專利名稱：免疫調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子受體25(tnfr25)的激動劑、拮抗劑和免疫毒素的制作方法
免疫調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子受體25 (TNFR25)的 激動劑、拮抗劑和免疫毒素優(yōu)先權(quán)本申請要求享有2005年8月30號提交的美國申請?zhí)?0/712,084 的優(yōu)先權(quán)，在此以參考的方式將其完整引入。發(fā)明背景1. 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明分別涉及腫瘤壞死因子受體超家族25 ( TNFR25)的激動 劑、免疫毒素、拮抗劑和它們在治療癌癥、炎癥和影響免疫抑制中的 用途。2. 背景技術(shù)人免疫系統(tǒng)的許多病癥屬于兩個大類那些以衰弱的免疫應(yīng)答 為特征的病癥和那些以過度免疫應(yīng)答為特征的病癥。免疫缺陷以衰弱 的應(yīng)答為表征。存在先天(生來的)和后天形式的免疫缺陷。慢性肉芽 種病，其中吞噬細胞難于破壞病原體，是前者的實例。AIDS("獲得性 免疫缺陷綜合征")， 一種傳染病，起因于破壞CD4十T細胞的HIV病 毒，是后者的實例。另一種以衰弱的免疫應(yīng)答為特征的疾病是癌癥。 與健康個體不同，癌癥患者的免疫系統(tǒng)已經(jīng)不能有效識別和/或破壞腫 瘤細胞。盡管寄予很大期望，迄今為止沒有藥物能夠直接增強免疫系統(tǒng)的 活性。但是，近來生物療法已被用于募集免疫系統(tǒng)，直接地或者間接 地，用于對抗諸如癌癥的疾病?，F(xiàn)在單克隆(MAb)抗體經(jīng)常被用于生 物療法。例如，單克隆抗體可以與特異類型的癌細胞作用，具有直接 或者間接的抗癌效果。腫瘤疫苗可以用于治療或者初次治療后的預防?？鼓[瘤疫苗可能 需要以CD4或者CD8表型的腫瘤特異的細胞毒性T細胞形式誘導細胞免疫。普遍認為有效的抗癌免疫需要長時間產(chǎn)生和維持的這類細胞毒性細胞。此外，證據(jù)表明必須激活免疫系統(tǒng)的固有裝備(innate arm) 以產(chǎn)生有效的抗腫瘤疫苗。增強或者產(chǎn)生體液應(yīng)答的疫苗能夠產(chǎn)生可 以在相對較長的時間段內(nèi)被檢測到的抗體。如果有效，這些抗體需要 能夠在活細胞檢測中靶定細胞表面抗原。保持針對抗原表位的特異性 細胞免疫應(yīng)答(獲得性免疫)可能需要更頻繁的免疫，盡管記憶細胞能 夠維持應(yīng)答和再刺激免疫表位的能力。因而，如果能夠獲得加強的針 對腫瘤疫苗的癌癥特異性細胞免疫應(yīng)答將是非常有利的。在天平的另一端，過度免疫系統(tǒng)包括進許多其他病癥，特別是自 身免疫病癥，例如紅斑狼瘡，I型糖尿病(有時稱為"少年發(fā)病糖尿病，，)， 多發(fā)性硬化，牛皮褲，類風濕性關(guān)節(jié)炎和諸如克羅恩氏病(Crohn's Disease)和潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的炎性腸疾病。在這些病癥中，免疫系統(tǒng) 不能正確區(qū)分自身和非自身，攻擊患者自身機體的一部分。疾病中過 度免疫應(yīng)答的其他實例包括超敏反應(yīng)，例如變態(tài)反應(yīng)和哮喘。當這些病癥造成過度組織損傷時，經(jīng)常利用免疫系統(tǒng)的抑制控制 自身免疫病癥或者炎癥。免疫抑制藥物故意誘導免疫缺陷以避免對移 植器官的排斥。常用的免疫抑制劑包括糖皮質(zhì)激素，咪唑硫噤呤，氨 曱^^呤，環(huán)孢子菌素，環(huán)磷酰胺和巰基噤呤。在器官移植中，選擇性 的T細胞抑制避免器官排斥，使用環(huán)孢子菌素、他克莫司、霉酚酸酯 (mycophenolate mofetil)和多種其他藥物。T淋巴細胞在調(diào)控免疫應(yīng)答中起著重要作用。輔助T細胞表達CD4 表面標志物，協(xié)助B細胞的抗體產(chǎn)生，并輔助CD8 T細胞發(fā)展細胞毒 活性。其他CD4T細胞抑制抗體產(chǎn)生和細胞毒性。T細胞調(diào)節(jié)被感染 或者致瘤細胞的攻擊和機體細胞耐受性之間的平4軒。失調(diào)的免疫攻擊 可能導致自身免疫，而減弱的免疫應(yīng)答導致慢性感染和癌癥。本文的胂瘤壞死因子受體25(TNFR25)還可以互換的指如此處所 述的死亡受體3(Death receptor 3, DR3),是T細胞功能的調(diào)節(jié)劑。死 亡受體3 (DR3) (Chinnaiyan等人，Science 274:990, 1996)是TNF受體 家族的成員。它還被稱作TRAMP (Bodmer等人，Immunity 6:79, 1997), wsl-l (Kitson等人，Nature 384:372, 1996), Apo-3 (Marsters等人，CurrBiol 6: 1669， 1996)，和LARD (Screaton等人，Proc Natl Acad Sci U S A 94:4615， 1997)，并包含典型的死亡結(jié)構(gòu)域。用人DR3 (hDR3)轉(zhuǎn)染 293細月包i秀導凋亡和激活NF-kB。最近已經(jīng)鑒定DR3的同源配體為 TL1A (Migone等人，Immunity 16:479, 2002),并已經(jīng)顯示，通過表達 cIAP2誘導NF-;cB和抑制凋亡，其對T細胞上的DR3具有共刺激活性 (Wen等人，J Biol Chem 25:25， 2003)。 。 TL1A還結(jié)合誘何受體 3(DcR3/TR-6)，表明生物學的TL1A可及性的細微調(diào)整(fme-tuning)具 有非常重要的意義。已經(jīng)觀察到人DR3mRNA的多種剪接形式，顯示 轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)(Screaton等人，Proc Natl Acad Sci U S A 94:4615， 1997)。許多TNF受體家族成員具有通過凋亡誘導細胞死亡或者誘導T細 胞功能的共刺激信號的能力。最近針對TNF-R1證實了這些相對途徑 的調(diào)節(jié)，所述TNF-R1是包含原型(prototypic)死亡結(jié)構(gòu)域的受體，其 能夠引起受體陽性T細胞的凋亡或者增殖(Micheau和Tschopp. Cell 114:181,2003)。由TNF-R1組成的信號復合物通過TRADD、 TRAF2 和RIP引起的NF-kB活化來誘導FLIPL與由TNFR1 、 TRADD和FADD 組成的第二信號復合物的結(jié)合，只要NF-KB信號持續(xù)，就阻止半胱天 冬酶8活化。已經(jīng)證明DR3能夠在轉(zhuǎn)染細胞中誘導凋亡并誘導NF-kB 和所有三種MAP-激酶途徑(Chinnaiyan等人，Science 274:990, 1996; Bodmer等人，Immunity 6:79, 1997; Kitson等人，Nature 384:372, 1996; Marsters等人，Curr Biol 6: 1669, 1996; Screaton等人，Proc Natl Acad Sci U S A 94:4615， 1997; Wen等人，j Biol Chem 25:25, 2003)。 NF-kB 的阻斷，而不是MAP激酶的阻斷和蛋白合成的抑制導致DR3介導的 細胞死亡，表明NF-kb信號通過抗細月包凋亡蛋白的合成調(diào)節(jié)抗細胞凋 亡作用。人DR3mRNA在淋巴組織中表達，主要在脾，淋巴結(jié)，胸腺， 和小腸中，表明DR3在淋巴細胞中的重要功能。通過同源重組已經(jīng)在 胚胎干細胞中去除鼠DR3(Wang等人，Mol Cell Biol 21 :3451, 2001)。 DR3-A小鼠顯示抗CD3在胸腺中的減弱的陰性選擇，而對超級抗原顯 示正常的陰性選4奪，對胸腺細胞顯示未受損的陽性選擇。成熟的外周T細胞不受DR3缺陷的影響。盡管進行了大量初步研究，DR3的生理 機能仍然沒有充分表征。所有此處引用的科技出版物包括專利文件，為了所有目的在此以 參考的方式完整引入。發(fā)明概述本發(fā)明的 一個方面涉及抗體，所述抗體結(jié)合腫瘤壞死因子受體 25(TNFR25)抗原并可以作為TNFR25激動劑。在一個實施方式中，當 利用gp96-Ig-卵清蛋白交叉初免(cross-primed)時，所述抗體相對于對 照抗體能夠增強OT-I CD8細胞擴增。在另一個實施方式中，所述抗 體是純化的單克隆抗體4C12。本發(fā)明的另一個方面涉及TNFR25特異性毒素，包括與結(jié)合 TNRF25受體的多肽連接的毒性劑。在這方面的一個實施方式中，包 含毒素的部分包括單克隆抗體4C12或者4C12的免疫特異部分。在另 一個實施方式中，毒性劑選自放射性同位素，荒麻毒，相思豆毒素， 白喉毒素，假單胞菌屬外毒素，或者金屬離子。在另一實施方式中， 結(jié)合TNRF25受體的多肽是TL1A蛋白或者其片段或者變異體。在本發(fā)明發(fā)明的另 一個方面，在治療患者癌癥的方法中使用 TNFR25特異性毒素。具體地，所述方法包括通過給予患者TNFR25 特異性毒素并給予患者化療劑，去除患者的CD4+/CD25+ T調(diào)節(jié)細胞 (Tregs)。本發(fā)明的另一個方面涉及激活細胞表達的TNFR25受體的方法， 包括將細胞與TNFR25激動劑接觸。該激動劑可以選自單克隆抗體 4C12;結(jié)合TNFR25的抗體，并且當利用gp96-Ig-卵清蛋白交叉初免 時，該抗體相對于對照抗體能夠增強OT-I CD8細胞的擴增；可溶性 TL1A蛋白；具有能夠驅(qū)動TNFR25激動劑抗體轉(zhuǎn)基因表達的表達盒 的表達載體；具有能夠驅(qū)動可溶性TL1A轉(zhuǎn)基因表達的表達盒的表達 載體；或者具有能夠驅(qū)動TNFR25轉(zhuǎn)基因表達的表達盒的表達載體。 該方法還包括觀察TNFR25受體信號傳遞的增強。本發(fā)明的一個其他方面涉及能夠作為TNFR25拮抗劑的抗體。在 一個實施方式中，所述抗體結(jié)合TL1A,并且當利用gp96-Ig-卵清蛋白 交叉初免時，該抗體相對于對照抗體能夠降^氐OT-I CD8細胞擴增。 在另 一個實施方式中，所述抗體是純化的單克隆抗體L4G6。本發(fā)明的另一個方面涉及抑制細胞中TNFR25受體信號傳遞的方 法。該方法包4舌將細力包與TNFR25拮抗劑4妻觸。該方法還包4舌，見察 TNFR25受體信號傳遞的減弱。本發(fā)明的另 一個方面涉及腫瘤疫苗，所述腫瘤疫苗包括腫瘤抗原 和作為生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑的TNFR25激動劑。該疫苗的另一個實施方式 還包括佐劑。在本發(fā)明的另一個方面，在分離腫瘤特異性抗原后，用包括腫瘤 特異性抗原和TNFR25激動劑的疫苗免疫患者以^J氐抗腫瘤。本發(fā)明的另 一個方面涉及治療和/或預防腸炎癥的方法，包括給予 有需要的患者有效量的包括TNFR25激動劑的治療組合物。本發(fā)明的另 一個方面涉及一種促進器官移植的治療組合物，包括 TNFR25拮抗劑和免疫抑制劑。在這方面的一個實施方式中，所述免 疫抑制劑是糖皮質(zhì)激素，咪唑硫噪呤，氨曱蝶呤，環(huán)孢子菌素，環(huán)磷 酰胺，疏基噤呤，他克莫司或者霉酚酸酯。在本發(fā)明的另 一個方面，在從供體移植組織到宿主的方法中使用 TNFR25拮抗劑組合物。該方法包括以下步驟從供體中獲得組織； 給予宿主TNFR25拮抗劑組合物；和移檔:組織到宿主中。本發(fā)明的另 一個方面涉及抑制同源CD8 T細胞群的克隆性增殖的 方法。該方法包括將CD8 T細胞暴露于它們的同源抗原和將CD8 T細 胞暴露于TNFR25拮抗劑。在另一個實施方式中，同源抗原與從供體 移植到宿主的組織有關(guān)。本發(fā)明的另一個方面涉及包括多肽的分離的TNFR25拮抗劑，所 述多肽由包括嚴緊條件下與SEQ ID NOs: 4, 5, 6和/或16雜交的序列 的核酸編碼，并且其中該序列編碼能夠結(jié)合TL1A蛋白的氨基酸序列。 在一個實施方式中，該序列在嚴緊條件下與SEQIDNO:4雜交。在另 一個實施方式中，該序列在嚴緊條件下與SEQIDNO:5雜交。在另一個實施方式中，該序列在嚴緊條件下與SEQIDNO: 6雜交。在另一個 實施方式中，該序列在嚴緊條件下與SEQIDNO: 16雜交。在另一個 實施方式中，TL1A是人或者小鼠TL1A。本發(fā)明的另 一個方面涉及治療和/或預防肺炎癥的方法，包括給予 有需要的患者有效量的治療組合物，所述組合物包括包含多肽的 TNFR25拮抗劑，所述多肽由包括嚴緊條件下與SEQ ID NOs: 4, 5, 6 和/或16雜交的序列的核酸編碼，并且其中該序列編碼能夠結(jié)合TL1A 蛋白的氨基酸序列。本發(fā)明的另 一 個方面涉及從供體移植組織到宿主的方法，包括從 供體獲得組織；給予宿主包括多肽的TNFR25拮抗劑，所述多肽由包 ^括嚴緊條件下與SEQ ID NOs: 4， 5， 6和/或16雜交的序列的核酸編碼， 并且其中該序列編碼能夠結(jié)合TL1A蛋白的氨基酸序列；及將所述組 織移植入所述宿主。本發(fā)明的另一個方面涉及組合物，包括由嚴緊條件下與SEQ ID NOs: 3和/或7雜交的序列編碼的多肽，并且其中該序列編碼能夠結(jié)合 TNFR25受體蛋白的氨基酸序列；和毒性劑。在一個實施方式中，所 述毒性劑選自放射性同位素，蓖麻毒，相思豆毒素，白喉毒素，假單 胞菌屬外毒素，和金屬離子。本發(fā)明的另 一個方面涉及治療患者癌癥的方法，包括通過給予患 者一種包含如權(quán)利要求39所述的毒素的組合物去除患者的 CD4+/CD25+ T調(diào)節(jié)細胞(Tregs);和給予患者化療劑。本發(fā)明的另一個方面涉及治療和/或預防腸炎癥的方法，包括給予 有需要的患者有效量的治療組合物，所述組合物包括由嚴緊條件下與 SEQ ID NOs: 3和/或7雜交的序列編碼的多肽，并且其中該序列編碼 能夠結(jié)合TNFR25受體蛋白的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述 炎癥是過敏性腸綜合征導致的。在另一個實施方式中，所述腸炎癥是 克羅恩氏病導致的。本發(fā)明的另 一個方面涉及腫瘤疫苗，包括肺瘤抗原和由嚴緊條件 下與SEQIDNOs: 3和/或7雜交的序列編碼的多肽，并且其中該序列編碼能夠結(jié)合TNFR25受體蛋白的氨基酸序列，所述多肽作為生物效 應(yīng)調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明的另一個方面涉及表達載體，所述表達載體包括嚴緊條件 下與SEQ IDNOs: 3和/或7雜交和編碼能夠結(jié)合TNFR25受體蛋白的 氨基酸序列的核酸序列。本發(fā)明的另一個方面涉及表達載體，所述表達載體包括嚴緊條件 下與SEQ ID NOs: 4， 5, 6和/或16雜交的核酸，并且其中該序列編碼 能夠結(jié)合TL1A蛋白的氨基酸序列。根據(jù)下面的詳細說明，其中只展示和描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式， 簡單地通過實現(xiàn)本發(fā)明的最佳預期方式進行說明，本發(fā)明的其他優(yōu)點 對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。作為將要實現(xiàn)的，本發(fā)明還可以 采用其他和不同的實施方式，其多個細節(jié)可以在不同明顯的方面進行 改進，所有這些都不脫離本發(fā)明的實質(zhì)。無需這些具體細節(jié)的一些或 者全部，本發(fā)明也可以實現(xiàn)。在其他情況下，沒有詳細描述公知的操 作方法，以免不必要地模糊本發(fā)明。因此，附圖和說明實質(zhì)上被認為 是說明性的，而不是限制性的。附圖簡述

圖1A描述鼠TNFR25在淋巴結(jié)細胞中的表達。對作為第一抗體 的同種型對照抗體，用黑色數(shù)字表明MFI，對抗TNFR25用灰色表示。 TNFR25的檢測需要三夾心法，首先是倉鼠抗TNFR25單克隆抗體， 然后是山羊抗倉鼠生物素和PE-標記的Strept-抗生物素蛋白。圖1B描 述TNFR25在活化、淋巴細月包上的表達。利用固定的抗CD3 (5/xg/ml)和 抗CD28(l/ig/ml)或者LPS(l/ig /ml)進行24小時完成脾細胞的活化。以 CD4或者CD8或者B220陽性和7-AAD陰性細胞對細胞進行設(shè)門(下 標表示活化的CD4， CD8或者B細胞)。在直方圖中，顯示靜止脾細 胞和活化脾細胞中TNFR25表達的MFI。圖1C描述TNFR25在胸腺 細胞上的表達。以CD4/CD8雙陰性，雙陽性或者單陽性細胞對胸腺細 胞"i殳門，并評估抗TNFR25熒光。圖2A描述鼠TNFR25的剪接形式。對從靜止鼠脾細胞和鼠細胞 系獲得的mRNA進行RT-PCR獲得剪接形式。CRD:半胱氨酸-富集 結(jié)構(gòu)域；TM:跨膜結(jié)構(gòu)域；DD:死亡結(jié)構(gòu)域。星號在框的終止密 碼子。在剪接形式l-4中，外顯子2和3之間的內(nèi)含子不被剪接，包 含一個未成熟終止密碼子。剪接形式1-4很可能是無功能的蛋白。小 鼠A5和A6(對應(yīng)于人A6和A6,7)缺少完整的跨膜結(jié)構(gòu)域，預測其是 分泌形式，能夠作為TL1A的可溶性誘斜受體。A5,6(可能對應(yīng)于人 A3)和FL剪接形式在本報告中作為轉(zhuǎn)基因被研究。A5,6,8和A5，6,9(無 人的同系物)被預測是膜錨定的，但缺少死亡結(jié)構(gòu)域，可能具有改變的 信號傳遞性質(zhì)或者可能作為顯性陰性剪接形式。此處公開的優(yōu)選的DN TNFR25是在TM結(jié)構(gòu)域后被截短的。圖2B描述活化誘導的TNFR25 的其他剪接。小鼠和人的TNFR25均在活化之后被剪接。此處顯示人 的剪接，因為凝膠電泳后TNFR25的剪接形式比鼠形式在大小方面分 離的更好。通過測序確認剪接形式。利用Ficoll-Hypaque梯度離心分 離PBL。每個樣本使用五百萬個細胞，提取mRNA,并利用Invitrogen cDNA合成試劑盒轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA。顯示通過PHA (5/ig/ml),固定的抗 CD3 (5jLtg/ml)和可溶性抗CD28 (lpg/ml),或者PMA (10ng/ml)和伊屋 諾霉素(400ng/ml)活化PBL。在指定時間點收集細胞，進行RT-PCR; )3-肌動蛋白被用作內(nèi)參。圖2C描述活化誘導的剪接是PKC-依賴的和 蛋白合成-不依賴的。單獨用PMA(10ng/ml)或者單獨用伊屋諾霉素 (400ng/ml)或者它們的組合刺激新分離的PBL纟田月包。用H7(50]LiM)或者 放線菌酮(10/ig/ml)預處理PBL半小時，然后在細胞培養(yǎng)物中添加 PMA和伊屋諾霉素。12小時后收集細胞進行RT-PCR分析。圖3顯示TNFR25轉(zhuǎn)基因在CD2啟動子和增強子下的表達和功 能。圖3A描述TNFR25在轉(zhuǎn)基因小鼠中相對B6野生型小鼠和同種型 對照的表達。腹股溝淋巴結(jié)細胞對CD4, CD8， B220， CDllc陽性細胞， 或者NK 1.1陽性和CD陰性細胞，或者NK1.1/CD3雙陽性細胞設(shè)門。 相應(yīng)MFI被指明。FL TNFR25, A5,6 TNFR25和DN TNFR25的表達 譜是相同的。圖3B描述可選剪接的TNFR25轉(zhuǎn)染的肺瘤細胞的 Western印跡。上樣50/xg來自轉(zhuǎn)染了 3種TNFR25剪接形式的P815裂解產(chǎn)物的蛋白，用抗TNFR25抗體10D1進行印跡。第1道DN TNFR25;第2道A5，6 TNFR25;第3道FL TNFR25。在Western印 跡中該抗體不^r測A5,6 TNFR25。圖3C顯示相對于野生同類，F(xiàn)L TNFR25-tg淋巴結(jié)細胞和胸腺細胞中CD4和CD8陽性細胞減少的細 胞含量(cellularity)(n二5) *p<0.05; **p<0.01 ; ***p<0.001。圖3D描述 FL和A5，6 TNFR25轉(zhuǎn)基因細胞受損的活化誘導的增殖。通過胸腺嗜 啶核苷攝取刺激3天后，最后6小時期間測量純化的CD4或者CD8 細胞的增殖。在微量滴定板上用固定的抗CD3(2/ig/ml)活化細胞，包 含或者不包含可溶性抗CD28 (lgg/ml)或者PMA (10ng/ml)和伊屋諾霉 素(400ng/ml)。使用1000U/ml重組小鼠IL-2。圖3E顯示轉(zhuǎn)染FL TNFR25(上欄)或者A5,6 TNFR25(下欄)的EL4細胞對TNFR25觸發(fā)的 應(yīng)答中，測量FL TNFR25和A5，6 TNFR25激活的NF-kB NF-kB的活 化。細胞用激動型(agonistic)TNFR25抗體4C12(5/ig/ml)處理50分鐘； 如所示，以25%的TL1A轉(zhuǎn)染的EL4細胞上清液形式添加可溶性TL1A 25、50或者75分鐘；通過直接添加TL1A轉(zhuǎn)染EL4細胞到表達TNFR25 的EL4，給予膜結(jié)合TL1A(MTL1A) 50分鐘。對照接受EL4(未轉(zhuǎn)染) 上清液50分鐘。制備核提取物，用EMSA分析；箭頭指明活化的 NF-kB。圖3F描述野生、FL TNFR25和A5,6 TNFR25轉(zhuǎn)基因CD4 T 細胞的初始Th2偏性細胞因子的產(chǎn)生。來自脾的CD4T細胞經(jīng)陰性選 擇純化，用固定的抗CD3(2/ig/ml)和可溶性抗CD28 (1/xg/ml)活化3天。 收集上清液用于細胞因子ELISA檢測。附圖表示3個獨立實驗，n.s: 不顯著；*p<0.05; ** p〈0.001; ***p<0.001。圖3G說明TNFR25能夠 同時刺激Thl或者Th2細胞因子的產(chǎn)生。在非極化(Th中性)、Thl或 者Th2極化條件下，檢測再刺激的FL TNFR25-tg CD4 T細胞的細胞 因子產(chǎn)生。單獨用固定的抗CD3(2/xg/ml)和可溶性抗CD28 (1/x/ml) (Th 中性)，或者聯(lián)用IL-12 (5ng/ml)和抗IL- 4 (20/xg/ml)用于Thl極化，或 者聯(lián)用IL-4 (10ng/ml)、抗IFN-7(10yg/ml)和抗IL-12 (10/zg/ml)用于Th2 極化，作用4天，活化CD4細胞。收集細胞，洗滌后再鋪板于抗CD3 24小時，收集上清液用于細胞因子ELISA分析。圖4顯示TNFR25轉(zhuǎn)基因細胞減少的增殖不是由于凋亡、IL-2或 者IL-2受體表達的缺失。圖4A顯示轉(zhuǎn)基因CD4和CD8細胞中IL-2-Ra (CD25)在活化時的正常上調(diào)。在用固定的抗CD3和可溶性抗CD28活 化72小時后，收集脾細胞，洗滌，用抗CD25-FITC、抗CD8-PE和抗 CD4-CY染色。上欄為野生型，下欄為A5,6 TNFR25-tg細胞。圖4B 證明轉(zhuǎn)基因細胞在活化時不經(jīng)歷增加的凋亡。用固定的抗小鼠CD3 (2^g/ml)和可溶性抗mCD28 (1/^g/ml)活化CD4細胞3天，再用 Annexin陽V陽PE和7-AAD染色。Annexin-V陽性和7-AAD陰性細月包表 示凋亡的細胞。圖4C顯示A5,6 TNFR25轉(zhuǎn)基因T細胞產(chǎn)生降低的 IL-2。通過陰性選擇純化T細胞，用固定的抗CD3和可溶性抗CD28 活化3天。通過ELISA^r測分析上清的IL-2產(chǎn)生；** p=0.0078。圖 4D顯示在初始應(yīng)答中顯性陰性TNFR25轉(zhuǎn)基因細胞不是Th2極化的。 來自脾的CD4 T細胞經(jīng)陰性選擇純化，用固定的抗CD3(2/ig/ml)和可 溶性抗CD28 (1/^g/ml)活化3天。收集上清用于細胞因子ELISA抬r測。 附圖表示3個獨立實驗。圖4E描述DNTNFR25轉(zhuǎn)基因和野生小鼠相 同的抗體-同種型應(yīng)答。用溶于無菌PBS的100ggDNP-KLH腹腔內(nèi)免 疫小鼠，在免疫3周后通過ELISA評-階血清中DNP特異性IgGl和 IgG2a抗體。用0.8jiig/ml DNP-BSA包被高結(jié)合96孔板，以檢測抗DNP 的特異性抗體。附圖表示3個獨立實驗中的一個。圖5顯示TNFR25轉(zhuǎn)基因小鼠在體內(nèi)刺激(challenge)后出現(xiàn)Th2-偏性應(yīng)答(biased response)。圖5A證明在免疫的TNFR25-tg小鼠中， 抗體-同種型是Th2偏性的。用不含佐劑、溶于無菌PBS的lOOpg DNP-KLH腹腔內(nèi)免疫小鼠。免疫1周后通過ELISA評價血清中的DNP 特異性IgGl和IgG2a抗體。用0.8pg/ml DNP-BSA包被高結(jié)合96孔 板，以檢測抗DNP的特異性抗體。數(shù)據(jù)表示3個獨立實驗中的一個。 ** p<0.11; n.s.:不顯著。圖5B顯示TNFR25信號傳遞在支氣管肺泡 液(BALF)中調(diào)節(jié)嗜曙紅細胞增多。如實施例10-15所述，對野生型和 △ 5,6 TNFR25-tg小鼠進行免疫和氣道刺激(challenge)。灌洗氣道，從 Wright-Giemsa染色的細胞離心涂片制品獲得差異細胞計數(shù)。*: pO.05; n.s.:不顯著。圖5C顯示TNFR25-tg小鼠中加重的肺部炎癥。用卵清蛋白腹腔內(nèi)致敏和氣道刺激的小鼠的肺組織結(jié)構(gòu)。在支氣 管灌洗后，取出肺，固定于10%中性緩沖福爾馬林中。然后將肺用石蠟包埋，切成S/xm厚，用H&E(左欄)或者過碘酸-席夫染色反應(yīng)(PAS， 右欄M企測粘液產(chǎn)生。上面兩欄野生型B6小鼠；下欄A5，6 TNFR25-tg 小鼠。圖5D顯示TNFR25信號控制血清IgE水平。在第0天和氣霧 劑刺激3天后(第15天)對小鼠取血。分離血清，利用夾心ELISA分析 進行ELISA卵清蛋白特異性IgE。因為沒有OVA特異性IgE的標準 蛋白，結(jié)果顯示為O.D.單位。附圖表示3個獨立實驗中的一個。**: p<0.01。圖5E描述TNFR25-tg小鼠中支氣管淋巴結(jié)細胞增加的Th2 細胞因子產(chǎn)生。在氣霧劑刺激l天后(第13天)收集支氣管淋巴結(jié)，在 體外用100/xg/ml卵清蛋白再刺激細胞4天。然后通過ELISA分析上 清的細胞因子產(chǎn)生。該圖是2個獨立實驗的代表。*p<0.05;**p<0.01; *** pO細。圖6顯示顯性陰性的TNFR25干擾Th2極化和肺部炎癥。圖6A 顯示DN TNFR25轉(zhuǎn)基因阻斷內(nèi)源TNFR25的細胞因子共刺激。用抗 CD3,或者用激動型抗TNFR25抗體4C12和抗CD3聯(lián)用，刺激野生 型和DNTNFR25-tg CD4細胞3天，通過ELISA分析上清的細胞因子。 圖6B顯示DN TNFR25通過內(nèi)源TNFR25阻斷增殖的共刺激。在增殖 ;險測中，用抗CD3， 4C12，或者抗CD3和4C12的組合活化野生型和 DN TNFR25-tg CD4細胞3天，在最后8小時測量胸腺嗜啶核苷的摻 入。圖6C顯示DN TNFR25-tg CD4 T細胞在二級活化(secondary activation)時產(chǎn)生減少的Th2細胞因子。野生型和轉(zhuǎn)基因CD4 T細胞 經(jīng)陰性選擇純化，用固定的抗CD3(2]Ltg/ml)和可溶性抗CD28 (1/xg/ml) 活化3天。然后收集細胞，洗滌，重新鋪板，用固定的抗CD3 (ljwg/ml) 再刺激2天。收集上清用于細胞因子ELISA檢測。n.s-不顯著的；*** pO.OOl。圖6D描述在體外DN TNFR25-tg CD4 T細胞抵抗Th2極化。 純化野生型和DN TNFR25-tg CD4細胞，并在中性(ThN)或者Th2極 化條件(通過添加IL-4并用抗體阻斷IFN-7)下用抗CD3和抗CD28活 化4天。收集細胞，洗滌后重置于抗CD3 24h,收集上清，用ELISA 分析細胞因子。圖6E顯示相對野生型小鼠，DNTNFR25-tg小鼠BALF中減少的細胞滲出。激發(fā)小鼠，然后根據(jù)標準步驟用卵清蛋白進行氣霧劑刺激；11=5;* :pO.05。圖6F描述免疫和氣道刺激后DN TNFR25-tg 小鼠中肺部炎癥的抑制。上欄抗原氣霧劑暴露后，DN TNFR25-tg 小鼠中未出現(xiàn)血管周圍浸潤。下欄DN TNFR25-tg小鼠中未出現(xiàn)粘 液產(chǎn)生過剩和杯狀細胞增生。如圖5所示，通過卵清蛋白免疫和后續(xù) 氣霧劑暴露，誘導肺部炎癥。野生型對照小鼠具有如圖5所示的典型 炎癥。圖6G顯示DN TNFR25-tg小鼠中卵清蛋白特異性IgE產(chǎn)生的抑 制。通過ELISA測定血清中卵清蛋白特異性IgE。 ** p<0.01。圖6H 描述支氣管淋巴結(jié)中DN TNFR25對Th2而不是Thl細胞因子產(chǎn)生的 抑制。在氣霧劑刺激1天后收集支氣管淋巴結(jié)，在體外用1001.tg/ml 卵清蛋白再刺激細胞4天。然后通過ELISA分析上清的細胞因子產(chǎn)生。 該圖是表示2個獨立實驗的代表。n.d.:未檢測；n.s.:不顯著的；*: p<0.05。圖7顯示TL1A封閉抗體消除肺部炎癥，并減少肺中Th2細胞因 子的產(chǎn)生。圖7A-D顯示抗TLIA抗體L4G6是TLIA的功能拮抗劑。 a. P815轉(zhuǎn)染子，轉(zhuǎn)染FL TNFR25, b.轉(zhuǎn)染A5,6 TNFR25和c.轉(zhuǎn)染 TL1A,用合適的抗體通過流式細胞術(shù)染色。d. L4G6阻斷TL1A介導 的TNFR25轉(zhuǎn)染細胞的細胞毒性。從P815-TL1A轉(zhuǎn)染細胞上清收集的 系列稀釋的可溶性TL1A與51Cr標記的P815-TNFR25耙細胞混合。 在檢測物中添加不同的抗小鼠TL1A單克隆抗體，5小時后分析51Cr 的釋放。圖7E顯示TL1A封閉抗體L4G6在野生型C57B16小鼠體內(nèi) 抑制粘液產(chǎn)生和肺部炎癥。圖解卯清蛋白初免(priming)，氣霧劑刺 激和給藥封閉抗體(L4G6)或者對照抗體的方案。用對照IgG (左)和 L4G6-IgG(右)進行PAS染色后的肺部組織結(jié)構(gòu)。注意在L4G6治療動 物中無粘液產(chǎn)生(箭頭指向用對照IgG處理的小鼠中的粘液)。圖7F顯 示相對于對照IgG治療動物，L4G6治療小鼠中BALF細胞滲出減少。 *:p<0.05; **:p<0.01 ;n.s.不顯著的。圖7G顯示在用L4G6阻斷TLIA 后，用卵清蛋白再刺激的支氣管淋巴結(jié)細胞產(chǎn)生IL-5和IL-13減少。 ** p<0.01; *** p<0.001。實驗細節(jié)如圖5所示。圖7H顯示在氣霧劑刺 激后，肺的CDllc陽性細胞亞群(箭頭)中TLIA的表達。在卵清蛋白-氣霧劑刺激前后收集支氣管淋巴結(jié)，分析CDllc細胞的TL1A表達。 所有其他的支氣管淋巴結(jié)細胞是TL1A陰性的。圖7I顯示在氣道刺激 后，來自卵清蛋白免疫小鼠的支氣管淋巴結(jié)細胞的淋巴細胞缺乏TL1A 表達。在夾心法中用抗TL1A作為初始單克隆抗體對單細胞懸浮液染 色。利用各自的標記抗體作為群標志物對細胞進行設(shè)門，顯示TL1A 直方圖。抗TL1A;同種型對照。圖7J顯示TL1A在體外活化的T淋 巴細胞中表達。用板結(jié)合的抗CD3或者LPS活化脾細胞24小時，然 后用如圖1所示的抗TL1A夾心法和標明的群標志物染色。甚至在LPS 活化后，B細胞也是TL1A陰性的。設(shè)門群標志物，顯示活化細胞中 的TL1A表達。圖8顯示對于肺部炎癥的誘導，NKT細胞中需要TNPR25信號。 按照材料和方法的標準步驟，NKT缺陷Jcd8敲除小鼠(Cui, J.等人 Science 278, 1623-6 (1997))用卵清蛋白和明礬初免。在第11天，小鼠 接受靜脈注射所示的過繼轉(zhuǎn)移310萬部分純化的野生型NKT細胞或者 DN TNFR25-tg NKT細胞或者PBS。第12天小鼠用卵清蛋白霧化刺激， 第14天進行分析。野生型小鼠作為肺部炎癥誘導的陽性對照，被免疫 和卵清蛋白霧化刺激但無過繼細胞轉(zhuǎn)移的Jcd8 k.o.小鼠作為陰性對 照。數(shù)據(jù)來自兩個獨立實驗每組的4只小鼠。Ja是NKT缺陷小鼠(Cui, J.等人Science 278, 1623- 6 (1997)。圖9顯示肺部TL1A/TNFR25介導的NKT細胞和Th2極化的CD4 細胞的觸發(fā)才莫型。該才莫型顯示TL1A和TNFR25之間潛在的相互作用， 其有助于IL-13的產(chǎn)生和AHR的i秀導。先前已經(jīng)給出了需要NKT細 胞的IL-13產(chǎn)生的證據(jù)(Akbari， O.等人，Nat Med 9, 582-8 (2003》。該文 顯示對于肺部炎癥、CDllc+細胞的TL1A表達和通過TNFR25的CD4 Th2效應(yīng)物的共刺激，NKT細胞中的TNFR25信號傳遞的需求。因為 CD4效應(yīng)物能夠表達TL1A,有可能CD4和NKT細胞之間的 TL1A/TNFR25相互作用提供它們在哞喘中協(xié)同作用的分子聯(lián)系。此 外，其他肺相關(guān)細胞可能表達TL1A并促進引發(fā)肺部炎癥。圖IO描述小鼠接受1百萬OT-I-gfp靜脈注射的試驗的結(jié)果。2天 后它們接受指定劑量的溶于PBS的卵清蛋白的腹腔內(nèi)免疫(藍色曲線)；利用EG7-gp96-Ig或者3T3-ova-gp96-Ig - 24小時內(nèi)注射細胞 分泌gp96-Ig的數(shù)量(以ng計)標示在橫坐標上；3T3-ova - 24小時內(nèi) 注射細胞分泌卯清蛋白的數(shù)量標示在橫坐標上。5天后，通過流式細 胞術(shù)檢測腹膜腔(PEC)和脾中的OT-I擴增。用3T3-ova-gp96-Ig免疫后， CD8細胞中OT-I的比例在PEC中達到50%,在脾中達到8%。圖11A顯示抗TNFR25 mAb 4C12起激動性作用和殺傷TNFR25 轉(zhuǎn)染EL4細胞而不是野生型EL4的試驗的結(jié)果。在圖11B,在 EG7-gp96-Ig免疫后24小時和72小時，腹腔內(nèi)給予50gg激動性4C12 或者拮抗性抗TL1A L4G6或者對照IgG。 4C12造成OT-I擴增的8-10 倍增加和腹腔滲出細胞的加倍(每組n=4只小鼠)。抗TL1A抑制CD8 擴增。圖12顯示熱休克蛋白gp96對CD8細胞的交叉初免。用gp96-Ig 和卯清蛋白轉(zhuǎn)染疫苗細胞(同種異體的或者同系基因型的)，因此它們 分泌gp96-Ig伴侶卵清蛋白肽。利用導致其活化和gp96—ig與其結(jié)合肽 的吞噬的DC上的CD91和TLR2/4檢測gp96?；罨腄C上調(diào)B7(不 依賴CD40-L)并通過Kb交叉對付(cross-resent) gp96結(jié)合肽(在B6小 鼠中)。OT-I是表達gfp的TCR轉(zhuǎn)基因CD8細胞，其過繼轉(zhuǎn)移到對 Kb-ova特異的B6小鼠。它們的擴增可以方便的利用綠色焚光蛋白來 檢測。圖13顯示FoxP3陽性CD4+CD25+ Tregs表達TNFR25。通過去 除B細胞CD8細胞和單核細胞純化CD4細胞，然后通過磁力分選 CD25進行陽性選擇，隨后進行活化。圖14顯示從DSS誘導的結(jié)腸炎中缺乏DN TNFR25-tg小鼠的康 復。每組中5只小鼠接受含2% DSS的飲用水共8天，然后恢復到正 常水。圖15顯示TNFR25信號傳遞消除Treg抑制。圖16顯示gp96-Ig腹腔內(nèi)免疫后，Gfp-OT-I定位到粘膜。小鼠通 過過繼轉(zhuǎn)移接受1百萬gfp-OT-I靜脈注射。2天后，小鼠腹腔內(nèi)接受 4百萬EG7-gp96-Ig(左)或者4百萬EG7(右欄)作為刺激物。4天后，除了對PEC、脾和淋巴結(jié)中進行細胞的常規(guī)分析外，分析IEL、派氏淋 巴結(jié)(Peyer's patches)和LPL中的gfp-OT-I比例。圖17顯示SEQ ID NOs: 1-7和SEQ ID NO: 16和選定的公共數(shù)據(jù) 庫登錄號。發(fā)明詳述本發(fā)明的目的是提供利用免疫調(diào)節(jié)劑的新的組合物和方法，所述 免疫調(diào)節(jié)劑能夠刺激或者間接增強免疫系統(tǒng)或者在其它情況下具有免 疫抑制效果。此處公開的TNFR25激動劑代表生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑，當給 予腫瘤疫苗時，所述生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑改變機體細胞免疫防御和癌細胞 之間的相互作用以加強、指導或者修復機體抵抗癌癥的能力。此處公 開的TNFR25特異性毒性劑能夠通過去除癌癥患者天然存在的免疫抑 制細胞，增強化療方案的效果。此處公開的TNFR25激動劑還具有愈 合作用。在其他情況下，它們可以用于治療諸如炎癥性腸病引起的疾 病慢性炎癥。此處公開的TNFR25拮抗劑能夠抑制CD8T細胞介導的 細胞免疫應(yīng)答，例如能夠治療哞喘和減輕組織移植后的器官或者組織 排斥。1.定義在描述本發(fā)明時，將使用下列術(shù)語，如下面所示進行定義。 "抗原"包括可以一皮抗體分子特異結(jié)合的任何物質(zhì)。因此，術(shù)語"抗 原"包括生物分子，包括但不限于，簡單的中間代謝物，糖，月旨，自體 酸(autoacids)，以及激素以及大分子例如復合糖類，磷脂，核酸和蛋白。 抗原組合物可以包^r抗原(例如，肽或者多肽)，編碼抗原的核酸(例如，抗原表達載體)，或者表達或者展現(xiàn)抗原的細胞。參見美國公開號 2003/0185840,在此以參考將其完整引入。"免疫原"是一種大分子抗原，能夠引發(fā)淋巴細胞活化，導致抗原 特異性免疫應(yīng)答。因此免疫原包括任何包含一種或者多種抗原決定簇 的分子，所述抗原決定簇將刺激宿主的免疫系統(tǒng)以起始分泌的、體液 的和/或細胞抗原-特異性應(yīng)答。術(shù)語"抗體"包括多克隆和單克隆抗體制品。本發(fā)明的抗體可以在 任何哺乳動物中制備，包括小鼠，大鼠，兔子，山羊和人?？贵w可以是下列免疫球蛋白類中任意一類的成員IgG, IgM， IgA， IgD,或者IgE, 和其亞類，優(yōu)選的是IgGl抗體。術(shù)語抗體還指本說明書所述抗體的功能同等物。功能同等物具有 與那些抗體相當?shù)慕Y(jié)合特征，包括，例如，嵌合、雜交、人源化和單 鏈抗體及其片段。產(chǎn)生這類功能同等物的方法公開于PCT申請WO 93/21319,歐洲專利申請?zhí)?39,400; PCT申請WO 89/09622;歐洲專 利申請338，745;和歐洲專利申請EP 332,424。功能同等物包括多肽， 所述多肽具有與本發(fā)明抗體的可變或者高變區(qū)的氨基酸序列基本上相 同的氨基酸序列。"基本上相同"的氨基酸序列此處定義為與另 一氨基 酸序列具有至少70%，優(yōu)選的至少大約80%，和更優(yōu)選的至少大約90% 同源性的序列，按照Pearson和Lipman的FASTA搜索法-險測，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85， 2444-2448 (1988)。此處使用的術(shù)語"單克隆抗體，，是指具有同質(zhì)性抗體群的抗體組合 物。該術(shù)語不限于抗體的物種或者來源，也不受其制備方法的限制。 該術(shù)語包括全體免疫球蛋白。制備多克隆和單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。通過目標抗原 免疫合適的動物，例如小鼠，大鼠，兔子，羊或者山羊，產(chǎn)生多克隆 抗體。為了增強免疫原性，在免疫前抗原可以連接到載體。合適的載 體通常是大的、代謝緩慢的大分子例如蛋白，多糖，聚乳酸，聚乙醇 酸，聚合氨基酸，氨基酸共聚物，脂聚集物(例如油滴或者脂質(zhì)體)， 和失活的病毒顆粒。這類載體對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是公知的。 此外，抗原可以偶聯(lián)到細菌類毒素，例如來自白喉，破傷風，霍亂， 等等的類毒素，以增強其免疫原性。當需要大量血清時，優(yōu)選的用兔子、綿羊和山羊制備多克隆血清。 這些動物之所以是好的設(shè)計選擇，還因為標記的抗兔子、抗羊和抗山 羊抗體的提供。通常通過在鹽水中，優(yōu)選的在佐劑例如弗氏完全佐劑 ("FCA")中，混合或者乳化抗原，并且腸胃外的注射混合物或者乳 劑(通常皮下或者肌內(nèi)的)，進行免疫。通常2-6周后，用鹽水中、優(yōu)選弗氏不完全佐劑("FIA")中的抗原進行一次或者多次注射后，對動物加強免疫。也可以利用本領(lǐng)域已知的方法，通過體外免疫產(chǎn)生抗體。然 后從免疫動物獲得多克隆抗血清。通常利用以下方法制備單克隆抗體Kohler和Milstein, Nature (1975) 256:495-497,或者其改進，或者Campbell的"Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas" Burdon等人,Eds.， Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13， Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985);以及利用Huse等人在Science 246, 1275-1281 (1989)中描述的重組DNA方法。通常，按照上述方法免疫小鼠或者大鼠。但是，不是從動物取血 以獲得血清，而是摘除脾(和可選的若干大的淋巴結(jié))并將其解離成單 細胞。如果需要，通過將細胞懸液經(jīng)過包被抗原的板或者孔，可以篩 選脾細胞(在去除非特異性粘附細胞后)。表達對抗原特異的膜結(jié)合免 疫球蛋白的B細胞，將與板結(jié)合，不會隨剩余的懸浮液被洗掉。然后 誘導所獲B細胞或者所有解離的脾細胞與骨髓瘤細胞融合以形成雜交 瘤，在選擇培養(yǎng)基(例如，次黃嘌呤，氨基蝶呤，胸腺嘧啶核苷培養(yǎng)基， "HAT")中培養(yǎng)。然后通過有限稀釋將所獲雜交瘤種到板上，檢測與免 疫抗原特異結(jié)合(并且不和無關(guān)抗原結(jié)合)的抗體的產(chǎn)生。然后在體外 (例如，在組織培養(yǎng)瓶或者空心纖維反應(yīng)器)，或者體內(nèi)(例如，在小鼠 腹水中)培養(yǎng)挑選的單克隆抗體-分泌雜交瘤。"抗原結(jié)合部位"，或者"結(jié)合部分"是指參與抗原結(jié)合的免疫球蛋 白分子部分?？乖Y(jié)合部位由重("H")和輕("L")鏈的N端可變("V") 區(qū)氨基酸殘基形成。位于重和輕鏈V區(qū)的3個高度變異的伸展 (stretches)被稱為"高變區(qū)"，其插入稱為"框架區(qū)"或者"FR"的更保守的 側(cè)翼伸展之間。因此術(shù)語"FR"是指天然存在于免疫球蛋白的高變區(qū)之 間和附近的氨基酸序列。在抗體分子中，輕鏈的3個高變區(qū)和重鏈的 3個高變區(qū)在三維空間中彼此相對排列形成抗原結(jié)合表面?？乖Y(jié)合 表面與結(jié)合抗原的三維表面互補，每條重和輕鏈的3個高變區(qū)被稱為 "互補決定區(qū)"或者"CDR"。此處使用的術(shù)語"免疫特異性"，"免疫結(jié)合"和"免疫結(jié)合性質(zhì)，，是 指免疫球蛋白分子和抗原之間存在的類型之間的非共價相互作用，所 述免疫球蛋白對該抗原是特異的。免疫結(jié)合相互作用的強度或者親合 力可以表示為相互作用的解離常數(shù)(Kd),其中更小的Kd表示更強的親 合力?？梢岳帽绢I(lǐng)域公知的方法定量所選多肽的免疫結(jié)合性質(zhì)。這 類方法需要測定抗原結(jié)合部位/抗原復合物形成和解離的速率，其中所 述速率取決于復合物伴侶的濃度，相互作用的親合力和雙向等同影響 速率的幾何參數(shù)。因此，通過計算結(jié)合和解離的濃度和實際速率可以確定"開速率常數(shù)(on rate constant)"(Kon)和"關(guān)速率常數(shù)(off rate constant)"(K。ff)。 K。ff/K。n的比例能夠去除所有和親合力無關(guān)的參數(shù)， 因此等于解離常數(shù)Kd。通常參見Davies等人(1990) Annual Rev. Biochem. 59:439-473。本領(lǐng)域已知許多治療有效的分子，所述分子包括能夠展示抗體分 子的免疫結(jié)合性質(zhì)的抗原結(jié)合部位。蛋白水解酶木瓜蛋白酶優(yōu)選的切 割I(lǐng)gG分子產(chǎn)生若干片段，其中兩個("F(ab)"片段)均包括一個共價雜 二聚體，該雜二聚體包括完整的抗原結(jié)合部位。酶胃蛋白酶能夠切割 IgG分子得到若干片段，包括"F(ab')2"片段，該片段包括兩個抗原結(jié)合 部位。通過優(yōu)先對IgM， 4艮少情況下對IgG或者IgA免疫球蛋白分子 的蛋白水解切割，產(chǎn)生"Fv"片段。但是，F(xiàn)v片段更常見的是利用本領(lǐng) 域已知的重組技術(shù)獲得。Fv片段包括非共價VH::VL雜二聚體，該雜 二聚體包括保留天然抗體分子的大部分抗原識別和結(jié)合能力的抗原結(jié) 合部位。Inbar等人(1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69:2659-2662; Hochman等人(1976) Biochem 15:2706-2710;和Ehrlich等人(1980) Biochem 19:4091- 4096。單鏈Fv("sFv")多肽是共價連接的VH::VL雜二聚體，由通過肽-編碼連接子連接的包括VH-和VL-編碼基因的基因融合物表達。Huston 等人(1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85(16):5879-5883。已經(jīng)描述了 許多識別用于將抗體天然聚集的-但化學分離的-輕和重多肽鏈的V 區(qū)轉(zhuǎn)入sFv分子的化學結(jié)構(gòu)的方法，該sFv分子將折疊形成與抗原結(jié)合部位結(jié)構(gòu)基本上類似的三維結(jié)構(gòu)。參見，例如，Huston等人的美國專 利5,091,513和5,132,405; Ladner等人的美國專利4,946,778。此處使用的"同源抗原"是指CD8 T細胞受體(TCR)的免疫特異的 抗原。這類抗原，通常衍生自例如病原體、移植組織(同種抗原)和腫 瘤細胞，被免疫系統(tǒng)識別為非自身的。同源抗原與其CD8T細胞受體 的結(jié)合導致T細胞的克隆性增殖。然后擴增的同源CD8T纟田月包群能夠 誘發(fā)抵抗侵入同源抗原來源的細胞免疫應(yīng)答。本發(fā)明的抗體還可以用于制備"免疫毒素"。雜交分子組合了抗體 的特異性或者具有毒素毒性的抗原。因而，免疫毒素分子具有抗原結(jié) 合部分和毒性劑部分。免疫毒素優(yōu)選的是對細胞表面分子例如 TNFR25特異的，并促進毒性劑輸送到表達上述細胞表面分子的細胞。優(yōu)選的，"毒性劑"對其輸送到的細胞具有細胞抑制和/或細胞毒性 作用。優(yōu)選的毒性劑是，例如，放射性同位素，熒光劑，化學發(fā)光劑， 酶，酶底物，酶輔因子，酶抑制劑，染料，和金屬離子。毒性劑包括 ^〖旦不限于碘-131,銦-111，和锝-99m，锝-99m，銦-111，釔-90，阿霉 素(Yang等人，(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1189-1193),柔紅 霉素(Diener等人(1985) Science 231 : 148-150; Dillman等人(1988) Cancer Res. 48:6097-6102)，曱氨喋呤(Uadia et al, (1985) J Natl Cancer Inst, 74:29-35; Deguchi等人(1986) Cancer Res. 46:3751- 3755)，和苯 丁酸氮芥(Symth等人(1986) J Immunol. 137:3361-3366)。其他毒性劑 包括蓖麻毒，相思豆毒素，白喉毒素和假單胞菌屬外毒素，或者其酶 活性部分(A鏈)。參見，例如，F(xiàn)rankel等人的美國專利4,753,894 ; Nevelle,等人 (1982) Immunol Rev 62:75-91; Ross等人 (1980) European J Biochem 104; Vitteta等人(1982) Immunol Rev 62: 158-183; Raso等人(1982) Cancer Res 42:457-464,和Trowbridge等人(1981) Nature 294:171-173。還包括酶活性毒素及其片段，例如蒴蓮根毒素， ce-帚曲菌素(alpha-sarcin)，油桐蛋白，石竹素蛋白，美洲商陸(Phytolacca americana)蛋白(PAPI， PAPII,和PAP-S),苦瓜抑制劑，瀉果素，巴 豆毒素，石石威花(sapaonaria officinalis)承卩制劑，白初于毒素，mitogellin， 局限曲菌素，酚霉素，和伊諾霉素。"毒性劑"還可以是化療劑。此處使用的術(shù)語"化療劑，，通常涉及給 藥以停止、減緩或者逆轉(zhuǎn)不需要的細胞增殖的化合物。優(yōu)選的這類藥 劑具有抗增殖效果?；焺┛梢允强勾x產(chǎn)物例如5-FU，例如，基于5-FU的化療法， 包括給藥5-FU，其衍生物，單獨或者與其他化療劑聯(lián)用，例如曱酰四 氫葉酸或者DPD抑制劑，例如尿嘧啶，5-乙炔基尿嘧咬，溴乙基尿嘧 啶，胸腺嘧啶，千基羥千基尿嘧啶(benzyloxybenzyluracil, BBU)或者 5-氯-2，4-二羥基吡啶。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與5-FU或者其衍生物與DPD 抑制劑5-乙炔基尿嘧啶聯(lián)用相比，化學式(I)的5'-脫氧-胞苷衍生物和 5-FU或者其衍生物的共給藥顯著促進化療劑選擇性輸送到肺瘤組織。或者，遺傳毒性劑是那些形成持久基因組損傷的藥劑，優(yōu)選的在 臨床控制不需要的細胞增殖中用作化療劑。遺傳毒素誘導的DNA損 傷的細胞修復的速率，以及細胞分裂周期中細胞生長的速率，影響遺 傳毒素療法的結(jié)果。用于治療眾多癌癥的一類遺傳毒性化合物是DNA 烷化劑和DNA插入劑。補骨脂素是已知可用于皮膚疾病例如牛皮癬、 白癜風、真菌感染和皮膚T細胞淋巴瘤的光化學治療的遺傳毒性化合 凈勿。Harrison's Principles of Internal Medicine, Part' 2 Cardinal Manifestations of Disease, Ch.60 (12th ed. 1991)。另 一類遺傳毒性4匕合 物，其成員能夠烷基化或者插入DNA，包括合成的和天然來源的抗生 素。本發(fā)明尤其感興趣的是抗腫瘤抗生素，包括但不限于下列代表的 化合物種類安吖啶；放線菌素A、 C、 D(或者稱為更生霉素)或者F(或 者稱KS4);重氮乙酰絲氨酸；博來霉素；洋紅霉素(cambicin)，柔紅 霉素(daunombicin)，或者14-羥基柔紅霉素(阿霉素或者多柔比星)；絲 裂霉素A、 B或者C;米托蒽醌；普卡霉素(光輝霉素)；等等。另一類 經(jīng)常使用和烷基化DNA的遺傳毒性劑包括卣代乙基亞硝脲 (haloethylnitrosoureas)，尤其是氯乙基亞硝脲。這一大類的代表成員包 括亞硝脲氮芥，吡葡亞硝脲，福莫司汀，環(huán)己亞硝脲，嘧咬亞硝脲， 雷莫司汀和鏈脲佐菌素。囟代乙基亞硝脲第一藥劑可以是任意上述代 表化合物的類似物或者衍生物。當前可以通過鉑配位化合物例如順鉑或者奧沙利鉑控制的肺瘤包 括包括睪丸、子宮內(nèi)膜、頸、胃、扁平細胞、腎上腺皮質(zhì)和小細胞肺 癌以及成神經(jīng)管細胞瘤和成神經(jīng)細胞瘤。其他細胞毒性抗癌治療劑包 括，例如，用于睪丸癌的BEP(博來霉素，鬼臼乙叉戒，順鉑)，用于膀胱癌的MVAC(氨曱蝶呤，長春花堿，多柔比星，順鉑)，用于非小 細胞肺癌治療的MVP(絲裂霉素C，長春花堿，順鉑)。另一類遺傳毒性劑，其成員烷基化DNA，包括硫和氮芥。這些化 合物主要通過在鳥。票呤的N7原子形成共價加合物來損傷DNA。這大 類的典型成員包括苯丁酸氮芥，環(huán)磷酰胺，異磷酰胺，苯丙氨酸氮芥， 氮芥(mechloroethamine)，新氮芥(novembicin), 氯乙環(huán)磷酰胺，等等。 與所選細胞基因組中特異序列共價或者非共價相互作用的寡核苷酸或 者其類似物也可以用作遺傳毒性劑，如果需要選擇一個或者多個預定 的基因組耙標作為基因組損傷的部位。另一類藥劑，其成員烷基化DNA，包括氮丙啶和曱基三聚氰胺。 這些類例如包括六曱密胺(六甲三聚氰胺)，三亞乙基磷酰胺(TEPA), 三亞乙基硫化磷酰胺(ThioTEPA)和三乙烯胺三溱。其他類的DNA烷化劑包括烷基磺酸鹽，以白消安為代表； azinidines，以千替派為代表；和其他，以例如丙脒腙、米托蒽醌和曱 基千肼為代表。每一類均包括各自代表化合物的類似物和衍生物。在一個實施方式中，化療劑是諸如EGFR和HER2-neu的受體酪 氨酸激酶的抑制劑，并用作增殖細胞生長的選擇性抑制劑。例如， erbstatin， 一種EGF受體酪氨酸激酶抑制劑，減緩表達EGFR的人癌 細胞的生長。苯乙烯的不同衍生物據(jù)稱也具有酪氨酸激酶抑制性質(zhì)， 可用作抗瘤劑。兩種這類苯乙烯衍生物是I類RTK抑制劑，其效果已 經(jīng)通過減緩注入棵鼠的人鱗狀細胞癌的生長證明。 一些4-苯胺會唑啉 衍生物可用作受體酪氨酸激酶的抑制劑。這些化合物顯示的非常緊密 的結(jié)構(gòu)-活性之間的關(guān)聯(lián)提示清楚確定的結(jié)合模式，其中喹唑啉環(huán)結(jié)合 在腺嘌呤口袋內(nèi)，而苯胺基環(huán)結(jié)合在相鄰的、唯一親脂性的口袋內(nèi)。 已經(jīng)在臨床上對作為抗癌藥的3種4-苯胺喹唑啉類似物(兩種可逆的和 一種不可逆的抑制劑)進行了評估。此外，單克隆抗體曲妥單抗(HerceptinTM)用于治療過表達HER2-neu的轉(zhuǎn)移性乳腺癌。Scheurle,等 人，Anticancer Res 20:2091-2096， 2000。"表達載體"是任意的遺傳成分，例如，質(zhì)粒、染色體、病毒、表 現(xiàn)為細胞內(nèi)多核苷酸復制的自主單位(即，能夠在其自身控制下復制) 或者使其能夠通過插入宿主細胞染色體進行復制，具有與其結(jié)合的另 一多核苷酸片段，以引起所結(jié)合的片段的復制和/或表達。合適的載體 包括，但不限于病毒、質(zhì)粒和粘粒。表達載體包含"表達盒"，所述表達盒包括待轉(zhuǎn)錄的多核苷酸序列， 該序列與影響載體連接或者插入所需宿主細胞并影響待表達的多核苦 酸的轉(zhuǎn)錄的多核苷酸序列進行可操作的連接。這類序列包括影響轉(zhuǎn)錄 的啟動子序列，增強轉(zhuǎn)錄的增強子序列，核醣體結(jié)合位點序列和轉(zhuǎn)錄 和翻譯終止序列。或者，可能無需將載體連接或者整合入宿主細胞 DNA序列，表達載體就能夠直接表達其編碼的核酸序列產(chǎn)物。術(shù)語"可操作的連接"是指一條DNA片段與另一條DNA片段連 接，這種方式使這些片段以預期的方式發(fā)揮功能。編碼基因產(chǎn)物的 DNA序列被可操作的連接到調(diào)控序列，當其被連接到調(diào)控序列時，例 如，啟動子，增強子和/或沉默子，這種方式能夠直接或者間接的調(diào)控 DNA序列的轉(zhuǎn)錄。例如，當一 DNA序列相對啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點 連接到啟動子的下游，相對轉(zhuǎn)錄起始位點在正確的讀碼框中并允許轉(zhuǎn) 錄沿著DNA序列進行延伸時，該DNA序列被可操作的連接到啟動子。增強或者減弱時，增強子或者沉默子被可操作的連接到編碼基因產(chǎn)物 的DNA序列。增強子和沉默子可以位于DNA序列編碼區(qū)的上游、下 游或者嵌入其中。如果信號序列可以表達為參與多肽分泌的前蛋白， 則作為信號序列的DNA被可操作的連接到編碼多肽的DNA。通常利 用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的限制性核酸內(nèi)切酶在合適的限制性位點或者 通過接頭或者連接子插入序列之中，實現(xiàn)DNA序列與調(diào)控序列的連 接。 "此處使用的"小分子"是指設(shè)計與已知涉及特定疾病狀態(tài)的特定蛋 白相互作用的分子量合成化合物。這類化合物文庫可以利用例如組合化學輕易地合成，可利用常規(guī)技術(shù)篩選TNFR25激動/拮抗活性。術(shù)語"TNFR-SF25" ， "TNFR25"或者"DR3"對于以往不清楚 其完整生物功能的TNF受體家族的成員，在本文中可以互換使用。參 見美國專利6，713，061，和Borysenko，等人，Biochem Biophys Res Commun. 2005 Mar 18;328(3):794隱9， Sheikh，等人，Curr. Cancer Drug Targets. 2004 Feb;4( 1):97-104,在此以參考的方式將其完整引入。但是， 本發(fā)明人做出了許多重要的發(fā)現(xiàn)。編碼小鼠TNFR25的cDNA序列如 SEQ ID NO: 1所示。編碼人TNFR25的cDNA序列如SEQ ID NO: 2 所示。與TNF-R家族的任何其他成員不同，發(fā)現(xiàn)DR3表達受選擇的 mRNA剪接的控制。靜止的T細胞很少或者幾乎不表達DR3蛋白，但 包含高水平的隨機剪接的DR3 mRNA。通過T細胞受體活化T細胞時， 蛋白激酶C(PKC)被活化。PKC活化依次介導全長DR3的正確剪接和 蛋白的表面表達。這種對DR3表達的獨特調(diào)控允許DR3蛋白在T細 胞中快速表達，并通過影響控制DR3剪接和表達的PKC水平能夠?qū)?現(xiàn)對DR3表達的環(huán)境調(diào)控。DR3還參與共刺激T細胞極化和刺激Th2極化細胞中IL-13和 IL-10的產(chǎn)生。這是一個重要的發(fā)現(xiàn)，因為在其他情況下，IL-10的產(chǎn) 生在抑制炎癥性腸病中起著關(guān)鍵作用。在T細胞活化和抗原暴露時，T細胞中TNFR25的轉(zhuǎn)基因表達介 導細胞因子的TH2極化和抗體產(chǎn)生。此外轉(zhuǎn)基因TNFR25部分抑制 TCR驅(qū)動的CD4和CD8細胞增殖，并減少淋巴器官中T細胞總數(shù)而 且不誘導凋亡。CD8細胞比CD4細胞更受TNFR25的影響。因此，通 過造成針對TH2或者針對混合TH1/TH2應(yīng)答的續(xù)發(fā)才及化，TNFR25 信號傳遞在對病原體的效應(yīng)物應(yīng)答中非常重要。在小鼠的哮喘模型中，TNFR25轉(zhuǎn)基因小鼠對抗原誘導的氣道炎 癥高度敏感，在通過吸入接觸抗原時在肺中產(chǎn)生IL-13和嗜酸性粒細胞的數(shù)量增加。當與野生型小鼠比較時，表達顯性陰性形式TNFR25 的轉(zhuǎn)基因小鼠顯示對氣道高反應(yīng)性增強的抗性。此處"TL1A"是指TNF-樣因子，其通過包含結(jié)合死亡結(jié)構(gòu)域的受 體DR3，作為IFN-7分泌的共刺激物。TL1A，和TNF—樣，據(jù)推測 也作為同源三聚體的可溶形式進行循環(huán)。因此，此處使用的"可溶性 TL1A"是指同源三聚體TL1A。該術(shù)語不限于任何種類的特異形式。但 是，人TL1A單體的cDNA序列如SEQIDNO: 7所示，小鼠的如SEQ ID NO: 3所示。已經(jīng)表明TL1A通過作為Thl極化細胞因子，在炎癥性腸病(IBD) 中發(fā)揮作用。已經(jīng)證明TL1A蛋白的數(shù)量和TL1A陽性細胞的數(shù)目與 炎癥的嚴重程度相關(guān)聯(lián)，最明顯地是在克羅恩氏病(CD)中。還證明向 來自CD患者的受PHA刺激的固有層單個核細胞培養(yǎng)物中添加重組人 TL1A，顯著增加IFN-7產(chǎn)生達到4倍，而在對照患者中只觀察到4艮小 的影響。此外，阻斷抗TL1A的抗體能夠改善野生型小鼠的哞喘，表 明TNFR25和TL1A涉及譯喘的發(fā)病機理。人體受體通過被天然(例如激素，細胞因子和神經(jīng)遞質(zhì))或者合成 (例如藥物，例如，抗體或者小分子)激動劑刺激或者抑制來起作用。此處"TNFR25激動劑，，是指結(jié)合TNFR25受體并在細胞中觸發(fā) 應(yīng)答的物質(zhì)，所述細胞中TNFR25受體的表達類似于將細胞暴露于天 然TNFR25配體，例如TL1A時觀察到的應(yīng)答。激動劑在含義上是拮 抗劑的反義詞，雖然拮抗劑也能結(jié)合受體，但它不能活化受體，實際 上是完全的或者部分的阻斷由內(nèi)源或者外源激動劑引起的活化。部分 激動劑活化受體，但不造成和完整激動劑同樣的生理變化。作為TNFR25激動劑，可溶性TL1A可以用治療劑形式給藥患者， 以增強給定細胞群中TNFR25受體的活化?；蛘?，TNFR25激動劑的 另一個實例是能夠結(jié)合和活化TNFR25的抗體。例如，單克隆抗體4C12 結(jié)合和活化TNFR25信號途徑。在另一個實施方式和本發(fā)明背景下， TNFR25激動劑可以源自具有表達盒的表達載體，所述表達盒能夠異 位驅(qū)動TNFR25激動劑抗體和/或TL1A蛋白在選定位置或者選定時間 進行轉(zhuǎn)基因表達。在另一個實施方式中，通過一種具有能夠驅(qū)動TNFR25自身的轉(zhuǎn)基因表達的表達盒的表達載體提供導致組織中 TNFR25信號傳遞增強的TNFR25激動劑。這在組織中需要增強 TNFR25信號的情況下是有用的，其中相對于受體存在過量的外源或 者內(nèi)源TNFR25激動劑。此處"TNFR25拮抗劑"是指抑制TNFR25受體正常生理機能的物 質(zhì)。這類藥劑通過干護L內(nèi)源受體激動劑/配體例如TL1A與TNFR25受 體的結(jié)合起作用。TNFR25拮抗劑的 一 個實例是顯性陰性TNFR25受 體。優(yōu)選地，此處使用的TNFR25拮抗劑是對TL1A特異的抗體，它 干擾TL1A活化TNRF25受體的能力。最優(yōu)選地，該抗體是單克隆抗 體L4G6。在另一個實施方式中，TNFR25拮抗劑是TNFR25的胞外部 分或者TNFR25的選擇剪接形式與免疫球蛋白的Fc部分或者任何其他 合適的融合伴侶的融合蛋白。在另一個實施方式中，TNFR25拮抗劑 是TNFR25的可溶性形式，通過在跨膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域上截斷制備，其或 者作為其他剪接形式或者作為人工構(gòu)建物。在另一個實施方式中， TNFR25拮抗劑是特異結(jié)合TNFR25并干擾其結(jié)合天然配體的抗體。 在另一個實施方式中，TNFR25拮抗劑可以是具有表達盒的表達載體， 所述表達盒能夠驅(qū)動反義mRNA、 RNAi或者核糖酶的轉(zhuǎn)基因表達， 所述反義mRNA、 RNAi或者核糖酶能夠在選定位置或者選定時間敲 除內(nèi)源TNFR25和/或TL1A mRNA的轉(zhuǎn)錄和/或翻i奪。在另一個實施 方式中，通過提供具有能夠驅(qū)動顯性陰性TNFR25轉(zhuǎn)基因表達的表達 盒的表達載體，可以在組織中減弱TNFR25信號傳遞。TNFR25拮抗劑或者激動劑可以采用適體的形式。"適體"是基于 結(jié)合其他分子的能力選自隨機庫(pools)的DNA或者RNA分子。在一 個實施方式中，適體特異結(jié)合TNFR25以阻斷與其天然配體例如TL1A 的結(jié)合，或者結(jié)合TL1A自身，從而阻止其結(jié)合TNFR25。在另一個 實施方式中，適體特異結(jié)合TNFR25受體并活化它。此處使用的"顯性陰性，，或者"DN"是指外源給予的TNFR25結(jié)構(gòu)變 異體，用于封閉內(nèi)源TNFR25。例如，摩爾過量的DN將與內(nèi)源TNFR25 竟爭結(jié)合TNFR25配體，例如TL1A。除了缺失胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域以外，DN 優(yōu)選地與野生型TNFR25相同?；蛘撸巳笔Э缒ず桶麅?nèi)結(jié)構(gòu)域以夕卜，DN與野生型TNFR25相同。小鼠DN TNFR25的編碼序列如SEQ ID NO: 4所示。人DN TNFR25的編碼序列如SEQ ID NO: 5所示。只 包含胞外結(jié)構(gòu)域的人DN TNFR25的編碼序列如SEQ ID NO: 6所示。本發(fā)明還涉及與SEQ ID NOs: 3-7基本上相同的編碼序列。技術(shù) 人員還清楚與SEQ ID NOs: 3-7基本上相同的寡聚核苷酸序列分別可 以不同于SEQ ID NOs: 3-7，相對于至少一個核苷酸堿基的相同。但是， 所有與SEQ ID NOs: 3-7基本上相同的寡聚核苷酸序列將在嚴緊條件 (如此處定義)下分別與SEQ ID NOs: 3-6互補序列的全部或者部分(即: 耙序列)雜交。術(shù)語"雜交特異地"或者"特異地雜交"是指寡聚核苷酸(例 如，引物或者標記探針)和靶序列之間的互補雜交。術(shù)語特異的包含少 量錯配，該錯配是可以接受的，通過降低雜交介質(zhì)的嚴緊性來實現(xiàn)PCR 聚合酶所需的引發(fā)或者雜交信號的檢測。在嚴緊雜交條件下，只有高互補的，即基本上相同的核酸序列才 能雜交。優(yōu)選地，這類條件阻止20個連續(xù)核苦酸中具有3個或者更多 錯配的核酸雜交，更優(yōu)選地20個連續(xù)核芬酸中具有2個或者更多錯配， 最優(yōu)選地20個連續(xù)核苷酸中具有1個或者更多錯配。雜交核酸的雜交 部分與靶序列或者其互補序列的序列至少大約90%相同，優(yōu)選地至少 大約95%,或者最優(yōu)選地大約至少大約98%。下面定義了與核酸樣本在嚴緊條件下的核酸雜交。核酸雙鏈或者 雜交穩(wěn)定性表示為熔解溫度(Tm)，這是探針從靶DNA解離的溫度。該 熔解溫度用于限定所需的嚴緊條件。如果待測序列與探針基本上相同， 而不是相同，則首先確定在特定濃度的鹽(例如SSC或者SSPE)條件下 只有同源雜交發(fā)生的最低溫度是有用的。然后假定1。/。錯配導致Tm降 低1。C,雜交反應(yīng)中最終洗滌的溫度相應(yīng)降低(例如，如果序列與探針 具有〉95%的同一性，最終洗滌溫度降低5°C)。實際上，每1%錯配的 Tm變化在0.5°C和1.5。C之間。嚴緊條件包括68。C下在5xSSC/5xDenhart's溶液/1.0% SDS中雜 交，和室溫下在0.2xSSC/0.1% SDS中洗滌。中等嚴緊條件包括42。C 下在3xSSC中洗滌?？梢愿淖凔}濃度和溫度的參數(shù)以實現(xiàn)引物和靶核 酸之間同 一 性的最適水平。很容易在本領(lǐng)域找到關(guān)于這類條件的其他教導，例如，Sambrook, Fischer和Maniatis, Molecular Cloning, a laboratory manual, (2nd ed.) , Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, (1989) and F. M. Ausubel等人eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley和Sons (1994)。此處作為術(shù)語使用的"免疫抑制劑"是治療炎性疾病和促進器官移 植必需的重要藥物。例如，環(huán)孢菌素A(CsA)具有相當?shù)拿庖咭种苹钚浴?它極大促進了器官移植，通常在自身免疫疾病的治療中使用。關(guān)于CsA 用途和作用機理的綜述可以參見Wenger等人；Cyclosporine Chemistry, Structure-activity relationships and Mode of Action, Progress in Clinical Biochemistry and Medicine, Vol. 2， 176 (1986)。 {旦是，CsA藥效大，可 能具有嚴重的副作用例如腎衰竭、骨髓抑制和不育癥。皮質(zhì)激素因其抗炎效果而被用于炎性病癥。它們作用迅速，深切 影響免疫系統(tǒng)的諸多部分以及大多數(shù)其他身體系統(tǒng)。皮質(zhì)激素是治療 大多數(shù)類型血管炎的基礎(chǔ)，常和其他免疫抑制藥物聯(lián)用。但是，皮質(zhì) 激素的長期使用也可能具有嚴重的副作用包括高血壓、體重增加、痤 瘡和臉水腫。其他免疫抑制劑包括咪唑硫嘌呤，氨曱蝶呤，環(huán)磷酰胺， 巰基噤呤，他克莫司和霉酚酸酯。作為常見物質(zhì)，激動劑和拮抗劑可以作為^皮吞服、注射、p及入的 組合物對患者給藥或者經(jīng)由栓劑給藥?；蛘撸M合物可以配制成滴耳 劑或滴眼劑。此處使用的術(shù)語"譯喘"包括任何特征為陣發(fā)性呼吸困難反復發(fā)作 的哮喘狀態(tài)(即，"可逆性阻塞性氣道疾病")，表現(xiàn)為支氣管痙攣性收縮 (通常所說的"支氣管痙攣")造成的喘鳴。根據(jù)本發(fā)明可以治療乃至預防 的哮喘狀態(tài)包括變應(yīng)性哮喘和支氣管變態(tài)反應(yīng)，其特征表現(xiàn)在致敏個 體中，由各種因素包括鍛煉，尤其是劇烈運動("鍛煉-誘導的支氣管痙 攣")，刺激性顆粒(花粉，灰塵，棉，貓皮屑)引起，以及輕度到中度哞 喘、慢性哮喘、嚴重慢性哞喘、嚴重的和不穩(wěn)定的哞喘、夜間譯喘和 精神應(yīng)激。本發(fā)明的方法尤其可用于預防哺乳動物中哮喘的發(fā)作，例 如，人類所受的下氣道和肺部的可逆阻塞性疾病以及鍛煉-誘導的支氣管痙攣的困擾。在此處/>開的治療哮喘的方法中，優(yōu)選的輸送本發(fā)明 拮抗劑的方法是采用吸入。存在若干不同類型的裝置，它們通常利用不同的機理和方法來產(chǎn) 生用于吸入的氣霧劑。最常用的裝置是定量吸入器(MDI),它包括一 個具有包括低沸點噴射劑的制劑的藥劑容器。該制劑在壓力下裝在容 器中，當容器閥門打開后，定量制劑釋放為氣霧劑。當該制劑暴露于容器外的大氣壓力時，低沸點噴射劑很快蒸發(fā)或者"閃蒸(flashes)"。無 噴射劑的包含藥物的制劑顆粒被吸入到患者的肺部，此后進入患者的 循環(huán)系統(tǒng)。存在許多不同類型的MDI裝置。這類裝置公開于1995年 4月11日授權(quán)的美國專利5,404,871和1994年11月15號授權(quán)的美國 專利5,364,838。另一類型的裝置是干粉吸入器(DPI)裝置。如其名稱所示，這類裝 置使用干粉制劑，其粉末通過氣體噴發(fā)被吹成霧化的云狀物。典型的 DPI裝置見于1998年7月7日授權(quán)的美國專利5,775,320和1998年4 月21日授權(quán)的美國專利5，740，794。另一類型的氣霧劑輸送裝置通過多孔膜壓成制劑。制劑移動通過 小孔后分散形成小顆粒，被患者吸入。這類裝置見于1996年8月13 日4受權(quán)的美國專利5，554，646和1996年6月4日4受權(quán)的美國專利 5,522,385。對于可吸入組合物，合適的載體可以是無定形粉末、結(jié)晶性粉末 或者無定形和結(jié)晶性粉末組合的形式。合適的材料包括糖類，例如， 單糖例如果糖，半乳糖，葡萄糖，D-甘露糖，山梨糖，等等；二糖， 例如乳糖，海藻糖，纖維二糖，等等；環(huán)糊精，例如2-羥丙基-/3-環(huán)糊 精；和多糖，例如棉子糖，麥芽糖糊精，葡聚糖，等等；(b)氨基酸， 例如甘氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，賴氨酸，等等； (c)有機酸和堿制備的有機鹽，例如檸檬酸鈉，抗壞血酸鈉，葡糖酸鎂， 葡糖酸鈉，鹽酸氨基丁三醇，等等；(d)肽和蛋白，例如天冬酰苯丙氨 酸曱酯，人血清白蛋白，明膠，等等；(e)多羥糖醇，例如甘露醇，木 糖醇，等等。優(yōu)選的載體組包括乳糖，海藻糖，棉子糖，麥芽糖糊精， 甘氨酸，檸檬酸鈉，鹽酸氨基丁三醇，人血清白蛋白，和甘露醇。這類載體材料可以在噴霧干燥前與本發(fā)明的激動劑或者拮抗劑混 合，即，通過將載體材料添加到用于噴霧干燥的緩沖溶液。用這種方 法，該載體材料將與本發(fā)明的激動劑或者拮抗劑顆粒同時形成，并作 為它們的一部分。通常，當載體與本發(fā)明的激動劑或者拮抗劑通過噴劑的重量百分數(shù)范圍從5%到95%,優(yōu)選的從20%到80%。顆粒的其 余部分主要是載體材料(通常從5%到95%，按重量計算一般從20%到 80%)，但還包括緩沖液并可能包括如上所述的其他組分。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)顆 粒中載體的存在不會顯著干擾本發(fā)明激動劑或者拮抗劑的全身吸收， 所述顆粒被輸送到肺的肺泡區(qū)(即，在小于10/mi的所需粒度范圍內(nèi))。 或者，載體可以單獨制備為干粉形式并通過混和與本發(fā)明的激動 劑或者拮抗劑干粉組合。單獨制備的粉末載體通常是晶狀的(以防止吸 水)，但在一些情況下是無定型的或者是晶狀和無定型的混合物。可以 選擇載體顆粒的粒徑以改進本發(fā)明激動劑或者拮抗劑粉末的流動性，范圍通常,人25]Ltm到lOO)tmi。這個粒度范圍內(nèi)的載體顆粒通常不進入 肺的肺泡區(qū)，經(jīng)常在吸入前在輸送裝置中與本發(fā)明的激動劑或者拮抗 劑分離。因此，進入肺肺泡區(qū)的顆?；旧嫌杀景l(fā)明的激動劑拮抗劑 和緩沖物組成。優(yōu)選的載體是具有上述粒徑范圍內(nèi)的晶狀甘露醇。本發(fā)明的干粉組合物優(yōu)選地利用常規(guī)方式通過在流動空氣或者其 他生理可接受的氣流中分散進行霧化。 一個適于這類分散的系統(tǒng)描述 與共同待決申請序列號07/910,048，其7>開為WO 93/00951,在此以 參考方式將其完整引入。通過在合適的溶劑例如磷酸鈉緩沖鹽水中加入所需量的本發(fā)明組 合物和制劑，然后進行過濾滅菌，制備無菌注射溶液。此處使用的"生 理上可接受的載體，，包括對人等等無毒的任何及所有的溶劑、分散介 質(zhì)、抗細菌和抗真菌劑。這類介質(zhì)和藥劑用于藥學活性物質(zhì)的用途是 本領(lǐng)域公知的。所述介質(zhì)或者藥劑必須適合保持本發(fā)明蛋白鏈的正確 構(gòu)象及其在治療組合物中的用途。組合物中還可以添加輔助活性成分。 示范性的藥學可接受的載體和稀釋劑以及藥物制劑的說明參見于 Remington's Pharmaceutical Sciences,本領(lǐng)域的標準文件，和USP/NF。所述組合物給藥的劑量和方式應(yīng)該根據(jù)其特性、劑型、給藥途徑 和其他已知的或者本領(lǐng)域能夠輕易辨別的相關(guān)特征來調(diào)整。2. TNFR25激動劑作為T細胞極化和肺部炎癥的直沖妻增效劑TNFR25和其配體TL1A被發(fā)現(xiàn)是T細胞極化和肺部炎癥的直接 增效劑。在激動型TNFR25-轉(zhuǎn)基因小鼠中觀察到的惡化的肺部炎癥證 明TL1A和TNFR25在肺部疾病中的重要功能。TNFR25的過表達導 致活化時CD4細胞的強Th2偏性。該偏性從而可能導致卵清蛋白模型 (ovalbumin model)中惡化的肺部炎癥。本發(fā)明人注意到在鼠譯喘模型中，TNFR25信號途徑的阻斷導致 Th2細胞因子產(chǎn)生減少，這抑制肺部炎癥。CD4細胞上的TNFR25觸 發(fā)Thl和Th2極化細胞的IL-13分泌，起始和加劇肺部炎癥的NKT 細胞需要TNFR25信號傳遞。TNFR25觸發(fā)的長期IL-13產(chǎn)生還造成 慢性肺炎的繼發(fā)癥(sequaelae)、氣道重塑和纖維化，所述慢性肺炎包括 但不限于慢性譯喘。在過繼轉(zhuǎn)移實驗中顯性陰性TNFR25突變體對 NKT細胞TNFR25信號的阻斷消除了肺部炎癥。諸如這類的TNFR25 信號阻斷將有利于治療急性和慢性哮喘和其他肺部病癥。在導致肺部炎癥的一連串事件中，NKT細胞的IL-13產(chǎn)生是一個 早期步驟(Akbari, O.等人，Nat Med 9, 582-8 (2003))。本研究證明NKT 細胞在哮喘中的關(guān)鍵功能，因為過繼轉(zhuǎn)移實驗表明NKT細胞使用的誘 導肺部炎癥的主要分子開關(guān)是TNFR25。在TCR活化細胞中利用PKC 介導的TNFR25剪接，通過抗原特異性的CD4記憶纟田胞，TNFR25還 具有改變初始效應(yīng)物應(yīng)答的能力。因此TNFR25在肺中記憶應(yīng)答啟始 的早期起作用。因此，通過抗TL1A或者其他步驟造成的TNFR25信 號阻斷中斷了事件的級聯(lián)，從而導致被認為引起哞喘發(fā)作的急性肺部炎癥。在野生型小鼠中可以遺傳地實現(xiàn)TNFR25的阻斷，以及通過兩個 獨立方法的抗體阻斷得到相似的結(jié)果。體內(nèi)干擾TNFR25信號傳遞導 致減少的抗原再刺激的引流支氣管淋巴結(jié)產(chǎn)生的IL-13， IL-5和IL-4,并抑制肺部炎癥。重要地是，在初免和Th2極化的氣道抗原刺激期間的抗TL1A抗體阻斷能夠有效抑制肺部炎癥，表明TNFR25在肺效應(yīng) 期的直接作用。3. NKT細胞的組成性TNFR25表達和活化T細胞的誘導性表達。為研究TNFR25和其同源配體TL1A的生物功能，按照標準步驟 產(chǎn)生倉鼠抗小鼠單克隆抗體。為了通過流式細胞術(shù)可信地檢測原代細 胞低水平的TNFR25表達，必須開發(fā)一種三層夾心一企測法。沒有活化 的情況下，在初始CD4 T細胞中檢測到低水平的TNFR25,還在CD8 T細胞中檢測到更低水平的TNFR25，但在B細胞中未檢測到(圖la)。 此夕卜CDllc+細胞的一個亞群表達TNFR25。 NKT細胞組成性表達相 對豐交高水平的TNFR25，而只有小部分CD3陰性NKll +細胞顯示 TNFR25表達(圖la)。在胸腺中，與外周T細胞類似，CD4和CD8單 一陽性的細胞表達TNFR25,而CD4、 CD8雙陽性和雙陰性胸腺細胞 不表達TNFR25(圖lc)。當用抗CD3和抗CD28活化外周T細月包時，CD4+和CD8+細胞的 TNFR25表達均被上調(diào)(圖lb)。另一方面B細胞的LPS活化不導致 TNFR25表達。鼠TNFR25 mRNA在T細胞中組成性表達，但與人 TNFR25類似進行隨機剪接(Screaton, G.R.等人Proc Natl Acad Sci U S A 94, 4615-9.(1997》(圖2)?；罨疶細胞中增加的TNFR25蛋白表達與 活化誘導的全長TNFR25的剪接相關(guān)，所述全長TNFR25來自隨機剪 接的TNFR25 mRNA。 T細胞中TNFR25活化誘導的剪接被化學抑制 劑H7阻斷，表明PKC在剪接中的功能(圖2)。TNFR25在NKT和活化T細胞中的優(yōu)先表達和其活化誘導的對全 長TNFR25的剪接和表面表達的快速增加提出以下問題，即TNFR25 在免疫系統(tǒng)中的生物功能。除了胸腺中陰性選擇的輕度缺陷外，小鼠 中敲除TNFR25基因不顯示明確的TNFR25缺陷表型。因此，對CD2 啟動子和增強子驅(qū)動的T細胞表達的TNFR25轉(zhuǎn)基因的生物學影響進 行分析。全長TNFR25(FLTNFR25,如圖2)和缺失外顯子5和6的另 一種 TNFR25剪接產(chǎn)物(A5，6 TNFR25,圖2)用于轉(zhuǎn)基因表達。A5，6 TNFR25缺失編碼第4半胱氨酸富集胞外結(jié)構(gòu)域的外顯子5和6。它錨定在膜上，但是，具有類似FLTNFR25的完整胞內(nèi)信號傳遞結(jié)構(gòu)域，并且結(jié) 合TL1A和激動型抗TNFR25抗體(4C12)。此外顯性陰性突變體，DN TNFR25，其在跨膜結(jié)構(gòu)域后被截短，表達為轉(zhuǎn)基因，將在下面進行描 述。4. TNFR25的轉(zhuǎn)基因過表達促進CD4細胞的Th2極化并在AHR卵清 蛋白模型中介導增加的肺部炎癥。對獲得并分析各TNFR25轉(zhuǎn)基因的獲得4個獨立的原代 (founders),并進行分析。所有原代A5,6 TNFR25、 TNFR25和DN TNFR25中CD2啟動子和增強子支持的位置的獨立的轉(zhuǎn)基因表達，在 靜止T細胞、NKT細胞、NKNK細胞和CDllc+細胞亞群中顯示高水 平的表達。B細胞不表達轉(zhuǎn)基因(圖3a)。對轉(zhuǎn)染肺瘤細胞進行的Western 印跡，以驗證了流式細胞術(shù)檢測抗體的可靠性(圖3b)，在轉(zhuǎn)基因脾細 胞中檢測到相同的Western印跡條帶，而內(nèi)源分子低于Western印跡 的檢測水平。在Western印跡中利用抗體10D1檢測不到A5,6剪接形 式(圖3b)，表明該抗體結(jié)合外顯子5或者6。 FL TNFR25的轉(zhuǎn)基因過 表達與中樞初級和次級淋巴器官相對非轉(zhuǎn)基因同窩的T細胞數(shù)目減少 有關(guān)；A5,6轉(zhuǎn)基因?qū)毎康挠绊懺谛叵偈侵械鹊?，在次級淋巴?官中是不顯著的。當比較相等數(shù)目的純化轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因同窩的 CD4和CD8細胞時，轉(zhuǎn)基因小鼠中減少的T細胞數(shù)目伴隨著對抗CD3 和CD28刺激應(yīng)答的增殖的減少(圖3d)。在從24到72小時的所有時 間點均觀察到減少的增殖。但是，利用佛波酯PMA和Ca離子載體伊 屋諾霉素對TNFR25-tg CD4或者CD8細胞的刺激恢復了正常增殖， 表明轉(zhuǎn)基因細胞的增殖能力沒有內(nèi)在缺陷。相對于同窩對照， CD3/CD28活化的TNFR25-tg T細胞通常上調(diào)CD25,只產(chǎn)生大約一半 數(shù)量的IL-2(圖4)。過量IL-2的外源添加沒有恢復增殖(圖3d)。利用 annexin V染色進行測定，TNFR25-tg T細胞的凋亡沒有增加(圖4), 表明增殖減弱不是由引起細胞死亡的TNFR25信號造成的。FL和A5,6 TNFR25轉(zhuǎn)染的EL4細胞用于比較由可溶性TL1A、膜 結(jié)合TL1A (EL4-TL1A)或者激動型抗TNFR25抗體(4C12)觸發(fā)的剪接 變異體的信號傳遞特性。利用EMSA檢測，所有3種配體在25分鐘 內(nèi)快速誘導NF-kB活化(圖3e)。在用板結(jié)合的抗CD3和可溶性抗CD28初始活化后，與非轉(zhuǎn)基因 同窩相比，F(xiàn)L和A5,6 TNFR25轉(zhuǎn)基因細胞產(chǎn)生Th2細胞因子的數(shù)量 明顯增加，包括IL-4， IL-5， IL- 13和IL-10 (圖3f)。當FL TNFR25-tg CD4 細胞不是用A5，6 TNFR25轉(zhuǎn)基因活化時，IFN-7減少，表明剪接變異 體功能的微小差異。盡管TNFR25轉(zhuǎn)基因CD4細胞的增殖減少，增加 的Th2細胞因子產(chǎn)生在活化24小時內(nèi)就已經(jīng)能夠檢測到，并在之后 幾天持續(xù)增加，表明活化前已存在Th2偏性。隨后檢測FL TNFR25轉(zhuǎn)基因CD4細胞的Th2偏性是否能夠在Thl 極化條件下被改變。在Th中性條件，TNFR25-tgCD4細胞產(chǎn)生與Th2 極化條件下野生型CD4細胞一樣多的IL-4(圖3g)。Th2極化條件下FL TNFR25-tg細胞的孵育對IL-4或者IL-13的產(chǎn)生沒有額外影響，表明 細胞在Th中性條件下的初始活化期間已經(jīng)被最大程度的Th2極化。 但是，通過在培養(yǎng)物中包括IL-4的抗體并添加外源IL-12, FL TNFR25-tg CD4細胞能夠^L極化到Thl 。在這些條件下，F(xiàn)L TNFR25-tg 細胞產(chǎn)生比Thll極化的野生型細胞更高水平的IFN-7(圖3g)，表明 TNFR25轉(zhuǎn)基因還可以共刺激Thl細胞因子。Thl極化的FL TNFR25-tg CD4細胞，與野生型Thl細胞不同，還產(chǎn)生IL-13，但只有最小量的 IL-4。盡管TNFR25的轉(zhuǎn)基因過表達自發(fā)的偏向Th2，但是在合適的 極化條件下也能夠共刺激Thl或者Th2型細胞因子的產(chǎn)生。此外，在 Thl或者Th2極化條件下，TNFR25信號傳遞共刺激IL-13產(chǎn)生。通過免疫和抗體同種型產(chǎn)生的分析對TNFR25-tg小鼠體內(nèi)的自發(fā) Th2偏性進行評價。利用A5,6TNFR25轉(zhuǎn)基因小鼠進行體內(nèi)試驗。對 于NF-kB i秀導和凋亡的誘導，A5，6-TNFR25顯示與FLTNFR25相同 的信號傳遞性質(zhì)(圖3e)，并產(chǎn)生相似的Th2偏性細胞因子模式。但是， 與FL轉(zhuǎn)基因小鼠不同，A5，6轉(zhuǎn)基因小鼠在淋巴結(jié)(圖3c)和脾中具有正常的CD4 T細胞量，因此可以更精確地在體內(nèi)實驗中表現(xiàn)TNFR25 功能。相對非轉(zhuǎn)基因同窩，DNP-KLH免疫的TNFR25-tg小鼠產(chǎn)生的抗 原特異性IgGl/IgG2a抗體的比例增加，表明體內(nèi)Th2型抗體的比例增 力口(圖5a)。如果沒有免疫，野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠的IgGl和IgG2a水平 相同，證明活化是顯示Th2偏性必需的。TNFR25-tg CD4細胞的Th2偏性和它們增加的IL-13產(chǎn)生表明 TNFR25過表達可能傾向于加重哮喘的變態(tài)反應(yīng)肺炎特征，因為IL-13 是該病癥的標記細胞因子(Elias, J.A,等人Am J Respir Cell Mol Biol 28, 401-4 (2003)。利用用于實驗性肺部炎癥的小鼠經(jīng)典卵清蛋白模型， 檢測該假設(shè)。TNFR25-tg B6小鼠和野生型對照在第0和5天腹腔內(nèi)用 卵清蛋白和明礬初免。在第12天，用霧化的卵清蛋白對它們進行氣道 刺激，在1到3天后進行分析。TNFR254g小鼠的支氣管肺泡液(BALF) 中包含數(shù)量顯著增加的嗜酸性粒細胞(圖5b),與血清中卵清蛋白特異 性IgE水平增加(圖5d)和支氣管淋巴結(jié)細胞的卵清蛋白再刺激引起的 Th2細胞因子產(chǎn)生升高(圖5e)相關(guān)。相對野生型細胞，轉(zhuǎn)基因支氣管 淋巴結(jié)細胞中IFN-7的產(chǎn)生減少。TNFR25-tg小鼠肺的組織病理學分 析顯示大規(guī)模嗜酸性粒細胞的血管周圍肺部浸潤，增加的支氣管粘液 產(chǎn)生和PAS染色的杯狀細胞增生(圖5c)，符合T細胞中TNFR25過表 達引起的肺部炎癥惡化。5.在初免小鼠的氣道刺激期間TNFR25的遺傳或者抗體阻斷阻滯肺部炎癥。制備TNFR25的顯性陰性突變體DN TNFR25以在氣道刺激期間 阻斷TNFR25信號，DN TNFR25表達為CD2啟動子和增強子調(diào)控下 的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體。DNTNFR25轉(zhuǎn)基因缺失完整的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域，但 與其跨膜和胞外結(jié)構(gòu)域的全長TNFR25相同。通過流式細胞術(shù)一企測，轉(zhuǎn)基因DNTNFR25與激發(fā)激動型TNFR25 轉(zhuǎn)基因的表達水平相同(圖3a)。利用表面熒光強度檢測表達的分子數(shù) 目，檢測到轉(zhuǎn)基因倍摩爾量。這種DN TNFR25過表達的水平抑制內(nèi)源TNFR25的活性。 野生型和DN轉(zhuǎn)基因CD4細胞的初始抗CD3活化刺激Thl和Th2細 胞因子的分泌(圖4，插圖d)。在野生型細胞的初始抗CD3活化期間， 激發(fā)動型抗體(4C12)對TNFR25的觸發(fā)共刺激Thl和Th2細胞因子產(chǎn) 生，但這種對TNFR25的共刺激作用被DN TNFR25轉(zhuǎn)基因阻斷(圖6a)， 表明轉(zhuǎn)基因阻斷內(nèi)源基因的功能。類似地，4C12的激發(fā)激動型作用共 刺激野生型CD4細胞的增殖，而這種增殖在DN TNFR25-tg CD4細胞 中被阻斷(圖6b),表明內(nèi)源TNFR25 #皮抑制。重要地是，CD4纟田胞中 DN TNFR25的表達大大減少了細胞二度級活化時通常觀察到的、上調(diào) 的Th2細胞因子產(chǎn)生，所述細胞已經(jīng)在Th中性條件下進行初免(圖6c)， 表明TNFR25信號極大促進Th2極化或者是Th2極化所需的，并且這 些信號被DN轉(zhuǎn)基因阻斷。更重要地是，即使在Th2極化條件下，DN TNFR25-tg細胞也不能#皮Th2才及化，所述條件通過添加IL-4以及IFN々 和IL- 12的阻斷抗體來提供(圖6d)。另 一方面，即使在非極化(Th中 性，ThN)條件下，DN TNFR25-tg CD4細胞的Th 1極化也不受影響。 因此盡管在CD4細胞的初始活化中TNFR25共刺激Thl和Th2細胞 因子的產(chǎn)生，在體外TNFR25信號表現(xiàn)出是促進Th2極化必需的。Thi 極化與TNFR25無關(guān)，但Thl細胞中的TNFR25信號途徑促進IL-13 產(chǎn)生(圖3g)。用DNP-KLH免疫DN TNFR25-tg小鼠后，DN TNFR25-tg 小鼠體內(nèi)TNFR25信號的缺失不影響野生型小鼠中發(fā)現(xiàn)的正常IgGl 對IgG2a的抗體比例(圖4)。然后，檢測DN TNFR25-tg小鼠在肺部炎癥模型中是否具有改變 的應(yīng)答。與野生型小鼠相比，當通過組織病理學和PAS染色檢查時， DN TNFR25-tg小鼠在氣道刺激時顯示BALF中顯著減少的嗜酸細胞 浸潤，缺失的肺部炎癥和血清中減少的IgE產(chǎn)生(圖6e-圖6g)。對來自 氣道刺激的DN TNFR25-tg小鼠的支氣管的引流淋巴結(jié)用卵清蛋白進 行再刺激，顯示減少的Th2細胞因子產(chǎn)生，但IFN々產(chǎn)生正常(圖6h)。 該數(shù)據(jù)表明TNFR25在肺部免疫應(yīng)答中起到關(guān)鍵作用。為證實野生型小鼠中TNFR25阻斷的遺傳數(shù)據(jù)，制備小鼠TL1A 的單克隆抗體。利用TNFR25和TL1A轉(zhuǎn)染細胞(圖7 a,b),鑒定終止TNFR25信號的TL1A阻斷抗體。TL1A轉(zhuǎn)染細胞在其表面表達 TL1A(圖7c)，并像其他TNF超家族成員一樣，分泌TL1A到上清中。 包含TL1A的上清造成51Cr通過凋亡從FL TNFR25或者A5,6 TNFR25轉(zhuǎn)染肺瘤細胞的快速釋放，如先前所報道(Chinnaiyan, A.M. 等人Science 274, 9卯-2. (1996); Kitson, J.等人Nature 384, 372-5. (1996); Screaton, G.R.等人Proc Natl Acad Sci U S A 94, 4615-9. (1997); Bodmer， J丄.等人Immunity 6, 79-88. (1997); Marsters， S.A.等人Curr Biol 6， 1669-76. (1996); Tan, K.B.等人Gene 204, 35-46 (1997))(圖 7d)?？筎LIA抗體之一 L4G6完全阻斷TLIA介導的TNFR25轉(zhuǎn)染細 胞的裂解，而若干其他抗TLIA抗體不起作用或者只介導不完全的裂 解抑制(圖7d)。因此選4奪L4G6抗體用于TLIA的體內(nèi)阻斷，以阻斷 未發(fā)生遺傳學改變的野生型小鼠中的TNFR25信號。按常規(guī)用卵清蛋 白/明礬免疫小鼠兩次。在氣道剌激前1天和隨后3天，腹腔內(nèi)注射50jLtg L4G6，然后對小鼠進行分析(圖7e)。對照接受相同的數(shù)量和方案的倉 鼠IgG。在氣霧劑刺激期間和之后，以這種方式給藥的L4G6抑制嗜 酸性粒細胞滲入BALF，阻斷過度粘液產(chǎn)生，和減少體外用卵清蛋白 再刺激時支氣管淋巴結(jié)細胞的Th2細胞因子產(chǎn)生(圖7e-圖g)。氣霧劑刺激期間抗TL1A對肺部炎癥的阻斷被氣道中TL1A的表 達所證明。發(fā)現(xiàn)在氣道刺激后而不是氣道刺激前，支氣管的引流淋巴 結(jié)中CDllc+細胞亞群表達較低水平的TL1A(圖7h)。在氣霧劑刺激前 后，支氣管淋巴結(jié)中所有其他的細胞群都是TL1A陰性的(圖7i)。在 卵清蛋白初免或者氣道刺激前后的任意時刻，腹股溝淋巴結(jié)的CD1 lc+ 細胞或者任何其他細胞類型都不表達TL1A。但是利用抗CD3和抗 CD28活化，在純化的CD4+和CD8+脾或者淋巴結(jié)細胞中可以在24 小時內(nèi)體外誘導TL1A表達(圖7j)。 LPS活化的增殖B細胞不表達 TL1A(圖7j)。6.在抗原初免和氣霧劑刺激的NKT缺陷小鼠中，DNTNFR25轉(zhuǎn)基因 NKT細胞未能加劇肺部炎癥。已經(jīng)顯示野生型NKT細胞到NKT缺陷小鼠的過繼轉(zhuǎn)移導致卵清 蛋白模型中肺部炎癥和氣道高反應(yīng)性的恢復，并且需要NKT細胞產(chǎn)生 IL-13(Akbari， O.等人Nat Med 9, 582-8 (2003); Lisbonne， M.等人J Immunol 171， 1637-41 (2003); Meyer, E.H.等人Proc Natl Acad Sci U S A 103， 2782-7 (2006))。 NKT細胞還涉及哞喘患者的病理生理學(Sen, Y. 等人J Immunol 175， 4914-26 (2005). Akbari, O.等人N Engl J Med 354, 1 1 17-29 (2006))。為確定在NKT細胞中組成性表達的TNFR25(圖la) 是否涉及觸發(fā)肺部炎癥，轉(zhuǎn)移的野生型和DN TNFR25-tg NKT纟田月包被 過繼轉(zhuǎn)移入卯清蛋白初免的NKT-缺陷小鼠(Cui， J.等人Science 278, 1623-6 (1997)) (Jod8 k.o.)(圖8)。盡管過繼轉(zhuǎn)移的野生型NKT細胞在 氣道抗原刺激時恢復肺部炎癥，但相同數(shù)量的DNTNFR25-tg NKT細 胞不能發(fā)揮這樣的作用。該lt據(jù)證明NKT細胞中的TNFR25信號對致 敏小鼠接觸氣道抗原期間引發(fā)肺部炎癥非常關(guān)鍵。7. TNFR25激動劑作為抗肺瘤免疫應(yīng)答的直接增效劑成熟的樹突狀細胞進行一個重要的過程，稱為"交叉呈遞"，這使 得它們能夠有效地激發(fā)對腫瘤特異肽特異的T細胞毒性細胞。腫瘤抗 原萍皮降解，并在MHC I類蛋白上呈遞給循環(huán)的CD8 T細胞。為證明TNFR25激動劑是有效的腫瘤疫苗BRMs，給小鼠注射EG7 腫瘤細胞和OT-I細胞。然后觀察OT-I細胞的克隆性增殖。EG7是EL4 小鼠腹水淋巴瘤淋巴母細胞，其被遺傳改變以表達卵清蛋白，這是雞 蛋清的主要蛋白成分。小鼠被接種EG7細胞并接受卵清蛋白特異性T 細胞受體轉(zhuǎn)基因細胞(OT-I)的過繼轉(zhuǎn)移。通過對肺瘤特異性卵清蛋白 抗原的應(yīng)答,OT-I細胞在體內(nèi)作為指示細胞。理論上，小鼠的樹突狀細 胞把腫瘤特異性卵清蛋白呈遞給并活化卯清蛋白特異性(OT-I)T細胞。 但是，在這種情況下并且在人腫瘤疫苗試驗中經(jīng)?？梢杂^察到，OT-I 細胞對EG7鐘瘤細胞沒有反應(yīng)性。相反，用編碼熱休克蛋白gp96(gp-96-Ig)分泌形式的構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染 EG7細胞提供一種分泌gp96Ig和包含卵清蛋白作為替代抗原的肺瘤。 在利用gp96Ig分泌物初始注射和一次加強后，將CD8 OT-I細胞暴露于分泌的分子伴侶熱休克蛋白和腫瘤特異性卵清蛋白的組合導致OT-I從所有CD8細胞的0.5%的起始比例擴增到超過50%。因此，與 利用完整卵清蛋白的交叉初免相比，gp96-Ig-卵清蛋白對CD8纟田胞的 交叉初免增強了 10,000到1,000,000倍。參見實施例19和圖10和12。 還可參見Am J Reprod Immunol. 2002 Oct;48(4):220-5。當OT-ICD8細胞利用gp96-Ig-卵清蛋白交叉初免時，在TNRF25 激動劑抗體4C12存在的條件下，OT-I CD8擴增相對于對照抗體額外 增加10倍。但是，當OT-I CD8細胞利用gp96-Ig-卵清蛋白交叉初免 時，在TL1A封閉抗體L4G6存在的條件下，OT-I CD8擴增相對于對 照抗體減少10倍。參見圖11。因此，TNFR25激動劑是肺瘤疫苗有效的生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑，因為 它們增強T細胞活化和對腫瘤特異性抗原的細胞免疫應(yīng)答，而TNFR25 拮抗劑阻斷或者抑制T細胞活化。因此，本發(fā)明另一個方面涉及增強 腫瘤疫苗效果的方法和治療劑。腫瘤疫苗希望利用機體先天免疫系統(tǒng)的元件抵抗癌癥。腫瘤疫苗 包含一種或者多種腫瘤特異性抗原，并且可能包含佐劑和生物效應(yīng)調(diào) 節(jié)劑。腫瘤特異性抗原是基本上限于在腫瘤細胞內(nèi)和表面表達的多肽， 可用于刺激針對那些腫瘤細胞的免疫應(yīng)答。不同類型的疫苗用于治療 不同類型的癌癥。對于能夠用作疫苗的抗原組合物，抗原組合物必須 誘導針對細胞或者組織中抗原的免疫應(yīng)答。此處使用的"抗原組合物，， 可以包括抗原(例如，肽或者多肽)，編碼抗原的核酸(例如，抗原表達 載體)，或者表達或者展示抗原的細胞。參見美國公開號2003/0185840, 在此以參考的方式將其完整引入。生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(BRM)，已經(jīng)顯示上調(diào)T細胞免疫或者下調(diào)抑制 性細胞活性。這類BRM包括，但不限于，曱腈咪胍(CIM; 1200mg/d) (Smith/Kline， PA);低劑量環(huán)磷酰胺(CYP; 300 mg/m2) (Johnson/Mead NJ)，細胞因子例如g-干擾素、IL-2或者IL-12或者編碼參與免疫輔助 功能蛋白的基因，例如B-7。在本發(fā)明這方面的一個實施方式中，胂瘤疫苗組合物包括腫瘤抗 原組合物和TNFR25激動劑。在另一個實施方式中，TNFR25激動劑是抗體4C12。在優(yōu)選的實施方式中，TNFR25激動劑作為生物效應(yīng)調(diào) 節(jié)劑添加到肺瘤疫苗中。更優(yōu)選的，TNFR25激動劑是抗體4C12。在 另一個實施方式中，腫瘤疫苗包含佐劑。腫瘤疫苗佐劑可能包括IL-1， IL-2， IL-4, IL-7, IL-12, 7-干擾素, GMCSP, BCG，氫氧化鋁，MDP化合物，例如thur-MDP和nor-MDP, CGP (MTP-PE)，類脂A,和單磷酸類脂A (MPL)。 RIBI也是一種佐劑， 其包含從細菌提取的3種成分MPL，海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和細 胞壁骨架(CWS)，這些成分溶于2%角鯊烯/ Tween 80乳劑中。甚至可 以使用MHC抗原。示范性的，通常優(yōu)選的佐劑包括完全弗氏佐劑(非 特異的免疫應(yīng)答激發(fā)劑，包含滅活的結(jié)核分枝桿菌)，弗氏不完全佐劑 和氫氧化鋁佐劑。疫苗的制備在本領(lǐng)域通常是公知的，所述疫苗包含作為活性成分 的肽序列，如美國專利4,608,251 ; 4,601,903; 4，599，231; 4,599,230; 4,596,792;和4,578,770所示，均在此以參考方式引入。通常，這類疫苗制備為可注射的。還可以制備為液體溶液或者懸 浮液；在注射前適于溶解或者懸浮在液體中的固體形式。該制劑也可 以被乳化。經(jīng)常將活性免疫原性成分與賦形劑混合，所述賦形劑是藥 學可接受的并且和活性成分相容。合適的賦形劑是，例如，水，鹽水， 葡萄糖，甘油，乙醇，或者類似物和其組合。此外，如果需要，疫苗 可能包含少量輔助物質(zhì)例如濕潤劑或者乳化劑，pH緩沖劑，或者增強 疫苗效力的佐劑。8. TNFR25免疫毒素作為先天抗肺瘤免疫應(yīng)答的間接增效劑許多科學家和公司研究€04+/€025+丁調(diào)控細胞(丁^經(jīng)3)，因為它 們對多種疾病治療的廣泛潛在影響。盡管許多人暴露于相同的環(huán)境變 態(tài)反應(yīng)原，對變態(tài)反應(yīng)原的致敏性也是常見的，但是只有一小部分人 發(fā)展成變態(tài)反應(yīng)疾病例如孝喘。其原因到目前還是不清楚的，但可能 與有效調(diào)控Tregs的存在相關(guān)，所述Tregs在健康的變態(tài)反應(yīng)原暴露的 個體中抑制氣道炎癥。因此，已知Treg有助于保持對自身和非自身的 外周耐受。但是，根據(jù)記載Treg還阻礙機體抵抗癌癥的能力。在這些病例中，Treg干擾才幾體的腫瘤殺傷免疫細胞。因此，Tregs作用為專 注的抑制性細胞，可能在防止腫瘤中被免疫系統(tǒng)識別中起作用，所述 肺瘤例如頭和頸的鱗狀細胞癌。參見Br J Cancer, 2005 Mar 14;92(5):913陽20。本發(fā)明人已經(jīng)注意到Treg具有表明它們被活化的性質(zhì)。已經(jīng)報道 了 Tregs上表達其他TNF受體。GITR由活化的Tregs表達。已發(fā)現(xiàn)它 的連接終止Treg的抑制活性(Nocentini等人，Eur J Immunol.2005 Apr;35(4): 1016-22)。 TNFR25具有多種使其成為Treg細胞多能調(diào)節(jié)物 的性質(zhì)。a) TNFR25蛋白表達被PKC誘導的mRNA剪接快速上調(diào)； b)包括誘斜受體和顯性陰性形式的若干功能剪接形式允許調(diào)控的微 調(diào)；c)克羅恩氏病中TL1A表達表現(xiàn)出被高度調(diào)節(jié)；此外活化淋巴細 胞中的TL1A表達允許檢測淋巴細胞密度。最后，它們至少部分的通 過分泌TNFR25信號引發(fā)的細胞因子IL-10和IL-13來發(fā)揮它們的調(diào) 節(jié)功能。本發(fā)明人最先注意到FoxP3表達，CD4十/CD25+培養(yǎng)的Treg 表達非常高的TNFR25水平。因此，本發(fā)明人總結(jié)得出，TNFR25調(diào) 節(jié)Treg功能，并且TNFR25可以用作體內(nèi)耗盡Tregs的分子標簽。參 見實施例20 。此外，TNFR25激動劑消除Treg抑制。參見圖15。因此，本發(fā)明的另 一 個方面涉及可用于增加抗癌療法效能的方法 和治療劑，所述抗癌療法通過耗盡患者CD4+/CD25+ T調(diào)控細胞(Tregs) 來實現(xiàn)。在本發(fā)明這方面的一個實施方式中，利用免疫毒素耗盡Treg。 在該實施方式中，該免疫毒素具有對TNFR25特異的抗原結(jié)合部分； 并與毒性劑偶聯(lián)。在替代實施方式中，給患者提供與毒性劑偶聯(lián)的可 溶性TL1A。另一實施方式涉及具有化療劑和TNFR25特異性免疫毒 素的化療組合物。另 一實施方式涉及具有化療劑和與毒性劑偶聯(lián)的 TL1A的化療組合物。本發(fā)明的另一個方面涉及可用于增強抗癌療法效能的方法和治療 劑，通過提供患者TNFR25激動劑，減少CD4+/CD25+ T調(diào)控細胞 (Tregs)介導的的抑制來實現(xiàn)。9.作為抗炎劑的TNFR25激動劑利用缺失胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域的TNFR25顯性陰性形式(DN-TNFR25) 和缺失外顯子5和6的另 一種TNFR25剪接形式(delta 5,6-TNFR25)， 所述外顯子5和6編碼第四個胞外半胱氨酸富集域，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn) TNFR25功能是粘膜損傷后恢復體內(nèi)穩(wěn)態(tài)所需的。具體地，本發(fā)明人 在小鼠中在CD2啟動子調(diào)控下轉(zhuǎn)基因表達TNFR25的顯性陰性形式 (DN-TNFR25)。給予小鼠右旋葡聚糖硫酸鈉(DSS)來誘導結(jié)腸炎，作為 人克羅恩氏病的模型。在飲用含2。/oDSS的水5天后，野生型C57B1/6 小鼠出現(xiàn)結(jié)腸炎、腹瀉和體重減輕。但是，如果恢復為正常水，野生 型小鼠在一周內(nèi)康復并恢復體重，而DN TNFR25-tg表達小鼠患有與 野生型小鼠相似類型的疾病，但腹瀉顯得更嚴重。此外，恢復為正常 水不引起它們的康復。相反，所有DN TNFR-tg表達小鼠持續(xù)體重減 輕，在第二周內(nèi)死亡。表達TNFR25功能轉(zhuǎn)基因(全長TNFR25或者剪 接形式A5，6-TNFR25)的小鼠以類似于野生型小鼠的方式康復。參見實 施例21和22和圖14?？肆_恩氏病的現(xiàn)有治療利用抗炎劑，免疫抑制劑和TNF抑制劑。 所有這些都是針對癥狀的。刺激TNFR25信號向致病事件鏈中深入了 一步。活化的TNFR25刺激IL-10和IL-13產(chǎn)生，然后依次刺激TGF-|3 產(chǎn)生，引起穩(wěn)態(tài)的恢復。這種治療是能治愈的或者接近治愈的。因此，本發(fā)明的另一個方面涉及通過給藥患者治療量的TNFR25 激動劑來治療患者炎癥性腸病的方法。另 一個實施方式涉及通過升高 腸粘膜區(qū)域的IL-10水平來治療患者炎癥性腸病的方法。在另一個實 施方式中，TNFR25激動劑是抗體4C12。在另一個實施方式中，TNFR25 激動劑是TL1A的可溶性形式。在優(yōu)選的實施方式中，炎癥性腸病是 克羅恩氏病?？紤]到TNFR25激動劑的這種抗炎活性，本發(fā)明的另一個方面給 需要減輕炎癥的患者提供治療方法和治療劑。在一個實施方式中，給 藥患者包含TNFR25激動劑的組合物，以減輕炎癥和促進康復。在一 個實施方式中，給藥患者包含TNFR25激動劑4C12的組合物。這種 實施方式可用于減輕慢性炎癥應(yīng)答在細胞水平介導的疾病的癥狀，包 括心血管疾病(例如，動脈粥樣硬化)，自身免疫疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，多發(fā)性硬化(MS)，糖尿病(尤其是I型糖尿病)，強直性脊 柱炎，關(guān)節(jié)炎(特別是類風濕性關(guān)節(jié)炎)，哞喘和變態(tài)反應(yīng)，骨再吸收 病癥，眼科病癥包括-現(xiàn)網(wǎng)膜病，和纖維化疾病。10. TNFR25拮抗劑作為免疫抑制劑現(xiàn)在很多器官和組織可以常規(guī)的從一個人移植到另一個人。除了 供體和受體是單卵雙生的"相同"雙胞胎這種罕見情況以外，這類移植被稱作異源移植。對于從一個個體移植組織到另一個個體，其組織配 型是非常重要的，因為組織受體將對所有的非自身蛋白產(chǎn)生強烈的體 液和細胞免疫反應(yīng)。組織分型涉及鑒定供體和受體細胞上的MHC抗 原，并且利用與受體細胞有盡可能多的MHC等位基因的供體細胞。 對于成功的移植，MHC I類(尤其是HLA-B)和II類HLA-DR等位基因 的配型比其他MHC抗原的配型更重要；MHC配型比少量組織適合性 抗原的配型更重要。HLA配型提高移植存活率，但不能阻止排斥，甚至在MHC相同 的同胞兄妹中(除同卵雙生以外)。同種異體MHC被CD8 T細胞(I類) 或者CD4 T細胞(II類)識別；達到10%的T細胞能夠識別給定的同種 異體MHC，因為它類似于自身MHC+外源肽。移植成功的提高起因于增長的技術(shù)知識，更多進行HL A配型和縮 短器官運輸時間的移植中心的出現(xiàn)，和更多免疫抑制藥物(環(huán)孢子菌素 和他克莫司)的提供，所述免疫抑制藥物阻斷針對同種異體抗原的T細 胞活化。仍然存在的問題是器官短缺，現(xiàn)有疾病破壞移植器官的能力 (糖尿病和HB V感染是兩個實例)，免疫抑制藥物的副作用和高成本?？紤]到現(xiàn)有的阻斷T細胞活化的免疫抑制劑相關(guān)的主要副作用， 以及觀察到TNFR25拮抗劑例如TL1A封閉抗體L4G6是同源CD8 T 細胞克隆性增殖有效抑制劑(參見圖11，實施例19)，本發(fā)明的另一個 方面涉及TNFR25拮抗劑在預防組織排斥以促進組織移植中的用途。 在一個實施方式中，向移植受體提供TNFR25拮抗劑以抑制CD8 T細 胞的克隆性增殖和減輕TNFR25對T-regs的抑制，所述CD8 T細胞攜帶同種異體抗原特異性T細胞受體(TCRs)。在另一個實施方式中， TNFR25拮抗劑和免疫抑制劑一起提供給移植受體。實施例實施例1: i咅養(yǎng)基和試劑細胞在IMDM必需培養(yǎng)基(Invitrogen)中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基添加 10%熱滅活FBS (Invitrogen)， 10/xg/ml慶大霉素(Invitrogen),和50/iM /5-巰基-乙醇(Bio-Rad)。從2C11和OKT3細胞系(ATCC, Manassas， VA)的培養(yǎng)上清中分別純化單克隆抗小鼠CD3和抗人CD3。單克隆抗 小鼠CD28和抗人CD28購自eBioscience(San Diego， CA)， ConA， PHA 和LPS購自Sigma (St， Louis, MO)。重組鼠IL誦2來自BioSource Intematkmal(Camarillo， CA)。 PMA,伊屋諾霉素，H7，和放線菌酮 購自Calbiochem(San Diego， CA)。直接偶聯(lián)的單克隆抗體，包括FITC-CD4， Cychrome-CD4， PE-CD8a, Cychrome-CD8A FITC-B220, PE-B220, FITC-CD25, PE-CD1 lc， PEDX5， FITC- CD3， PE-NK1.1， PE誦Annexin V和7-AAD購 自BD/PharMingen (San Diego, CA)。倉鼠IgG對照購自eBioscience。實施例2:抗mTNFR25和mTL 1A單克隆抗體的產(chǎn)生用弗氏佐劑中的50]Lig mTNFR25-Ig或者mTLlA-MBP(麥芽糖結(jié) 合蛋白)腹腔內(nèi)免疫亞美尼亞倉鼠，每隔兩周一次，共3次。在融合前 3天，倉鼠用相應(yīng)蛋白靜脈內(nèi)加強免疫。利用ClonaCell-HY試 劑盒(StemCell Technologies Inc.，BC, Canada)，在PEG存在條件下，倉 鼠脾細胞與鼠骨髓瘤SP20融合，然后種在基于曱基纖維素的培養(yǎng)基 中兩周。挑選1千個集落，在包被免疫融合蛋白或者對照蛋白-Ig融 合蛋白的板上通過ELISA進行分析。通過流式細胞術(shù)和Western印跡， 檢驗陽性克隆的上清液檢測轉(zhuǎn)染細胞中mTNFR25亞型的能力。在蛋 白G柱上/人Nutridoma國SP(Roche， Indianapolis, IN)上清液中純化抗體， 在PBS中透析，過濾除菌。實施例3:流式細胞術(shù)分析mTNFR25和mTL 1A的表達從獨立實驗所標的淋巴器官中制備單細胞懸浮液。在染色前，細 胞用純化的抗小鼠CD16/CD32 (Fc-7lII/II受體；BD)和純化的人IgG (Jackson ImmunoResearch， West Grove, PA)處理以封閉與FcR的非特 異結(jié)合。在4°C細胞用亞美尼亞倉鼠抗小鼠TNFR25或者抗小鼠TL1A 染色30分鐘。細胞在FACS緩沖液(包含0.5% BSA和2mM EDTA的 PBS)中洗滌，然后用生物素標記的山羊抗亞美尼亞倉鼠IgG(杰克遜 immunoresearch)在4。C染色30分鐘。洗滌細胞，然后用鏈霉親和素-PE 或者鏈霉親和素-Cychrome(BD)在4。C染色30分鐘。洗滌細胞，然后 用針對不同細胞群的直接偶聯(lián)的細胞表面標志物標記。利用Becton Dickinson FACS LSR裝置和CELLQuestTM軟件對樣本進行分析。實施例4: RT-PCRmTNFR25剪4妻形式的鑒定利用Micro Fast-Track試劑盒 (Invitrogen， Carlsbad, CA)從鼠細胞系或者組織中提取信使RNA,利用 Superscript II試劑盒(Invitrogen)對cDNA進行逆轉(zhuǎn)錄。利用TOPO克 隆試劑盒(Invitrogen)將RT-PCR產(chǎn)物亞克隆入PCR II載體，通過DNA 測序確認為mTNFR25的剪接形式。使用下列引物進行鼠TNFR25的 剪接分析。上游引物，外顯子2: CAG TGA GTC CCA GAA GAG GT (SEQ ID NO: 8);下游引物，外顯子7: GGA TAG CCC CAA AAA GGA AC (SEQ ID NO: 9);上游引物，外顯子7: TCC TTT TTG GGG CTA TCC TG (SEQ ID NO: 10);下游引物，外顯子10: GGT ATT TCT CCA TGA CGC TT (SEQ ID NO: 11)。對活化誘導的人TNFR25其他剪接進行分析，因為在小鼠中不同 剪接形式的PCR產(chǎn)物更難在瓊脂糖凝膠中區(qū)分，但對人類剪接形式似 乎是相似的。使用下列PCR引物。上游外顯子4: TTC ACC CTT CTA CTG CCA AC (SEQ ID NO: 12);下游，外顯子7: TAA CCA GGG GCT TGT GAG GC (SEQ ID NO: 13)。利用Ficoll Hypaque密度梯度離心, 從健康供體分離人外周血單個核細胞。每份樣本中5百萬個細胞用 PHA (5pg/ml),或者固定的抗-CD3 (OKT3, 5yg/ml)和抗-CD28(1/Ag/ml),或者PMA(10ng/ml)和伊屋諾霉素(400ng/ml)活化。在指定時 間點收集細胞，提取mRNA,利用Invitrogen試劑盒轉(zhuǎn)換為cDNA。 人/3-肌動蛋白被用作內(nèi)參。利用Molecular Analyst軟件(BioRad)的幫 助完成PCR產(chǎn)物的定量。實施例5:轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生利用限制酶位點EcoR I和Sal I,將鼠TNFR25構(gòu)建體克隆為在人 CD2啟動子和局部控制區(qū)(Dr. A. Singer, NIH惠贈)的調(diào)控下。利用校 正酶，通過PCR產(chǎn)生3個mTNFR25構(gòu)建體。所述構(gòu)建體是鼠TNFR25 的全長分子(FL TNFR25),缺失第5和第6外顯子的TNFR25剪接變 異體(A5,6 TNFR25)，和在^,膜結(jié)構(gòu)域末端終止并缺失完整胞內(nèi)結(jié)構(gòu) 域的TNFR25顯性陰性形式(DN TNFR25,如1-234)。通過測序確^人 PCR產(chǎn)物的序列。利用邁阿密大學醫(yī)學院的轉(zhuǎn)基因設(shè)備將DNA顯微 注射入授精卵。對來自尾部活組織切片的DNA進4亍PCR，篩選潛在 的原代小鼠。引物對位于克隆位點的上游和下游，因此對所有的 mTNFR25轉(zhuǎn)基因使用相同的引物。上游引物是5' CGC TCT TGC TCT CTG TGT ATG 3' (SEQ ID NO: 14)，下游引物是5' CTG CCA GCC CTC TTC CAT C 3' (SEQ ID NO: 15)。通過半合子轉(zhuǎn)基因動物與野生型 C57BL/6J小鼠的系列交配，轉(zhuǎn)基因小鼠培育成C57BL/6J背景 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)。所有小鼠在6-12周齡使用， 在無病原體的設(shè)備中飼養(yǎng)。邁阿密大學動物動物實驗管理委員會 (University of Miami Animal Care and Use Committee)杏匕;隹戶斤有6勺動if勿 使用步驟。實施例6:核提取物制備和NFkB活化的電泳遷移率變動分析107個EL4-A5,6 TNFR25或者EL4-FL TNFR25細胞用可溶性或者膜結(jié)合TL1A或者用TNFR25激動型抗體4C12進4亍處理，如圖例所示，然后在800 g離心，5分鐘進行收集。利用小量制備實驗方法分離核提取物，按照文獻所述(Harhaj， E.W.等人Virology 333, 145-58 (2005)進行EMSA。核l是取物(6/ig)在室溫下與32P標記的高親合力kB探針孵育20分鐘，然后在非變性5%聚丙 烯酰胺凝膠上解離DNA-蛋白復合物。實施例7: T細胞增殖檢測脾細胞以lxl05細胞/孔濃度種于96孔平底板，設(shè)3個重復孔。利 用具有或者不具有可溶性抗-CD28 (1]tig/ml)條件下的固定抗 -CD3(2/ig/ml),或者ConA (5gg/ml)或者PMA (1 /xg/ml)和伊屋諾霉 素(400ng/ml)活化細胞。為了 T細胞增殖，1 x 105細胞/孔的純化CD4 T 細胞或者5"04細胞/孔的純化CD8 T細胞用包被的抗-CD3 (2 /xg/ml) 和可溶性抗-CD28 (1 pg/ml)進行刺激。在培養(yǎng)基中添加指定實一驗的 1000U/ml的重組mlL-2。細胞培養(yǎng)72小時，用l/xCi/孔3H-胸腺嘧咬 核苷(Perkin Elmer， Boston, MA)脈沖孵育的最后6個小時，并利用閃爍 計數(shù)器定量胸腺嘧啶核苷摻入。按照制造商的實驗步驟，利用SpinSep試劑盒(StemCell Technology Inc.),通過陰性選擇從脾細胞和/或淋巴結(jié)純化鼠CD4或者 CD8或者T細胞。利用FACS分析檢測，純度通常在90%-96%左右。實施例8:利用DNP-KLH對小鼠的免疫，抗體同種型的確定，和細 胞因子ELISA成年(6-10周齡)轉(zhuǎn)基因和野生型小鼠在腹膜內(nèi)用lOOpg DNP偶聯(lián) 的鑰孔血藍蛋白(DNP-KLH) (CalBiochem)進行免疫。免疫1周和3周 后，從小鼠取血，分離血清，按照制造商的實驗步驟(BD)利用ELISA 對抗DNP特異性IgGl 、 IgE和IgG2a抗體進行分析。來自單獨動物的 血清被吸附到包被0.8/ig/ml DNP-白蛋白(DNP-BSA)(CalBiochem)的96 孔板，利用ELISA檢測結(jié)合抗體的同種型。為^f企測細胞培養(yǎng)上清液中的細胞因子產(chǎn)生，按照制造商的說明書 進4亍夾心ELISA。利用來自BD的抗體對進刊-IL-2， IFN-7,和IL-4分析。 用于IL-13 ELISA的試劑購自R&D Systems (Minneapolis, MN),用于 IL-5和IL-10 ELISA的試劑購自eBioscience。實施例9: CD4 T細胞體外極化為Thl或者Th2細胞如上所述利用陰性選擇純化CD4 T細胞。單獨利用固定的抗 -mCD3 (2/zg/ml)和可溶性-mCD28 (1/xg/ml),或者在IL- 12 (10ng/ml) 和抗-mlL-4 (20/xg/ml)存在的條件下用于Thl分化，或者利用IL-4 (10ng/ml),抗-mlFN-7 (10gg/ml)，和抗-mlL-12 (10/ig/ml)作用7天對 CD4T細胞進行活化。收集細胞，洗滌，以lxl()S細胞每孔重新種板， 用固定的抗CD3再刺激。24小時后收集上清，利用ELISA評價細胞 因子的產(chǎn)生。實施例10:用于變應(yīng)性孝喘鼠模型的免疫實驗方法按照前述產(chǎn)生和回交至少七代得到C57BL/6J背景的DN TNFR25-tg (SEQ ID NO: 16編碼)，A5,6 TNFR25-tg,和FL TNFR25-tg 小鼠與購自國家癌癥研究所(Frederick， MD)的野生型C57BL/6J小鼠進 行比較。在第0天通過腹膜內(nèi)注射66/ig卵清蛋白(結(jié)晶的雞卵清白蛋 白，等級V; Sigma)致敏小鼠，所述卵清蛋白吸附于6.6 mg硫酸鋁 鉀(明礬；Sigma)，溶于200/d PBS。在第5天，在腹膜內(nèi)用相同劑量 的卵清蛋白和明礬對小鼠加強免疫。在第12天，利用超聲霧化器 (MABIS Healthcare Inc., Lake Forest, IL)，用溶于PBS的0.5%卵清蛋 白對小鼠進行氣霧劑刺激。在單一氣霧劑暴露后3天，測定小鼠肺的 變態(tài)反應(yīng)性炎癥。通過C02的吸入處死小鼠。在套管插入氣管后，用 lml PBS灌洗肺4次。計數(shù)從BAL液體回收的纟田胞，用于細胞涂片制 備(50，000個細胞或者更少/載玻片)。對每個用Wright-Giemsa染色 (Sigma)的細胞涂片計數(shù)〉200個細胞，以確定巨噬細胞、嗜酸性粒細 胞、淋巴細胞和中性粒細胞的不同細胞數(shù)目。實施例11:肺部組織結(jié)構(gòu)在支氣管灌洗步驟后從小鼠摘除肺，固定于10%中性緩沖福爾馬 林中。樣本送交邁阿密大學醫(yī)學院Sylvester癌癥中心的組織病理學核 心實驗室，在那里標本被包埋、切片并用蘇木精和曙紅染色。切片還 用過碘酸-席夫(PAS染色)以4全測粘液產(chǎn)生。實施例12:用于血清總IgE和卯清蛋白特異性Ig的ELISA在致敏前(第0天)，氣霧劑刺激后3天(第15天)和在一些實驗中 氣霧劑刺激前1天(第11天)，從小鼠取血。根據(jù)制造商的實驗方案(BD) 通過ELISA定量總IgE水平。通過首先用溶于PBS的0.01% OVA包 被板，隨后加入稀釋的血清樣本，然后加入第二生物素標記的抗IgE 抗體(BD),在夾心ELISA中檢測卯清蛋白特異性IgE。實施例13:支氣管淋巴結(jié)細胞的體外再刺激和細胞因子產(chǎn)生。在氣霧劑刺激后1天或者3天，收集支氣管淋巴結(jié)，制備單細胞 懸浮液。細胞種于圓底96孔板，口106細胞/孔，添加100/ig/ml卯清 蛋白培養(yǎng)4天。然后按照所述收集上清用于細胞因子ELISA檢測。實施例14:細胞毒性檢測在"Cr標記的P815-TNFR25轉(zhuǎn)染靶細胞中添加系列稀釋的可溶性 mTLlA上清，所述上清從P815-TL1A轉(zhuǎn)染細胞中收集。為檢驗TL1A 阻斷活性，在培養(yǎng)物中添加不同的抗TL1A單克隆抗體，4小時后枱r 觀'JCr釋放，每個樣本重復3次。在只包含51Cr標記靶細胞的孔中計 算自發(fā)釋放。在包含51Cr標記靶細胞和1% SDS的孔中計算100%釋 放(陽性對照)。細胞毒活性的百分比按如下方式計算(樣本的平均讀 數(shù)_自發(fā)釋放的平均讀數(shù))/陽性對照的平均讀數(shù)。從EL4-轉(zhuǎn)化子 (transfetants)也獲得相似數(shù)據(jù)。實施例15:拮抗性抗mTLlA抗體對肺部炎癥的阻斷在第0天和第5天腹膜內(nèi)用明礬中的卵清蛋白對小鼠進行致敏， 然后在第12天用溶于PBS的0.5%卵清蛋白進行氣霧劑刺激1小時。 從第11到14天，通過每天腹膜內(nèi)注射50gg/小鼠，給予小鼠L4G6或 者相同量的對照倉鼠IgG(Jackson Immuno Research)。第15天對變態(tài) 反應(yīng)肺部炎癥進行評估。實施例16: NKT細胞的過繼轉(zhuǎn)移Jcd8 k.o.小鼠(Cui， J.等人Science 278， 1623-6 (1997》由Michael Lotze (U. Pittsburgh)惠贈，獲得M. Taniguchi (Ciba University, Japan) 的允許。根據(jù)制造商的說明書，利用EasySep小鼠通用NK陽性選擇 試劑盒(StemCell Technologies, Vancouver, Canada)通過陽性選擇，乂人 10只小鼠匯集的脾細胞中分離野生型和DN TNFR25-tg小鼠的NKT 細月包。實施例17:統(tǒng)計分析通過GraphPad Prism Software (San Diego, CA)進行利用雙尾 Student's t檢驗的統(tǒng)計分析；p<0.05被認為是顯著的。文中數(shù)據(jù)顯示為 平均值士標準誤。實施例18: DR3和TLIA抗體的產(chǎn)生產(chǎn)生、純化DR3-Ig融合蛋白，并用于免疫倉鼠。獲得雜交瘤上清， 利用DR3-Ig融合蛋白作為篩選劑通過ELISA進行篩選。通過DR3轉(zhuǎn) 染腫瘤細胞的流式細胞術(shù)，通過Western印跡和通過功能研究，確認 雜交瘤的性質(zhì)。所有抗體都能利用FACS在轉(zhuǎn)染細胞中檢測到全長和 其他剪接的DR3， 一種抗體在Western印跡中檢測到DR3,而抗體(4C12) 顯示激動型活性，在TL1A缺失的情況下調(diào)節(jié)DR3信號。通過用TLlA-麥芽糖-結(jié)合-蛋白融合免疫倉鼠，獲得TL1A單克 隆抗體。通過流式細胞術(shù)TL1A抗體檢測到轉(zhuǎn)染的TL1A?？贵w(L4G6) 顯示拮抗活性，阻斷TL1A結(jié)合DR3。實施例19:通過TNFR25的信號傳遞增強CD8交叉初免Strbo等人(Am J Reprod Immuno1.2002 Oct;48(4):220-5)最近描述 了一種基于新熱休克蛋白gp96的系統(tǒng)，該系統(tǒng)在體內(nèi)調(diào)節(jié)強的、抗原 特異性CD8-CTL擴增。在該模型系統(tǒng)中，釋放的gp96-Ig(被工程化進 行分泌)活化4對突狀細胞，并為CD8細月包的交叉呈遞和交叉初免^是供 分子伴侶肽(圖12)。該系統(tǒng)非常有用，因為它不需要CD4的幫助。分泌的gp96通過CD91和TLR2/4提供DC的活化信號，所述TLR2/4 另由CD4細胞上的CD40-L提供。因此，在CD40-L缺陷小鼠中，該 系統(tǒng)的CD8(0T-I)擴增正常進行。它已經(jīng)被用于研究粘膜免疫和檢測 TNFR25在CD8擴增中的功能。EG7-gp96是利用卵清蛋白和gp96-Ig轉(zhuǎn)染，源自EL4淋巴瘤的細 胞系。該細胞分泌與卵清蛋白肽相關(guān)的gp96-Ig。與單獨的卵清蛋白相 比，用gp96-Ig作為分子伴侶的卵清蛋白-肽增強CD8細胞的交叉初免 (圖IO)達大約IO，OOO倍。100ngova-gp96-Ig擴增B6小鼠中的OT-I， 從轉(zhuǎn)移后CD8細胞中0.5%的比例到EG7-gp96-Ig免疫后脾中20%的 比例。為了檢測TNFR25信號對CD8擴增的影響，如上所述的TCR轉(zhuǎn) 基因OT-I模型，與EG7-gp96-Ig介導的刺激一起使用。為了檢測 TNFR25信號的作用，小鼠在EG7-gp96-Ig免疫后24小時和72小時， 接受激動型抗TNFR25抗體(4C12)， TNFR25結(jié)合^旦非激動型抗體 (L4G6)或者對照IgG。在免疫后第5天監(jiān)測腹膜腔中的OT-I擴增。通 過EG7-gp96-Ig， 4C12造成細胞招募入腹膜腔的增加，導致細胞數(shù)目 的加倍。此外，4C12還特異的引起OT-I擴增超過8倍的增加。L4G6 抗TNFR25抗體不誘導細胞招募入腹膜腔的增加，并抑制OT-I擴增。這些數(shù)據(jù)顯示激動型抗TNFR25抗體共刺激CD8細胞和/或通過 TNFR25抑制Treg的抑制作用。TNFR25對初始T細胞的共刺激導致 增加的增殖和二級活化時的Th2極化。此外，T調(diào)控細胞中的TNFR25 信號傳遞導致它們對抑制(suppression)的臨時抑制(inhibition)。該組合 效應(yīng)然后導致增加的CD8擴增和細胞募集，如圖ll所示。實施例20: CD4+CD25+T調(diào)控細胞表達高水平的TNFR25為了檢測TNFR25的表達，通過CD4細胞的陰性選擇然后用抗 CD25 ;茲力分選，從脾中純化CD4+CD25 Tregs。用抗CD3、抗CD28 珠子培養(yǎng)細胞，珠子與細胞的比例為3:1，添力。2000u/ml人IL-2。在這些條件下細胞將在3-4天后開始增殖，持續(xù)擴增大約3周。培養(yǎng)的 細胞然后通過FACS進行CD4和CD25的分析，通過胞內(nèi)流式細胞術(shù)進行FoxP3表達和TNFR25表面分析。圖13顯示利用該方法得到的 Tregs基本上是純的，表達FoxP3和TNFR25。實施例21: TNFR25阻斷引起右旋葡聚糖硫酸鈉結(jié)腸炎的致死性右旋葡聚糖硫酸鈉(DSS)模型被廣泛用作結(jié)腸炎模型，該模型在一 些方面代表克羅恩氏病。初始損傷是DSS對通透性屏障的破壞作用， 所述通透性屏障通常由腸上皮提供。DSS的這種作用允許正常腸道菌 群到達粘膜免疫系統(tǒng)中的部位，這引起了類似克羅恩氏結(jié)腸炎的炎性 免疫反應(yīng)。在暴露包含2% DSS的^t用水的8天期間，野生型(wt)B6 小鼠患有腹瀉和體重減輕。當恢復為正常水時，B6小鼠康復并恢復它 們的正常體重。TNFR25還影響結(jié)腸炎疾病的病程。在本實^^中，野 生型和轉(zhuǎn)基因小鼠暴露2% DSS水共7天。如圖14所示，DN TNFR25-tg 小鼠患有類似于野生型小鼠的疾病，但是當恢復為正常水時，DN TNFR25-tg小鼠沒有康復，不同于野生型小鼠。相反，DNTNFR25-tg 小鼠持續(xù)體重減輕，在第12和16天之間死亡。A5,6-TNFR25-tg小鼠 類似于野生型小鼠，盡管一只小鼠的死亡可能還顯示了被干擾的免疫 應(yīng)答。得出兩個結(jié)i侖在DN TNFR25-tg小鼠中，繼發(fā)免疫應(yīng)答比在 野生型小鼠中更強，導致致死性，而野生型小鼠正常健康和穩(wěn)態(tài)的恢 復取決于功能正常的T調(diào)控(Treg)細胞。DN TNFR25-tg小鼠中Treg 功能被干擾。后一結(jié)論是很可能的，因為眾所周知通過保持對養(yǎng)分和 正常腸道菌落的耐受和對腸病原體的免疫應(yīng)答之間的正確平衡，Treg 功能對保持粘膜免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)非常重要。實施例22:用EG7-gp96-Ig的免疫誘導OT-I細胞遷移到粘膜部位派氏 淋巴結(jié)，固有層淋巴細胞(LPL)和上皮內(nèi)淋巴細胞(IEL)如圖16所示(右列)，EG7細胞不能造成OT-I的克隆性增殖或者 遷移到粘膜部位。另一方面EG7細胞分泌gp96-Ig引起脾、淋巴結(jié)和 腹膜腔中OT-I的克隆性增殖(未顯示)和它們到粘膜部位的遷移(圖 16)。在派氏淋巴結(jié)中，8%的細胞為CD8+， 6.7%的CD8細胞是OT-I; 在IEL中，61%的細胞是CD8+， 9%的CD8是OT-I。在LPL中，29%的CD8纟曰胞是OT-I。免疫后遷移到IEL的OT-I纟田月包是oEb7+和"4/37+ 但保留CD8W和TCRc^，不像殘留的CD8 IEL，其大多數(shù)是CD8aa 和50% TCK/yS。本文只描述了本發(fā)明優(yōu)選的實施方式和其通用性的幾個實施例。 應(yīng)當理解本發(fā)明能夠在不同的其他組合和環(huán)境中使用，能夠在此處表 述的發(fā)明構(gòu)思范圍內(nèi)進行改變或者改進。因此，例如，僅僅利用常規(guī) 試驗方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員就將識別，或者能夠確定，此處描述的具 體物質(zhì)和方法的很多等同物。這類等同物被認為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.結(jié)合腫瘤壞死因子受體25(TNFR25)抗原的分離的抗體，其中所述抗體能夠作為TNFR25激動劑。
2. 如權(quán)利要求1所述的抗體，其中當利用gp96-Ig-卵清蛋白交叉 初免時，所述抗體相對于對照抗體能夠增強OT-ICD8細胞的擴增。
3. 如權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述肺瘤壞死因子受體 25(TNFR25)抗原是人或者小鼠的。
4. 腫瘤壞死因子受體25(TNFR25)特異性毒素，包括與結(jié)合 TNRF25受體的多肽連接的毒性劑。
5. 如權(quán)利要求4所述的毒素，其中所述多肽包括單克隆抗體4C12 或者其免疫特異性部分。
6. 如權(quán)利要求4所述的毒素，其中所述毒性劑選自放射性同位素， 蓖麻毒，相思豆毒素，白喉毒素，假單胞菌屬外毒素和金屬離子。
7. 如權(quán)利要求4所述的毒素，其中所述多肽包括其TNFR25-結(jié)合 部分的TL1A蛋白。
8. 活化細胞中表達的腫瘤壞死因子受體25(TNFR25)受體的方法， 包括a.將細胞與TNFR25激動劑接觸，其中所述激動劑選自i. 單克隆抗體4C12;ii. 結(jié)合腫瘤壞死因子受體25(TNFR25)的抗體，其中當利用 gp96-Ig-卵清蛋白交叉初免時，所述抗體相對于對照抗體能夠增加 OT-I CD8細胞的擴增；iii. 可溶性TL1A;iv. 具有能夠驅(qū)動TNFR25激動劑抗體轉(zhuǎn)基因表達的表達盒的表 達載體；v. 具有能夠驅(qū)動可溶性TL1A轉(zhuǎn)基因表達的表達盒的表達載體；和vi. 具有能夠驅(qū)動TNFR25轉(zhuǎn)基因表達的表達盒的表達載體； b.觀察TNFR25受體信號傳遞的增強。
9. 結(jié)合肺瘤壞死因子受體25(TNFR25)抗原的分離的抗體，其中 所述抗體能夠作為TNFR25拮抗劑。
10. 如權(quán)利要求9所述的抗體，其中當利用gp96-Ig-卵清蛋白交叉 初免時，其中所述抗體相對于對照抗體能夠減弱OT-I CD8細胞的擴增。
11. 如權(quán)利要求9所述的抗體，其中所述腫瘤壞死因子受體 25(TNFR25)抗原是人或者小鼠的。
12. 抑制細胞中肺瘤壞死因子受體25(TNFR25)受體信號傳遞的方 法，包括a.將細胞與TNFR25拮抗劑接觸，其中所述拮抗劑選自i. 單克隆抗體L4G6ii. 結(jié)合肺瘤壞死因子受體25(TNFR25)的抗體，其中當利用 gp96-Ig-卯清蛋白交叉初免時，所述抗體相對于對照抗體能夠減弱 OT-I CD8細胞的擴增；iii. 對可溶性TL1A特異的抗體；iv. 包括TNFR25胞外部分的融合蛋白；體；表達載體；及vi.具有能夠驅(qū)動L4G6轉(zhuǎn)基因表達的表達盒的表達載體； b.觀察TNFR25受體信號的減弱。
13. 肺瘤疫苗，包括肺瘤抗原和作為生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑的TNFR25 激動劑。
14. 如權(quán)利要求12所述的腫瘤疫苗，其中所述TNFR25激動劑選自a. 單克隆抗體4C12;b. 結(jié)合肺瘤壞死因子受體25(TNFR25)的抗體，其中當利用 gp96-Ig-卯清蛋白交叉初免時，所述抗體相對于對照抗體能夠增加 OT-I CD8纟田月包的擴增；c. 可溶性TL1A;d. 具有能夠驅(qū)動TNFR25激動劑抗體轉(zhuǎn)基因表達的表達盒的表達 載體；e. 具有能夠驅(qū)動可溶性TL1A轉(zhuǎn)基因表達的表達盒的表達載體；及f. 具有能夠驅(qū)動TNFR25轉(zhuǎn)基因表達的表達盒的表達載體。
15. 如權(quán)利要求14所述的腫瘤疫苗，還包括佐劑。
16. 對患者進行免疫抵抗腫瘤的方法，包括從所述肺瘤分離腫瘤 特異性抗原；和給藥患者權(quán)利要求14所述的腫瘤疫苗。
17. 治療患者癌癥的方法，包括通過給予患者包含如權(quán)利要求4 所述毒素的組合物，去除患者的CD4十/CD"+T調(diào)節(jié)細胞(Tregs);和給予患者化療劑。
18. 治療和/或預防腸炎癥的方法，包括給予有需要的患者有效量的包括TNFR25激動劑的治療組合物。
19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述腸炎癥選自炎癥性腸 病，克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎。
20. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述TNFR25激動劑選自a. 可溶性TL1A;b. 單克隆抗體4C12;c. 具有能夠驅(qū)動TNFR25激動劑抗體轉(zhuǎn)基因表達的表達盒的表達 載體；d. 具有能夠驅(qū)動可溶性TL1A轉(zhuǎn)基因表達的表達盒的表達載體；和e. 具有能夠驅(qū)動TNFR25轉(zhuǎn)基因表達的表達盒的表達載體。
21. 便利器官移植的治療組合物，包括TNFR25拮抗劑和免疫抑 制劑。
22. 如權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述免疫抑制劑選自糖皮 質(zhì)激素，咪唑硫嘌呤，氨曱蝶呤，環(huán)孢子菌素，環(huán)磷酰胺，琉基嘌呤， 他克莫司和霉酚酸酯。
23. 如權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述TNFR25拮抗劑選自a. 單克隆抗體L4G6b. 結(jié)合腫瘤壞死因子受體25(TNFR25)的抗體，當利用gp96-Ig-卵清蛋白交叉初免時，所述抗體相對于對照抗體能夠減弱OT-I CD8 細胞的擴增；c. 對可;容性TL1A特異的抗體；d. 包括TNFR25胞外部分的融合蛋白；體；f. 具有能夠驅(qū)動可溶性TL1A特異性抗體轉(zhuǎn)基因表達的表達盒的 表達載體；及g. 具有能夠驅(qū)動L4G6轉(zhuǎn)基因表達的表達盒的表達載體。
24. ;人供體移才直組織到宿主的方法，包括a. 從所述供體獲得所述組織；b. 給予所述宿主如權(quán)利要求21所述的組合物；c. 移植所述組織到所述宿主。
25. 抑制同源CD8 T細胞群的克隆性增殖的方法，包括a. 將所述CD8T細胞暴露于它們的同源抗原；和b. 將所述CD8 T細胞暴露于TNFR25拮抗劑。
26. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述TNFR25拮抗劑選自a. 單克隆抗體L4G6b. 結(jié)合肺瘤壞死因子受體25(TNFR25)的抗體，其中當利用 gp96-Ig-卵清蛋白交叉初免時，所述抗體相對于對照抗體能夠減弱 OT-I CD8細胞的擴增；c. 對可溶性TL1A特異的抗體；d. 包括TNFR25月包外部分的融合蛋白；體；f. 具有能夠驅(qū)動可溶性TL1A特異性抗體轉(zhuǎn)基因表達的表達盒的 表達載體；及g. 具有能夠驅(qū)動L4G6轉(zhuǎn)基因表達的表達盒的表達載體。
27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述同源抗原與欲從供體移 植到宿主的組織有關(guān)。
28. 治療和/或預防肺部炎癥的方法，包括給予有需要的患者有效量的包括TNFR25拮抗劑的治療組合物。
29. 如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述炎癥狀態(tài)是。孝喘導致的。
30. 如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述TNFR25拮抗劑選自a. 單克隆抗體L4G6b. 結(jié)合肺瘤壞死因子受體25(TNFR25)的抗體，其中當利用 gp96-Ig-卵清蛋白交叉初免時，所述抗體相對于對照抗體能夠減弱 OT-I CD8細胞的擴增；c. 對可溶性TL1A特異的抗體；d. 包括TNFR25胞外部分的融合蛋白；體；f. 具有能夠驅(qū)動可溶性TL1A特異性抗體轉(zhuǎn)基因表達的表達盒的 表達載體；及g. 具有能夠驅(qū)動L4G6轉(zhuǎn)基因表達的表達盒的表達載體。
31. 包括多肽的分離的TNFR25拮抗劑，所述多肽由包括嚴緊條 件下與SEQ ID NOs: 4， 5， 6和/或16雜交的序列的核酸編碼，且其中 所述序列編碼能夠結(jié)合TL1A蛋白的氨基酸序列。
32. 如^K利要求31所述分離的TNFR25拮抗劑，其中所述序列在 嚴緊條件下與SEQ IDNO:4雜交。
33. 如權(quán)利要求31所述分離的TNFR25拮抗劑，其中所述序列在 嚴緊條件下與SEQ ID NO: 5雜交。
34. 如權(quán)利要求31所述分離的TNFR25拮抗劑，其中所述序列在 嚴緊條件下與SEQ IDNO:6雜交。
35. 如權(quán)利要求31所述分離的TNFR25拮抗劑，其中所述TL1A 是人TL1A。
36. 如權(quán)利要求31所述分離的TNFR25拮抗劑，其中所述TL1A 是小鼠TL1A。
37. 治療和/或預防肺部炎癥的方法，包括給予有需要的患者有效 量的包括如權(quán)利要求31所述TNFR25拮抗劑的治療組合物。
38. /人供體移植組織到宿主的方法，包括a. 從所述供體獲得所述組織；b. 給予所述宿主如權(quán)利要求31所述的TNFR25拮抗劑；c. 移^L所述組織到所述宿主。
39. 組合物，包括由嚴緊條件下與SEQ ID NOs: 3和/或7雜交的 序列編碼的多肽，且其中所述序列編碼能夠結(jié)合TNFR25受體蛋白的 氨基酸序列；和毒性劑。
40. 如權(quán)利要求39所述的組合物，其中所述毒性劑選自放射性同 位素，蓖麻毒，相思豆毒素，白喉毒素，假單胞菌屬外毒素和金屬離 子。
41. 治療患者癌癥的方法，包括通過給予患者包含如權(quán)利要求39 所述的毒素的組合物，去除患者的CD壯/CDM+T調(diào)節(jié)細胞(Tregs); 和給予患者化療劑。
42. 治療和/或預防腸炎癥的方法，包括給予有需要的患者有效量的治療組合物，所述組合物包括由嚴緊條件下與SEQ ID NOs: 3和/或 7雜交的序列編碼的多肽，且其中所述序列編碼能夠結(jié)合TNFR25受 體蛋白的氨基酸序列。
43. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述腸炎癥與過敏性腸綜合 4i相關(guān)。
44. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述腸炎癥與克羅恩氏病相關(guān)。
45. 腫瘤疫苗，包括肺瘤抗原和由嚴緊條件下與SEQ ID NOs: 3 和/或7雜交的序列編碼的多肽，且其中所述序列編碼能夠結(jié)合 TNFR25受體蛋白的氨基酸序列，所述多肽作為生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑。
46. 表達載體，包括嚴緊條件下與SEQ ID NOs: 3和/或7雜交的 核酸序列，且其中所述序列編碼能夠結(jié)合TNFR25受體蛋白的氨基酸 序列。
47. 表達載體，包括嚴緊條件下與SEQ ID NOs: 4, 5, 6和/或16 雜交的核酸序列，且其中所述序列編碼能夠結(jié)合TL1A蛋白的氨基酸 序列。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供利用免疫調(diào)節(jié)劑的新的組合物和方法，所述免疫調(diào)節(jié)劑能夠刺激或者間接增強免疫系統(tǒng)或者在其它情況下具有免疫抑制作用。本文公開的TNFR25激動劑具有抗炎和愈合作用。在其他情況下，它們可以用于治療哮喘和慢性炎癥引起的疾病，例如炎性腸疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩氏病(Crohn′s Disease)。本文公開的TNFR25拮抗劑能夠抑制CD8T細胞介導的細胞免疫應(yīng)答，例如能夠減輕組織移植后的器官或者組織排斥。本文公開的TNFR25激動劑代表生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑，當給予腫瘤疫苗時，所述生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑改變機體細胞免疫防御和癌細胞之間的相互作用以加強、指導或者修復機體抵抗癌癥的能力。本文公開的TNFR25特異性免疫毒素還能夠通過去除癌癥患者天然存在的免疫抑制細胞，增強化療方案的效果。
文檔編號A61K39/395GK101253199SQ200680031977
公開日2008年8月27日 申請日期2006年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月30日
發(fā)明者埃克哈德·泊達克, 瓦迪姆·德耶梧, 羅伯特·拉維 申請人:邁阿密大學