一種檢測(cè)弱氧化低密度脂蛋白損傷小鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能及機(jī)制的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)弱氧化低密度脂蛋白損傷小鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能及機(jī)制的方法，采用離體微血管張力描記，透射電鏡觀察血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示mmLDL致小鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞明顯水腫、內(nèi)彈力膜斷裂，顯著抑制EDHF介導(dǎo)的舒張；顯著抑制NO介導(dǎo)的舒張；對(duì)PGI2介導(dǎo)的舒張功能無(wú)明顯影響，mmLDL損傷內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；顯著降低內(nèi)皮依賴性舒張功能與NO-和EDHF途徑受損有關(guān)。本發(fā)明方法靈敏高效，操作簡(jiǎn)單，且對(duì)環(huán)境友好。
【專利說明】一種檢測(cè)弱氧化低密度脂蛋白損傷小鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能及機(jī)制的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測(cè)弱氧化低密度脂蛋白損傷小鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能及機(jī)制的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]血管內(nèi)皮細(xì)胞廣泛分布于血管內(nèi)層，具有多種生理功能，能分泌血管舒張因子和收縮因子，在調(diào)節(jié)血管張力和血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面有重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是眾多心血管疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等疾病的發(fā)病共同環(huán)節(jié)和關(guān)鍵。內(nèi)皮依賴性舒張(endothelium-dependent relaxation, EDR)主要由一氧化氮(nitric oxide,NO)-、前列環(huán)素(prostacyclin I2, PGI2)-、內(nèi)皮衍生超極化因子(endothelium derivedhyperpolarizing factor, EDHF)三條途徑構(gòu)成[卜4]。EDHF途徑介導(dǎo)血管舒張反應(yīng)與細(xì)胞膜上的鈣激活鉀通道開放、促進(jìn)鉀離子外流有關(guān)。鈣激活鉀通道主要由小電導(dǎo)鈣激活鉀通道(smal 1-conductance calcium-activated potassium channel, SKca)、中電導(dǎo)?丐激活鉀通道(intermediate-conductance calcium-activated potassium channel, IKca)和大電導(dǎo)?丐激活鉀通道(big-conductance calcium-activated potassium channel,BKca)組成。經(jīng)典的EDHF激活方式有兩種，可以通過激活I(lǐng)Kca和SKcaw開放引起超極化，繼而激活下游微區(qū)信號(hào)通路1~8]和肌一內(nèi)皮縫隙連接[9]進(jìn)而引起血管平滑肌細(xì)胞舒張；另一種則不涉及內(nèi)皮細(xì)胞超極化，但涉及到Ν0、ΗΝ0、環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids,EETs)等內(nèi)皮源性因子的釋放，它們直接作用于平滑肌細(xì)胞上的BKca等鉀離子通道，從而引起血管平滑肌舒 張[1°]。有文獻(xiàn)報(bào)道NO-，EDHF-，PGI2三條途徑對(duì)機(jī)體不同部位血管張力的調(diào)節(jié)作用有明顯差異[11’12]。
[0003]弱氧化低密度脂蛋白(minimallymodified low density lipoprotein, mmLDL)是指僅有脂質(zhì)部分被氧化、載脂蛋白中賴氨酸殘基結(jié)構(gòu)未被破壞的LDL。mmLDL促進(jìn)氧化型低密度脂蛋白大量產(chǎn)生，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和平滑肌細(xì)胞的增殖，但機(jī)制還不明了。近期我們研究發(fā)現(xiàn)，mmLDL可以上調(diào)大鼠腦基底動(dòng)脈[13]和冠狀動(dòng)脈[14]內(nèi)皮素B受體(endothelin Breceptor,ETbR),在功能上表現(xiàn)為ETbR介導(dǎo)的收縮性增強(qiáng)。mmLDL對(duì)整體動(dòng)物的阻力血管EDR和超微結(jié)構(gòu)的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)考察尾靜脈注射mmLDL對(duì)小鼠腸系膜動(dòng)脈EDR的影響及作用機(jī)制，同時(shí)觀察其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于采用離體微血管張力描記技術(shù)，透射電鏡觀察血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)，提供一種研究mmLDL對(duì)小鼠腸系膜動(dòng)脈EDR的影響及作用機(jī)制的方法。
[0005]材料與方法
[0006]1.1 主要試劑 mmLDL>5-輕色胺(5_hydroxytryptamine, 5-HT)、乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)、L-Νω -硝基精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME)、吲哚美辛(indomethacin, Indo)、apamin、charybdotoxin (ChTX)、二甲基亞諷(dimethyl sulphoxide,DMS0)均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。除了 Indo用DMSO初溶外,其余均用Krebs液溶解,并且所有試劑在使用前均用Krebs液稀釋到所需濃度。實(shí)驗(yàn)中使用的水為超純水、其它化學(xué)試劑均為分析純。
[0007]1.2 儀器 DMT610M 微小血管張力測(cè)定儀(Danish Myo Technology A/S, DMT,丹麥)、Powerlab生物信號(hào)采集和分析系統(tǒng)(埃德儀器有限公司，澳大利亞)、歐-卡XSP-C系列生物顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)、顯微手術(shù)解剖工具(World PrecisionInstruments, WPI，美國(guó))、透射電子顯微鏡(TEM，H7650, HITACHI,日本)、電子天平(BP211D, Startorius公司)、微量移液器(Dragonmed，芬蘭)、HH-2型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)、SHZ-D循環(huán)水式真空泵(鞏義予華儀器有限公司)、QL-90IVortex震蕩混勻器(海門其林貝爾儀器制造有限公司)、LG冰箱、優(yōu)普純水機(jī)(成都優(yōu)普純水設(shè)備有限公司)。[0008]1.3 方法
[0009]1.3.1動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
[0010]動(dòng)物ICR小鼠(8-10周齡)，SPF級(jí)，(20-24) g，雌、雄各半，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證:SYXK(陜)2012-005。實(shí)驗(yàn)組以lmg/kg尾靜脈注射mmLDL，第1次注射即開始計(jì)時(shí)，以后每12h重復(fù)一次，并分別于24h(0h，12h各注射一次)、48h (Oh, 12h, 24h, 36h 各注射一次)、72h (Oh, 12h, 24h, 36h, 48h, 60h 各注射一次)、96h (Oh,12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h各注射一次)將小鼠頸部脫臼處死后觀察mmLDL對(duì)血管EDR的影響?？疾靘mLDL對(duì)血管EDR影響的量效關(guān)系時(shí)，設(shè)立0.5mg/kg、lmg/kg、2rmg/kgmmLDL組。實(shí)驗(yàn)設(shè)2個(gè)對(duì)照組，分別為尾靜脈注射生理鹽水組或者LDL組。
[0011]1.3.2血管環(huán)收縮、舒張功能檢測(cè)
[0012]小鼠脫白處死后，迅速取出含有腸系膜動(dòng)脈的組織，浸入冷Na+-Krebs液(含mmol/L:NaC1119、NaHCO315, KC14.6、MgCl2L 2、NaH2PO4L 2、無(wú)水 CaCl2L 5 和葡萄糖 5.5)中，在顯微鏡下剔除腸系膜動(dòng)脈周圍的結(jié)締組織，將處理好的血管剪切成約l_2mm長(zhǎng)的圓筒環(huán)，并在顯微鏡下將動(dòng)脈環(huán)套在DMT的兩根金屬絲上，其中一根連接張力換能器，另一根連接微調(diào)裝置(可調(diào)節(jié)負(fù)荷張力)，通過張力換能器與PowerLab系統(tǒng)相連，記錄血管收舒曲線。血管環(huán)置于充滿Na+-Krebs液的37°C恒溫水浴槽中，并持續(xù)接通混合氣體(95% O2,5% CO2)，使氧飽和，pH維持在7.4[15]。保持靜息張力為lmN，每隔20min更換一次Krebs液，平衡 1.5h。加 K+-Krebs 液(含 mmol/L:NaC160、NaHC0315、KC163.5,MgCl2L 2,NaH2PO4L 2、CaCl2L 5和葡萄糖5.5)檢驗(yàn)血管環(huán)的收縮活性，沖洗3次后，重復(fù)上一步驟。當(dāng)兩次收縮高度大于ImN并且兩次收縮幅度相差在10%以內(nèi)者才可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0013]濃度累加法加入5-HT (10_9~10_4mol/L)，考察mmLDL對(duì)5-HT收縮血管功能的影響。預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示與對(duì)照組比較，mmLDL基本不影響5-HT誘導(dǎo)的收縮量效曲線，而且20 μ mol/L5-HT可以引起血管強(qiáng)而穩(wěn)定的收縮達(dá)lh，我們選擇5-HT為預(yù)收縮劑。20 μ mol/!^-肌預(yù)收縮血管環(huán)’濃度累加法加入八⑶^父川，~^)—4!^^/!)可誘導(dǎo)血管環(huán)產(chǎn)生EDR，當(dāng)舒張值低于預(yù)收縮值的85%時(shí)，認(rèn)為血管EDR受損。濃度累加法加入硝普鈉(sodiumnitroprusside，SNP3X10-n~l(T5mol/L)誘導(dǎo)血管非內(nèi)皮依賴性舒張，考察血管平滑肌的舒張功能。[0014]為考察mmLDL影響血管EDR的作用機(jī)制，我們使用了三條途徑的拮抗劑。在浴槽中預(yù)先加入PGI2途徑抑制劑Indo(10-5mol/L)、NO途徑抑制劑L-NAME(ΙΟΛιοΙ/?、大電導(dǎo)和中電導(dǎo)鈣激活鉀通道抑制劑ChTX(5X10_8mOl/L)、小電導(dǎo)鈣激活鉀通道抑制劑apamin (10_6mol/L)可以完全阻斷累加ACh引起的血管EDR[15_17]。在浴槽中預(yù)先分別加入通路抑制劑，孵育30min，加入5-HT預(yù)收縮，濃度累加法加入ACh，分別考察N0_、PGI2_和EDHF途徑介導(dǎo)的內(nèi)皮舒張功能；并考察EDHF途徑中SKca，IKca和BKca介導(dǎo)的舒張功能。
[0015]1.4血管內(nèi)皮完整性的形態(tài)學(xué)檢查
[0016]mmLDL組和生理鹽水組腸系膜動(dòng)脈取出、分離后切開，立即放置在2.5%的戊二醛固定液中，并于4°C環(huán)境中固定6h。0.1M磷酸緩沖液洗滌，I %四氧化鋨固定2h后洗滌、脫水；70%乙醇醋酸雙氧鈾塊染色過夜后環(huán)氧丙烷置換；環(huán)氧樹脂Epon812浸透、包埋，聚合后作半超薄切片1-2 μ，美蘭染色后光學(xué)顯微鏡下定位，用透射電鏡(日本日立Η-600)觀察、拍照。
[0017]1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0018]用Rmax (最大松弛百分率)和PlCstl (產(chǎn)生一半最大松弛百分率時(shí)所需要ACh濃度的負(fù)對(duì)數(shù))來描述EDR反應(yīng)的特征性。
[0019]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)弱氧化低密度脂蛋白損傷小鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能及機(jī)制的方法，包括采用離體微血管張力描記和透射電鏡觀察血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法包括以下具體步驟:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、檢測(cè)血管環(huán)收縮和舒張功能、檢測(cè)血管內(nèi)皮完整性以及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
【文檔編號(hào)】G01N33/50GK103940984SQ201410174962
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月29日
【發(fā)明者】李潔, 陳根, 林杰, 王俊杰, 陽(yáng)建軍, 黃曉亮 申請(qǐng)人:李潔, 林杰, 王俊杰