專利名稱：：用銅氧還蛋白治療ephrin信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)性病變的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及銅氧還蛋白(Cupredoxins)及其在調(diào)節(jié)涉及Ephrin和Ephrin受體的細(xì)胞功能方面的用途。本發(fā)明也涉及治療Ephrin相關(guān)性病變的方法。更具體地，本發(fā)明涉及基本上純化的銅氧還蛋白在減慢癌細(xì)胞和病理性病變(特別是那些與Ephrin/Ephrin受體信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的病變)的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的方法以及其他與Ephrin/Ephrin受體信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的治療方法中的用途。本發(fā)明也涉及保留了干擾細(xì)胞中Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的能力的銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物。
背景技術(shù)：
：Ephrin受體(Eph受體)是一個(gè)大的受體酪氨酸激酶家族，其通過結(jié)合被稱作Ephrin的配體家族來調(diào)節(jié)發(fā)育和成體組織中的多個(gè)過程。用Ephrin配體可以將Eph受體分成A型或B型。目前已知有9種A型成員，即EphAl-8和EphAlO，和4禾中B型成員，EphBl-4和EphB6。A型受體一般優(yōu)選地結(jié)合A型配體，而B型受體優(yōu)選地結(jié)合B型配體。Eph受體和其他受體酪氨酸激酶一樣，具有單個(gè)跨膜橫跨結(jié)構(gòu)域、和由具有免疫球蛋白樣基序的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、富半胱氨酸區(qū)和兩個(gè)m型纖維結(jié)合蛋白重復(fù)組成的糖基化的細(xì)胞外區(qū)(Surawskaetal，Cytokine&GrowthFactorReviews15:419-433(2004))。根據(jù)其序列保守性可以將Ephrin配體分成A和B型。EphrinA配體是糖基磷脂酰肌醇錨定的，通常被Eph-A型受體所結(jié)合，而EphrinB含有跨膜結(jié)構(gòu)域和短的細(xì)胞漿區(qū)，其通常被Eph-B受體所結(jié)合。當(dāng)Eph受體與Ephrin配體形成二聚體，引起受體成為磷酸化時(shí)，信號(hào)傳導(dǎo)過程從此開始。通過更高級(jí)的成簇形成了Ephrin-Eph受體復(fù)合物的聚集物。受體活性被認(rèn)為是依賴于多聚體化的程度，但是并非限于四聚體形式，因?yàn)樵诟突蚋呒?jí)的形式中也觀察到了受體磷酸化。根據(jù)多聚體化的狀態(tài)，不同的Eph受體復(fù)合物可以誘導(dǎo)生物學(xué)作用。除了通過Eph受體進(jìn)入到受體表達(dá)細(xì)胞的"前向"信號(hào)傳導(dǎo)外，也有著通過Ephrin進(jìn)入到Ephrin表達(dá)細(xì)胞的"反向"信號(hào)傳導(dǎo)。例如，B-Ephrin的細(xì)胞漿尾部可以變成磷酸化，導(dǎo)致了信號(hào)傳導(dǎo)效應(yīng)物的募集以及Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)?，F(xiàn)在己知Ephrin在多種細(xì)胞-細(xì)胞相互作用中發(fā)揮作用，包括軸突路徑選擇(axonpathfinding)、神經(jīng)元細(xì)胞遷移、和血管內(nèi)皮細(xì)胞和專門上皮的相互作用(Flanagan&Vanderhaeghen,Annu.Rev.Neurosci.21:309-345(1998);Frisenetal，EMBOJ.18:5159-5165(1999))。Eph受體也參與了多個(gè)病理過程，包括腫瘤進(jìn)展、病理形式的血管生成、組織損傷后的慢性疼痛、脊髓損傷后的神經(jīng)再生的抑制、和人類先天性畸形(Koolpeetal,JBiolChem.280:17301-17311(2005))。也報(bào)道了Eph受體在平衡干細(xì)胞自我更新和細(xì)胞結(jié)局確定及分化中起到了作用。Eph受體和Ephrin過度表達(dá)可以造成腫瘤生成，并且與多種人類癌癥類型中的血管生成和轉(zhuǎn)移相關(guān)，包括肺癌、乳腺癌和前列腺癌、以及黑色素瘤禾B白血病(Surawskaetal.，Cytokine&GrowthFactorReviews15:419-433(2004))。Eph受體的過度表達(dá)被認(rèn)為并未影響細(xì)胞的增殖，而是改變細(xì)胞的侵襲行為。根據(jù)一個(gè)理論，在具有高水平EphA2的惡性細(xì)胞中，受體是錯(cuò)位的(mislocalized)，其不能結(jié)合它們的Ephrin配體，因此不會(huì)被磷酸化，造成了細(xì)胞外基質(zhì)粘附的增加以及更高的轉(zhuǎn)移可能(Ruoslahti,Adv.CancerRes.76:1-20(1999))。血管生成是從預(yù)先存在的脈管結(jié)構(gòu)中形成新的血管和毛細(xì)血管，這是腫瘤存活和生長(zhǎng)的基本過程。有證據(jù)表明在腫瘤的血管侵襲期間存在著Eph受體/Ephrin的上調(diào)(Surawskaetal，(2004))。具體地，A型Ephrin與腫瘤血管生成相關(guān)，EphA2-Fc和EphA3-Fc融合蛋白降低了腫瘤血管密度、腫瘤體積和細(xì)胞增殖，也增加了凋亡(Brantleyetal,Oncogene21:7011-7026(2002))。EphB2受體-EphrinB2復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)表明EphrinB2折疊拓?fù)鋵W(xué)的胞外結(jié)構(gòu)域(ectodomain)是8鏈桶(barrel),其是常見的希臘花邊(3桶折疊的變體，與銅結(jié)合蛋白的銅氧還蛋白家族具有相當(dāng)多的同源性，不過EphrinB2不結(jié)合銅。Ephrin和銅氧還蛋白折疊蛋白之間的主要差別是EphrinG-Hl和C-Dl袢(loop)的罕見長(zhǎng)度，它們分別是二聚體的和四聚體的配體受體界面的一部分。晶體結(jié)構(gòu)還表明G-Hl袢參與了受體結(jié)合(Himanenetal，Nature414:933-938(2001))。小鼠EphrinB2的細(xì)胞外區(qū)也具有與植物Nodulin和Phytocyanin相似的拓?fù)鋵W(xué)(Tothetal,DevelopmentalCell,1:83-92(2001))。關(guān)于受微生物病原體感染的人類和動(dòng)物體內(nèi)的癌癥消退的報(bào)道可以追溯到100多年前，源自Coley的第一個(gè)報(bào)道(Clin.Orthop,Rdat.Res.262:3-12(1891))。一些隨后的報(bào)道已經(jīng)顯示，微生物病原體在缺氧狀態(tài)下在腫瘤部位進(jìn)行復(fù)制，并且在感染期間也刺激了宿主的免疫系統(tǒng)，造成了癌癥進(jìn)展的抑制(Alexandrofetal,Lancet353:1689-1694(1999);Paglia&Guzman,CancerImmunol.Immunother.46:88-92(1998);Paweleketal，CancerRes.57:4537-4544(1997))。細(xì)菌病原體例如銅綠假單胞菌OP"wcfomomMaen^>w0和許多其他的細(xì)菌都生成了多種容許細(xì)菌逃脫宿主防御并引起疾病的致病因素(Tangetal,Infect.Immun.64:37-43(1996);ClarkandBavoil,MethodsinEnzymology,vol.235，BacterialPathogenesis,AcademicPress,Inc.SanDiegoCalif.(1994);SalyersandWhitt，BacterialPathogenesis:AMolecularApproach,ASMPress,WashingtonD.C.(1994))。一些致病因素誘導(dǎo)了吞噬細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞的凋亡，以摧毀宿主的防御(Monacketal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:10385-10390(1997);ZychlinskyandSa歸netti,J.Clin.I謂stig.100:493-495(1997》。銅綠假單胞菌生成的兩種氧化還原蛋白，即銅氧還蛋白天青蛋白(Azurin)和細(xì)胞色素C551(CytC55I)，兩者都能進(jìn)入J774細(xì)胞，并且與正常細(xì)胞相比較，其對(duì)人類癌癥細(xì)胞顯示出了顯著的細(xì)胞毒活性(Zaborinaetal,Microbiology146:2521-2530(2000))。天青蛋白也能進(jìn)入人黑色素瘤UISO-Mel-2或人乳腺癌MCF-7細(xì)胞(Yamadaetal，PNAS99:14098-14103(2002);Punjetal,Oncogene23:2367-2378(2004);Yamadaetal,Cell.Biol.7:14181431(2005))。另外，銅綠假單胞菌的天青蛋白優(yōu)選地進(jìn)入J774小鼠網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤細(xì)胞，與腫瘤抑制蛋白p53形成復(fù)合物并穩(wěn)定p53蛋白，增加了p53的細(xì)胞內(nèi)濃度，并誘導(dǎo)凋亡(Yamadaetah,InfectionandImmunity,70:7054-7062(2002))。與非癌癥細(xì)胞相比較，天青蛋白也引起了人成骨肉瘤細(xì)胞凋亡的顯著增加(Yeetal，AiZheng24:298-304(2003))。銅綠假單胞菌的細(xì)胞色素C551(CytC551)增加了J774細(xì)胞中的腫瘤抑制蛋白pl6自a的水平，并抑制了J774細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程(Himokaetal,PNAS101:6427-6432(2004))。但是，當(dāng)結(jié)腸癌細(xì)胞例如HCT116細(xì)胞或無p53的肺癌H1299細(xì)胞與野生型天青蛋白或野生型細(xì)胞色素C別一起生長(zhǎng)3天時(shí)，它們抑制HCT116細(xì)胞生長(zhǎng)的濃度(天青蛋白的IC50=17ng/ml;CytCIC50=12pg/ml)比抑制H1299細(xì)胞(>20pg/ml)更低。癌癥是可能無限生長(zhǎng)的惡性腫瘤。它主要是人體中所見的各種類型細(xì)胞的病理性復(fù)制(缺少正常的調(diào)節(jié)控制)。疾病的初始治療常常是手術(shù)、放療或這些治療的組合物，但是局部的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性病變也很常見。一些癌癥可以進(jìn)行化學(xué)治療，但是這些治療很少獲得長(zhǎng)期緩解。因此，它們常常是非治愈性的。在稱作發(fā)生多藥耐藥的情況中，腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶常常變得對(duì)化療耐藥。在多種情況中，腫瘤對(duì)一些類型的化療藥物天生耐藥。另外，這些治療威脅著非癌癥細(xì)胞，這對(duì)人體是一種應(yīng)激，并產(chǎn)生了許多副作用。因此需要改良藥物來阻止癌癥細(xì)胞的播散。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及使用銅氧還蛋白和銅氧還蛋白的變體、衍生物及結(jié)構(gòu)等價(jià)物來干擾哺乳動(dòng)物的Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的的組合物和方法。具體地，本發(fā)明涉及使用銅氧還蛋白例如天青蛋白和質(zhì)體藍(lán)素(Plastocyanin)及其變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物治療哺乳動(dòng)物的癌癥的組合物和方法。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及分離的肽，其是銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物，其能抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中癌癥的生長(zhǎng)。這個(gè)肽可以是天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、假天青蛋白(Pseudoazurin)、質(zhì)體藍(lán)素、Rusticyanin或Auracyanin，特另ll是天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素禾口Rusticyanin。在一些實(shí)施方式中，銅氧還蛋白來自銅綠假單胞菌、氧化亞鐵硫桿菌(7TK'o6ac/〃wjy^roo;nV^a"力、P/2orw,d7ww2/am/"oswm、類產(chǎn)減菌(^4/ca/(ge"es/"ecafe)、氧化木糖無色桿菌(^c/zrawo^cferx7/oso;aV^")、支氣管敗血性博德特菌(5orafefe〃a6ra"ctoeWcfl)、甲基單胞菌屬(Mef/^/簡(jiǎn)o""51腦膜炎奈瑟菌(jVe&en'a,w'"g"/cfo)、淋病奈瑟菌(7Ve",/ago"orA7zoeae)、熒光假單胞菌(尸化"(iomo"as/7womscera)、綠針假單胞菌(尸^ew^fowo"asc/7/0raraj!/H》、茍養(yǎng)木桿菌(J^"/e〃(3^/^s礎(chǔ)'c^fl)、黃瓜(Cwcwmz,ssarivw"、C7z/oroyfexwsflwraf打A'acws、晶(]溶血虧瓜菌(W6n'opara/2aemo/y"cw"、或孔石莼(Wva;em^a)，特別是來自銅綠假單胞菌、氧化亞鐵硫桿菌、戶/7wvmW/ww/am/"omw或孔石莼。戶萬述分離的肽可以是SEQIDNO:l-17和22-23的部分。另外，SEQIDNO:1-17和22-23可以與所述肽具有至少約90%的氨基酸序列相同性。在一些實(shí)施方式中，分離的肽可以是銅氧還蛋白的截短形式。在具體的實(shí)施方式中，肽具有超過約10個(gè)殘基，但不超過約100個(gè)殘基。肽可以包括或者是由銅綠假單胞菌天青蛋白殘基96-113、銅綠假單胞菌天青蛋白殘基88-113、孔石莼質(zhì)體藍(lán)素殘基70-84、孔石莼殘基57-98或SEQIDNO:22-30組成。在一些實(shí)施方式中，所述分離的肽包括與選自由銅綠假單胞菌天青蛋白殘基96-113、銅綠假單胞菌天青蛋白殘基88-113、孔石莼質(zhì)體藍(lán)素殘基70-84、孔石莼殘基57-98或SEQIDNO:22-30組成的組目標(biāo)銅氧還蛋白區(qū)域等同的對(duì)象銅氧還蛋白的殘基。本發(fā)明的另一個(gè)方面是包括存在于藥物組合物中的至少一個(gè)銅氧還蛋白或能抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中癌癥生長(zhǎng)的銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的組合物。在一些實(shí)施方式中，藥物組合物可以被配制成靜脈內(nèi)施用。銅氧還蛋白是來自銅綠假單胞菌、氧化亞鐵硫桿菌、Phormidiumlaminosum、糞產(chǎn)堿菌、氧化木糖無色桿菌、支氣管敗血性博德特菌、甲基單胞菌屬、腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、熒光假單胞菌、綠針假單胞菌、苛養(yǎng)木桿菌、黃瓜、Chloroflexusaurantiacus、副溶血弧菌、或孔石莼，特別是來自銅綠假單胞菌、氧化亞鐵硫桿菌、Phormidhimlaminosum或孔石莼。在一些實(shí)施方式中，銅氧還蛋白可以是SEQIDNO:1-17和22-23。本發(fā)明的另一個(gè)方面是治療患有與Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)的病理性病變或患有癌癥的哺乳動(dòng)物患者的方法，包括給患者施用治療有效量的藥物組合物中的組合物，其包括至少一種銅氧還蛋白、或銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物。在一些實(shí)施方式中，患者患有間質(zhì)性膀胱炎(IC)、與炎性腸病(IBD)相關(guān)的病變、HIV感染、心血管病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、周圍血管病、病毒性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變(ChristopherReeve病)或Alzheimer病。在其他實(shí)施方式中，患者患有癌癥，例如乳腺癌、肝癌、胃腸道癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、絨癌、畸胎瘤、甲狀腺癌、所有肉瘤包括源自軟組織和骨骼的肉瘤、腎癌、表皮樣癌或非小細(xì)胞肺癌。在一些實(shí)施方式中，患者是人。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是包括至少兩種分離的多肽的組合物，所述分離的多肽是銅氧還蛋白或能抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中癌癥生長(zhǎng)的銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物。在一些實(shí)施方式中，組合物是藥物組合物的形式。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是試劑盒，其包括瓶裝的藥物組合物中的包括至少一種銅氧還蛋白、或銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物。試劑盒可以被設(shè)計(jì)成靜脈內(nèi)施用。本發(fā)明的另一個(gè)方面是方法，其包括用銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物接觸哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞；測(cè)定癌癥細(xì)胞的生長(zhǎng)。癌癥細(xì)胞可以是乳腺癌、肝癌、胃腸道癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、絨癌、畸胎瘤、甲狀腺癌、所有肉瘤包括源自軟組織和骨骼的肉瘤、腎癌、表皮樣癌或非小細(xì)胞肺癌。在一些實(shí)施方式中，癌細(xì)胞是體內(nèi)的癌細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)方面是編碼能夠抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中癌癥生長(zhǎng)的銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的表達(dá)載體。本發(fā)明的另一個(gè)方面是分離的肽，其是銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物，以及其能結(jié)合Ephrin受體，例如EphAl、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphAlO、EphBl、EphB2、EphB3、EphB4和EphB6。在一些實(shí)施方式中，肽也可以結(jié)合Ephrin，例如EphrinAl、EphrinA2、EphrinA3、EphrinA4、EphrinA5、EphrinBl、EphrinB2、EphrinB3和EphrinB4。在其他實(shí)施方式中，分離的肽結(jié)合Ephrin及其受體，特別是Ephrin2B和Eph2B。在一個(gè)相關(guān)部分，分離的肽是銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物，其可以結(jié)合Ephrin例如EphrinAl、EphrinA2、EphrinA3、EphrinA4、EphrinA5、EphrinB1、EphrinB2、EphrinB3禾口EphrinB4。本發(fā)明的另一個(gè)方面是方法，包括給哺乳動(dòng)物患者施用含有至少一種銅氧還蛋白或本發(fā)明的肽的藥物組合物，以指導(dǎo)患者體內(nèi)的血管生長(zhǎng)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是方法，包括給哺乳動(dòng)物患者施用含有至少一種銅氧還蛋白或本發(fā)明的肽的藥物組合物，以減少患者體內(nèi)的血管生長(zhǎng)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是方法，包括給哺乳動(dòng)物患者施用含有至少一種銅氧還蛋白或本發(fā)明的肽的藥物組合物，以指導(dǎo)患者體內(nèi)的神經(jīng)元生長(zhǎng)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是方法，包括給哺乳動(dòng)物患者施用含有至少一種銅氧還蛋白或本發(fā)明的肽的藥物組合物，以促進(jìn)患者體內(nèi)的骨生長(zhǎng)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是方法，包括給哺乳動(dòng)物患者施用治療有效量的含有至少一種銅氧還蛋白或本發(fā)明的肽的藥物組合物，以取代需要使用Ephrin的治療方法中的Ephrin。本發(fā)明的另一個(gè)方面是方法，包括給哺乳動(dòng)物細(xì)胞施用含有至少一種銅氧還蛋白或本發(fā)明的肽的藥物組合物，以抑制細(xì)胞相關(guān)的Ephrin受體的活性。本發(fā)明的另一個(gè)方面是方法，包括施用含有至少一種銅氧還蛋白或本發(fā)明的肽的藥物組合物，以增加細(xì)胞相關(guān)的Ephrin受體的活性。本發(fā)明的另一個(gè)方面是方法，包括給具有表達(dá)Ephrin受體的組織的人類患者施用含有至少一種銅氧還蛋白或本發(fā)明的肽的藥物組合物，所述本發(fā)明的肽包括Ephrin的衍生物或者與藥物融合的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物。在一些實(shí)施方式中，表達(dá)Ephrin受體的組織是癌。本發(fā)明的另一個(gè)方面是撿測(cè)具有Ephrin受體的組織的方法，其步驟包括給人類患者施用包含與檢測(cè)探針融合的至少一種銅氧還蛋白或本發(fā)明的肽的藥物組合物，并檢測(cè)探針在患者體內(nèi)的分布。通過下面的附圖和具體實(shí)施方式的說明，本發(fā)明的這些和其他方面、優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將是顯而易見的。序列說明SEQIDNO:l:SEQIDNO:2:SEQIDNO:3:SEQIDNO:4:SEQIDNO:5:SEQIDNO:6:SEQIDNO:7:SEQIDNO:8:SEQIDNO:9:SEQIDNO:10SEQIDNO:llSEQIDNO:12SEQIDNO:13SEQIDNO:14銅綠假單胞菌天青蛋白的氨基酸序列。Phormidiumlaminosum質(zhì)體藍(lán)素的氨基酸序列。氧化亞鐵硫桿菌Rusticyanin的氨基酸序列。Achromobactercycloclastes亍叚天青蛋白的氨基酸序列糞產(chǎn)堿菌天青蛋白的氨基酸序列。氧化木糖無色桿菌天青蛋白的氨基酸序列。支氣管敗血性博德特菌天青蛋白的氨基酸序列。甲基單胞菌屬天青蛋白的氨基酸序列。腦膜炎奈瑟菌天青蛋白的氨基酸序列。淋病奈瑟菌天青蛋白的氨基酸序列。熒光假單胞菌天青蛋白的氨基酸序列。綠針假單胞菌天青蛋白的氨基酸序列?？琉B(yǎng)木桿菌天青蛋白的氨基酸序列。黃瓜的漆樹花青甙(Stdlacyanin)的氨基酸序列。SEQIDNO:15SEQIDNO:16SEQIDNO:17SEQIDNO:18SEQIDNO:19SEQIDNO:20SEQIDNO:21SEQIDNO:22SEQIDNO:23SEQIDNO:24SEQIDNO:25SEQIDNO:26:SEQIDNO:27:SEQIDNO:28:SEQIDNO:29:SEQIDNO:30:SEQIDNO:31SEQIDNO:32SEQIDNO:33SEQIDNO:34Chloroflexusaurantiacus的AumcyaninA的氣基酸序歹廿。Chloroflexusaurantiacus的AuracyaninB的氨基酸序歹'J。黃瓜的黃瓜堿性蛋白的氨基酸序列。銅綠假單胞菌天青蛋白的殘基96-113的18個(gè)殘基的天青蛋白肽的氨基酸序列。銅綠假單胞菌天青蛋白的殘基88-113的氨基酸序列。孔石莼質(zhì)體藍(lán)素的殘基70-84的氨基酸序列。副溶血弧菌天青蛋白的氨基酸序列?？资毁|(zhì)體藍(lán)素的氨基酸序列。人EphrinB2胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。人EphrinB2的G-H袢區(qū)的氨基酸序列。與EphrinB2G-H袢區(qū)結(jié)構(gòu)類似的銅綠假單胞菌天青蛋白區(qū)的氨基酸序列。與EphrinB2G-H袢區(qū)結(jié)構(gòu)類似的氧化亞鐵硫桿菌(氧化亞鐵酸硫豐干狀菌(」"W^/oZ^c/〃wjybroaxW""力)Rusticyanin區(qū)的氨基酸序列。與EphrinB2G-H袢區(qū)結(jié)構(gòu)類似的Chloroflexusaurantiacus的AuracyaninB區(qū)的氨基酸序列。與EphrinB2G-H袢區(qū)結(jié)構(gòu)類似的孔石莼質(zhì)體藍(lán)素區(qū)的氨基酸序列。與EphrinB2G-H袢區(qū)結(jié)構(gòu)類似的黃瓜的黃瓜堿性蛋白區(qū)的氨基酸序列。與EphrinB2G-H袢區(qū)結(jié)構(gòu)類似的黃瓜漆樹花青甙區(qū)的氨基酸序列。人EphrinB2殘基69-138的氨基酸序列?？资毁|(zhì)體藍(lán)素殘基57-98的氨基酸序列。人EphrinB2殘基68-138的氨基酸序列。銅綠假單胞菌天青蛋白殘基76-128的氮基酸序列。圖1:圖1描述了天青蛋白和EphrinB2的結(jié)構(gòu)比對(duì)。用圖框顯示出了EphrinB-2的G-H拌(介導(dǎo)與EphB受體的高親和力相互作用的區(qū)域)。1JZG—A是銅綠假單胞菌天青蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO.1)。1KGY_E是人EphrinB2胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。圖2:圖2描述了銅氧還蛋白和EphrinB2的結(jié)構(gòu)比對(duì)。圖框代表EphrinB2的涉及Eph受體結(jié)合的G-H拌(15個(gè)氨基酸)。用黑體和下劃線表示保守殘基。大寫字母是重疊位置。虛線是沒有對(duì)齊的地方。EphrinB2G-H袢區(qū)是SEQIDNO:24。與EphrkB2G-H袢區(qū)結(jié)構(gòu)類似的銅綠假單胞菌天青蛋白區(qū)是SEQIDNO:25。與EphrinB2G-H袢區(qū)結(jié)構(gòu)類似的氧化亞鐵硫桿菌(氧化亞鐵酸硫桿狀菌)Rusticyanin區(qū)是SEQIDNO:26。與EphrinB2G-H袢區(qū)結(jié)構(gòu)類j以的Chloroflexusaurantiacus的Auracyanin區(qū)是SEQIDNO:27。與EphrinB2G-H袢區(qū)結(jié)構(gòu)類似的Phormidiumlaminosum的質(zhì)體藍(lán)素區(qū)是SEQIDNO:28。與EphrinB2G-H袢區(qū)結(jié)構(gòu)類似的黃瓜的黃瓜堿性蛋白區(qū)是SEQIDNO:29。與EphrinB2G-H袢區(qū)結(jié)構(gòu)類似的黃瓜漆樹花青甙區(qū)是SEQIDNO:30。圖3:圖3描述了人EphrinB2胞外結(jié)構(gòu)域(lkgy—E)、孔石莼的質(zhì)體藍(lán)素(liuz)、銅綠假單胞菌的天青蛋白(ljzg—A)和氧化亞鐵硫桿菌(氧化亞鐵酸硫桿狀菌)的Rusticyanin(lrcy)的結(jié)構(gòu)之間的比較。在圖3A中，用TOPS動(dòng)畫顯示出每個(gè)蛋白的拓?fù)鋵W(xué)。TOP動(dòng)畫將結(jié)構(gòu)表示為二級(jí)結(jié)構(gòu)元件(SSE)的序列卩鏈(用三角表示)和螺旋(a和310)(用圓圈表示)，它們?nèi)绾伟磸陌被┒说紧然┒说男蛄邢噙B接，以及它們的相對(duì)空間位置和定向?？梢詮倪B接線中推導(dǎo)出元件的方向。用朝上的三角表示"向上"的鏈，以及用朝下的三角表示"向下"的鏈。圖3B，用MolMol程序畫出的圖像(Koradietah，J.Mol.Graphics14:51-55(1996))。圖4:圖4描述了用于結(jié)合銅氧還蛋白和所結(jié)合的Eph-Fc的表面等離子共振Sensorgrams。顯示了天青蛋白(圖4A)、質(zhì)體藍(lán)素(圖犯)、Rusticyanin(圖4C)和EphA-Fc和EphB-Fc蛋白的選擇性結(jié)合。圖5:圖5描述了源自全長(zhǎng)天青蛋白(SEQIDNO:l)的各種截短形式的天青蛋白構(gòu)建體的圖解說明。圖解了二級(jí)結(jié)構(gòu)元件，用箭頭表示J3片以及用矩形表示螺旋(a和310)。編碼128個(gè)氨基酸天青蛋白的基因的各種片段與gst基因(編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)的3'末端骨架融合，并將其克隆于大腸桿菌中，如上所述的進(jìn)行高表達(dá)并純化出融合蛋白(Yamadaetal.，CellMicro.7:1418-1431(2005))。圖6:圖6描述了在表面等離子共振研究中所測(cè)定出的天青蛋白和選擇性構(gòu)建的GST-Azu融合蛋白與EphB2-Fc的相對(duì)結(jié)合親和力。在圖6A中，進(jìn)行初篩選試驗(yàn)，以便確定出天青蛋白或GST-Azu的相對(duì)結(jié)合強(qiáng)度，其中在將銅氧還蛋白(100nM)注射到EphB2-Fc修飾的CM5傳感器芯片上之后記錄下SPR蹤跡。值得注意的是，天青蛋白、GST-Azu88-113、和GST-Azu36-128與EphB2-Fc的結(jié)合比天然配體(EphrinB2-Fc)更強(qiáng)。圖6B顯示了，在滴定逐漸增加的銅氧還蛋白的濃度(0.05-100nM)之后，天青蛋白、GST-Azu88-113、EphrinB2-Fc、和GST-Azu36-89與固定化的EphB2-Fc的相互作用的結(jié)合親和力曲線。從單個(gè)Sensorgrams中推導(dǎo)出平衡共振信號(hào)(Req)，以構(gòu)建出曲線。在將數(shù)據(jù)擬合于利用公式11叫=Rmax/(1+Kd/C)的Langmuir(1:1)結(jié)合模型之后，計(jì)算出結(jié)合解離常數(shù)(Kd)(表6)，連接滴定曲線上的數(shù)據(jù)點(diǎn)顯示出曲線。定量數(shù)據(jù)組與那些從最初結(jié)合篩選中獲得的數(shù)據(jù)相一致。圖7:圖7描述了在結(jié)合滴定和競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)法中確定出的天青蛋白和GST-Azu與EphrinB2-Fc和EphB2-Fc的結(jié)合相互作用。在圖7A中，顯示了天青蛋白和GST-Azu與EphrinB2-Fc的相互作用的SPR結(jié)合曲線，如先前所述的那樣從中測(cè)定出結(jié)合親和力(Kd)。在圖7B中，用固定于CM5傳感器芯片上的EphB2-Fc進(jìn)行的SPR結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)研究。圖8:圖8描述了經(jīng)VAST算法計(jì)算出的包括孔石莼的質(zhì)體藍(lán)素的C末端(1IUZ)和銅綠假單胞菌的天青蛋白(1JZG一A)(分別為圖8A和圖8B)與人EphrinB2胞外結(jié)構(gòu)域(1KGY—E)的結(jié)構(gòu)比對(duì)。用黑體大寫字母表示重疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。虛線和小寫字母表示此處沒有對(duì)齊。圖解了二級(jí)結(jié)構(gòu)元件，用箭頭表示P片以及用空心矩形表示310螺旋。用星號(hào)表示相同的氨基酸。在EphrinB2序列中用暗灰色和淺灰色突出顯示的氨基酸分別表示參與EphrinB2和EphB2受體之間的相互作用和配體二聚體化的殘基(Hirnanenetal,Nature414:933-938(2001);Tothetal，Dev.Cell.1:83-92(2001))。用圖框標(biāo)出并在每個(gè)比對(duì)的下面顯示了對(duì)應(yīng)于EphrinB2的G-H袢區(qū)的質(zhì)體藍(lán)素和天青蛋白肽(分別稱作Pic70-84(SEQIDNO:20)和Azu96-113(SEQIDNO:18))，其是介導(dǎo)Ephrin與Eph受體的高親和力結(jié)合的主要區(qū)域。在EphrinB2的氨基酸序列的上方，用粗箭頭標(biāo)記出G和H袢區(qū)。分別可以在SEQIDNO:31和33中找到IKGY—E殘基69-138和68-138。在SEQIDNO:32中找到了1IUZ殘基57-98。在SEQIDNO:34中找到了1JZG_A殘基76-128。圖9:圖9描述了銅氧還蛋白肽對(duì)癌細(xì)胞活力的作用。在圖9A中，描述了天青蛋白(Azu96-113)和質(zhì)體藍(lán)素(Pic70-84)合成肽對(duì)星形細(xì)胞瘤CCF-STTG1和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤LN-229癌細(xì)胞株的細(xì)胞活力的作用。在圖9B中，描述了不同濃度的質(zhì)體藍(lán)素(Pic70-84)合成肽對(duì)黑色素瘤UISO-Mel-2細(xì)胞活力的作用。如實(shí)施例10所述的，用MTT測(cè)定法測(cè)定出細(xì)胞活力。用不同濃度的合成肽在37。C下處理癌細(xì)胞(96孔板，每孔2x104個(gè)細(xì)胞)24個(gè)小時(shí)。數(shù)據(jù)表示為與未處理的對(duì)照細(xì)胞(活力為100%)相比較的細(xì)胞活力百分比。在圖9C中，描述了Azu96-113合成肽對(duì)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤LN-229細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。用MTT測(cè)定法測(cè)定出細(xì)胞毒作用。用不同濃度的Azu96-113(10、25、50、75、lOOfiM)在37°C下處理癌細(xì)胞(96孔板，每孔2x104個(gè)細(xì)胞)24個(gè)小時(shí)。數(shù)據(jù)表示為與未處理的對(duì)照細(xì)胞(細(xì)胞毒性為0%)相比較的細(xì)胞死亡百分比。圖10:描述了GST-Azu36-128和GST-Azu88-113對(duì)MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞活力的作用。向含有每孔8x103個(gè)細(xì)胞的96孔板中加入漸增濃度(1.25、6.25和12.5pM)的GST-Azu肽，在37°C下孵育48個(gè)小時(shí)，隨后用MTT測(cè)定法分析。與GST-Azu36-128和GST-Azu88-113平行進(jìn)行相同濃度的GST和GST-Azu36-89及未處理細(xì)胞的試驗(yàn)，將其作為對(duì)照。發(fā)明詳述定義除非被特殊地描述為"單個(gè)細(xì)胞"，否則術(shù)語"細(xì)胞"在此包括單數(shù)或復(fù)數(shù)術(shù)語。術(shù)語"多肽"、"肽"、禾『蛋白"在此可以互換使用，其指的是氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)天然存在氨基酸的人工化學(xué)類似物的氨基酸殘基的氨基酸聚合物。該術(shù)語也適用于天然存在氨基酸聚合物。術(shù)語"多肽"、"肽"、和"蛋白"也包含修飾，包括但不限于糖基化、脂質(zhì)連接、硫酸化、谷氨酸殘基的Y羧化、羧化和ADP核糖基化?？梢岳斫?，多肽并非都是完全線性的。例如，由于泛素化的結(jié)果，多肽可以是分支的，并且它們可以是環(huán)形的(有或沒有分支)，一般都是翻譯后事件的結(jié)果，包括天然加工事件和不會(huì)天然發(fā)生的人工處理帶來的事件。通過非翻譯的天然過程以及通過完全合成方法都可以合成環(huán)形的、分支的和分支環(huán)形的多肽。此外，本發(fā)明預(yù)期了本發(fā)明的含甲硫氨酸和少甲硫氨酸的氨基末端變體的用途。術(shù)語"病理性病變，，在此包括不同于正常的解剖的和生理的偏差，其構(gòu)成了對(duì)活體動(dòng)物或其中一部分的正常狀態(tài)的損害，中斷或修飾了軀體功能的性能，并且是一種對(duì)各種因素(例如營(yíng)養(yǎng)不良、工業(yè)危害或氣候)、對(duì)特殊感染原(例如蠕蟲、寄生原蟲、細(xì)菌或病毒)、對(duì)生物體的先天缺陷(例如遺傳學(xué)異常)或這些因素的組合的應(yīng)答。術(shù)語"病變"在此包括不同于正常的解剖的和生理的偏差，其構(gòu)成了對(duì)活體動(dòng)物或其中一部分的正常狀態(tài)的損害，中斷或修飾了軀體功能的性能。術(shù)語"抑制細(xì)胞生長(zhǎng)"在此表示減慢或停止細(xì)胞分裂和域細(xì)胞擴(kuò)增。該術(shù)語也包括抑制細(xì)胞發(fā)育或增加細(xì)胞死亡。術(shù)語"患有"在此包括目前表現(xiàn)出病理性病變的癥狀、具有甚至沒有可觀察到的癥狀的病理性病變、處于病理性病變的恢復(fù)期以及已經(jīng)從病理性病變中康復(fù)。術(shù)語"治療"在此包括阻止、減慢、終止或逆轉(zhuǎn)與所治療的病變相關(guān)的病變或癥狀的進(jìn)展或嚴(yán)重度。因此，在當(dāng)?shù)那闆r下，術(shù)語"治療"包括醫(yī)療性的、治療性的、和/或預(yù)防性的施用。"治療有效量"是能有效地阻止或減慢所治療對(duì)象的特殊病變的現(xiàn)有癥狀的進(jìn)展或部分或完全消除所述癥狀的劑量。確定治療有效量是在本領(lǐng)域人員的能力范圍之內(nèi)。術(shù)語"p53腫瘤抑制基因的表達(dá)缺陷"在此指的是其中p53腫瘤抑制基因?yàn)闇缁畹?、突變的、缺失的或低產(chǎn)的細(xì)胞。例如，因?yàn)閜53基因內(nèi)的遺傳學(xué)異?；蛘哂捎诒碛^遺傳學(xué)原因例如腫瘤抑制基因上游CG島中C殘基的高甲基化或者由于與病毒和細(xì)胞的癌基因的相互作用，可能發(fā)生這種缺陷。當(dāng)用于修飾術(shù)語"銅氧還蛋白"時(shí)，術(shù)語"基本上純化的"在此指的是銅氧還蛋白，例如從生長(zhǎng)培養(yǎng)基或細(xì)胞成分中分離出的銅氧還蛋白，其形式為基本上沒有或者沒有摻雜其他蛋白和/或活性抑制化合物。術(shù)語"基本上純化的"指的是，以干重計(jì)，分離的部分的量的分?jǐn)?shù)至少約為75%，或至少"75%基本上純化的"。更具體的，術(shù)語"基本上純化的"指的是量至少約為活性化合物干重的85%或至少"85%基本上純化的"化合物。最具體的，術(shù)語"基本上純化的"指的是量至少約為活性化合物干重的95%或至少"95%基本上純化的"化合物。所述基本上純化的銅氧還蛋白可以聯(lián)合一種或多種其他基本上純化的化合物或分離的銅氧還蛋白使用。短語"分離的"、"純化的"或"生物學(xué)純化的"指的是，一種物質(zhì)基本上或?qū)嵸|(zhì)上不含那些在天然狀態(tài)中通常伴隨著所述物質(zhì)的組分。因此，本發(fā)明的分離的肽優(yōu)選地不含在肽的原位環(huán)境中與肽正常相關(guān)的物質(zhì)。"分離的"區(qū)指的是不含該區(qū)域所來源的多肽的整個(gè)序列的區(qū)域。"分離的"核酸、蛋白或其相應(yīng)片段已經(jīng)基本上從其體內(nèi)環(huán)境中移出，使得其可以被本領(lǐng)域人員加工處理，例如但不限于核苷酸測(cè)序、限制性消化、定向誘變、和核酸片段被亞克隆到表達(dá)載體內(nèi)、以及獲得基本上純化質(zhì)量的蛋白或蛋白片段。當(dāng)涉及到肽時(shí)，術(shù)語"變體"在此指的是氨基酸序列變體，其與野生型多肽相比較可以具有取代的、缺失的或插入的氨基酸。變體可以是野生型肽的截短形式。因此，通過加工編碼多肽的基因可以制備出變體肽。通過變更多肽的基本組成或特征，但是不變更至少一些其基本活性，可以制備出變體。例如，天青蛋白的"變體"可以是突變的天青蛋白，其保留了抑制哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。在一些情況中，用非天然氨基酸例如s-(3，5-dinitrobenzoy1)-Lys殘基合成變體肽(Ghadiri&Fernholz,J.Am.Chem.Soc，112:9633-9635(1990))。在一些實(shí)施方式中，與野生型肽相比較，變體可以具有不超過20、19、18、17或16個(gè)取代的、缺失的或插入的氨基酸。在一些實(shí)施方式中，與野生型肽相比較，變體可以具有不超過15、14、13、12或11個(gè)取代的、缺失的或插入的氨基酸。在一些實(shí)施方式中，與野生型肽相比較，變體可以具有不超過10、9、8、或7個(gè)取代的、缺失的或插入的氨基酸。在一些實(shí)施方式中，與野生型肽相比較，變體可以具有不超過6個(gè)取代的、缺失的或插入的氨基酸。在一些實(shí)施方式中，與野生型肽相比較，變體可以具有不超過5或4個(gè)取代的、缺失的或插入的氨基酸。在一些實(shí)施方式中，與野生型肽相比較，變體可以具有不超過3、2、或1個(gè)取代的、缺失的或插入的氨基酸。術(shù)語"氨基酸"在此表示包括任一天然存在的或非天然存在的或合成的氨基酸殘基的氨基酸部分，即包括經(jīng)1、2、3或更多個(gè)碳原子(通常是1個(gè)(a)碳原子)直接連接的至少一個(gè)羧基和至少一個(gè)氨基的任何部分。當(dāng)涉及到肽時(shí)，術(shù)語"衍生物"在此指的是源自對(duì)象肽(subjectpeptide)的肽。衍生作用包括化學(xué)修飾肽，使得肽仍然保留一些其基本活性。例如，天青蛋白的"衍生物"可以是保留其抑制哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞生長(zhǎng)的能力的化學(xué)修飾的天青蛋白。感興趣的化學(xué)修飾包括但不限于肽的酰胺化、乙?；?、硫酸化、聚乙二醇(PEG)修飾、磷酸化或糖基化。另外，衍生肽可以是多肽或其片段與化合物的融合，所述化合物是例如但不限于另一種肽、藥物分子或其他治療性或藥物試劑或可檢測(cè)探針。術(shù)語"氨基酸序列相同性百分比(％)"被定義為當(dāng)兩個(gè)序列被比對(duì)時(shí)，多肽中與候選序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。為了確定出氨基酸相同性％，比對(duì)序列，如果必要，則引入缺口，以便獲得最大的序列相同性％，保守取代不被認(rèn)為是序列相同性的一部分。確定相同性百分比的氨基酸序列比對(duì)方法是本領(lǐng)域人員公知的。使用常常可公用的計(jì)算機(jī)軟件例如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)軟件比對(duì)肽序列。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，使用Blastp(來自國(guó)立生物技術(shù)信息中心，BethesdaMD)，其施用長(zhǎng)復(fù)雜性濾器(longcomplexityfilter)的缺省參數(shù)，預(yù)期(expect)10、字長(zhǎng)(wordsize)3、存在(existence)11和延伸1。當(dāng)比對(duì)氨基酸序列時(shí)，給定氨基酸序列A與或相對(duì)于給定氨基酸序列B的氨基酸序列相同性％(其或者可以表達(dá)為給定氨基酸序列A具有或包括與或相對(duì)于給定氨基酸序列B的特定的氨基酸序列相同性％)可以被計(jì)算為氨基酸序列相同性％=X/Y*100其中X是通過對(duì)A和B的序列比對(duì)程序或算法的比對(duì)被積分為相同的匹配的氨基酸殘基的數(shù)目；而Y是B中氨基酸殘基的總數(shù)。如果氨基酸序列A的長(zhǎng)度與氨基酸序列B的序列不相等，那么A與B的氨基酸序列相同性％將不等于B與A的氨基酸序列相同性％。當(dāng)比較較長(zhǎng)的序列與較短的序列時(shí)，較短的序列將是"B"序列。例如，當(dāng)比較截短形式的肽與相應(yīng)的野生型多肽時(shí)，截短形式的肽將是"B"序列。概述本發(fā)明的一些方面提供了使用具有與Ephrin相似結(jié)構(gòu)的銅氧還蛋白來干擾各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織中的Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)以及也抑制哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞生長(zhǎng)的組合物和方法。具體地，本發(fā)明提供了使用銅氧還蛋白及其變體、衍生物、和結(jié)構(gòu)等價(jià)物來干擾Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)以及也抑制體外和體內(nèi)哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的組合物和方法。本發(fā)明人先前發(fā)現(xiàn)致病性微生物分泌一些ATP非依賴性細(xì)胞毒因子，例如氧化還原蛋白如銅綠假單胞菌的天青蛋白，且這些因子通過凋亡引起了J774細(xì)胞死亡，在癌細(xì)胞中尤為如此。也已知天青蛋白具有一從氨基酸殘基50到77的結(jié)構(gòu)域，其促進(jìn)了蛋白有限進(jìn)入到癌細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。令人驚訝的是，本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)天青蛋白和其他銅氧還蛋白中所見的C末端結(jié)構(gòu)域顯示出了與Ephrin相似的結(jié)構(gòu)。見實(shí)施例2、5和9?，F(xiàn)在也已知天青蛋白和質(zhì)體藍(lán)素以及這些肽的特殊區(qū)域是與EphrinG-H袢結(jié)構(gòu)同源的，按1:1比例競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合Ephrin受體。見實(shí)施例6-8。具體地，銅綠假單胞菌天青蛋白與Ephrin受體EphB2和EphA6結(jié)合。見實(shí)施例6。Phormidiumlaminosum質(zhì)體藍(lán)素顯示出結(jié)合Ephrin受體EphAl、A3和B2的特異性以及更低程度的結(jié)合Ephrin受體EphA2和A6的特異性。見實(shí)施例6。最后，Rusticyanin表現(xiàn)出與Ephrin受體EphA8和B1的弱結(jié)合力。見實(shí)施例6?，F(xiàn)在也已知含有與EphrinG-H袢區(qū)結(jié)構(gòu)同源的天青蛋白區(qū)氨基酸殘基88-113與Ephrin受體EphB2結(jié)合。見實(shí)施例7。最后，現(xiàn)在已知天青蛋白和天青蛋白的88-113區(qū)結(jié)合EphrinB2和Ephrin受體EphB2，以及能夠與EphrinB2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合其受體EphB2。見實(shí)施例8。本發(fā)明人也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有與EphrinG-H袢區(qū)結(jié)構(gòu)相似區(qū)域的銅氧還蛋白在體外抑制了哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞的生長(zhǎng)?？偠灾?，Phormidiumlaminosum的質(zhì)體藍(lán)素、氧化亞鐵硫桿菌的Rusticyanin和銅綠假單胞菌天青蛋白在臺(tái)盼藍(lán)測(cè)定法中都抑制了Md-2人黑色素瘤細(xì)胞和MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的體外生長(zhǎng)。見實(shí)施例4。另夕卜，現(xiàn)在已知天青蛋白的88-113殘基區(qū)能夠抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)。見實(shí)施例IO。最后，現(xiàn)在己知對(duì)應(yīng)于與EphrinB2G-H袢區(qū)的結(jié)構(gòu)相似的區(qū)域的18聚體天青蛋白肽和15聚體孔石莼質(zhì)體藍(lán)素肽能夠在體外抑制MCF-7人乳腺癌細(xì)胞、CCF-STTG1腦瘤星狀細(xì)胞瘤細(xì)胞和LN-229成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)。見實(shí)施例3和9。令人驚訝的是，與EphrinB2的G-H袢結(jié)構(gòu)相似的銅氧還蛋白也能在體內(nèi)影響Ephrin相關(guān)發(fā)育?，F(xiàn)在從秀麗隱桿線蟲(C.degans)的Ephrin相關(guān)發(fā)育的體內(nèi)研究中得知，銅氧還蛋白R(shí)usticyanin干擾了尾部肌肉形成，而銅氧還蛋白天青蛋白阻止了胚胎發(fā)育，兩者都是Ephrin相關(guān)發(fā)育。見實(shí)施例1?，F(xiàn)在已經(jīng)明白，除了天青蛋白外，銅氧還蛋白R(shí)usticyanin和質(zhì)體藍(lán)素也與EphrinB2的G和H區(qū)共享結(jié)構(gòu)同源性。見實(shí)施例2和5。此外，已知天青蛋白和Phytocyanin漆樹花青甙和黃瓜堿性蛋白與Ephrin共享顯著的結(jié)構(gòu)同源性。因?yàn)殂~氧還蛋白蛋白家族中的普遍的結(jié)構(gòu)保守性，預(yù)計(jì)許多其他的銅氧還蛋白和銅氧還蛋白樣蛋白也會(huì)顯示出與Ephrin的顯著的結(jié)構(gòu)同源性。見實(shí)施例2。因此，提出了利用本發(fā)明的組合物和方法，銅氧還蛋白家族蛋白一般都可以用于治療Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)性病變和癌癥。相關(guān)的特殊銅氧還蛋白包括但不限于天青蛋白、Rusticyanin、質(zhì)體藍(lán)素、漆樹花青甙、Auracyanin、假天青蛋白和黃瓜堿性蛋白。示例蛋白序列在此為質(zhì)體藍(lán)素(SEQIDNO:2和22)、Rusticyanin(SEQIDNO:3)、假天青蛋白(SEQIDNO:4)、漆樹花青甙(SEQIDNO:14)、Auracyanin(SEQIDNO:15和16)、和黃瓜堿性蛋白(SEQIDNO:17)。術(shù)語"銅氧還蛋白"在此指的是銅氧還蛋白蛋白家族的任一成員，包括銅氧還蛋白樣蛋白例如奈瑟菌的Laz。天青蛋白是特別特異的，這些銅氧還蛋白的示例蛋白序列是但不限于從銅綠假單胞菌(SEQIDN0:1)、糞產(chǎn)堿菌(SEQIDN0:5)、氧化木糖無色桿菌的denitrificansI(SEQIDNO:6)、支氣管敗血性博德特菌(SEQIDNO:7)、甲基單胞菌屬J(SEQIDNO:8)、腦膜炎奈瑟菌(SEQIDNO:9)、淋病奈瑟菌(SEQIDNO:IO)、熒光假單胞菌(SEQIDNO:ll)、綠針假單胞菌(SEQIDNO:12)、苛養(yǎng)木桿菌9a5c(SEQIDNO:13)和副溶血弧菌(SEQIDNO:21)分離到的那些蛋白序列。在最具體的實(shí)施方式中，天青蛋白來自銅綠假單胞菌。在其他具體的實(shí)施方式中，銅氧還蛋白是質(zhì)體藍(lán)素(SEQIDNO:2和22)、Rusticyanin(SEQIDNO:3)、假天青蛋白(SEQIDNO:4)、漆樹花青武(SEQIDNO:14)、Auracyanin(SEQIDNO:15和16)、以及黃瓜堿性蛋白(SEQIDNO:17)。在一些實(shí)施方式中，銅氧還蛋白具有希臘花邊P桶結(jié)構(gòu)。希臘花邊P桶結(jié)構(gòu)是公知的蛋白折疊。見例如，Zhang&Kim(Proteins40:409-419(2000))。因?yàn)樵撃Ｊ皆谙ＥD陶瓷中常見，所以被稱作希臘花邊拓?fù)鋵W(xué)。其具有3個(gè)經(jīng)發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接的上和下p鏈，緊接著的是更長(zhǎng)的與第4個(gè)(3鏈的連接，其位于第1個(gè)P鏈的鄰近位置。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，銅氧還蛋白和銅氧還蛋白的變體、衍生物及結(jié)構(gòu)等價(jià)物包括至少一個(gè)希臘花邊p桶結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，銅氧還蛋白和銅氧還蛋白的變體、衍生物及結(jié)構(gòu)等價(jià)物包括一個(gè)至少4個(gè)p鏈的希臘花邊結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，銅氧還蛋白和銅氧還蛋白的變體、衍生物及結(jié)構(gòu)等價(jià)物包括至少8個(gè)P鏈的希臘花邊結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，銅氧還蛋白和銅氧還蛋白的變體、衍生物及結(jié)構(gòu)等價(jià)物包括一個(gè)以上的希臘花邊P桶結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的組合物本發(fā)明提供了作為銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的肽。在一些實(shí)施方式中，肽是基本上純化的。在其他實(shí)施方式中，肽位于包括或基本上由肽組成的組合物中。在其他實(shí)施方式中，肽是分離的。在一些實(shí)施方式中，肽比全長(zhǎng)銅氧還蛋白短，其保留了銅氧還蛋白的一些功能特征。在一些實(shí)施方式中，肽保留了干擾哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織中Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)和/或抑制哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，肽不會(huì)引起哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答，更具體的是人的免疫應(yīng)答。本發(fā)明也提供了包括至少一個(gè)、至少2個(gè)或至少三個(gè)銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物及結(jié)構(gòu)等價(jià)物的組合物。本發(fā)明也提供了包括存在于藥物組合物中的至少一個(gè)、至少2個(gè)或至少三個(gè)銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物及結(jié)構(gòu)等價(jià)物的組合物。因?yàn)殂~氧還蛋白之間的高度結(jié)構(gòu)同源性，預(yù)期家族中其他銅氧還蛋白也能夠干擾Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)，并特異地抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織中癌癥的生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，銅氧還蛋白是但不限于天青蛋白、假天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、假天青蛋白、Rusticyanin或Auracyanin。在一些特別具體的實(shí)施方式中，天青蛋白源自銅綠假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、氧化木糖無色桿菌的denitriflcansI、支氣管敗血性博德特菌、甲基單胞菌屬、腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、熒光假單胞菌、綠針假單胞菌、苛養(yǎng)木桿菌9a5或副溶血弧菌。在非常具體的實(shí)施方式中，天青蛋白來自銅綠假單胞菌。在其他具體的實(shí)施方式中，銅氧還蛋白是質(zhì)體藍(lán)素，更具體的是來自Phormidiumlaminosum或孔石莼的質(zhì)體藍(lán)素。在其他具體的實(shí)施方式中，銅氧還蛋白是Rusticyanin，更具體的是源自氧化亞鐵硫桿菌的Rusticyanin。在其他具體的實(shí)施方式中，銅氧還蛋白包括氨基酸序列SEQIDNO:l-17、21-22。本發(fā)明提供了銅氧還蛋白的氨基酸序列變體，其與野生型多肽相比具有取代的、缺失的或插入的氨基酸。本發(fā)明的變體可以是野生型多肽的截短形式。多肽的"截短形式"在此是去除多肽序列的至少一個(gè)末端的至少一個(gè)氨基酸殘基所形成的肽。在一些實(shí)施方式中，截短形式的肽是總共至少去除了多肽序列的一端或兩端的至少1個(gè)氨基酸殘基、至少5個(gè)氨基酸殘基、至少10個(gè)氨基酸殘基、至少50個(gè)氨基酸殘基或約100個(gè)氨基酸殘基所形成的肽。在一些實(shí)施方式中，組合物包括由小于全長(zhǎng)野生型多肽的銅氧還蛋白區(qū)域組成的肽。在一些實(shí)施方式中，組合物包括由截短形式的肽的超過約10個(gè)殘基、超過約15個(gè)殘基或超過約20個(gè)殘基組成的肽。在一些實(shí)施方式中，組合物包括由截短形式的肽的不超過約100個(gè)殘基、不超過約50個(gè)殘基、不超過約40個(gè)殘基或不超過約30個(gè)殘基組成的肽。在一些實(shí)施方式中，變體是與銅氧還蛋白以及具體地是與SEQIDNO:l-17、21-22具有至少約90%氨基酸序列相同性、至少約95%氨基酸序列相同性或至少約99%氨基酸序列相同性的肽。在具體的實(shí)施方式中，銅氧還蛋白的變體包括銅綠假單胞菌天青蛋白殘基96-113(SEQIDNO:18)、88-113(SEQIDNO:19)或SEQIDNO:25。在其他的實(shí)施方式中，銅氧還蛋白的變體是由銅綠假單胞菌天青蛋白殘基96-113(SEQIDNO:18)、88-113(SEQIDNO:19)或SEQIDNO:25組成的。在其他具體的實(shí)施方式中，銅氧還蛋白的變體包括孔石莼殘基70-84(SEQIDNO:20)、孔石莼殘基57-98(SEQIDNO:32)、或孔石莼序列SEQIDNO:28。在其他具體的實(shí)施方式中，銅氧還蛋白的變體是由孔石莼殘基70-84(SEQIDNO:20)、孔石莼殘基57-98(SEQIDNO:32)、或孔石莼序列SEQIDNO:28組成的。在其他具體的實(shí)施方式中，銅氧還蛋白的變體包括氧化亞鐵硫桿菌Rusticyanin序列SEQIDNO:26、Chloroflexusaumntiacus的Auracyanin(SEQIDNO:27)、黃瓜序列SEQIDNO:29和30。在其他具體的實(shí)施方式中，銅氧還蛋白的變體是由氧化亞鐵硫桿菌Rusticyanin序列SEQIDNO:26、Chloroflexusaurantiacus的Auracyanin(SEQIDNO:27)、黃瓜序列SEQIDNO:29和30組成的。在其他具體的實(shí)施方式中，變體是由來自其他銅氧還蛋白的上述截短形式序列的等同殘基組成的。也提出了，可以設(shè)計(jì)出具有與上面所提及的任一變體相似活性的其他銅氧還蛋白變體。為此，用BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)、位于目標(biāo)銅氧還蛋白序列上的截短形式變體的相關(guān)殘基、和對(duì)象銅氧還蛋白序列上可見的等同殘基以及因此設(shè)計(jì)出的等同截短形式變體來比對(duì)對(duì)象銅氧還蛋白氨基酸序列和目標(biāo)銅氧還蛋白序列例如那些含有上面的截短形式變體的序列。變體也包含有非天然存在的合成氨基酸制成的肽。例如，非天然存在的氨基酸可以被整合到變體肽內(nèi)，以便延伸或優(yōu)化組合物在血流中的半衰期。這些變體包括但不限于D，L-肽(非對(duì)映體)(Futakietal，J.Biol.Chem.276(8):5836-40(2001);Papoetal,CancerRes.64(16):5779-86(2004);Milleretal，Biochem.Pharmacol.36(1):169-76,(1987))、含有罕見氨基酸的肽(Leeetal.,J.Pept.Res.63(2):69-84(2004))、和含烯烴的非天然氨基酸繼以碳?xì)浠衔镦i環(huán)(stapling)(Schafmeisteretal,J.Am.Chem.Soc.122:5891-5892(2000);Walenskietah,Science305:1466-1470(2004))、以及包括s-(3，5-dinitrobenzoyl)-Lys殘基的肽。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽是銅氧還蛋白的衍生物。銅氧還蛋白的衍生物是所述肽的化學(xué)修飾形式，使得肽仍然保留一些其基本活性。例如天青蛋白的"衍生物"可以是化學(xué)修飾的天青蛋白，其保留了其干擾Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)以及特異地抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織中癌癥生長(zhǎng)的能力。感興趣的化學(xué)修飾包括但不限于，肽的酰胺化、乙?；?、硫酸化、聚乙二醇(PEG)修飾、磷酸化和糖基化。另外，衍生肽可以是銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物與化合物的融合體，所述化合物是例如但不限于另一個(gè)肽、藥物分子或其他治療性或藥物用試劑或可檢測(cè)探針。感興趣的衍生物包括通過其可以延長(zhǎng)或優(yōu)化本發(fā)明的肽和組合物在血流中的半衰期的化學(xué)修飾，例如通過一些本領(lǐng)域人員公知的方法，包括但不限于環(huán)lt月太(Circularizedpeptide)(Monketal，BioDrugs19(4):261-78,(2005);DeFreestetal,J.Pept.Res.63(5):409-19(2004))、N-和C-末端修飾(Labrieetal,Clin.Invest.Med.13(5):275-8，(1990))、和含烯烴的非天然氨基酸繼以碳?xì)浠衔镦i環(huán)(Schafineisteretal.,J.Am.Chem.Soc.122:5891-5892(2000);Walenskietal.，Science305:1466-1470(2004》。預(yù)期本發(fā)明的肽可以是銅氧還蛋白的變體、衍生物和/或結(jié)構(gòu)等價(jià)物。例如，肽可以是已經(jīng)被PEG化的天青蛋白的截短形式，因此使得其同時(shí)既是變體又是衍生物。在一個(gè)實(shí)施方式中，用含有帶烯烴的系鏈(tether)的oc，a雙取代的非天然氨基酸來合成本發(fā)明的肽，以及隨后通過釕催化的烯烴易位作用形成全碳?xì)浠衔?鎖環(huán)"(Scharmeisteretal，J.Am.Chem.Soc.122:5891-5892(2000);Walenskyetal，Science305:1466-1470(2004))。另外，作為天青蛋白的結(jié)構(gòu)等價(jià)物的肽可以與其他肽融合，因此制備出同時(shí)是結(jié)構(gòu)等價(jià)物和衍生物的肽。這些實(shí)施例只是為了說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物可以結(jié)合或可以不結(jié)合銅。在另一個(gè)實(shí)施方式中，肽是銅氧還蛋白的結(jié)構(gòu)等價(jià)物。確定出銅氧還蛋白和其他肽之間的顯著的結(jié)構(gòu)同源性的研究實(shí)例包括Tothetal.(DevelopmentalCell1:82-92(2001))。具體地，通過使用VAST算法確定出銅氧還蛋白和結(jié)構(gòu)等價(jià)物之間的顯著的結(jié)構(gòu)同源性(Gibratetal，CurrOpinStructBiol6:377-385(1996);Madejetal，Proteins23:356-3690(1995))。在具體的實(shí)施方式中，來自銅氧還蛋白與結(jié)構(gòu)等價(jià)物的結(jié)構(gòu)比較的VASTp值小于約10—3、小于約10—5、小于約10'7。在其他實(shí)施方式中，通過使用DALI算法確定出銅氧還蛋白和結(jié)構(gòu)等價(jià)物之間的顯著的結(jié)構(gòu)同源性(Holm&Sander,J.Mol.Biol.233:123-138(1993》。在具體的實(shí)施方式中，配對(duì)結(jié)構(gòu)比較的DALIZ積分是至少約3.5、至少約7.0、或至少約10.0。在實(shí)施例2和9中可找到這些確定方法的實(shí)例。在一些實(shí)施方式中，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物具有銅綠假單胞菌天青蛋白、孔石莼質(zhì)體藍(lán)素、Phormidiumlaminosum質(zhì)體藍(lán)素或氧化亞鐵硫桿菌Rusticyanin的一些功能特征。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物抑制干擾了Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，和/或抑制了哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織中癌癥的生長(zhǎng)。對(duì)哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞或組織生長(zhǎng)的抑制可能與銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物對(duì)Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的任何干擾有關(guān)或無關(guān)。確定銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物是否干擾Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)的方法是本領(lǐng)域公知的，包括確定銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物是否與Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)途徑的組分結(jié)合，例如但不限于Ephrin和/或Ephrin受體。Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)廣義上包含Ephrin和相關(guān)的Ephrin受體、和向后及向前傳送信號(hào)所需的任何分子(或"組分")。狹義上說，Ephrin信號(hào)傳動(dòng)系統(tǒng)只包括Ephrin和負(fù)責(zé)信號(hào)傳導(dǎo)的相關(guān)Ephrin受體。當(dāng)在Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的上下文中使用時(shí)，術(shù)語"干擾"可以造成相關(guān)的Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)("向前"和"向后"方向中的一種或兩種)的增加或減少。測(cè)定對(duì)Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的干擾的方法是本領(lǐng)域公知的。確定對(duì)Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)的干擾的一種方法是肽與Ephrin或Ephrin受體或Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的其他組分的結(jié)合或競(jìng)爭(zhēng)，如實(shí)施例6-8所示。可以使用體內(nèi)系統(tǒng)例如秀麗隱桿線蟲，其中已知銅氧還蛋白能干擾Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)，并變更了尾部肌肉形成和胚胎孵育，如實(shí)施例1所示。其他方法包括但不限于Himanen等(Nat.Neurosci,7:501-509(2004))和Koolpe等(J.Biol.Chem.280:17301-17311(2005))中的Eph受體磷酸化檢測(cè)法。因?yàn)楝F(xiàn)在已知銅氧還蛋白及銅氧還蛋白的變體可以干擾Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)并抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織中癌癥的生長(zhǎng)，因此現(xiàn)在可以設(shè)計(jì)出保留這種功能的銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物。通過例如利用本領(lǐng)域已知的多種方法中的一種方法生成銅氧還蛋白的各種變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物的"文庫(kù)"，然后測(cè)試每種物質(zhì)的抗癌活性就可以制備出這種變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物，例如采用實(shí)施例3、9和10中的示例方法。預(yù)期所形成的具有抗癌活性的銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物可以被用于本發(fā)明的方法，以替代銅氧還蛋白或與其共同使用。在其他的實(shí)施方式中，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物可以與Ephrin具有顯著的結(jié)構(gòu)同源性。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體和衍生物具有Ephrin的G-H袢區(qū)周圍的顯著的結(jié)構(gòu)同源性。確定出銅氧還蛋白和Ephrin之間的顯著的結(jié)構(gòu)同源性的研究實(shí)例包括Tothetal.(DevelopmentalCell1:82-92(2001))和本申請(qǐng)的實(shí)施例2。具體地，通過使用VAST算法確定出銅氧還蛋白和Ephrin之間的顯著的結(jié)構(gòu)同源性(Gibratetal,CurrOpinStructBiol6:377-385(1996);Madejetal，Proteins23:356-3690(1995))。在具體的實(shí)施方式中，來自銅氧還蛋白與Ephrin的結(jié)構(gòu)比較的VASTp值小于約l(T3、小于約10—5、小于約10—7。在其他實(shí)施方式中，通過使用DALI算法確定出銅氧還蛋白和Ephrin之間的顯著的結(jié)構(gòu)同源性(Holm&Sander,J.Mol.Biol.233:123-138(1993))。在具體的實(shí)施方式中，配對(duì)結(jié)構(gòu)比較的DALIZ積分是至少約3.5、至少約7.0、或至少約10.0。在另一個(gè)實(shí)施方式中，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物與Ephrin和/或Eph受體結(jié)合?，F(xiàn)在已知一些銅氧還蛋白具有與EphrinB2胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)相似的C末端區(qū)。見實(shí)施例2、5和9。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物與Ephrin結(jié)合。在一個(gè)特別具體的實(shí)施方式中，Ephrin是但不限于EphrinAl、EphrinA2、EphrinA3、EphrinA4、EphrinA5、EphrinB1、EphrinB2、EphrinB3禾口EphrinB4。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，Ephrin是但不限于EphrinBl、EphrinB2、EphrinB3和EphrinB4。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物與Eph受體結(jié)合。在特別具體的實(shí)施方式中，Eph受體是但不限于EphAl、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphBl、EphB2、EphB3、EphB4禾卩EphB6。在一些實(shí)施方式中，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物既與Ephrin又與Ephrin受體結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物與Ephrin及其受體(特別是EphrinB2及EphB2)結(jié)合。用于確定蛋白與其他蛋白結(jié)合的方法是本領(lǐng)域公知的。確定與Eph受體結(jié)合的方法實(shí)例包括實(shí)施例6-8以及Koolpe等(J.Biol.Chem.280:17301-17311(2005))和Himanen等(Nat.Neurosci.7:501-509(2004》。在一些具體的實(shí)施方式中，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物誘導(dǎo)了哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞(更具體的是J774細(xì)胞)的凋亡。通過利用MITOSENSORTMAPOLERT線粒體膜傳感器試劑盒(ClontechLaboratories,Inc.,PaloAlto,California,U.S.A.)的MitosensorApoAlert共聚焦顯微鏡，通過用Zou等(J.Biol.Chem.274:11549-11556(1999))所述的方法測(cè)定caspase-8、caspase-9和caspase-3活性、以及通過利用例如APOLERTDNA片段化試劑盒(ClontechLaboratories,Inc.,PaloAlto,California,U.S.A.)檢測(cè)凋亡誘導(dǎo)的核DNA片段化可以觀察到銅氧還蛋白或其他多肽誘導(dǎo)凋亡的能力。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞(更具體的是J774細(xì)胞)的細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。通過例如用Yamada等(PNAS101:4770-4775(2004))所述的方法測(cè)定對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的抑制程度可以確定出細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物抑制了哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞(更具體的是J774細(xì)胞)的細(xì)胞周期進(jìn)程。銅氧還蛋白類這些小的藍(lán)銅蛋白(銅氧還蛋白)是參與細(xì)菌電子傳遞鏈的電子傳遞蛋白(10-20kDa)或者是未知功能的蛋白。銅離子獨(dú)自被蛋白基質(zhì)所結(jié)合。銅周圍的兩個(gè)組氨酸和一個(gè)半胱氨酸配體的特殊變形的三角平面排列給出了金屬位點(diǎn)的非常奇特的電子性能和強(qiáng)烈的藍(lán)色。已經(jīng)中到高分辨率地結(jié)晶學(xué)表征出了大量的銅氧還蛋白。銅氧還蛋白一般都具有低的序列同源性，但是具有高的結(jié)構(gòu)同源性(Gough&Clothia,Structure12:917-925(2004);DeRienzoetal"ProteinScience9:1439-1454(2000))。例如，天青蛋白的氨基酸序列與AuracyaninB的氨基酸序列有著31%的相同性，與質(zhì)體藍(lán)素的氨基酸序列有著20.3%的相同性，以及與假天青蛋白的氨基酸序列有著17.3%的相同性。見表1。但是，這些蛋白的結(jié)構(gòu)相似性是更加顯著的。天青蛋白和AuracyaninB的結(jié)構(gòu)比較的VASTp值是l(T74，天青蛋白和Rusticyanin是l(T5，天青蛋白和質(zhì)體藍(lán)素是10—56，以及天青蛋白和假天青蛋白是10—41。所有的銅氧還蛋白都具有8鏈的希臘花邊P桶或P三明治折疊以及具有高度保守的位點(diǎn)結(jié)構(gòu)(DeRienzoetal,ProteinScience9:1439-1454(2000))。在天青蛋白類、Amicyanin類、籃細(xì)菌質(zhì)體藍(lán)素類、黃瓜堿性蛋白的銅位點(diǎn)周圍存在著由于存在多個(gè)長(zhǎng)鏈脂肪族殘基例如甲硫氨酸和亮氨酸所形成的明顯的疏水性補(bǔ)片(hydrophobicpatch),假天青蛋白和真核質(zhì)體藍(lán)素類也有較小程度的疏水性補(bǔ)片。在漆樹花青甙和Rusticyanin銅位點(diǎn)出也能找到較小程度的疏水性補(bǔ)片，但具有不同的性能。表l:利用VAST算法對(duì)銅綠假單胞菌天青蛋白(1JZG)和其他蛋白的序列和結(jié)構(gòu)比對(duì)。<table>complextableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>'比對(duì)長(zhǎng)度兩個(gè)結(jié)構(gòu)之間重疊的等價(jià)的C-(X原子對(duì)數(shù)目，即多少殘基已經(jīng)被用于計(jì)算3D重疊。2P-VAL:VASTp值是比較顯著性的測(cè)量值，表示可能性。例如，如果p值是0.001，那么通過純偶然機(jī)會(huì)看到這種質(zhì)量的配對(duì)的幾率是1000:1。對(duì)于多個(gè)比較的效果，利用假定即在MMDB數(shù)據(jù)庫(kù)中有500個(gè)獨(dú)立的和無關(guān)類型的結(jié)構(gòu)域來調(diào)整VASTp值。所示的p值因此對(duì)應(yīng)于每個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)Φ呐鋵?duì)比較的p值除以500。3積分VAST結(jié)構(gòu)相似性積分。該數(shù)字與重疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件的數(shù)目以及這種重疊的質(zhì)量相關(guān)。更高的VAST積分有著更高的相似性。4RMSD:根均方根重疊殘基(埃)。在兩個(gè)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化重疊之后，用等價(jià)C-a原子之間的方差距離的平方根計(jì)算出該數(shù)值。注意RMSD數(shù)值刻度與結(jié)構(gòu)比對(duì)的程度有關(guān)，當(dāng)用RMSD作為總體結(jié)構(gòu)相似性的描述指標(biāo)時(shí)，必須要考慮到這個(gè)尺寸。5秀麗隱桿線蟲證實(shí)是卵母細(xì)胞成熟中的Ephrin拮抗劑的主要精子蛋白(Kuwabara，2003"ThemultifacetedC.elegansmajorspermprotein:anEphrinsignallingantagonistinoocytematuration"GenesandDevelopment,17:155-161)。天青蛋白天青蛋白是128個(gè)氨基酸殘基的含銅蛋白，其屬于參與特定細(xì)菌的電子傳遞的銅氧還蛋白家族。天青蛋白包括那些來自銅綠假單胞菌(PA)(SEQIDNO:l)、氧化木糖無色桿菌、禾卩A.Denitrificans(Murphyetah,J.MoI.Biol.315:859-871(2002))的天青蛋白。天青蛋白之間的氨基酸序列相同性變化在60-90%之間，這些蛋白顯示出了強(qiáng)的結(jié)構(gòu)同源性。所有的天青蛋白都具有特征性的P-三明治和希臘花邊基序，以及單個(gè)銅原子始終都位于蛋白的相同區(qū)域。另外，天青蛋白具有圍繞在銅位點(diǎn)周圍的基本中性的疏水性補(bǔ)片。質(zhì)體藍(lán)素類質(zhì)體藍(lán)素是藍(lán)細(xì)菌(cyanobacteria)、藻類和植物的可溶性蛋白，其每個(gè)分子含有1分子銅，其氧化形式為藍(lán)色。它們存在于葉綠體中，其中它們作用為電子載體。自從1978年確定出白楊質(zhì)體藍(lán)素類的結(jié)構(gòu)之后，用結(jié)晶學(xué)或NMR方法已經(jīng)確定出了藻類(Scenedesmus、Enteromorpha、Chkmydomonas)和植物(菜豆)質(zhì)體藍(lán)素類的結(jié)構(gòu)，以及白楊的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被精細(xì)到1.33A分辨率。SEQIDN0:2顯示了Phormidiumlaminosum(一種嗜熱藍(lán)細(xì)菌)的氨基酸序列。SEQIDNO:22顯示了孔石莼的質(zhì)體藍(lán)素類的氨基酸序列。盡管藻類和脈管植物之間的序列趨異性(例如衣滴蟲目和白楊植物之間的序列相同性為62%)，但是三維結(jié)構(gòu)是保守的(例如，衣滴蟲目和白楊植物之間的Ca位點(diǎn)的偏差為0.76A)。結(jié)構(gòu)特征包括8鏈反向平行卩桶的一個(gè)末端上的變形的四面體銅結(jié)合位點(diǎn)、明顯負(fù)性補(bǔ)片和平坦的疏水性表面。優(yōu)化了銅位點(diǎn)的電子轉(zhuǎn)移功能，負(fù)性和疏水性補(bǔ)片被認(rèn)為參與了生理反應(yīng)伴侶的識(shí)別?；瘜W(xué)修飾、交聯(lián)和定點(diǎn)誘變?cè)囼?yàn)已經(jīng)驗(yàn)證了負(fù)性和疏水性補(bǔ)片在與細(xì)胞色素f的結(jié)合相互反應(yīng)中的重要性，并確認(rèn)了涉及質(zhì)體藍(lán)素類的兩個(gè)功能顯著的電子轉(zhuǎn)移途徑的模型。一個(gè)推定的電子轉(zhuǎn)移途徑是相對(duì)短的(近4A)并涉及疏水性補(bǔ)片上的溶劑暴露的銅配體His-87，而另一個(gè)途徑則更長(zhǎng)(近12-15A)，并涉及負(fù)性補(bǔ)片中的近保守殘基Tyr誦83(Redinboetal,J.Bioenerg.Biomembr.26:49-66(1994))。Rusticyanin類Rusticyanin是從硫桿菌(現(xiàn)在稱作酸硫桿狀菌(Acid他iobacillus))中獲得的含藍(lán)銅的單鏈多肽。用多波長(zhǎng)異常衍射已經(jīng)確定出了來自氧化亞鐵硫桿菌的極為穩(wěn)定的和高度氧化的銅氧還蛋白R(shí)usticyanin的氧化形式的X射線晶體結(jié)構(gòu)，并將其精細(xì)到了1.9A分辨率。Rusticyanin是由核心p三明治折疊(由6鏈和7鏈的(3片組成)組成的。與其他銅氧還蛋白相似，銅離子與一簇按變形四面體排列的四個(gè)保守殘基(His85、Cysl38、Hisl43、Metl48)配位(Walteretal,J.Mol.Biol.263:730-51(1996》。假天青蛋白類假天青蛋白是含藍(lán)銅的單鏈多肽家族。來自Achromobactercycloclastes的假天青蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。對(duì)假天青蛋白的X射線結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)其具有與天青蛋白相似的結(jié)構(gòu)，盡管這些蛋白之間只有低的序列同源性。假天青蛋白和天青蛋白的總體結(jié)構(gòu)之間存在著兩個(gè)主要差異。一個(gè)是假天青蛋白相對(duì)于天青蛋白的包括兩個(gè)a螺旋的羧基末端延伸。在肽中間區(qū)域，天青蛋白含有延伸環(huán)，而假天青蛋白有所縮短，其形成了含有短a螺旋的瓣(flap)。銅原子位點(diǎn)的唯一的主要差別是MET側(cè)鏈的構(gòu)型以及Met-S銅鍵長(zhǎng)度，其在天青蛋白中要比假天青蛋白明顯更短。Phytocyanin類被鑒定為Phytocyanin的蛋白包括但不限于黃瓜堿性蛋白、漆樹藍(lán)蛋白、Mavicyanin、Umecyanin、黃瓜皮銅氧還蛋白(cucumberpeelingcupredoxin)、豌豆莢內(nèi)的推定的藍(lán)銅蛋白、和來自擬南芥的藍(lán)銅蛋白。在除了黃瓜堿性蛋白和豌豆莢蛋白外的所有這些蛋白中，正常情況下位于藍(lán)銅蛋白位點(diǎn)的中軸(axial)甲硫氨酸配體被谷氨酸取代。Auracyanin已經(jīng)從嗜熱的綠色光合作用細(xì)菌Chloroflexusaurantiacus中分離出被禾爾作AuracyaninA、AuracyaninB-l、禾BAuracyaninB-2的三個(gè)小的藍(lán)銅蛋白。兩個(gè)B形式是糖蛋白，其彼此具有幾乎相同的性能，但是不同于A形式。十二垸基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳發(fā)現(xiàn)表觀單體分子量為14(A)、18(B-2)、和22(B畫l)kDa。已經(jīng)確定出AuracyaninA的氨基酸序列，并顯示出AuracyaninA是139殘基的多月太(VanDreisscheetal;.ProteinScience8:947-957(1999))。按預(yù)期的空間安置His58、Cysl23、Hisl28、和Metl32，只要它們是已知小銅蛋白質(zhì)體藍(lán)素類和天青蛋白中的進(jìn)化保守的金屬配體，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)也表明Auracyanin具有普遍的與銅綠假單胞菌的天青蛋白和白楊葉的質(zhì)體藍(lán)素類相似的13桶結(jié)構(gòu)。但是，Auracyanin表現(xiàn)出兩種小銅蛋白序列組的序列特征。與天青蛋白的共有序列的總體相似性和與質(zhì)體藍(lán)素的共有序列的總體相似性大致相同，約為30.5%。Auracyanin的N末端序列區(qū)l-18特別富含甘氨酸和羥基氨基酸。見來自Chloroflexusaurantiacus的AuracyaninA鏈的示例氨基酸序列SEQIDNO:15(NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)No.AAM12874)。AuracyaninB分子具有標(biāo)準(zhǔn)的銅氧還蛋白折疊。己經(jīng)研究了來自Chloroflexusaurantiacus的AuracyaninB的晶體結(jié)構(gòu)(Bondetal，J.Mol.Biol.306:47-67(2001);在此通過引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng))。除了附加的N末端鏈外，分子與細(xì)菌銅氧還蛋白天青蛋白的結(jié)構(gòu)非常相似。與其他銅氧還蛋白一樣，一個(gè)Cu配體位于多肽的鏈4上，而其他3個(gè)配體位于鏈7和8之間的大環(huán)上。參照后面3個(gè)配體的氨基酸空間位置討論了Cu位點(diǎn)幾何位置。通過表現(xiàn)出與一些其他膜相關(guān)的電子傳遞蛋白中己知的系鏈顯著的序列相同性的N末端尾部可能將結(jié)晶學(xué)表征的AuracyaninB的Cu結(jié)合區(qū)系到細(xì)胞膜的胞漿側(cè)。McManus等(JBiolChem.267:6531-6540C1992))給出了B形式的氨基酸序列。見來自Chloroflexusaurantiacus的Auracyanin的B鏈的示例氨基酸序列SEQIDNO:16(NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)No.IQHQA)。漆樹花青甙漆樹花青甙是Phytocyanin(植物銅氧還蛋白的遍在家族)的一個(gè)亞型。SEQIDNO:14給出了漆樹花青甙的一個(gè)示例序列。也己知了Umecyanin(—種來自辣根的漆樹花青甙)(Kochetal,J.Am.Chem.Soc.127:158-166(2005))和黃瓜漆樹花青甙(Hartelal，ProteinScience5:2175-2183(1996))的晶體結(jié)構(gòu)。蛋白具有與其他Phytocyanin相似的所有折疊。EphrinB2蛋白胞外結(jié)構(gòu)域四級(jí)結(jié)構(gòu)與漆樹花青甙具有顯著的相似性(Tothetal，DevelopmentalCell1:83-92(2001))。在國(guó)立生物技術(shù)信息中心蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中可以找到編號(hào)為No.1JER的漆樹花青甙的示例氨基酸序列SEQIDNO:14。黃瓜堿性蛋白SEQIDNO:17給出了黃瓜堿性蛋白的示例氨基酸序列。黃瓜堿性蛋白(CBP)是一種l型藍(lán)銅蛋白，其晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被精細(xì)到了1.8A分辨率。分子類似于其他具有希臘花邊J3桶結(jié)構(gòu)的藍(lán)銅蛋白，不同之處是桶的一側(cè)是開放的，且被更好地稱作"(3三明治"或"卩-taco"(Gussetal.,J.Mol.Biol.262:686-705(1996))。EphrinB2蛋白胞外結(jié)構(gòu)域四級(jí)結(jié)構(gòu)與黃瓜堿性蛋白具有高度的相似性(50a碳的rms偏差為1,5A)(Tothetal，DevelopmentalCell1:83-92(2001))。Cu原子具有正常的藍(lán)銅NNSS'配位，鍵長(zhǎng)為Cu-N(His39)=1.93A、Cu-S(Cys79)=2.16A、Cu-N(His84)=1.95A、Cu畫S(Met89)=2.61A。二硫鍵(Cys52)-S-S-(Cys85)在穩(wěn)定分子結(jié)構(gòu)方面似乎起到了重要作用。多肽折疊是藍(lán)銅蛋白亞族(Phytocyanin)以及非金屬蛋白豚草過敏原Ra3(其與CBP具有高度的序列相同性)所特有的?，F(xiàn)在被鑒定為Phytocyanin的蛋白是CBP、漆樹花青武、Mavicyanin、Umecyanin、黃瓜皮銅氧還蛋白、豌豆莢內(nèi)的推定的藍(lán)銅蛋白、和來自擬南芥的藍(lán)銅蛋白。在除了CBP和豌豆莢蛋白外的所有蛋白中，正常位于藍(lán)銅蛋白位點(diǎn)的中軸甲硫氮酸配體被谷氨酸取代。在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)No.2CBP中可以發(fā)現(xiàn)黃瓜堿性蛋白的示例序列SEQIDNO:17。本發(fā)明的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種或多種銅氧還蛋白和其變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物在治療患有病理性病變的哺乳動(dòng)物患者的方法中的用途。更具體的，病變與Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)有關(guān)。另外，哺乳動(dòng)物可能患有癌癥?，F(xiàn)在已知銅氧還蛋白和其變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物一般能干擾細(xì)胞或組織中Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的活性。另外，現(xiàn)在已知銅氧還蛋白和其變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物能抑制細(xì)胞和組織中的癌癥生長(zhǎng)。在具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞和組織是哺乳動(dòng)物的細(xì)胞和組織。在更具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞是人類細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞是非人細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，給細(xì)胞施用銅氧還蛋白和其變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物以便抑制細(xì)胞表面上的Ephrin受體的活性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，施用銅氧還蛋白和其變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物，以便增加細(xì)胞表面上的Ephrin受體的活性。在其他具體的實(shí)施方式中，銅氧還蛋白和其變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物抑制和減增加了前向和/或后向的Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)。此外，在抑制前向信號(hào)的同時(shí)增加后向信號(hào)是可能的。哺乳動(dòng)物所患的病理性病變具體的是與Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)活性相關(guān)的病變?，F(xiàn)在知道，銅氧還蛋白包括與Ephrin特定的結(jié)構(gòu)同源性，其也可以象Ephrin—樣在體內(nèi)作用于Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。提出了銅氧還蛋白可以用于治療與Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)的病理性病變。在具體的實(shí)施方式中，病理性病變伴有比正常濃度更高或更低濃度的Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的組分。在其他具體的實(shí)施方式中，病理性病變是由于Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的組分的過度表達(dá)或表達(dá)低下所造成的。在其他具體的實(shí)施方式中，病理性病變是由于Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的組分的過度循環(huán)或循環(huán)缺陷所造成的。在其他具體的實(shí)施方式中，病理性病變引起了Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)途徑的組分的過度表達(dá)或表達(dá)低下。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，病理性病變引起了Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)途徑的組分的過度循環(huán)或循環(huán)缺陷。Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)途徑的"組分"包括傳遞Ephrin與Ephrin受體結(jié)合所生成的信號(hào)或造成Ephrin與Ephrin受體結(jié)合所生成的信號(hào)被傳遞的任何分子。在更具體的實(shí)施方式中，組分是Ephrin或Ephrin受體。另外，病理性病變可以伴有Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的組分的異常分布(細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間或組織特異性分布)。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，可以在細(xì)胞表面上或細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)更高濃度的Ephrin受體。在一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，上調(diào)或下調(diào)了組織中的Ephrin受體。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，上調(diào)或下調(diào)了組織中的Ephrin。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，給患有癌癥的患者施用銅氧還蛋白或其變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物。在一些實(shí)施方式中，患者是哺乳動(dòng)物，特別是人。在其他實(shí)施方式中，患者不是人。雖然未限制這個(gè)治療方法的作用機(jī)制，多個(gè)癌癥與Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)途徑的組分的濃度增加或降低有關(guān)。腫瘤中多個(gè)Ephrin和Eph受體都已經(jīng)顯示出其受到了上調(diào)或下調(diào)，特別是腫瘤進(jìn)展的更晚期。例如，乳腺癌、肝癌和前列腺癌、和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、食道鱗癌、卵巢癌和黑色素瘤中的EphA2受到了上調(diào)。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，癌癥與上調(diào)的EphA2受體相關(guān)。但是，已知在多種腫瘤中，Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的不同組分得受到了上調(diào)或下調(diào)，具體的是Ephrin和Eph受體。各種腫瘤中Ephrin和Ephrin受體的異常表達(dá)是本領(lǐng)域公矢n的，并如Surawska等(Cytokine&GrowthFactorReviews15:419-433(2004))所述。在其他實(shí)施方式中，癌癥與異常量的Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的組分或活性無關(guān)。在具體的實(shí)施方式中，癌癥是但不限于乳腺癌、肝癌、胃腸癌癥、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、絨癌、畸胎癌、甲狀腺癌、所有肉瘤包括源自軟組織和骨骼的肉瘤、腎癌、上皮樣癌和非小細(xì)胞肺癌。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，癌癥是p53腫瘤抑制基因表達(dá)缺陷的。在其他實(shí)施方式中，癌癥具有與腫瘤生長(zhǎng)階段相關(guān)的各種屬性。腫瘤發(fā)生的早期步驟是血管化，其中募集動(dòng)脈給腫瘤提供補(bǔ)養(yǎng)。雖然未將操作機(jī)制限制為任一方式，但已知Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)與血管生成有關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥是一種與血管生成相關(guān)的癌癥。腫瘤發(fā)生的另一個(gè)階段是轉(zhuǎn)移，其中腫瘤形成轉(zhuǎn)移灶，其被定義為與原發(fā)腫瘤不連續(xù)的腫瘤植入物。雖然未將操作機(jī)制限制為任一方式，認(rèn)為轉(zhuǎn)移也與Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥是轉(zhuǎn)移前的癌癥。在另一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥是轉(zhuǎn)移癌。測(cè)定化合物對(duì)血管生成的作用的方法是本領(lǐng)域公知的。用于測(cè)定血管生成的特異方法包括但不限于在下面文章中所見的檢測(cè)法，在此通過引用將其內(nèi)容并入本申請(qǐng)Danieletal，KidneyInt.Suppl.57:S73畫S81(1996);Myersetal,J.CellBiol.148:343-351(2000);Pandeyetal，Science268:567-569(1995);Brantleyetal，Oncogene21:7011-7026(2002)。除了腫瘤外，還有多種與Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)有關(guān)的病理性病變。例如，病理性血管生成形式(Adams&Klein,TrendsCardiov.Medicine10:183-188(2000);Brantley-Sieders&Chen，Angiogenesis7:17-28(2004);Norenetal，Proc.Natl.Acad.SciUSA101:5583-558(2004))、組織損傷后的慢性疼痛(Battagliaetal,NatNeurosci.6:339-340(2003))、脊髓損傷后神經(jīng)再生的抑制(Goldscmitetal,J.Neurosci.6:339-340(2003))、和人先天性畸形(Twiggetal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:8652-8657(2004);Wielandetal.，Am.J.Hum.Genet.74:1209-1215(2004))，以及本發(fā)明的具體實(shí)施方式用銅氧還蛋白、或其變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物治療這些病理性病變。在具體實(shí)施方式中，病理性病變是間質(zhì)性膀胱炎(IC)、炎性腸病(IBD)相關(guān)性病變、HIV感染、心血管病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、周圍血管病、病毒性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變(ChristopherReeve病)和Alzheimer病。與治療患間質(zhì)性膀胱炎和炎性腸病患者相關(guān)的方法學(xué)見例如美國(guó)專利申請(qǐng)20050049176(2005年3月3日出版，在此通過引用將其20內(nèi)容并入本申請(qǐng))。對(duì)于與抑制或刺激血管生成相關(guān)的方法學(xué)見例如美國(guó)專利申請(qǐng)No.20040136983(2004年7月15日出版，在此通過引用將其并入本申請(qǐng))。對(duì)于與治療骨生成相關(guān)的方法學(xué)，見例如美國(guó)專利申請(qǐng)No.20040265808(2004年7月15日出版，在此通過引用將其內(nèi)容并入本申請(qǐng))。通過本領(lǐng)域人員公知的多種途徑和多種方案給患者施用銅氧還蛋白或其變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物。在具體的實(shí)施方式中，靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或通過腫瘤內(nèi)注射來施用銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體或衍生物。在具體的實(shí)施方式中，靜脈內(nèi)施用銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物。在特別具體的實(shí)施方式中，給患癌癥或從癌癥中康復(fù)的患者施用銅氧還蛋白或其變體或衍生物和化療。除了病理性病變外，銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物還可以用于與患者所患的其他病變相關(guān)的治療性方法。這些病變可以是損傷了神經(jīng)或血管系統(tǒng)的意外事故、其他治療如手術(shù)的康復(fù)、和衰老相關(guān)的病變等所造成的。在一個(gè)實(shí)施方式中，患者需要血管的生長(zhǎng)或再生，則施用銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物以指導(dǎo)血管的生長(zhǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，患者需要減少血管生長(zhǎng)，則施用銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物以抑制血管的生長(zhǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，給需要神經(jīng)元生成或再生的患者施用銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物，以知道神經(jīng)元的生長(zhǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，給患者施用銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物以促進(jìn)骨生成。本發(fā)明的另一個(gè)方面是在體內(nèi)檢測(cè)表現(xiàn)出特異的Ephrin受體的細(xì)胞?，F(xiàn)在已知銅氧還蛋白含有與Ephrin和其他Ephrin高度結(jié)構(gòu)同源的區(qū)域，且銅氧還蛋白在體外可以與Ephrin受體特異性結(jié)合。因此，銅氧還蛋白將能定位到表達(dá)Ephrin受體的細(xì)胞表面。因此，在一些實(shí)施方式中，銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物可以用于定位未表達(dá)Eph受體細(xì)胞或組織中的這些表達(dá)Eph受體的細(xì)胞和組織。另外，表現(xiàn)出對(duì)特殊類型的Eph受體的結(jié)合優(yōu)先性的銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物可以用于定位特異地表達(dá)這類Eph受體的細(xì)胞或組織。在一個(gè)實(shí)施方式中，銅氧還蛋白或其變體或衍生物與可檢測(cè)探針相連接，并被施用給人類患者，測(cè)定出可檢測(cè)探針在患者體內(nèi)的位置，以便確定出表達(dá)Eph受體的細(xì)胞或組織的位置。在特別具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞是癌細(xì)胞?？蓹z測(cè)探針可以是多種本領(lǐng)域目前已知的探針之一。特異相關(guān)的探針包括但不限于熒光探針、同位素探針和碘、釓和金。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物與藥物相連接，并被施用給人類患者，以便將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)給表達(dá)Eph受體的細(xì)胞或組織。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，組織是腫瘤。在特別具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞是癌細(xì)胞。藥物可以是任何類型的化合物，其對(duì)表達(dá)Eph受體的細(xì)胞有著影響。藥物可以是有機(jī)的或無機(jī)的化合物，包括但不限于肽、DNA分子、RNA分子、藥物組合物和這些化合物的任一衍生物。在具體的實(shí)施方式中，藥物是毒素例如假單胞菌外毒素A結(jié)構(gòu)域III或化合物例如紫杉醇或其他殺死癌細(xì)胞的藥物。通過施用在人類患者的所需細(xì)胞或組織中表達(dá)的含有與啟動(dòng)子區(qū)可操縱地連接的編碼銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的編碼區(qū)的DNA可以向細(xì)胞或人類患者施用銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，給患者施用編碼銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的DNA，以便治療能被銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物所治療的病變。將其施用給細(xì)胞和人類患者的合適載體和方法是本領(lǐng)域公知的。在人類對(duì)象中表達(dá)外源蛋白的方法學(xué)在本領(lǐng)域是公知的，并且可以適用于在患者體內(nèi)表達(dá)銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物。在下面的美國(guó)專利中可以找到示例方案2002年1月15日提交的美國(guó)專利No.6,339,068、2005年3月15日提交的美國(guó)專利No.6,867,000、2004年11月23日提交的美國(guó)專利No.6,821,957、2004年11月23日提交的美國(guó)專利No.6,821,955、2003年5月13日提交的美國(guó)專禾ijNo.6，562，376;在此通過引用將其內(nèi)容并入本申請(qǐng)。在更具體的實(shí)施方式中，將編碼銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的DNA注射到患有癌癥的患者的腫瘤內(nèi)。在更具體的實(shí)施方式中，將編碼銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的DNA注射到患有癌癥的患者的腫瘤內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，通過靜脈注射、肌肉內(nèi)注射、皮下注射、吸入、局部施用、透皮貼劑、栓劑、或口服以及特異地通過靜脈注射可以給患者施用藥物組合物?？梢栽谑┯昧硪环N已知能治療Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的病理性病變或癌癥的藥物的同時(shí)或在1分鐘到1周或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)給患者施用藥物組合物?？梢耘c另一種抗癌藥物同時(shí)施用藥物組合物。包括銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的藥物組合物用任一常用方法例如通過常用的混合、溶解、顆?；?、制錠、乳化、包囊化、包埋或低壓凍千方法可以生產(chǎn)包括至少一種銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的藥物組合物?；旧霞兓你~氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物可以容易地與本領(lǐng)域公知的可藥用載體組合在一起。這些載體使得制品可以被配制成片劑、藥丸、錠劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、懸浮液等。合適的輔料也可以包括例如填充劑和纖維素制品。其他的敷料可以包括例如芳香劑、加色劑、防粘劑(detackifiers)、增稠劑和其他可用的添加劑、佐劑或結(jié)合齊廿。在Anseletal,PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems(LippencottWilliams&Wilkins，BaltimoreMD(1999))中可以找到關(guān)于藥物劑量形式的通用方法。用多種方式包括通過注射(例如皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)等)、通過吸入、通過局部施用、通過栓劑、通過使用透皮貼劑或通過口服可以施用本發(fā)明所用的包括銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的組合物。在Anseletal(同上)中可以找到關(guān)于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的一般信息。在一些實(shí)施方式中，包括銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的組合物可以被配制并直接用作用于皮下和靜脈內(nèi)注射等的注射液。在與保護(hù)劑例如聚丙二醇或相似的涂層劑混合之后，也可以口服攝入包括銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的組合物。當(dāng)通過注射施用時(shí)，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物可以被配制于水溶液，特異地被配制于生理學(xué)相容的緩沖液例如Hanks溶液、林格液或生理鹽水緩沖液。溶液可以包含制劑藥物例如懸浮的、穩(wěn)定的和/或分散的藥物?；蛘?，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物在使用前可以是被合適載體例如無菌的無致熱源水所構(gòu)建的粉末形式。在一些實(shí)施方式中，藥物組合物不包括佐劑或任何其他被加入用于增強(qiáng)所述肽所刺激的免疫應(yīng)答的物質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，藥物組合物包括抑制針對(duì)所述肽的免疫應(yīng)答的物質(zhì)。當(dāng)通過靜脈內(nèi)液體進(jìn)行施用時(shí)，用于施用銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的靜脈內(nèi)液體可以是由晶體或膠體組成的。在此所用的晶體是無機(jī)鹽或其他水溶性分子的水溶液。在此所用的膠體包含更大的不可溶分子例如凝膠。靜脈內(nèi)液體可以是無菌的?？梢员挥糜陟o脈內(nèi)施用的晶體液包括但不限于生理鹽水(0.9%氯化鈉溶液)、林格乳酸液或林格液、和5%葡萄糖水溶液(有時(shí)也稱作D5W)，如表2所示。表2:常用晶體液的組成實(shí)施例1。<table>complextableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>*林格乳酸液也含有28mmol/L乳酸、4mmol/LK+和3mmol/LCa2+。當(dāng)通過吸入施用時(shí)，利用合適的推進(jìn)劑例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲垸、二氧化碳或其他合適的氣體可以從加壓的包裝或噴霧器中釋放出氣霧劑形式的銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物。對(duì)于加壓氣霧劑而言，通過提供釋放計(jì)量的量可以確定出劑量單位?？梢耘渲瞥鲇糜谖肫骰虼等肫鞯暮械鞍缀秃线m的粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉的粉末混合物的凝膠的膠囊和藥筒。當(dāng)通過局部施用來施用時(shí)，可以將銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物配制成溶液、凝膠、軟膏、乳膏、凝膠劑、懸浮液等，如本領(lǐng)域公知的那樣。在一些實(shí)施方式中，施用是經(jīng)透皮貼劑的方式。當(dāng)施用是通過栓劑(例如直腸內(nèi)或陰道內(nèi))進(jìn)行時(shí)，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物也可以被配制于含有常用栓劑基質(zhì)的組合物。當(dāng)施用是口服施用時(shí)，通過混合銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物和本領(lǐng)域公知的可藥用載體可以容易地配制出銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物。可以采用固體載體例如甘露醇、乳糖、硬脂酸鎂等；合適的載體使得銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物可以被配制成用于所治療的對(duì)象口服攝入的片劑、藥丸、錠劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿劑、膏劑、懸浮液等。對(duì)于口服的固體制劑例如粉末、膠囊和片劑，合適的賦形劑包括填充劑例如糖、纖維素制品、顆粒化試劑和結(jié)合劑。本領(lǐng)域公知的其他常用載體也包含對(duì)價(jià)載體例如細(xì)菌莢膜多糖、葡聚糖或遺傳學(xué)加工的載體。另外，包含銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的持續(xù)釋放制劑容許在延長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)釋放出銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物，使得在沒有持續(xù)釋放制劑時(shí)，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物在沒有引起或增強(qiáng)治療性作用之前可以被對(duì)象系統(tǒng)清除和/或被例如蛋白酶和簡(jiǎn)單水解所降解。用本領(lǐng)域熟知的一些方法可以延長(zhǎng)或優(yōu)化本發(fā)明的組合物的血流半衰期，所述方法包括但不限于環(huán)化肽(Monketal,BioDrugs19(4):261-78,(2005);DeFreestetal"J.PeptRes.63(5):409-19(2004》、D，L陽月太(非對(duì)映體)(Futakietal，J.Biol.Chem.Feb23;276(8):5836-40(2001);Papoetal，CancerRes.64(16):5779-86(2004);Milleretal，Biochem.Pharmacol.36(1):169-76,(1987))、含罕見氨基酸的肽(Leeetal，J.Pept.Res.63(2):69-84(2004》、N和C末端的修飾(Labrieetal,Clin.Invest.Med.13(5):275-8,(1990》、和碳?xì)浠衔镦i環(huán)(Schafmeisteretal,J.Am,Chem.Soc.122:5891-5892(2000);Walenskietal，Science305:1466-1470(2004))。特別相關(guān)的方法是經(jīng)D-取代或L-氨基酸取代的d-異構(gòu)化作用(取代)和肽穩(wěn)定性修飾。在各種實(shí)施方式中，藥物組合物包含載體和輔料(包括但不限于緩沖劑、碳水化合物、甘露醇、蛋白、多肽或氨基酸例如甘氨酸、抗氧化劑、制菌劑、螯合劑、懸浮劑、增稠劑和/或防腐劑)、水、油、鹽溶液、葡萄糖水溶液和甘油溶液、近似生理狀態(tài)所需的其他可藥用輔助物質(zhì)例如緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑、濕化劑等。要認(rèn)識(shí)到，雖然可以采用本領(lǐng)域人員已知的任一合適的載體來施用本發(fā)明的組合物，但是載體的類型將根據(jù)施用模式而有所不同。利用公知的技術(shù)也可以將化合物包裹在脂質(zhì)體內(nèi)。生物可降解的微球也可以被采用作本發(fā)明的藥物組合物的載體。例如在美國(guó)專利No.4,897,268、5,075,109、5,928,647、5,811,128、5,820,883、5,853,763、5，814，344和5,942,252中描述了合適的生物可降解的微球。藥物組合物可以被常用的公知的滅菌技術(shù)滅菌或者被滅菌過濾。所形成的水溶液可以被包裝使用或者被低壓凍干，低壓凍干的制品在施用之前可以與無菌溶液組合。銅氧還蛋白的施用可以施用被配制成藥物組合物的銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物，以及可以用任何合適的途徑來進(jìn)行施用，例如通過口服、頰粘膜、吸入、舌下、直腸、陰道、經(jīng)尿道、鼻、局部、經(jīng)皮，即經(jīng)皮或腸外(包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和冠狀動(dòng)脈內(nèi))施用?？梢允┯媚苡行?shí)現(xiàn)其預(yù)定目標(biāo)的任何量的藥物制劑。更具體的，施用治療有效量的組合物。在具體的實(shí)施方式中，治療有效量一般是從約0.01至lj20mg/天/kg體重。包括銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的化合物可以單獨(dú)地或聯(lián)合其他活性藥物用于治療哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織中的Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的病變或癌癥。合適的劑量當(dāng)然將根據(jù)例如所采用的銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物、宿主、施用模式和所治療的病變的性質(zhì)和嚴(yán)重度的不同而有所不同。但是，一般來說，每日從約0.01到20mg/kg體重的劑量將在人體中獲得滿意的結(jié)果。人體中所給出的每日劑量范圍是施用從約0.7mg到約1400mg銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的化合物，例如是每日劑量、每周劑量、每月劑量和/或連續(xù)劑量。每日劑量可以是從每日1次到12次的分離劑量。或者，可以隔日、每3天、每4天、每5天、每6天、每周以及類似地天數(shù)間隔增加到31天或更長(zhǎng)來施用劑量?；蛘?，劑量可以是使用貼片、靜脈內(nèi)施用等的連續(xù)劑在一些實(shí)施方式中，向患者引入銅氧還蛋白和/或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的方法是共施用已知能治療Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的特異的病理性病變或癌癥或其他病變或方法的其他藥物。這些方法是本領(lǐng)域公知的。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，銅氧還蛋白和/或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物是含有治療Ephrin相關(guān)的病理性病變或癌癥的其他藥物的雞尾酒或共劑量的一部分。相關(guān)的藥物包括用于治療炎性腸病、HIV感染、病毒性疾病、心血管病、周圍血管病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變和Alzheimer病的那些藥物。用于治療炎性腸病的藥物包括但不限于氨基水楊酸鹽如柳氮磺吡啶(Azulfidine)、奧沙拉嗪(Dipentum⑧)、美沙拉嗪(Asacol、Pentasa)、和巴柳氮(Colazal);糖皮質(zhì)激素例如潑尼松、Medrol、甲基潑尼松龍、氫化可的松、布地奈德(EntocortEC);免疫調(diào)節(jié)劑例如硫唑嘌呤(依木蘭⑧)、6-巰基嘌呤(6-MP，Purinethol)和環(huán)孢菌素A(Sandimmune,Neoral);抗生素例如甲硝唑(Flagyl)和環(huán)丙沙星(Cipro);生物治療例如英夫利昔單抗(Remicade);以及其他治療例如他克莫司(FK506)和麥考霉酚酸酯。用于治療HIV感染的藥物包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑AZT(齊多夫定[Retrovir⑧])、ddC(扎西他濱[Hivid⑧]、雙脫氧肌苷)、d4T(司他夫定[Zerit⑧])、和3TC(拉米夫定[Epivir⑧]);非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIS):地拉夫定(Rescriptor)和奈韋拉平(Viramune);蛋白酶抑制劑利托那韋(Norvir)、洛匹那韋和利托那韋組合物(Kaletra)、沙奎那韋(Invirase)、硫酸印地那韋(Crixivan)、安潑那韋(Agenerase)和那非那韋(Viracept⑧)。用于治療病毒性疾病的藥物包括但不限于阿昔洛韋、水痘帶狀皰疹免疫球蛋白(VZIG)、PEG干擾素、利巴韋林、阿昔洛韋(Zovirax).伐昔洛韋(Valtrex)、泛昔洛韋(Famvir)、金剛垸胺、金剛乙胺、扎那米韋、奧賽米韋和a-干擾素。用于治療心血管病的藥物包括但不限于抗凝劑、抗血小板藥、溶栓劑、腎上腺能神經(jīng)阻斷劑、腎上腺能神經(jīng)激動(dòng)劑、a/p-腎上腺能神經(jīng)阻斷劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑和鈣離子通道阻斷劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑和利尿劑、血管緊張素II受體拮抗劑、鈣離子通道阻斷劑、利尿劑(包括碳酸酐酶抑制劑、袢利尿劑、保鉀利尿劑、噻嗪類和相關(guān)利尿劑)、血管擴(kuò)張劑和血管升壓藥等。用于治療周圍血管病的藥物包括但不限于乙酮可可堿(pentoxifylline)(Trental)、口服甲基黃嘌呤衍生物、和西洛他唑(Pletal);III型磷酸二酯酶抑制劑；抗血小板/抗血栓治療如阿司匹林；抗凝劑如肝素和華法林⑧(Coumadin);降膽固醇藥物如煙酸、他汀類、貝特類、1opid⑧片劑(吉非貝齊；Parke-Davis)、tricor片劑(非諾貝特；Abbott)、膽酸多價(jià)螯合劑、colestid⑧片劑(微粒化的鹽酸降膽寧；PharmaciaandUpjohn)、welchol⑧片劑(鹽酸考來維綸；Sankyo);鈣離子通道阻斷劑；微生物和食品添加物如葉酸、B-6、B-12、L-精氨酸和co-3脂肪酸；和HMG-COA還原酶抑制劑如advicor⑧片劑(Niadn/Lovastatin;Kos);altocor⑧延長(zhǎng)釋放片劑(洛伐他?。籄ndryxlabs);lescol⑧膠囊(氟伐他汀鈉；Novartis&Reliant);lipitor⑧片劑(阿托伐他?。籔arke-DavisandPfizer);mevacor⑧片劑(洛伐他?。籑erck);pmvacho胸片劑(普伐他汀鈉；Bristol-MyersSquibb)、pravigardPAC片劑(緩沖阿司匹林和普伐他汀鈉；；Bristol-MyersSquibb);zocor0片劑(辛伐他?。籑erck);煙酸類藥物如advicor⑧片劑(煙酸/洛伐他?。籏os(也列為HMG-COA還原酶抑制劑))；niaspan(niacin;Kos);和其他藥物如zetia⑧片劑(ezetimibe;Merck/ScheringPlough)。用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物包括但不限于精神治療藥物例如各種苯二氮卓類制品和組合物、抗焦慮藥、抗抑郁藥(包括單胺氧化酶抑制劑、選擇性5-羥色胺再攝入抑制劑(SSRI)、三環(huán)類抗抑郁藥)、抗躁狂劑、抗驚恐劑、抗緊張劑、精神興奮劑、和強(qiáng)制性障礙疾病治療藥物；偏頭痛制品如P腎上腺能神經(jīng)阻斷劑、甲異辛烯胺和5-羥色胺受體抑制劑、以及其他的偏頭痛制品包括depakote⑧片劑中的活性成分(Divalproexsodium;Abbott)、和excedrin⑧偏頭痛片劑中的活性成分(對(duì)乙酰氨基酚；BMS產(chǎn)品)；鎮(zhèn)靜劑和安眠藥；抗驚厥劑；禾Bpimozide⑧。用于治療帕金森病的藥物包括但不限于抗膽堿能藥物、兒茶酚-鄰-甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、多巴胺藥物和單胺氧化酶(MAO)抑制劑。用于治療CNS退行性變疾病的藥物包括以下藥物用于治療多發(fā)性硬化的藥物包括但不限于avonex⑧中的活性成分(干擾素-pia;BiogenNeurology);用于皮下注射的Betaseron(干擾素-pib的修飾形式；Berlex);用于注射的Copaxone(醋酸格拉默；TevaNeuroscience);depo-medrol⑧注射用懸浮液(醋酸甲基潑尼松龍；Pharmacia&Upjohn);Novantrone⑧注射用濃縮劑(按鹽酸米托蒽醌提供的米托蒽醌；Serono);Orapred⑧口服液(潑尼松龍磷酸鈉口服液；Ascent);和Rebif⑧注射液(干擾素-Pla;Pfizer&Serono)。用于治療亨廷頓病的藥物包括但不限于鎮(zhèn)定劑如氯硝西泮(Klonopin⑧)；抗精神病藥如氟哌唑醇(Haldol)和氯氮平(Clozaril);氟西汀(Prozac、Sarafem)、舍曲林(Zoloft⑧)、去甲替林(Aventyl、Pamelor)、和鋰齊lj(Eskalith、Lithobid)。用于治療Alzheimer病的藥物包括但不限于aricept⑧片劑(鹽酸多奈培齊；Eisai或Pfizer);exelon⑧膠囊(利斯的明(rivastigmine)(重酒石酸鹽形式)；Novartis);exelon⑧口服溶液(酒石酸利斯的明；Novartis);reminy鵬口服液(氫溴酸力口蘭他敏(galantaminehydrobromide);Janssen)或reminyl⑧片劑(氫溴酸加蘭他敏；Janssen)。在一些實(shí)施方式中，向患者引入銅氧還蛋白和/或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的方法是共施用已知能治療癌癥的其他藥物。這些方法是本領(lǐng)域公知的。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，銅氧還蛋白和/或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物是含有治療癌癥的其他藥物的雞尾酒或共劑量的一部分。相關(guān)的藥物包括例如那些在此所列的藥物，特別是5-氟尿嘧啶、干擾素a、甲氨喋呤、他莫昔芬和長(zhǎng)春新堿。上面的實(shí)例指示作為舉例說明的目的，許多其他的化合物是本領(lǐng)域人員所己知的。適用于治療癌癥的其他藥物包括但不限于烷化劑如氮芥、烷磺酸鹽、亞硝脲、乙撐亞胺、和三氮烯；抗代謝藥如葉酸拮抗劑、嘌呤類似物、和嘧啶類似物；抗生素類如蒽環(huán)類、博萊霉素、絲裂霉素、更生霉素和光輝霉素；酶如L-天冬酰胺酶；法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑；5-oc還原酶抑制劑、3型np-羥類固醇脫氫酶抑制劑；激素類藥物如糖皮質(zhì)激素、雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、黃體酮、和促黃體生成激素釋放激素拮抗劑、醋酸奧曲肽；微管阻斷劑如海鞘素(ecteinascidin)或其類似和衍生物；微管穩(wěn)定劑如紫杉垸類例如紫杉醇(Taxo鵬)、多西他奇(Taxotere)及其類似物、和Epothilone類如EpothiloneA-F及其類似物；植物衍生產(chǎn)品如長(zhǎng)春花堿、鬼臼乙叉甙、紫杉垸類；和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑；異戊二烯基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑；和其他藥物如羥基脲、甲基芐肼、鄰對(duì)滴滴滴、六甲密胺、鉑配位絡(luò)合物如順鉑和卡鉑；和用作抗癌和細(xì)胞毒藥物的其他藥物如生物效應(yīng)修飾劑、生長(zhǎng)因子；免疫調(diào)節(jié)劑和單克隆抗體。也可以結(jié)合放療和手術(shù)來使用本發(fā)明的化合物。這些類型的抗癌和細(xì)胞毒藥物的代表性實(shí)例包括但不限于鹽酸氮芥、環(huán)磷酰胺、瘤可寧、馬法蘭、異環(huán)磷酰胺、馬利蘭、卡莫司汀、環(huán)己亞硝脲、甲基環(huán)己亞硝脲、鏈脲霉素、塞替派、氮烯咪胺、甲氨喋呤、硫鳥嘌呤、巰基嘌呤、氟達(dá)拉濱、Pentastatin、克拉屈濱、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、鹽酸阿霉素、柔紅霉素、去甲氧柔紅霉素、硫酸博萊霉素、絲裂霉素C、方文線菌素D、safracins、saframycins、quinocarcins、discodermolides、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、酒石酸長(zhǎng)春瑞濱、足葉乙甙、磷酸足葉乙甙、鬼臼噻吩甙、紫杉醇、他莫昔芬、雌氮芥、雌氮芥磷酸鈉、氟他米特、乙基酰胺、亮丙瑞林、蝶啶、二炔基、左旋咪唑、aflacon、干擾素、白介素、阿地白介素、非格司亭、沙莫司亭、利妥昔單抗、BCG、維甲酸、鹽酸依立替康、倍他米松(betamethosone)、鹽酸吉西他濱、六甲密胺和拓泊替康以及它們的任一類似物或衍生物。這些類型的優(yōu)選成員包括但不限于紫杉醇、順鉑、卡鉑、阿霉素、去甲氧柔紅霉素、柔紅霉素、氨基蝶呤、甲氨喋呤、甲基葉酸、絲裂霉素C、海鞘素743或Pofiromycin、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、吉西他濱、阿糖胞苷、鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物例如足葉乙甙、磷酸足葉乙甙或鬼臼噻吩甙、馬法蘭、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、異長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春地辛和長(zhǎng)春羅新。用于與本發(fā)明的組合物共施用的抗癌藥和其他細(xì)胞毒藥物的實(shí)例包括以下藥物德國(guó)專利No.4138042.8、WO97/19086、WO98/22461、WO98/25929、WO98/38192、WO99/01124、WO99/02224、WO99/02514、WO99/03848、WO99/07692、WO99/27890、WO99/28324、WO99/43653、WO99/54330、WO99/54318、WO99/54319、WO99/65913、WO99/67252、WO99/67253和WO00/00485所述的Epothilone衍生物；WO99/24416(也見于美國(guó)專利No.6，040，321)所述的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑；和WO97/30992和WO98/54966所述的異戊二烯基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑；以及藥物例如那些在美國(guó)專利No.6,011,029中屬性和具體描述的藥物(可以與任何NHR調(diào)節(jié)劑(包括但不限于本發(fā)明的那些調(diào)節(jié)劑)如AR調(diào)節(jié)、ER調(diào)節(jié)劑、LHRH調(diào)節(jié)劑，或者與手術(shù)技術(shù)特別是治療癌癥的手術(shù)一起采用美國(guó)專利的化合物)。由主治醫(yī)師根據(jù)患者的病變來決定正確的制劑、施用途徑和劑量。可以個(gè)體化地調(diào)整劑量的量和間隔，以提供足以保持治療作用的活性銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的血槳水平。一般都用與經(jīng)預(yù)定施用途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥物實(shí)踐所選出的藥物載體的混合物來施用所需的銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物。在一個(gè)方面，轉(zhuǎn)運(yùn)DNA形式的銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物，使得在原位生成多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，DNA是"裸"DNA，如Ulmer等(Science259:1745-1749(1993))所述以及如Cohen(Science259:1691-1692(1993))所綜述的那樣。通過將DNA涂層到載體例如生物可降解珠上可以增加對(duì)裸DNA的攝取，然后裸DNA被有效地轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。在這些方法中，可以用本領(lǐng)域人員已知的多種轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的任一系統(tǒng)來呈遞DNA，包括核酸表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)菌和病毒表達(dá)系統(tǒng)。用于將DNA整合到表達(dá)系統(tǒng)中的技術(shù)是本領(lǐng)域人員所公知的。見例如WO90/11092、WO93/24640、WO93/17706、和美國(guó)專利No.5,736,524。用于將遺傳物質(zhì)從生物體穿梭到生物體的載體可以分成兩大類克隆載體是可復(fù)制的質(zhì)?；蚴删w，其具有在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制所必需的以及其中被插入外源DNA的區(qū)域；外源DNA是可復(fù)制和繁殖的，只要其是載體的一個(gè)組件。表達(dá)載體(例如質(zhì)粒、酵母菌、或動(dòng)物病毒基因組)被用于將外源遺傳物質(zhì)引入到宿主細(xì)胞或組織內(nèi)，以便轉(zhuǎn)錄和翻譯外源DNA例如銅氧還蛋白的DNA。在表達(dá)載體中，所引入的DNA與元件例如啟動(dòng)子可操縱地連接，啟動(dòng)子給宿主細(xì)胞傳遞信號(hào)，以便高水平地轉(zhuǎn)錄所插入的DNA。一些啟動(dòng)子是特別有用的，例如誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其控制應(yīng)答于特異的因素的基因轉(zhuǎn)錄。銅氧還蛋白和其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的多核苷酸與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的可操縱地連接可以控制銅氧還蛋白和/或細(xì)胞色素c和其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物應(yīng)答于特異的因素的表達(dá)。常用的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例是那些應(yīng)答于oc干擾素、熱休克、重金屬離子、和類固醇如糖皮質(zhì)激素(Kaufman,MethodsEnzymol.185:487-511(1990))和四環(huán)素的啟動(dòng)子。其他所需的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括那些非細(xì)胞內(nèi)源的啟動(dòng)子，其中向細(xì)胞內(nèi)引入構(gòu)建體，當(dāng)外源性提供誘導(dǎo)劑時(shí)，這些細(xì)胞中的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是有應(yīng)答的。有用的表達(dá)載體一般常常是質(zhì)粒。但是，也關(guān)注其他形式的表達(dá)載體例如病毒載體(如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。由所用的生物體或細(xì)胞以及所需的載體性質(zhì)決定載體選擇。載體一般包括信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、標(biāo)記物基因、多連接物位點(diǎn)、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。包括銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的試劑盒在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了含有包裝或容器中的一個(gè)或多個(gè)下面的物質(zhì)的試劑盒(1)包括至少一種銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的生物學(xué)活性組合物；(2)包括共施用藥物的生物學(xué)活性組合物；(3)可藥用輔料；(4)施用工具例如注射器；(5)施用說明書。在相同包裝或容器中的兩種或多種組分(1)-(5)的實(shí)施方式也被預(yù)期?？梢詮哪切┫惹疤峒暗乃幬镏羞x出共施用藥物。當(dāng)提供試劑盒時(shí)，組合物的不同組分可以被包裝在分離的容器內(nèi)，在使用前即刻將其混合。這種分開包裝組分可以容許長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存，且不丟失活性組分的功能?？梢杂萌我活愋偷娜萜魈峁┰噭┖兴脑噭?，使得可以保存不同組分的壽命，且不被容器的材料所吸收或變更。例如，密封的玻璃安瓿可以包含低壓凍干的銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物，或者已經(jīng)在中性的、無反應(yīng)的氣體如氮?dú)庀掳b的緩沖液。安瓿可以由任何合適的材料組成，例如玻璃、有機(jī)聚合物例如聚碳酸鹽、聚苯乙烯等、陶瓷、金屬或任一通常被用于保存相似試劑的材料。合適容器的其他實(shí)例包括普通瓶，其可以由與安瓿相似的物質(zhì)制成，和外殼，其可以包括夾箔的內(nèi)層例如鋁箔或合金箔。其他容器包括試管、小瓶、燒瓶、瓶、注射器等。容器可以具有無菌的進(jìn)孔，例如具有可以被皮下注射針頭穿透的塞子的瓶子。其他容器可以具有由容易取出的膜分隔開的兩個(gè)室，在取出膜之后容許組分混合在一起?？扇〕龅哪た梢允遣Ａ?、塑料、橡膠等。試劑盒也可以提供說明材料。說明書可以被打印在紙或其他底物上，或者可以提供可電子閱讀的介質(zhì)如軟盤、CD-ROM、DVD-RPM、zip盤、錄像帶、錄音磁帶、閃盤等。詳細(xì)的說明書可以不與試劑盒物理地相連;取而代之的是，用戶可以被引導(dǎo)到試劑盒的產(chǎn)商或經(jīng)銷商指定的網(wǎng)站或者通過電子郵件來提供。銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物的修飾銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物可以被化學(xué)修飾或遺傳學(xué)變更，以生成如上面所解釋的變體和衍生物。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以合成這些變體和衍生物。除了銅氧還蛋白的天然存在的等位基因變體外，通過向銅氧還蛋白編碼序列中引入突變可以造成改變，這能使得所編碼的銅氧還蛋白的氨基酸序列發(fā)生變更，但不會(huì)顯著地變更銅氧還蛋白干擾Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)或抑制癌癥生長(zhǎng)的能力。"非必需"氨基酸殘基是銅氧還蛋白的野生型序列中可以被變更且不變更生物學(xué)活性的殘基，而"必需"氨基酸殘基是這種生物學(xué)活性所必需的氨基酸殘基。例如，預(yù)計(jì)在銅氧還蛋白中為保守氨基酸的氨基酸殘基是特別不適合于變更的，因此是"必需"氨基酸?？梢灾苽涑霾粫?huì)改變多肽活性的保守取代的氨基酸是本領(lǐng)域公知的。表3"優(yōu)選的取代"顯示了有用的保守取代。其中相同類型的另一個(gè)氨基酸對(duì)一種類型的氨基酸的保守取代是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，只要取代實(shí)質(zhì)上不會(huì)變更化合物的生物學(xué)活性。表3:優(yōu)選的取代<table>complextableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>lie(I)Leu，Val,Met,Ala，Phe，正亮氨酸LeuLeu(L)正亮氨酸，He,Val,Met，Ala,PheIleLys(K)Arg,Gin,AsnArgMet(M)Leu,Phe，lieLeuPhe(F)Leu,Val,Ile，Ala,TyrLeuPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(W)Tyr,PheTyrTyr(Y)Trp，Phe，Thr，SerPheVal(V)Ile,Leu，Met,Phe，Ala,正亮氨酸Leu影響(1)多肽骨架的結(jié)構(gòu)例如P片或a螺旋構(gòu)象；(2)電荷；(3)疏水性；或(4)耙位點(diǎn)側(cè)鏈的體積的非保守取代都能修飾細(xì)胞毒因子的功能。根據(jù)表4所示的常見側(cè)鏈性能可以將殘基分組。非保守取代使得用這些類型之一中的成員交換另一種類型的成員。取代可以被引入到保守取代位點(diǎn)或者更特異地被弓I入到非保守位點(diǎn)。表4:氨基酸類型類型氨基酸疏水性正亮氨酸，Met,Ala,Val,Leu,Ile中性親水性Cys,Ser，Thr酸性Asp,Glu堿性Asn,Gln，His,Lys,Arg破壞鏈構(gòu)象Gly,Pro芳香性Trp,Tyr,Phe利用本領(lǐng)域已知的方法例如寡核苷酸介導(dǎo)的(定點(diǎn))誘變、丙氨酸掃描、和PCR誘變可以制備出變體多肽?？梢栽谒寺〉腄NA上實(shí)施定點(diǎn)誘變(Carter,BiochemJ.237:1-7(1986);ZollerandSmith,MethodsEnzymol.154:329-350(1987))、限制性選擇誘變(Wellsetal,Gene34:315-323(1985))或其他己知的技術(shù)，以生成銅氧還蛋白變體DNA。也可以用已知的銅氧還蛋白突變生成用于本發(fā)明的方法中的變體銅氧還蛋白。例如，已知銅綠假單胞菌天青蛋白的C112D和M44KM64E突變體具有不同于天然天青蛋白的細(xì)胞毒活性和生長(zhǎng)停滯活性，這種變更了的活性可以用于本發(fā)明的治療方法。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式利用銅氧還蛋白及其保留了干擾哺乳動(dòng)物細(xì)胞中Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)或抑制癌癥生長(zhǎng)的能力的變體和衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法利用了銅氧還蛋白變體如M44KM64E突變體，其具有引起細(xì)胞生長(zhǎng)停滯的能力。通過參照下面的特殊實(shí)施例可以獲得對(duì)本發(fā)明的更充分的理解。描述實(shí)施例只是為了舉例說明的目的，并不打算限制本發(fā)明的范圍。給出提示或者出于方便目的的情況下對(duì)本發(fā)明作出的形式變化和等同替換也屬于本發(fā)明的范圍。盡管在此采用了具體的術(shù)語，但這些術(shù)語只是描述意義的，并不是限制的目的。在不脫離本發(fā)明的精神和范圍前提下，可以進(jìn)行如在此之前所述的本發(fā)明的修飾和變異，因此本發(fā)明的范圍為所附權(quán)利要求書所示的范圍。實(shí)施例實(shí)施例l:秀麗隱桿線蟲發(fā)育的體內(nèi)研究己知秀麗隱桿線蟲中一些Ephrin參與了尾部的肌肉形成和胚胎發(fā)育。我們的初步試驗(yàn)顯示Rusticyanin干擾了尾部肌肉形成(引起尾部麻痹)，而天青蛋白阻止了幼蟲出生(胚胎發(fā)育)。在這些試驗(yàn)中，在大腸桿菌中高表達(dá)天青蛋白和Rusticyanin基因。維持沒有天青蛋白或Rusticyanin基因的對(duì)照大腸桿菌。當(dāng)用對(duì)照大腸桿菌喂養(yǎng)秀麗隱桿線蟲最多3天時(shí)，它們是健康的并能生產(chǎn)幼蟲。當(dāng)用表達(dá)Rusticyanin的大腸桿菌喂養(yǎng)秀麗隱桿線蟲時(shí)，約30%只能移動(dòng)它們的頭部或其身體的上半部分，但不能移動(dòng)它們的尾部或其身體的下半部分，說明尾部麻痹。實(shí)施例2:天青蛋白結(jié)構(gòu)鄰近物分析通過用載體比對(duì)搜索工具(VAST)算法(Gibratetal，CurrOpinStructBiol6:377國(guó)385(1996);Madejetal，Proteins23:356-3690(1995))直接比較分子塑模數(shù)據(jù)庫(kù)中的3維蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)鄰近物分析。分子塑模數(shù)據(jù)庫(kù)含有來自結(jié)晶學(xué)和NMR結(jié)構(gòu)測(cè)定的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并由國(guó)立生物技術(shù)信息中心(Bethesda,MD，USA)維護(hù)。通過國(guó)立生物技術(shù)信息中心可以獲得進(jìn)行VAST蛋白結(jié)構(gòu)鄰近物分析的程序。天青蛋白顯示出與MMDB(分析塑模數(shù)據(jù)庫(kù))編號(hào)1KGYE(EphB2-EphrinB2復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu))的顯著的(VastP值10e46;比對(duì)長(zhǎng)度90個(gè)氨基酸；相同性％:6)(圖1)結(jié)構(gòu)重疊。天青蛋白與參考晶體結(jié)構(gòu)的重疊比對(duì)涉及鏈E(138個(gè)氨基酸)(被稱作Ephrin的蛋白(Ephrin-B2))。該計(jì)算分析與Himanen等(Nature,vol414:933-938(2001》發(fā)表的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)相一致。進(jìn)一步的VAST分析表明銅氧還蛋白R(shí)usticyanin、Auracyanin、質(zhì)體藍(lán)素、黃瓜堿性蛋白和漆樹花青甙也顯示出與EphrinB2在G-H袢區(qū)的顯著的結(jié)構(gòu)同源性(圖2)。實(shí)施例3:源自天青蛋白和質(zhì)體藍(lán)素的合成肽的功效已經(jīng)分析了源自天青蛋白和質(zhì)體藍(lán)素的與人EphrinB-2G-H袢結(jié)構(gòu)相似的合成肽的功效。已經(jīng)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成了具有以下序列的18-mer天青蛋白肽TFDVSKLKEGEQYMFFCTSEQIDNO:18將MCF-7乳腺癌細(xì)胞在含有5和50|ig/ml18-mer天青蛋白肽的16孔板中孵育0、24、48和72個(gè)小時(shí)，在此之后，用庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器計(jì)算出MCF-7細(xì)胞的數(shù)目。與沒有合成肽處理的細(xì)胞相比較，發(fā)現(xiàn)50ng/ml肽在48到72個(gè)小時(shí)內(nèi)抑制了50%MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)。與未處理的對(duì)照相比較，5ng/ml18-mer合成肽的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的程度約為25。/。。該試驗(yàn)表明只依據(jù)其與B-2Ephrin的結(jié)構(gòu)相似性所設(shè)計(jì)出的合成肽的確抑制了B-2Ephrin所加速的癌細(xì)胞進(jìn)展。實(shí)施例4:體外測(cè)定銅氧還蛋白對(duì)Mel-2和MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)的作用用16孔板測(cè)定出經(jīng)銅氧還蛋白處理過的細(xì)胞的生長(zhǎng)。Md-2或MCF-7細(xì)胞(每孔5xl()s個(gè)細(xì)胞)被容許粘附到多孔板(在此為16孔板)24個(gè)小時(shí)。在粘附之后，吸除生長(zhǎng)培養(yǎng)基。然后向含有新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基的孔內(nèi)加入PBS(磷酸緩沖液)或濃度為0.1到IOjiM的各種銅氧還蛋白/細(xì)胞色素PBS，癌細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)24、48和72個(gè)小時(shí)。在孵育期之后，將臺(tái)盼藍(lán)加入到培養(yǎng)物中，并計(jì)算出死的漂浮細(xì)胞的數(shù)目。計(jì)算活的和死的漂浮細(xì)胞，以便確定出各種銅氧還蛋白劑量的IC50。IC50是抑制50。/。細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)的蛋白濃度。當(dāng)每孔500,000個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)24個(gè)小時(shí)時(shí)，有足夠多的細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)。在無銅氧還蛋白的對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，它們沒有足夠的空間粘附到板的底部，就開始死亡并成為漂浮細(xì)胞。在質(zhì)體藍(lán)素處理過的或Rusticyanin處理過的細(xì)胞培養(yǎng)物中，細(xì)胞也生長(zhǎng)超過板的表面積，并開始死亡和漂浮，但是其數(shù)目小于對(duì)照。但是，在天青蛋白處理過的細(xì)胞培養(yǎng)物中，Mel-2和MCF-7細(xì)胞株生長(zhǎng)被抑制到造成了非常少的漂浮細(xì)胞。實(shí)施例5:EphrinB2胞外結(jié)構(gòu)域和銅氧還蛋白之間的結(jié)構(gòu)相似性用分別通過美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所和歐洲生物信息研究所獲得的VAST和DALI算法(HolmandSander,J.MoLBiol.233:123-138(1993);Gibratetal.,Curr.Opm.Biol.6"377-385(1996))測(cè)定出EphrinB2胞外結(jié)構(gòu)域和銅氧還蛋白之間的結(jié)構(gòu)相似性。禾U用VAST算法計(jì)算出基于結(jié)構(gòu)的配對(duì)序列比對(duì)。用TOPS(蛋白結(jié)構(gòu)的拓?fù)鋵W(xué))動(dòng)畫進(jìn)行2維的蛋白結(jié)構(gòu)算法(Torranceetal，Bioinformatics21:2537-2538(2005))。通過使用程序MolMol來進(jìn)行結(jié)構(gòu)評(píng)估(Koradietal，J，Mol,Graphics14:51-55(1996》。兩個(gè)程序都發(fā)現(xiàn)了一些同源物，包括單體銅氧還蛋白蛋白的一個(gè)小亞組、質(zhì)體藍(lán)素、天青蛋白和Rusticyanin。具體地，EphrinB2胞外結(jié)構(gòu)域與這三種銅氧還蛋白(其被選作銅氧還蛋白家族的代表性蛋白)之間的結(jié)構(gòu)比較所提供的VAST和DALI比對(duì)具有顯著的相當(dāng)相似的積分，范圍分別是從11.0到9.7(超出可能的最大值15.7)和6.7到6.4。DALIZ積分<2.0是結(jié)構(gòu)不相似的(表5)。在EphrinB2和質(zhì)體藍(lán)素之間存在著最明顯的結(jié)構(gòu)保守性，重疊的根均方差(r.m.s.d.)為1.8A(在67個(gè)結(jié)構(gòu)等價(jià)的Cot原子上計(jì)算出的數(shù)值)(表5)。相比而言，天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素和Rusticyanin表現(xiàn)出了與EphrinB2胞外結(jié)構(gòu)域更弱的一級(jí)序列相同性(小于腦)。表5:人EphrinB2胞外結(jié)構(gòu)域與單結(jié)構(gòu)域銅氧還蛋白家族的三種成員(質(zhì)體藍(lán)素、天青蛋白和Rusticyanin)的結(jié)構(gòu)相似性。<table>complextableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>a-VAST積分VAST結(jié)構(gòu)相似性積分。該數(shù)字與重疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件的數(shù)目以及這種重疊的質(zhì)量相關(guān)。更高的VAST積分有著更高的相似性。b-DALIZ積分利用Ephrin胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)和DALI數(shù)據(jù)庫(kù)中的其他結(jié)構(gòu)的配對(duì)比較計(jì)算出Z積分。Z積分越高，3D結(jié)構(gòu)之間的相似性為隨機(jī)的可能性就越小(Z<2.0的配對(duì)是結(jié)構(gòu)不相似的)。c-RMSD:結(jié)構(gòu)對(duì)的比對(duì)部分之間的骨架殘基的根均方差(A)。圖3顯示了所研究的EphrinB2胞外結(jié)構(gòu)域和所有三種銅氧還蛋白的TOPS動(dòng)畫(A)和MolMol圖像(B)。拓?fù)鋵W(xué)描述表明蛋白采用了形成希臘花邊折疊核心的兩個(gè)P片的三明治結(jié)構(gòu)，并且顯示出了在P鏈數(shù)目和空間定位方面的顯著的結(jié)構(gòu)相似性；1KGY—E(EphrinB2)、IIUZ(質(zhì)體藍(lán)素)和1JZGA(天青蛋白)(圖3)。相反的，a螺旋的數(shù)目和排列是更不保守的。在JZGA中，與在此所示的其他蛋白相比較，其螺旋結(jié)構(gòu)是獨(dú)特的。對(duì)于具有不同大小的蛋白可以預(yù)計(jì)到，連接二級(jí)結(jié)構(gòu)元件的環(huán)顯示出在其長(zhǎng)度及構(gòu)象方面的差異。IRCY(Rusticyanin)具有最低的結(jié)構(gòu)同源性，主要差異在于共享的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件(SSE)的長(zhǎng)度和非共享SSE的存在。實(shí)施例6:通過表面等離子共振分析Eph-Fc受體-銅氧還蛋白相互作用通過表面等離子共振(SPR)分析確定出Eph受體和銅氧還蛋白的特異性相互作用。如先前所述的那樣(Yamadaetal，CellMicrobiol.7:1418-1431(2005);Hiraokaetal，Proc.Natl.Acad.SciUSA101:6427-6432(2004))，在含5°/。C02的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中、37°C下將人星狀細(xì)胞瘤CCF-STTG1、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤LN229和MCF-7(乳腺癌)細(xì)胞培養(yǎng)在含2mML-谷氨酰胺、10mMHepes、10%(體積/體積)熱滅活FBS、100U/ml青霉素和100|iig/ml鏈霉素的RPMI培養(yǎng)基1640中。將人黑色素瘤細(xì)胞UISO-Mel-2(Yamadaetal，Proc.Natl.Acad.SciUSA99:14098-14103(2002))培養(yǎng)在加有10%FBS的MEM和Hank培養(yǎng)基中。大腸桿菌JM109禾口BL21(DE3)用作過量生產(chǎn)天青蛋白、Rusticyanin和質(zhì)體藍(lán)素的宿主菌株。如先前所述的純化出天青蛋白和Rusticyanin(Yamadaetal，Proc.Natl.Acad.SciUSA99:14098-14103(2002);Yamadaetal.,CellCycle3:1182-1187(2004))。早先已經(jīng)報(bào)道了GST-天青蛋白融合衍生物的構(gòu)建和純化(Yamadaetal,CellMicrobiol.7:1418-1431(2005))?；旧先缭缦人龅哪菢舆M(jìn)行對(duì)來自Phormidiumlaminosum的質(zhì)體藍(lán)素的純化和表達(dá)(Schlarbetal，Gene234:275-283(1999))，除了用大腸桿菌菌株BL21(DE3)Cd+(RIL)取代BL21(DE3)。利用4700M"cm"的吸光系數(shù)以分光光度法在598nm確定出充分氧化蛋白的濃度。Eph胞外結(jié)構(gòu)域Fc融合蛋白和Ephrin的低壓凍干粉末都購(gòu)自R&DSystems,Minneapolis,MN。所有用于表面等離子共振和生長(zhǎng)試驗(yàn)的化學(xué)物都購(gòu)自BiacoreABInternational或Sigma，它們都是高分析級(jí)的。用基于表面等離子共振(SPR)技術(shù)的BiacoreX生物傳感器系統(tǒng)(BiacoreAB)測(cè)定出銅氧還蛋白或GST肽與Eph-Fc或EphrinB2-Fc之間的直接蛋白-蛋白相互作用。在最初的篩選試驗(yàn)中，用胺偶聯(lián)方法實(shí)現(xiàn)了天青蛋白、Rusticyanin、或質(zhì)體藍(lán)素被固定于CM5傳感器芯片上的單個(gè)通道。連續(xù)注射N-羥基琥珀酰亞胺/N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亞胺(N—hydroxysucGinimide/N-(3-dimethylaminopropyl)畫N-ethylGarbodiimide)(0.05M/0.2M，35pL)、銅氧還蛋白蛋白(255^M，50pL)、1M氨基乙醇(50|^L，pH8.8)禾nlOOmMNaOH(10pL)使得蛋白與CM5傳感器芯片共價(jià)連接，使得共振信號(hào)增加300RU。通過將lOOnMEph-Fc蛋白HBS-EP電泳緩沖液(0.01MHEPES,pH7.4;0.15MNaCl、3mMEDTA、0.005%v/v表面活性劑P20)連續(xù)注射到傳感器表面(流速為5和30pL/min，共2.3min)(70|iL注射液)以及間斷注射lOOmMNaOH(10|aL脈沖)以再生銅氧還蛋白-CM5表面來實(shí)施結(jié)合試驗(yàn)。在裸AuCM5傳感器表面(陰性通道)上進(jìn)行所有結(jié)合試驗(yàn)，以校正非特異性結(jié)合。通過連續(xù)注射lOOnMEph-Fc受體(流速為30|aL/min，共2.3min)可以在銅氧還蛋白修飾傳感器表面上實(shí)施結(jié)合篩選。曲線代表Eph-Fc和天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、及Rusticyanin的相互作用的結(jié)合相的開始。相對(duì)結(jié)合親和力是飽和共振(R叫)的函數(shù)，Rusticyanin與EphBl-Fc或EphA8-Fc的結(jié)合親和力為79RU，天青蛋白與EphB2-Fc的結(jié)合親和力為1248RU。銅氧還蛋白與特異性EphA和EphB受體蛋白的交叉選擇性結(jié)合是非常顯著的，在銅氧還蛋白和EphB之間出現(xiàn)了最好的相互作用。固定化的銅氧還蛋白與Eph-Fc的結(jié)合的SPRSensorgrams說明了這兩個(gè)亞組蛋白之間的選擇性識(shí)別(圖4A-C)。在這些測(cè)定中，Eph-Fc的濃度被保持恒定于100nM，使得用Req表示的結(jié)合程度的差異能夠反映出Eph-Fc受體蛋白和銅氧還蛋白之間的親和力差異。天青蛋白顯示了與EphB2-Fc和A6的最高的親和力，其也與A4和A7緊密結(jié)合(圖4A)。另一方面，質(zhì)體藍(lán)素顯示出對(duì)EphAl-Fc、A3和B2的選擇性，對(duì)A2和A6的選擇性較小(圖4B)。最后，Rusticyanin識(shí)別EphA8-Fc、和Bl，但是其結(jié)合都是弱的(圖4C)。天青蛋白和EphB2-Fc及EphA6-Fc的結(jié)合相互作用是最高的，其Req值分別是1248和1200RU。實(shí)施例7:分析天青蛋白和GST-Azu肽與EphB2-Fc的結(jié)合親和力一SPR結(jié)合測(cè)量值利用固定化的EphB2-Fc和天青蛋白或GST-Azu肽實(shí)施天青蛋白和GST-azu肽與EphB2-Fc的結(jié)合親和力(SPR結(jié)合測(cè)量值)，以評(píng)價(jià)全長(zhǎng)天青蛋白或其可變區(qū)與EphB2-Fc受體的相對(duì)集合親和力。給EphB2-Fc或EphrinB2-Fc修飾的CM5芯片注射漸增濃度(0.05-100nM)的天青蛋白或GST-Azu肽，注射之間給予100mMNaOH脈沖注射。將數(shù)據(jù)放入Langmuir(1:1)結(jié)合模型Req二Rmax/(1+Kd/C)，以推導(dǎo)出平衡結(jié)合常數(shù)(Kd)。圖5顯示了用于闡述天青蛋白結(jié)合EphB2-Fc的結(jié)構(gòu)決定子的試驗(yàn)策略，其描述了如先前所述的天青蛋白和GST-Azu構(gòu)建體的一級(jí)/二級(jí)結(jié)構(gòu)參數(shù)的圖譜(Yamadaetal.,CellMicrobiol.7:1418-1431(2005))。具體地，GST-Azu88-113與EphrinB2(天然配體)的GH袢區(qū)相一致，因此其與EphB2-Fc的結(jié)合效率是特別相關(guān)的。最初對(duì)天青蛋白和各種GST-Azu構(gòu)建體(所有濃度均為100nM)與EphB2-Fc的結(jié)合測(cè)定發(fā)現(xiàn)了它們的相對(duì)親和力即天青蛋白〉GST-Azu88-113>GST-Azu36-128>EphrinB2-Fc>GST-Azu36-89>>GST(圖6A)。天青蛋白和GST-標(biāo)簽的天青蛋白顯示出相當(dāng)?shù)挠H和力(數(shù)據(jù)沒有顯示)。為了定量結(jié)合親和力，測(cè)定出了作為其濃度(0-100nM)函數(shù)的天青蛋白或GST-Azu的飽和反應(yīng)值(Req)(圖6B)。將結(jié)合數(shù)據(jù)放入Langmuir(1:1)結(jié)合公式以測(cè)定出平衡解離常數(shù)(Kd)。值得注意的是，天青蛋白(Kd=6nM)和GST-Azu88-113(Kd=12nM)與EphB2-Fc的親和力分別比其天然EphrinB2-Fc配體(Kd=30nM)的親和力的5倍和2.5倍。GST-Azu36-128(表6)也顯示比EphrinB2-Fc(Kd=30nM)稍高的親和力。相反的，GST-Azu36-89和GST表現(xiàn)出基本上可忽略的結(jié)合(表6)。這些數(shù)據(jù)說明天青蛋白的Azu88-113區(qū)對(duì)與EphB2-Fc的高親和力的相互作用的重要性。Azu88-113區(qū)是由與EphrinB2中的GH袢結(jié)構(gòu)同源的GH袢區(qū)組成的。表6:天青蛋白和GST-Azu構(gòu)建體與EphB2-Fc的相對(duì)結(jié)合親和力。<table>complextableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>用SPR結(jié)合滴定試驗(yàn)測(cè)定出天青蛋白和GST-Azu構(gòu)建體與EphB2-Fc的相對(duì)結(jié)合親和力，在此總結(jié)了所推測(cè)的數(shù)據(jù)組，并與天然的EphrinB2-Fc配體和GST的結(jié)合力進(jìn)行比較。在向傳感器表面注射1OOnM分析物之后，生成了最初篩選試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，列出了共振單位的飽和信號(hào)(Req)。獲得了圖6b所述的結(jié)合曲線的每個(gè)滴定點(diǎn)上的飽和結(jié)合，用按分析物標(biāo)繪的這些數(shù)值計(jì)算出平衡解離常數(shù)(Kd)。天青蛋白和GST-Au的Kd數(shù)值范圍是從6到61nM，而EphB2-Fc與天然配體具有這個(gè)范圍內(nèi)的中間的結(jié)合親和力。實(shí)施例8:分析天青蛋白/GST-Azu和EphrinB2-Fc與EphB2-Fc的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合研究為了更好的了解高親和力的天青蛋白-EphB2-Fc結(jié)合的生理學(xué)作用，我們進(jìn)行了進(jìn)一步的結(jié)合測(cè)定。與結(jié)合常數(shù)研究相似的進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合滴定，除了在EphB2-FcCM5傳感器表面上注射EphrinB2-Fc(246nM)+競(jìng)爭(zhēng)物(天青蛋白或GST-Azu(0-1020nM))。將不同濃度的Azruin(0-1020nM)+EphrinB2-Fc(246nM)樣品加入到傳感器表面上，并標(biāo)繪出作為共振比例的數(shù)據(jù)(占總應(yīng)答n/。[R叫(天青蛋白+EphrinB2-Fc)/(Req/(EphrinB2-Fc))])。用EphrinB2隱Fc將GST-Azu88-113和GST-Azu36-89滴定到固定化的EphB2-Fc，并用相似的方式進(jìn)行分析。競(jìng)爭(zhēng)數(shù)據(jù)表明Azruin禾nGST-Azu88-113與固定化的EphB2-Fc之間的結(jié)合化學(xué)計(jì)量為1:1。我們首先測(cè)定了天青蛋白和GST-Azu構(gòu)建體與EphB2-Fc配體EphrinB2-Fc的結(jié)合。圖7A顯示天青蛋白的確高親和力地結(jié)合EphrinB2-Fc(Kd=8.5+0.8nM)，反映出這兩種蛋白之間的結(jié)構(gòu)相似性(表5)。GST-Azu88-113對(duì)EphrinB2-Fc的相對(duì)高親和力(Kd=39+6.5nM)說明88和113之間的區(qū)域也對(duì)結(jié)合EphrinB2-Fc起到了重要作用。相反的，GST和GST-Azu36-89沒有顯示出與EphrinB2-Fc的相互作用?？偠灾@些數(shù)據(jù)表明天青蛋白可以經(jīng)GH袢(88-113)區(qū)高親和力地結(jié)合EphB2-Fc和EphrinB2-Fc。為了進(jìn)一步測(cè)試這個(gè)區(qū)域，在EphrinB2-Fc與不同濃度的天青蛋白和GST-Azu構(gòu)建體孵育之后，我們進(jìn)行了對(duì)EphrinB2-Fc與固定到CM5傳感器芯片上的EphB2-Fc的結(jié)合的SPR分析。圖7B顯示了0-1020nM天青蛋白、GST-Azu88-113、和GST-Azu36-89分別對(duì)EphrinB2-Fc(246nM)與EphB2-Fc的結(jié)合的抑制作用。抑制作用用占總應(yīng)答％表示(呵Req(天青蛋白+￡1^1182^0)/1^(￡1^1162^(;單用)]*100)。抑制作用譜表明當(dāng)用天青蛋白或GST-Azu88-113預(yù)孵育EphrinB2-Fc時(shí)，減少了總蛋白與固定化的EphB2-Fc的結(jié)合，以及天青蛋白是比GST-Azu88-113更強(qiáng)的抑制劑。Azruin或GST-Azu88-113與EphrinB2-Fc的預(yù)孵育將總蛋白與表面的結(jié)合最多減少了60%。另一方面，GST-Azu36-89不影響總蛋白結(jié)合(圖7B)，這和其與EphrinB2-Fc或EphB2-Fc的弱結(jié)合力相一致。這表明天青蛋白(或GST-Azu88-113)和EphrinB2-Fc形成了化學(xué)計(jì)量的復(fù)合物，因?yàn)楫?dāng)EphrinB2-Fc和天青蛋白(或GST-Azu88-113)的比例為1:1時(shí)獲得了最大的抑制作用。天青蛋白或GST-Azu88-113的抑制作用停留于40到50M的事實(shí)表明推定的天青蛋白-EphrinB2-Fc復(fù)合物與EphB2-Fc受體有著一些親和力。總之，這些結(jié)合數(shù)據(jù)表明天青蛋白對(duì)EphrinB2-Fc和EphB2-Fc都有著高親和力，以及表明天青蛋白可以通過配體隔離和受體占據(jù)的雙重機(jī)制干擾EphrinB2-Fc-EphB2-Fc結(jié)合。實(shí)施例9:對(duì)Azu96-113和Plc70-84合成肽以及GST-Azu融合衍生物對(duì)各種癌細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性的分析在對(duì)azruin和質(zhì)體藍(lán)素與人EphrinB2胞外結(jié)構(gòu)域進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)的序列比對(duì)之后，我們?cè)O(shè)計(jì)出了對(duì)應(yīng)于EphrinB2的G-H袢區(qū)的肽(稱作Azu96-113(SEQIDNO:18)和Pic70-84(SEQIDNO:20))，所述G-H袢區(qū)是介導(dǎo)Ephrin與Eph受體的高親和力結(jié)合的主要區(qū)域(Himanenetal,Nature414:933-938(2001);Tothetal,Dev.Cell.1:83-92(2001》。在圖8中，可以看到EphrinB2胞外結(jié)構(gòu)域、天青蛋白和質(zhì)體藍(lán)素的C末端片段的結(jié)構(gòu)重疊。用對(duì)天青蛋白和質(zhì)體藍(lán)素與人EphrinB2胞外結(jié)構(gòu)域的基于結(jié)構(gòu)的序列比對(duì)設(shè)計(jì)出基于介導(dǎo)EphrinB2與EphB2受體的高親和力結(jié)合的區(qū)域(EphrinB2-Fc胞外結(jié)構(gòu)域的G鏈-袢-H鏈)的天青蛋白的肽(稱作Azu96-113(96-TFDVSKLKEGEQYMFFCT-113))和質(zhì)體藍(lán)素的肽(稱作Pic70-84(70-VRKLSTPGVYGVYCE-84》(圖8)。從GenScript公司(Piscataway，NJ)購(gòu)得純度為99%的肽。用反相高壓液相色譜純化肽，并用質(zhì)譜法確認(rèn)其身份。將肽溶解于磷酸緩沖液(PBS)(lx)，并分裝儲(chǔ)存在-20°C直到使用。為了判斷天青蛋白的這些區(qū)域是否也作用為癌癥進(jìn)展中的Eph信號(hào)傳導(dǎo)的拮抗劑，我們?cè)诙鄠€(gè)已知高表達(dá)EphB受體/Ephrin配體的癌細(xì)胞株中進(jìn)行了定量MTT檢測(cè)。在37。C孵育24h期間，75pM天青蛋白和質(zhì)體藍(lán)素G-H袢肽都顯示出誘導(dǎo)了腦瘤星狀細(xì)胞瘤CCF-STTGl和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤LN-229的細(xì)胞死亡(圖9A)。質(zhì)體藍(lán)素肽Plc70-84多少顯示了比天青蛋白肽Azu96-113更高的細(xì)胞毒活性。為了確定出這種細(xì)胞毒性是否是劑量依賴性的以及是否對(duì)其他癌細(xì)胞株也是有效的，我們?cè)u(píng)價(jià)了一些濃度的這些肽對(duì)黑色素瘤(圖9B)或成交質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞(圖9C)的作用。在兩種情況中，漸增的肽濃度造成了漸增的細(xì)胞毒性(圖9B和9C)。實(shí)施例10:對(duì)GST-Azu融合肽誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞細(xì)胞死亡的能力的分析我們己經(jīng)測(cè)試了GST-Azu融合肽誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞細(xì)胞死亡的能力。為了測(cè)定天青蛋白和質(zhì)體藍(lán)素合成肽的細(xì)胞毒性，進(jìn)行了四甲基f禺氮唑藍(lán)(3-(4，5-dimethylthiazol畫2畫yl-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)(MTT》(Sigma)檢測(cè)(Mosmann,J,Immunol.Methods65:55-63(1983))。將每孔近2乂104個(gè)細(xì)胞種植到96孔培養(yǎng)板內(nèi)的100pLRPMI1640培養(yǎng)基中。在過夜培養(yǎng)后，去除上清液，向粘附細(xì)胞加入含有各種指定濃度的天青蛋白或質(zhì)體藍(lán)素合成肽的新培養(yǎng)基。在24或48h處理之后，向培養(yǎng)基加入10fiL5mg/mlMTT溶液，并在37。C下孵育lh。通過加入40mMHC1異丙醇溶液來終止MTT反應(yīng)。如先前所述的那樣(Mosmann,1983)，分光光度地測(cè)定出所形成的MTT甲臘(formazan)。比較未處理的對(duì)照細(xì)胞和處理過的細(xì)胞，以便確定出活力，以及因此確定出細(xì)胞毒性的測(cè)量值。與對(duì)照(沒有蛋白)相似，GST或GST-Azu36-89融合蛋白觸發(fā)了非常低的細(xì)胞毒性(圖10)。但是，具有能夠干擾EphrinB2/EphB2結(jié)合的天青蛋白區(qū)的GST-Azu36-128或GST-Azu88-113顯示出劑量依賴方式的顯著的細(xì)胞毒性，驗(yàn)證了Azu88-113區(qū)在觸發(fā)MCF-7細(xì)胞死亡中的作用。實(shí)施例11:患有與Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的病理性病變的患者的治療在患有癌癥的患者中進(jìn)行銅氧還蛋白化合物(研究藥物)的I/II期臨床研究。具體而言，銅氧還蛋白化合物是Plc70-84(SEQIDNO:20)。在施用研究藥物的開放標(biāo)簽、前瞻性研究中入選了49例患有經(jīng)組織學(xué)確診的乳腺癌、結(jié)腸癌和黑色素瘤成人患者，這些患者都在經(jīng)目前可獲得的FDA批準(zhǔn)的化療藥物和方案充分治療后出現(xiàn)了臨床和放射學(xué)的進(jìn)展或復(fù)發(fā)。為了符合該研究的入選條件，所有患者在完成經(jīng)批準(zhǔn)的化療方案療程之后出現(xiàn)了可測(cè)量腫瘤病灶體積的增加。持續(xù)的轉(zhuǎn)移灶和/或大小或體積的連續(xù)增加的證據(jù)在組織學(xué)上必須是明確的。通過細(xì)針穿刺(FNA)活檢可以獲得這種組織學(xué)證據(jù)。在芝加哥伊利諾斯大學(xué)的研究所倫理委員會(huì)和FDA的監(jiān)督下，在得到所有患者的知情同意書之后實(shí)施研究方案?；颊邲]有合并癥例如其他惡性腫瘤、既往惡性腫瘤病史、血液惡液質(zhì)、胰島素依賴性糖尿病或其他嚴(yán)重的心血管疾病，這些合并癥可能會(huì)干擾對(duì)所提出的治療的作用的適當(dāng)評(píng)價(jià)。在開始治療之前進(jìn)行基線血液檢查(全血細(xì)胞計(jì)數(shù)(CBC)和血清生化)，其包括肝功能檢查(LFT)。所有入選患者在試驗(yàn)期間都不能同時(shí)接受任何癌癥化療。通過每日靜脈內(nèi)注射研究藥物的可藥用制品共12周來施用研究藥物，觀察所有對(duì)象的任何劑量限制性毒性。有7種劑量水平，從10mg/kg/天開始，按5mg/kg/天逐漸增加到最大劑量為50mg/kg/天。在7例患有晚期可測(cè)量癌癥(乳腺癌、結(jié)腸癌和黑色素瘤)的患者中記錄下每個(gè)劑量水平的療效。通過2維地測(cè)定可測(cè)量的腫瘤來評(píng)價(jià)反應(yīng)(a和b)。1)耙向轉(zhuǎn)移性腫瘤的完全消失被認(rèn)為是完全緩解(CR);2)縮小75°/。被認(rèn)為是極好的部分反應(yīng)(PR);禾卩3)良好好的反應(yīng)(PR)是治療后尺寸縮小了50%;4)尺寸縮小25°/。被認(rèn)為是疾病穩(wěn)定(SD)以及5)尺寸縮小<25%被認(rèn)為是無反應(yīng)(NR)。被證實(shí)出現(xiàn)疾病進(jìn)展的患者則停止治療，但繼續(xù)再隨診12周。靶向轉(zhuǎn)移性腫瘤的完全消失以及尺寸的任何縮小都表明天青蛋白治療可有效地治療癌癥。表明Plc70-84治療是有效治療的其他指示物是降低了新轉(zhuǎn)移性腫瘤的出現(xiàn)率以及腫瘤相關(guān)的血管生成的減少。權(quán)利要求1.一種分離的肽，其是銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物，并能抑制哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。2.權(quán)利要求l的分離的肽，其中銅氧還蛋白選自由天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、假天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、Rusticyanin和Auracyanin組成的組。3.權(quán)利要求2的分離的肽，其中銅氧還蛋白選自由天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素和Rusticyanin組成的組。4.權(quán)利要求l的分離的肽，其中銅氧還蛋白來自選自由銅綠假單胞菌(i^ewfibwo"oyaerwg/"oja)、氧化亞鐵硫桿菌(77z/oZac///wsy^roox/c/a"j)、尸/20/777/(i/w;W/(3W/"OSWm、糞產(chǎn)石咸菌(^4/0<3//1^6"&>6￡^/&)、氧"(七木糖無色桿菌04c/7rawo6ac/erx_y/osox/<ia")、支氣管敗血性博德特菌(5orafe&//a6rawc/2&e//ca)、甲基單胞菌屬(A/ef/2少/o"w"ass;.)、腦月莫炎奈瑟菌(iVe/^eWfl艦"/wgi礎(chǔ)》、淋病奈瑟菌(iVe&,/agono/r/7c^—、熒光假單胞菌(Psew(iowo"asyMomscera)、綠針假單胞菌(/^ewiiowowayc/z/orara//7/力、苛養(yǎng)木桿菌(Zy/e//a/a幼Wo犯)、黃瓜(Ccmra"f/acus、畐iJ、溶血弓瓜菌(WZ"'opara/2aewo/;^'cws)、禾口孑L石莼(L7va/er^sa)組成的組的生物體。5.權(quán)利要求4的分離的肽，其來自選自由銅綠假單胞菌、氧化亞鐵硫桿菌、尸/zo，Www/mm'"asww和孔石莼組成的組的生物體。6.權(quán)利要求l的分離的肽，其是選自由SEQIDNO:l-17和22-23組成的組的肽的一部分。7.權(quán)利要求1的分離的肽，選自由SEQIDNO:l-17和22-23組成的組的序列與所述肽有至少約90%的氨基酸序列相同性。8.權(quán)利要求l的分離的肽，其是銅氧還蛋白的截短形式。9.權(quán)利要求1的分離的肽，其中所述肽具有超過約10個(gè)殘基但不超過約100個(gè)殘基。10.權(quán)利要求9的分離的肽，其中所述肽包括選自由銅綠假單胞菌天青蛋白殘基96-113、銅綠假單胞菌天青蛋白殘基88-113、孔石莼質(zhì)體藍(lán)素殘基70-84、孔石莼殘基57-98、和SEQIDNO:22-30組成的組的銅氧還蛋白區(qū)域。11.權(quán)利要求10的分離的肽，其中所述肽由選自由銅綠假單胞菌天青蛋白殘基96-113、銅綠假單胞菌天青蛋白殘基88-113、孔石莼質(zhì)體藍(lán)素殘基70-84、孔石莼殘基57-98、和SEQIDNO:22-30組成的組的銅氧還蛋白區(qū)域組成。12.權(quán)利要求l的分離的肽，其中所述肽包括與選自由銅綠假單胞菌天青蛋白殘基96-113、銅綠假單胞菌天青蛋白殘基88-113、孔石莼質(zhì)體藍(lán)素殘基70-84、孔石莼殘基57-98、和SEQIDNO:22-30組成的組的目標(biāo)銅氧還蛋白區(qū)域等價(jià)的對(duì)象銅氧還蛋白的殘基。13.—種組合物，其包括存在于藥物組合物中的至少一種銅氧還蛋白或權(quán)利要求1的肽。14.權(quán)利要求13的組合物，其中藥物組合物被配制為用于靜脈內(nèi)施用。15.權(quán)利要求13的組合物，其中銅氧還蛋白來自選自由銅綠假單胞菌、氧化亞鐵硫桿菌、尸/20/7^/"附/aw/"oyww、糞產(chǎn)堿菌、氧化木糖無色桿菌、支氣管敗血性博德特菌、甲基單胞菌屬、腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、熒光假單胞菌、綠針假單胞菌、苛養(yǎng)木桿菌、黃瓜、C/2/ora/fea^^rantoa^、副溶血弧菌和孔石莼組成的組的生物體。16.權(quán)利要求15的組合物，其中銅氧還蛋白來自選自由銅綠假單胞菌、氧化亞鐵硫桿菌、尸Aom7^/ww/am/"osww和孔石莼組成的組的生物體。17.權(quán)利要求13的組合物，其中銅氧還蛋白選自由SEQIDNO:l-17和22-23組成的組。18.—種治療患有Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)性病理性病變或患有癌癥的哺乳動(dòng)物患者的方法，包括給所述患者施用治療有效量的權(quán)利要求13的組合物。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述患者患有選自由間質(zhì)性膀胱炎(IC)、炎性腸病(IBD)相關(guān)性病變、HIV感染、心血管病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、周圍血管病、病毒性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變(ChristopherReeve病)、和Alzheimer病組成的組的病理性病變。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述患者患有選自由乳腺癌、肝癌、胃腸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、絨癌、畸胎癌、甲狀腺癌、所有肉瘤包括源自軟組織和骨骼的肉瘤、腎癌、表皮樣癌和非小細(xì)胞肺癌組成的組的癌癥。21.權(quán)利要求18的方法，其中所述患者是人。22.權(quán)利要求18的方法，其中通過選自由靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、皮下注射、吸入、局部施用、經(jīng)皮貼片、栓劑和口服組成的組的方式施用所述組合物。23.權(quán)利要求22的方法，其中施用方式是通過靜脈內(nèi)注射。24.權(quán)利要求18的方法，其中在施用另一種已知能治療所述病理性病變或癌癥的藥物的O分鐘到1周內(nèi)施用所述組合物。25.權(quán)利要求24的方法，其中與另一種抗癌藥物大約同時(shí)施用所述組合物。26.—種組合物，其包括至少兩種選自由銅氧還蛋白和權(quán)利要求1的分離的肽組成的組的分離的多肽。27.權(quán)利要求26的組合物，其存在于藥物組合物中。28.—種試劑盒，其包括存在于瓶?jī)?nèi)的權(quán)利要求13的組合物。29.權(quán)利要求28的試劑盒，其中所述試劑盒被設(shè)計(jì)為用于靜脈內(nèi)施用。30.—種方法，包括用權(quán)利要求13的組合物接觸哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞，并測(cè)定癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。31.權(quán)利要求30的方法，其中癌細(xì)胞選自由乳腺癌、肝癌、胃腸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、絨癌、畸胎癌、甲狀腺癌、所有肉瘤包括源自軟組織和骨骼的肉瘤、腎癌、表皮樣癌和非小細(xì)胞肺癌組成的組。32.權(quán)利要求30的方法，其中癌細(xì)胞是體內(nèi)的癌細(xì)胞。33.—種表達(dá)載體，其編碼權(quán)利要求1的肽。34.—種分離的肽，其是銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物，并與Ephrin受體結(jié)合。35.權(quán)利要求34的分離的肽，其中Ephrin受體選自由EphAl、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphAlO、Ep固、EphB2、EphB3、EphB4和EphB6組成的組。36.權(quán)利要求35的分離的肽，其也結(jié)合Ephrin。37.權(quán)利要求36的分離的肽，其中Ephrin選自由EphrinAl、EphrinA2、EphrinA3、EphrinA4、EphrinA5、EphrinBl、EphrinB2、EphrinB3和EphrinB4組成的組。38.權(quán)利要求36的分離的肽，其結(jié)合Ephrin及其受體。39.權(quán)利要求38的分離的肽，其結(jié)合Ephrin2B和Eph2B。40.—種分離的肽，其是銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物，并與選自由EphrinAl、EphrinA2、EphrinA3、EphrinA4、EphrinA5、EphrinBl、EphrinB2、EphrinB3和EphrinB4組成的組的Ephrin結(jié)合。41.一種方法，包括給哺乳動(dòng)物患者施用權(quán)利要求13的組合物以指導(dǎo)所述患者體內(nèi)的血管生長(zhǎng)。42.—種方法，包括給哺乳動(dòng)物患者施用權(quán)利要求13的組合物以減少所述患者體內(nèi)的血管生長(zhǎng)。43.—種方法，包括給哺乳動(dòng)物患者施用權(quán)利要求13的組合物以指導(dǎo)所述患者體內(nèi)的神經(jīng)元生長(zhǎng)。44.一種方法，包括給哺乳動(dòng)物患者施用權(quán)利要求13的組合物以促進(jìn)所述患者體內(nèi)的骨生成。45.—種方法，包括給哺乳動(dòng)物患者施用有效量權(quán)利要求13的組合物以替代需要使用Ephrin的治療方法中的Ephrin。46.—種方法，包括用權(quán)利要求13的組合物接觸哺乳動(dòng)物細(xì)胞以抑制與所述細(xì)胞有關(guān)的Ephrin受體的活性。47.—種方法，包括用權(quán)利要求13的組合物接觸哺乳動(dòng)物細(xì)胞以增加與所述細(xì)胞有關(guān)的Ephrin受體的活性。48.—種方法，包括給具有表達(dá)Ephrin受體的組織的人類患者施用權(quán)利要求13的組合物，所述組合物包括銅氧還蛋白衍生物、或與藥物融合的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物。49.權(quán)利要求48的方法，其中組織是癌組織。50.檢測(cè)哺乳動(dòng)物患者體內(nèi)具有Ephrin受體的組織的方法，包括步驟(a)給所述患者施用權(quán)利要求13的組合物，所述組合物包括銅氧還蛋白衍生物、或與可檢測(cè)探針融合的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價(jià)物；和Cb)檢測(cè)探針在患者體內(nèi)的分布。全文摘要本發(fā)明涉及干擾哺乳動(dòng)物細(xì)胞中Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的銅氧還蛋白和銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物的組合物和使用方法。具體地，本發(fā)明涉及使用銅氧還蛋白例如天青蛋白、Rusticyanin和質(zhì)體藍(lán)素及其變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物治療哺乳動(dòng)物體內(nèi)的癌癥的組合物和方法。文檔編號(hào)A61K39/00GK101198351SQ200680017470公開日2008年6月11日申請(qǐng)日期2006年5月19日優(yōu)先權(quán)日2005年5月20日發(fā)明者A·喬杜里,A·查克拉巴迪,A·菲亞略,T·達(dá)斯古普塔,山田亨,朱永華申請(qǐng)人:伊利諾斯大學(xué)理事會(huì)