)分析法鑒定正確耙向 的胚胎干細胞(Valenzuela等(2003)上文)。使用兩個獨立的正確把向 ES系產(chǎn)生嵌合的雄性小鼠，它是ES-產(chǎn)生的精子的完整傳遞者。然后 將嵌合體繁殖成C57BL/6和/或ICR雌性以產(chǎn)生F1小鼠或胚胎，通過 LONA分析法和p-半乳糖苷酶組織化學(xué)分析法對其進行基因型分析。 兩者均由ES系獲得的小鼠表現(xiàn)相同，由兩者克隆的合并(pooled )數(shù) 據(jù)用于統(tǒng)計。
結(jié)果。在小鼠中靶向D114基因?qū)е屡咛ブ滤垃F(xiàn)象和嚴(yán)重 的血管缺損，甚至在以單個等位基因靶向的小鼠中也會出現(xiàn)(參見Gale等(2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:15949-15954)。
腫瘤植入。將Lewis肺癌細胞(ATCC)皮下植入D114嵌合的小鼠肋部，16天之后采集，切成80微米切片，并按照描述對CD31/PECAM或P-半乳糖苷酶染色(Holash等(2002) Proc Natl. Acad.Sci. USA 99:11393-8)。
PECAM和報道分子染色。對整體裝載的胚胎、以及源自胚胎和成體的組織切片，按照前述用于CD31/PECAM的方法進行染色以界定血管內(nèi)皮，用于P-半乳糖苷酶的方法染色以使D114指示基因產(chǎn)物顯像(Gale等(2004) PNAS 101:15949-54)。實施例2. D114-Fc構(gòu)建和小鼠異種移植研究。
D114-Fc (-TM)構(gòu)建。構(gòu)建具有2297個核苷酸的核酸序列， 其相應(yīng)于人D114的胞外域(SEQ IDNO: 1)，不含跨膜(-TM)功能域，含 人Fc功能域。該編碼的氨基酸序列具有D114蛋白的765個氨基酸(SEQ ID NO: 18)，分子量為大約85kDa。


圖1顯示C6腫瘤細胞的D114-Fc過表達導(dǎo)致C6腫瘤變小 (平均值土SD)。
腫瘤細胞過表達D114-Fc的逆轉(zhuǎn)錄病毒工程。使C6大鼠 膠質(zhì)瘤腫瘤細胞(ATCC)感染逆轉(zhuǎn)錄病毒以過表達綠熒光蛋白(GFP)和 可溶性D114-Fc;感染上GFP的細胞單獨用作對照。將細胞進行FACS 分選用于GFP熒光兩次。
逆轉(zhuǎn)錄病毒釋放的D114-Fc。用GFP或D114-Fc逆轉(zhuǎn)錄病 毒工程的C6細胞以106個細胞/小鼠皮下植入剃光的雄性SCID/CB17 小鼠(8-10wk大)右肋。
腫瘤體積測量在腫瘤變得明顯之后，記錄每三天一次使 用游尺的尺寸測量(尺寸- (長度x寬度72)。 一處死動物，就用游尺 得到離體測量并利用公式長度x寬度x高度)計算體積。
腫瘤組織學(xué)。在腫瘤細胞植入12至16天以后，采集腫瘤 并處理以進行組織或表達分析。將胂瘤切成80 um切片，以抗體染至CD31/Pecam-1之后進行DAB-過氧化物酶反應(yīng)，并用派洛寧Y復(fù)染。利 用NIH Image 1. 62分析程序進行血管形態(tài)測定分析。
Northern印跡和實時-PCR。使用Trizol試劑(Life Technologies, Grand Island, NY)由腫瘤組織制備總RNA。在1.2% 瓊脂糖凝膠上分離RNA(IO mg)，轉(zhuǎn)入尼龍膜上并通過UV交聯(lián)固定。 在預(yù)雜交之后，加入32P標(biāo)記的Dl 14或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH) -特異性探針，并將濾料在42'C雜交過夜。以標(biāo)準(zhǔn)方案進行嚴(yán)格洗滌(一 次洗滌0.5 X SSPE緩沖液之后用0.2 X SSPE緩沖液洗滌兩次，每次 在55。C進行30分鐘)。在暴露于帶有增感屏(intensifying screens ) 的X光膠片48 h之后獲得自動射線照相。此外，使用Taqman (Applied Biosystems， Foster City, California)實時PCR化學(xué)和檢測系統(tǒng)在 分開的反應(yīng)中分析組織特異性表達，所述系統(tǒng)具有引物對和對D114、 notch受體1和4和notch下游耙向、Hesl、 Hey2、 HeyL和Nrarp特 異的標(biāo)記探針。獲得達到cDM擴增閾值(或CT值)所必需的循環(huán)數(shù)目， 標(biāo)準(zhǔn)化為內(nèi)操作參照(housekeeping reference) (GAPDH) ( = 2-DCT)。 將結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為基線，實驗的媒介物對照，得到相對的mRNA豐度變化 (- 2DDCT)并用至少4個分開的樣品重復(fù)三次的平均值± s. e. m.來表示 (Livak and Schmittgen (2001) Methods. Dec; 25 (4): 402-8)。
對D114、 HeyL Nrarp和Hesl進行定量的RT-PCR分析。 按照描述進行RT-PCR分析(Livak等(200D Methods 24: 402-8)。結(jié) 果用目標(biāo)RM量與對照RM (GAPDH)量之比來表示，其中所述的量按照 描述(Daly等，(2004) Genes Dev. 18: 1060-71)在Applied Biosystems 7900HT上使用如下的特異性引物和探針獲得D114引物 D114-1574F(SEQ ID NO: 9)和Dl 14-1644R(SEQ ID NO: IO)和D114探針 D1 14-1594T(SEQ ID NO: 11); HeyL引物:mHeyL-135F(SEQ ID NO: 12) 和mHeyL-216R(SEQ ID N0:13)和HeyLProbe: mHeyL-154T(SEQ ID NO: 14); Nrarp引物mNrarp-350F( SEQ ID NO: 15 )和mNrarp-418R (SEQ ID NO: 16)和Nrarp探針mNrarp-373T: (SEQ ID NO: 17)和mHes 1 (ID Mm00468601 ml, Hesl) (ABI, Assay on demand services)。 cDNA從C6-D114-Fc和C6-D114腫瘤中獲得。
體外分析測定C6細胞中表達分泌的D114-Fc是否激活 HUVEC中的Notch信號。將4 x 105 HUVEC細胞平鋪在60 mm平皿上 在隨后的幾天得到~ 50%鋪滿培養(yǎng)物。第二天，將8 x 105 C6細胞鋪 在HUVECs的上層。在24小時的共培養(yǎng)之后，將細胞破碎入1 ml的 Tri試劑中并按照前述方法制備總RNA。使用人特異性Hesl、 HeyL和 Nrarp探針以Taqman②分析樣品。實施例3. D114-Fc全身給藥的作用。[Q062]D114-Fc蛋白。將上述編碼D114-Fc cDNA構(gòu)建體的質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染到CHO細胞中，并將分泌性蛋白從上清液中純化。將D114-Fc蛋 白純化并用于經(jīng)皮下注射(IO mg/kg,每周3x)治療有胂瘤的小鼠。
結(jié)果。進行實驗，其中將HT1080腫瘤按上述方法在第0 天植入小鼠。在第O天或第15天(以100腿s的尺寸)，用純化的D114-Fc 蛋白(10mg/kg，每周3x)或?qū)φ盏鞍字委熜∈?。用VEGF拮抗劑(VEGF 捕捉劑，SEQ ID N0:19)以25 mg/kg的劑量，每周三次治療其它組。 結(jié)果如圖2所示。在第O天開始治療的腫瘤中(左側(cè))，VEGF拮抗劑和 D114-Fc都能有效控制腫瘤生長。在尺寸為100 mi^的腫瘤中(右邊)， D114-Fc也有效地控制肺瘤生長，事實上比VEGF拮抗劑更有效。
循環(huán)性D114-Fc和hFc的定量。通過ELISA分析法對從 GFP或D114-Fc治療的有腫瘤的小鼠中獲得的血清樣品進行分析。通 過以hFc作為俘獲抗體覆蓋平皿進行ELISA，用0.2% I-阻斷溶液 (Tropix)阻斷，并使用與過氧化物酶綴合的hFc作為報道抗體。將純 化的hFc和Dl 14-Fc蛋白包括在標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)。
VEGF-抑制劑治療。將VEGF捕捉劑(R1R2) (Regeneron Pharmaceuticals) (SEQ ID NO: 19)或空白對照劑(5 % v/v PBS /甘 油)以25 mg/kg的劑量每A天一次皮下施用于具有100 mm3腫瘤的小 鼠，直到研究結(jié)束。
D114-Fc的腺病毒遞送。沒有給出的其它實驗應(yīng)用腺病毒全身遞送D114-Fc。將C6、 HT1080或MMT腫瘤細胞皮下植入剃光的雄 性SCID/CB17小鼠(8-10wk大)右肋。24小時之后，將lxl(fpfu的 腺-hFc或腺D114-Fc注入到小鼠的頸靜脈內(nèi)。用腺-D 114-Fc觀察到與 用D114-Fc蛋白全身治療相似的結(jié)果。實施例4. D114-Fc的多克隆抗體對HT1080腫瘤的作用。
進行實驗，其中將HT1080腫瘤按上述方法在第0天時植 入小鼠。當(dāng)腫瘤達到100 111013時(大約在15天)，用Dl 14-Fc單獨(25 mg/kg)、對照抗體(兔Ig)、或去除(depleted)結(jié)合人Fc的抗D114多 克隆抗體每周三次治療小鼠(IO mg/kg)。結(jié)果顯示各治療組中的腫瘤 尺寸土S.D.(圖3)。 D114抗體對抗HT1080腫瘤生長是高效的，具有與 D114-Fc所觀察到的相似效力。這些結(jié)果表明D114特異性阻斷劑是有 效的抗腫瘤劑。
進行表面胞質(zhì)團共振(81&(:016 )分析以證實D114抗體能 阻斷D114與Notch受體結(jié)合。將Notch 1覆蓋在碎片(chip)表面上并 將DU4-Fc用遞增量的兔多克隆抗D114抗體(如上所述)溫育。圖4 中的結(jié)果表明遞增量的D114抗體增加地阻斷D114-Fc與Notchl結(jié)合 (對照-Dl 14-Fc +非特并性兔多克隆抗體)。
權(quán)利要求
1.能抑制δ樣配體4(D114)活性的治療劑的用途，用于在需要其的患者中抑制腫瘤的發(fā)展或生長。
2. 按照權(quán)利要求1的用途，其中能夠抑制D114的治療劑為抗體或 抗體片段。
3. 按照權(quán)利要求2的用途，其中D1M抗體或抗體片段為多克隆的 或單克隆的。
4. 按照權(quán)利要求3的用途，其中抗體或抗體片段為人源化的、嵌 合的或完全人抗體或抗體片段。
5. 按照權(quán)利要求4的用途，其中抗體片段為單鏈抗體、Fab或 F(ab02。
6. 按照權(quán)利要求1的用途，其中D114拮抗劑為與多聚化成分融合 的D114的片段。
7. 權(quán)利要求1至6中定義的能抑制D114活性的治療劑作為第一治 療劑，與另一種治療劑在制備抑制腫瘤發(fā)展或生長的藥物中的用途，所 述另 一種治療劑為血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抑制劑。
8. 按照權(quán)利要求7的用途，其中VEGF抑制劑為抗VEGF抗體或VEGF 捕捉劑。
9. 按照權(quán)利要求8的用途，其中VEGF捕捉劑為SEQ ID NO: 19。
全文摘要
抑制腫瘤發(fā)展或生長的治療方法，包括給需要這種治療的患者施用能抑制人δ樣配體4(D114)活性的治療劑。在一實施方案中，治療劑為能抑制D114與Notch受體結(jié)合的抗D114抗體或抗體片段。在另一實施方案中，治療劑為包含與多聚化成分如Fc功能域融合的D114胞外域或其片段的融合蛋白。本發(fā)明的方法用于抑制腫瘤生長，尤其用于對其它治療劑不敏感的腫瘤。
文檔編號A61K39/00GK101330925SQ200680047372
公開日2008年12月24日 申請日期2006年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月16日
發(fā)明者E·史密斯, G·瑟斯頓, I·諾格拉, N·蓋爾 申請人:瑞澤恩制藥公司