專利名稱：：以高親和力結(jié)合凝血酶的適體的制作方法200680031169.7以高親和力結(jié)合凝血酶的適體發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及核酸領(lǐng)域，更具體涉及能夠結(jié)合凝血酶的適體，其用作湊是血相關(guān)病癥和/或涉及n血酶的其它疾病或病癥的治療劑和診斷劑。本發(fā)明進一步提供了用于施用能夠結(jié)合凝血酶的適體的材料和方法。
背景技術(shù)：
：適體是通過經(jīng)典沃特森-克里克堿基配對外的相互作用對分子具有高度特異性結(jié)合親和力的核酸。類似于通過噬菌體展示或單克隆抗體("mAbs")產(chǎn)生的肽，適體能夠特異性結(jié)合于選定的靶，并且調(diào)節(jié)靶的活性，例如，通過結(jié)合適體，可以阻斷它們的耙起作用的能力。通過從隨機序列寡核苦酸集合的體外選擇過程產(chǎn)生，已經(jīng)制備了超過IOO種蛋白的適體，所述蛋白包括生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、酶、免疫球蛋白和受體。典型的適體大小是10-15kDa(30-45個核苦酸)，以亞納摩爾親和力結(jié)合其耙，并且區(qū)分密切相關(guān)的靶(如適體典型地不結(jié)合來自相同基因家族的其它蛋白)。一系列結(jié)構(gòu)研究證明了適體能夠利用相同類型的結(jié)合相互作用(如氫鍵鍵合、靜電互補、疏水接觸、空間排斥)，它們驅(qū)動抗體-抗原復(fù)合物中的親和力和高選擇性結(jié)合。適體具有許多用作治療劑和診斷劑需要的特征，包括高選擇性和親和力、生物效力和卓越的藥代動力學(xué)特性。此外，它們提供與抗體和其它蛋白生物相比特殊的竟?fàn)幮詢?yōu)勢，例如l)速度和控制。適體是通過完全體外的過程產(chǎn)生的，使得能夠迅速產(chǎn)生最初的前導(dǎo)物，包括治療前導(dǎo)物。體外選擇使得適體的選擇性和親和力能夠受到緊密控制，并且使得能夠產(chǎn)生前導(dǎo)物，包括抗毒性和非免疫原性靶的前導(dǎo)物。.2)毒性和免疫原性。適體類顯示了治療上可接受的毒性，并且缺乏免疫原性。在用高水平適體給大鼠或土撥鼠長期施用中(每日10mg/kg,持續(xù)90天)，通過臨床、細胞或生化測量沒有觀察到毒性。盡管通過對抗體自身的免疫應(yīng)答，可以顯著限制很多單克隆抗體的效力，5但產(chǎn)生針對適體的抗體是非常困難的J艮可能是由于適體不能通過MHC由T細胞呈遞，并且免疫應(yīng)答通常訓(xùn)練為不能識別核酸片段。3)施用。盡管大多數(shù)最近批準的抗體治療劑是通過靜脈輸注施用的(典型超過2-4小時)，但適體也可以通過皮下注射施用(在猴研究中，適體通過皮下施用的生物利用度〉80。/。(Tuckeretal，J.ChromatographyB.732:203-212,1999))。這種差異主要是由于相對低的溶解度，因此大多數(shù)治療性mAbs需要大體積。由于具有良好的溶解度(>150mg/mL)和相對低的分子量(適體:10-50kDa;抗體150kDa)，可以通過以小于0.5mL的體積注射而送遞適體的每周劑量。此外，適體的小體積使得它們能夠穿透到不允許抗體或抗體片段穿透的構(gòu)象阻塞區(qū)，提供了基于適體的治療或預(yù)防的另一優(yōu)點。4)規(guī)模性和花費。治療性適體是化學(xué)合成的，因此可以容易地根據(jù)生產(chǎn)需要而按規(guī)模生產(chǎn)。盡管規(guī)模生產(chǎn)的困難目前限制了一些生物制品的可獲得性，并且大規(guī)模蛋白生產(chǎn)廠的資金花費是巨大的，但單個大規(guī)沖莫寡核苷酸合成儀可以生產(chǎn)100kg/年以上，并且僅僅需要相對適度的資金投入。5)穩(wěn)定性。治療性適體是化學(xué)上穩(wěn)定的。它們本質(zhì)上適于在暴露于諸如熱和變性劑的因子后重新獲得活性，并且能夠在室溫下作為凍干粉末長期儲存(〉1年)。凝血酶凝血酶是一種多功能蛋白酶，其具有促凝和抗凝活性。作為一種促凝酶，凝血酶使纖維蛋白原凝結(jié)，激活凝血因子v、vm和xni，并且激活血小板。凝血酶對纖維蛋白原的特異性切割起始了纖維蛋白單體的聚合，這是血凝塊形成中的主要事件。血小板血栓形成中的中心事件是從"非結(jié)合"到"結(jié)合"模式的血小板激活。凝血酶是血小板聚集的生理激活劑。因此，作為促凝劑，凝血酶在阻斷出血(生理止血)和形成血管阻塞性血栓(病理性血栓形成)中起關(guān)鍵作用。作為抗凝劑，凝血酶結(jié)合凝血調(diào)節(jié)蛋白(TM)，即一種在血管內(nèi)皮細胞表面表達的糖蛋白。TM通過活性位點構(gòu)象的變構(gòu)改變以及TM和凝血酶上纖維蛋白原結(jié)合位點的重疊的組合，使底物特異性從纖維蛋白原和血小板改變?yōu)榈鞍證。激活的蛋白C在磷脂表面、Ca^和第二種維生素K依賴性蛋白輔因子，即蛋白S的存在下，通過蛋白裂解性降解6因子Va和Vnia抑制凝血。因此，凝血酶-TM復(fù)合物的形成將凝血酶從促凝酶轉(zhuǎn)化為抗凝酶，并且這兩種相反活性之間的正常平衡對止血的調(diào)節(jié)是關(guān)鍵的。凝血病癥血管損傷和血栓形成代表多種血管疾病，包括動脈粥樣硬化的致病中的關(guān)鍵事件。導(dǎo)致多種疾病狀態(tài)和多個部位，如冠狀動脈、心室和人工心臟瓣膜中的血栓形成的血小板和/或達是血系統(tǒng)激活的致病過程看起來是不同的。因此，血小板抑制劑、抗凝劑或這兩者的組合的使用可能需要與打開封閉的血管并且防止再阻塞的溶栓劑聯(lián)合。通過凝血級聯(lián)的化合物進行的受控蛋白水解對于止血是關(guān)鍵的。因此，存在多種復(fù)雜調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其部分基于一系列高度特異性的蛋白酶抑制劑。在一種病理狀況下，可以通過活性蛋白酶的過量產(chǎn)生或抑制活性的滅活而中斷功能性的抑制活性。反應(yīng)于多種創(chuàng)傷(組織損傷)或感染(膿毒癥)的持續(xù)炎癥取決于血漿級聯(lián)系統(tǒng)的蛋白水解酶，包括凝血酶，以及溶酶體來源的蛋白水解酶。通過同時出現(xiàn)的蛋白酶和它們的抑制性調(diào)節(jié)劑之間的不平衡，增強了這些情況下的多器官衰竭(MOF)。此外，腦中的凝血酶活性不平tf，可能導(dǎo)致神經(jīng)變性疾病。冠狀動脈旁路移植(CABG)手術(shù)在2001年，美國心臟病學(xué)會寺艮道了在美國估計有1240萬患者診斷患有某種形式的冠心病?？紤]到凝血酶在凝血過程中的重要性，抗凝血酶劑或減少或抑制凝血酶活性的藥劑是例如冠狀動脈旁路移植(此后表示為"CABG")手術(shù)、經(jīng)皮冠狀動脈介入(此后表示為"pcr')和急性冠狀動脈綜合征過程中采用的抗凝劑。從2001年起，美國每年進4亍超過570,000次CABG手術(shù)，并且估計在世界范圍內(nèi)進行超過700,000次該手術(shù)。目前，最常用的抗凝劑是肝素，其必須與解毒劑魚精蛋白一起使用。但是，肝素-魚精蛋白治療與許多嚴重副作用相關(guān)，包括出血和血小板減少(血小板計數(shù)減少)，其通常是無癥狀的，但可能與威脅生命的動脈或靜脈血栓形成相關(guān)。此外，肝素-魚精蛋白治療具有許多其它缺點，包括與血漿蛋白的非特異性結(jié)合，導(dǎo)致一些患者中的抗性；肝素不能抑制血凝塊結(jié)合的凝血酶；肝素具有非線性動力學(xué)，導(dǎo)致不容易控制劑量；并且肝素是從?；蜇i組織制備的，其具有來自于傳播病毒和/或朊病毒的可能性導(dǎo)致的固有安全性風(fēng)險。因此，許多更新的、更貴的抗凝劑，如低分子量肝素和Angiomax,已經(jīng)顯著進入市場。但是，這些化合物具有相似的副作用，并且它們的抗凝活性不能迅速逆轉(zhuǎn)。因此，存在對安全、價格合理的抗凝劑的顯著未滿足的醫(yī)學(xué)需求，所述抗凝劑不需要單獨的逆轉(zhuǎn)劑，并且不與上文列出的副作用和的藥劑用作治療劑是有益的:'-''''^5'—發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于治療凝血酶介導(dǎo)的病癥，如急性和慢性凝血相關(guān)病癥的材料和方法。本發(fā)明進一步提供了用于調(diào)節(jié)凝血酶，特別是用于減少或抑制凝血酶介導(dǎo)的凝血，用于在受試者或患者中抗凝的治療組合物和方法。在一種具體實施方案中，提供了結(jié)合凝血酶耙的適體，其中該適體減少或抑制凝血酶介導(dǎo)的凝血，并且該適體是ARC2172(SEQIDNO294)或與ARC2172(SEQIDNO294)具有基本相同的減少或抑制凝血酶介導(dǎo)的凝血的能力的適體，其中該適體以小于lnM,優(yōu)選小于300pM,更優(yōu)選小于250pM，更優(yōu)選小于200pM的Ko結(jié)合人凝血酶，并且所述適體的長度是56個核苷酸或更少，55個核苦酸或更少，50個核苷酸或更少，45個核苷酸或更少，40個核普酸或更少，35個核苦酸或更少，30個核苷酸或更少，28個核苷酸或更少，26個核苷酸或更少。在一些實施方案中，適體的長度是至少22個核苷酸。在另一種實施方案中，提供了結(jié)合凝血酶耙的適體，其中該適體減少或抑制凝血酶介導(dǎo)的凝血，并且該適體是ARC2172(SEQIDNO294)或與ARC2172(SEQIDNO294)具有基本相同的減少或抑制凝血酶介導(dǎo)的凝血的能力的適體，并且該適體的大多數(shù)胸苷或尿苷不包含5-溴脫氧尿苦修飾。在一些實施方案中，該適體以小于]nM，優(yōu)選小于300pM，更優(yōu)選小于250pM，更優(yōu)選小于200pM的KD結(jié)合人凝血酶。在一些實施方案中，該適體的長度是56個核苷酸或更少，55個核普酸或更少，50個核苦酸或更少，45個核苷酸或更少，40個核苷酸或更少，35個核苷酸或更少，30個核苷酸或更少，28個核苷酸或更少，26個核苷酸或更少。在一些實施方案中，適體的長度是至少22個核苷酸。在一些實施方案中，可以通過下文實施例1描述的點印跡滴定確定解離常數(shù)。8在一些實施方案中，通過測量適體減少或抑制激活的凝血時間(ACT)、凝血酶原時間(PT)和/或激活的部分促凝血酶原激酶時間(aPTT),評估本發(fā)明的適體減少或抑制凝血酶介導(dǎo)的凝血的能力。優(yōu)選地，通過測量適體減少ACT的能力，評估凝血酶介導(dǎo)的凝血。在一種優(yōu)選實施方案中，通過用下文實施例3B描述的HemochronJr.儀器(ITCMed,EdisonNJ)測量ACT,評估本發(fā)明的適體減少或抑制湊是血的能力。在一些實施方案中，本發(fā)明的適體在體內(nèi)，特別是人受試者中減少或抑制凝血酶介導(dǎo)的凝血。在一些實施方案中，本發(fā)明的適體在體外減少或抑制凝血酶介導(dǎo)的凝血。在一種特定實施方案中，提供了結(jié)合凝血酶的適體，其中該適體選自SEQIDNOs9-41,43-191,193-204，208-304,307-329,331-332:334,336-337,340-392,396-397,400和402-440。在一種實施方案中，提供了結(jié)合凝血酶并且包含以下核酸序列的適體CCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGG。在特定實施方案中，提供了包含選自下組的序列的適體ACTGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCAGT(ARC2169(SEQIDNO283)),GCTGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCAGC(ARC2170(SEQIDNO292)),CTGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCAG(ARC2171(SEQIDNO293))和CGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCG(ARC2172(SEQTDNO294))。在另一種實施方案中，提供了包含以下核酸序列的適體NjN2N3TAGGTTGGGTAGGGTGGTN'3N'2N、，其中N2或N3是分別與N、、N'2或N'3形成堿基對的任何核普酸，其中N"N2和N3可以各自是相同的核苦酸或不同的核苷酸，并且該適體減少或抑制凝血酶介導(dǎo)的凝血。在一些實施方案中，N2或N3是脫氧核苦酸。在其它實施方案中，N"N2或N3中的至少兩個包含2'OMe修飾。在另一種實施方案中，提供了包含以下核酸序列的適體N!N2N3N4TAGGTTGGGTAGGGTGGTN4'N'3N'2N、，其中N2、N3或N4是分別與NVN'2、N、或N'4形成堿基對的任何核苷酸，其中N}、N2、N3和N4可以各自是相同的核苷酸或不同的核苦酸，并且該適體減少或抑制凝血酶介導(dǎo)的凝血。在一些實施方案中，N"N2、N3或N4是脫氧核苷酸。在其它實施方案中，N!、N2、N3或N4中的至少兩個包含2'OMe9修飾。在另一種實施方案中，提供了包含以下核酸序列的適體NjN2N3N4N5TAGGTTGGGTAGGGTGGTN'5N4'N'3N'2N、，其中N!、N2、N3、Hi或Ns是分別與N、、N'2、N'3、N'4或N's形成堿基對的任何核普酸，其中Ni、N2、N3、N4和N5可以各自是相同的核苷酸或不同的核苷酸，并且該適體減少或抑制凝血酶介導(dǎo)的凝血。在一些實施方案中，N2、N3、N4或N5是脫氧核苷酸。在其它實施方案中，N2、N3、N4或N5中的至少兩個包含2'OMe修飾。在另一種實施方案中，提供了包含以下序列的適體NiN^Nz^NJAGGTTGGGTAGGGTGGTN^NWN'gN'W,其中N!、N2、N3、N4、Ns或Ne是分別與NVN'2、N'3、N'4、N'5或N'6形成堿基對的任何核苷酸，其中Ni、N2、N3、N4、Ns或N6可以各自是相同的核苷酸或不同的核苷酸，并且該適體減少或抑制凝血酶介導(dǎo)的凝血。在一些實施方案中，上文描述的適體中的N是鳥苦或胞苷核苷酸殘基。在本發(fā)明的該方面的另一種實施方案中，該適體以小于1nM的Ko結(jié)合凝血酶。在本發(fā)明的這方面的另一實施方案中，適體至少與ARC2172(SEQIDNO294)具有基本相同的減少或抑制凝血酶介導(dǎo)的凝血的能力。在這方面的一些實施方案中，凝血酶靶是人凝血酶。在本發(fā)明的適體的一些實施方案中，大多數(shù)核苷酸是脫氧核糖核酸。在一些實施方案中，本發(fā)明的適體是脫氧核糖核酸，特別是單鏈脫氧核糖核酸。在本發(fā)明的一些實施方案中，至少14個，優(yōu)選至少16個，更優(yōu)選至少18個核苦酸是脫氧核苷酸。在一種特定實施方案中，適體包含脫氧核酸序列TAGGTTGGGTAGGGTGGT。在一些實施方案中，本發(fā)明的適體包含至少一個化學(xué)修飾，特別是選自下組的化學(xué)修飾在核酸的糖位置的化學(xué)取代；磷酸位置的化學(xué)取代；和堿基位置的化學(xué)取代。在一些實施方案中，化學(xué)修飾不導(dǎo)致適體的大多數(shù)胸苷或尿苷殘基的5-溴脫氧尿苷修飾。在一些實施方案中，修飾選自摻入修飾的核苷酸，3'加帽，以及與高分子量、非免疫原性化合物的綴合，與親脂性化合物的綴合，特別是其中高分子量、非免疫原性化合物是聚亞烷基二醇，特別是聚乙二醇。在一些實施方案中，上文描述的本發(fā)明的抗凝血酶適體，如ARC2172，減少或抑制靜止血液中的凝血，特別是室溫下持續(xù)至少約30分鐘，更特別是在5MM的濃度下室溫下持續(xù)至少約30分鐘。在一些實施方案中，提供了一種方法，包括給受試者，特別是人受試者或體外循環(huán)施用本發(fā)明的適體，其量有效減少或抑制受試者中凝血酶介導(dǎo)的凝血。在一些實施方案中，提供了一種組合物，其包含有效減少或抑制受試者中凝血酶介導(dǎo)的凝血的量的本發(fā)明的抗凝血酶適體或其鹽和藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑。在一些實施方案中，包含在本發(fā)明的組合物中的抗凝血酶適體是ARC2172(SEQIDNO294)。提供了一種方法，包括給有需要的受試者，特別是人受試者施用本發(fā)明的組合物。在本發(fā)明的一些實施方案中，人受試者是腎臟受損的，并且在本發(fā)明的方法中施用的本發(fā)明的抗凝血酶適體不綴合于PEG。在一些實施方案中，在本發(fā)明的方法中施用適體的人受試者具有肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥、是肝素抗性的和/或具有受損的肝功能。在本發(fā)明方法的一些實施方案中，在受試者的手術(shù)程序之前、期間、之后或其任意組合，給受試者，特別是人受試者施用本發(fā)明的抗凝血酶適體。在一些實施方案中，手術(shù)程序是心臟手術(shù)。在一些實施方案中，手術(shù)程序選自心肺旁路手術(shù)、冠狀動脈旁路移植手術(shù)、經(jīng)皮冠狀動脈介入、血管成形術(shù)、心血管和外周血管開放和血管內(nèi)手術(shù)、支架放置手術(shù)、心瓣膜置換手術(shù)、用于治療冠狀動脈疾病和/或靜脈或動脈的血管疾病的手術(shù)，和用于治療外周動脈阻塞疾病的手術(shù)。在本發(fā)明方法的一些實施方案中，抗凝血酶適體是ARC2172(SEQIDNO294)。在本發(fā)明方法的一種特定實施方案中，適體是ARC2172(SEQIDNO294)，并且手術(shù)程序是冠狀動脈旁路移植手術(shù)。在本發(fā)明方法的另一種特定實施方案中，本發(fā)明的適體是ARC2172，手術(shù)程序是心肺旁路手術(shù)，并且手術(shù)過程中使用開放的、非肝素結(jié)合的回路(non-heparmbondedcircuit)。在本發(fā)明方法的另一種特定實施方案中，適體是ARC2172(SEQIDNO294),并且手術(shù)程序是經(jīng)皮冠狀動》》介入。附圖筒述圖1是從隨機序列寡核苷酸集合進行體外適體選擇(SELEXTM)過程的示意圖。圖2是40kDa分支PEG的圖示。圖3是連接于適體5'末端的40kDa分支PEG的圖示。圖4是描述代表標準單聚乙二醇化、多聚乙二醇化和通過聚乙二醇化進行二聚的多種聚乙二醇化策略的圖示。圖5描述湊是血酶適體ARC2169(SEQIDNO283)、ARC2171(SEQIDNO293)和ARC2172(SEQIDNO294)的預(yù)測二級結(jié)構(gòu)。圖6是描述用硝酸纖維素濾膜結(jié)合測定測量的ARC2172(SEQIDNO294)和ARC183與人凝血酶的結(jié)合曲線的圖解。圖7是描述用纖維素濾膜結(jié)合測定測量的ARC2172(SEQIDN0294)與人、豬和大鼠凝血酶的結(jié)合曲線的圖解。圖8是描述用檸檬酸化的人血漿體外測定的ARC2172(SEQEDNO294)和ARC183對凝血酶原時間(PT)的影響的比專交的圖解。圖9是描述用人全血體外測定的ARC2172(SEQIDNO294)和ARC183對激活的凝血時間(ACT)的影響的比較的圖解。圖IO描述用人血漿體外測定的ARC2172(SEQIDNO294)和ARC183對激活的部分促凝血酶原激酶時間(aPTT)的影響的比較的圖解。圖ll是描述采用人全血的測定中ARC2172和ARC183對靜止血液凝血的影響的比較的圖解。圖12是顯示實施例4A描述的抗凝血酶適體的大鼠IV推注研究的實驗研究設(shè)計的表。圖13是描述連接于ARC2172(SEQIDNO294)的不同大小的PEG基團對接受1.5微摩爾/kg適體IV推注的大鼠中激活的凝血時間(ACT)的影響的比較的圖解。圖14是實施例4B描述的抗凝血酶適體的大鼠IV推注研究的實驗研究設(shè)計的表。圖15是描述ARC2172(SEQIDNO294)和ARC186對接受12.2mg/kg(ARC2172(SEQIDNO294))或30mg/kg(ARC183)適體[V推注的大鼠中激活的凝血時間(ACT)的影響的比較的圖解。圖16是概括ARC2172(SEQIDNO294)和ARC186對接受12.2mg/kg(ARC2172(SEQIDNO294))和30mg/kg(ARC183)適體IV推注的大鼠中激活的凝血時間(ACT)的影響的表。圖17是顯示實施例4C描述的對大鼠腎結(jié)扎模型中抗凝血酶適體的實驗研究設(shè)計的表。12圖18是顯示當(dāng)IV推注施用12.2mg/kg(ARC2172(SEQIDN〇294))時，腎結(jié)扎和々i手術(shù)大鼠中ARC2172(SEQIDNO294)對激活的凝血時間(ACT)的影響的比較的圖解。圖19是顯示當(dāng)IV推注施用30mg/kg(ARC183)時，腎結(jié)扎和假手術(shù)大鼠中ARC183對激活的凝血時間(ACT)的影響的比較的圖解。圖20是概括接受0.46微摩爾/kg適體IV推注的獼猴中抗凝血酶適體ARC2172(SEQIDNO294)、ARC2949(SEQIDNO434)、ARC2169(SEQIDNO283)和ARC2840(SEQIDNO423)對激活的湊是血時間(ACT)的影響的表。圖21是顯示接受0.46微摩爾/kg適體IV推注的獼猴中抗凝血酶適體ARC2172(SEQIDNO294)、ARC2949(SEQIDNO434)、ARC2169(SEQIDNO283)和ARC2840(SEQIDNO423)對激活的達是血時間(ACT)的影響的比較的圖解。圖22是顯示實施例4E描述的抗凝血酶適體猴IV推注+輸注研究的實驗研究設(shè)計的表。圖23是顯示單次IV推注施用并且隨后連續(xù)1小時輸注時，ARC2172(SEQIDNO294)(兩劑)和ARC183對獼浙吳中激活的凝血時間(ACT)的影響的比較的圖解。圖24是積X括單次IV推注施用并且隨后連續(xù)1小時llr注時，ARC2172(SEQIDNO294)(兩劑)和ARC183對獼猴中激活的凝血時間(ACT)的影響的表。圖25是比較ARC2172(SEQIDNO294)對凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集和ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的影響的圖解。圖26是比較ARC2172(SEQIDNO294)對血小板聚集的阿司匹林和Integnlin依賴性抑制的影響的圖解。圖27是顯示實施例5A中描述的豬心肺旁路模型中ARC2172(SEQIDNO294)和肝素的研究的實驗設(shè)計的表。圖28是豬心肺旁路研究方案的概括。圖29是顯示實施例5A描述的開放的、非肝素結(jié)合的豬心肺旁路研究中使用的對照動物(無抗凝劑處理)中激活的凝血時間(ACT)的圖解。圖30是顯示實施例5A描述的開放的、非肝素結(jié)合的豬心肺旁路研究中接受肝素IV推注使ACT保持〉400秒的豬中激活的凝血時何(ACT)的圖解。圖31是顯示實施例5A描述的開放的、非肝素結(jié)合的豬心肺旁路研究中接受ARC2172(SEQIDNO294)IV推注使ACT保持〉400秒的豬中激活的凝血時間(ACT)的圖解。圖32是顯示實施例5A描述的采用開放的、非肝素結(jié)合的旁路回路的心肺旁路模型中肝素和ARC2172(SEQIDNO294)對激活的凝血時間(ACT)(在縱軸上作圖為秒)的影響的比較的圖解。圖33是實施例5A描述的開放的、非肝素結(jié)合的豬心肺旁路研究中使用的對照動物(無抗凝劑處理)中TAT復(fù)合物的血漿濃度的圖解。圖34是顯示實施例5A描述的開放的、非肝素結(jié)合的豬心肺旁路研究中接受肝素IV推注使ACT保持〉400秒的豬中TAT復(fù)合物的血漿濃度的圖解。圖35是顯示實施例5A描述的開放的、非肝素結(jié)合的豬心肺旁路研究中接受ARC2172(SEQIDNO294)推注使ACT保持〉400秒的豬中TAT復(fù)合物的血漿濃度的圖解。發(fā)明詳述在下文所附的描述中闡述了本發(fā)明的一種或多種實施方案的細節(jié)。盡管與上文描述的相似或等同的任何方法和材料可以用于實施或測試本發(fā)明，目前描述的是優(yōu)選的方法和材料。從i兌明書可以明確本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點。在說明書中，單數(shù)形式也包括復(fù)數(shù)，除非上下文明確指出相反的意思。除非有相反的定義，本發(fā)明使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。在沖突的情況下，以本說明書為準。SELEX法用于制備適體的合適方法是采用標題為"通過指數(shù)富集進行配體的系統(tǒng)進化"("SELEXTM")的過程，該過程概括描述于圖1。SELEXTM法是用于對靶分子具有高度特異性結(jié)合的核酸分子的體外進化的方法，并且描述于例如目前已經(jīng)放棄的、1990年6月11日提交的美國專利申請系列No.07/536,428，名稱為"核酸配體"的美國專利No.5,475，096;和名稱為"核酸配體"的美國專利5,270,163(也參見WO91/19813)。適體被認為對靼分子具有高度特異性的結(jié)合，這例如是由于適體對靶的結(jié)合親和力的數(shù)量級高于以前未暴露于靶的起始核酸文庫或集合的結(jié)合親和力。每種SELEXTM鑒定的核酸配體，即每種適體，是給定的靶化合物或分子的特異性配體。SELEXTM法基于獨特的看法，即核酸具有足夠的能力形成多種二維和三維結(jié)構(gòu)，和它們的單體內(nèi)的足夠化學(xué)多功能性，作為基本上任何化合物的配體(即形成特異性結(jié)合對)，不論是單體還是聚合物。任何大小或組成的分子都可以作為草巴。SELEXTM作為包含隨機序列的單鏈寡核苷酸大文庫或集合的起始點。所述寡核苷酸可以是修飾或未〗務(wù)飾的DNA、RNA或DNA/RNA雜合體。在一些實例中，集合包含100%隨機或部分隨機的寡核香酸。在其它實例中，集合包含隨機或部分隨機的寡核苦酸，其包含隨機化序列中摻入的至少一個固定序列和/或保守序列。在其它實例中，集合包含隨機或部分隨機的寡核苷酸，其包含位于其5'和/或3'末端的至少一個固定序列和/或保守序列，所述序列可以包含寡核苷酸集合的所有分子共有的序列。固定序列是集合中的寡核苷酸共有的序列，它們的摻入是為了預(yù)選的目的，如下文進一步描述的CpG基序、PCR引物的雜交位點、RNA聚合酶(如T3，T4,T7和SP6)的啟動子序列、限制位點或均聚序列，如聚腺苷酸或聚胸苷酸束、催化核心、用于選擇性結(jié)合親和柱的位點，和其它促進感興趣的寡核苦酸克隆和/或測序的序列。保守序列是除前面描述的固定序列外的、由許多結(jié)合相同靶的適體共有的序列。集合的寡核苷酸優(yōu)選包含隨機化序列部分以及有效擴增必須的固定序列。典型地，起始集合的寡核苷酸含有側(cè)翼于30-50個隨機核苦酸的內(nèi)部區(qū)域的固定的5，和3'末端序列?？梢酝ㄟ^多種方式生產(chǎn)隨機化核苷酸，包括化學(xué)合成和從隨機切割的細胞核酸中進行大小選擇。可以在選擇/擴增循環(huán)之前或過程中導(dǎo)入或增加測試核酸的序列變異。寡核苦酸的隨機序列部分可以是任何長度，并且可以包含核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苷酸，并且可以包含+務(wù)飾的或非天然的核苷酸或核苦酸類似物。參見例如美國專利No.5,958,691;美國專利No.5,660,985;美國專利No.5,958,691;美國專利No.5，698,687;美國專利No.5，817,635;美國專利No.5,672,695和PCT公開WO92/07065?？梢?5用本領(lǐng)域公知的固相寡核普酸合成技術(shù)從磷酸二酯鍵連接的寡核苦酸合成隨機寡核苷酸。參見例如Froehleretal,Nucl.AcidRes.14:5399-5467(1986)和Froehleretal,Tet.Lett.27:5575-5578(1986)。也可以用液相方法，如三酯合成方法合成隨機寡核苷酸。參見例如Soodetal，Nucl.AcidRes.4:2557(1977)和Hiroseetal,TetLett.,28:2449(1978)。在自動化DNA合成儀上進行的典型合成產(chǎn)生1014-1016個單個分子，這是大多數(shù)SELEXTM實驗足夠的數(shù)目。序列設(shè)計中足夠大的隨機序列區(qū)增加了每種合成分子可能代表獨特序列的可能性。可以通過DNA合成儀上的自動化化學(xué)合成制備寡核苷酸的起始文庫。為了合成隨機化序列，在合成過程中的每個核苷酸添加步驟中添加所有四種核苦酸的混合物，使得能夠隨機摻入核普酸。如上文所述，在一種實施方案中，隨機寡核苷酸包括完全隨機的序列；但是，在其它實施方案中，隨機寡核苷酸可以包括非隨機或部分隨機序列段。可以通過在每個添加步驟中以不同的摩爾比添加四種核苷酸而制備部分隨機的序列。寡核苷酸的起始文庫可以是RNA或DNA。在這些情況下，當(dāng)RNA文庫用作起始文庫時，它典型是通過用T7RNA聚合酶或修飾的T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄DNA文庫并且純化而制備的。然后在有利于結(jié)合的條件下將RNA或DNA文庫與靶混合，并且用相同的通用選擇方案，進行結(jié)合、區(qū)分和擴增的逐步重復(fù)，以滿足結(jié)合親和力和選擇性的基本上任何需要的標準。更具體地，從含有核酸的起始集合的混合物開始，SELEXTM法包括以下步驟(a)在有利于結(jié)合的條件下使混合物與耙解除；(b)從特異性結(jié)合于靶分子的核酸區(qū)分未結(jié)合的核酸；(c)解離核酸-革巴復(fù)合物；(d)擴增/人核酸-靶復(fù)合物解離的核酸，以產(chǎn)生核酸的富含配體的混合物；和(e)重復(fù)結(jié)合、區(qū)分、解離和擴增的步驟，重復(fù)產(chǎn)生靶分子的高度特異性、高親和力核酸配體所需的循環(huán)數(shù)。在選擇RNA適體的情況下，SELEXTM法進一步包括以下步驟(i)在步驟(d)的擴增前逆轉(zhuǎn)錄/人核酸-輩巴復(fù)合物解離的核酸；和(ii)在重新開始該過程前，轉(zhuǎn)錄來自步驟(d)的擴增的核酸。在含有大量可能的序列和結(jié)構(gòu)的核酸混合物中，存在對給定耙的廣泛結(jié)合親和力。包含例如20個核苷酸的隨沖幾化區(qū)段的核酸混合物可以具有42(>種候選可能性。對靶具有較高親和力常數(shù)的那些最可能16結(jié)合于輩巴。區(qū)分、解離和擴增后，產(chǎn)生第二種核酸混合物，富集更高結(jié)合親和力的候選物。其它輪的選擇逐漸增多地有利于最佳配體，直到得到的核酸混合物主要僅僅包含一種或幾種序列?？梢詫@些序列進行克隆、測序和單獨測試結(jié)合親和力，作為純配體或適體。重復(fù)選擇和擴增循環(huán)，直到實現(xiàn)需要的目標。在大多數(shù)一般情況下，持續(xù)進行選擇/擴增，直到在周期重復(fù)時沒有達到結(jié)合強度的顯著改進。該方法典型地用于對大約1014種不同的核酸種類進行取樣，但也可以用于對多至1018種不同的核酸種類進行取樣。通常，在5-20個循環(huán)程序中選擇核酸適體分子。在一種實施方案中，僅僅在初始選擇階段引入異質(zhì)性，在整個復(fù)制過程中不出現(xiàn)異質(zhì)性。在SELEXTM的一種實施方案中，選擇過程對于分離這些與選定的輩巴最強結(jié)合的核酸配體非常有效，以至于僅僅需要一個選擇和擴增循環(huán)。所述有效選擇可以發(fā)生在例如色錯型過程中，其中核酸與結(jié)合在柱上的耙締合的能力以使得柱子足夠允許最高親和力的核酸配體分開和分離的方式進行。在很多情況下，不是必須進行SELEXTM的重復(fù)步驟直到鑒定單個核苷酸配體。高度靼特異性的核酸配體溶液可以包括核酸結(jié)構(gòu)或基序家族，其具有一些保守序列和一些可以取代或添加而不顯著影響核酸配體與革巴的親和力的序列。通過在完成前終止SELEXTM過程，能夠確定核酸配溶液家;^矣中一些成員的序列。已知存在多種核酸一級、二級和三級結(jié)構(gòu)。已經(jīng)顯示最常參與非沃特森-克里克型相互作用的結(jié)構(gòu)和基序稱作發(fā)夾環(huán)、對稱和不對稱凸出、假結(jié)和它們的多種組合。所述基序的幾乎所有情況表明它們能夠在不超過30個核苷酸的核酸序列中形成。為此，通常優(yōu)選的是具有相鄰隨機化區(qū)段的SELEXTM程序用含有約20-約50個核苦酸的隨機化區(qū)段的核酸序列開始，在一些實施方案中，是約30-約40個核苷酸。在一個實例中，5'-固定隨機3'-固定序列包含約30-約50個核苦酸的隨機序列。已經(jīng)改進了核心SELEXTM法，以實現(xiàn)一些特定目的。例如，美國專利No.5,707,796描述了利用SELEX與凝膠電泳的結(jié)合來選擇具有特定結(jié)構(gòu)特征，如彎曲DNA的核酸分子。美國專利No.5，763，177描述了基于SELEXTM的方法，用于選擇含有能夠結(jié)合和/或光交聯(lián)和/或光滅活耙分子的光活性基團的核酸配體。美國專利No.5,567,588和美國專利No.5,861,254描述了基于SELEXTM的方法，其實現(xiàn)對靶分子具有高和低親和力的寡核苷酸之間的高度有效區(qū)分。美國專利No.5,496，938描述了在進行SELEXTM過程后獲得改進的核酸配體的方法。美國專利No.5,705，337描述了將配體共價連接于其輩巴的方法。SELEX也可以用于獲得結(jié)合輩巴分子上一個以上位點的核酸配體，并且獲得包括結(jié)合耙上特定位點的非核酸種類的核酸配體。SELEXTM提供了分離和鑒定結(jié)合于任何可預(yù)見的靶的核酸配體的手段，所述耙包括大和小生物分子，如核酸結(jié)合蛋白和不知道結(jié)合核酸是其生物功能的一部分的蛋白，以及輔因子和其它小分子。例如，美國專利No.5,580,737公開了通過能夠以高親和力結(jié)合咖啡因和密切相關(guān)類似物茶堿的SELEXTM鑒定的核酸序列。反_SELEXTM是一種通過消除與一種或多種非靶分子具有交叉反應(yīng)性的核酸配體序列而改進核酸配體與耙分子的特異性的方法。反SELEX包含以下步驟(a)制備核酸的候選混合物；(b)使候選混合物與草巴接觸，其中相對于候選混合物，與靶的親和力更高的核酸可以從候選混合物的其余部分中區(qū)分出來；(c)區(qū)分親和力更高的核酸與混合物的其余部分；(d)使親和力更高的核酸從靶解離；(e)使親和力更高的核酸與一種或多種非耙分子接觸，使得除去對非靶分子具有高度特異性親和力的核酸配體被除去；和(f)擴增僅僅對靶分子具有高度特異性的親和力的核酸，產(chǎn)生富含對靶分子的結(jié)合具有相對更高的親和力和特異性的核酸序列的核酸混合物。如上文對SELEXTM的描述，根據(jù)需要重復(fù)選擇和擴增循環(huán)，直到實現(xiàn)需要的目的。將核酸用作治療劑和疫苗可能遇到的一個問題是磷酸二酯形式的寡核苷酸可能在體液中在展示需要的作用之間被諸如內(nèi)切核酸酶和外切核酸酶的細胞內(nèi)和細胞外酶迅速降解。因此，SELEXTM法包括鑒定含有修飾的核苷酸的高親和力核酸配體，所述修飾的核苷酸給配體賦予改進的特征，如改進的體內(nèi)穩(wěn)定性或改進的送遞特征。所述修飾的實例包括在核糖和/或磷酸和/或堿基位置的化學(xué)取代。含有修飾的核苷酸的SELEXTM鑒定的核酸配體描述于例如美國專利No.5,660,985，其描述了包括在核糖的2'位、嘧啶的5位和噤呤的8位化學(xué)修飾的核苷酸衍生物的寡核苷酸，美國專利No.5,756,703，其描述了包括多個2'-修飾的嘧啶的寡核苷酸，和美國專利No.5,580,737,其描述了含有一個或多個用2'-氨基(2'-NH2)、2'-氟代(2'-F),和/或2'-0-甲基(2'-OMe)取代基修飾的核苦酸的高度特異性的核酸配體。本發(fā)明考慮的核酸配體的修飾包括但不限于提供其它化學(xué)基團的那些修飾，所述其它化學(xué)基團給核酸配體堿基或作為整體的核酸配體摻入額外的電荷、極性、疏水性、氫鍵、靜電相互作用和流動性。產(chǎn)生抗核酸酶的寡核苷酸群體的修飾也可以包括一個或多個取代的核苷酸間鍵、糖改變、堿基改變或其組合。所述修飾包括但不限于2'位糖修飾、5位嘧啶修飾、8位嘌呤修飾、環(huán)外胺的修飾、4-硫尿苷的取代、5_溴或5_碘-尿嘧啶的取代；主鏈修飾、硫代磷酸酯或磷酸烷酯修飾、甲基化和不常見的堿基配對組合，如異堿基-異胞苷和異鳥苷。修飾也可以包括3，和5，》多飾，如加帽。在一種實施方案中，提供了寡核苷酸，其中P(O)O基團被P(O)S("硫代磷酸酯")，P(S)S("二硫代磷酸酯")，P(0)NR2("酰胺化物"),P(O)R,P(O)OR',CO或CH2("甲?；?)或3'-胺(-NH-CH2-CHr)取代，其中每個R和R'獨立地是H或取代或未取代的烷基。可以通過-O-,-N-或-S-鍵，將連接基團連接于相鄰核苷酸。并不要求寡核苷酸中的所有鍵都是相同的。如本文用到的，術(shù)語硫代磷酸酯包括磷酸二酯鍵中的一個或多個非橋接氧原子被一個或多個硫原子取代。在進一步的實施方案中，寡核普酸包含修飾的糖基團，例如，一個或多個羥基被鹵素、脂族基團取代或官能化為酯或胺。在一種實施方案中，呋喃糖殘基的2'-位置被O-曱基、O-烷基、O-烯丙基、S-烷基、S-烯丙基、或面素基團中的任何一個取代。合成2'-修飾的糖的方法描述于例如Sproat,etal,Nucl.AcidRes.19:733-738(1991);Cotten,etal.,Nucl.AcidRes.19:2629-2635(1991);和Hobbs,etal,Biochemistry12:5138-5145(1973)。其它修飾是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。所述修飾可以是SELEXTM過程前修飾或SELEXTM過程后修飾(以前鑒定的未修飾配體的修飾)或可以通過摻入SELEXTM過程中而進行。SELEXTM過程前修飾或通過摻入SELEX過程中而進行的修飾產(chǎn)生對它們的SELEXTM靶具有高度特異性并且具有改進的穩(wěn)定性，如體內(nèi)穩(wěn)定性的核酸配體。對核酸配體進行的SELEXTM過程后修飾可以導(dǎo)致改進的穩(wěn)定性，如體內(nèi)穩(wěn)定性，而對核酸配體的結(jié)合能力沒有不19利影響。SELEXTM法包括按照美國專利No.5,637,459和美國專利No.5,683,867中的描述將選定的寡核苷酸與其它選定的寡核苦酸和非寡核苷酸功能單位組合。SELEXTM法進一步包括按照例如美國專利No.6,011,020、美國專利No.6,051,698和PCT公開No.WO98/18480的描述將選定的核酸配體與親脂或非免疫原性高分子量化合物組合在診斷或治療復(fù)合物中。這些專利和申請教導(dǎo)了將廣泛的形狀和其它特性與寡核苷酸的有效擴增和復(fù)制特性，和與其它分子的需要的特性組合。已經(jīng)揭示了通過SELEXTM法鑒定小的柔性肽的核酸配體。小肽具有柔性結(jié)構(gòu)，并且通常以多種構(gòu)象的平衡存在于溶液中，因此，最初認為它的結(jié)合親和力可能受到與柔性肽結(jié)合后構(gòu)象熵損失的限制。但是，美國專利No.5,648,214中證明了在溶液中鑒定小肽的核酸配體的可行性。在這方面，鑒定了底物P,即一種11個氨基酸的肽的高親和力RNA核酸配體。典型地通過上文描述的SELEXTM過程選擇對本發(fā)明的耙具有高度特異性和結(jié)合親和力的適體。作為SELEXTM過程的一部分，隨后任選對選擇用于結(jié)合靶的序列進行最小化，以確定具有需要的結(jié)合親和力的最小序列。任選通過進行序列的隨機或定向誘變，對選定的序列和/或最小化的序列進行優(yōu)化，以增加結(jié)合親和力，或確定序列中的哪些位置對結(jié)合親和力是關(guān)鍵的。此外，可以用摻入修飾的核苷酸的序列進行選擇，以穩(wěn)定適體分子，使其抗體內(nèi)降解。2，修飾的SELEXTM為了使適體適于用作治療劑，優(yōu)選便宜地合成、以及體內(nèi)的安全性和穩(wěn)定性。野生型RNA和DNA適體典型在體內(nèi)是不穩(wěn)定的，因為它們?nèi)菀资艿胶怂崦傅慕到?。通過在2'位置摻入修飾基團，可以顯著增加對核酸酶降解的抗性。氟和氨基基團已經(jīng)成功摻入了寡核苷酸集合，從中隨后選擇了適體。但是，這些修飾顯著增加了合成得到的適體的花費，并且在某些情況下可能引入安全性問題，這是因為通過修飾的核苦酸的降解和隨后用核苷酸作為DNA合成的底物，修飾的核苷酸可以再循環(huán)到宿主DNA中。本文提供的含有2'-0-曱基("2'-OMe")核苷酸的適體克服了很20多上述缺陷。含有2'-OMe核苦酸的寡核苦酸是抗核酸酶的，并且能夠便宜地合成。盡管2'-OMe核苦酸在生物系統(tǒng)中是普遍存在的，天然聚合酶在生理條件下不4妻受2'-OMeNTPs作為底物，因此不存在2'-OMe核苷酸再循環(huán)到宿主DNA中的考慮。用于制備2，-修飾的適體的SELEXTM法描述于例如2002年12月3日提交的美國臨時專利申請系列No.60/430，761,2003年7月15日提交的美國臨時專利申請系列No.60/487,474,2003年11月4日提交的美國臨時專利申請系列60/517,039,2003年12月3日提交的美國專利申請No.10/729,581,以及2004年6月21日提交的美國專利申請No.10/873,856，其發(fā)明名稱為"體外選擇2，-O-甲基取代的核酸的方法"，在此全文引入所有上述申請作為參考。本發(fā)明包括結(jié)合凝血酶并且減少或抑制凝血酶功能的適體，其含有修飾的核苦酸(如在2，位置具有修飾的核苷酸)，從而制備比未修飾的核苷酸對酶和化學(xué)降解以及熱和物理降解更穩(wěn)定的寡核普酸。盡管在文獻中(參見例如Greenetal.,CurrentBiology2,683-695，1995)存在含2'-OMe的適體的一些實例，這些都是通過體外選擇修飾的轉(zhuǎn)錄物文庫而得到的，所述轉(zhuǎn)錄物中C和U殘基是2，-氟(2'^)取代的，并且A和G殘基是2'-OH。一旦鑒定功能性序列，隨后對A和G殘基都測試了對2，-OMe取代的耐受性，并且重新合成了具有所有耐受2'-OMe取代的A和G殘基作為2'-OMe殘基的適體。以該兩步方式產(chǎn)生的適體的大多數(shù)A和G殘基耐受用2'-OMe殘基取代，但平均約20%不耐受。因此，用該方法產(chǎn)生的2'-OMe殘基傾向于含有2-4個2'-OH殘基，并且因此損害了合成的穩(wěn)定性并增加花費。通過將修飾的核苷酸摻入轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所述反應(yīng)產(chǎn)生用于通過SELEXTM(和/或其任何變化和改進，包括本文描述的那些)選擇和富集適體的寡核苦酸集合的穩(wěn)定寡核苦酸，本發(fā)明的方法消除了對選擇的適體寡核苷酸(例如通過重新合成具有修飾的核苦酸的適體寡核苷酸)進行穩(wěn)定化的需要。在一種實施方案中，本發(fā)明提供了包含ATP、GTP、CTP、TTP和UTP核苷酸的2'-OH、2'-F、2'-脫氧和2'-OMe修飾的組合的適體。在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了包含ATP、GTP、CTP、TTP和UTP核苦酸的2'-OH、2'-F、2'-脫氧、2'-OMe、2'-NH2和2'-甲氧乙基修飾的適體。在另一種實施方案中，提供了包含ATP、GTP、CTP、TTP和UTP核苷酸的2'-OH、2'-F、2'-脫氧、2'-OMe、2'-麗2和2'-曱氧乙基修飾的56種組合的適體。本發(fā)明的2，修飾的適體是采用修飾的聚合酶，如修飾的T7聚合酶制備的，所述聚合酶摻入具有位于呋喃糖2，位置的大取代基的修飾核苷酸的速度高于野生型聚合酶。例如，單突變T7聚合酶(Y639F)(其中639位的酪氨酸殘基改變?yōu)楸奖彼?容易地利用2'脫氧、2，氨基-、和2，氟-三磷酸核苷酸(NTPs)作為底物，并且廣泛用于合成用于多種應(yīng)用的修飾的RNAs。但是，報道的該突變T7聚合酶不能容易地利用(即摻入)具有大的2，取代基如2'-0Me或2，-疊氮基(2'-^)取代基的NTPs。為了摻入大的2，取代基，描述了雙T7聚合酶突變體(Y639F/H784A),其7糾位的組氨酸改變?yōu)楸彼釟埢?，并且具有YW9F突變，并且已經(jīng)將其用于有限的情況下，用于摻入修飾的嘧啶NTPs。參見Padilla,R.andSousa,R.,NucleicAcidsRes.，2002,30(24):138。也已經(jīng)描述了784位的組氨酸改變?yōu)楸彼釟埢膯瓮蛔僒7聚合酶(H784A)。Padillaetal,NucleicAcidsResearch,2002,30:138。在Y639F/H784A雙突變和H784A單突變T7聚合酶中，諸如丙氨酸的較小氨基酸殘基的改變使得能夠摻入較大的核苷酸底物，如2'-OMe取代的核苷酸。通常，發(fā)現(xiàn)在本文公開的條件下，Y693F單突變體可以用于摻入除GTP外的所有2'-OMe取代的NTPs,并且Y639F/H784A雙突變體可以用于摻入所有2'-OMe取代的NTPs,包括GTP。預(yù)期當(dāng)在本文公開的條件下使用時，H784A單突變體具有類似于Y639F和Y639F/H784A突變體的性質(zhì)?？梢酝耆眯揎椇似账?，或用一個亞組的修飾核普酸合成2'-修飾的寡核苦酸。所述修飾可以是相同或不同的。所有核苦酸可以是修飾的，并且都可以含有相同的修飾。所有核苷酸都可以是修飾的，但是含有不同的修飾，例如，所有含有相同堿基的核苷酸可以具有一種類型的修飾，而含有其它堿基的核苷酸可以具有不同類型的修飾。所有噤呤核苦酸可以具有一種類型的修飾(或未修飾)，而所有嘧咬核苷酸具有另一種不同類型的修飾(或未修飾)。以此方式，用修飾的任意組合，包括例如核糖核苦酸(2'-OH)、脫氧核糖核普酸(2'-脫氧)、2'-F和2'-OMe核苷酸制備轉(zhuǎn)錄物或轉(zhuǎn)錄物集合。含有2'-OMeC和U以及2'-OHA和G的轉(zhuǎn)錄混合物稱作"rRmY"混合物，并且選自其中的適體稱作"rRmY"適體。含有脫氧A和G以及2'-OMeC和U的轉(zhuǎn)錄混合物稱作"dRmY"混合物，并且選自其中的適體稱作"dRmY"適體。含有2'-OMeA、C和U，以及2'-OHG的轉(zhuǎn)錄混合物稱作"rGmH"混合物，并且選自其中的適體稱作"rGmH"適體。替代地含有2'-OMeA、C、U和G以及2'-OMeA、C和U以及2'-FG的轉(zhuǎn)錄混合物稱作"替代混合物"，并且選自其中的適體稱作"替代混合物"適體。含有2'-OMeA、U、C和G,其中最多10%的G是核糖核苷酸的轉(zhuǎn)錄混合物稱作"r/mGmH"混合物，并且選自其中的適體稱作"r/mGmH"適體。含有2'-OMeA、U和C以及2'-FG的轉(zhuǎn)錄混合物稱作"fGmH"混合物，并且選自其中的適體稱作"fGmH"適體。含有2'-OMeA、U和C以及脫氧G的轉(zhuǎn)錄混合物稱作"dGmH"混合物，并且選自其中的適體稱作"dGmH"適體。含有脫氧A以及2'-OMeC、G和U的轉(zhuǎn)錄混合物稱作"dAmB"混合物，并且選自其中的適體稱作"dAmB"適體。含有2，-OH核苷酸的轉(zhuǎn)錄混合物稱作"rN"混合物，并且選自其中的適體稱作"rN"或"rRrY"適體。"mRmY"適體含有所有2'-0-甲基核苷酸，并且通常通過SELEXTM后替代來源于r/mGmH寡核苷酸，當(dāng)可能時，用2'-OMeG替代任何2'-OHG?！N優(yōu)選實施方案包括2'-OH、2'-脫氧和2'-OMe核苷酸的任意組合。一種更優(yōu)選的實施方案包括2'-脫氧和2'-OMe核苷酸的任意組合。一種甚至更優(yōu)選的實施方案是采用2'-脫氧和T-OMe核苷酸的任意組合，其中嘧啶是2'-OMe(如dRmY、mRmY或dGmH)。在選擇過程之前(前)將修飾的核苦酸摻入本發(fā)明的適體(如SELEX過程前修飾)。任選地，通過SELEXTM過程前修飾摻入修飾的核苷酸的本發(fā)明的適體可以進一步通過SELEX過程后修飾(即SELEX過程前修飾后的SELEX過程后修飾)進行進一步修飾。SELEX過程前修飾產(chǎn)生對SELEX靶具有高度親和力的修飾的核酸配體，并且也改進體內(nèi)穩(wěn)定性。SELEX過程后修飾，即修飾(如以前鑒定的具有通過SELEX過程前修飾摻入的核苷酸的配體的截短、缺失、取代或添加核苷酸的修飾)，能夠?qū)е逻M一步改進體內(nèi)穩(wěn)定性而對具有通過SELEX過程前修飾摻入的核苷酸的核酸配體的結(jié)合能力沒有不利影響。為了在聚合酶接受2'-修飾的NTPs的條件下制備2'-修飾的(如2'-OMe)RNA轉(zhuǎn)錄物的集合，優(yōu)選的聚合酶是Y693FZH784A雙突變體或Y693F單突變體。其它聚合酶，特別是對大的2，-取代基表現(xiàn)出高度耐受的那些，也可以用于本發(fā)明?？梢酝ㄟ^測量在本文公開的轉(zhuǎn)錄條件下?lián)饺胄揎椀暮塑账岬哪芰?，篩選所述聚合物的該能力。已經(jīng)確定了許多因素對用于本文公開的方法中的轉(zhuǎn)錄條件是重要的。例如，當(dāng)前導(dǎo)序列摻入DNA轉(zhuǎn)錄模板的5，末端的固定序列的5'末端，使得得到的轉(zhuǎn)錄物的至少大約前6個殘基都是噤呤時，觀察到修飾的轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)率增加。獲得摻入修飾的核苷酸的轉(zhuǎn)錄物的另一個重要因素是2'-OHGTP的存在或濃度。轉(zhuǎn)錄可以分為兩個階段第一個階段是起始，其中在GTP(或另一種取代的鳥苷)的3，-羥基末端添加NTP,以產(chǎn)生二核苷酸，隨后其延長約10-12個核苷酸；第二個階段是延伸，其中轉(zhuǎn)錄的進行超過添加的大約前10-12個核苷酸。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在含有過量2，-OMeGTP的轉(zhuǎn)錄混合物中添加的小量2'-OHGTP足夠使得聚合酶用2'-OHGTP起始轉(zhuǎn)錄，但一旦轉(zhuǎn)錄物進入延伸階段，2'-OMe和2'-OHGTP之間區(qū)分的減少，并且2'-OMeGTP相對于2'-OHGTP的過量使得主要摻入2'-OMeGTP。將2'-Ome取代的核苷酸摻入轉(zhuǎn)錄物的另一個重要因素是在轉(zhuǎn)錄混合物中使用二價鎂和錳。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)氯化鎂和氯化錳的濃度的不同組合影響2'-0-甲基化轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)率，氯化鎂和氯化錳的最佳濃度依賴于與二價金屬離子復(fù)合的NTPs轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物的中的濃度。為了獲得最大2，取代的O-甲基化轉(zhuǎn)錄物(即所有A、C和U,以及約90。/。的G核苷酸)的最大產(chǎn)率，當(dāng)每種NTP以0.5mM的濃度存在時，大約5mM氯化鎂和1.5mM氯化錳的濃度是優(yōu)選的。當(dāng)每種NTP的濃度是1.0mM時，大約6.5mM氯化鎂和2.0mM氯化錳的濃度是優(yōu)選的。當(dāng)每種NTP的濃度是2.0mM時，大約9.6mM氯化鎂和2.9mM氯化錳的濃度是優(yōu)選的。在任何情況下，偏離這些濃度最多2倍，仍然得到顯著量的修飾的轉(zhuǎn)錄物。用GMP或鳥苷引發(fā)轉(zhuǎn)錄也是重要的。這種作用由起始核普酸的聚合酶的特異性導(dǎo)致。因此，以此方式產(chǎn)生的任何轉(zhuǎn)錄物的5'末端核苷酸很可能是T-OHG。GMP(或鳥苷)的優(yōu)選濃度是0.5mM,甚至更優(yōu)選是1mM。也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中包含PEG，優(yōu)選PEG-8000，對于最大摻入修飾的核苷酸是有用的。為了在轉(zhuǎn)錄物中最大摻入2'-OMeATP(100%)，UTP(100%),CTP(100%)和GTP(約90Q/Q)("r/mGmH")，以下條件是優(yōu)選的HEPES緩沖液200mM,DTT40mM,亞精胺2mM,PEG-800010%(w/v)，TritonX-1000.01%(w/v),MgCl25mM(6.5mM,其中每種2'-OMeNTP的濃度是1.0mM),MnCl21.5mM(2.0mM，其中每種2'-OMeNTP的濃度是1.0mM),2'-OMeNTP(每種)500juM(更優(yōu)選1.0mM),2'-OHGTP30juM,2'隱OHGMP500juM,pH7.5,Y639F/H784AT7RNA聚合酶15單位/ml，無機焦磷酸酶5單位/ml，和長度為至少8個核苷酸的全噤呤前導(dǎo)序列。如本文用到的，一個單位的Y639F/H784A突變T7RNA聚合酶(或本文指出的任何其它突變T7RNA聚合酶)定義為在r/mGmH條件下將1納摩爾2'-OMeNTPs摻入轉(zhuǎn)錄物中需要的酶的量。如本文定義的，一個單位的無機焦磷酸酶定義為pH7.2和25。C下每分鐘釋放l.O摩爾無機正磷酸鹽的酶量。為了在轉(zhuǎn)錄物中最大摻入(100。/o)2'-OMeATP、UTP和CTP("rGmH"),以下條件是優(yōu)選的HEPES緩沖液200mM,DTT40mM,亞精胺2mM,PEG-800010%(w/v),TritonX隱1000.01%(w/v),MgCl25mM(9.6mM,其中每種2'-OMeNTP的濃度是2.0mM),MnCl21.5mM(2.9mM，其中每種2'-OMeNTP的濃度是2.0mM),2'-OMeNTP(每種)500yM(更優(yōu)選2.0mM),pH7.5,Y639FT7RNA聚合酶15單位/ml，無機焦磷酸酶5單位/ml,和長度為至少8個核苷酸的全噤呤前導(dǎo)序列。為了在轉(zhuǎn)錄物中最大摻入(100o/o)2'-OMeUTP和CTP("rRmY"),以下條件是優(yōu)選的HEPES緩沖液200mM,DTT40mM，亞精胺2mM,PEG-800010%(w/v),TritonX-1000.01%(w/v),MgCl25mM(9.6mM,其中每種2'-OMeNTP的濃度是2.0mM),MnCl21.5mM(2.9mM,其中每種2'-OMeNTP的濃度是2.0mM)，2'-OMeNTP(每種)500juM(更優(yōu)選2.0mM),pH7.5，Y639F/H784AT7RNA聚合酶15單位/ml，無機焦磷酸酶5單位/ml,和長度為至少8個核苷酸的全。票呤前導(dǎo)序列。為了在轉(zhuǎn)錄物中最大摻入(100%)脫氧ATP和GTP以及2'-OMeUTP和CTP("dRmY"),以下條件是優(yōu)選的HEPES緩沖液200mM,DTT40mM,精胺2mM,亞精胺2mM,PEG-800010%(w/v),TntonX-1000.01%(w/v)，MgCl29.6mM，MnCl22.9mM,2'陽OMeNTP(每種)2.0mM,pH7.5，Y639FT7RNA聚合酶]5單位/ml，無機焦磷酸酶25酸的全噤呤前導(dǎo)序列。為了在轉(zhuǎn)錄物中最大摻入(100o/o)2'-OMeATP、UTP和CTP以及2'-FGTP("fGmH"),以下條件是優(yōu)選的HEPES緩沖液200mM,DTT40mM,亞精胺2mM,PEG-800010%(w/v),TritonX-1000.01%(w/v),MgCl29.6mM,MnCl22.9mM,2'陽OMeNTP(每種)2.0mM,pH7.5,Y639FT7RNA聚合酶15單位/ml,無機焦磷酸酶5單位/ml,和長度為至少8個核苷酸的全。票呤前導(dǎo)序列。為了在轉(zhuǎn)錄物中最大摻入(100%)脫氧ATP以及2'-OMeUTP、GTP和CTP("dAmB")，以下條件是優(yōu)選的HEPES緩沖液200mM,DTT40mM,亞精胺2mM,PEG-800010%(w/v),TritonX-1000.01%(w/v),MgCl29.6mM,MnCl22.9mM,2'-OMeNTP(每種)2.0mM,pH7.5,Y639FT7RNA聚合酶15單位/ml，無機焦磷酸酶5單位/ml,和長度為至少8個核苷酸的全噤呤前導(dǎo)序列。對于上述每種情況，(a)轉(zhuǎn)錄優(yōu)選在約20°C-50°C,優(yōu)選約30°C-40°C,更優(yōu)選約37。C的溫度下進行至少2小時，并且(b)使用50-300nM雙鏈DNA轉(zhuǎn)錄模板(第一輪使用200nM模板，以增加多樣性(dRmY轉(zhuǎn)錄中使用300nM模板))，隨后各輪使用大約50nM,優(yōu)化的PCR反應(yīng)的1/10稀釋液，采用上文描述的條件)。優(yōu)選的DNA轉(zhuǎn)錄才莫4反描述于下文(其中ARC254和ARC256在所有2'-OMe條件下轉(zhuǎn)錄，ARC255在rRmY條件下轉(zhuǎn)錄)。SBQEDNO1TGAGTCGTATTA-3'SEQIDNO2GAOTCGTATTA-3'SEQIDNO35、GAGTCGTATTA-3'在本發(fā)明的rN轉(zhuǎn)錄條件下，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物包含2'-OH腺苷三磷酸(ATP)、2'-OH鳥苷三磷酸(GTP)、2'-OH胞苷三磷酸(CTP)和2'-OH尿苷三磷酸(UTP)。利用本發(fā)明的rN轉(zhuǎn)錄混合物產(chǎn)生的修飾的寡核苷酸包括基本所有2'-OH腺苷、2'-OH鳥苷、2'-OH胞苷和2'-OH尿苦。在rN轉(zhuǎn)錄的一種優(yōu)選實施方案中，得到的修飾的寡核苷酸包括這樣的序列，其中所有腺苷核苷酸中的至少80。/。是2'-OH腺苷，所有鳥苷核苷酸中的至少80。/o是2'-OH鳥苷，所有胞苷核苷酸中的至少80。/o是2'-OH胞苷，并且所有尿苷核苷酸中的至少80%是2'-OH尿苷。在rN轉(zhuǎn)錄的一種更優(yōu)選的實施方案中，得到的修飾的寡核苷酸包括這樣的序列，其中所有腺苷核苷酸中的至少90。/。是2'-OH腺苷，所有鳥苷核苷酸中的至少90。/。是2'-OH鳥苷，所有胞苷核苷酸中的至少90。/。是2'-OH胞苷，并且所有尿苷核苷酸中的至少9CT/。是2'-OH尿苷。在rN轉(zhuǎn)錄的一種最優(yōu)選的實施方案中，得到的修飾的寡核苷酸包括這樣的序列，其中所有Ai苷核苷酸中的100y。是2'-OH腺苷，所有鳥苷核苷酸中的100。/。是2'-OH鳥苷，所有胞苷核苷酸中的100。/o是2'-OH胞苷，并且所有尿苷核苷酸中的100y。是2'-OH尿苦。在本發(fā)明的rRmY轉(zhuǎn)錄條件下，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物包含2'-OH腺苦三磷酸、2'-OH鳥苷三磷酸、2'-0-曱基胞苷三磷酸和2'-0-曱基尿苷三磷酸。利用本發(fā)明的rRmY轉(zhuǎn)錄混合物產(chǎn)生的修飾的寡核苷酸包括基本所有2'-OH腺苷、2'-OH鳥苷、2'-0-甲基胞苷和2'-0-甲基尿苷。在一種優(yōu)選實施方案中，得到的修飾的寡核苷酸包括這樣的序列，其中所有腺苷核苷酸中的至少8(T/。是2'-OH腺苷，所有鳥苷核苷酸中的至少80Q/o是2'-OH鳥苷，所有胞苷核苷酸中的至少80%是2'-0-甲基胞苷，并且所有尿苷核苷酸中的至少80%是2'-0-甲基尿苷。在一種更優(yōu)選的實施方案中，得到的修飾的寡核苷酸包括這樣的序列，其中所有腺苷核苷酸中的至少90%是2'-011腺苷，所有鳥苷核苷酸中的至少90y。是2'-OH鳥苷，所有胞苷核苷酸中的至少90%是2'-〇-甲基胞苷，并且所有尿苷核苷酸中的至少90%是2'-0-甲基尿苷。在一種最優(yōu)選的實施方案中，得到的修飾的寡核苦酸包括這樣的序列，其中所有腺苦核苦酸中的100%是2'-OH腺苷，所有鳥苷核苷酸中的100%是2'-OH鳥苷，所有胞苷核苷酸中的100%是2'-0-甲基胞苷，并且所有尿苷核苷酸中的100%是2'-0-曱基尿苷。在本發(fā)明的dRmY轉(zhuǎn)錄條件下，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物包含2'-脫氧腺苷三磷酸、2'-脫氧鳥苷三磷酸、2'-0-曱基胞苷三磷酸和2'-0-甲基尿苦三磷酸。利用本發(fā)明的dRmY轉(zhuǎn)錄條件產(chǎn)生的修飾的寡核苷酸包括基本所有2'-脫氧腺苷、2'-脫氧鳥苷、2'-0-甲基胞苷和2'-0-曱基尿苷。在一種優(yōu)選實施方案中，得到的本發(fā)明的修飾的寡核苷酸包括這樣的序27列，其中所有腺苷核苷酸中的至少80%是2'-脫氧腺苷，所有鳥苷核苷酸中的至少80%是2'-脫氧鳥苷，所有胞苷核苷酸中的至少80%是2'-0-甲基胞苷，并且所有尿苷核苷酸中的至少80%是2'-0-甲基尿苷。在一種更優(yōu)選的實施方案中，得到的本發(fā)明的修飾的寡核苷酸包括這樣的序列，其中所有腺苷核苷酸中的至少90%是2'-脫氧腺苷，所有鳥苷核苷酸中的至少90%是2'-脫氧鳥苷，所有胞苷核苷酸中的至少90%是2'-0-甲基胞苷，并且所有尿苷核苷酸中的至少90%是2'-0-甲基尿苷。在一種最優(yōu)選的實施方案中，得到的本發(fā)明的修飾的寡核苷酸包括這樣的序列，其中所有腺苷核苷酸中的100%是2'-脫氧腺苷，所有鳥苷核苷酸中的100%是2'-脫氧鳥苷，所有胞苷核苷酸中的100%是2'-0-甲基胞苷，并且所有尿苷核苷酸中的100%是2'-0-曱基尿苷。在本發(fā)明的rGmH轉(zhuǎn)錄條件下，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物包含2'-OH鳥苷三磷酸、2'-0曱基胞苷三磷酸、2'-0-曱基尿苷三磷酸和2'-0-曱基腺苷三磷酸。利用本發(fā)明的rGmH轉(zhuǎn)錄混合物產(chǎn)生的修飾的寡核苷酸包括基本所有2'-OH鳥苷、2'-0甲基胞苷、2'-0-甲基尿苷和2'-0-甲基腺苷。在一種優(yōu)選實施方案中，得到的修飾的寡核苷酸包括這樣的序列，其中所有鳥苷核苷酸中的至少80。/。是2'-OH鳥苷，所有胞苷核苷酸中的至少80%是2'-0-甲基胞苷，所有尿苷核普酸中的至少80%是2'-0-曱基尿苷，并且所有腺苷核苷酸中的至少80%是2'-0-甲基腺苷。在一種更優(yōu)選的實施方案中，得到的修飾的寡核苷酸包括這樣的序列，其中所有鳥苷核苷酸中的至少90%是2'-OH鳥苷，所有胞苷核苷酸中的至少90%是2'-0-甲基胞苷，所有尿苷核苷酸中的至少90%是2'-0-曱基尿苷，并且所有腺苦核苦酸中的至少90%是2'-0-曱基腺苷。在一種最優(yōu)選的實施方案中，得到的修飾的寡核苷酸包括這樣的序列，其中所有鳥苷核苷酸中的100。/。是2'-OH鳥苷，所有胞苷核苷酸中的100%是2'-0-甲基胞苷，所有尿苦核苦酸中的100%是2'-0-曱基尿苷，并且所有腺苷核苷酸中的100%是2'-0-曱基腺苷。在本發(fā)明的r/mGmH轉(zhuǎn)錄條件下，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物包含2'-0-甲基腺苷三磷酸、2'-0-曱基胞苷三磷酸、2'-0-甲基鳥苷三磷酸、2'-0-甲基尿苦三磷酸和2'-OH鳥苷三磷酸。利用本發(fā)明的rGmH轉(zhuǎn)錄混合物產(chǎn)生的修飾的寡核苷酸包括基本所有2'-0-曱基腺苷、2'-0-甲基胞苷、2'-0-曱基鳥苷和2'-0-甲基尿苷，其中鳥苷核苷酸群體具有最多約〗0%2'-OH鳥苷。在一種優(yōu)選實施方案中，得到的本發(fā)明的r/mGmH修飾的寡核苷酸包括這樣的序列，其中所有腺苷核苷酸中的至少80%是2'-0-甲基腺苷，所有胞苷核苷酸中的至少80%是2'-0-曱基胞苷，所有鳥苦核苷酸中的至少80%是2'-0-甲基鳥苷，所有尿苷核苷酸中的至少80%是2'-0-曱基尿苷，并且所有鳥苷核苷酸中的不超過約10Q/。是2'-OH鳥苷。在一種更優(yōu)選的實施方案中，得到的修飾的寡核苷酸包括這樣的序列，其中所有腺苷核苷酸中的至少90%是2'-0-曱基腺普，所有胞苦核苷酸中的至少90%是2'-0-甲基胞苷，所有鳥苷核苷酸中的至少90%是2'-0-曱基鳥苷，所有尿苷核苷酸中的至少90%是2'-0-曱基尿苷，并且所有鳥苷核苷酸中的不超過約10。/。是2'-OH鳥苷。在一種最優(yōu)選的實施方案中，得到的修飾的寡核苷酸包括這樣的序列，其中所有腺苷核苷酸中的100%是2'-0-曱基腺普，所有胞苷核苷酸中的100%是2'-0-甲基胞苷，所有鳥苷核苷酸中的至少90%是2'-0-甲基鳥苷，所有尿苷核苷酸中的至少100%是2'-0-曱基尿苷，并且所有鳥苷核苷酸中的不超過約10%是2'-OH鳥苷。在本發(fā)明的fGmH轉(zhuǎn)錄條件下，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物包含2'-0-曱基腺苷三磷酸、2'-0-曱基尿苷三磷酸、2'-0-甲基胞苷三磷酸和2'-F鳥苷三磷酸。利用本發(fā)明的fGmH轉(zhuǎn)錄條件產(chǎn)生的修飾的寡核苷酸包括基本所有2'-0-甲基腺苷、2'-0-甲基尿苷、2'-0-甲基胞苷和2'-F鳥苷。在一種優(yōu)選實施方案中，得到的修飾的寡核苷酸包括這樣的序列，其中所有腺苷核苷酸中的至少80%是2'-〇-曱基腺苷，所有尿苷核苷酸中的至少80%是2'-0-甲基尿苷，所有胞苷核苷酸中的至少80%是2'-0-曱基胞普，并且所有鳥苷核苷酸中的至少80%是2'-F鳥苷三磷酸。在一種更優(yōu)選的實施方案中，得到的修飾的寡核苷酸包括這樣的序列，其中所有腺苦核苷酸中的至少90%是2'-0-甲基腺苷，所有尿苷核苷酸中的至少90%是2'-0-甲基尿苷，所有胞苷核苷酸中的至少90%是2'-0-甲基胞苦，并且所有鳥苷核苷酸中的至少90。/。是2'-F鳥苷三磷酸。在一種最優(yōu)選的實施方案中，得到的修飾的寡核苷酸包括這樣的序列，其中所有腺苷核苷酸中的100%是2'-0-甲基腺苷，所有尿苷核苷酸中的100%是2'-0-甲基尿苷，所有胞苷核苷酸中的100%是2'-0-甲基胞苷，并且所有鳥苷核苷酸中的100。/。是2'-F鳥苦三磷酸。在本發(fā)明的dAmB轉(zhuǎn)錄條件下，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物包含2'-脫29氧腺苷三磷酸、2'-0-甲基胞苷三磷酸、2'-0-曱基鳥苷三磷酸和2'-0-甲基尿苦三磷酸。利用本發(fā)明的dAmB轉(zhuǎn)錄混合物產(chǎn)生的修飾的寡核苷酸包括基本所有2'-脫氧腺苷、2'-0-曱基胞苷、2'-0-曱基鳥苷和2'-0-甲基尿苷。在一種優(yōu)選實施方案中，得到的修飾的寡核苷酸包括這樣的序列，其中所有腺苷核苷酸中的至少80%是2'-脫氧腺苷，所有胞苷核苷酸中的至少80%是2'-0-曱基胞苷，所有鳥苷核苷酸中的至少80%是2'-0-曱基鳥苷，并且所有尿苷核苷酸中的至少80%是2'-0-曱基尿苷。在一種更優(yōu)選實施方案中，得到的修飾的寡核苷酸包括這樣的序列，其中所有腺苷核苷酸中的至少90%是2'-脫氧腺苷，所有胞苷核苷酸中的至少90%是2'-0-甲基胞苷，所有鳥苷核苷酸中的至少90%是2'-0-曱基鳥苷，并且所有尿苷核苷酸中的至少90%是2'-0-曱基尿苷。在一種最優(yōu)選實施方案中，得到的修飾的寡核苷酸包括這樣的序列，其中所有腺苷核苷酸中的100%是2'-脫氧腺苷，所有胞苦核普酸中的100%是2'-0-曱基胞苷，所有鳥苷核苷酸中的100%是2'-0-曱基鳥苷，并且所有尿苷核苷酸中的100%是2'-0-曱基尿普。在每種情況下，隨后可以將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為SELEXTM過程中的文庫，用于鑒定適體和/或確定對給定靶具有高度結(jié)合特異性的序列的保守基序。得到的序列已經(jīng)部分穩(wěn)定化，從該過程中去除了這一步驟，以得到優(yōu)化的適體序列，并且因此得到更高度穩(wěn)定化的適體。2'-OMeSELEXTM過程的另一優(yōu)點是得到的序列很可能具有更少的序列中所需的2'-OH核苦酸，可能沒有。只要保留了2'OH核苷酸，可以通過進行SELEXTM后修飾將其去除。如下文描述的，在除上文描述的優(yōu)化條件外的條件下，可以獲得完全摻入2'取代的核苷酸的轉(zhuǎn)錄物的較低但仍然有用的產(chǎn)率。例如，對上述轉(zhuǎn)錄條件的改變包括HEPES緩沖液濃度可以是0-1M。本發(fā)明也考慮使用其它pKa為5-10的緩沖劑，包括例如三-羥曱基-氨基曱烷。DTT濃度可以是0-400mM。本發(fā)明的方法也提供了使用其它還原劑，包括例如巰基乙醇。亞精胺和/或精胺的濃度可以是0-20mM。PEG-8000濃度可以是0-50%(wZv)。本發(fā)明的方法也提供了使用其它親水聚合物，包括例如其它分子量的PEG或其它聚亞烷基二醇。TntonX-100濃度可以是0-0.1%(w/v)。本發(fā)明的方法也提供了使用其它非離子去污劑，包括例如其它去污劑，包括其它Tnton-X去污劑。MgCl2濃度可以是0.5mM-50mM。MnCl2濃度可以是0.15mM-15mM。MgCl2和MnCl2必須存在于描述的范圍內(nèi)，在優(yōu)選的實施方案中，以大約10-3的MgCl2:MnCl2比例存在，4尤選地，該比例是約3-5:1，更優(yōu)選地，該比例是約3-4:1。2'-OMeNTP濃度(每種)可以是5yM-5mM。2'-OHGTP濃度可以是0yM-300juM。2'-OHGMP濃度可以是0-5mM。pH可以是pH6-pH9。本發(fā)明的方法可以在摻入修飾的核苷酸的大多數(shù)聚合酶的活性的pH范圍內(nèi)實施。此外，本發(fā)明的方法提供了任選在轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件中4吏用螯合劑，包括例如EDTA，EGTA和DTT。適體藥物化學(xué)適體藥物化學(xué)是適體改進技術(shù)，其中化學(xué)合成適體變體的于該取代基的位置而彼此不同。然后將這些變體彼此比較或與親本比較。特征的改進可能是足夠顯著的，使得單個取代基的引入對于實現(xiàn)特定治療標準來說就足夠了。或者，/人單變體組收集的信息可以用于i殳計其它變體組，其中同時引入一個以上的取代基。在一種設(shè)計策略中，對所有單取代變體進行排序，選擇前4個，合成并測定這4種單取代變體的所有可能的雙(6種)、三(4種)和四(l種)組合。在第二種設(shè)計策略中，認為最好的單取代基是新的親本，合成并且測定包括這種排序最高的單取代變體的所有可能的雙取代變體。可以采用其它策略，這些策略可以重復(fù)應(yīng)用，使得取代基數(shù)目逐漸增加，而繼續(xù)鑒定進一步改進的變體?？梢圆捎眠m體藥物化學(xué)，作為研究局部而不是全面引入取代基的方法。由于適體是在通過轉(zhuǎn)錄制備的文庫中發(fā)現(xiàn)的，任何在SELEXTM過程中引入的取代基都必須全面引入。例如，如果需要在核苷酸之間引入硫代磷酸酯鍵，則它們僅僅可以在每個A(或每個G、C、T、31U等)引入(全面取代)。通過該過程可以容易地發(fā)現(xiàn)在某些A(或某些G、C、T、U等)需要硫代磷酸酯，而在其它A不能耐受所述硫代磷酸酯的適體。適體藥物化學(xué)方法可以利用的取代基的種類僅僅受到將它們作為固相合成試劑而產(chǎn)生并且將其引入寡聚物合成方案的能力的限制。該方法不僅僅限于核苷酸。適體藥物化學(xué)方案可以包括引入空間體積、疏水性、親水性、親脂性、抗脂性、正電荷、負電荷、中性電荷、兩性離子、極化性、核酸酶抗性、構(gòu)象剛性、構(gòu)象柔性、蛋白結(jié)合特征、質(zhì)量等的取代基。適體藥物化學(xué)方案可以包括堿基修飾、糖修飾或磷酸二酯鍵修飾。當(dāng)考慮在治療性適體范圍內(nèi)可能有益的取代基類型時，可能需要引入屬于以下一種或多種類型的取代基(1)已經(jīng)存在于體內(nèi)的取代基，如2'-脫氧、2'-核糖、2'-0-曱基嘌呤或嘧啶，或5-甲基胞苷。(2)已經(jīng)是批準的治療劑的一部分的取代基，如硫代磷酸酯連接的寡核苷酸。(3)水解或降解為上述兩類之一的取代基，如膦酸甲酯連接的寡核苦酸。本發(fā)明的凝血酶適體包括通過上文描述的適體藥物化學(xué)開發(fā)的適體。結(jié)合凝血酶的適體本發(fā)明的材料包括一系列長度為13-51個核苷酸的核酸適體，其結(jié)合凝血酶，并且在某些實施方案中，在體內(nèi)和/或基于細胞的測定中減少或抑制凝血酶活性。優(yōu)選地，本發(fā)明的適體以高親和力結(jié)合凝血酶，其Ko小于約300pM,優(yōu)選小于約250pM,更優(yōu)選小于約200pM。本發(fā)明的適體提供了治療和/或預(yù)防某些已知由凝血酶導(dǎo)致或以其它方式與凝血酶相關(guān)的凝血相關(guān)病癥的低毒性、安全和有效的形式。本發(fā)明的適體也提供了用于調(diào)節(jié)凝血，特別是用于抗凝的安全和有效的形式，所述調(diào)節(jié)凝血，特別是抗凝與以下手術(shù)程序有關(guān)例如經(jīng)皮冠狀動脈介入，包括放置支架、與外周動脈阻塞疾病(PAOD)相關(guān)的手術(shù)，和心肺旁路(CPB)程序，包括冠狀動脈旁路移植(CABG)手術(shù)。本發(fā)明的適體對抗凝有作用，其可以通過激活的凝血時間(ACT)和其它常規(guī)凝血測量方法進行測量，并且不導(dǎo)致不需要的繼發(fā)作用，如血小板激活(例如隨肝素施用發(fā)生)。此外，在一些實施方案中，抗凝血酶適體具有短的藥代動力學(xué)(PK)和藥物動力學(xué)(PD)半衰期，其導(dǎo)致迅速的、可逆的抗凝血酶作用。用作本發(fā)明的治療劑和/或診斷劑的凝血酶結(jié)合適體的實例包括以下序列SEQIDNOs9-41,43-191,193-204,208-304,307-329，331-332,334,336-337,340-392，396-397,400和402-440。結(jié)合湊是血酶的其它適體描述于下文實施例1和2。這些適體可以包括下文描述的修飾，包括例如，綴合于親脂或高分子量化合物如PEG,摻入加帽部分，摻入修飾的核苷酸，磷酸主鏈中的取代，和硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在本發(fā)明的一種實施方案中，提供了一種分離的、非天然存在的結(jié)合凝血酶的適體。在一些實施方案中，所述分離的、非天然存在的適體對凝血酶的解離常數(shù)("kd")小于100juM，小于lmM,小于500nM，小于100nM,小于50nM,小于1nM,小于500pM,小于約300pM，優(yōu)選小于250pM,更優(yōu)選小于約200pM。可以通過下文實施例1描述的點印跡滴定確定解離常數(shù)。在另一種實施方案中，本發(fā)明的適體減少或抑制凝血酶的功能。在本發(fā)明的另一種實施方案中，適體結(jié)合凝血酶的變體，并且減少或抑制其功能。本文使用的凝血酶變體包括與凝血酶行使基本相同的功能的變體，優(yōu)選包括基本相同的結(jié)構(gòu)，并且，在一些實施方案中，包括與凝血酶的氨基酸序列的70%序列同一性，優(yōu)選80%序列同一性，更優(yōu)選90%序列同一性，更優(yōu)選95%序列同一性。在本發(fā)明的一些實施方案中，用下文描述的BLAST確定靶變體的序列同一性。在兩個或多個核酸或蛋白序列內(nèi)容中的術(shù)語"序列同一性"是指當(dāng)為最大對應(yīng)而進行比較和比對時，用以下序列比較算法之一或通過視覺檢查測量的相同或具有特定百分比的相同氨基酸殘基或核苦酸的兩個或多個序列或亞序列。為了序列比H通常一個序列作為參照序列，測試序列與其進行比4支。當(dāng)采用序列比較算法時，將測試和參照序列輸入計算機，如果必要，指定亞序列座標，并且指定序列算法程序參數(shù)。然后序列比較算法基于指定的程序參數(shù)，計算測試序列相對于參照序列的序歹'J同一性百分比。可以通過例如Smith&Waterman,Adv.Appl.33Math.2:482(1981)的局部同源性算法、通過Needleman&Wunsch，JMol.Biol.48:443(1970)的同源性比對算法、通過Pearson&Lipman，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性方法才全索、通過這些算法的計算機實現(xiàn)(WisconsinGenetics軟件包中的GAP,BESTFIT,FASTA,和TFASTA,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,Wis.)，或通過岸見覺檢查(一般參見Ausubeletal.,mfra)而進行用于比較的序列的最優(yōu)比對。適于確定序列同一性百分比的一個算法的實例是用于基本局部比對檢索工具(此后稱作"BLAST")中的算法，參見例如Altschuletal.,JMol.Biol.215:403-410(1990)和Altschuletal,NucleicAcidsRes.,I5:3389-3402(199"。用于進行BLAST分析的軟件是可以從國家生物技術(shù)信息中心(此后稱作"NCBr)公開獲得的。采用從NCBI可獲得的軟件，例如BLASTN(針對核苷酸序列)和BLASTP(針對氨基酸序列)來確定序列同一'性的默認參數(shù)描述于McGmmsetal,NucleicAcidsRes.，32:W20-W25(2004)。在本發(fā)明的另一種實施方案中，適體與包含SEQIDNOS:43_44,48-49,52,63,72,82,84,92,97，116,130，141,143,146,166,172，185,283,292-294,319-329,331-332,334,336-337,340-392,396-397,400,402-433中任何一個序列的適體具有基本相同的結(jié)合凝血酶的能力。在本發(fā)明的其它實施方案中，適體與包含SEQIDNOS:43-44,48-49,52,63,72,82,84,92,97,116,130,141，143,146,166，172，185,283,292-294,319-329,331-332,334,336-337,340-392,396-397,400,402-433中任何一個序列的適體具有基本相同的結(jié)構(gòu)和結(jié)合凝血酶的能力。在本發(fā)明的另一種實施方案中，適體與SEQIDNOs.:11,15,21,23,32,34,84,86,92,94，116,191，197,200，283-285,287,289-290,292-304,307-318,411，434-438和440中任何一個序列具有基本相同的減少或抑制凝血的能力。在本發(fā)明的另一實施方案中，適體與SEQIDNOs.:11,15,21，23，32，34,84，86,92,94,116,191,197,200,283-285,287,289-290,292-304,307-318,411,434-438和440任何一個序列具有基本相同的減少或抑制凝血的能力以及基本相同的結(jié)構(gòu)。在另一實施方案中，本發(fā)明的適體具有SEQIDNOS191,197，283,292-294，411和434-440中任何一個序列。在另一實施方案中，本發(fā)明的適體用作藥物組合物中的活性成分。在另一實施方案中，本發(fā)明的適體或包含本發(fā)明的適體的組合物用于治療凝血相關(guān)病癥，如急性和慢性的凝血酶介導(dǎo)的凝血病癥。在另一實施方案中，本發(fā)明的適體或包含本發(fā)明的適體的組合物在諸如冠狀動脈血管旁路移植(CABG)程序或經(jīng)皮冠狀動脈介入的手術(shù)程序之前、期間、之后或其任意組合，用作抗凝劑。在一些實施方案中，本發(fā)明的適體治療劑對它們的靶具有高親和力和高特異性，同時減少適體治療劑在患者或受試者體內(nèi)分解時來自非天然核苷酸取代的有害副作用。在一些實施方案中，含有本發(fā)明的適體治療劑的治療組合物不含氟化核苷酸，或含有少量氟化核普酸?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的任何寡核苷酸合成技術(shù)，包括本領(lǐng)域公知的固相寡核苷酸合成技術(shù)(參見例如Froehleretal,Nucl.AcidRes.14:5399-5467(1986)和Froehleretal,Tet.Lett.27:5575-5578(1986))和液相方法，如三酉旨合成方法(參見例如Soodetal，Nucl.AcidRes.4:2557(1977)和Hiroseetal，TetLett.,28:2449(1978))合成本發(fā)明的適體。ARC2172(SEQIDNO294)是合成制造的，并且具有分子式C256H319N104O158P25(游離酸形式)，分子量(MW)為8,155.24道爾頓。ARC2172(SEQIDNO294)的鹽形式具有分子式C256H294Na25NKnCh58P25,相應(yīng)MW為8704.77道爾頓。ARC2172(SEQIDNO294)的鈉鹽的化學(xué)名稱是2'-脫氧胞苦酰基-(3'—5'O,O-磷?；?-2'-脫氧鳥苷?；?(3'—5'0,0-磷?；?-2'-脫氧胞苷?；?(3"5'O,O-磷酰基)-2'-脫氧胞苦?；?(3'—5'0,0-磷?；?-2'-脫氧胸苦?；?(3'—5'O,O-磷?；?-2'-脫氧腺苷酰基-(3'—5'0,0-磷?；?-2'-脫氧胞普?；?(3'—5'O,O-磷?；?-2'-脫氧鳥苷酰基-(3'—5'0,0-磷?；?-2'-脫氧胸苷?；?(3'—5'O,O-磷?；?-2'-脫氧胸香酰基-(3'—5'0,0-磷?；?-2'-脫氧鳥香?；?(3'—5'O,O-磷?；?-2'-脫氧鳥苷?；?(3'—5'0，0-磷酰基)-2'-脫氧鳥苷?；?(3'—5'0,0-磷?；?-2'-脫氧胸苦?；?(3'—5'0，0-磷?；?-2'-脫氧腺苷酰基-(3'—5'O，O-磷酰基)-2'-脫氧鳥苷?；?(3'—5'O,O-磷酰基)-2'-脫氧鳥苷?；?(3"5'O,O-磷酰基)-2'-脫氧鳥苷?；?(3'—5'O，O-磷?；?-2'-脫氧胸苷?；?(3'—5'O,O-磷酰基)-2'-脫氧鳥苦?；?(3'—5'0,0-磷酰基)-2'-脫氧鳥苷?；?(3'—5'O,O-磷酰基)-2'-脫氧胸香?；?(3'—5'0,0-磷?；?-2'-脫氧鳥苷?；?(3'—5'0,0-磷酰基)-2'-脫氧鳥苷?；?(3'—5'O,O-磷?；?-2'-脫氧胞苷酰基-(3"5'O,O-磷?；?-2'-脫氧鳥苷，25-鈉鹽。藥物組合物本發(fā)明也包括含有結(jié)合凝血酶的適體分子的藥物組合物。在一些實施方案中，組合物適于內(nèi)部使用，并且包含有效量的本發(fā)明的藥物活性化合物，其是單獨的或與一種或多種藥學(xué)可接受載體組合。所述化合物特別有用，因為它們具有非常低(如果有)的毒性?；蚓徑饣颊咧兴黾膊』虿“Y的癥狀。例如，本發(fā)明的組合物可以用于治療或預(yù)防與凝血相關(guān)的病理，特別是與凝血酶相關(guān)凝血相關(guān)的病理。者施用，所述疾病或病癥與本發(fā)明的適體以高親和力結(jié)合的靶相關(guān)，或來源于所述把。的受試者施用，所述疾病或病癥與本發(fā)明的適體以高親和力結(jié)合的靶相受試者的方法中。該方法包括給患者或受試者施用適體或包含適體的組合物，所述適體結(jié)合參與病理的靶蛋白(如凝血酶)，使得適體與革巴蛋白的結(jié)合改變靶，例如凝血酶的生物功能，從而治療該病理。具有病理和/或需要抗凝的患者或受試者，即通過本發(fā)明的方法治療的患者或受試者可以是脊推動物，更特別是哺乳動物，如狗、貓、猴和/或有蹄動物，如馬，或更特別是人。在一些實施方案中，在手術(shù)介入之前、期間或之后，或其任意組合，施用本發(fā)明的適體，如ARC2172(SEQIDN0294),所述手術(shù)介入如CABG、PCI、血管成形術(shù)、心血管和外周血管開放和血管內(nèi)手術(shù)、在外周/冠狀動脈或靜脈中放置支架的手術(shù)、放置人工器官、心臟瓣膜的手術(shù)，用于治療冠狀動脈疾病和/或靜脈或動脈，如腎動脈、腹主動脈、頸動脈中的血管疾病，用于治療外周動脈阻塞疾病(TAOD")。在該方法的一些實施方案中，施用本發(fā)明的適體，以預(yù)防手術(shù)后血栓形成，如在髖關(guān)節(jié)置換、膝關(guān)節(jié)置換等之后。在該方法的一些實施方案中，在最小介入性操作，如腹腔鏡、婦科操作等之前、期間、之后，或其任意組合，施用適體。本發(fā)明的適體，如ARC2172(SEQIDN0294),-故用于肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥("HIT")、肝素抗性、腎功能受損和/或肝功能受損患者的抗凝治療中。在進一步的實施方案中，本發(fā)明涉及治療人或其它哺乳動物中的狀況，其中需要減少或抑制凝血酶。本發(fā)明的適體可以用于哺乳動物，包括人，用于治療和/或預(yù)防血栓形成和/或血液和組織中的高凝狀態(tài)，包括急性冠狀動脈綜合征、充血性心衰、房顫、靜脈血栓形成，如深靜脈血栓形成、月申栓塞、動脈血栓形成，如心肌缺血、心肌梗塞、不穩(wěn)定心絞痛、基于血栓形成的卒中和外周動脈血栓形成。此外，適體可以用于治療和/或預(yù)防動力永粥樣硬化病癥(疾病)，如冠狀動S永疾病、腦動脈疾病和外周動脈疾病。在一些實施方案中，本發(fā)明的適體，如ARC2172(SEQIDNO294),可以用于血液透析和散布的血管內(nèi)凝血中的抗凝治療。在一些實施方案中，本發(fā)明的適體可以用于沖洗和/或包被患者體內(nèi)使用的導(dǎo)管、支架和機械裝置的方法中，并且作為體外保存血液、血漿和其它血液制品的抗J是劑。進一步，適體可以用于其它疾病，其中法是血可以是一種基礎(chǔ)起作用的過程，或者是繼發(fā)病理的來源，如癌癥，包括轉(zhuǎn)移、炎性疾病，包括關(guān)節(jié)炎，和糖尿病。本發(fā)明的組合物可以用于在例如手術(shù)，如心臟手術(shù)之前、期間和/或之后治療需要抗凝的患者或受試者的方法中。在調(diào)節(jié)凝血的方法中，在本發(fā)明的一些實施方案中，例如在CABG手術(shù)之前、期間和/或之后，可以通過連續(xù),爭脈內(nèi)輸注或靜脈內(nèi)推注施用抗湊是血酶的適體。在這些實施方案中，可以在本發(fā)明的組合物中作為鈉鹽，在等滲、pH中性、含水的鹽溶液中提供適體。在實施中，以足夠施加需要的生物活性的量施用適體或其藥學(xué)可接受鹽，所述活性例如減少或抑制適體靶，即凝血酶與纖維蛋白原和PAR-I的結(jié)合。本發(fā)明的一方面包括本發(fā)明的適體組合物，其與凝血相關(guān)病癥的其它治療聯(lián)合。本發(fā)明的適體組合物可以包含例如一種以上適體。在一些實例中，與另一種有用的組合物聯(lián)合施用含有一種或多種本發(fā)明化合物的本發(fā)明的適體組合物，另一種有用的組合物例如抗炎劑、免疫抑制劑、抗病毒劑等。此外，本發(fā)明的化合物可以與上文描述的細胞毒性劑、細胞抑制劑或化療劑，如烷化劑、抗代謝物、有絲分裂抑制劑或細胞毒性抗生素聯(lián)合施用。通常，目前可以用于所述聯(lián)合中的已知治療劑的劑型是合適的。"聯(lián)合治療"(或"共同治療")包括施用本發(fā)明的適體組合物和至少一種笫二藥劑，所述第二藥劑作為意欲從這些治療劑的共同作用提供有益效果的特定治療方案的一部分。聯(lián)合的有益效果包括但不限于由這些治療劑的聯(lián)合導(dǎo)致的藥代動力學(xué)或藥物動力學(xué)共同作用。聯(lián)合施用這些治療劑典型是在確定的時間段中進行(取決于選擇的聯(lián)合，通常是分、小時、天或周)。但是，"聯(lián)合治療"可能，但通常不意欲包括施用這些治療劑中的兩種或多種，作為分開的單治療方案的一部分，所述方案順帶和任意地導(dǎo)致本發(fā)明的聯(lián)合。"聯(lián)合治療"意欲包括以序貫方式施用這些治療劑，即，其中在不同的時間施用每種治療劑，以及以基本同時的方式施用這些治療劑，或治療劑中的至少兩種。例如，可以通過給受試者施用具有固定比例的每種治療劑的單膠嚢，或多個每種治療劑的單膠嚢，實現(xiàn)基本同時施用?？梢酝ㄟ^任何合適途徑實現(xiàn)每種治療劑的序貫或基本同時施用，所述途徑包括但不限于局部途徑、口服途徑、靜脈內(nèi)途徑、肌內(nèi)途徑和通過粘膜組織直接吸收?？梢酝ㄟ^相同途徑或通過不同途徑施用治療劑。例如，選擇的耳關(guān)合中的第一種治療劑可以通過注射施用，而耳關(guān)合中的其它治療劑可以局部施用?；蛘撸?，可以局部施用所有治療劑，或可以通過注射施用所有治療劑。施用治療劑的順序不是非常關(guān)鍵的，除非另外指出。"聯(lián)合治療"也可以包括與其它生物活性成分進一步聯(lián)合施用上文描述的治療劑。當(dāng)4關(guān)合治療進一步包含非藥物治療時，可以在任何合適的時間進行非藥物治療，只要從治療劑和非藥物治療的聯(lián)合的共同作用中達到有益效果。例如，在合適的情況下，當(dāng)非藥物治療臨時(可能是數(shù)天或甚至數(shù)周)從治療劑的施用中除去時，仍然達到有益效果。本發(fā)明的治療或藥物組合物通常包含有效量的治療活性成分，其溶解或分散于藥學(xué)可接受的介質(zhì)中。藥學(xué)可接受的介質(zhì)或載體包括任何和全部溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。所述用于藥物活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的使用是本領(lǐng)域公知的。補充的活性成分也可以纟參入本發(fā)明的治療組合物中。根據(jù)本公開內(nèi)容，藥物或藥理組合物的制備將是本領(lǐng)域技術(shù)38人員了解的。典型地，所述組合物可以制備為可注射劑，例如液體溶液或懸浮液；適于在注射前溶解于或懸浮于液體中的固體形式；用于口服施用的片劑或其它固體；控釋膠嚢；或目前使用的任何其它行使，包括滴眼液、霜、洗液、藥膏、吸入劑等。無菌制劑，如外科醫(yī)生、內(nèi)科醫(yī)生或健康護理工作者用于在操作領(lǐng)域處理特定區(qū)域的無菌制劑，如基于鹽水的洗液的使用也是特別有用的。組合物也可以通過微裝置、微顆?；蚝＞d送遞。在配制時，治療劑將以與劑型相容的方式施用，并且以藥理學(xué)有效量施用。制劑容易地以多種劑型施用，例如作為上文描述的可注射溶液的類型，但也可以使用藥物釋放膠嚢等。在上下文中，要施用的活性成分的量和組合物的體積取決于要治療的宿主動物。施用所需的活性化合物的精確量取決于從業(yè)者的判斷，并且對每個個體都是特有的。典型地利用分散活性化合物所需的組合物的最小體積。用于施用的合適方案也是可變的，但典型是最初施用化合物，并且監(jiān)測結(jié)果，然后以其它間隔給予進一步控制的劑量。例如，為了以片劑或膠嚢(如明膠膠嚢)形式口服施用，活性藥物成分可以與口月l、無毒、藥學(xué)接受的惰性載體，如乙醇、甘油、水等組合。此外，當(dāng)需要或必要時，也可以將合適的粘合劑、潤滑劑、崩解劑和著色劑摻入混合物。合適的粘合劑包括淀粉、硅酸鋁鎂、淀粉糊、明膠、曱基纖維素、羧曱基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮、天然糖，如葡萄糖或P-乳糖、玉米增甜劑、天然和合成樹膠，如阿拉伯樹膠、黃芘膠或藻酸鈉、聚乙二醇、蠟等。用于這些劑型中的潤滑劑包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、醋酸鈉、氯化鈉、二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、其鎂或鈉鹽和/或聚乙二醇等。崩解劑包括但不限于，淀粉、甲基纖維素、瓊脂、斑脫土、黃原膠淀粉、瓊脂、藻酸或其鈉鹽或發(fā)泡混合物等。稀釋劑包括例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纖維素和/或甘氨酸。本發(fā)明的化合物也可以以所述口服劑型，作為控釋和持續(xù)釋放片劑或膠嚢、藥丸、粉末、顆粒、酏劑、酊劑、懸浮液、糖漿和乳液施用。栓劑有利地從脂肪乳液或懸浮液制備。藥物組合物可以是滅菌的和/或含有佐劑，如防腐劑、穩(wěn)定39劑、潤濕劑或乳化劑、溶液促進劑、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽和/或緩沖液。此外，它們也含有其它有治療價值的物質(zhì)。根據(jù)常規(guī)混合、造?；虬环椒ㄖ苽浣M合物，并且典型地含有約0.1%-75%,優(yōu)選約1%_50%的活性成分。例如，可以通過溶解、分散等制備液體，特別是可注射的組合物。活性化合物溶解于藥學(xué)純的溶劑，或與該溶劑混合，從而形成可注射的溶液或懸浮液，所述溶劑例如水、鹽水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等。此外，可以配制適于在注射前溶解于液體中的固體形式。本發(fā)明的化合物可以以靜脈內(nèi)(推注或輸注)、腹膜內(nèi)、皮下或肌內(nèi)形式施用，并且都采用制藥領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的形式?？勺⑸鋭┛梢砸猿Ｒ?guī)形式制備，制備為液體溶液或懸浮液。腸胃外注射施用通常用于皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射和輸注。此外，用于腸胃外施用的一種方法根據(jù)美國專利No.3,710,795利用緩釋或持續(xù)釋放系統(tǒng)的植入，其確保維持恒定水平的劑量，該專利在此引入作為參考。此外，可以通過合適的鼻內(nèi)載體、吸入劑的局部使用以鼻內(nèi)形式施用本發(fā)明的優(yōu)選化合物，或使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的經(jīng)皮皮膚貼劑通過經(jīng)皮途徑施用。當(dāng)然，為了以經(jīng)皮送遞系統(tǒng)的形式施用，施用劑量在劑量方案中將是連續(xù)的，而不是間斷的。其它優(yōu)選的局部制劑包括霜、油膏、洗液、氣溶膠噴霧和凝膠，其中活性成分的濃度典型是0.01%_15%w/w或w/v。對于固體組合物，賦形劑包括藥物級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。上文定義的活性化合物也可以采用例如聚亞烷基二醇，例如丙二醇作為載體，配制為栓劑。在一些實施方案中，有利地從脂肪乳液或懸浮液制備栓劑。本發(fā)明的化合物也可以以脂質(zhì)體送遞系統(tǒng)，如小的單層泡、大的單層泡和多層泡形式施用。也可以從多種磷脂，包括膽固醇、硬脂胺或磷脂酰膽堿形成脂質(zhì)體。在一些實施方案中，用藥物的水溶液對脂質(zhì)成分的膜進行水合，形成包裹藥物的脂質(zhì)層，如美國專利No.5,262,564中的描述。例如，本文描述的適體分子可以提供為與親脂化合物或用本領(lǐng)域已知的方法構(gòu)建的非免疫原性的高分子量化合物形成的復(fù)合物。締合核酸的復(fù)合物的一個實例在美國專利No.6,011,020中提供。也可以將本發(fā)明的化合物偶聯(lián)于作為可單巴定的藥物載體的可溶性聚合物。所述聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚鞋基丙基_甲基丙歸酰胺-苯酚、polyhydroxyethylaspanamidephenol或棕櫚酰殘基取代的聚環(huán)氧乙烷聚賴氨酸。此外，本發(fā)明的化合物可以偶聯(lián)于一類用于實現(xiàn)藥物控釋的可生物降解的聚合物，例如，聚乳酸、聚5己內(nèi)酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚縮醛、聚二氫吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝膠的交聯(lián)或兩性嵌段共聚物。如果需要，要施用的藥物組合物也可以含有最小量的無毒輔助物質(zhì)，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑和其它物質(zhì)，如醋酸鈉和油酸三乙醇胺。利用適體的劑量方案是根據(jù)多種因素選擇的，包括患者的類型、物種、年齡、體重、性別和醫(yī)學(xué)狀況；要治療的狀況的嚴重程度；施用途徑；患者的腎功能和肝功能；和采用的特定適體及其鹽。普通醫(yī)生或獸醫(yī)可以容易地確定預(yù)防、對抗或阻斷狀況進展的有效量，并且開處方。以下劑量中給出的分子量僅僅與適體寡聚物重量相關(guān)，不包括任何通過與諸如PEG部分綴合賦予的質(zhì)量。當(dāng)為了指定效果使用時，本發(fā)明的口服劑量是口服約0.05-7500mg/日。組合物優(yōu)選以含有0.5，1.0,2.5,5.0,10.0,15.0,25.0,50.0，100.0,250.0,500.0和1000.0mg活性成分的帶刻痕的藥片形式提供。輸注劑量、鼻內(nèi)劑量和經(jīng)皮劑量將是0.05-7500mg/日。經(jīng)皮、靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)劑量將是0.05-12，000mg/曰。本發(fā)明化合物的有效血漿水平是0.002mg/mL-50mg/mL。本發(fā)明的化合物可以以每日單劑施用，或可以將全部日劑量以每日2、3或4次的分開劑量施用。調(diào)節(jié)適體治療劑的藥代動力學(xué)和生物分布重要的是調(diào)節(jié)所有基于寡核苷酸的治療劑，包括適體的藥代動力學(xué)特征，從而匹配需要的藥用。盡管針對細胞外靶的適體不經(jīng)受與細胞內(nèi)送遞(如基于反義分子和RNAi的治療劑的情況)相關(guān)的困難，但所述適體仍然必須能夠分布于靶器官和組織，并且在體內(nèi)(未修飾)保留與需要的給藥方案一致的時間段。因此，本發(fā)明提供了影響適體組合物的藥代動力學(xué)，特別是調(diào)節(jié)適體藥代動力學(xué)的材料和方法。本發(fā)明的具有較長半衰期(11/2)的凝血酶結(jié)合適體-PEG綴合物可以用于治療多種病癥，例如肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥(HIT)、急性冠狀動脈綜合征(ACS)和深靜脈血栓形成(DVT)。這些適體綴合物表現(xiàn)出的較長半衰期W2影響，例如降低產(chǎn)生需要的效果所必須的劑量。具有較長半衰期的適體綴合物也可以用于慢性病。本發(fā)明的具有較長半衰期(tm)的適體，包括本發(fā)明的適體綴合物和/或穩(wěn)定化的適體，也可以用作血液采集、血液循環(huán)或血液儲存裝置中的抗凝劑，其中該裝置包含有效量的本發(fā)明的抗凝血酶適體或本發(fā)明的抗凝血酶適體的混合物。所述裝置的實例包括但不限于采血袋、采血管和采血注射器。在一種特定實施方案中，在血液儲存裝置如血袋中使用有效量的本發(fā)明的適體，其中血液在約4。C下儲存數(shù)天，優(yōu)選約2周。通過將修飾部分(如PEG聚合物)與適體綴合，和/或摻入修飾的核苷酸(如2'-氟或2'-0-甲基)來改變核酸的化學(xué)組成，實現(xiàn)適體藥代動力學(xué)的可調(diào)節(jié)性(即減少或抑制的能力)。調(diào)節(jié)適體藥代動力學(xué)的能力用于改進存在的治療應(yīng)用，或用于開發(fā)新的治療應(yīng)用。例如，在一些治療應(yīng)用中，例如在可能需要迅速藥物清除或更新的抗肺瘤或急性護理情況下，需要減少適體在循環(huán)中的保留時間?；蛘?，在其它治療應(yīng)用中，例如需要治療劑的系統(tǒng)循環(huán)的維持治療，可能需要增加適體在循環(huán)中的保留時間。此外，適體藥代動力學(xué)的可調(diào)節(jié)性用于改變適體治療劑在受試者中的生物分布。例如，在一些治療應(yīng)用中，可能需要在一種努力中改變適體治療劑的生物分布，以便靶定特定類型的組織或特定器官(或器官組)。在這些應(yīng)用中，適體治療劑優(yōu)先在特定組織或器官中積累。在其它治療應(yīng)用中，可能需要靶定展示出與特定疾病、細胞損傷或其它異常病理相關(guān)的細胞標記或癥狀的組織，使得適體治療劑優(yōu)先在受影響的組織中積累。例如，在2004年3月5日提交的名稱為"適體治療劑的藥代動力學(xué)和生物分布的受控調(diào)節(jié)"的美國臨時申請系列No.60/550790和2005年3月7日提交的名稱為"適體治療劑的藥代動力學(xué)和生物分布的受控調(diào)節(jié)"的美國非臨時申請系列No.11/075,648中描述的，用適體治療劑的聚乙二醇化(例如用20kDaPEG聚合物聚乙二醇化)靶定有炎癥的組織，使得聚乙二醇化的適體治療劑優(yōu)先在有炎癥的42組織中積累。為了確定適體治療劑(如適體綴合物或具有改變的化學(xué)的適體，如修飾的核苷酸的適體)的藥代動力學(xué)和生物分布圖譜，監(jiān)測了許多參數(shù)。所述參數(shù)包括適體組合物的例如半衰期(W2)、血漿清除率(C1)、分布體積(Vss)、濃度-時間曲線下面積(AUC)、最大觀察血清或血漿濃度(Cmax)、和平均保留時間(MRT)。如此處用到的，術(shù)語"AUC"表示適體施用后適體治療劑的血漿濃度對時間作圖的曲線下面積。AUC值用于評估給定適體治療劑的生物利用度(即適體施用后循環(huán)中施用的適體治療劑的百分比)和/或總清除率(Cl)(即適體治療劑從循環(huán)去除的速Vss越大，血漿外存在的適體越多(即更多溢出)。本發(fā)明提供了通過將適體綴合于調(diào)節(jié)部分，如小分子、肽或聚合物末端基團，或通過在適體中摻入修飾的核苷酸而以受控方式調(diào)節(jié)穩(wěn)定化的適體組合物的體內(nèi)藥代動力學(xué)和生物分布的材料和方法。如本文描述的，綴合修飾部分和/或改變核苷酸化學(xué)組成，改變了循環(huán)中適體保留時間的基本方面和在組織中的分布。除了通過核酸酶清除，寡核苷酸治療劑通過腎過濾進行清除。因此，靜脈內(nèi)施用的核酸酶抗性寡核苦酸典型地表現(xiàn)出<10mm的半衰期，除非能夠阻斷過濾。這可以通過促進從快速離開血流分布到組織中，或通過使核苦酸的表觀分子量增加到大于腎'J、球有效大小截留值而實現(xiàn)。下文描述的小治療劑與PEG聚合物的綴合(聚乙二醇化)能夠顯著增加適體在循環(huán)中的保留時間，從而減少給藥頻率并且增強對血管輩巴的有效性。適體可以綴合于多種修飾部分，例如高分子量聚合物，如PEG;肽，如Tat(HIVTat蛋白的13個氨基酸的片段(Vives,etal.(1997),丄Biol.Chetn.272(25):16010-7));Ant(來源于果蠅觸角足(antennapedia)同源異型蛋白的第三個螺旋的16個氨基酸的序列(Pietersz,etal.(2001),Vaccine19(11-12):1397-405))和Arg7(包含聚精氨酸(Arg7)的短的、帶正電的穿透細胞的肽(Rothbard，etal.(2000),Nat.Med.6(11):1253-7;Rothbard,Jetal.(2002),J.Med.Chem.45(17):3612國8));和小分子,如親脂化合物，如膽固醇。在本文描述的多種綴合物中，通過與PEG基團復(fù)合，最顯著改變了適體的體內(nèi)特性。例如，混合的2'F和2'-OMe修飾的43聚合物的復(fù)合阻礙了腎過濾，并且促進適體分布到健康的和有炎癥的組織。此外，20kDaPEG聚合物-適體綴合物證明在防止適體的腎過濾中與40kDaPEG聚合物同樣有效。盡管聚乙二醇化的一種作用是針對適體清除，通過20kDa部分的存在提供的系統(tǒng)暴露延長，也促進適體分布到組織，特別是高度灌注的器官的組織和位于炎癥位點的組織。適體-20kDaPEG聚合物綴合物指導(dǎo)適體分布到炎癥位點，使得聚乙二醇化適體優(yōu)先在有炎癥的組織中積累。在一些情況下，20kDa聚乙二醇化的適體綴合物能夠評估細胞，例如腎細胞內(nèi)部。也可以用#^飾的核苷酸調(diào)節(jié)適體的血漿清除。例如，纟參入2'-F和2'-OMe穩(wěn)定化學(xué)的未綴合的適體與未修飾的適體相比，表現(xiàn)出從血漿的迅速喪失(即迅速血漿清除)和迅速分布到組織中，主要分布到腎中，所述未綴合的適體是目前適體的典型特征，因為它表現(xiàn)出在體外和體內(nèi)的高度核酸酶穩(wěn)定性。PEG衍生的核酸如上文的描述，用高分子量非免疫原性聚合物對核酸進行衍生，具有改變核酸的藥代動力學(xué)和藥物動力學(xué)性質(zhì)的潛能，使得核酸成為更有效的治療劑?；钚缘挠欣淖兛梢园▽怂崦附到獾目剐栽黾印⑼ㄟ^腎的過濾減少、對免疫系統(tǒng)的暴露減少，和改變治療劑在體內(nèi)的分布。生。PAG衍生的核酸描述于2003;n月1r日;交的美國專利申請系列No.10〃18,833,其在此全文引入作為參考。用于本發(fā)明的典型聚合物包括聚乙二醇("PEG")，也稱作聚環(huán)氧乙烷("PEO")和聚丙二醇(包括聚異丙二醇)。此外，不同環(huán)氧烷(如環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷)的無規(guī)或嵌段共聚物可以用于很多應(yīng)用中。在其最常見形式中，聚亞烷基二醇，如PEG，是在每個末端以羥基終止的線性聚合物HO-CH2CH20(CH2CH20)n-CH2CH2-OH。這種聚合物，a,co-二羥基聚乙二醇，也可以表示為HO-PEG-OH，其中-PEG-符號代表以下結(jié)構(gòu)單元-CH2CH20-(CH2CH20)n-CH2CH2-,其中n典型的范圍是約4-約10000。如所示的，PEG分子是雙功能的，并且有時稱作"PEG二醇"。PEG分子的末端部分是相對無反應(yīng)性的羥基部分，即-OH基團，其可以活化或轉(zhuǎn)化為功能部分，用于將PEG連接于位于化合物上的反應(yīng)44位點的其它4匕合物。所述活化的PEG二醇在此稱作雙活化的PEG。例如，已經(jīng)將PEG二醇的末端部分官能化為活性碳酸酯，用于通過用來自N-羥基琥珀酰亞胺的琥珀酰活性酯部分取代相對無反應(yīng)性的羥基部分-OH而與氨基部分選擇性反應(yīng)。在^艮多應(yīng)用中，需要用基本無反應(yīng)性的部分給PEG分子的一端加帽，使得PEG分子是單功能的(或單活化的)。在通常展示活化的PEGs的多個反應(yīng)位點的蛋白治療劑的情況下，雙功能活化的PEGs導(dǎo)致廣泛交聯(lián)，產(chǎn)生功能不佳的聚集物。為了制備單活化的PEGs,典型地用無反應(yīng)性甲氧基末端部分-OCH3取代PEG二醇分子末端上的羥基部分。PEG分子的未加帽末端典型地轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性末端部分，其可以活化，用于連接表面上或諸如蛋白的分子上的反應(yīng)位點。PAGs是典型地在水中，并且在4艮多有機溶劑中具有溶解性質(zhì)，缺乏毒性，并且缺乏免疫原性的聚合物。PAGs的一種用途是將聚合物共價連接于不溶分子，使得到的PAG-分子"綴合物"可溶。例如，已經(jīng)表明當(dāng)不溶于水的藥物紫杉醇與PEG偶聯(lián)時，變得可溶于水。Gre匿ald,etal，J.Org.Chem.,60:331-336(1995)。PAG綴合物通常不僅僅增加溶解性和穩(wěn)定性，也能延長分子的血液循環(huán)半衰期。本發(fā)明的聚烷基化化合物大小典型是5-80kDa,但可以使用任何大小，其選擇依賴于適體和應(yīng)用。本發(fā)明的其它PAG化合物的大小是10-80kDa。本發(fā)明的另一些其它PAG化合物大小是10-60kDa。例如，PAG聚合物的大小可以是至少10、20、30、40、50、60或80kDa。所述聚合物可以線性或分支的。在一些實施方案中，聚合物是PEG。在一些實施方案中，聚合物是分支PEG。在其它實施方案中，聚合物是圖2中描述的40kDa分支PEG。在一些實施方案中，40kDa分支PEG連接于圖3描述的適體的5'末端。與生物表達的蛋白治療劑相反，核酸治療劑典型地從活化的單體核苷酸化學(xué)合成?？梢酝ㄟ^用相同的重復(fù)單體合成摻入PEG，制備PEG-核酸綴合物。例如，通過轉(zhuǎn)化為亞磷酰胺形式而活化的PEGs可以摻入固相寡核苷酸合成?；蛘撸押塑账岷铣煽梢耘c反應(yīng)性PEG連接位點的定點一參入竟?fàn)?。最常見地，這是通過在5，-末端添加游離伯胺而實現(xiàn)的(在固相合成的最后一個偶聯(lián)步驟中用修飾劑亞磷酰胺摻入)。采用這種方法，反應(yīng)性PEG(如活化的PEG,其將與胺反應(yīng)并且與其形成鍵)與純化的寡核苷酸組合，并且在溶液中進行偶聯(lián)反應(yīng)。包括綴合物的表觀大小、(如根據(jù)流體動力學(xué)半徑測量的)。已知較大的綴合物(>10kDa)更有效阻斷經(jīng)過腎的過濾，并且隨后增加小的大分子(如肽、反義寡核苦酸)的血清半衰期。已經(jīng)證明PEG綴合物阻斷過濾的能力隨著PEG大小增加到大約50kDa而增加(進一步增加具有最小有益效果，因為半衰期受到巨噬細胞介導(dǎo)的代謝而不是腎清除的限定)。高分子量PEGs(〉10kDa)的生產(chǎn)可能是困難的、無效的和昂貴的。作為合成高分子量PEG-核酸綴合物的途徑，以前的工作集中于高分子量活化PEGs的產(chǎn)生。制備所述分子的一種分子涉及形成分支的活化PEG,其中兩種或多種PEGs連接于攜帶活化基團的中心。這些高分子量PEG分子的末端部分，即相關(guān)無反應(yīng)性羥基(-OH)部分可以活化，或轉(zhuǎn)化為功能部分，用于一種或多種PEGs與化合物的反應(yīng)位點上的其它化合物連接。分支的活化PEGs具有超過2個末端，并且，在活化兩個或更多末端的情況下，所述活化的高分子量PEG分子在本文中稱作多活化的PEGs。在一些情況下，并不是分支PEG分子的所有末端都活化。當(dāng)分支PEG分子的任何兩個末端活化時，所述PEG分子稱作雙活化的PEGs。在分支PEG分子的僅僅一個末端活化的情況下，所述PEG分子稱作單活化的。作為該方法的一個實例，描述了通過將兩個單甲氧基PEGs連接于隨后^^活化用于反應(yīng)的賴氨酸核心而制備的活化PEG(Harnsetal,Nature,vol.2:214-221,2003)。本發(fā)明提供了合成包括多聚乙二醇化核酸的高分子量PEG-核酸(優(yōu)選適體)綴合物的另一種經(jīng)濟的方法。本發(fā)明也包括PEG連接的多聚寡核苷酸，例如，二聚化適體。本發(fā)明也涉及高分子量組合物，其中PEG穩(wěn)定部分是分開適體的不同部分的接頭，例如，PEG綴合于單適體序列內(nèi)，使得高分子量適體組合物的線性排列是例如核酸-PEG-核酸(-PEG-核酸)n,其中n大于或等于l。本發(fā)明的高分子量組合物包括分子量為至少10kDa的那些。組合物的大小典型是分子量為10-80kDa。本發(fā)明的高分子量組合物的大小是至少10、20、30、40、50、60或80kDa。穩(wěn)定部分是一種分子，或分子的一部分，其改進本發(fā)明的高分子量適體組合物的藥代動力學(xué)和藥物動力學(xué)特性。在一些情況下，穩(wěn)46定部分是一種分子或分子的一部分，其使兩種或多種適體或適體結(jié)構(gòu)域鄰近，或使本發(fā)明的高分子量適體組合物的總體旋轉(zhuǎn)自由度減少。穩(wěn)定部分可以是聚亞烷基二醇，如聚乙二醇，其可以是線性或分支的均聚物或雜聚物。其它穩(wěn)定部分包括諸如肽核酸(PNA)的聚合物。寡核苷酸也可以是穩(wěn)定部分；所述寡核苷酸可以包括修飾的核苷酸和/或修飾的鍵，如硫代磷酸酯。穩(wěn)定部分可以是適體組合物的組成部分，即，它與適體共價鍵合。本發(fā)明的組合物包括高分子量適體組合物，其中兩個或多個核酸部分與至少一個聚亞烷基二醇部分共價綴合。聚亞烷基二醇部分作為穩(wěn)定部分。在聚亞烷基二醇部分在適體的任一末端共價結(jié)合，使聚亞烷基二醇將核酸部分一起連接在一個分子中的組合物中，認為聚亞烷基二醇是連接部分。在所述組合物中，共價分子的主要結(jié)構(gòu)包括線性排列核酸-PAG-核酸。一個實例是具有一級結(jié)構(gòu)核酸-PEG-核酸的組合物。另一個實例是以下線性排列核酸-PEG-核酸-PEG-核酸。為了制備核酸-PEG-核酸綴合物，最初合成核酸，使其攜帶單個反應(yīng)位點(例如，它是單活化的)。在一種優(yōu)選實施方案中，該反應(yīng)位點是通過在寡核苷酸的固相合成的最后一個步驟中加入修飾劑亞磷酰胺，在5，-末端引入的氨基。對修飾的寡核苷酸去保護和純化后，在使活化的PEG的自發(fā)水解最少的溶液中以高濃度重建。在一種優(yōu)選實施方案中，寡核苷酸的濃度是1mM,并且重建的溶液含有200mMNaHC03緩沖液，pH8.3。通過緩慢、逐步加入高度純化的雙功能PEG,起始綴合物的合成。在一種優(yōu)選實施方案中，通過用琥珀酰亞氨基丙酸酯衍生，在兩個末端活化PEG二醇(雙活化的)。反應(yīng)后，通過凝膠電泳或液相色譜純化PEG-核酸綴合物，以分離完全、部分和未綴合的種類。可以連接多個濃縮的PAG分子(例如作為無規(guī)或嵌段共聚物)或更小的PAG鏈，以達到各種長度(或分子量)?？梢栽诟鞣N長度的PAG鏈之間使用非PAG接頭。2'-0-甲基、2'-氟和其它修飾的核苦酸修飾使適體穩(wěn)定抗核酸酶，并且增加其體內(nèi)半衰期。3'-3'-dT帽也增加外切核酸酶抗性。參見例如美國專利5,674,685;5,668，264;6,207,816和6,229,002,在此引入每篇所述專利作為參考。47反應(yīng)性核酸的PAG書亍生可以通過單功能活化PEG與含有一個以上反應(yīng)位點的核酸的反應(yīng)，制備高分子量PAG-核酸-PAG綴合物。在一種實施方案中，核酸是雙反應(yīng)性的，或雙活化的，并且含有兩個反應(yīng)位點通過常規(guī)亞磷酰胺合成，例如圖4說明的3，-5，-二聚乙二醇化而引入寡核苷酸中的5，-氨基和3，-氨基。在替代的實施方案中，可以采用例如嘧啶的5-位、噤呤的8-位或核糖的2'-位作為連接伯胺的位點，將反應(yīng)位點引入內(nèi)部位置。在所述實施方案中，核酸可以具有一些活化的或反應(yīng)性位點，并且認為是多活化的。合成和純化后，在促進與寡核苦酸反應(yīng)位點的選擇性反應(yīng)，同時使自發(fā)水解最小的條件下使修飾的寡核苷酸與單活化的PEG組合。在優(yōu)選實施方案中，用琥珀酰亞氨基丙酸酯活化單曱氧基-PEG,并且在pH8.3進4亍偶聯(lián)的反應(yīng)。為了驅(qū)動雙取代的PEG的合成，提供相對于寡核苷酸化學(xué)計量過量的PEG。反應(yīng)后，通過凝膠電泳或液相色譜純化PEG-核酸綴合物，以分離完全、部分和未綴合的種類。連接結(jié)構(gòu)域也可以具有一個或多個與其連接的聚亞烷基二醇部分。所述PAGs可以是各種長度，并且可以以合適的組合使用，以達到組合物的需要的分子量?？梢酝ㄟ^化學(xué)組成和長度影響特定接頭的作用。太長、太短或與凝血酶形成不利的空間和/或離子相互作用的形式的接頭將阻斷適體和凝血酶之間復(fù)合物的形成。長于跨核酸之間距離所需的接頭可能通過使配體的有效濃度減少而減少結(jié)合穩(wěn)定性。因此，通常必須優(yōu)化接頭組成和長度，從而使適體與靶的親和力最大。如同特別和單獨指出每篇所述公開文獻和專利文件在此引入作為^考。公開文獻和專利文件的引用不意欲承認它們中的任何一篇是現(xiàn)有技術(shù)，也不承認它構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)的內(nèi)容或日期。已經(jīng)通過書面說明描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域:技術(shù)人員可以意識到，可以以多種實施方案實施本發(fā)明，前述說明和下文實施例僅僅是舉例說明，并非限制權(quán)利要求。實施例實施例1:適7本選一奪和序列該程序的總體目的是發(fā)現(xiàn)通過減少或抑制凝血酶活性而作48為潛在抗凝劑的適體。具體地，潛在的適體抗凝劑將與凝血酶的纖維蛋白原結(jié)合外位點(exosite)1結(jié)合，由此與底物(纖維蛋白原)竟?fàn)幗Y(jié)合該酶。為了保留與以前鑒定的具有以下序列5GGTTGGTGTGGTTGG3'(SEQIDNO4)(ARC183)的結(jié)合凝血酶的DNA適體相關(guān)的迅速解離藥代動力學(xué)性質(zhì)，用單DNA組合物進行適體選擇。用硝酸纖維素濾膜捕獲復(fù)合物，伴隨加入10-100倍摩爾過量的肝素，有效阻斷來自適體集合的非中和性外位點2,從而實現(xiàn)高親和力外位點l結(jié)合劑的發(fā)現(xiàn)。此外，進入我們的SELEX方案的其它策略包括在設(shè)計用于除去結(jié)合凝血酶原的適體的最初步驟中捕獲和丟棄凝血酶原適體復(fù)合物，并且4吏凝血酶原和水蛭素/凝血酶復(fù)合物的混合物與適體集合接觸，然后捕獲和丟棄凝血酶原/適體和凝血酶/水蛭素/適體復(fù)合物。引入凝血酶/水蛭素復(fù)合物意名夂有效呈遞外位點2,用于當(dāng)單獨的肝素竟?fàn)師o效時，從不需要的非抑制性結(jié)合劑的集合中捕獲和除去。最終，這些選擇策略導(dǎo)致產(chǎn)生了一系列對凝血酶具有高親和力的適體，所述適體在體外和體內(nèi)減少或抑制凝血酶的活性。實施例1A:湊是血酶DNA選一奪存1進行基于硝酸纖維素過濾柱的選擇，采用由脫氧核苷酸(DNA)組成的核苷酸集合鑒定結(jié)合人凝血酶的適體，得到對人凝血酶具有高親和力的適體。集合制備用ABIEXPEDITEDNA合成4義合成具有序列5NNNGGGATTTAGCTTCCTCTTACACGC-3'(ARC1488,SEQIDNO5)的DNA模板。DNA模板中的一系列N可以是任何核苷酸組合，并且產(chǎn)生得到的適體的獨特序列區(qū)。在標準條件下用引物5'-GATCGATCCTCAGCCAC-3'(ARC1489,SEQIDNO6)和5'-TATACGACTCAGCGTGTAAGAGGAAGCTAArA-3'(ARC1490,SEQIDNO7)對模板進行PCR擴增。擴增后，用乙醇沉淀PCR產(chǎn)物，然后進行堿水解(333mMNaOH,90。C,15mm),隨后用HCL中和，并且加入甲酰胺加樣緩沖液，然后純化。在10%變性聚丙烯酰胺凝膠上分離鏈，從凝膠切除以較高運動性遷移的單鏈DNA集合，被動洗脫，用異丙醇沉淀。得到的集合序列是ARC1488的切割的反向互補片段，長度是50nt,具有以下序列AGGATCGATC-3'(ARC1538,SEQIDNO8)。選擇針對凝血酶進行總共12輪選擇。在第1輪，制備由3mLIXDPBS(w/Ca"和Mg2+)(Gibco，目錄號14040,Invitrogen,Carlsbad，CA)、2x1014個分子的ARC1538DNA集合和卯0皮摩爾凝血酶(300nM終濃度)(EnzymeResearchLabs,SouthBend，IN)組成的結(jié)合反應(yīng)。室溫下將結(jié)合反應(yīng)溫育2小時。溫育過程中，制備Centrex硝酸纖維素過濾柱(Schleicher&Schuell,Keene,NH)用于選擇。用1mL0.5MKOH將每個柱處理15分鐘。處理后，通過離心除去KOH(2000rpm，1分鐘)，用1mLddH20將柱子額外處理15分鐘。然后通過離心除去ddH20(2000rpm，l分鐘)。在制備的過濾柱中加入選^f結(jié)合反應(yīng)物，通過離心旋轉(zhuǎn)(2000rpm,1分鐘)。然后用1xDPBS(w/Ca"和Mg2+)(Gibco,目錄號14040，Invitrogen，Carlsbad，CA)洗滌柱子。洗滌后，用預(yù)先加熱到90°C的1mL洗脫緩沖液(7M脲，300mMNaOAc,5mMEDTA)將柱子洗脫3分鐘，然后通過離心旋轉(zhuǎn)(2000rpm，1分鐘)，并且收集在l.5mLEppendorf管中。然后用1體積的異丙醇和1n1糖原沉淀洗脫液。對于第1輪后的所有后續(xù)輪的選一奪，在陽性選擇前引入陰性選擇柱，以便從集合除去非特異性濾膜結(jié)合劑。按照上文的概括制備陰性選才奪柱。4吏來自前面一輪選4奪的200julIXDPBS(w/Ca2+和Mg2+)(Gibco,目錄號14040,Invitrogen,Carlsbad,CA)和60皮摩爾集合的混合物通過陰性選擇柱，并且收集，然后進行前面描述的結(jié)合反應(yīng)步驟。在后續(xù)輪中也加入竟?fàn)巹﹖RNA，以增加選^^壓力，并且在隨后輪中將肝素加入陽性選4奪步驟中，以結(jié)合外位點2，并且防止適體結(jié)合凝血酶的外位點2。采用的選擇條件概括于下表1。ARC1538DNA集合的擴增需要在5'-末端磷?；?，然后將恒定區(qū)特異性連接于序列的5，-末端(即用于擴增最初的ARC1488合成DNA序列的3'-引物)，然后進4亍標準PCR擴增。因此，在沉淀后，將選定的集合重懸于9julddH20中，在反應(yīng)中加入10yl2X激酶相容性緩沖液(8ul1MDTT+1mL2X快速連接酶緩沖液(NewEngland50Biolabs,Beverly,MA))lju1T4PNK(NewEnglandBiolabs,Beverly，MA),37。C下溫育20分鐘。溫育后，在100皮摩爾3，引物5'-TATACGACTCAGCGTGTAAGAGGAAGCTAArA-3'(ARC1490)(SEQIDNO7)和100皮摩爾3'連接引物5'-GGGATTTAGCTTCC[3T]隱3'(ARC1491)(SEQIDNO192)中加入1ju1T4連接酶(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)，并且在室溫下溫育10分鐘。使反應(yīng)物在含有5，引物5'-GATCGATCCTCAGCCAC-3'(ARC1489)和3，引物(ARC1490)的PCR混合物中達到200iu1。用以下條件循環(huán)PCR反應(yīng)94。C下變性l分鐘，進^f亍94。C下30秒，54。C下30秒和72。C下1分鐘的循環(huán)。循環(huán)PCR,直到終產(chǎn)物是大約10ng/m1，這是用4%e-Gel(Invitrogen,CarlsbadCA)評估的(在下面表1最右邊的一列中稱作"PCR閾值")。然后將產(chǎn)物種植到較大的PCR反應(yīng)中，用于進一步的DNA擴增(20Ml加入400ju1總PCR體積)。擴增后，用乙醇沉淀PCR產(chǎn)物，然后進行i咸水解(333mMNaOH,90°C,15mm),隨后用HCL中和，并且加入曱酰胺加樣緩沖液，然后在10。/。PAGE凝力交上純化。一皮動洗脫純化的產(chǎn)物，沉淀，定量，然后進入下一輪選才奪。選擇是作為單一選擇進行，直到第7輪，其中選擇分為兩個分支(參見表1)。選擇的一個分支持續(xù)增加嚴格性，這是通過減少凝血酶蛋白濃度而測量的。表1:針對人凝血酶進行的DNA選擇#1的SELEX條件輪耙(人凝血酶)竟?fàn)巹㏄CR閾值(#輪)1300dM無152300nM.1mg/mLtRNA183300nM.1mg/mLtRNA154300nM.1mg/mLtRNA105300iiM,1mg/mLtRNA和，1156100nM,1rug/mLtRNA和.1mg/mL肝素7L——J100IiM30nM.1mg/mLtRNA和,1mg/mLtRNA和1mg/roL101051<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>監(jiān)測選擇過程在選擇中進行點印跡結(jié)合測定，以便監(jiān)測集合的蛋白結(jié)合親和力。將微量32P標記的RNA與人凝血酶的系列稀釋液(lnM-1000nM)組合，并且室溫下在終體積為30Jul的lxDPBS(w/Ca^和Mg2+)(Gibco目錄號14040,Invitrogen,Carlsbad，CA)+0.1mg/mlBSA中溫育30分鐘。采用MmifoldI點印跡，96-孔真空過濾歧管(Schleicher&Schuell,Keene,NH),通過硝酸纖維素過濾分析結(jié)合反應(yīng)。采用了由Protran硝酸纖維素(Schleicher&Schuell，Keene,NH)、Hybond-P尼龍(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)和GB002凝股印跡紙(Schleicher&Sclmell,Keene,NH)組成的三層過濾介質(zhì)。與蛋白結(jié)合的RNA捕獲在硝酸纖維素濾膜上，而未結(jié)合蛋白的RNA捕獲在尼龍濾膜上。凝膠印跡紙的引入僅僅是用作其它濾膜的支持介質(zhì)。過濾后，分離濾膜層，干燥,并且在磷光體屏幕(AmershamBiosciences,Piscataway，NJ)上曝光，用Storm860Phosphorimager⑧印跡成"f象系統(tǒng)(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)定量。當(dāng)觀察到人凝血酶存在下與缺乏凝血酶的條件下RNA結(jié)合的顯著正比值，則根據(jù)制造商的說明書，用TOPOTA克隆試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)對集合進4亍克隆。第9和12輪克隆和測序基于集合的結(jié)合，選擇第9輪和第12輪的集合，用于克隆和測序。為了通過序列家族進行篩選，合并來自兩個選擇分支的第9輪和第12輪集合。以25微摩爾的合成規(guī)模，合成所有獨特DNA克隆序列。用下文實施例3A描述的凝血酶原時間(PT測定)篩選來自第9輪的克隆減少或抑制凝血酶活性的能力。PT測定結(jié)果報道于下文實施例3的表17。顯示出第12輪集合不具有導(dǎo)致繼續(xù)進行的新的獨特序列。從合并的第9輪集合得到的克隆的序列列于下文表2。每個克隆的隨機區(qū)從序列5'TCCC后開始，在GTGGCTGAGGATCGTATC3'(SEQIDN042)前終止。但是，由于5'-TCCC序列不是PCR引物的一部分，在SELEX和測序過程中可以觀察到一些突變。因此，在下文序列中可以觀察到該區(qū)域中的點突變。除非另外指出，下文列出的各個序列以5，到3'方向表示，并且在DNASELEXTM條件下選擇，其中所有核苷酸都是脫氧核苷酸。表2:來自針對人凝血酶進行的第9輪DNASELEX#1的克隆AMX(453)一A6(SEQIDNO9)TCCCATCGATCTGGC!GTAATTTACTGGOTCGGGTGCiCTGA。GATCGATCAMX(453)一A9(SEQEDNO10)ATCCCAATGTTGAGACGAGTACXrraTGGIGTAGOGTGaCTGAGGATCGATCAMX(453)_B6(SEQIDNOi1)tcccatcgagctcagtctaggatgggtagggtggtggctgaggatcgatcAMX(453)一B8(SEQIDNO12)TCCCATCGAGCCGGGGT八TGATTATOGGTGGGGTGGCTGAGGATCGATCAMX(453)一B10(SBQIDNO13)tcccatcgatctggggtagttttattgggtcggg丁ggctgaggatcgatcAMX(453)一B12(SEQIDNO14)tcccgatcggtctgoggtgtgttcatcgtttgggtggctgaggatcgatcAMX(453)一C10(SEQIDNO15)TCCTGATTOATCTGAQGOOTATTGTTGGCGTGOGTaGCTGAGGATCGATCAMX(453)—D12(SEQIDNO16)丁cccgattgatctgaggogtattgttggcgtgggtggctgaggatcgatcAMX(453)—E4(SEQIDNO17)tcccgtaatcgagtctgotattgttggtctgggtggctgaggatcgatcAMX(453)一E8(SEQIDNO18)tcctatgatc5"aatgactaaggootggggtoggtgoctgaggatcgatcAMX(453)一E10(SEQIDNO19)tcccggotcgtatccgtttctggc!tggtctogg丁ggctgagga丁cgatcAMX(453)一E12(SEQIDNO20丁CCCGTAATroAGCCTGGTATTGTTGGTCTGGGTGGCTGAGGATCGA丁CAMX(453)一F6(SEQIDNO21)TCCTGATCGGATGTGGTGGGTTATTGGTrraGGTGOCTGAGGATCGATCAMX(453)一F7(SEQIDNO22)TCCCGAGCGATACTGTCTAGGTTGGGTAGGGTCGTOGCTGAGGATCGATCAMX(453)一F11(SEQE)NO23)tcccgagcgatattgtctagottgggtagggtggtggctgaggatcgatcAMX(453)一G5(SEQIDNO24)tcccatgatc5"ttagattcagggatogtgtoggtggctgaggatcgatcAMX(453)—Gl1(SBQEDNO25)TCCCGTATCGAGCTTGGTATraiTGGTCTGGGTGGCTGAGGATCGATCAMX(453)—Hll(SEQIDNO26)tcccttttga5;tgcaacjaacggttgototggotggctgaggatcgatc細X(454)一B7(SEQIDNO27)TCCCGGATCGTTTTGCT丁CAAACiGTTGGGTTGGG丁GGCTGAGGArcGATCAMX(454)B9(SEQE)N028)CCCGACTGAfFcTTACCTTAGGGATOGTCTGGGTGGCT。AGGATCOATCAMX(454)一B12(SEQIDNO29)TCCCTGGTrTCGATCTOTnTGOTTGGTCKK3GTGGCTOAG0ATCGATCAMX(454)一D5(SEQIDNO30)TCCCATCGATTCGGGGTTnTTAGTGGTATGGGTGGCTGAGGATCGATCAMX(454)一D6(SEQIDNO31)TCCCATCaATTTOGGG丁AOTTCTATrO00TTCGG丁0GCTGAaQATCGATCAMX(454)—Dl1(SBQIDNO32)TCCCTGCTrGTC。ATArnTAG。GTTCSGTOT。。aTGOCTGAGGATCGATCAMX(454)JD12SEQIDNO33)TCCCTCGA丁CCGGGOTOTCTTTCGTOGGCTGGGTGGCTGAGCJATCGATCAMX(454)F2(SEQEDNO34)TCCCGAOCGATATTCiCCTAGGrroQaTAGQGTGOTOGCTOAGGATCCfATC她X(454)—F7(SEQIDNO35)TCCCTCGATCTAAGOTGmATTATOGTGTOOOTGGCTGAGGATCGATCAMX(454)一F9(SEQIDNO36)TCCCTOCATCGAGCCTCTA丁GGGATGGTTTGG。T。GCT。AOGATCGATCAMX(454)一G2(SEQIDNO37)TCCCGATCGTTCCG丁GGGGTAGTOTTGOTTGGOGTGGCTGAGGATCGATCAMX(454)_G6(SEQIDNO38)丁CCCTATGGATTCGGGGTACGTTAGTOGTCTOOGTCGCTGAGCA了CGATCAMX(454)一H3(SEQIDNO39)TCCCATCGATCTQGaOTAGTTrrATTaGGTTGGQTGGCTGAGOATCGATCAMX(454)—H6(SEQIDNO40)TCCCTGTTGTTCCOOGG丁GGTTTAATGGTTTGGOTGGCTGAGGATCQATC雄X(454)一H7(SEQU)NO41)TCCCATTAGGTCCGTATACTGGTOAGOTTGGGTGGCTGAGGATCGATC實施例IB:進行了兩次額外的基于硝酸纖維素過濾柱的DNA選擇，用于l)通過在陰性SELEX步驟中摻入凝血酶原，鑒定相對于凝血酶原，對人凝血酶具有高親和力的適體；2)通過在陰性選才奪步驟中加入凝血酶/水蛭素復(fù)合物，鑒定偏向結(jié)合外位點2的凝血酶適體。凝血酶/水蛭素復(fù)合物應(yīng)該有效阻塞凝血酶的外位點1和活性位點，使得能夠從集合中捕獲并除去潛在的外位點2結(jié)合劑。此外，如選擇l，在隨后的輪中在陽性選才奪步驟中加入肝素，以結(jié)合外位點2,并且防止適體結(jié)合凝血酶的外位點2。集合制備和選擇按照上文實施例1A的描述制備用于新選擇的DNA集合。針對人凝血酶(EnzymeResearchLabs,SouthBend,IN)進行了總共9輪選擇。在第1輪中，結(jié)合反應(yīng)由3mLIXDPBS(w/Ca"和Mg2+)(Gibco，目錄號14040,I而trogen,Carlsbad，CA)、2xIO"個分子的ARC1538DNA集合和900皮摩爾凝血酶(300nM終濃度)組成。室溫下將結(jié)合反應(yīng)溫育2小時。溫育過程中，制備Centrex過濾柱(Schleicher&Schuell，Keene,NH)用于選擇。用1mL0.5MKOH將每個柱處理15分鐘。處理后，通過離心除去KOH(2000rpm，1分鐘)，用1mLddH20將柱子額外處理15分鐘。然后通過離心除去ddH20。在制備的Centrex中加入選擇結(jié)合反應(yīng)物，通過離心旋轉(zhuǎn)(2000卬m,l分鐘)。然后用lxDPBS(w/Ca2+和Mg2+)(Gibco,目錄號14040,Invitrogen，Carlsbad,CA)洗滌柱子并且通過離心旋轉(zhuǎn)(2000rpm，1分鐘)。洗滌后，用預(yù)先加熱到9CTC的1mL洗脫緩沖液(7M脲，300mMNaOAc,5mMEDTA)將柱子洗脫3分鐘，然后通過2000rpm離心1分鐘，并且收集在1.5mLEppendorf管中。然后用l體積的異丙醇和lJlil糖原沉淀洗脫液。對于第1輪后的所有后續(xù)輪的選擇，在陽性選擇前引入陰性選擇柱，以便從集合除去非特異性濾膜結(jié)合劑。按照上文的概括制備該柱。使來自前面一輪選擇的200y1DPBS(w/Ca"和Mg2+)(Gibco，目錄號14040,Invitrogen,Carlsbad,CA)和60皮摩爾集合的混合物通過陰性選擇柱，并且收集，然后進行結(jié)合反應(yīng)。在后續(xù)輪中也加入竟?fàn)巹﹖RNA,以增加選擇壓力，并且在隨后輪中將肝素加入陽性選擇步驟中，以結(jié)合外位點2，并且防止適體結(jié)合凝血酶的外位點2。采用的選擇條件概括于下表3。按照上文實施例IA對SELEX1的描述擴增和純化選定的集合。選擇是作為單一選擇進行，直到第3輪，其中選擇分為兩個分支(參見表3)。一個分支(選擇2)按照前面的描述繼續(xù)，其中在每輪的陰性選擇步驟中使用300nM人凝血酶原。用陰性選擇步驟中的150nM凝血酶原(AthensResearch,Athens,GA)和150nM凝血酶和水蛭素(AmencanDiagnostica,Stamford,CT)復(fù)合物繼續(xù)進行另一個分支(選擇3)。表3:凝血酶DNA選擇#2和#3的選擇條件<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>基于上文描述的在選擇中監(jiān)測的集合結(jié)合，克隆了來自選擇#2和#3的第7輪集合，測序，并且用夾心濾膜結(jié)合測定篩選結(jié)合凝血酶的能力。以25微摩爾的合成規(guī)模，通過IDT按順序合成DNA。從來自兩個選擇的第7輪集合獲得的66個組合的序列中，選擇20個獨特序列用于在1個點的點印跡篩選中進行測定。用/"PATP對克隆轉(zhuǎn)錄物進4亍5，末端才示i己，用Centrisep4主(PrincetonSeparations,Adelphia,NJ)》走轉(zhuǎn)純化，以除去過量的標記。用總體積30iu1IXDPBS(w/Ca2+和Mg2+)(Gibco,Catalog#14040,Invitrogen,Carlsbad,CA)中的+/-10nM凝血酶和0.1mg/mlBSA溫育微量的標記的克隆30分鐘。溫育后，結(jié)合反應(yīng)采用前面實施例1A中描述的點印跡結(jié)合測定裝置。為了確定選擇的克隆的kD，用/"PATP對克隆轉(zhuǎn)錄物進行5，末端標記。用人凝血酶的系列稀釋液(根據(jù)特定克隆對凝血酶的親和力，范圍是1pM-1000nM)在點印跡結(jié)合測定中測定ko值，并且代入描述1:1RNA:蛋白復(fù)合物的公式，得到數(shù)據(jù)(適體結(jié)合比例=振幅*([凝血酶]/(KD+[凝血酶]))(KaleidaGraphv.3.51,SynergySoftware,Reading，PA)。從第7輪得到的序列列于下表4。每個克隆的相應(yīng)結(jié)合特征制表于下文表5。對于列于下文表4的每個序列，每個克隆的隨機區(qū)在序列5'TCCC后開始，在GTGGCTGAGGATCGTATC3'(SEQIDN042)前終止。除非另外指出，下文列出的各個序列以5，到3'方向表示，并且在DNASELEXTM條件下選擇，其中所有核苷酸都是脫氧核苷酸。表4:獲自凝血酶DNA選擇#2和#3的第7輪的克隆的序列AMX(395)—Al(SEQIDNO43)TCCCTGCAATTCGAT^AGCAGOOGTGGTQTGGCiTGCiCTGAGGATCGATCAMX(395)—A4(S￡QIDNO44)TCCCGGOAGATCGCTTCGAAAATGGTTGGCOTGCiGTGGCTGAGQATCGATCAMX(395)一A5(SEQIDNO45)TCCX:ACGCATCGATCCT八TATGOOTGGCATGOGGTOaCTGAGG八TCCiATCAMX(395)一A11(SEQIDNO46)TCCCGTAATCGAGCCTGGTATTGTTCGCCTGGGTGOCraAX3aATCGATCAMX(395)—B5(SEQIDNO47)TCCCGCAATCGGTACTCAGqAGGATOOTTGCiGCiTGGCTOAGGATCGATCAMX(395)一B7(SEQIDNO48)TCCCGGaATCGAGTCCQATTAOOOATGGTGTGGGTCGCTOAOOATCGATCAMX(395)一C1(SEQEDN'O49)TCCCGGGTOOTTATCTTCTCAGGGATGOTGT。aGTOC;CTCA。CiATCGATCAMX(395)—C3(SEQIDNO50)TCCCAAGCOATCTGTAAGQGATGGGGTTGCOOOTCGCTGAGGATCOATCAMX(395)—D5(SEQIDNO51)TCCCO人GTGTC八TATCATCAG湖TreG八OTGGaTGGCTGAGG八'rCOATCAMX(395)—Dl1(SEQIDNO52)TCCCAA。ATC5GTACAT織GT咖TGGTGAGG。TGGCTGM3CJATCGATCAMX(395)一B2(SBQIDNO53)TCCTATCQATACG。GQTCrrcTATTGGGTCGGGGTGGCT。AG。ATCOATCAMX(395)一E4(SEQIDNO54)TCCCGACTTc5ATTACTCAOGGGT(XiCTGTG(3QTOClCTGAGGATCGATC60AMX(395)—E7(SEQIDNO55)TCCCGOTCGAGTCCTCACGAAGGGTTGGGAGGaTGGCTCAGGATCGATCAMX(395)一E8(SEQIDNO56)TCCCATGATCGTCAG八TTCAGGGATGGTGTGGGTGGCTOAGGATCGATCAMX(395)一E11(SEQIDNO57)TCCC。GTCGTAlT八GTCTGGGTGGTGTAGCiGTGC3TGaCT0AGGATCGATCAMX(395)一F3(SEQIDNO58)TCCCATAOTATCG入OCCGATTGOATGGTCTGOGTGGCTOAGGATCGATCAMX(395)一G2(SEQIDNO$9)丁CCC八CGGTCCTC入CCT人GOATGGTTAGGGTGGTCGCTGAGGATCGATCAMX(395)一G11(SEQIDNO60)TCCCAGAGCG(3AAATCCTCAGOa0TGG0CiTGGGTCiCJC.raAGGATCGATCAMX(395)一H9(SEQIDNO61)rcCCGGTAGCGATCCAGAGAGGGATGGGGTQOGTGGCTGAGGATCGATCAMX(395)一H10(,IDNO62)TCCCGCAGTATCGOTCTCOTTOOrreiiATGGOGTCiaCTCiAOGATCGATC表5:獲自DNA選擇#2和#3的第7輪的克隆的結(jié)合特征SEQIDNO克隆43AMX(395)一A144AMX(395)一a445AMX(395)二a5鄰AMX(395)一A1147AMX(395)一B5■48amx(395)一b749amx(395>—c150AMXi395;—C351AMX(395)二D552amx(395)一d1153amx(395)一e254'AMX(3沾)—e4.55AMX(395)一E756AMX(395)—E857AMX(395)一E1158AMX(395Lf359amx(395;—g260AMX(395):G1161AMX(395匸H962AMX(395)一隨10nM凝血酵時的結(jié)合％(篩3^)40.7719.643.2935.8017.1032.8240,233.5713.3931.926.5124.029.1221.3133.706.2933.1021.899.612.80Kd6.4029,38N/A14.48承承N/A量K]D躬AASS^AAA仏仏A仏AA61DNA選擇#2和#3的第9輪測序和克隆篩選基于上文描述的在選擇中監(jiān)測的集合結(jié)合，根據(jù)制造商的說明，用TOPOTA克隆試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)克隆了來自選擇#2和#3的第9輪集合，并且測序。從來自兩個選擇的笫9輪獲得的136個序列中，選^奪130個獨特序列用于在針對凝血酶和,疑血酶原的1個點的點印跡篩選中進行測定，以測試對凝血酶的選擇性結(jié)合。以25微摩爾的合成規(guī)模，通過IDT(Coralville,IA)按順序合成克隆。用Y—32PATP只于克隆4爭錄物進4亍5，末端才示i己，用Centrisep4主(PrmcetonSeparations,Adelphia,NJ)旋轉(zhuǎn)純化以除去過量的標記。用總體積30ju1IXDPBS(w/Ca2+和Mg2+)(Gibco,Catalog#14040,Invitrogen，Carlsbad，CA)中的+/-10nM凝血酶和0.1mg/mlBSA溫育微量的標記的克隆30分鐘。溫育后，結(jié)合反應(yīng)采用前面實施例1A中描述的點印跡結(jié)合測定裝置。為了確定選擇的克隆的kD，用/"PATP對克隆轉(zhuǎn)錄物進行5，末端標記。用人凝血酶的系列稀釋液(根據(jù)特定克隆對凝血酶的親和力，范圍是1pM-1000nM)在點印跡結(jié)合測定中測定ko值，并且代入描述1:1RNA:蛋白復(fù)合物的公式，得到數(shù)據(jù)(適體結(jié)合比例=振幅*([凝血酶]/(KD+[凝血酶]))(KaleidaGraphv.3.51,SynergySoftware,Reading,PA)。從DNA選擇#2和#3的第9輪得到的序列列于下表6。每個克隆的相應(yīng)結(jié)合特征制表于下文表7。對于列于下文表6的每個序列，每個克隆的隨一幾區(qū)在序列5'TCCC后開始，在GTGGCTGAGGATCGTATC3'(SEQIDNO42)前終止。除非另外指出，下文列出的各個序列以5'到3'方向表示，并且在DNASELEXTM條件下選擇，其中所有核苷酸都是脫氧核苷酸。表6:獲自凝血酶DNA選擇#2和#3的第9輪的克隆的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>NO克隆名稱序列18SAMX(399)—H7TCCCGGTTGTCGAlTCTGGTATTGTTGC3CiCTGG柳GCTGAGGATCCiATC189AMX(399)朋TCCCTGGTATCGTATCCAAAGGGGTGG丁GTGOGTCiGC丁GAGGATCGATCl卯AMX(399)一H9TOCCGGAGATCCGAGGTGTnTATTGGTTTGGGTGGCTGAGCiATCCiATC表7:獲自凝血酶DNA選擇#2和#3的第9輪的克隆的結(jié)合特征:SEQIDNO克隆10nM凝血酶時的結(jié)合％(篩選)50nM凝血酶原時的結(jié)合％(篩選)對凝血酶的Kd(nM)63AMX(398)—Al15.85i譜0,3064AMX(398)一A226.672S.45N/A65AMX(398)一A445.6747.70L2766AMX(398)—A<331,1531.27N/A67AMX(398)一A726.5025.45N/A68AMX(398)一A840.0243.87N/A69AMX(398)一A928.2629.7'1N/A70AMX(398)一A1235.3637.47N/A71AMX(398)一B131.3332.66'N/A72AMX,—B247.7651.750,3973AMX(398)—B317.5416.54N/A74AMX(398)—B512.488.27奠75AMX(398)—B93.032.16N/A76AMX(398)一B1026.8125.66N/入77AMX(398)一B119.762.0SN/A78AMX(398)一B1220.1120.21風(fēng)79AMX(398)一C135.8037.04N/A80AMX(398)—C2■0.200.66N/A81AMX闊一C310.773.04N/A68<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>SEQIPNO克隆1OnM凝血酵時的結(jié)合°/(篩選)50nM凝血酵原時的結(jié)合°/(篩選)對凝血酶的Kd(nM)107AMX(預(yù))—FS2.763.02108AMX(398)—F927.2430.15跳109AMX(398)一FI234.4(540,32N/A110AMX(398)一G212.6613,75N/A111AMX(398)一G640.3442,14N/A112AMX(39S)—G73Ui33.60N/A113AMX(398)一G828.8529.38N/A114AMX(398)一GH11.4710.91N/AU5AMX(398)一KQ4.815.38N/A116AMX(柳)—H540.57]42.91117歳X(398)一H632,6335,35跳11SAMX(3鄰)一H76.58j4.22跳119AMX(398)—H813,0115,64跳120AMX(39S)一H1019.0020.62跳121AMX(399)—A240.5037.75N/A122AMX(399)一A37.56鄰N/A123AMX(399)一A59.378.23N/A124AMX(399)一A631,8934,19N/A125AMX(399)—A722,7423.02N/A126AMX。99)JU0]12,0510.98N/A127AMX(399)一A117.088,82脆128AMX(399)—A1222.5023.64N/A129AMX(399)一B214.5912,86N/A130AMX(399)—B345.4145.130.64131AMX(399)—B625.4125.41N/A132AMX(399)—BS2.S12別N/A133AMX(399)—l德14.26脆70<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>SEQIDNO克隆1OnM凝血酵時的結(jié)合％(篩選)50nM凝血酶原時的結(jié)合％(篩選)對凝血酶的Kd(nM)188AMX(399)一H73S.1036.07淮189AMX(399)一H823.3414.34190AMX(399)一H93.863,16N/A實施例2:組合物以及序列優(yōu)化和序列實施例2A:DNA選擇#2和#3凝血酶適體的最小化來自DNA選擇存2和#3的第7輪的克隆的最小化用RNA折疊程序(RNAstmcture(1996-2004)DavidH.Mathews,MichaelZuker&DouglasH.Turner)確定第7輪克隆的推定二級折疊，所述克隆的Ko是按照上文實施例IB的描述確定的。高親和力克隆來自相關(guān)序列，并且基于克隆AMX(395)_C1(SEQIDNO49)的折疊，設(shè)計并且合成最小化的適體序列。用人凝血酶的系列稀釋液(根據(jù)特定克隆對凝血酶的親和力，范圍是1pM-1000nM)在上文實施例l描述的點印跡結(jié)合測定中測定ko值，并且代入描述1:1RNA:蛋白復(fù)合物的公式，得到數(shù)據(jù)(適體結(jié)合比例=振幅*([凝血酶]/(KD+[凝血酶]))(KaleidaGraphv.3.51,SynergySoftware,Reading,PA)。基于親本適體AMX(395)—CI(SEQIDNO49)的最小化構(gòu)建體的序列和相應(yīng)的kD列于下文表8。如所示的，最小化過程中鑒定的得到的27聚體ARC1985表現(xiàn)出在DNA選擇存2和S3的第7輪鑒定并且最小化的所有克隆中對凝血酶具有最高的結(jié)合親和力。為了最小化下文表8中描述的DNA適體，所有核苦酸(A，T，C和G)都是脫氧核苷酸。除非另外指出，各個序列都是以5'到3'方向表8:AMX(395)—CI(SEQIDNO49)截短構(gòu)建體的序列和結(jié)合特征SEQIDNOARC#序列(iiM)19ARC1訴5CCTCAGGOATCGTGTCGaTGCiCTCAGG5.773來自DNA選擇存2和弁3的第9輪的克隆的最小化按照上文的描述從DNA選一奪存2和//3的第9輪鑒定的克隆設(shè)計最小化構(gòu)建體，其在上文實施例1B中描述的點印跡結(jié)合測定中表現(xiàn)出最高結(jié)合親和力，并且在下文實施例3A描述的PT測定中具有最強抗凝能力。最小化構(gòu)建體的序列，和每個構(gòu)建體的相關(guān)親本適體描述于下文表9。將每個最小化構(gòu)建體的功能活性與下文實施例3A描述的PT測定中的相關(guān)親本適體進行比較。在設(shè)計的截短的構(gòu)建體中，ARC2091(SEQIDNO197)顯示出與PT測定(參見下文實施例3A)中的親本克隆相似的效能。ARC2091(SEQIDNO197)在從DNA選擇#2和#3的第9輪鑒定并且最小化的所有克隆中顯示出最佳的功能活性，并且是用于下文實施例2B描述的摻雜質(zhì)的(doped)重新選^^的基礎(chǔ)。為了最小化下文表9中描述的DNA適體，所有核苷酸(A，T,C和G)都是脫氧核苷酸。除非另外指出，各個序列都是以5'到3'方向表示。表9:從針對人凝血酶的DNA選擇#2和#3的第9輪中鑒定的克隆設(shè)計的截短的構(gòu)建體的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>實施例2B:ARC2091摻雜質(zhì)的重新選才奪進行采用基于最小化的人凝血酶結(jié)合序列ARC2091(SEQIDNO197)(描述于實施例2A)的摻雜質(zhì)的集合的選擇，以便鑒定對凝血酶的更高親和力。用摻雜質(zhì)的重新選擇探測活性克隆或最小化適體(mimmer)內(nèi)的序列要求。用基于單個序列設(shè)計的合成的、簡并集合進行選擇。簡并水平通常是70%-85%野生型核苷酸。積克言之，觀察到了中性突變，4旦在一些情況下，序列改變可以導(dǎo)致親和力的改變。然后可以用復(fù)合序列信息鑒定最小結(jié)合基序并且輔助優(yōu)化。集合制備采用ABIEXPEDITETMDNA合成4義合成具有序列5'GTGGCTGAGGATCGCCGAATTTCCCGAGAGTTCC3'(ARC2082,SEQIDNO205)的DNA模板，并且通過標準方法去保護。粗體表示的核苦酸具有85%的機會是指出的殘基，并且5%的機會是其它3個核苷酸之一。用5，引物5'ATGCTTTTATACCTTCGGC3，(ARC2083，SEQIDNO206)和3，引物5，GGAACTCTCGGGAAATTCG3'(ARC2084，SEQIDNO207)擴增才莫板。擴增后，用乙醇沉淀PCR產(chǎn)物，然后進行堿水解(333mMNaOH,90。C,15mm),隨后用HCL中和，并且加入甲酰胺加樣緩沖液，然后在10。/。PAGE凝膠上純化。選擇針對凝血酶(EnzymeResearchLabs,SouthBend,IN)進行總共3輪基于硝酸纖維素柱的摻雜質(zhì)的重新選擇。按照上文實施例1A的描述制備Centrex柱(Schleicher&Schuell,Keen,NH)。從第1輪開始引入陰性選擇步驟，以便按照下文從集合中除去非特異性濾膜結(jié)合劑。對于每一輪，按照上文實施例1的描述制備陰性濾膜，旋轉(zhuǎn)100皮摩爾的溶于200jul1XDPBS中的ARC2082(500nM集合濃度)，并且收集。陰性選4奪步驟后，在過濾的集合中加入20皮摩爾凝血酶(lOOnM終濃度)、0.1mg/ml竟?fàn)巹﹖RNA和0.1mg/ml肝素，室溫下溫育1小時。引入竟?fàn)巹﹖RNA，以增加選擇壓力，并且在陽性選擇步驟中加入肝素，以結(jié)合外位點2,并且防止適體結(jié)合凝血酶的外位點2。每輪的選才奪條件概括于表IO。對于每一輪，將選擇結(jié)合反應(yīng)物加入制備的Centrex中并且旋轉(zhuǎn)(2000rpm,1分鐘)。然后用1xDPBS(w/Ca"和Mg2+)(Gibco，目錄號14040,Invitrogen,Carlsbad,CA)洗滌柱子，并且通過離心旋轉(zhuǎn)(2000rpm，1分鐘)。洗滌后，通過4吏系統(tǒng)緩沖液在柱子中保持3分鐘，用加熱到9CTC的1mL洗脫緩沖液(7M脲，300mMNaOAc，5mMEDTA)洗脫柱子，然后2000rpm下離心1分鐘，并且收集在Eppendorf管中。用1體積的異丙醇和1jul糖原沉淀洗脫液。4吏反應(yīng)物在含有5，引物5'ATGCTTTTATACCTTCGGC3'(ARC2083)(SEQIDNO206)和3'引物5'GGAACTCTCGGGAAATTCG3'(ARC2084)(SEQIDNO2084)的PCR混合物中達到200pl。用以下條件循環(huán)PCR反應(yīng)94。C下變性l分鐘，進4亍94。C下30秒，54。C下30秒和72。C下1分鐘的循環(huán)；直到76終產(chǎn)物是大約10ng/m1，這是用4%E-Gel(Invitrogen,Carlsbad,CA)評估的(在表10最右邊的一列中稱作"PCR閾值")。然后將產(chǎn)物種植到4交大的PCR反應(yīng)中，用于進一步的擴增(20jlU加入400yl總PCR體積)。擴增后，用乙醇沉淀PCR產(chǎn)物，然后進行堿水解(333mMNaOH,卯。C，15mm)，隨后用HCL中和，并且加入甲酰胺加樣緩沖液，然后在10。/。PAGE凝膠上純化。洗脫純化的產(chǎn)物，濃縮，定量，然后進入下一輪選擇。按照上文的描述進行隨后的沉淀和凝膠純化。表10:ARC2091(SEQIDNO197)摻雜質(zhì)的重新選擇條件<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>效'J序和篩選三輪選擇后，根據(jù)制造商的推薦用TOPOTA克隆(Invitrogen,Carlsbad,CA)試劑盒克隆摻雜質(zhì)的集合，并且測序。如下文表ll所示，鑒定了總共75個獨特的序列。在摻雜質(zhì)的重新選擇完成前，設(shè)計并合成了ARC2091(SEQIDNO197)的30聚體衍生物，稱作ARC2169(SEQIDNO283),其保留了ARC2091(SEQIDNO197)的所有凝血酶結(jié)合親和力。來自摻雜質(zhì)的重新選擇的序列包括ARC2169(SEQIDNO283)的序列限定的適體的核心功能基序內(nèi)和外的突變。棄去該核心外的突變，在ARC2169(SEQIDN0283)序列背景中測試核心內(nèi)的突變。因此，從下文表11所示的序列，用獲自摻雜質(zhì)的重新選擇的數(shù)據(jù)設(shè)計了一組基于ARC2169(SEQIDN0283)的克隆(參見表12),以測試進一步最小化的效果，和從對適體功能的摻雜質(zhì)的重新選擇得到的最普遍存在的突變。用PTT測定測量突變對適體功能的影響，并且描述于下文實施例3。對于下文表11和表12中描述的DNA適體，所有核苷酸(A，T,C和G)都是脫氧核苦酸。除非另外指出，各個序列是以5，到3，方向表示。表11:來自第3輪ARC2091(SEQIDNO197)摻雜質(zhì)的重新選擇的<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>SEQIDNO克隆名稱序列214AMX(449)一A11ATGCmT八TACC丁TCGGCGACiACTGCC丁AGGTreGGTAGCiGTGGTCGCr(3AGaATTGCCGAATTTCCCG入GAGTTCC215雄X(449)—A12CCOAATTTCCCOAGAGTTCC216AMX(449)—BlATGCTTTTA丁ACCTTCGGCGATAGTGCCTAGGTTGGGTAC!GGTCGTCOTAGTGGATCGCCGAATTTCCCG八GAGTTCC217AMX(449)—B2ATGCTTTTATACCTTCGGC'GGTCGTGTCTAGGGTGGGTACiCiGTGGTGACTCAGOTTTCCCGAATITCCCGAGAGTTCC218AMX(449)—B3ATCCrnT八TACCTTCOOCCAAACTGACTAGCnTGGGTAGGO丁GaTGGCTOTGCiTOaGCCGAATTTCCCGAGAGTTCC219AMX(449)JB4ATGCTTTTATACCTTCGGCGATAGTGCCTAGOTraGGTAGOOTGGTCGCTGAGGCGTGCCGAATTTCCCGAGAGTTCC220AMX(449)一B5A丁GCTTTTATACCTrCGCiCaACACiTGCCTAGOTTCi。Cn'AGGGTGG丁GGCrrAGGC。CGCCGAATTTCCCGAGAGTTCe221AMX(449)一B6ATGCTTTTATACCTTCGGCGATO丁AGACTAGGTTGGGTAaGGTGGTGGCTAAGTATTGCCGAAmCCCGAGAGTTCC222AMX(449)—B8ATGCnTrATACCTTCGGCT八TACTGTCTAGGTTGGGTAGGGTOG'rGACTTAGTGTTGCCGAATTTCCCGA。AGTrCC223AMX(449)一B9ATGCTTTrATACCTTCGGCGGG/VrTGTTTAGGTTOQGTAGtiGTOG丁aGCACiAGGATCG匚'CGAATTTCCCGAGAGTTCC224AMX(449)JB10ATGCTTTrATACCrrOXJCtiGGAT0TCCTAGGTT。00TACiaG丁CiGTGCiCTGAGGTTTGCC。AATTTCCCG人GAGTTCC.225AJVD((449)—BllATGC.nTTATACCTTCGGCTAT八CTGCATAGGrrcCiGTAGGGTGGTGGCTO八CiTG'rrGCC。AATTTC'CCGAGAGTTCC226AMX(449)—C2.ATGCTTTrATACCTTCOGCCiATACTGACTAGGTTGC(GT八GGGTGGTGGCTGATCTTCGCCGAATTTCCCGAGAOTTCC227AMX(449)—C4ATGCTTTTATACCTTCGGCGMAGTGCTTAGGATGGGTAOaGTCiG'raOCTGCGGATCGCCGAATTTCCC3AGAGTTCC228AMX(449)一C5AT。CrnTATACCTrCGGC。Ci丁AGTGCCTA。GrroGOTAGGGTGGTOGCTCTGGATCGCCGAATTTCCCGAGAGTTCC229AMX(449)—C6ATGCTTTTATACCTTCGaCaATATTaCCTAGGTT。G。TAtiGGTCGTGCiCroAACTTTOCCGAATTTCCCGAGAGTTCC'230AMX(449)—C10ATCCTTTTATACCTTCGOCGACACA。ACTAGGATOCKyrAGGGTGGTOGCTGAGGCTCC;CCGAATTTCCCGAGAOTTCC231AMX(449)一C11ATGCrrrTATACCTTCGQCGOACATTGGCTAGGTTG0GTAGGGTG咖GCTGCGGATTGCCGAATTTCCC0AC5ACmCC232AMX(449)一C12ATGCTTTTATACCTTCGGCGATACTGTG丁AGGTTGGGTAC;。。TGGTCGTA(JAG。ATTGCCQAATTrCCCGAGAGTTCC233AMX(449)一D1'ATGCTTTTATACCTTCGaCaATAATGTCT八0GTOGGTAaGGTaOTG(3CTC丁0AATTGCCGAATTTCCCGAGAGTTCC234AMX(449)一D2ATGCTTTTATACCTTCGGCGGTCCTCCCTAGGA則GTACiOOT(3GTGGCCCJAaOATTCCCGAATTTCCCGAGAGTTCC235AMX(449)一D3ATGCmTATACCTTCGGC(3AAGATTOACTAGCnTGGGTA0GGTGG丁GTTrTAG0ATTGCCGAATTTCCCGAG入GTTCC236AMX(449)一D5ATGCTrn'ATACCTTCGGCCATATTGCTTAGQTTGGGTAOGGTCGTAGCTCAGTATTGCC。AATTTCCC0A(3AffnrCC237AMX(449)一D6CGAATTTCCCGAGAaTTCC79SEQIDNO克隆名稱序列238AMX(449)一D7ATGCTTTTATACCTrCGCiCGGATACAGGCTAGaTTGGGTAGGGTGGTGGCTOTTAATCGCCC3AiVrrrcCCGAGAGTTCC239AMX(449)一D8ATGCTTTT八TACCrrCGGO3ATMTGCCTACi0TTGGGTAGGGTOGTGGCTGGGGATTGC-CGAATTTCCCOAGAGTTCC240AMX(449)—D9ATGCTTTT八TACCTTCGGCCATAATAACTAGGTTGGGTAGGG'rGGTGGCTCiATTATCGCCGA八TTTCCCOAOAGTTCC241AMX(449)一D10ATGCTTTTATACCTTCGGCGATATTGCCTAGGATGOOTAGGOTOOTGGCTAAGGTTTGCCGAAT1TCCCGAGAGTTCC:242AMX(柳)一DllATaCTnTATACCTTCQOCGACACAaAGTAOQ'n'GG0TAGGCiT0OTATCTOTCGAATOCCGAATTTCCCOAGAGTTCC243AMX(449)_D12ATaCTTTTATACCTTCCXiCaAT八CTGCCTAGGTTCGGTAG0CiTGGT(3CiCTAGGaATCGCCaAATTTC咖入OACiTTCC244AMX(449)一E1ATGCTTTT八TACCTTC(3GCaACATTACCTAGGrrC!GGTAGGGTGGTGGCTAAGGGTT0CCGAATTTCCCC!AaAGTrCC245AMX(449)_E2ATOCTTTTATACCTTCGGCGCiTTCAGCCTAGGATGGGTAGGGTGOTOGGTGAGGATTGCC0AATTTCOCaAGA0TTCC246AMX(449)一E4ATGCTTTTATACCTTCGGC0ACATAGGGTAGG1TCiGGTAGGGTCGTCCCTOAGaArrcCCGAATITCCCGAOAOTTCC247AMX(449)一E5CGAATTTCCCG入G人GTTCC248AMX(449)一E7ATGCTTTTATACCTTC'QOCOGTAGGGTTTAOGTTGCiaTAGGCTGGTGTCTGAGGATTCCCGAATTTCCCGAGAGTTCC249AMX(449)一E9ATGCrnT八TACCTTCGCiCCATACAGACTAGOTTGGGTA0GGTGGTCiTCTCAGGATCGCCOAATTTCCCGAGAarrCC250AMX(449)—E10CGAATrrCCCGAGAGTTCC251AMX(449)—EllATGCTTTTATACCTTCGGCGGTACTGCATAGGTTGGaTACiGOTGOTGGCTGAGAATCGCCOAATTTCCCaAGMlTTCC252AMX(449)一E12ATGCmTATACCTrCGGC0QC八CTCGCTAGGATG(3GTAaaGTCGTG0CTGAGCATTGCCGAATTTCCCGAGAOTTCC253AMX(449)—FlATGCTTnATACCTrcaaC(3ATAACTGCCT/LGGTTOGGTAGGGTGGTGGCTC人C0ATCGTCCIAATrTCCCGA。AGTTCC254AMX(449)一F3ATCCTTTTATACCTTCGGCGATACT(3CATAGG入TGG0TA。0GTGGTTGCTGATGTOTGCCGAAnTCCCOAGAGTTCC255AMX(449)一F4ATGCTrTT入TACCrrCGGCGATOTTGCCTAGGrrGGOTAGOGTGGTCGTTGTC八G'rTGCCGA八TTTCCCGAG八GTTCC256AMX(449)一F5ATCCTnT入TACCTTCGaCGACACTGTATAGOTTGGGTAGGGTGOTGGCTOATGATTCiCCGAATTTCCC。AG入GTTCC257AMX(449)一F6ATCCTTTTATACCTTCOQCCACATTGCATAOOTTGGCTAOOOTOCTCjGCAAAGTACTOCCGAATTFCCCGAGAGTTCC258AMX(449)一F7ATGCnTTATACCTrCCiCiCG八TACAGaTTAGGATGGGTAaGGTGGT(3GCTGAGTACTGCCGAATTTCCCGAGAOTTCC259AMX(449)—F9ATGCTTTTATACCTrCGGCGATAAGGCiCTAGGATGOGTAGGGTGGTGACTAAAACTCGCCGAATTTCCCG八OAarrCC260AMX(449)—F10ATGCTm'ATACCTTCGGCGAOATTGaCTAGGGTGCiGTAGGGTGGTGCTAGATGATrGCCOAATTTCCCGAOAOTTCC261AMX(449)一f'11ATGCTTTTATACCTTCGGCGACAATOACT人GGTTG。GTAG。OTCCiTaTCTTAGGATGGCCGAATTTCCCGAGAGTTCC80<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>表12:從ARC2091(SEQIDNO197)摻雜質(zhì)的重新選擇得到的突變設(shè)計的一組最小化的構(gòu)建體<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>采用ARC2091(SEQIDNO197)和摻雜質(zhì)的重新選擇數(shù)據(jù)，進一步將ARC2169(SEQIDNO283)最小化為26個核苦酸的適體，稱作ARC2172(SEQIDNO294)，而不破壞對凝血酶的結(jié)合親和力，如下表13所示。對于下文表13描述的DNA適體，所有核苦酸(A，T,C和G)都是脫氧核苷酸。(采用RNAstructure(1996-2004)DavidH.Mathews,MichaelZuker&DouglasH.Turner)推定的ARC2169(SEQIDNO283)、ARC2171(SEQIDNO293)和ARC2172(SEQIDNO294)的二級結(jié)構(gòu)示于圖5。除非另外指出，各個序列是以5，到3，方向表示。表13:基于親本適體ARC2169(SEQIDNO283)的最小化構(gòu)建體的序列和結(jié)合特征<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>采用上文實施例1A描述的硝酸纖維素濾膜結(jié)合測定，將ARC2172(SEQID)NO294)的結(jié)合親和力與以前鑒定的結(jié)合凝血酶的DNA適體ARC183進行比較。如圖6中所示，ARC2172(SEQIDNO294)顯示出相對于ARC183的對凝血酶的親和力的顯著改進。也采用硝酸纖維素濾膜結(jié)合測定，測試了ARC2172(SEQIDNO294)抗人、豬和大鼠凝血酶(均來自EnzymeResearchLabs，SouthBend,IN)的物種交叉反應(yīng)性。如圖7所示，ARC2172(SEQIDNO294)與豬和大鼠凝血酶以及人凝血酶結(jié)合。實施例2C:最小化克隆ARC1985和ARC2169的優(yōu)化觀察到了微小的總體向下的趨勢，其中通過ACT測定(參見實施例3B)測量的適體功能隨著進行最小化嘗試時適體大小的減少而減少。因此，最初的優(yōu)化嘗試涉及通過在推定的莖結(jié)構(gòu)上添加額外的堿基對或聚-T尾而延長分子。序列列于下文表14中的以下分子是基于ARC1985(SEQIDNO191)和ARC2169(SEQIDNO283):設(shè)計的ARC2173-ARC2184在5'或3，末端添加了l-5個額外的石咸基對，設(shè)計的ARC2185-ARC2196在5，或3，末端添加了3或6個"T，，。ARC2183和ARC2184是基于以前選擇的抗凝血酶適體(ARC183)(SEQIDNO4)的適體，在確定以前選擇的凝血酶適體ARC183和本組分子之間的任何相似性的嘗試中，將ARC1985(4十對ARC2183)或ARC2169(4十對ARC2184)的莖元件摻入到ARC183上。用下文實施例3B中描述的ACT測定中的單點篩選(IOpM適體濃度)，測試了這些優(yōu)化的適體的功能性。對于下文實施例14描述的DNA適體，所有核普酸(A,T,C和G)都是脫氧核苷酸。除非另外指出，各個序列是以5，到3，方向表示。83表14:在ARC1985和ARC2169(SEQIDNO283)的第一階段優(yōu)化過程中產(chǎn)生的適體的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>進一步的優(yōu)化采用ARC2169(SEQIDNO283)作為基礎(chǔ)分子，以1微摩爾合成一系列衍生物，以便用2'-OMe或硫代磷酸酯堿基單獨替代每個堿基。用dl(脫氧肌苷)或ml(2'-OMe)堿基單獨取代所有dG(脫氧鳥苷)堿基。每個分子通過PAGE凝膠純化，并且在上文實施例1描述的條件下采用點印跡結(jié)合測定，測量與凝血酶的結(jié)合。這些ARC2169(SEQIDNO283)衍生物的序列和結(jié)合特征列于下文表15?；诒?5所示的結(jié)合數(shù)據(jù)，確定單取代都沒有顯著增加與凝血酶的結(jié)合。對于下文表15描述的適體，"d"表示脫氧核苷酸，"m"表示2'-OMe核苦酸，'T，表示肌苷，"s"表示石克代》粦酸酯核苷酸間鍵。除非另外指出，各個序列是以5，到3'方向表示。表15:ARC2169(SEQIDNO283)的進一步優(yōu)化期間產(chǎn)生的適體的<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>SEQIDNO克隆名稱序列341ARC2635dAdCTdadCdCTdAi!GdQTT<JCidCidCiT<(AdOdOdaTdGmGT<ICMG(iCdA(!GT248342ARC2636dAdCTdGdCdCTdAdGdGTTdGdGdOTMdGdCidGTdCWOmUdGdGdCtlAdeT102343ARC2637dAdCTdGdCdCTaAdGdGTTdadGd(3丁dAdGdGdG丁dGdOTmO(jadCdA(IOT118344ARC2638dAdCtiSGdCdCTdAdCidCnTdOdGdCmiAdCldGdGTdGdOTdOmGdCdAdGT192345AHC2639dAdCWCWCdCTdAdGdGTWGdGdCiTdAdCJdCldCiTdOdOTdGdOmCdAdOT80346ARC2640dAdgTdOdCdCTdAd(MOTTdOdGdaTdAdG咖OT(lOdOTclCWGdCmAdOT174.347ARC2641<JAdCTdOdC'dCTdA*3dGTKGdGdCmJAdCi(i0dCiT(iGdOTiJGdQdCdAmGT171348ARC2642dAdCTdGdCdCTdAdGdGTTdOdGdGTdAdGdGdaTdGdGTdCkiGdCdAdGnil/94349ARC2644(1A二S"dCTdGdCdCTdAdai3GTTdCidGdGT函CMGdGTdG)JGTdGdGdOJAdOT183350ARC2645dAdC-s-TdadCdCTdAdGilGTTdGdGcraTdAdGdCJdOTdGdGTdOdGdCdAdOT167351ARC2646dAdCT-SHWdCMCT<U(lGdGTTdGdadGTdAd。dGdGTdOdGT<JGdCWCdAdGT169352ARC2M7<UdCTdO"S^CdCTdAd(3dCnTdQdGdGTdAdGciGdaTdCWGT(iGdGdC<JAdCiT161353ARC2648dAdCTdGdC-s^CTdAdOdGTTdGdGdOTdAdOdGdOTdGdGTdGdGdCdAdOT128354AJIC2649dAdCTdGdCdC-s-TOAdadOTTdCMOdG'rdAdCidGdOTdGiJGTdGdGdCdAdGT264355ARC2650dAdCTd(MC()Cmd。daTrdGdQdGTdAdG;10dGTdQdGTdGdG()CilAdGT230356ARC2651dA'dCTdGdCdCn-dGdOTTdOdGdGTdAdOdadGTdCWGTdGdaiCMAdGT111357ARC2652t)AdCTdGdCdCTd/WG."GTWC!d(3dGTtJAdGdGdQTdGdC)TdC!dGdC<IAdOT192358ARC2653dAdCTdGdCdCTdAdGdCJ-s-TTdCJdGdCiTdAdGdGdGTdGOOTdGdGdCdAdQT66359ARC2654dA(JCTdGdCdCTdAdGdGT-s-TdGdGdOTdAdGdGdGTi3CldGTdQdGdCdAdGT95360ARC2655(JAtiCTdOdQiCmdGdGTT-S"dGdGdGTdAdOdGdaTda()GTdCidGdCclAdGT7987<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>SEQIDNO克隆名稱序列(pM)384ARC2679dAdCTdGdCdCT(IAdGdGTTdG(lG(IGTdAddGdGTdG(10TdGdGdC(JAdGT355385ARC2680dAdCTdGdCdCTdAclGdGTTdGdCMGTdAdGdldGTdGdqTdGdGdCdAdGT240386ARC2681dAdCTdGdCdCTdAdGdGTTdGdGdGTdAdGdGdrWGdOTdGdGdOfAdCfT334387ARC2682dAdCTdGdCdCTd細dGTMCMG!JGTdAdCldGda，aT()OdGdCdA(iGT129S388ARC2鄉(xiāng)dAdCTdGdCdCTdAdGdOTTdGdGdGTdAdGdGdGTdGdITdCMQdCdAdGT151389ARC2(584dAdCTdOdCdCTdAdGdGTOGdGdOTdAdGdGdGTdGdGTaidGdCdAdGT1883卯ARC2685(JAdCTd。dCdCTdA(lGdOTTdGdGdGTdAdGdGdGTdGd6T(lG服CdA犯T226391ARC2686dAdCTdGdCdCTdAdadGTrclGdG柳dAd。dOd咖GdGT(iadGdCdAdlT189392ARC2687dAdCTtnWCdCTdAdGdGrraGdGdGTdAdGdGdOTdGilOTdGdGdCdAdGT220393ARC26S8dAdCTdGdCdCTdAmldarrdGdGdGTdAdOdGdaTdGtlGTdGdGdC(JAdGTNB394■ARC2689<IAdCTdCidC(iCWAdCiniTTdOda(lGTdAdadGdOTdGdGTdadOdC<)AtlGTNB395ARC2,NB396ARC2691dAdCTcK3(JCdCTdAdGdaTTdCM()OTdAdGdGdOTdGdQTdCWGdCdAdOT2279397ARC2692dAdCTdCWCdCTdAdGdCiTTdCWGniraAdadGdOTdGdOTdGdGdCdAdOT測398纖2柳dAdCTdOdC^lCTdAdGdGrrdGdGdOTdAmltKMGTdGdGTdOdGdCdAdGTNB399ARC2694dMCTdGdCtiCTdAdGiJCnTdOdGdOTdAdOmldOTdGdGTdOdOdQiAdOTNB400ARC2695dAdCTdGdCdCTdAdGdOTTdadCiiiGTdAdGdGtiilTdGdaT(lG(iadCd八ijaT2084401ARC2696dAdCTdGdCdCTdAdGdGTTiKJdGcJGTdAdGdGdGTtMdCrWGdGdCdAdGTNB402ARC2柳dAdCTdadCdCTiJAdGdOTTdGdGdGTdAdGdadOTdGnilTdadGiiCdAclGT1558柳ARC2柳dAdCTdGdCdCTdAdadOTTdpdGdGTdAdGdGdGTdGdaTmMGdCdAdGT165404ARC2,dAdCTdOdCiiCTdAdGdGTTd.GdGdOTdAdGclOdaTdGdGTdOtiiIdCdAdqT128405ARC270QdAdCTdGdCdCTdAdGdGTTdGdGdGTdAdG犯dGTdOt)GTdGdGdCdAmrr46傘NB-非結(jié)合劑實施例2D:ARC2169、ARC2170、ARC2171和ARC2172的第2階段進行了額外的優(yōu)化階段，主要用于調(diào)節(jié)前導(dǎo)適體體內(nèi)活性的持續(xù)時間(因為對于該化合物，需要迅速締合/迅速解離曲線)。為此，89頁設(shè)計了一系列構(gòu)建體，其莖區(qū)中耐受2，-OMe堿基。也改變了莖，使一些G-C堿基對成為A-T堿基對，從而弱化堿基配對，并且可能減少分子的穩(wěn)定性，并且能夠更快降解。下文采用ARC2169(SEQIDNO283),ARC2170(SEQIDNO292),ARC2171(SEQIDNO293)和ARC2172(SEQIDN0294)作為親本分子，概括了2'-OMe取代和G-C改變?yōu)锳-T堿基對形式的突變。每種適體以l微摩爾合成規(guī)^莫合成，并且用PAGE純化，然后通過上文實施例1描述的點印跡測定，測量與凝血酶的結(jié)合。該系列的優(yōu)化構(gòu)建體的序列和結(jié)合特征列于下文表16。對于下文表16描述的適體，"d"表示脫氧核苷酸，"m"表示2'-OMe核苷酸。除非另外指出，各個序列是以5，到3，方向表示。表16:優(yōu)化的ARC2169、ARC2170、ARC2171、ARC2172的序列和結(jié)合特征SEQH)NO克隆名稱序列KD(iiM)406ARC2S239.10407ARC2824mAmCmUmGmCmCTdAdQ(l。TTdQdOdOTdA(ltid。d。TdGdaTm。dOniCTOABKiuiU0.73408ARC2825mAmCmUmOniCdCTdAdOdGTrd(3dGdOTdAdOdOdGTdGdaTdC3(iQniCmAtriCJmU'1.03柳ARC2826dAdATdGdATTdAdCMGTTdGdOdGTdAdGdOdaTdadOTdATdCdATT0,77410ARC2827mAmAmUniGmAniUniU(]Ad娜rWGdG'd3TdA犯dadOTdGdGmUmAniUmCmAmUmU楊411ARC2828mAmAmUmflftiAmUTdA卿CiTTdGc]G(iaTdAiKidCidOTdG(i。TmAniUn、CmAniUniU0,33412ARC28295nAmAmUmGmATTdA(JGdGTTdC;dOdGTdAdGdGdOTdGdaTdAm(JmCniAn)UiuU0.93413潔娜'mCn)UmOmCmCmUdAdGdGTTdGdGdGTdAdGdGdOT(JCklGmUmG(tGmCmAmG15,35414ARC2831mCmUlffl3mCmCTdA(iad。TrdCidG(iaTdAdi3犯dC)TdGdG丁mGdGraCmAmG5.12415ARC2832mCmUmQmCdCTdAdaiGTTdOdGtlGTdAdadGdGTdGdGTdGdGmCmAiTyG1.8890<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>承ND二未測定實施例2E:適體-5'-PEG綴合物的合成基于上文描述的用莖延長進行的第一次優(yōu)化嘗試的初步結(jié)果，制備了抗凝血酶適體ARC2169(SEQIDNO283)和ARC2172(SEQIDNO294)的小的5'-PEG綴合物。該概念是小PEGs可能改進適體效能，而不顯著延長體內(nèi)功能活性的持續(xù)時間(因為對于該化合物，需要迅速締合/迅速解離曲線)。通過首先合成適體的5，-胺修飾形式，制備適體，以促進化學(xué)偶K根據(jù)制造商推薦的程序，用標準商購DNA亞磷酰胺(ChemGenesCorp.Wilmington,MA)和以下支持物合成5'NH2-T3'(ARC2321,SEQIDNO435)和5'NH2-dCdGdCdCTdAdGdGTTdGdGdGTdAdGdGdGTdGdGTdGdGdCdG3'(ARC2324,SEQIDNO436),所述支持物是對于ARC2327(SEQIDNO439)和2338(SEQIDN0438)，是引物支持物200dG(CAT#17-5262-02,GEHealthcare,Uppsala,Sweden);對于ARC2329(SEQIDNO440)是iBuDMT脫氧鳥苷CPG支持物(CAT存CPG60N11DGVN,PrimeSynthesis,Aston,PA),對于ARC2323(SEQIDNO437),是DMT脫氧胸苦CPG支持物(CAT存CPG60N11DTN，PrimeSynthesis,Aston,PA)。用5'-氨基修飾劑TFA氨基C-6CED亞磷酰胺(ChemGenesCorp.Wilmington,MA)連接末端胺功能。去保護后，通過SuperQ5PW(30)樹脂(TosohBiosciences,Montgomeryville,PA)上的離子交^灸色i普純化寡核苷酸，并且用乙醇沉淀。將5，-胺修飾的適體的等分物在合成后綴合于PEG部分(例如2、5和10kDaPEG部分)。將適體溶解于水/DMSO(l:l)溶液，達到1.5-3mM的濃度。加入碳酸鈉緩沖液pH8.5,達到100mM的終濃度，使寡聚物與1.7-3倍摩爾過量的所需PEG試劑(10KDaSunbnghtGL2-400NP對-硝基苯基碳酸酯(NOFCorp，Japan])反應(yīng)過夜，所述PEG試劑溶解于等體積的乙腈中。通過在SuperQ5PW(30)樹脂(TosohBiosciences,Montgomeryville,PA)上進4亍離子交才灸色i普而純化J尋到的聚乙二醇化產(chǎn)物，用AmberchromCG300畫S樹月旨(RohmandHaas,Philadelphia,PA)上進行的反相色i普脫鹽，并且凍干。下文列出了得到的聚乙二醇化的適體序列。在人全血中，用多種濃度的適體在ACT測定中測試這些適體，以及它們的5'胺對應(yīng)物(參見實施例3B)。對于下文列出的每種序列，小寫字母"d"表示脫氧核苷酸(注意，下文列出的序列中的所有核苦酸都是脫氧核苷酸，包括"T",其表示為"T"而不是表示為"dT"),并且"NH"表示促進化學(xué)偶聯(lián)的己胺。ARC2323(SEQIDNO437)(ARC2169+5'-胺+10kDaPEG)其包含以下結(jié)構(gòu)929O/。10kDamPEG-0—6-N-"""^^^"^、(^乂，j_,H-。'0-5'適體3'其中適體=(JAdCTdGdCdCTdAdOdGTWGdGclGTdAdGdGdGTdOdGTdCMCidCdAdGTARC2338(SEQIDNO438)(ARC2172十5'-胺+2kDaPEG)PEG2K—nh掘GdCdCTdAdGdGTTdGdG犯TdAdGdGd(3TdGdCJTdGdG(3CdG其包含以下結(jié)構(gòu)9。oH-o'0—5'適體3'其中適體=dCdGdCdCTdAdGdGTTdGd。dOTdAclGdGdGTdOdGTdOdGdCdG.ARC2327(SEQIDNO439)(ARC2172+5'-胺+5kDaPEG)PEG5K~nl"CdOdCdCTdAdGdGTrdGd0dOTdAdGdGdGTdGdGTdGdGdCdG其包含以下結(jié)構(gòu)5kDamPEG-0-"^^^^義p壬乂士q'H-o'O一5逸體3其中適體=dCdGdCdCTdAdGdGTTdGdGdGTdAdGdGdGTclGdGTdGdGdCdGARC2329(SEQIDNO440)(ARC2172+5'-胺+10kDaPEG)其包含以下結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage94</formula>其中適體二dCdOdCdCTdAdGdGTTdGdGdGTdA(]Gc1GdGTdO(iGTdGdGdCdG實施例3:體外功能測定實施例3A:湊是血酶原測定組織因子是"外源，，凝血途徑的強誘導(dǎo)劑，其在損傷部位釋放。凝血酶原時間("PT")測量將過量的組織因子加入血漿時凝血的時間，并且對外源途徑因子VII和"共同"途徑因子I(纖維蛋白原)、n(凝血酶原)、V和X的水平最每1感。稱作促凝血酶原激酶的PT試劑由與磷脂和鈣混合的組織因子組成，它們是激活一些凝血因子的必要共同因子。除了診斷因子缺陷，臨床PT最常用于監(jiān)測口服抗凝劑華法令，即一種維生素K拮抗劑。PT不用于臨床監(jiān)測肝素，但對用于CABG的高肝素濃度敏感，所述濃度最高達到5U/mL(例如，1U/mL肝素時PT時間是正常對照的142%;數(shù)據(jù)未示出)。PT測定利用Coag-a-mate凝血分析儀(Biomeneux,Durham,NC)、凍干的促凝血酶原激酶(FisherScientific)、檸檬酸化的人血漿(InnovativeResearch,Southfield,MI)和已知濃度的適體。在測試盤(Biomeneux,Durham,NC)中，用檸檬酸化的血漿將已知濃度的適體37。C下預(yù)先溫育3分鐘。然后用200jul促凝血酶原激酶-D(PacificHemostasis,FisherDiagnostics,Middletown，VA)(在10mLddH20中從凍干形式重懸)起始凝血，并且確定凝血時間，分析Coag-a-mate上的測試樣品。采用雙份樣品，平均為單次PT時間。不存在抑制劑/適體時測量出的凝血時間是大約13秒，其在12-14秒的臨床"正常"對照范圍內(nèi)。300秒的值是該儀器測量的最大值。用描述的PT測定篩選從凝血酶DNA選才奪#1的第9輪鑒定的適體(參見實施例1A)減少或抑制凝血酶活性的能力。在檸檬酸化的人血漿中力口入兔促凝血酶原激酶(PacificHemostasis,FisherDiagnostics,Middletwon,VA),采用Coag-A陽Mate(Biomeneux,Durham,NC)進行纖維蛋白聚合物形成的光學(xué)檢測，從而測量3或10微摩爾適體存在時的PT值。從DNA選擇#1的第94侖鑒定的10uM結(jié)合凝血酶的適體的PT值列于下表17。注意背景值沒有從表17列出的PT值扣除。表17:凝血酶適體的PT值-DNA選擇#1的第9輪SEQIDNO克隆名稱10uM適體時的PT(sec)9AMX(453)_A612.810AMX(453)一A929,311AMX(453)—B6300.012AMX(453)一B811.913AMX(453)—B1024.S14AMX(453)—B1212.815AMX(453)一C10104.316AMX(453)—D1212.717AMX(453)—E415.918AMX(453)—E813.119AMX(453)一E1011.820AMX(453)—E1212.221AMX(453)一F6300.095<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>也采用上文描述的PT測定，用10juM適體篩選DNA選4奪#2和#3的第7輪鑒定的結(jié)合凝血酶的適體的最小化構(gòu)建體(參見實施例2A)減少或抑制凝血酶活性的能力。最小化構(gòu)建體ARC1985的PT值(包括背景)示于下表18。表18:來自DNA選擇#2的第7輪的最小化凝血酶適體的PT值<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>也采用10pM適體，在上文描述的PT測定中篩選了展示對凝血酶的高結(jié)合親和力的、在DNA選擇存2和存3的第9輪鑒定的結(jié)合凝血酶的適體(參見實施例2A)減少或抑制凝血酶活性的能力。結(jié)果示于下文表19。注意下文表19中的"N/A"表示沒有測量PT值。表19:來自DNA選擇#2和#3的第9輪的凝血酶適體的PT值(包括背景)<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>sEQroNO克隆名稱10uM適體時的PT(sec)78AMX(398)—B12隱79AMX(398)—CI11.480AMX(398)一C2N/A81AMX(398)—C3N/A82AMX(398)一C564.783AMX(398)一C6N/A84AMX(398)一C3300,085AMX(398)_C9N/A86AMX(398)一C1058.887AMX(398)—Cll11.388AMX(398)—C12N/A89AMX(398)—DlN/A90AMX(398)一D3N/A91AMX(398)一D5N/A92AMX(3訴)—D6300.093AMX(398)一D711.494AMX(398)一D9肌895AMX(398)一ElWA96AMX(398)一E2N/A97AMX(398)一E31U98AMX(398)—E5N/A99AMX(398)一E6N/A100AMX(398)一E7N/A101AMX(398)一E8N/A102AMX(3卯)一EUN/A103AMX(398)—B1210.7104AMX(39S)—F2跳105AMX(398)—F5皿98SE(roNO克隆名稱10uM適體時的PT(sec)106AMX(398)一F6隱107AMX(398)—F8N/A108AMX(398)一F9N/A109AMX(398)一FI2腦U0AMX(39S)—G2跳111AMX(398)—G610.7112AMX(398)一G7N/A113AMX(398)—G8N/A114AMX(—柳)一GIIN/A115AMX(398)一H1N/A116AMX(398)—H571.0117AMX(398)一H611.0H8AMX(398)—H7N/AU9AMX(398)一H8N/A120AMxp鄰)—moN/A121AMX(399)—A211.3122AMX(3效)—A3厳123AMX(399)—A5N/A124AMX(399)一A6N/A125AMX(399)—A7N/A126AMX(399)—A10N/A127AMX(399)一AUN/A128AMX(399)—A12N/A129AMX(399)一B2N/A130AMX(39)—B310.913iAMX(399)一B6脆132AMX(399)一B8N/A133AMX(399)一B9N/A99<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>也采用10juM適體，在上文描述的PT測定中篩選了在DNA選擇存2和存3的第9輪鑒定的高度凝血酶特異性適體的最小化構(gòu)建體(參見實施例2A)減少或抑制凝血酶活性的能力。這些最小化適體相對于得到所述最小化構(gòu)建體的親本適體的PT值(包括背景)比較列于下表20。表20:DNASELEX#2和#3的第9輪PT測定中最小化適體與各自的親本適體相比的PT值<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>最小化適體的SEQIDNO最小化適體名稱親本適體(SEQIDNO)lOuM最小化適體時的PT(sec)1OuM親本適體時的PT199Minimer12AMX(398)一D6(ARC2026)SEQIDNO9210.3300.0200Minimer7AMX(3卯)C8,(SEQIDNO84)83.3300.0201Minimer8AMX(398)—C8(ARC2027)(ARC2027)10,1300.0202Minimer9AMX(398)—C8(ARC2027)SBQ1DN08410,6300.0203Minimer10AMX(398)一C8(ARC2027)SEQIDN08411.0300.0204Minimer11AMX(398)一C8(ARC2027)SEQIDNO8427.9300.0也在上文描述的PT測定中篩選了基于摻雜質(zhì)的重新選l奪而設(shè)計的最小化構(gòu)建體減少或抑制凝血酶活性的能力。結(jié)果示于下表21。表21:來自ARC2091(SEQIDNO197)摻雜質(zhì)的重新選擇的最小化凝血酶適體的PT值(包括背景)SEQIDNO克隆名稱.10uM適體時的PT(sec)283ARC2169300284ARC2169.1285ARC21狄2300103roNO克隆名稱10uM適體時的PT("sec)286ARC2169.311287ARC21欣453.8288ARC2169.512.8289ARC2169.6300290ARC2169.7300291ARC2169.828.7292ARC2170300293ARC2171300294ARC2172300采用上文描述的PT測定，篩選ARC2172(SEQIDNO294)與ARC183相比減少或抑制l是血酶活性的能力。如圖8所示，在相同的摩爾濃度下，ARC2172(SEQIDN0294)比ARC183更有效。實施例3B:激活的凝血時間測定ACT測量加入內(nèi)源途徑激活劑時非檸檬酸化全血中的凝血時間。ACT相對于apTT對肝素4交不敏感(例如，1U/mL肝素時ACT時間是正常對照的181%;數(shù)據(jù)未示出)，因此，ACT通常用作床旁測試，用于監(jiān)測CABG期間的高肝素劑量。與其它凝血測試不同，ACT不進行標準化，因此，ACT結(jié)果依賴于使用的激活劑類型和檢測方法而不同。對于該儀器，公開的靶凝血時間對于旁路手術(shù)中的肝素抗凝是>420秒，相應(yīng)于3—5U/mL的濃度。在利用光學(xué)檢測的凝血分析儀(HemochronJr.,ITCMed,EdisonNJ)上采用ACT+比色杯(ITCMed，EdisonNJ)進行以下測量。采用ACT測定，篩選了表現(xiàn)出對凝血酶的高結(jié)合親和力或在PT測定中表現(xiàn)出極佳PT值的實施例1和2中描述的選一奪的適體減少或抑制凝血酶活性的能力。簡言之，用已知濃度范圍(O-IOjuM)的選擇的適體預(yù)先溫育.70yl新鮮全血，所述適體室溫下以7ju1體積加入血液中30秒。隨后立即在血液/適體混合物中加入30ju125mMCaCl2,然后將樣品加入預(yù)熱到37°C的ACT+比色杯(HemochronJr.,ITCMed，EdisonNJ),用于在104HemochronJr.凝血分析儀(HemochronJr.,ITCMed,EdisonNJ)中進行分析。測量的125-150秒的時間認為是ACT測定的背景。選擇的適體在ACT測定中的結(jié)果示于下表22。注意背景值沒有從下表22列出的ACT值中扣除。表22:ARC1985,ARC2026,ARC2027,ARC2091,ARC2169和ARC2171的ACT值<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>也用上文描述的ACT測定，測量了與凝血酶DNA適體ARC183相比，ARC2172(SEQIDNO294)減少或抑制凝血酶活性的能力。如圖9所示，ARC2172(SEQIDNO294)產(chǎn)生了ACT的濃度相關(guān)延長，需要>2wM適體達到〉400秒的耙凝血時間。在2-10yM的濃度范圍，ARC2172(SEQIDNO294)顯示出比ARC183顯著更高的效力。也采用上文描述的ACT測定篩選了上文實施例2C描述的優(yōu)化的適體在10juM適體濃度時減少或抑制凝血酶活性的能力。這些結(jié)果示于下文表23。ARC2169和ARC1985的環(huán)區(qū)進行了突變，以對應(yīng)ARC183的序列，分別得到ARC2183和ARC2184。這些分子不再比ARC183有-爻，如下表23所示。表23:在第1階段優(yōu)化嘗試中鑒定的適體的ACT值(包括背景)<table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table>SEQIDNO克隆名稱10uM時的ACT(sec)312ARC2190389313ARC2191453314ARC2192423315ARC2193545316ARC2194462317ARC2195438318ARC2196441也在上文描述的ACT測定中用一定濃度范圍(O-IOuM)的適體測量上文實施例2E中描述的聚乙二醇化適體和它們的5'-胺綴合的中間體的ACT值。結(jié)果示于下表24。表24:—個亞組的聚乙二醇化適體及各自的5'-胺中間體的ACT值(包4舌背景)適體(uM)ACT值(sec)ARC2321(SEQIDNO435)ACT值(sec)ARC2324(SEQIDNO436)ACT值(sec)AKC2323(SEQU>NO437)ACT值(sec)ARC2329(SEQIDNQ440)10440.5424.5514.56645418400536558.52.5402.5376.5477.5.507.51348234250.52600.5162138.5144.51360-139139139139實施例3C:激活的部分促凝血酶原激酶時間(aPTT)與帶負電的表面(如玻璃、二氧化硅、膠原蛋白)的接觸使"內(nèi)源性"凝血途徑激活。aPTT測量在血漿中加入帶負電的激活劑后凝血的時間，并且對因子VIII、IX、XI、XII、激肽l奪放酶原、高分子量激肽原和共同途徑成分敏感。用檸檬酸化的血漿預(yù)先溫育包括磷脂(部107分促凝血酶原激酶)和激活劑的aPTT試劑(激活步驟)，然后通過加入CaCl2起始凝血。由于肝素(與抗凝血酶復(fù)合)靶定內(nèi)源性途徑和共同途徑中的一些因子，aPTT對肝素比PT顯著更每丈感(例如lU/mL肝素時的aPTT時間是正常對照的〉1000%,數(shù)據(jù)未示出)，并且可以用于監(jiān)測低劑量的治療性肝素?；景凑諏τ赑T測定的描述，用Coag-a-Mate儀器(Biomeneux,Durham,NC)測量人血漿中ARC2172(SEQIDNO294)與ARC183相比對aPTT的影響，不同指出是在加入100juL20mMCaCl2起始達是血之前用100juLaPTT-LS試劑(PacificHemostasis，F(xiàn)isherDiagnostics,Middletown,VA)使血漿/抑制劑混合物激活3分鐘。不存在適體時測量的約20秒的凝血時間，處于臨床正常范圍(20-40秒)內(nèi)。如圖10所示，相對于PT，aPTT對ARC2172(SEQIDNO294)的敏感性在某種程度上降低；但是，ARC2172(SEQIDNO294)的抗凝活性顯著延長了aPTT測定中的凝血時間。此外，再次證明ARC2172(SEQIDNO294)在aPTT測定中比ARC183顯著更有效。實施例3D:靜止血液的凝血按照下文測量與ARC183相比，ARC2172(SEQIDNO294)在足量時間中保持抗凝作用，以防止靜止血液中的凝血的抗凝作用。37。C下在人全血中溫育等摩爾濃度(5juM)的ARC2172(SEQIDN0294)或ARC183最多1.5小時，隨時間監(jiān)測樣品中凝血級耳關(guān)的激活。加入組織纖溶酶原激活劑(5kU/mL),以促進聚合的纖維蛋白的分解，并且維持樣品流動性，使得可以取得時間點。在每個時間點通過凝血酶原蛋白水解片段1.2的ELISA測定的凝血酶產(chǎn)生，用作凝血級聯(lián)激活的標志物。簡言之，將樣品直接加入預(yù)先包一皮的EnzygnostTAT微量ELISA(DadeBehring;Deerfield,Illinois;cat.#OWMG15)的孔。隨后根據(jù)制造商的程序完成ELISA。為了獲得這些條件下抗凝效力的指示。在溫育開始時，按照上文實施例3B的描述測量ACTs,分別觀察每種化合物的凝血時間是388和266秒。如圖11所示，5juM的ARC2172(SEQIDNO294)防止靜止血液中的凝血級聯(lián)激活，持續(xù)30分鐘。該作用代表相對于ARC183的顯著改進，在相似條件下，ARC183的抗凝持續(xù)時間僅僅是大約10分鐘，并且該作用基本平4亍于ACT值延長所測量的ARC2172(SEQID108NO294)的改進的效力。實施例4:藥代動力學(xué)和藥物動力學(xué)研究在實施例4和5中，所有基于質(zhì)量的適體濃度數(shù)據(jù)僅僅表示適體的寡核苷酸部分的分子量，而不考慮PEG綴合所賦予的質(zhì)量。實施例4A:抗凝血酶適體的大鼠IV推注研究在IV推注施用于Sprague-Dawley大鼠后，才艮據(jù)抗凝藥代動力學(xué)特征對io種具有需要的體外特性的結(jié)合凝血酶的適體(上文實施例1和2描述的ARC2949(SEQIDNO434),ARC2172(SEQIDNO294),ARC2324(SEQIDNO436),ARC2327(SEQIDNO439),ARC2338(SEQIDNO438),ARC2329(SEQIDNO440)，ARC2840(SEQIDNO423)，ARC2321(SEQIDNO435)，ARC2323(SEQIDNO437),ARC2828(SEQIDN0411))進行排序，并且與ARC183進行比較。通過以下方法預(yù)先制備適體給藥溶液將凍干的適體溶解在生理鹽水中，用生理鹽水調(diào)節(jié)給藥溶液的濃度直到通過分光光度計分析確定達到正確的濃度，通過0.22jum濾膜將得到的溶液無菌過濾到無菌樣品管形瓶中，然后-20。C下冷凍直到使用。在給藥期間將解凍的管形瓶放置在濕水上，當(dāng)不用于給藥時，將使用的管形瓶在4。C下儲存。除ARC183夕卜，所有適體都是以1.5微摩爾/kg的劑量給藥，該劑量產(chǎn)生范圍是300-700秒的最大ACTs。ARC183以6.35微摩爾/kg的劑量給藥。通過留置的頸靜脈導(dǎo)管，給股靜脈和頸靜脈插管的有意識的雄性未接觸過抗原的Sprague-Dawley大鼠靜脈內(nèi)施用適體。在預(yù)定的時間點(給藥前;給藥后0.83、1.83、2.83、5、10、15、20、30、40、50和60分鐘；如果到給藥后60分鐘還沒有達到基線ACT,則也采用額外的時間點，即給藥后90和120分鐘)從股靜脈導(dǎo)管采集出300jul血液樣品。用上文實施例3B描述的ACT測定，實時確定ACTs。研究i殳計和結(jié)果片既括于圖12。ARC2949(SEQIDNO434)，ARC2172(SEQIDNO294)和ARC2321(SEQIDNO435)在顯著更低的劑量(是ARC183的mg/kg的38-48%,摩爾/kg的24%)比ARC183更有效，它們分別是24、26或30個寡核苷酸組成的ARC2169(SEQIDNO283)的未聚乙二醇化形式。當(dāng)基于大小比較這三種適體時，注意到了通過最大ACT測量的朝向效力增加的強趨勢。也注意到了大小的增加與109達到170秒的ACT時間顯示的適體活性的延長。通過最大ACT顯示，與ARC2949(SEQIDNO434)相比，ARC2172(SEQIDNO294)顯示出效力增力口。發(fā)現(xiàn)用弱化的富含AU的2'-0Me莖制備的ARC2840(SEQTDNO423),即一種26聚體樣ARC2172(SEQIDNO294)是新適體中效力最4氐的。發(fā)現(xiàn)用弱化的富含AT的2'-OMe莖制備的ARC2828(SEQIDNO411)，即ARC2321(SEQIDNO435)的30聚體形式不能與ARC2321(SEQIDNO435)區(qū)分。測試的其余適體是上文ARC2172(SEQIDNO294)和ARC2321(SEQIDNO435)的修飾形式，其加入5，胺接頭±2-IOKPEG基團。這些修飾產(chǎn)生了效力的適度增加，也增加了藥代動力學(xué)作用的延長(參見圖13)。因此，測試的IO種適體表現(xiàn)出一定范圍的藥代動力學(xué)特性，大小增加和PD效果延長(通過ACT測量)之間的相關(guān)性通過朝向效力增加的趨勢平衡。與ARC183相比，ARC2172(SEQIDN0294)表現(xiàn)出更高的效力。實施例4B:Sprague-Dawley大鼠中的靜月永內(nèi)推注施用通過圖14展示的研究設(shè)計中描繪的留置的頸靜脈導(dǎo)管，靜脈內(nèi)(IV)施用ARC2172(SEQIDN0294)和ARC183。除了IV推注，給這些大鼠進行假的腎結(jié)扎，作為研究的一部分，用于確定這些化合物的腎清除；假手術(shù)和針對腎結(jié)扎效果的PK/PD結(jié)果描述于下文實施例4C。通過留置的股靜脈導(dǎo)管采集血液，用于在注射后確定的時間點，直到2小時，進行ACT測定。用上文實施例3B描述的具有ACT(+)比色杯的HemochronJrSignature十儀器測量ACT值。施用ARC2172(SEQIDNO294)和ARC183對ACT的影響示于圖15,相關(guān)參數(shù)概括于圖16。通過IV推注施用ARC2172(SEQIDNO294),產(chǎn)生的平均最大ACT值是418。以ARC2172(SEQIDNO294)劑量的2.5倍mg/kg(4.2倍摩爾/kg)劑量施用ARC183,導(dǎo)致較低的平均最大ACT,即328秒。ARC183的解離速度快，達到200或170秒的ACT的平均時間分別是2.7和4.1分鐘。ARC2172(SEQIDNO294)達到200或170秒的ACT的平均時間分別是9.5和12.2分鐘?？傊?，在假手術(shù)大鼠的IV推注施用后，發(fā)現(xiàn)ARC2172(SEQIDNO294)比ARC183更有效。110實施例4C:腎結(jié)扎和假手術(shù)Sprague-Dawley大鼠中的ARC2172和ARC183本研究的目的是確定和比較腎結(jié)扎和假手術(shù)雄性Sprague-Dawley大鼠中腎清除及其對ARC2172(SEQIDNO294)和ARC183的藥代動力學(xué)活性的影響。通過IV推注給完全腎結(jié)扎手術(shù)或假手術(shù)的雄性Sprague-Dawley大鼠施用ARC183和ARC2172(SEQIDNO294)。研究設(shè)計示于圖17。在給藥前和指定時間點采集血液，用于進4亍ACT測量和ARC2172(SEQIDNO294)或ARC183濃度分析。按照實施例3B的描述測量ACT。分別采用0.05wg/mL和0.16pg/mL的定量下限(LLOQ),通過HPLC分析確定ARC2172(SEQIDNO294)和ARC183的血漿濃度。采用WmNonlmTM,5.1片反(PharsightCorporation,Mountamview,CA),分別通過非區(qū)室和Emax模型，用各個血漿濃度_時間曲線進行PK和PK/PD分析(￡=￡0+(￡1^乂-E0)*(Cy/(Cy+EC50y))。將單因素方差分析(ANOVA,a=0.05)統(tǒng)計分析用于腎結(jié)扎和有￡手術(shù)大鼠的Cmax、AUClasJpMRTlast。腎結(jié)扎和假手術(shù)組的ARC2172(SEQIDNO294)和ARC183的藥代動力學(xué)曲線(ACT)分別示于圖18和圖19。在假手術(shù)和腎結(jié)扎大鼠中由ARC2172(SEQIDNO294)達到的平均最大ACTs分別是422秒和419秒，而對于ARC183,平均最大ACTs分別是325秒和363秒。ARC2172(SEQIDNO294)的平均ACT在15分鐘內(nèi)從最大值降低到170秒，而對于ARC183,平均ACT在5-10分鐘內(nèi)降低到170秒。當(dāng)與假手術(shù)大鼠比較時，ARC2172(SEQIDNO294)和ARC183的總體PD曲線沒有受到大鼠中腎結(jié)扎的顯著影響(P〉0.05,采用Mann-Whitney檢驗)。但是，在早期時間點(對于ARC2172(SEQIDNO294)和ARC183分別是1=5-20和1=0.83-5分鐘)，與假手術(shù)大鼠相比，大鼠中腎結(jié)扎具有小的、但仍然是統(tǒng)計學(xué)顯著的影響(P〈0.05,采用Mann-Whitney檢驗)。在腎結(jié)扎和假手術(shù)大鼠中IV施用后，ARC2172(SEQIDNO294)和ARC183的血漿濃度-時間曲線都是雙相的。兩種化合物的腎結(jié)扎組都顯示與假手術(shù)組相比，在大多數(shù)取樣時間的血漿濃度增加。發(fā)現(xiàn)ARC2H2(SEQIDNO294)和ARC183中C咖x和AUC0-last的增加是統(tǒng)計學(xué)顯著的，P<0.05。m概言之，與假手術(shù)大鼠相比，ARC2172(SEQIDNO294)和ARC183的總體PD曲線沒有受到大鼠中腎結(jié)扎的顯著影響(P〉0.05,采用Mann-Whitney檢驗)。但是，在早期時間點(對于ARC2172(SEQIDNO294)和ARC183分別是t=5-20和t=0.83-5分鐘)，與j艮手術(shù)大鼠相比，大鼠中的腎結(jié)扎具有小的，但是統(tǒng)計學(xué)顯著的影響(PO.05,采用Mann-Whitney檢驗)。與假手術(shù)大鼠相比，在腎結(jié)扎大鼠的單次IV推注后，對ARC2172(SEQIDN0294)和ARC183的總體暴露都具有小的，但是統(tǒng)計學(xué)顯著的影響。對于ARC2172(SEQIDN0294)，腎結(jié)扎大鼠中的平均Cm^和AUC(Hast值比假手術(shù)大鼠高約1.5倍和2倍。對于ARC183,腎結(jié)扎大鼠中的平均Cmax和AUC(Hast值比比假手術(shù)大鼠高約2.4倍和2.9倍。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，對于ARC183和ARC2172(SEQIDNO294),腎結(jié)扎大鼠的MRT(Hast與假手術(shù)大鼠相比都沒有顯著差異。該數(shù)據(jù)顯示在最嚴重形式的腎損傷的腎結(jié)扎大鼠模型中，ARC2172的藥代動力學(xué)影響受到最小影響。盡管不希望受到理論的限制，由于ARC2172顯示其藥代動力學(xué)可逆性(回到200秒的平均ACT值的時間)的最小改變并且在這種代表嚴重腎損傷(雙側(cè)結(jié)扎)的大鼠模型中藥代動力學(xué)僅僅中度改變，腎清除似乎不是清除ARC2172的主要機制。此外，盡管不希望受到理論的限制，綜合考慮這些數(shù)據(jù)，表明在具有腎損傷的患者中對于ARC2172(SEQIDN0294)來說，劑量調(diào)節(jié)不是必須的。實施例4D:用于給抗凝血酶適體排序的猴IV推注研究在猴的IV推注研究中評估實施例4A描述的大鼠研究中比較的結(jié)合凝血酶的適體中的4種(ARC2172(SEQIDNO294),ARC2949(SEQIDNO434),ARC2169(SEQIDNO283)和ARC2840(SEQEDNO423))。(ARC2169(SEQIDNO283)是不含5，胺的ARC2321(SEQIDNO435)的30個寡核苦酸的形式)。通過以下方法制備適體給藥溶液凍干的適體或肽溶解在生理鹽水中，用生理鹽水調(diào)節(jié)給藥溶液的濃度直到通過分光光度計分析確定達到正確的濃度，通過0.22ym濾膜將得到的溶液無菌過濾到無菌樣品管形瓶中，然后-2(TC下冷凍直到使用。在給藥期間將解凍的管形瓶放置在濕冰上，當(dāng)不用于給藥時，將使用的管形瓶在4t:下儲存。在獼猴中的以下IV推注研究中，所有適體都以0.46樣i摩爾Zkg的劑量給藥。將IV導(dǎo)管置于麻醉的獼猴的頭靜脈中，用于推注施用適體。以大約5-10mL/kg/hr的速度通過該頭靜脈導(dǎo)管提供乳酸化的Rmger氏液，以提供流體保持和導(dǎo)管開放。推注后，按照上文的描述在確定時間點從血管進入端口中取血，共1小時(總體積=約3mL)。對于所有適體，時間點是給藥前和給藥后0.83、1.83、2.83、5、10、15、20、30、45、60分鐘；在ARC2169(SEQIDNO283)的情況下，也采用了給藥后90和120分鐘的額外時間點。按照上文實施例3B的描述，采用ACT+(ITCMed,EdisonNJ)藥筒，用HemachronJrSignature+儀器(ITCMed,EdisonNJ)實時確定激活的ACTs。圖20和21概括了結(jié)果。與獲自大鼠中的IV推注模型的結(jié)果(實施例4A)相比，所有適體顯示猴中的效力增加，這是通過在猴中采用大鼠中使用的摩爾/kg劑量的31%，就達到了最大ACTs而證明的。ARC2840(SEQIDNO423),即具有富含AU的2'-OMe莖的26聚體，顯示效力最低，最大ACT僅僅223.3秒，達到170秒的ACT的時間是2.2分鐘。ARC2949(SEQEDNO434)達到了402.7秒的最大ACT,達到170秒的ACT的時間是14.9分鐘。ARC2172(SEQIDNO294)和ARC2169(SEQIDNO283)的最大ACTs非常相似(分別是526.8和541.7秒)，但ARC2169(SEQEDN0283)達到170秒的ACT的時間幾乎是ARC2172(SEQIDN0294)的兩倍(54.6分鐘與24.9分鐘)。實施例4E:ARC2172和ARC183在獼猴中的靜脈內(nèi)推注+輸注施用在獼猴中，用以下單次IV推注+連續(xù)1小時IV輸注研究評估ARC2172(SEQIDNO294)和ARC183。給獼猴IV推注施用ARC2172(SEQIDNO294)或ARC183，隨后立即開始連續(xù)輸注1小時，如圖22中的研究設(shè)計所示。^姿照上文描述，從血管進入端口取血，按照上文實施例3B的描述，采用ACT+(ITCMed，EdisonNJ)藥筒，用HemachronJrSignature+4義器(ITCMed,EdisonNJ)測量ACT值。通過IV推注+1小時輸注施用ARC2172(SEQIDNO294)或ARC183后的ACT測量的效果示于圖23,相關(guān)參數(shù)概括于圖24。通過IV推注+1小時輸注而施用ARC2172(SEQIDNO294),耙定5pM的血漿濃度，這產(chǎn)生了397秒的平均最大ACT值，并且達到200或170秒的ACT值的時間分別是22.2和26.5分鐘。增加ARC2172(SEQIDNO294)的劑量，以達到7.5juM的耙血漿濃度，這使平均最大ACT增加到414秒，而達到200或170秒的ACT值的平均時間分別是13.9和18.0分鐘(兩種ARC2172(SEQIDNO294)給藥方法之間后面兩個時間的差異在實-驗誤差內(nèi))。當(dāng)IV推注+1小時輸注施用ARC183以達到15juM的血漿濃度時，導(dǎo)致平均最大ACT為343秒，達到200或170秒的ACT值的平均時間分別是4.9和7.3分鐘。因此，在比較ARC183的結(jié)果和用較低劑量方案的ARC2172(SEQIDNO294)觀察到的結(jié)果時(其中給予的總劑量是施用ARC183的mg/kg劑量的7%),用ARC2172(SEQIDNO294)處理能夠產(chǎn)生輸注過程中大約400秒的穩(wěn)定ACT。ARC2172(SEQIDNO294)的解離速度比ARC183慢大約4倍。實施例4F:藥代動力學(xué)藥物相互作用ARC2172對血小板聚集的影響。除了產(chǎn)生纖維蛋白，凝血酶進一步通過激活血小板而刺激血凝塊形成。在體外，通過多種激動劑，包括凝血酶、膠原蛋白和ADP而激活血小板。一旦激活，血小板進行形態(tài)、受體表達和釋放的因子的顯著改變。在某些情況下，這些改變誘導(dǎo)血小板聚集，并且該聚集不依賴于其它細胞的存在。通過全血的低速離心產(chǎn)生富含血小板的血漿(PRP)。在PRP中加入血小板激動劑，能夠誘導(dǎo)血小板激活和聚集。血小澤反聚集并且,人溶液中沉淀出來，正常混濁的RPR逐漸澄清，可以通過吸光度監(jiān)測PRP中的血小板聚集。本研究的目的是評估ARC2172(SEQIDNO294)對人PRP中的血小板聚集的影響。在各種濃度的ARC2172(SEQIDNO294)存在或不存在的條件下，將PRP與cc-凝血酶(0.25單位/mL)或ADP(10yM)混合。用光學(xué)血小板計評估血小板聚集。ARC2172(SEQIDNO294)抑制凝血酶而不是ADP誘導(dǎo)的血小板聚集(即激活受體GPIIb/IIIa)(圖25)。這些數(shù)據(jù)證明ARC2172(SEQIDNO294)是以高親和力結(jié)合凝血酶的凝血酶拮抗劑。ARC2172對阿司匹林和Integrilm的活性的體外影響在體外，用多種激動劑，包括凝血酶、膠原蛋白和ADP激活血小板，或用多種拮抗劑如阿司匹林或血小板IIb/IIa抑制劑抑制血小板。本研究的目的是評估ARC2172(SEQIDNO294)對阿司匹林或二石克鍵連接的七肽Ilb/IIa抑制劑Integrilm對人PRP中血小板聚集的活性的114影響。室溫下，在存在和或不存在阿司匹林(6mg/L)以及存在和不存在各種濃度的ARC2172(SEQIDNO294)的條件下用Integrilm(1juM)預(yù)先溫育PRP20分鐘。將血小板混合物預(yù)熱到37°C3分鐘，然后采用光學(xué)血小板計通過ADP(3juM)評估血小板聚集。阿司匹林減少人PRP中ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，而Integrilm在有或沒有阿司匹林的條件下完全阻斷人PRP中ADP誘導(dǎo)的血小板聚集。ARC2172(SEQIDNO294)不減少或抑制阿司匹林或Integrilm的活性(圖26)。實施例5:功能性動物研究實施例5A:開放的、非肝素結(jié)合的旁路回路中的ARC2172采用開放的、非肝素結(jié)合的旁路回路在豬心血管旁路才莫型中評估ARC2172(SEQIDNO294)。通過推注或推注+輸注用鹽水(11=2)、肝素0=5)和ARC2172(SEQIDNO294)(11=5,動物38和39沒有包括在統(tǒng)計分析中)處理動物，以便在旁路開始前獲得400秒的耙ACT。第三組動物(n=2)沒有接受抗凝劑處理，并且沒有進行心臟麻痹和主動脈橫跨鉗閉。研究設(shè)計描述于圖27。以202mmol/g的負荷在PrimerSupport200上合成ARC2172(SEQIDNO294)。標準合成循環(huán)利用1.8當(dāng)量的amidite和3當(dāng)量的氧化劑。用溶于乙腈的20%二乙胺進行合成后堿基洗滌，用氨水去保護過夜，然后進行制備SAX-HPLC。隨后凍干適體，然后以20.0mg/ml的濃度重懸于無菌鹽水。該研究中使用從豬胰腺制備的肝素鈉。豬旁路模型按照圖27的描述，將公豬和母豬隨機分為多個治療組。動物38和39沒有包括在統(tǒng)計分析中。在手術(shù)準備前，用阿托品S04/Telazol/Xylazme(分別是0.04mg/kg/4-6mg/kg/2mg/kg肌內(nèi)[IM])預(yù)先麻醉動物。然后給動物插管，在異氟烷吸入麻醉劑中保持，以實現(xiàn)通過體積調(diào)節(jié)的吸入器進行送遞。麻醉開始后，給股動脈和靜脈插管，以分別監(jiān)測血壓和獲得血樣。用緩'f曼鹽水滴注或通過輸注ARC2172(SEQIONO294)維持股l爭脈導(dǎo)管的開放。在胸骨的長度上進行皮膚切口。隨后切開胸骨，打開胸腔。用Bovi電烙探針止血。打開心包，提供到心臟的入口。解剖分開主動脈周圍的組織，用5.0聚酯縫線在心臟遠端4cm的升主動脈中進4亍荷包減張縫合。類似地，用5.0聚酯縫線在右心耳中進行荷包減張縫合。進行縫合后，用肝素或ARC2172(SEQIDN0294)處理動物。多次IV推注施用肝素(40,000-60,000單位)，以實現(xiàn)通過ACTPlus系統(tǒng)(Medtromc,MinneapolisMN)測量的ACT高于400，和用實施例3b描述的具有ACT+測試比色杯(ITCMed,Edison,NJ)的HemochronJuniorSignature十農(nóng)U疑血儀(ITCMed,Edison,NJ)測量的約1000。通常需要10-20分鐘來調(diào)節(jié)肝素劑量，并且確保ACT在正確范圍內(nèi)。通過推注+連續(xù)靜脈內(nèi)輸注(0.139)施用ARC2172(SEQIDNO294),獲得實施例3b描述的具有ACT+測試比色杯(ITCMed,Edison,NJ)的HemochronJuniorSignature+微凝血儀(ITCMed，Edison,NJ)上測量的約400秒的ACT(參見圖27)。通常需要10-20分鐘來施用藥物，并且確保ACT在正確范圍內(nèi)。施用合適劑量的抗凝劑后，放置動脈和靜脈導(dǎo)管。將主動脈導(dǎo)管迅速連接于心/肺儀的預(yù)先準備好的動脈線，用鹽水小心填充動脈導(dǎo)管和動脈線，以便在連接前消除氣泡。迅速夾住動脈線。用類似的技術(shù)在右心耳中放置和縫合靜脈導(dǎo)管(29/37兩階段靜脈導(dǎo)管，Medtromc，Minneapolis,MN),然后將導(dǎo)管連接于心/肺儀的靜脈線。完整旁路回路包括非肝素結(jié)合的成分(親和CVR心臟切開術(shù)/靜脈儲存器和具有血漿抗性纖維的膜充氧器，Medtronic,Minneapolis,MN)。隨后，將動物放置在心肺旁路上持續(xù)3小時。心/肺儀的動脈和靜脈線具有連接在動物和儀器中間的多普勒超聲探頭，以監(jiān)測栓子的存在。在程序中監(jiān)測直接血壓，并且在旁3各中通過以下方法維持血壓a)調(diào)節(jié)旁路血流速度，b)施用靜脈內(nèi)流體，和c)通過靜脈內(nèi)注射施用多種藥物，包括去氧腎上腺素、多巴胺、腎上腺素和鈣來起作用。通過調(diào)節(jié)異氟烷噴霧器流速，并且i^艮據(jù)需要偶爾施用IV苯巴比妥推注，使動物維才爭在麻醉的手術(shù)水平。完成3小時旁路后，使動物離開旁路，當(dāng)血壓穩(wěn)定時除去導(dǎo)管，然后通過用魚精蛋白處理(肝素處理組)或通過終止適體輸注(ARC2172處理組)而終止抗凝活性。停滯藥物輸注后，使動物維持額外的1小時。用IV去氧腎上腺素和/或IV流體施用的組合，在旁路后維持血壓。CPB研究方案的概述顯示于圖28。116ACT測定和心肺旁路回路的檢查，用于顯示大血凝塊或纖維蛋白沉積在計劃的采樣時間點獲得新鮮的全血，立即用實施例3B描述的具有ACT+測試比色杯(ITCMed,Edison,NJ)的HemochronJuniorSignature十微凝血儀(ITCMed,Edison,NJ)和ACTPlus系統(tǒng)(Medtromc,Minneapolis,MN)測量。完成每個實驗后，用鹽水沖洗心肺旁路回路，檢查儲存器、充氧器膜和動脈濾器，用于檢查大血凝塊形成并且拍照。過程中對照動物ACT值保持相對恒定，但旁路后逐漸變化(圖29)。在開始旁路后15分鐘內(nèi)可以在旁路回路中看見大血凝塊，并且旁路3小時后變得4艮大，使得通過旁^^回路的流動幾乎^L阻斷。施用肝素后，該治療組中的動物具有非常高的ACT值，其通常遠離正常標準(超過1000秒)(參見圖30)。重復(fù)給動物推注，將ACT維持在該升高的水平。在實驗結(jié)束時施用魚精蛋白，導(dǎo)致ACT值回到基線。在旁路回路中沒有看到大的血凝塊。在通過推注+輸注ARC2172(SEQIDNO294)處理的動物中，在旁路過程中ACT維持在相對窄的范圍內(nèi)，在停止施用ARC2172(SEQIDNO294)20分鐘內(nèi)，ACT回到基線(圖31)。在旁路回路中沒有看到大的血凝塊。采用每種抗凝劑時旁路過程中ACT值的比較示于圖32中。全血ACT和T/ATIII復(fù)合物形成之間的相關(guān)性旁路過程中，收集檸檬酸化血漿的樣品，用于監(jiān)測凝血酶/抗凝血酶m(TAT)復(fù)合物的存在，作為凝血級聯(lián)激活的間接測量值。簡言之，將未稀釋的血漿樣品直接加入EnzygnostTAT微ELISA(DadeBehrmg;Deerfield,Illinois;目錄號OWMG15)的預(yù)先包被的孔中。隨后根據(jù)制造商的方案完成ELISA。采用自動化平板洗滌器(Bio-Tek;Wmooski,Vermont;目錄號ELx405MagnaMVR)完成所有洗滌步驟。用VersamaxTunable微量滴定板讀數(shù)器(MolecularDevices;Sunnyvale,Califorma)檢測吸光度值。在所有動物中，基線血漿TAT復(fù)合物濃度測量值小于10ng/ml。在未用抗凝劑處理的對照動物中，在放置于旁路后數(shù)分鐘內(nèi)，TAT復(fù)合物開始在血漿中積累，在旁路即將終止前，達到150+/-87ng/ml的最大值。在旁路后觀察階段，血漿TAT復(fù)合物的濃度在這些動物中減少，但從未回到基線(參見圖33)。相反，肝素處理抑117制了旁路期間凝血級聯(lián)的激活，這是由相對低的血漿TAT復(fù)合物濃度表明的(〈50ng/ml)(參見圖34)。肝素抑制對內(nèi)源性凝血級聯(lián)中較上游的多個凝血因子的活性，并且抑制凝血酶的活性。盡管ARC2172(SEQIDNO294)防止旁路回路中大血凝塊的形成，它不抑制凝血級聯(lián)的激活，這是由旁路開始后血漿TAT復(fù)合物濃度迅速增加而表明的(參見圖35)。但是，TAT復(fù)合物濃度沒有對照動物中那么高。盡管不希望受到理論的限制，該結(jié)果預(yù)期是ARC2172(SEQIDNO294)僅僅減少凝血酶的活性，而不是內(nèi)源性凝血級聯(lián)中較上游的其它激活的凝血因子的活性。概言之，采用開放的、非肝素結(jié)合的旁路回路在豬心肺旁路才莫型中評估ARC2172(SEQIDNO294)。用鹽水(n二2)、肝素(n-5)和ARC2172(SEQIDNO294)0=5)通過推注或推注+輸注處理動物，以便在開始旁路之前獲得400秒的靶ACT(通過HemachronJr.儀器測量)。旁路期間這些組中每個組的平均ACT值是123+/-39秒(對照)，950+/-158秒(肝素)和433+/-61秒(ARC2172(SEQIDNO294))。肝素和ARC2172(SEQIDNO294)減少旁路期間大血凝塊的形成。此外，在旁路期間僅有肝素抑制了TAT復(fù)合物的積累。盡管不希望受到理論的限制，認為這表明其它處理沒有抑制內(nèi)源性凝血級聯(lián)的激活。已經(jīng)通過書面說明和實施例描述了本發(fā)明，本發(fā)明技術(shù)人員可以意識到可以以多種實施方式實施本發(fā)明，上文的i兌明書和實施例是為了說明，而不是限制權(quán)利要求。118權(quán)利要求1.結(jié)合凝血酶靶的適體，其中該適體減少或抑制凝血酶介導(dǎo)的凝血，并且該適體是ARC2172(SEQIDNO294)或與ARC2172(SEQIDNO294)具有基本相同的減少或抑制凝血酶介導(dǎo)的凝血的能力的適體，其中該適體以小于1nM的KD結(jié)合人凝血酶，并且所述適體的長度是55個核苷酸或更少。2.結(jié)合凝血酶草巴的適體，其中該適體減少或抑制凝血酶介導(dǎo)的凝血，并且該適體是ARC2172(SEQIDNO294)或與ARC2172(SEQIDNO294)具有基本相同的減少或抑制凝血酶介導(dǎo)的凝血的能力的適體，并且該適體的大多數(shù)胸苷或尿苷不包含5-溴脫氧尿苷修飾。3.前述任一項權(quán)利要求的適體，其中該適體減少或抑制凝血酶介導(dǎo)的凝血的能力是通過測量該適體減少或抑制激活的凝血時間或凝血酶原時間的能力而評估的。4.權(quán)利要求3的適體，其中該適體在體內(nèi)減少或抑制凝血酶介導(dǎo)的凝血。5.權(quán)利要求4的適體，其中該適體在人受試者中減少或抑制凝血酶介導(dǎo)的凝血。6.結(jié)合凝血酶的適體，該適體選自SEQIDNOs9-41，43-191,193-204,208-304，307-329,331-332，334,336-337,340-392,396-397,400和402-440。7.結(jié)合凝血酶并且包含以下核酸序列的適體CCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGG。8.前述任一項權(quán)利要求的適體，其中該適體包含選自下組的核酸序列ACTGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCAGT(ARC2169(SEQIDNO283))GCTGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCAGC(ARC2170(SEQIDNO292))CTGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCAG(ARC2171(SEQIDNO293))和，CGCCTAGGTTGGGTAGGGTGOTGGCG(ARC2172(SEQIDNO294))9.包含以下核酸序列的適體N晶N3TAGGTTGGGTAGGGTGGTN'3N'2N、，其中Ni、N2或Ns是分別與N、、N'2或N'3形成堿基對的任何核苷酸，其中N!、N2和N3可以各自是相同的核苷酸或不同的核苷酸，并且該適體減少或抑制凝血酶介導(dǎo)的凝血。10.權(quán)利要求9的適體，其中Ni、N2或N3是脫氧核苷酸。11.權(quán)利要求9的適體，其中N"N2或N3中的至少兩個包含2'OMe修飾。12.權(quán)利要求9、10或11的適體，進一步包含序列N!N2N美N5N6TAGGTTGGGTAGGGTGGTN'sN'WNW^,其中N!、N2、N3、N4、Ns或N6是分別與NVN'2、N'3、N'4、N'5或N'6形成堿基對的任何核苷酸，其中N"N2、N3、N4、Ns或N6可以各自是相同的核苷酸或不同的核苷酸，并且該適體減少或抑制凝血酶介導(dǎo)的凝血。13.權(quán)利要求9、10、11或12的適體，其中N是鳥苷或胞苦核苷酸殘基。14.權(quán)利要求7-13的任一項的適體，其中該適體以小于lnM的Kd結(jié)合凝血酵。15.權(quán)利要求7-14的任一項的適體，其中該適體至少與ARC2172(SEQIDNO294)具有基本相同的減少或抑制凝血酶介導(dǎo)的凝血的能力。16.前述任一項權(quán)利要求的適體，其中凝血酶革巴是人凝血酶。17.前述任一項權(quán)利要求的適體，其中該適體是脫氧核糖核酸。18.前述任一項權(quán)利要求的適體，其中該適體是單鏈脫氧核糖核酸。19.前述任一項權(quán)利要求的適體，其中該適體包含至少一個化學(xué)修飾。20.權(quán)利要求19的適體，其中該修飾選自在核酸的糖位置的化學(xué)取代；磷酸位置的化學(xué)取代；和堿基位置的化學(xué)取代。21.權(quán)利要求19或20的適體，其中該修飾選自摻入修飾的核苷酸，3'加帽，以及與高分子量、非免疫原性化合物的綴合，與親脂性化合物的綴合。22.權(quán)利要求19的適體，其中該修飾是與非免疫原性、高分子量化合物的綴合，其中該化合物是聚亞烷基二醇。23.權(quán)利要求22的適體，其中該聚亞烷基二醇是聚乙二醇。24.權(quán)利要求1-3和5-23的任一項的適體，其中該適體在體外減少或抑制凝血酶介導(dǎo)的凝血。25.—種方法，包括給受試者或體外循環(huán)施用前述任一項權(quán)利要求的適體，其量有效減少或抑制受試者中的凝血酶介導(dǎo)的凝血。26.權(quán)利要求25的方法，其中該受試者是人。27.—種組合物，其包含有效減少或抑制受試者中凝血酶介導(dǎo)的凝血的量的權(quán)利要求1-26的任一項的適體或其鹽，和藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑。28.—種方法，包括給有需要的受試者施用權(quán)利要求27的組合物。29.權(quán)利要求28的方法，其中該受試者是人。30.^又利要求25、26、28或29的方法，其中該人受試者是腎臟受損的，并且用于該方法中的適體不綴合于PEG。31.權(quán)利要求25、26、28、29或30的方法，其中該人受試者具有肝素誘導(dǎo)的血小纟反減少癥。32.4又利要求25、26、28、29、30或31的方法，其中該人受試者是肝素抗性的。33.4又利要求25、26、28、29、30、31或32的方法，其中該受試者具有受損的肝功能。34.權(quán)利要求25、26、28、29、30、31、32或33的方法，其中在受試者的手術(shù)程序之前、期間、之后或其任意組合，給受試者施用適體。35.權(quán)利要求34的方法，其中手術(shù)程序選自心肺旁路手術(shù)、冠狀動脈旁^各移植手術(shù)、經(jīng)皮冠狀動脈介入、血管成形術(shù)、心血管和外周血管開放和血管內(nèi)手術(shù)、支架放置手術(shù)、心瓣膜置換手術(shù)、用于治療冠狀動脈疾病和/或靜脈或動脈的血管疾病的手術(shù)，和用于治療外周動脈阻塞疾病的手術(shù)。36.權(quán)利要求25、26、28、29、30、31、32、33、34或35的任一項的方法，其中該適體是ARC2172(SEQIDNO294)。37權(quán)利要求35的方法，其中該適體是ARC2172(SEQIDNO294)，并且手術(shù)程序是冠狀動脈旁路移植手術(shù)。38.權(quán)利要求35的方法，其中該適體是ARC2172(SEQIDNO294)，并且手術(shù)程序是經(jīng)皮冠狀動脈介入。39.權(quán)利要求35的方法，其中該手術(shù)程序是心肺旁路手術(shù)，并且手術(shù)過程中使用開放的、非肝素結(jié)合的回路。全文摘要本發(fā)明提供了能夠結(jié)合凝血酶的適體，其用作凝血相關(guān)病癥和/或涉及凝血酶的其它疾病或病癥的治療劑和診斷劑。本發(fā)明進一步提供了用于施用能夠結(jié)合凝血酶的適體的材料和方法。文檔編號A61K31/711GK101501056SQ200680031169公開日2009年8月5日申請日期2006年8月23日優(yōu)先權(quán)日2005年8月26日發(fā)明者D·豐塔納,J·L·迪納,J·瓦納-惠特申請人:阿切米克斯公司