專利名稱：綴合有結(jié)構(gòu)完全確定的支化聚合物的促胰島素劑的衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及連接至GLP-1的支化聚合物，所述的支化聚合物由精確數(shù)量的單體結(jié)構(gòu)單元組成。單體結(jié)構(gòu)單元可以用合適的單體保護和活化策略在固體載體或溶液中寡聚體化。連接至GLP-1的支化聚合物在這里也稱為綴合的GLP-1或GLP-1綴合物。使用下面描述的方法，制備其中支化聚合物是結(jié)構(gòu)完全確定的綴合GLP-1是可能的。因此，本發(fā)明化合物是單分散性的。使用在這里描述的方法，能夠制備純度大于50％的下面通式I的化合物。在一個實施方案中，其大于約75％。在一個實施方案中，其大于90％。在一個實施方案中，其大于95％。在一個實施方案中，其大于99％(重量/重量)。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及含有如此高純度的單個、特定的式I化合物的產(chǎn)品。
本發(fā)明的一個實施方案提供了如上描述的GLP-1綴合物，其由通式I表示 ITA-L4-(L3)m-Y1(Y2(Y3(Y4(Y5(Y6)r)q)p)s)n(I) 其中，ITA表示促胰島素劑，從所述的促胰島素劑中，一個氫已經(jīng)從促胰島素劑中存在的α-氨基上除去，或從存在于促胰島素劑中任意位置的賴氨酸中的ε氨基上除去， 對于第一代二叉化合物， Y1是Yb；Y2是Z；r、q、p和s都是0；并且n是2； 對于第二代二叉化合物， Y1和Y2是Yb；Y3是Z；r、q和p都是0；s是4；并且n是2； 對于第三代二叉化合物， Y1、Y2和Y3都是Yb；Y4是Z；r和q是0；p是8；s是4； 并且n是2； 對于第四代二叉化合物， Y1、Y2、Y3和Y4都是Yb；Y5是Z；r是0；q是16；p是8；s是4；并且n是2； 并且對于第五代二叉化合物， Y1、Y2、Y3、Y4和Y5都是Yb；Y6是Z；r是32；q是16；p是8；s是4；并且n是2； 其中 Yb是
對于第一代三叉化合物， Y1是Yt；Y2是Z；r、q、p和s都是0；并且n是3； 對于第二代三叉化合物， Y1和Y2是Yt；Y3是Z；r、q和p都是0；s是9；并且n是3； 對于第三代三叉化合物， Y1、Y2和Y3都是Yt；Y4是Z；r和q是0；p是27；s是9； 并且n是3； 并且對于第四代三叉化合物， Y1、Y2、Y3和Y4都是Yt；Y5是Z；r是0；q是81；p是27； s是9；并且n是3； 其中 Yt是
其中A是-CO-、-C(O)O-、-P(＝O)(OR)-或-P(＝S)(OR)-，其中R是氫、烷基或任選取代的芳基； 并且B是-NH-或-O-； 條件為，當(dāng)B是-NH-時，則A是-CO-或-C(O)O-，以及當(dāng)B是-O-時，則A是-P(＝O)(OR)-或-P(＝S)(OR)-； 并且其中一個單體層(代)(例如Y1、Y2和Y3)的基團B連接至其中Y具有后面下標(biāo)數(shù)字(例如分別為Y2；Y3和Y4)的鄰近的、后一層的基團A，或者連接至Z； X3是氮原子、烷三基、芳烴三基、烷三氧基、式-CO-N＜的氨基羰基部分、式-CH2CO-N＜的乙酰氨基部分或下式的部分
其中Q是烷三基； X4是烷四基或芳烴四基； 在本發(fā)明的實施方案中，L1是價鍵、氧、亞烷基、亞烷基氧烷基、聚烷氧二基、(聚烷氧基)烷基羰基、氧烷基或(聚烷氧基)烷基，其中最后的3個部分的末端烷基部分連接至A； 在本發(fā)明的實施方案中，L1在最后三個部分的氧-部分中連接至A。
在本發(fā)明的實施方案中，L2是價鍵、氧、亞烷基、亞烷基氧烷基、聚烷氧二基、(聚烷氧基)烷基羰基、氧烷基或(聚烷氧基)烷基，其中最后3個部分的末端烷基部分連接至B； 在本發(fā)明的實施方案中，L2在該二價基團的另一端連接至B。
在本發(fā)明的實施方案中，L3表示價鍵、亞烷基、氧、聚烷氧二基、氧烷基、烷基氨基、羰基烷基氨基、烷基氨基羰基烷基氨基、羰基烷基羰基氨基(聚烷氧基)烷基氨基、羰基烷氧烷基羰基氨基(聚烷氧基)烷基氨基、烷基羰基氨基(聚烷氧基)烷基氨基、羰基(聚烷氧基)烷基氨基或羰基烷氧烷基氨基，其中最后10個部分的末端羰基、烷基和氧部分任選通過L4部分連接至ITA基團； 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述部分在該二價基團的另一端連接。
m是0、1、2或3； 在本發(fā)明的實施方案中，L4選自價鍵和式-CO-L5-CH＝N-O-的部分，其中L5是價鍵、亞烷基或亞芳基，并且其中所述的L4部分的末端羰基部分連接至ITA部分； 在本發(fā)明的實施方案中，這些部分在該二價基團的另一端連接。
并且 Z是氫、烷基、烷氧基、羥烷基、聚烷氧基、氧烷基、?；⒕弁檠跬榛?、或聚烷氧烷基羰基。
如上定義的，L1、L2、L3和L4都應(yīng)該理解為二價基團，X3是三價基團而X4是四價基團。
在本申請中上面和別處的式I定義中，使用二叉、三叉和代這三個術(shù)語來試圖促進關(guān)于此點的理解并且它們不應(yīng)該以任何方式導(dǎo)致受限的解釋。
因此，第一代二叉化合物可以用式Ia說明 ITA-L4-(L3)m-Y1(Y2)2(Ia) 其也可以用式Ia’說明
其中ITA、Y1、Y2、L3、L4、m、Yb和Z的每個是如上定義的。此外，第二代二叉化合物可以用式Ib說明 ITA-L4-(L3)m-Y1(Y2(Y3)4)2(Ib) 其也可以用式Ib’說明
其中ITA、Y1、Y2、Y3、L3、L4、m、Yb和Z的每個是如上定義的。
可替代地，本發(fā)明可以通過繪制例如，如下面式Ic中的第四代二叉化合物的式來說明
其中所有的符號是如上面提及的(并且垂直線不是式的一部分，而是說明不同的水平)。給出式Ic只是試圖說明本發(fā)明并不用于限制保護的范圍。
在本發(fā)明的實施方案中，r是0。在本發(fā)明的另一個實施方案中，r和q各自為0。在本發(fā)明的另一個實施方案中，n是2(對于二叉化合物)或3(對于三叉化合物)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，s是4(對于二叉化合物)或9(對于三叉化合物)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，s是4，以及p是8(對于二叉化合物)或者s是9以及p是27(對于三叉化合物)。
如上面提及的，式I化合物含有一個或多個Yb部分。如果式I化合物含有不止一個Yb部分，則那些部分可以是相同的或不同的。在本發(fā)明的一個實施方案中，所有的Yb部分是相同的。在本發(fā)明的另一個實施方案中，在式I中，相同水平上的Yb部分是相同的，但是一個水平上的Yb與另一水平上Yb部分不同，每個水平分別通過下標(biāo)n、s、p、q和r確定。在特定的部分Yb中，兩個B部分是相同的或不同的。在一個實施方案中，這樣的兩個B部分是相同的。此外，在一個實施方案中，特定的部分Yb、兩個L2部分是相同的或不同的。在一個實施方案中，這樣的兩個L2部分是相同的。類似地，這適用于在本申請中給出的Yt部分以及B和L2部分。
在本發(fā)明的一個實施方案中，其涉及二叉化合物，在另一個實施方案中，其涉及三叉化合物。
分別存在于任意Yb或Yt部分中的兩個或三個L2部分可以是相同的或不同的。在本發(fā)明的一個實施方案中，分別存在于任意Yb或Yt部分中的兩個或三個L2部分是相同的。
至少用于說明目的而且在某種程度上于實踐中，式I化合物的非促胰島素劑的主要部分能夠由具有下列式的式IVb或IVc化合物構(gòu)建 式IVb

式IVc
其中L1、L2、X3和X4是如上定義的，并且其中-A’和-B’是能夠反應(yīng)形成部分-A-B-的基團；其中A和B是如上定義的。
通過基團A’和B’之間反應(yīng)形成的共價鍵的性質(zhì)取決于對A’和B’的選擇，并且包括，如上面指出的，酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵、磷酸酯鍵、硫代磷酸酯鍵和亞磷酸酯(phosphit)鍵。
在一個實施方案中，A’選自-COOH、-COOR、-OCOOR、-OP(NR2)OR、-(O＝)P(OR)2、-(S＝)P(OR)(OR′)、-(S＝)P(SR)(OR′)、-(S＝)P(SR)(SR′)、-COCl、-COBr、-OCOBr、-P(OR)3、對硝基苯基碳酸酯(-OC(＝O)OC6H4NO2)、琥珀酰亞胺基碳酸酯(-OC(＝O)-Nhs，其中Nhs是N-羥基琥珀酰亞胺)、羰基咪唑(-C(＝O)-Im，其中Im是咪唑)、氧基羰基咪唑(-OC(＝O)-Im，其中Im是咪唑)、碳酰氯類(-C(＝O)Cl)、氯甲酸酯(-OC(＝O)Cl)、異氰酸酯(-N＝C＝O)和異硫氰酸酯(-N＝C＝S)，其中R和R’表示C1-6-烷基、芳基或經(jīng)取代的芳基。
在另一個實施方案中，B’選自-NH2、-OH、-N3、-NHR’和-OR’；其中R’是保護基團，其有利于如，例如在肽化學(xué)和寡核苷酸化學(xué)中使用的分步的單體寡聚化。
保護基團的非限制性實例包括9-芴基甲氧羰基(稱為Fmoc)、叔丁氧羰基(稱為Boc)、鄰苯二甲酰基、三苯甲基和經(jīng)取代的三苯甲基、三鹵乙酰基例如三氟乙?；蛉纫阴；?、pixyl、三甲代甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基，以及叔丁基二苯基甲硅烷基。合適的保護基的其它實例是技術(shù)人員已知的，并且可以在Green&Wuts“Protection groups in organic synthesis”，第3版，Wiley-interscience中找到建議。
X3可以是分支的、三價有機基團(連接體)。在一個實施方案中，X3具有親水性。在一個實施方案中，它包括含有至多18的多官能化烷基。在一個實施方案中，其含有1至約10個碳原子。在另一個實施方案中，X3是單個氮原子。在另一個實施方案中，X3是烷三基。在另一個實施方案中，X3是丙烷-1，2，3-三基。在另一個實施方案中，X3是烷三氧基。在另一個實施方案中，X3是烷三基、烷三氧基或式-CO-NH-Q-NH-CO-的部分，其中Q是烷三基； 并且，因此，X3可以是式-CO-N＜的氨基羰基部分或者是式-CH2CO-N＜的乙酰氨基部分并且，在另一個實施方案中，X3具有下列式之一
最后兩個部分是(R)和(S)-1，5-二(氨基羰基)戊基。
在本發(fā)明的一個實施方案中，X4是對稱的。在一個實施方案中，X4是苯-1，3，4，5-四基。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，X3或X4是對稱的。
L1和L2的實例是亞烷基和-((CH2)m’O)n’-，其中m’是2、3、4、5或6，并且n’是0至10的整數(shù)。在一個實施方案中，L1和L2是具有親水性。在本發(fā)明的另一個實施方案中，L1、L2或兩者都是價鍵。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，L1是-CH2(OCH2CH2)n”-OCH2C(O)-，其中n”是0至10的整數(shù)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，L1和L2獨立地選自水溶性有機二價基團。在本發(fā)明的另一個實施方案中，L1或L2或兩者都是含有約1-5個PEG(-CH2CH2O-)基團的二價有機基團。在本發(fā)明的另一個實施方案中，L1和L2每個彼此獨立地是三、四或五乙二醇部分，即(-CH2CH2O-)3、(-CH2CH2O-)4或(-CH2CH2O-)5。在本發(fā)明的另一個實施方案中，L1是氧(-O-)或氧甲基(-OCH2-)，并且L2是式(-CH2CH2O-)2的部分，其也具有式
在本發(fā)明的一個實施方案中，L1是價鍵、氧、亞烷基氧烷基、氧烷基或(聚烷氧基)烷基。在一個實施方案中，L1是價鍵、-O-或下列三個部分之一-OCH2-、-CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2-和-CH2OCH2-。在本發(fā)明的另一個實施方案中，L1是價鍵、氧、亞烷基、聚烷氧二基或氧烷基。在另一個實施方案中，L1是(聚烷氧基)烷基羰基、氧烷基或(聚烷氧基)烷基，其中末端烷基部分優(yōu)選連接至A。在一個實施方案中，這些部分在該二價基團的另一端連接。
在本發(fā)明的一個實施方案中，L2是亞烷基、亞烷基氧烷基、聚烷氧二基或(聚烷氧基)烷基。在一個實施方案中，L2是下列四個部分之一部分-CH2CH2OCH2CH2O-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2-、-CH2CH2OCH2CH2-或-CH2CH2-。在本發(fā)明的另一個實施方案中，L2是價鍵、氧、亞烷基、聚烷氧二基或氧烷基。在另一個實施方案中，L2是(聚烷氧基)烷基羰基、氧烷基或(聚烷氧基)烷基，其中末端烷基部分優(yōu)選連接至B。在一個實施方案中，這些部分在該二價基團的另一端連接。
在本發(fā)明的一個實施方案中，X3是氮原子、烷三基、芳烴三基或下列式的部分
其中Q是烷三基。
在本發(fā)明的一個實施方案中，Q是1，1，5-戊三基。
在本發(fā)明的一個實施方案中，m是整數(shù)或1、2或3。在本發(fā)明的另一個實施方案中，m是整數(shù)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，m是1、2或3。
在本發(fā)明的一個實施方案中，L3是亞烷基、聚烷氧二基、氧、氧烷基和價鍵，L4是鍵，并且L3的一部分可以包含下面的部分之一兩種同分異構(gòu)(順式和反式)形式的氧基亞氨基芳基羰基(-O-N＝CH-Ar-CO-)和兩種同分異構(gòu)(順式和反式)形式的氧基亞氨基羰基(-O-N＝CH-CO-)，在這種情況下，作為孔的L3是氨基鏈烯基或氨基聚烷氧二基衍生物例如氨基烷基氧基亞氨基芳基羰基或氨基聚烷氧基亞氨基羰基。在本發(fā)明的另一個實施方案中，L3是亞烷基、聚烷氧二基、氧、氧烷基和價鍵，L4是鍵，并且L3的一部分可以包含下面的部分之一兩種同分異構(gòu)(順式和反式)形式的氧基亞氨基甲基芳基羰基(-O-N＝CH-Ar-CO-)和兩種同分異構(gòu)(順式和反式)形式的氧基亞氨基乙酰基(-O-N＝CH-CO-)，在這種情況下，作為孔的L3是氨基鏈烯基或氨基聚烷氧二基衍生物例如氨基烷基氧基亞氨基甲基芳基羰基或氨基聚烷氧基亞氨基乙?；Ｔ诒景l(fā)明的另一個實施方案中，L3是烷基氨基、羰基烷基氨基或烷基氨基羰基烷基氨基。在一個實施方案中，L3是下列三個部分之一-C(O)CH2CH2NH-、-CH2CH2CH2CH2NHC(O)CH2CH2NH-或-CH2CH2CH2CH2NH-。
在一個實施方案中，L3是價鍵或二價連接體基團，例如通過下列六個式所說明的那些基團
其中所述二價基團的每一端能夠連接至ITA基團。在一個實施方案中，ITA基團通過羰基連接。
在一個實施方案中，L4和鄰近的L3是二價連接體基團，例如通過下面8個式所說明的那些基團
其中所述二價基團的每一端能夠連接至ITA基團。在實施方案中，羰基連接至ITA基團。
在本發(fā)明的一個實施方案中，L4是氧基亞氨基烷基羰基部分，例如兩種同分異構(gòu)(順式和反式)形式的氧基亞氨基乙酰基(-O-N＝CH-CO-)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，L4是氧基亞氨基烷基芳基羰基部分，例如兩種同分異構(gòu)(順式和反式)形式的氧基亞氨基烷基芳基羰基(-O-N＝CH-Ar-CO-)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，L4是價鍵。在本發(fā)明的另一個實施方案中，L4是順式或反式的下式部分之一
在本發(fā)明的另一個實施方案中，L4是順式和反式的下式部分
在本發(fā)明的一個實施方案中，A是-CO-、-C(O)O-、-P(＝O)(OR)-或-P(＝S)(OR)-，其中R是氫。在一個實施方案中，A是-CO-、-C(O)O-、-P(O)O--或-P(S)O- 在本發(fā)明的一個實施方案中，B是-NH-或-O-。
在本發(fā)明的一個實施方案中，Z是氫、烷基、?；蚓弁檠跬榛驶⑶以谝粋€實施方案中，Z是H-、CH3OCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)-、CH3-或C6H5C(O)-。在一個實施方案中，Z是氫或下面的三個基團之一CH3OCH2CH2OCH2CH2O-CH2C(O)-、CH3-和C6H5C(O)-。
在本發(fā)明的一個實施方案中，A’是羧基，并且B’是受保護的氨基，所述受保護氨基在去保護后可以通過它的羧基偶合至相同結(jié)構(gòu)的新單體上形成酰胺。如從標(biāo)準(zhǔn)的寡肽合成已知的，可以以重復(fù)的方式組裝更大的聚合物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，A’是對硝基苯基碳酸酯(-C(O)-O-pC4H6NO2)、羰基咪唑(-C(O)-Im)、-COOH或-C(O)Cl。在本發(fā)明的另一個實施方案中，B’是N3-、FmocNH-或下式之一的基團
在一個實施方案中，L3是氨基烷基，它的碳原子連接至含有ITA-L4部分的式I的部分。在一個實施方案中，L3是氧烷基，它的碳原子連接至含有ITA-L4部分的式I的部分。在一個實施方案中，L1是聚烷氧二基、聚烷氧烷基或氧烷基，它的末端亞烷基部分連接至A部分。在一個實施方案中，L2是聚烷氧二基或氧烷基，它的氧基部分連接至X3和X4部分。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，A’是亞磷酰胺而B’是經(jīng)適當(dāng)保護的羥基，其一旦去保護后能偶合至相同類型的另一個單體而形成亞磷酸三酯，所述的亞磷酸三酯隨后氧化形成穩(wěn)定的磷酸三酯或硫代磷酸三酯。因此，如從標(biāo)準(zhǔn)的寡核苷酸合成已知的，可以以重復(fù)的方式組裝更大的聚合物。
在另一個實施方案中，A’是活性碳酸酯例如硝基苯基碳酸酯，并且B’是氨基。在一個實施方案中，這是其受保護形式。因此，如從標(biāo)準(zhǔn)的寡氨基甲酸酯類合成得知的，可以以重復(fù)的方式組裝更大的聚合物。
在另一個實施方案中，A’是酰鹵例如-COCl或-COBr，并且B’是氨基。在一個實施方案中，這是其保護形式的。在一個實施方案中，A是下列三個部分之一-CO-、-P(O)O-和-P(S)O-。在一個實施方案中，B是氧或部分-NH-。
在一個實施方案中，本發(fā)明化合物的支化聚合物具有大于約500Da的分子量。在一個實施方案中，其大于約3kDa。在一個實施方案中，其大于約5kDa。
在一個實施方案中，本發(fā)明化合物的支化聚合物具有小于約10kDa的分子量。在一個實施方案中，其小于約7kDa。
在一個實施方案中，本發(fā)明化合物具有約3-約7的等電點。
在一個實施方案中，在生理條件下本發(fā)明化合物具有凈負(fù)電荷。
在進一步的實施方案中，式A’-L1-X3-(L2-B’)2的單體結(jié)構(gòu)單元是
在另一個實施方案中，式A’-L1-X3-(L2-B’)2的單體結(jié)構(gòu)單元是
在另一個實施方案中，式A’-L1-X3-(L2-B’)2的單體結(jié)構(gòu)單元是
在一個實施方案中，L3是二價的連接體基團例如下面的三個式
在一個實施方案中，Z是能夠與末端氨基或羥基反應(yīng)的加帽劑。在一個實施方案中，Z包括下面的三個實例
在一個實施方案中，對于二叉化合物，式I化合物的非ITA部分的主要部分由式A’-L1-X3-(L2-B’)2的單體構(gòu)建



在本發(fā)明的一個實施方案中，對于三叉化合物，式I化合物的非ITA部分的主要部分由式A’-L1-X4-(L2-B’)3的單體構(gòu)建
在一個實施方案中，ITA是來自任意天然種類的GLP-1及其鹽、GLP-1的活性衍生物，或GLP-1類似物，從中如上面提及的氫原子已經(jīng)除去。依然在進一步的實施方案中，ITA是在下面實施例中特別提及的任意GLP-1分子，從中已經(jīng)如上面提及的氫原子除去。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑衍生自具有27-45個氨基酸殘基長的肽，所述的氨基酸殘基中，最初的28個氨基酸殘基中有22個與在GLP-1(7-37)(SEQ ID No.1)相應(yīng)位置或在毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID No.2)相應(yīng)位置發(fā)現(xiàn)的那些氨基酸殘基一致。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑衍生自具有28-45個氨基酸殘基長的肽，所述的氨基酸殘基中，最初的28個氨基酸殘基中有22個與在GLP-1(7-37)相應(yīng)位置或在毒蜥外泌肽-4(1-39)相應(yīng)位置發(fā)現(xiàn)的那些氨基酸殘基一致。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑選自包含下列式(II)的氨基酸序列的肽 Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46 式(II)(SEQ ID No3) 其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、Nα-乙?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸； Xaa8是Ala、D-Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基環(huán)丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(1-氨基環(huán)戊基)羧酸、(1-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸； Xaa16是Val或Leu； Xaa18是Ser、Lys或Arg； Xaa19是Tyr或Gln； Xaa20是Leu或Met； Xaa22是Gly、Glu或Aib； Xaa23是Gln、Glu、Lys或Arg； Xaa25是Ala或Val； Xaa26是Lys、Glu或Arg； Xaa27是Glu或Leu； Xaa30是Ala、Glu或Arg； Xaa33是Val或Lys； Xaa34是Lys、Glu、Asn或Arg； Xaa35是Gly或Aib； Xaa36是Arg、Gly或Lys； Xaa37是Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、酰胺或不存在； Xaa38是Lys、Ser、酰胺或不存在； Xaa39是Ser、Lys、酰胺或不存在； Xaa40是Gly、酰胺或不存在； Xaa41是Ala、酰胺或不存在； Xaa42是Pro、酰胺或不存在； Xaa43是Pro、酰胺或不存在； Xaa44是Pro、酰胺或不存在； Xaa45是Ser、酰胺或不存在； Xaa46是酰胺或不存在； 條件是假如Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45或Xaa46不存在，則下游每個氨基酸殘基也不存在。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑是包含下列式(III)的氨基酸序列的肽 Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38 式(III)(SEQ ID No4) 其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、Nα-乙?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸； Xaa8是Ala、D-Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基環(huán)丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(1-氨基環(huán)戊基)羧酸、(1-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸； Xaa18是Ser、Lys或Arg； Xaa22是Gly、Glu或Aib； Xaa23是Gln、Glu、Lys或Arg； Xaa26是Lys、Glu或Arg； Xaa30是Ala、Glu或Arg； Xaa34是Lys、Glu或Arg； Xaa35是Gly或Aib； Xaa36是Arg或Lys； Xaa37是Gly、Ala、Glu或Lys； Xaa38是Lys、酰胺或不存在。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑選自GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、GLP-1(7-36)-酰胺、GLP-1(7-37)、GLP-1(7-38)、GLP-1(7-39)、GLP-1(7-40)、GLP-1(7-41)或其類似物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，與GLP-1(7-37)(SEQ ID No.1)比較，促胰島素劑包含不多于15個經(jīng)交換、加入或缺失的氨基酸殘基，或者與GLP-1(7-37)(SEQ ID No.1)比較，包含不多于10個經(jīng)交換、加入或缺失的氨基酸殘基。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，與GLP-1(7-37)(SEQ ID No.1)比較，促胰島素劑包含不多于6個經(jīng)交換、加入或缺失的氨基酸殘基。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑包含不多于4個不是由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑包含Aib殘基作為N-端的第二個氨基酸殘基。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的促胰島素劑的N-端氨基酸殘基(式II和III的位置7)選自D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、Nα-乙?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑選自[Arg34]GLP-1(7-37)、[Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Lys36Arg26，34]GLP-1(7-36)、[Aib8，22，35]GLP-1(7-37)、[Aib8，35]GLP-1(7-37)、[Aib8，22]GLP-1(7-37)、[Aib8，22，35Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35Arg26]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Arg26]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22Arg26]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35Arg34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Arg34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22Arg34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35Ala37]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Ala37]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22Ala37]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35Lys37]GLP-1(7-37)、[Aib8，35Lys37]GLP-1(7-37)、[Aib8，22Lys37]GLP-1(7-37)或其衍生物，其已經(jīng)在C-端酰胺化。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑包含至少一個Aib殘基。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑包含兩個Aib殘基。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑在相對于GLP-1(7-37)(SEQ ID.No.1)的位置18，相當(dāng)于相對于毒蜥外泌肽-4(1-39)的位置12包含絲氨酸殘基。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑在相對于GLP-1(7-37)(SEQ ID.No.1)的位置19，相當(dāng)于相對于毒蜥外泌肽-4(1-39)的位置13包含酪氨酸殘基。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑在相對于GLP-1(7-37)(SEQ ID.No.1)的位置22，相當(dāng)于相對于毒蜥外泌肽-4(1-39)的位置16包含甘氨酸殘基。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑在相對于GLP-1(7-37)(SEQ ID.No.1)的位置23，相當(dāng)于相對于毒蜥外泌肽-4(1-39)的位置17包含谷氨酰胺殘基。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑在相對于GLP-1(7-37)(SEQ ID.No.1)的位置26，相當(dāng)于相對于毒蜥外泌肽-4(1-39)的位置20包含賴氨酸殘基。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑在相對于GLP-1(7-37)(SEQ ID.No.1)的位置27，相當(dāng)于相對于毒蜥外泌肽-4(1-39)的位置21包含谷氨酸殘基。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑是毒蜥外泌肽-4(1-39)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑是ZP-10，即[Ser38Lys39]毒蜥外泌肽-4(1-39)LysLysLysLysLys-酰胺(SEQ ID No.5)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑通過相對于氨基酸序列SEQ ID No 1的位置25至45的氨基酸殘基連接至支化聚合物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑通過選自10個C-端氨基酸殘基之一的氨基酸殘基連接至支化聚合物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑通過相對于氨基酸序列SEQ ID No1的位置23、26、34、36或38的氨基酸殘基連接至支化聚合物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑通過相對于氨基酸序列SEQ ID No2的位置17、20、28、30或32的氨基酸殘基連接至支化聚合物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑通過C-端氨基酸殘基連接至支化聚合物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑通過羧基、氨基、酮基、羥基、巰基或酰肼基團連接至支化聚合物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑通過賴氨酸殘基上的ε氨基連接至支化聚合物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑只包含一個賴氨酸殘基。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，促胰島素劑只包含一個賴氨酸殘基，所述的賴氨酸殘基是所述的促胰島素劑的C-端氨基酸殘基。
在另一個實施方案中，如通過本申請中公開的功能性受體測定法測定的，根據(jù)本發(fā)明的化合物具有小于1000pM、小于500pM、小于300pM、小于200pM、小于100pM、小于50pM或小于10pM的EC50。
在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的化合物選自 GLP-1類似物可以使用t-Boc或F-Moc化學(xué)或其它充分確定的技術(shù)，通過就經(jīng)典的肽合成法，例如固相肽合成法生產(chǎn)，見實例例如Houben-Weyl，Methods of organic Chemistry，Volume E 22a，E 22b and E22c；Green和Wuts，“Protecting Groups in Organic Synthesis”，JognWiley&Sons，1999。當(dāng)促胰島素劑是含有非天然氨基酸殘基的肽時，這些方法是優(yōu)選的。
當(dāng)促胰島素試劑是只包含由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基的多肽時，該多肽可通過這樣的方法生產(chǎn)該方法包括培養(yǎng)含有編碼多肽的DNA序列并能在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中于允許該肽表達的條件下表達該多肽的宿主細胞，之后從培養(yǎng)物中回收產(chǎn)生的肽并然后將其衍生為式(I)化合物。
用于培養(yǎng)該細胞的培養(yǎng)基可以是適于生長宿主細胞的任何常規(guī)培養(yǎng)基，例如包含適當(dāng)添加物的基本培養(yǎng)基或復(fù)合培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)廠商獲得或可以根據(jù)公開的配方(例如在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)的目錄中)制備。然后可以通過常規(guī)方法從培養(yǎng)基回收細胞產(chǎn)生的肽，所述的常規(guī)方法包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離宿主細胞。對于胞外產(chǎn)物，上清液的蛋白質(zhì)成分可通過過濾、柱色譜法或沉淀，如微過濾、超濾、等電沉淀，通過用多種色譜方法，如離子交換色譜法、疏水作用色譜法、凝膠過濾色譜法、親合色譜法等純化來分離，這取決于所討論的多肽的類型。對于包內(nèi)或周質(zhì)產(chǎn)物，將從培養(yǎng)基中分離的細胞分裂或滲透并經(jīng)萃取以回收產(chǎn)物多肽或其前體。
編碼治療多肽的DNA序列可適當(dāng)?shù)鼐哂谢蚪M或cDNA起源，可以例如根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(見，例如Sambrook，J，F(xiàn)ritsch，EF和Maniatis，T，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，1989)，通過制備基因組或cDNA文庫并用合成的寡核苷酸探針通過雜交篩選編碼全長肽或肽部分的DNA序列而獲得。編碼多肽的DNA序列也可以通過建立的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如由Beaucage和Caruthers描述的亞磷酰胺(phosphoamidite)方法，Tetrahedron Letters22(1981)，1859-1869或由Matthes等描述的方法，EMBO Journal 3(1984)，801-805而合成制備。該DNA序列也可以使用特定引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)制備，例如在US 4,683,202或Saiki等，Science 239(1988年)，487-491中描述的。
該DNA序列可以插入至可方便地接受重組DNA操作的任何載體中，并且載體的選擇通常取決于其將被引入的宿主細胞。因此，該載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外實體存在的載體，該載體的復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒?？商娲?，該載體可以是當(dāng)將其被引入宿主細胞時，整合進入宿主細胞基因組并與其已經(jīng)整合進入的染色體一起復(fù)制的載體。
在一個實施方案中，該載體是其中編碼多肽的DNA序列有效連接至DNA轉(zhuǎn)錄所需的額外片段(例如啟動子)上的表達載體。該啟動子可以是在選擇的宿主細胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列并且可源自編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。用于在多種宿主細胞中引導(dǎo)編碼本發(fā)明的肽的DNA轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是本領(lǐng)域熟知的，參見例如Sambrook等，同上。
如果需要，編碼多肽的DNA序列也可以有效地連接至合適的終止子、聚腺苷酸化信號、轉(zhuǎn)錄增強子序列和翻譯增強子序列。本發(fā)明的重組體載體可進一步包含使該載體能在所討論的宿主細胞中復(fù)制的DNA序列。
該載體也可以包含可選標(biāo)記，例如其產(chǎn)物補充宿主細胞的缺陷的基因或賦予對藥物(如氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、新霉素、潮霉素或甲氨蝶呤)抗性的基因。在大規(guī)模生產(chǎn)的實施方案中，可選標(biāo)記不是抗生素抗性的，例如，當(dāng)載體用于大規(guī)模生產(chǎn)時切除了載體中的抗生素抗性基因。用于從載體中消除抗生素抗性基因的方法是本領(lǐng)域已知的，參見例如在這里通過引用作為參考的US 6,358,705。
為了將本發(fā)明母體肽引導(dǎo)進入宿主細胞的分泌路徑中，可在重組體載體中提供分泌信號序列(也稱為引導(dǎo)序列、前原序列或前序列)。將分泌信號序列連接至正確閱讀框內(nèi)的編碼肽的DNA序列。分泌信號序列通常位于編碼肽的DNA序列的5′。分泌信號序列可以是通常與肽結(jié)合的序列或者可能來自編碼另一種分泌的蛋白質(zhì)的基因。
用于連接分別編碼本發(fā)明肽、啟動子和任選終止子和/或分泌信號序列的DNA序列并將其插入至包含復(fù)制所需信息的合適載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參考，例如，Sambrook等，同上)。
DNA序列或重組體載體所引入的宿主細胞可以是能夠生產(chǎn)本發(fā)明肽的任意細胞并包括細菌、酵母、真菌和高等真核細胞。本領(lǐng)域熟知并使用的合適宿主細胞的實例是(而不限于)大腸桿菌(E.coli)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或哺乳動物BHK或CHO細胞系。
顯然，通過組合在本申請中描述的一個或多個本發(fā)明實施方案(包括下文中的權(quán)利要求)，可得到新的實施方案。
通常，支化聚合物可使用稱為趨異法和趨同法的兩種基本不同的寡聚化策略之一，從上面描述的單體結(jié)構(gòu)單元組裝。
支化聚合物的發(fā)散型組裝 使用趨異法組裝支化聚合物 在一個實施方案中，支化化合物通過合成循環(huán)的迭代方法組裝，其中每一次循環(huán)使用合適的活化的、活性二叉的或三叉單體結(jié)構(gòu)單元，它們本身含有官能末端基團-使得進一步延伸(即，聚合物“生長”)。所述的官能末端基團通常需要保護以防止自身聚合，并且在這類情況下將需要去保護步驟以便產(chǎn)生進一步延伸所需的官能末端基團。在迭代方法中，加入活化的(活性)單體結(jié)構(gòu)單元并隨后去保護的這樣一次循環(huán)完成一代。趨異方法在使用液相化學(xué)的反應(yīng)方案4和使用固相化學(xué)的反應(yīng)方案3中闡述。
支化聚合物的趨同組裝 然而，當(dāng)在這種迭代方法中達到更高代數(shù)的材料時，常會出現(xiàn)高堆積密度的官能末端基團，其阻止了進一步規(guī)則生長而導(dǎo)致不完全的代。實際上，對于生長需要大量表面官能團反應(yīng)的所有系統(tǒng)，確保所有官能團在每一生長步驟中反應(yīng)是困難的。由于在分步生長序列的后面階段，未反應(yīng)的官能末端基團可能導(dǎo)致失敗的序列(截短)或假反應(yīng)性，這在規(guī)則單分散和高度組織化支化結(jié)構(gòu)的合成中造成了重大問題。
因此，在一個實施方案中，支化聚合物通過在美國專利5,041,516中描述的趨同法組裝。構(gòu)建大分子的趨同法包括通過在其外圍，而不是如趨異法中在其核心開始來構(gòu)建最后的分子。這避免了通常與在逐漸增大數(shù)量的位點處的反應(yīng)相關(guān)的問題，例如共價鍵的不完全形成。
用于組裝第二代支化聚合物的趨同法在反應(yīng)方案1和反應(yīng)方案2中闡述，其使用了涉及單體結(jié)構(gòu)單元之一的具體實例。
支化聚合物的剛性可以通過設(shè)計特定的單體，例如通過使用剛性的核心結(jié)構(gòu)(X3或X4)或通過使用剛性的連接體部分(L1和L2)來控制。在另一個實施方案中，剛性的調(diào)節(jié)通過在一個或多個特定層中使用混合有更大柔性的單體的剛性單體來獲得。在另一個實施方案中，聚合物的總親水性是可控制的。這通過在一個或多個樹枝狀層中，選擇具有更大疏水性核結(jié)構(gòu)(X3或X4)或更大疏水性連接體部分(L1和L2)的單體而實現(xiàn)。
在另一個實施方案中，在支化聚合物的外端層(Z)中使用不同的單體，所述的外端層在最終的GLP-1綴合物中將會暴露于周圍環(huán)境中。在本申請中描述的一些單體具有如末端基團(B’)的受保護的胺官能，其在去保護步驟后，并且在生理條件下，即中性生理性緩沖至pH值約7.4時，將會質(zhì)子化，導(dǎo)致整體結(jié)構(gòu)帶多個陽離子電荷?？商娲?，中性結(jié)構(gòu)可以通過用多種?；瘎┘用敝苽?。如反應(yīng)方案5中描述的一個實例使用了CH3(OCH2CH2)2CH2COOH用于加帽樹枝狀結(jié)構(gòu)的最后層(Z)，否則其將會以胺終止。
在另一個實施方案中，提供了模擬天然存在的糖肽的支化聚合物，其通常在它們的N-聚糖的觸角結(jié)構(gòu)上具有多個帶陰離子電荷的唾液酸作為終止基團。通過適當(dāng)選擇用于產(chǎn)生最后層(Z)的單體，這類聚糖可以模擬它們的多陰離子性質(zhì)。一個這樣的實例在反應(yīng)方案6中描述，其中支化聚合物用琥珀酸單叔丁基酯加帽，其在用酸去保護后產(chǎn)生了在生理條件下帶負(fù)電荷的聚合物表面。
將單體組裝成聚合物可以例如在如Biopolymers 47，381-396(1998)中由N.J.Wells，A.Basso和M.Bradley描述的固相支持體上進行，或者例如，如在美國專利5,041,516中由Frechet等描述的，通過經(jīng)典的液相化學(xué)在合適的有機溶劑中進行。
因此在一個實施方案中，如上文中描述的和在反應(yīng)方案3中闡述的，在迭代趨異法中在用合適的鍵衍生的固相支持體上組裝支化聚合物。對于用Fmoc或Boc保護的氨基基團(B’)，以及活性官能酰化部分(A’)設(shè)計的單體，適用于常規(guī)肽合成的固相方案可以方便地適用。在適用性上來說，標(biāo)準(zhǔn)固相技術(shù)例如在文獻(參見Fields，編者，Solid phase peptide synthesis，在Meth Enzymol 289中)中描述的那些技術(shù)可以利用合適的可編程儀器(例如，ABI 430A)或類似的自制設(shè)備實施，或者使用用于分離和洗滌支持體的標(biāo)準(zhǔn)過濾技術(shù)手動進行。
對于具有，例如DMT保護的醇基團(B’)和例如活性亞磷酰胺(A’)的單體，用于標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸合成的固相設(shè)備例如AppliedBiosystems Expidite 8909，以及條件例如最近由M.Dubber和J.M.J.Fréchet在Bioconjugate chem.2003，14，239-246中描述的那些條件可方便地應(yīng)用。根據(jù)常規(guī)亞磷酰胺法的這種磷酸二酯的固相合成通常需要將中間產(chǎn)物亞磷酸三酯氧化成磷酸三酯。這種類型的固相支持體氧化通常用碘/水或過氧化物(例如但不限于叔丁基過氧化氫和3-氯過苯甲酸)實現(xiàn)，并且要求有保護或無保護的單體抵抗氧化條件。亞磷酰胺法還能夠通過在吡啶或有機硫化試劑例如3H-1，2-苯并二硫雜環(huán)戊二烯-3-酮-1，1-二氧化物中用元素硫簡單置換碘來方便合成硫代磷酸酯(見，例如M.Dubber和J.M.J.Fréchet in Bioconjugate chem.2003，14，239-246)。
連接樹脂的支化聚合物，在完成時，隨后能夠在合適的條件下從樹脂上裂解。重要的是，在生長的聚合物和固相支持體之間的可裂解連接體是以這樣方式選擇，即它在單個單體的寡聚化過程中，包括在單個合成循環(huán)中使用的任何去保護步驟、氧化或還原步驟中將會保持完整，但是期望時在合適的條件下可以裂解，保留最終支化聚合物完整。技術(shù)人員將能夠?qū)B接體和支持體，以及寡聚化過程、去保護過程和任選氧化過程的反應(yīng)條件，根據(jù)所討論的單體而進行適當(dāng)?shù)倪x擇。
用允許能連接單體單元并隨后用作可裂解部分的合適官能團衍生的樹脂是可商業(yè)獲得的(見，例如Bachem和NovoBiochem的商品目錄)。
在另一個實施方案中，支化聚合物在具有合適連接體的樹脂上合成，所述的連接體一旦裂解就會產(chǎn)生具有官能團的支化聚合物產(chǎn)物，所述的官能團能夠如下面描述的，在隨后的液相綴合法中直接用作促胰島素劑(ITA)的連接基團或者，可替代地，通過合適的化學(xué)方法能夠轉(zhuǎn)化成這樣一種連接基團。
在另一個實施方案中，一定大小的樹枝狀支化聚合物和組合物用經(jīng)典的液相技術(shù)合成。
在該實施方案中，支化聚合物在合適的溶劑中，通過依次添加合適的活化的單體至生長的聚合物來組裝。在每次添加后，在可以起始構(gòu)建下一代之前可能需要去保護步驟。使用過量的單體以便達到完全反應(yīng)可能是理想的。在一個實施方案中，過量單體的去除利用了如下優(yōu)點親水聚合物在乙醚或類似類型的溶劑中具有低的溶解性。因而，能夠沉淀出生長的聚合物，留下過剩的單體、偶聯(lián)劑、副產(chǎn)物等等于溶液中。隨后可通過簡單的傾析進行相分離。在實施方案中，通過離心隨后通過傾析進行相分離。聚合物也能夠在例如硅膠上通過常規(guī)色譜技術(shù)與副產(chǎn)物分離，或者如P.R.Ashton等在J.Org.Chem.1998，63，3429-3437中描述的，在正相或反相條件下采用HPLC或MPLC系統(tǒng)分離。可替代地，相當(dāng)大的聚合物可以如E.R.Gillies和J.M.J.Fréchet在J.Am.Chem.Soc.2002，124，14137-14146中描述的，使用分子排阻色譜法，任選與透析組合來與低分子量組分(例如過剩的單體和副產(chǎn)物)分離。
在另一個實施方案中，使用趨同液相合成法。與固相技術(shù)比較，液相技術(shù)也使得用如上文描述以及由S.M.Grayson和J.M.J.Fréchet在Chem.Rev.2001，101，3819-3867中進一步綜述的趨同方法用于組裝支化聚合物成為可能。在該方法中，使用單體起始合成是理想的，其中最初將受保護的官能末端基團(B’)轉(zhuǎn)化成最終會出現(xiàn)于最終支化聚合物外表面上的部分。因此，在多數(shù)情況下通式I的官能部分(A’)將需要適當(dāng)保護，使得能對末端基團(B’)進行逐步的化學(xué)操作。官能部分(A’)的保護基的選擇取決于實際官能團。例如，如果通式IVb或IVc中的A’是羧基，則可以通過TFA除去的叔丁酯衍生物將是適當(dāng)?shù)倪x擇。合適的保護基是技術(shù)人員已知的，并且可以在Green&Wuts“Protection groups in organic synthesis”，第3版，Wiley-interscience中找到其它實例。支化聚合物的趨同組裝在反應(yīng)方案1和反應(yīng)方案2中闡述。反應(yīng)方案可以在下文中找到。在反應(yīng)方案1的步驟(i)中，叔丁酯官能(A’)通過將合適的前體與α-溴乙酸叔丁酯反應(yīng)制備。在步驟(ii)中，末端基團(B’)以這樣一種方式操作，這種方式使得步驟(iii)與羧酸?；?，該羧酸在步驟(iv)中轉(zhuǎn)化成酰鹵。在步驟(v)中，除去叔丁基酯官能(A’)，產(chǎn)生末端(B’)加帽的單體。這種末端加帽的單體在反應(yīng)方案2中用作制備第二代產(chǎn)物的原料，其中兩當(dāng)量用于與反應(yīng)方案1中的步驟(ii)產(chǎn)物的?；磻?yīng)。該反應(yīng)的產(chǎn)物是新的叔丁基酯，其在去保護后能夠以迭代的方式再次進入反應(yīng)方案2的起始步驟，產(chǎn)生更高代數(shù)的物質(zhì)。
為了實現(xiàn)支化聚合物分子與促胰島素劑(ITA)在溶液中或固相支持體上的共價連接，必須為支化聚合物提供活性柄，即提供活性官能團，所述的活性官能團的實例包括羧酸、伯氨基基團、酰肼類、O-烷基化的羥胺、硫醇、琥珀酸酯、丁二酸琥珀酰亞氨酯、丙酸琥珀酰亞氨酯、琥珀酰亞氨基羧甲基化產(chǎn)物(succimidyl carboxymethylates)、酰肼芳基碳酸酯和芳基氨基甲酸酯例如硝基苯基氨基甲酸酯和硝基苯基碳酸酯、氯碳酸酯、異硫氰酸酯、異氰酸酯、順丁烯二酰亞胺，以及活化的酯例如
支化聚合物綴合至ITA通過熟練技術(shù)人員已知的常規(guī)方法進行。技術(shù)人員將認(rèn)識到要使用的活化法和/或綴合化學(xué)(例如，反應(yīng)基團等的選擇)取決于ITA上選擇的連接基團(例如氨基、羥基、硫醇基等)和支化聚合物上選擇的連接基團(例如，丙酸琥珀酰亞氨酯、硝基苯基碳酸酯、順丁烯二酰亞胺、乙烯基砜、鹵代乙酸酯等)。在另一個實施方案中，支化聚合物上的合適的連接部分(例如上面提及的那些)是用常規(guī)液相化學(xué)在支化聚合物已經(jīng)組裝后產(chǎn)生的。說明了用于產(chǎn)生含有羧酸基團的支化聚合物上的親核連接部分的不同方式的本發(fā)明的實施方案，在反應(yīng)方案7中列出。
作為引導(dǎo)用支化聚合物衍生物?；嚢彼嵘系摩虐被目商娲椒?，開始可以用甲?；苌聂人?例如用活化如N-羥基琥珀酰亞胺酯、1-羥基苯并三唑酯等)來?；僖葝u素劑(ITA)。獲得的攜帶醛官能的ITA隨后可以依次與本發(fā)明的單-、寡-或聚合的結(jié)構(gòu)單元，通過將這兩種成分混合于含水介質(zhì)中而縮合，所述的結(jié)構(gòu)單元適當(dāng)?shù)匮苌鸀槔鏞-取代的羥胺、肼或酰肼，所述的含水介質(zhì)任選含有中性、酸性或堿性pH的有機共溶劑。在這種情況下，L4是價鍵，并且通式I中的二價基團L3含有肟基團。部分L4加上鄰接的L3的典型的非限制性實例包括(順式和反式)

和
在實施方案中，L3是根據(jù)定義的二價基，并且L4選自價鍵和式-CO-L5-CH＝N-O-的部分，其中L5是價鍵、亞烷基或亞芳基，并且其中所述的L4部分的末端羰基部分連接至ITA部分。L4的典型的非限制性實例包括(順式和反式)
可替代地，可以用部分衍生促胰島素劑(ITA)，該部分在化學(xué)反應(yīng)(例如高碘酸鹽氧化作用)后，可以產(chǎn)生含有醛官能的ITA分子。攜帶醛官能的ITA隨后可以如上與本發(fā)明的單-、寡-或聚合的結(jié)構(gòu)單元，通過將這兩種成分混合于含水介質(zhì)中而縮合，所述的結(jié)構(gòu)單元類似地衍生為例如O-取代的羥胺、肼或酰肼，所述的含水介質(zhì)任選含有中性、酸性或堿性pH的有機共溶劑。
一個特別的實例是最初用絲氨酸酰化賴氨酸上的ε氨基，之后通過高碘酸裂解產(chǎn)生乙醛酰衍生的ITA。在這種情形中，二價L4部分加上鄰接的L3部分的典型的非限制性實例包括(順式和反式)


和
L3也可以是根據(jù)定義的二價基團，并且L4可以是氧基亞氨基烷基羰基基團。典型的非限制性實例包括(順式和反式)
在含水反應(yīng)介質(zhì)中將生物活性ITA與活化的支化聚合物反應(yīng)，所述的反應(yīng)介質(zhì)經(jīng)任選緩沖，這取決于ITA的pH要求。反應(yīng)的最佳pH值通常在約6.5和約8之間。在一個實施方案中，對大多數(shù)ITA類似物而言為約7.4。
促胰島素劑(ITA)穩(wěn)定性、反應(yīng)效率等的最佳反應(yīng)條件是在本領(lǐng)域一般技術(shù)人員水平內(nèi)的。在一個實施方案中，溫度范圍是約4℃至約37℃。反應(yīng)介質(zhì)的溫度不能超過促胰島素劑(ITA)可能變性或分解的溫度。在一個實施方案中，將促胰島素劑(ITA)與過量的活化的支化聚合物反應(yīng)。反應(yīng)后，回收綴合物并例如通過透濾法，柱色譜法包括分子排阻色譜法、離子交換色譜、親和色譜法、電泳或其組合等純化。
在一個實施方案中，綴合的方法是基于標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)，其以以下的方式進行。支化聚合物具有在合成期間，例如，在反應(yīng)方案7中所述的通過?；被榛B接的氨基氧乙酸而連接的氨基氧乙酰基。ITA具有末端絲氨酸或蘇氨酸殘基，其根據(jù)Rose在J.Am.Chem.Soc.1994，116，30-33)和歐洲專利0243929中所述在溫和條件下用高碘酸鹽氧化成乙醛?；??？商娲?，醛官可以通過用含有醛或暫時保護的醛基的?；糠瞩；┞兜陌被?例如賴氨酸殘基的ε氨基)而引入。支化的聚合物的氨基氧成分和ITA的醛成分以大概相等的比例，在含水溶液中以約1-10mM的濃度，在適度酸性條件下，例如約2-約5的pH值下，特別是在大約室溫下混合，并且在綴合反應(yīng)(在該情況下是肟化)后，進行反相高壓液相色譜法(HPLC)和電噴射離子化質(zhì)譜法(ES-MS)。反應(yīng)速度取決于濃度、pH值和位阻因素，但通常在幾小時內(nèi)處于平衡，并且平衡非常有利于綴合(Rose等，BioconjugateChemistry 1996，7，552-556)。稍微過量(至多五倍)的一種成分促使該綴合反應(yīng)朝向完成。如先前關(guān)于肟描述的，將產(chǎn)物分離并表征。ITA類似物例如通過反向HPLC(Rose，J.Am.Chem.Soc.，同上和Rose等，Bioconjugate Chemistry，同上)純化。
在另一實施方案中，綴合方法以以下方式進行支化聚合物如反應(yīng)方案3中描述的在Sasrin或Wang樹脂(Bachem)上合成。使用樹脂生產(chǎn)商(Bachem)推薦的方法，將支化聚合物通過用二氯甲烷中的TFA反復(fù)處理從樹脂上裂解并用甲醇中的吡啶中和裂解的聚合物溶液。如同GLP-1一樣，在室溫下(不施加熱)蒸發(fā)掉溶劑并純化裂解的聚合物后，活化連接至樹脂的羧基(例如，用HBTU、TSTU或HATU活化)并通過肽化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)偶合至促胰島素劑(ITA)上的親核基團(例如氨基，即賴氨酸側(cè)鏈上的ε氨基)上。如果需要，可通過眾多純化方法的一種，將經(jīng)修飾的靶標(biāo)分子或物質(zhì)從反應(yīng)混合物中純化，所述的純化方法是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所周知的，例如分子排阻色譜法、疏水作用色譜法、離子交換色譜法、制備型等電聚焦等。用于大分子純化，特別是肽純化的通用方法和原理可以在例如Seeres的“Protein PurificationPrinciples and Practice”，第2版，Springer-Verlag，New York，NY，(1987)中找到，在本申請中將其通過引用作為參考。
用于制備本發(fā)明化合物的許多母體GLP-1類似物或GLP-1衍生物是已知的(見L.B.Knudsen等，J.Med.Chem.2000，43，1664-1669的一系列非限制性實例)并且其它的可以與已知化合物的制備類似地制備或通過對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的其它方法制備。
前面是闡述促胰島素劑(ITA)，包括GLP-1類似物，其適合于用于與支化聚合物綴合。應(yīng)該理解，沒有具體提到但具有合適特性的促胰島素劑及類似物也是期望的并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在另一實施方案中，提供了水溶性聚合物。作為用于增強GLP-1類似物的特性的物質(zhì)這是重要的。例如，通過綴合水溶性聚合物至GLP-1類似物來降低溶解性。與由非綴合GLP-1類似物產(chǎn)生的免疫應(yīng)答比較，支化聚合物連接至具有固有免疫原特性的GLP-1類似物提供了具有降低的免疫應(yīng)答，或增加的藥物動力學(xué)性質(zhì)、增加的貯藏期和增加的生物半衰期的綴合物。本發(fā)明提供了GLP-1類似物，其通過連接親水的水溶性支化聚合物被修飾而基本上沒有減少或干擾非修飾的GLP-1類似物的生物學(xué)活性。
本發(fā)明提供了由結(jié)構(gòu)十分確定的聚合物修飾的GLP-1類似物，其基本上是均質(zhì)的化合物，其中所述支化聚合物的代數(shù)十分確定。
本發(fā)明提供綴合物，所述的綴合物保留了非綴合的GLP-1的生物學(xué)活性。在本發(fā)明另一實施方案中，與非綴合的GLP-1比較，綴合的GLP-1具有改良的特征。
在本發(fā)明的另一實施方案中，綴合至GLP-1的某些部分的支化聚合物減少了GLP-1的生物利用度、效價和效能或活性。這種減少在基于持續(xù)釋放原理的藥物遞送系統(tǒng)中是理想的。在另一實施方案中，考慮其中支化聚合物與連接體結(jié)合使用的持續(xù)釋放原理，所述的連接體在生理條件下可以裂解，因而從支化聚合物上緩慢釋放生物活性GLP-1。在該情形中，GLP-1在支化聚合物除去前可以是沒有生物活性的。在一特定的實施方案中，可裂解的連接體是可作為例如血清中存在的蛋白酶的底物的小肽。
應(yīng)該理解，設(shè)計所述的聚合體綴合物以便產(chǎn)生關(guān)于支化聚合物分子的數(shù)目、大小和組成(例如，代數(shù)和在每代中使用的特別的單體)以及GLP-1上的連接位點最優(yōu)的分子。要使用的支化聚合物的特定分子量可以例如基于要獲得的期望效果來選擇。例如，如果所述綴合物的主要目的是獲得具有高分子量的綴合物(例如，用于減少腎清除率)，綴合盡可能少數(shù)的高分子支化聚合物分子來獲得理想的分子量通常是理想的。在另外的情形中，防止特異性的或非特異性的蛋白水解裂解或遮蔽GLP-1上的免疫原性表位可能是理想的，并且具有特定的低分子量的支化聚合物可能是最佳的選擇。
因而，通過本發(fā)明，獲得了具有細調(diào)的預(yù)定質(zhì)量的聚合物衍生的GLP-1類似物(綴合物)。
仍然在本發(fā)明的另一實施方案中，將如此處描述制備的支化聚合物綴合至GLP-1。在本發(fā)明的另一實施方案中，這產(chǎn)生了具有增加的肺生物利用度的綴合物。在本發(fā)明的另一實施方案中，這產(chǎn)生了具有增加的肺部作用持續(xù)時間的綴合物。
在一個相關(guān)的實施方案中，將如此處描述的支化聚合物用于遮蔽從非-人來源獲得的生物藥物GLP-1上的免疫原性表位。
然而在另一實施方案中，將支化水溶性聚合物綴合至GLP-1上，所述的GLP-1處于其未經(jīng)修飾的狀態(tài)和在生理學(xué)條件下具有低的溶解性。
在另一實施方案中，本發(fā)明的某些GLP-1綴合物的體內(nèi)半衰期提高了多于10％。在一個實施方案中，某些GLP-1綴合物的體內(nèi)半衰期提高了多于25％。在一個實施方案中，GLP-1綴合物的體內(nèi)半衰期提高了多于50％。在一個實施方案中，某些GLP-1綴合物的體內(nèi)半衰期提高了多于75％。在一個實施方案中，某些GLP-1綴合物的體內(nèi)半衰期提高了多于100％。在另一實施方案中，某些GLP-1的體內(nèi)半衰期在綴合支化聚合物后增加了250％。
在另一實施方案中，本發(fā)明的某些GLP-1綴合物的功能體內(nèi)半衰期提高了多于10％。在另一個實施方案中，某些GLP-1綴合物的功能體內(nèi)半衰期提高了多于25％。在另一個實施方案中，某些GLP-1綴合物的功能體內(nèi)半衰期提高了多于50％。在另一個實施方案中，某些GLP-1綴合物的功能體內(nèi)半衰期提高了多于75％。在另一個實施方案中，某些GLP-1綴合物的功能體內(nèi)半衰期提高了多于100％。在另一實施方案中，某些GLP-1的功能體內(nèi)半衰期在綴合支化聚合物后增加了250％。
一般而言，GLP-1類似物在溶液中的穩(wěn)定性十分差。因而，在本發(fā)明的一個實施方案中，如在本申請中描述的十分確定的水溶性支化聚合物可以綴合GLP-1類似物并且通過使結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換(例如重新折疊)最小而穩(wěn)定GLP-1并保持GLP-1活性。
在一個相關(guān)的實施方案中，GLP-1的貯藏半衰期在綴合至如此處描述的支化聚合物后得以提高。
在本發(fā)明的另一實施方案中，所述的促胰島素劑是DPPIV保護的肽。
在本發(fā)明另一實施方案中，所述的促胰島素劑具有少于1nM的EC50，所述的EC50是由如此處公開的功能受體測定法測定的。
在本發(fā)明另一實施方案中，所述的促胰島素劑具有少于300nM、少于200nM或少于100nM的EC50，所述的EC50是此處公開的功能受體測定法測定的。
反應(yīng)方案1-在溶液中的趨同合成-加帽的-第一代
反應(yīng)方案2具有受保護的焦點的第二代
反應(yīng)方案3第二代支化聚合物的固相合成
反應(yīng)方案4第二代物質(zhì)在溶液中的趨異合成
反應(yīng)方案5用Me(PEG)2CH2COOH酸端加帽的第二代聚合物的說明
反應(yīng)方案6用琥珀酸單叔丁酯端加帽連接至固相支持物或促胰島素劑(R)的第二代聚合物來產(chǎn)生多陰離子糖模擬聚合物的說明
反應(yīng)方案7用于聚合物綴合至ITA分子的合適活性柄的形成。第二代聚合物物質(zhì)的說明
藥物施用 式I的本發(fā)明綴合的GLP-1類似物可以，例如皮下、經(jīng)口或肺部施用。
對于皮下施用，將式I化合物與配制已知GLP-1類似物類似地配制。此外，對于皮下施用，將式I化合物與施用已知GLP-1類似物類似地施用并且，通常，醫(yī)師熟悉該方法。
對于經(jīng)口施用，將式I化合物與配制經(jīng)口施用的其它藥物類似地配制。此外，對于經(jīng)口施用，將式I化合物與施用已知口服藥物類似地施用并且，大體上，醫(yī)師熟悉這種方法。
對于肺部施用的產(chǎn)品，給出了下面詳細細節(jié) 本發(fā)明綴合的GLP-1類似物可以通過吸入以劑量有效的方式施用來增加循環(huán)的GLP-1水平和/或降低循環(huán)的葡萄糖水平。這種施用可以有效用于治療障礙例如糖尿病或高血糖癥。獲得有效劑量的GLP-1需要施用大于約0.5μg/kg至約50μg/kg本發(fā)明綴合的GLP-1的吸入劑量。治療有效量可以由內(nèi)行的醫(yī)師確定，其將考慮多種因素，包括患者的GLP-1水平、血糖水平、身體條件、患者的肺狀態(tài)等。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明綴合的GLP-1可以通過吸入遞送以達到將其迅速吸收。通過吸入施用可能會導(dǎo)致與皮下施用GLP-1類似物相當(dāng)?shù)乃幬飫恿W(xué)。本發(fā)明綴合的GLP-1的吸入導(dǎo)致循環(huán)的GLP-1水平迅速上升，之后血糖水平迅速下降。在比較相似的粒度和相似的肺部沉積水平時，不同的吸入裝置通常提供相似的藥物動力學(xué)。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明綴合的GLP-1可以通過任意本領(lǐng)域已知的多種用于通過吸入施用治療劑的吸入裝置遞送。這些裝置包括定量吸入器、霧化器、干粉產(chǎn)生器、噴霧器等。在一個實施方案中，本發(fā)明綴合的GLP-1通過干粉吸入器或噴霧器遞送。用于施用本發(fā)明綴合的GLP-1的吸入裝置具數(shù)個理想的特征。例如，用吸入裝置遞送是有利可靠的、可再生的且準(zhǔn)確的。吸入裝置應(yīng)遞送細小的粒子，例如小于約10μm，例如約1-5μm，以便有好的呼吸性。適合用于實踐本發(fā)明的可商業(yè)獲得的吸入裝置的一些具體的實例是TurbohalerTM(Astra)、Rotahaler(Glaxo)、Diskus(Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)、由Inhale Therapeutics上市銷售的裝置、AERxTM(Aradigm)、Ultravent霧化器(Mallinckrodt)、Acorn II霧化器(MarquestMedical Products)、Ventolin定量吸入器(Glaxo)、Spinhaler粉末吸入裝置(Fisons)等。
如本領(lǐng)域那些技術(shù)人員將理解的，本發(fā)明綴合的GLP-1的配制、遞送的制劑的量，以及施用單次劑量的持續(xù)時間取決于采用的吸入裝置的類型。對于一些氣溶膠遞送系統(tǒng)，例如霧化器，施用頻率和系統(tǒng)激活的時間長度將主要取決于氣溶膠中GLP-1綴合物的濃度。例如，當(dāng)霧化器溶液中GLP-1綴合物的濃度高時，可以采用短的施用周期。裝置例如定量吸入器可以產(chǎn)生較高的氣溶膠濃度，并且可以操作更短周期來遞送期望量的GLP-1綴合物。裝置例如粉末吸入裝置遞送活性劑直到給定量的藥劑從裝置中排出。在這種類型的吸入器中，給定量的粉末中的本發(fā)明綴合的GLP-1的量決定了單次施用中遞送的劑量。
通過吸入裝置遞送的制劑中本發(fā)明綴合的GLP-1的粒度對于GLP-1使之進入肺的能力而言是關(guān)鍵的。在一個實施方案中，進入下氣道或肺泡。在一個實施方案中，配制本發(fā)明綴合的GLP-1以便至少約10％遞送的GLP-1綴合物在肺中沉積。在一個實施方案中，約10-約20％，或更多在肺中沉積。已經(jīng)知道，用口呼吸的人的最大肺部沉積效率用約2μm至約3μm的粒獲得。當(dāng)粒度大于約5mμ時，肺部沉積大量減少。小于約1μm的粒度導(dǎo)致肺部沉積減少，并且使遞送足夠治療有效量的顆粒變得困難。因此，在本發(fā)明的實施方案中，通過吸入遞送的GLP-1綴合物顆粒具有小于約10μm的粒度。在實施方案中，粒度為約1μm至約5μm。選擇GLP-1綴合物的制劑以在所選擇的吸入裝置中產(chǎn)生期望的粒度。
在作為干粉劑施用的實施方案中，本發(fā)明綴合的GLP-1以粒度小于約10μm的顆粒形式制備。在一個實施方案中，粒度約為1μm至約5μm。在一個實施方案中，所述粒度可有效用于遞送至患者的肺的肺泡中。在一個實施方案中，干粉劑主要由產(chǎn)生而使大多數(shù)顆粒具有期望范圍的大小的顆粒組成。在一個實施方案中，至少約50％的干粉劑由直徑小于約10μm的顆粒組成。這樣的制劑可以通過噴霧干燥、碾磨或臨界點濃縮含有GLP-1綴合物和其它期望成分的溶液獲得。也適合用于產(chǎn)生可用于本發(fā)明的顆粒的其它方法是本領(lǐng)域已知的。
顆粒通常從容器中的干粉劑分離并隨后通過載體氣流運送至患者的肺中。通常，在目前的干粉吸入器中，用于使固體分離的力僅通過患者的吸入提供。一種合適的干粉吸入器是由Astra(Sdertalje，瑞典)生產(chǎn)的TurbohalerTM。在另一種類型的吸入器中，患者吸入產(chǎn)生的氣流激活推進馬達，其使單體GLP-1類似物顆粒的解聚附。DuraSpirosTM吸入器是這樣一種裝置。
用于從干粉吸入器施用的本發(fā)明綴合的GLP-1制劑通常包括含有GLP-1綴合物的細粉碎干粉，但是所述粉劑還可以包含填充劑、載體、賦形劑、另外的添加劑等。添加劑可以包含于GLP-1綴合物的干粉劑中，例如用來稀釋粉劑(按照從特定干粉吸入裝置遞送所必需的)，用來促進制劑的處理、用來給制劑提供有利的粉末特性、用來促進粉末從吸入裝置分散、用來穩(wěn)定制劑(例如，抗氧化劑或緩沖劑)、用來給制劑提供味道等。有利地是，所述的添加劑不會不利地影響患者的氣道。GLP-1綴合物可以在分子水平上與添加劑混合或者固體制劑可以包含與添加劑顆粒混合或涂在添加劑粒子上的GLP-1綴合物顆粒。典型的添加劑包括單糖、二糖和多糖；糖醇和其它多元醇，例如乳糖、葡萄糖、棉子糖、松三糖、乳糖醇、麥芽糖醇、海藻糖、蔗糖、甘露醇、淀粉或其組合；表面活性劑，例如山梨醇、雙磷脂酰膽堿或卵磷脂等。通常，添加劑(例如填充劑)以有效用于上述目的的量存在，通常為制劑重量的約50％至約90％。另外的用于配制蛋白質(zhì)例如GLP-1類似物蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的試劑也可以包含于制劑中。
包含本發(fā)明綴合的GLP-1的噴霧劑可以通過在壓力下促使GLP-1綴合物的混懸劑或溶液劑通過噴嘴產(chǎn)生。可以選擇噴嘴的大小和結(jié)構(gòu)、施加的壓力以及流體進料速率來達到期望的輸出量和粒度。電噴射可以例如通過與毛細管或噴嘴進料裝置連接的電場產(chǎn)生。在一個實施方案中，通過噴霧器遞送的GLP-1綴合物顆粒具有小于約10μm的粒度。在一個實施方案中，粒度為約1μm至約5μm。
適合與噴霧器使用的本發(fā)明綴合的GLP-1制劑通常包括濃度為每ml溶液約1mg-約20mg GLP-1綴合物的水溶液中的GLP-1綴合物。制劑可以包含試劑例如賦形劑、緩沖劑、等滲劑、防腐劑、表面活性劑。在一個實施方案中，制劑含有鋅。制劑也可以包含用于穩(wěn)定GLP-1綴合物的賦形劑或試劑，例如緩沖劑、還原劑、大體積的蛋白質(zhì)(bulk protein)或糖類?？捎糜谂渲艷LP-1綴合物的大體積的蛋白質(zhì)包括白蛋白、魚精蛋白等。適用于配制GLP-1綴合物的典型糖類包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。GLP-1綴合物制劑還可以包含表面活性劑，所述的表面活性劑可以減少或防止形成氣溶劑時由于溶液霧化而引起的GLP-1綴合物的表面-誘導(dǎo)的聚集?？梢圆捎枚喾N常規(guī)的表面活性劑，例如脂肪酸聚氧乙烯酯和醇，以及聚氧化乙烯山梨醇脂肪酸酯。量將通常為制劑重量的約0.001和約4％之間。在一個實施方案中，對于本發(fā)明的目的來說，表面活性劑是聚氧乙烯山梨坦單油酸酯、聚山梨酯80、聚山梨酯20等。另外的用于配制蛋白質(zhì)例如GLP-1類似物蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的試劑也可以包含于制劑中。
本發(fā)明的綴合GLP-1可以通過霧化器，例如噴射霧化器或超聲霧化器施用。典型地，在噴射霧化器中，壓縮空氣源用于產(chǎn)生通過噴嘴的高速空氣噴射。當(dāng)氣體膨脹超出噴嘴時，產(chǎn)生一個低壓區(qū)，該低壓區(qū)通過連接至液體儲蓄器的毛細管汲取GLP-1綴合物溶液。來自毛細管的液流在其離開毛細管時剪切成不穩(wěn)定的細絲和液滴，形成氣溶膠?？梢圆捎靡幌盗薪Y(jié)構(gòu)、流速和折流板類型以從給定的噴射霧化器獲得期望的性能特性。在超聲霧化器中，通常采用壓電轉(zhuǎn)換器，將高頻率的電能量用來產(chǎn)生振動、機械能。該能量直接或通過耦合流體傳遞至GLP-1綴合物制劑，產(chǎn)生含有GLP-1綴合物的氣溶膠。有利地，通過霧化器遞送的GLP-1綴合物顆粒具有小于約10μm的粒度。在一個實施方案中，粒度的范圍為約1μm至約5μm。
適合與霧化器(噴射霧化器或超聲霧化器)使用的GLP-1綴合物制劑通常包括水溶液中的GLP-1綴合物，其濃度為每ml溶液約1mg-約20mg GLP-1綴合物。制劑可以包含試劑例如賦形劑、緩沖劑、等滲劑、防腐劑、表面活性劑。制劑也可以包含用于穩(wěn)定GLP-1綴合物的賦形劑或試劑，例如緩沖劑、還原劑、大體積的蛋白質(zhì)或糖類。可用于配制GLP-1綴合物的大體積的蛋白質(zhì)包括白蛋白、魚精蛋白等。適用于配制GLP-1綴合物的典型糖類包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。GLP-1綴合物制劑還可以包含表面活性劑，所述的表面活性劑可以減少或防止形成氣溶劑時由于溶液霧化引起的GLP-1綴合物的表面-誘導(dǎo)的聚集?？梢圆捎枚喾N常規(guī)的表面活性劑，例如脂肪酸聚氧乙烯酯和醇，以及聚氧化乙烯山梨醇脂肪酸酯。量通常在制劑重量的約0.001至約4％之間。在一個實施方案中，對本發(fā)明目的來說，表面活性劑是聚氧乙烯山梨坦單油酸酯、聚山梨酯80、聚山梨酯20等。額外的用于配制蛋白質(zhì)(例如GLP-1類似物蛋白質(zhì))的本領(lǐng)域已知試劑也可以包含于所述制劑中。
在定量吸入器(MDI)中，將推進劑、本發(fā)明GLP-1綴合物和任意賦形劑或其它添加劑作為混合物裝入含有液化壓縮氣體的罐中。啟動計量閥釋放氣溶膠形式的混合物。在一個實施方案中，含有的顆粒的大小小于約10μm。在一個實施方案中，約為1μm至約5μm?？梢酝ㄟ^采用由本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的多種方法(包括噴射研磨、噴霧干燥、臨界點濃縮等)而生產(chǎn)的本發(fā)明GLP-1綴合物制劑獲得期望的氣溶膠粒度。在一個實施方案中，定量吸入器包括由3M或Glaxo制造并采用氫氟烴推進劑的那些定量吸入器。
用定量吸入器施用的本發(fā)明GLP-1綴合物制劑將通常包括含有本發(fā)明GLP-1綴合物的細粉末粉劑，所述的粉劑作為不含水的介質(zhì)中的混懸劑，例如借助于表面活性劑懸浮于推進劑中。推進劑可以是為該目的而采用的任意常規(guī)材料，例如含氯氟烴、氫氯氟烴、氫氟烴或烴，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷、HFA-134a(氫氟烷-134a)、HFA-227(氫氟烷-227)等。在一個實施方案中，推進劑是氫氟烴?？梢赃x擇表面活化劑來穩(wěn)定作為推進劑中的懸浮劑的本發(fā)明GLP-1綴合物，以防止活性劑的化學(xué)降解等。合適的表面活性劑包括三油酸山梨坦、大豆卵磷脂、油酸等。在一些實施方案中，溶液型氣霧劑使用溶劑例如乙醇。額外的用于配制蛋白質(zhì)(例如GLP-1類似物蛋白質(zhì))的本領(lǐng)域已知試劑也可以包含于上述制劑中。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員將認(rèn)識到，本發(fā)明方法可以通過未在本申請中描述的裝置進行肺部施用本發(fā)明綴合的GLP-1而實現(xiàn)。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明GLP-1綴合物并適合通過吸入施用的藥物組合物或制劑。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的GLP-1綴合物可以用于生產(chǎn)適合通過吸入施用的制劑或藥物。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)適合通過吸入施用的形式的含有本發(fā)明GLP-1綴合物的制劑的方法。例如，干粉劑可以用常規(guī)技術(shù)以數(shù)種方式生產(chǎn)。適合在下呼吸道最大化沉淀的粒度范圍的顆粒可以通過微粉化、碾磨、噴霧干燥等制備。并且液體制劑可以通過將本發(fā)明GLP-1綴合物溶解于適當(dāng)pH的合適溶劑(例如水)中生產(chǎn)，所述的溶劑包含緩沖液或其它賦形劑。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及施用式II綴合的胰島素的方法，所述的方法包括通過肺部途徑施用有效量的式II綴合的胰島素給需要它的患者；在一個實施方案中，所述的式II綴合的胰島素通過所述患者的嘴吸入。
為了更加精確，本發(fā)明還涉及下列實施方案 a)如在本申請中描述的方法，其中將式I綴合的GLP1類似物遞送至患者的下氣道。
b)如在本申請中描述的方法，其中式I綴合的GLP1類似物在肺泡中沉積。
c)如在本申請中描述的方法，其中所述的式I綴合的GLP1類似物以包含藥學(xué)上可接受的載體中的所述式I綴合的GLP1類似物的藥物制劑施用。
d)如在本申請中描述的方法，其中所述的制劑選自含水介質(zhì)中的溶液劑和非含水介質(zhì)中的混懸劑。
e)如在本申請中描述的方法，其中所述的制劑作為氣溶膠施用。
f)如在本申請中描述的方法，其中所述的制劑呈干粉形式。
g)如在本申請中描述的方法，其中所述的式I綴合的GLP1類似物具有小于約10微米的粒度。
h)如在本申請中描述的方法，其中所述的式I綴合的GLP1類似物具有約1-約5微米的粒度。
i)如在本申請中描述的方法，其中所述的式I綴合的GLP1類似物具有約2-約3微米的粒度。
j)如在本申請中描述的方法，其中至少約10％的遞送的式I綴合的GLP1類似物在肺部沉積。
k)如在本申請中描述的方法，其中所述的式I綴合的GLP1類似物通過適合肺部施用并能夠使胰島素類似物在患者肺部沉積的吸入裝置遞送。
l)如在本申請中描述的方法，其中所述的裝置選自霧化器、定量吸入器、干粉吸入器和噴霧器。
m)如在本申請中描述的方法，其中所述的裝置是干粉吸入器。
n)如在本申請中描述的方法，其中所述的裝置是霧化器。
o)如在本申請中描述的方法，其中所述的裝置是定量吸入器。
p)如在本申請中描述的方法，其中所述的裝置是噴霧器。
q)如在本申請中描述的方法，其中啟動所述的裝置施用約3μg/kg至約20μg/kg所述的式I綴合的GLP1類似物。在實施方案中，施用約7μg/kg至約14μg/kg所述的式I綴合的GLP1類似物。
r)如在本申請中描述的方法，其中所述的式I綴合的GLP1類似物是在任意上述實例中特別提及的任意化合物。
s)如在本申請中描述的用于治療糖尿病的方法，所述的方法包括通過肺部途徑施用有效劑量的所述式I綴合的GLP1類似物給需要它的患者。
t)如在本申請中描述的方法，其中所述式I綴合的GLP1類似物作為包含藥學(xué)上可接受的載體中的所述式I綴合的GLP1類似物的藥物制劑施用。
如在本申請中描述的方法，其中所述的GLP1綴合物是在本申請中特別提及的，尤其在本申請中的特定實施例中特別提及的任意特定的式II化合物。即使相對于一種方法在本申請中特定地描述了上述實施方案，但它們類似地應(yīng)用于要使用的產(chǎn)品或制劑。
本發(fā)明的一個目的是提供含有根據(jù)本發(fā)明的化合物的藥物制劑，所述的化合物以約0.1mg/ml-約25mg/ml的濃度存在，其中所述的制劑的pH是2.0-10.0。該制劑可以進一步包含緩沖系統(tǒng)、防腐劑、等滲劑、螯合劑、穩(wěn)定劑和表面活性劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，藥物制劑是含水制劑，即含有水的制劑。這種制劑通常是溶液或混懸液。在本發(fā)明的進一步實施方案中，該藥物制劑是水溶液。術(shù)語“水制劑”定義為含有至少50％w/w水的制劑。同樣，術(shù)語“水溶液”定義為含有至少50％w/w水的溶液，并且術(shù)語“含水混懸液”定義為含有至少50％w/w水的混懸液。
在另一個實施方案中，藥物制劑是一種凍干制劑，在使用前醫(yī)師或患者向其中加入溶劑和/或稀釋劑。
在另一個實施方案中，藥物制劑是不需任何預(yù)先溶解就能使用的干的制劑(例如冰凍干燥或噴霧干燥)。
在另一方面，本發(fā)明涉及含有根據(jù)本發(fā)明的化合物的水溶液以及緩沖液的藥物制劑，其中所述的化合物以0.1mg/ml或更大濃度存在，并且其中所述的制劑pH為約2.0至約10.0。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述制劑的pH為約7.0至約9.5。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述制劑的pH為約3.0至約7.0。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述制劑的pH為約5.0至約7.5。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述制劑的pH為約7.5至約9.0。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述制劑的pH為約7.5至約8.5。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述制劑的pH為約6.0至約7.5。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述制劑的pH為約6.0至約7.0。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述制劑的pH為約3.0至約9.0，并且所述的pH與本發(fā)明化合物的等電pH相差至少2.0pH單位。
在本發(fā)明的進一步實施方案中，緩沖劑選自乙酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、N-甘氨酰甘氨酸、組氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉和三(羥甲基)-氨基甲烷、N，N-二(羥乙基)甘氨酸、三(羥甲基)甲基甘氨酸、蘋果酸、琥珀酸鹽、馬來酸、富馬酸、酒石酸、天門冬氨酸或其混合物。這些特定緩沖劑的每一種構(gòu)成本發(fā)明的一個可替代實施方案。
在本發(fā)明的進一步實施方案中，制劑進一步包含藥學(xué)上可接受的防腐劑。在本發(fā)明的進一步實施方案中，防腐劑選自苯酚、鄰甲酚、間甲酚、對甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、對羥基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、芐醇、三氯叔丁醇和硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪脲、氯己啶、甲醋吡喃酮鈉、氯甲酚、對羥苯甲酸乙酯、氯化芐乙銨、氯酚醚(3對-氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)或其混合物。在本發(fā)明的進一步實施方案中，防腐劑以0.1mg/ml至20mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的進一步實施方案中，防腐劑以0.1mg/ml至5mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的進一步實施方案中，防腐劑以5mg/ml至10mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的進一步實施方案中，防腐劑以10mg/ml至20mg/ml的濃度存在。這些特定防腐劑的每一種構(gòu)成了本發(fā)明的一個可替代實施方案。防腐劑在藥物組合物中的使用是技術(shù)人員熟知的。為了方便起見，可參考RemingtonThe Scienceand Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在本發(fā)明的進一步實施方案中，制劑進一步包含等滲劑。在本發(fā)明的進一步實施方案中，等滲劑選自鹽(如氯化鈉)、糖或糖醇、氨基酸(如L-甘氨酸、L-組氨酸、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天門冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸)、醛糖醇(如丙三醇(甘油)、1，2-丙二醇(丙二醇)、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇)聚乙二醇(如PEG400)或其混合物?？梢允褂萌魏翁抢鐔翁恰⒍腔蚨嗵?，或者水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖苷、芽霉菌糖、糊精、環(huán)胡精、可溶性淀粉、羥乙基淀粉和羧甲基纖維素鈉。在一個實施方案中，糖添加物是蔗糖。糖醇定義為具有至少一個-OH基團的C4-C8碳氫化合物并包括例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、衛(wèi)矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一個實施方案中，糖醇添加劑是甘露醇。上面提及的糖或糖醇可以獨立地或組合使用。對使用的量無固定限制，只要糖或糖醇可溶解于液體制劑并且對使用本發(fā)明方法達到的穩(wěn)定效應(yīng)無不利影響。在一個實施方案中，糖或糖醇的濃度在約1mg/ml和約150mg/ml之間。在本發(fā)明的進一步實施方案中，等滲劑以1mg/ml至50mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的進一步實施方案中，等滲劑以1mg/ml至7mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的進一步實施方案中，等滲劑以8mg/ml至24mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的進一步實施方案中，等滲劑以25mg/ml至50mg/ml的濃度存在。這些特定等滲劑的每一種構(gòu)成了本發(fā)明的一個可替代實施方案。等滲劑在藥物組合物中的使用是技術(shù)人員熟知的。為了方便起見，可參考RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在本發(fā)明的進一步實施方案中，制劑進一步包含螯合劑。在本發(fā)明的進一步實施方案中，螯合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸和天門冬氨酸的鹽及其混合物。在本發(fā)明的進一步實施方案中，螯合劑以0.1mg/ml至5mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的進一步實施方案中，螯合劑以0.1mg/ml至2mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的進一步實施方案中，螯合劑以2mg/ml至5mg/ml的濃度存在。這些特定的螯合劑的每一種構(gòu)成了本發(fā)明的一個可替代實施方案。螯合劑在藥物組合物中的使用是技術(shù)人員熟知的。為了方便起見，可參考RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在本發(fā)明的進一步實施方案中，制劑進一步包含穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑在藥物組合物中的使用是技術(shù)人員熟知的。為了方便起見，可參考RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
更特別地，本發(fā)明組合物是穩(wěn)定的液體藥物組合物，該液體藥物組合物的治療活性成分包括在存儲過程中液體藥物制劑可能會顯示出聚集體形成的多肽?！熬奂w形成”旨在指導(dǎo)致寡聚物，或者是從溶液中沉淀出的大的可見聚集體形成的多肽分子之間的物理相互作用，所述的寡聚物可保持可溶?！霸诖鎯^程中”旨在指曾經(jīng)制備的，未立即施用給受試者的液體藥物組合物或制劑。而且，在制備后，將其以液體形式、冷凍狀態(tài)或干燥形式包裝存儲用于隨后將其重構(gòu)為適合施用于受試者的液體形式或其它形式?！案傻男问健敝荚谥竿ㄟ^冷凍干燥(即，凍干法；見例如Williams和Polli(1984)J.Parenteral Sci.Technol.3848-59)、噴霧干燥(見Spray-Drying Handbook中的Masters(1991)(5th ed；Longman Scientific and Technical，Essez，U.K.)，pp.491-676；Broadhead等(1992)Drug Devel.Ind.Pharm.181169-1206；和Mumenthaler等(1994)Pharm.Res.1112-20)或風(fēng)干(Carpenter和Crowe(1988)Cryobiology 25459-470；和Roser(1991年)Biopharm.447-53)而干燥的液體藥物組合物或制劑。在液體藥物組合物存儲過程中多肽的聚集體形成可能會不利地影響所述多肽的生物活性，導(dǎo)致藥物組合物的治療效果喪失。而且，當(dāng)采用輸注系統(tǒng)施用含有多肽的藥物組合物時，聚集體形成可引起其它問題例如輸液管、膜或泵阻塞。
本發(fā)明的藥物組合物可以進一步包含足夠用來減少在組合物存儲過程中多肽聚集體形成的量的氨基酸堿?！鞍被釅A”旨在指氨基酸或氨基酸的組合，其中任何給定氨基酸是以其游離堿形式或其鹽形式存在。如果使用氨基酸的組合，所有的氨基酸可以以它們的游離堿形式存在，全部可以以它們的鹽形式存在，或者一些可以以它們的游離堿形式存在而其它的以它們的鹽形式存在。在一個實施方案中，制備本發(fā)明組合物中使用的氨基酸是那些具有帶電荷的側(cè)鏈的氨基酸，例如精氨酸、賴氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸。特殊氨基酸(例如，甘氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、咪唑、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸及其混合物)的任何立體異構(gòu)體(即L、D或DL異構(gòu)體)或這些立體異構(gòu)體的組合可存在于本發(fā)明的藥物組合物中，只要該殊氨基酸以其游離堿形式或其鹽形式存在。在一個實施方案中，使用L-立體異構(gòu)體。本發(fā)明組合物也可以使用這些氨基酸的類似物配制。“氨基酸類似物”旨在指天然存在的氨基酸的衍生物，所述的氨基酸衍生物引起減少在本發(fā)明液體藥物組合物存儲過程中的多肽聚集體形成的期望效果。合適的精氨酸類似物包括，例如氨基胍、鳥氨酸和N-單乙基L-精氨酸，合適的甲硫氨酸類似物包括S-乙基高半胱氨酸和S-丁基高半胱氨酸并且合適的半胱氨酸類似物包括S-甲基-L半胱氨酸。如同其它氨基酸一樣，氨基酸類似物以它們的游離堿形式或它們的鹽形式摻合進組合物。在本發(fā)明的進一步實施方案中，氨基酸或氨基酸類似物以足以防止或延遲蛋白質(zhì)聚集的濃度使用。
在本發(fā)明的進一步實施方案中，當(dāng)用作治療劑的多肽是包含至少一個易于氧化的甲硫氨酸殘基時，可以加入甲硫氨酸(或其它含硫的氨基酸或氨基酸類似物)以抑制甲硫氨酸殘基氧化為甲硫氨酸亞砜?！耙种啤敝荚谥鸽S著時間的過去甲硫氨酸氧化的物的最小限度的積聚。抑制甲硫氨酸氧化導(dǎo)致多肽更多地保持以其適當(dāng)?shù)姆肿有问酱嬖凇？梢允褂眉琢虬彼岬娜我饬Ⅲw異構(gòu)體(L、D或DL異構(gòu)體)或其組合。加入的量應(yīng)該是足以抑制甲硫氨酸殘基氧化的量，這樣甲硫氨酸亞砜的量對管理機構(gòu)是可接受的。通常，這意味著該組合物包含不多于約10％-約30％的甲硫氨酸亞砜。通常，這可以通過加入甲硫氨酸而使得加入的甲硫氨酸與甲硫氨酸殘基的比率為約1∶1-約1000∶1，例如10∶1-約100∶1來實現(xiàn)。
在本發(fā)明的進一步實施方案中，所述的制劑進一步包含選自高分子量聚合物或低分子量化合物的穩(wěn)定劑。在本發(fā)明的進一步實施方案中，穩(wěn)定劑選自聚乙二醇(如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基-/羥基纖維素或其衍生物(如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、環(huán)糊精、含硫的物質(zhì)如單硫代甘油、巰基乙酸和2-甲硫基乙醇以及不同的鹽(例如氯化鈉)。這些特定穩(wěn)定劑的每一種構(gòu)成了本發(fā)明的一個可替代實施方案。
藥物組合物還可以包含額外的穩(wěn)定劑，該穩(wěn)定劑進一步增強其中的治療活性多肽的穩(wěn)定性。本發(fā)明特別令人感興趣的穩(wěn)定劑包括(但不限于)保護多肽免于甲硫氨酸氧化的甲硫氨酸和EDTA，以及保護多肽免于與凍融或機械剪切相關(guān)的聚集的非離子型表面活性劑。
在本發(fā)明的進一步實施方案中，制劑進一步包含表面活性劑。在本發(fā)明的進一步實施方案中，表面活性劑選自去垢劑、乙氧基化的蓖麻油、聚乙二醇化甘油酯、乙?；瘑嗡岣视鸵阴?、山梨坦脂肪酸酯、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合體(如泊洛沙姆類如PluronicF68、泊洛沙姆188和407、Triton X-100)、聚氧乙烯山梨坦脂肪酸酯、聚氧乙烯和聚乙烯衍生物如烷基化和烷氧基化衍生物(吐溫如吐溫20、吐溫40、吐溫80和布里杰35)、其單酸甘油酯或乙氧基化衍生物、其甘油二酯或聚氧乙烯衍生物、醇、甘油、卵磷脂和磷脂(如磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、雙磷脂酰甘油和神經(jīng)磷脂)、磷脂的衍生物(如二棕櫚酰磷脂酸)和溶血磷脂(如乙醇胺的棕櫚酰溶血磷脂酰-L-絲氨酸和1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酯、膽堿、絲氨酸或蘇氨酸)以及溶血磷脂和磷酯酰膽堿的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)衍生物，如溶血磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿的十二酰和十四酰衍生物，以及極性頭基團的變體，即膽堿、乙醇胺、磷脂酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙三醇、肌醇和帶正電荷的DODAC、DOTMA、DCP、BISHOP、溶血磷脂酰絲氨酸和溶血磷脂酰蘇氨酸，以及甘油磷脂(如腦磷脂)、甘油糖脂(如吡喃半乳糖苷)、神經(jīng)鞘氨糖脂(如神經(jīng)酰胺、神經(jīng)節(jié)苷脂)、十二烷基磷酸膽堿、雞蛋溶血卵磷脂、羧鏈孢酸衍生物-(如牛磺-二氫羧鏈孢酸鈉等)、長鏈脂肪酸和其鹽C6-C12(如油酸和辛酸)、?；舛緣A和衍生物，賴氨酸、精氨酸或組氨酸的Nα?；苌?，或者賴氨酸或精氨酸的側(cè)鏈酰化衍生物、包含賴氨酸、精氨酸或組氨酸和中性或酸性氨基酸的任何組合的二肽的Nα?；苌?、包含中性氨基酸和兩種帶電荷氨基酸的任何組合的三肽的Nα-酰化衍生物，DSS(多庫酯鈉、CAS登記號[577-11-7])、多庫酯鈣、CAS登記號[128-49-4])、多庫酯鉀、CAS登記號[7491-09-0])，SDS(十二烷基硫酸鈉或十二烷基硫酸鈉)、辛酸鈉、膽酸或其衍生物、膽汁酸和其鹽及甘氨酸或?；撬峋Y合物、熊脫氧膽酸、膽酸鈉、去氧膽酸鈉、?；悄懰徕c、甘膽酸鈉、N-十六烷基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸酯、陰離子(烷基-芳基-磺酸酯)單價表面活性劑、兩性離子表面活性劑(如N-烷基-N，N-二甲氨基-1-丙磺酸酯、3-膽酰氨基-1-丙基二甲氨基-1-丙磺酸酯、陽離子表面活性劑(季銨堿)(如十六基-三甲基溴化銨、氯化十六烷基吡啶)、非離子表面活性劑(如十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷)、泊洛沙姆(如Tetronic’s)，其是由相繼添加氧化丙烯和氧化乙烯至乙二胺得到的四官能嵌段共聚物，或者該表面活性劑可選自咪唑啉衍生物或其混合物。這些特定表面活性劑的每一種構(gòu)成本發(fā)明的一個可替代實施方案。
表面活性劑在藥物組合物中的使用是技術(shù)人員熟知的。為了方便起見，可參考RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
其它成分可以存在于本發(fā)明的肽藥物制劑中是可能的。這些額外的成分可以包括濕潤劑、乳化劑、抗氧化劑、填充劑、張力調(diào)節(jié)劑、螯合劑、金屬離子、油質(zhì)載體、蛋白質(zhì)(例如人血清白蛋白、明膠或蛋白質(zhì))以及兩性離子(例如，氨基酸如甜菜堿、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、賴氨酸和組氨酸)。當(dāng)然，這些額外成分不應(yīng)該不利地影響本發(fā)明藥物制劑的整體穩(wěn)定性。
含有根據(jù)本發(fā)明化合物的藥物組合物可以在多個位點施用給需要這種治療的患者，例如在局部位點(如皮膚和粘膜位點)、在旁路吸收的位點(如在動脈、靜脈、心臟內(nèi)施用)、以及在涉及吸收的位點(如在皮膚內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或腹部內(nèi)施用)。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的施用可以通過多種給藥途徑施用給需要這種治療的患者，例如舌、舌下、口腔、口中、經(jīng)口、在胃和腸內(nèi)、鼻、肺(如通過細支氣管和肺泡或它們的組合)、表皮、真皮、透皮、陰道、直腸、眼(例如通過結(jié)膜)、輸尿管的和腸胃外施用。
在一方面，本發(fā)明涉及含有根據(jù)式(I)的化合物以及藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物。
在一個實施方案中，藥物組合物適于肺部施用。
在另一個方面，本發(fā)明涉及使用式(I)化合物用于制備肺部藥物的用途。
本發(fā)明組合物可以以多種劑型施用，例如作為溶液劑、混懸劑、乳劑、微乳劑、多層乳劑、泡沫劑、油膏劑、糊劑、硬膏劑、軟膏劑、片劑、包衣片劑、沖洗劑、膠囊劑(例如硬明膠膠囊劑和軟明膠膠囊劑)、栓劑、直腸用膠囊劑、滴劑、凝膠劑、噴霧劑、粉劑、氣溶劑、吸入劑、滴眼劑、眼膏劑、眼用沖洗劑、陰道栓劑、陰道環(huán)劑、陰道軟膏劑、注射液、原位轉(zhuǎn)化溶液劑(例如原位凝膠化、原位固定、原位沉淀、原位結(jié)晶)、輸液劑和埋植劑施用。
本發(fā)明組合物可進一步例如通過共價、疏水的和靜電相互作用在藥物載體、藥物遞送系統(tǒng)和高級藥物遞送系統(tǒng)中復(fù)合或與其連接，以便進一步增強化合物的穩(wěn)定性，提高生物利用度、增強溶解度、降低不良效應(yīng)、達到本領(lǐng)域那些技術(shù)人員熟知的按時治療，并且增強患者順應(yīng)性或任何它們的組合。載體、藥物遞送系統(tǒng)和高級藥物遞送系統(tǒng)的實例包括(但不限于)聚合物(如纖維素及衍生物)、多糖(如葡聚糖及衍生物、淀粉及衍生物)、聚(乙烯醇)、丙烯酸酯和甲基丙烯酸聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及它們的嵌段共聚體、聚乙二醇、載體蛋白(如白蛋白)、凝膠如熱膠凝(thermogelling)系統(tǒng)，如本領(lǐng)域那些技術(shù)人員熟知的嵌段共聚體系統(tǒng)、膠束、脂質(zhì)體、微球體、納米微粒、液晶及其分散體、脂-水系統(tǒng)的相行為領(lǐng)域中的那些技術(shù)人員熟知的L2相及其分散體、高分子膠束、多層乳劑、自乳化、自微乳化、環(huán)糊精和其衍生物，以及樹枝狀高分子。
本發(fā)明組合物可用于配制用于肺部施用化合物的固體、半固體、粉末和溶液，其中肺部施用是使用例如定量吸入器、干粉吸入器和噴霧器進行，全部為本領(lǐng)域那些技術(shù)人員熟知的裝置。
本發(fā)明組合物特別可用于配制控制釋放、持續(xù)釋放、延長釋放、阻釋和緩釋藥物遞送系統(tǒng)。更特別地，但不作為限制，組合物可用于配制本領(lǐng)域那些技術(shù)人員熟知的腸胃外控制釋放系統(tǒng)和持續(xù)釋放系統(tǒng)(兩個系統(tǒng)都導(dǎo)致施用量減少許多倍)。在一個實施方案中，控制釋放系統(tǒng)和持續(xù)釋放系統(tǒng)經(jīng)皮下施用。無意于限制本發(fā)明的范圍，有用的控制釋放系統(tǒng)和組合物的實例是水凝膠、油性凝膠、液晶、高分子微團、微球、納米微粒。
生產(chǎn)適用于本發(fā)明組合物的控制釋放系統(tǒng)的方法包括，但不限于結(jié)晶、濃縮、共結(jié)晶、沉淀、協(xié)同沉淀、乳化、分散、高壓勻化、膠囊化、噴霧干燥、微膠囊化、凝聚、相分離、溶劑蒸發(fā)以產(chǎn)生微球、擠出和超臨界流體方法。一般參考Handbook of PharmaceuticalControlled Release(Wise，D.L.，ed.Marcel Dekker，New York，2000)和Drug and the Pharmaceutical Sciences vol.99Protein Formulationand Delivery(Ma cNally，E.J.，ed.Marcel Dekker，New York，2000)。
腸胃外施用可以用注射器，任選筆式注射器，通過皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射來實施?？商娲兀c胃外施用可以通過輸注泵實施。進一步的選擇是一種組合物，所述的組合物可以是用于以鼻或肺噴霧劑形式施用根據(jù)本發(fā)明化合物的溶液或混懸液。作為更進一步的選擇，含有本發(fā)明化合物的藥物組合物也可以適合透皮給藥，例如通過無針注射或從貼劑，任選離子電滲療法貼劑或透粘膜，例如頰，給藥。
術(shù)語“穩(wěn)定制劑”指具有增加的物理穩(wěn)定性、增加的化學(xué)穩(wěn)定性或增加的物理和化學(xué)穩(wěn)定性的制劑。
在本申請中使用的術(shù)語蛋白制劑的“物理穩(wěn)定性”指該蛋白由于其暴露于熱-機械應(yīng)力下和/或與去穩(wěn)定化的界面和表面(如疏水表面和界面)相互作用而形成生物學(xué)上無活性的和/或不可溶的蛋白聚集物的傾向性。含水的蛋白質(zhì)制劑的物理穩(wěn)定性是通過在不同的溫度下將裝入合適容器(如藥筒或管形瓶)中的制劑暴露于機械/物理應(yīng)力(如攪動)下不同時間段后，通過視覺檢查和/或濁度測量來評估的。制劑的視覺檢查在具有黑色背景的強聚焦光下進行。制劑的濁度通過視覺打分評定混濁程度等級來表征，如以0-3的等級來表征(未顯示混濁的制劑對應(yīng)視覺打分0，而在日光下顯示可見混濁的制劑對應(yīng)視覺打分3)。當(dāng)制劑在日光線顯示可見的混濁度時，將根據(jù)蛋白聚集將制劑分類為物理不穩(wěn)定的?？商娲兀苿┑臐岫瓤赏ㄟ^技術(shù)人員熟知的簡單濁度測量來評估。含水蛋白質(zhì)制劑的物理學(xué)穩(wěn)定性也可以通過使用光譜劑或蛋白質(zhì)構(gòu)象狀態(tài)的探針來評估。在一個實施方案中，所述的探針是小分子。在一個實施方案中，所述的探針結(jié)合至蛋白質(zhì)的非天然構(gòu)象異構(gòu)體。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的小分子光譜探針的一個實例是硫黃素T。硫黃素T是已經(jīng)廣泛用于檢測淀粉樣蛋白原纖維的熒光染料。在有原纖維，和也許有其它蛋白質(zhì)構(gòu)型的情況下，硫黃素T在結(jié)合原纖維蛋白質(zhì)形式時在約450nm處產(chǎn)生新的激發(fā)最大值并且在約482nm處發(fā)射增強。未結(jié)合的硫黃素T在這些波長下基本上是無熒光的。
其它小分子可以用作蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變(從天然到非天然狀態(tài))的探針。例如，結(jié)合蛋白質(zhì)的暴露的疏水斑塊的“疏水斑塊”探針。疏水斑塊通常是包埋于天然狀態(tài)蛋白的三級結(jié)構(gòu)中，但當(dāng)?shù)鞍组_始去折疊或變性時其變?yōu)楸┞对谕?。這些小分子、光譜探針的實例是芳香的、疏水染料如蒽、吖啶、二氮雜菲等。其它光譜探針是金屬-氨基酸絡(luò)合物，例如疏水氨基酸如苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸等的鈷金屬絡(luò)合物。
在本申請中使用的術(shù)語，蛋白質(zhì)制劑的“化學(xué)穩(wěn)定性”指蛋白結(jié)構(gòu)中的化學(xué)共價變化，其中所述的這種變化導(dǎo)致具有相比于天然蛋白結(jié)構(gòu)具有潛在較小的生物學(xué)效力和/或潛在增加的免疫原特性的化學(xué)降解產(chǎn)物的形成?？梢孕纬啥喾N化學(xué)降解產(chǎn)物，這取決于天然蛋白質(zhì)的類型和性質(zhì)以及該蛋白質(zhì)暴露的環(huán)境?；瘜W(xué)降解的消除最可能不可能完全避免并且在存儲和使用蛋白質(zhì)制劑過程中通?？梢娀瘜W(xué)降解產(chǎn)物的量增加，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。多數(shù)蛋白質(zhì)易于脫酰胺，即谷氨?；蛱於０孵埢械膫?cè)鏈酰胺基水解形成游離羧酸的過程。其它降解途徑包括高分子量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的形成，其中兩個或更多個蛋白分子通過轉(zhuǎn)酰胺作用和/或二硫化物相互作用共價地彼此結(jié)合，導(dǎo)致形成共價結(jié)合的二聚體、寡聚體和多聚體降解產(chǎn)物(Stability of ProteinPharmaceuticals，Ahern.T.J.&Manning M.C.，Plenum Press，NewYork 1992)。氧化(例如甲硫氨酸殘基的氧化)可認(rèn)為是化學(xué)降解的另一種變體。蛋白制劑的化學(xué)穩(wěn)定性可通過在其暴露于不同的環(huán)境條件(降解產(chǎn)物的形成通常可通過例如增加溫度來加速)下后，在不同時間點測量化學(xué)降解產(chǎn)物的量來評估。每種單獨的降解產(chǎn)物的量通?？筛鶕?jù)分子大小和/或電荷，使用不同色譜技術(shù)(如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)而分離降解產(chǎn)物來測定。
因此，如上面所概括，“穩(wěn)定的制劑”指具有增強的物理學(xué)穩(wěn)定性、增強的化學(xué)穩(wěn)定性或增強的物理和化學(xué)穩(wěn)定性的制劑。一般而言，制劑在使用和存儲過程中(根據(jù)推薦的使用和存儲條件)必須是穩(wěn)定的，直到達到失效期。
在本發(fā)明的一個實施方案中，包含根據(jù)本發(fā)明化合物的藥物制劑在多于6周的使用和多于3年的存儲是穩(wěn)定的。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，含有根據(jù)本發(fā)明化合物的藥物制劑在多于4周的使用和多于3年的存儲是穩(wěn)定的。
在本發(fā)明進一步的實施方案中，含有根據(jù)本發(fā)明化合物的藥物制劑在多于4周的使用和多于2年的存儲是穩(wěn)定的。
在本發(fā)明更進一步的實施方案中，含有該化合物的藥物制劑在多于2周的使用和多于2年的存儲是穩(wěn)定的。
在另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的化合物用于制備藥劑的用途。
在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的化合物用于制備用于治療或預(yù)防高血糖、2型糖尿病、葡萄糖耐量降低、1型糖尿病、肥胖癥、高血壓、X綜合征、血脂異常、認(rèn)知障礙、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管障礙、中風(fēng)、炎性腸綜合征、消化不良和胃潰瘍的藥物。
在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的化合物用于制備用于延緩或預(yù)防2型糖尿病的疾病發(fā)展的藥物。
在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的化合物用于制備用于減少食物攝取、減少β-細胞調(diào)亡、增加β-細胞功能和β-細胞量和/或恢復(fù)對β-細胞的葡萄糖敏感性的藥物。
使用根據(jù)本發(fā)明化合物的治療也可以與第二種或更多種藥理學(xué)活性物質(zhì)，例如選自抗糖尿病劑、減肥藥、食欲調(diào)節(jié)劑、抗高血壓劑、用于治療和/或預(yù)防由糖尿病引發(fā)或與其相關(guān)的并發(fā)癥的藥劑以及用于治療和/或預(yù)防由肥胖癥引發(fā)或與其相關(guān)的并發(fā)癥和障礙的藥劑的藥理學(xué)活性物質(zhì)組合。這些藥理活性物質(zhì)的實例是胰島素、磺酰脲類、雙胍類、氯茴苯酸類、葡萄糖苷酶抑制劑、胰高血糖素拮抗劑、DPP-IV(二肽基肽酶-IV)抑制劑、參與刺激糖異生和/或糖原分解的肝臟酶抑制劑、葡萄糖攝取調(diào)節(jié)劑、調(diào)節(jié)脂類代謝的化合物如抗高血脂藥劑如HMG CoA抑制劑(他汀類藥物)、降低食物攝取的化合物、RXR激動劑和作用于β細胞的ATP依賴性鉀通道的制劑；考來烯胺、考來替泊、氯貝丁酯、吉非貝齊、洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、普羅布考、右旋甲狀腺素、內(nèi)他列奈、瑞格列奈；β-阻滯劑如烯丙心安、氨酰心安、噻嗎心安、吲哚心安、萘心安和甲氧乙心安、ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)抑制劑如貝那普利、卡托普利、恩納普利、福森普利、賴諾普利、alatriopril、喹那普利和雷米普利、鈣通道阻滯劑如硝苯吡啶、二氯苯吡啶、硝苯芐吡啶、依拉地平、尼莫地平、地爾硫和維拉帕米，以及α阻滯劑如多沙唑嗪、哌胺甲尿啶、哌唑嗪和特拉唑嗪；CART(可卡因安非他明調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄物)激動劑、NPY(神經(jīng)肽Y)拮抗劑、MC4(黑皮質(zhì)素4)激動劑、食欲肽拮抗劑、TNF(腫瘤壞死因子)激動劑、CRF(促皮質(zhì)素釋放因子)激動劑、CRF BP(促皮質(zhì)素釋放因子結(jié)合蛋白)拮抗劑、尿皮質(zhì)素(urocortin)激動劑、β3激動劑、MSH(黑素細胞-刺激激素)激動劑、MCH(黑素細胞濃縮激素)拮抗劑、CCK(膽囊收縮素)激動劑、5-羥色胺重攝取抑制劑、5-羥色胺和去甲腎上腺素重攝取抑制劑、混合的5-羥色胺和去甲腎上腺素能化合物、5HT(5-羥色胺)激動劑、蛙皮素激動劑、甘丙肽拮抗劑、生長激素、生長激素釋放性化合物、TRH(促甲狀腺激素釋放激素)激動劑、UCP 2或3(解偶聯(lián)蛋白2或3)調(diào)節(jié)劑、瘦素激動劑、DA激動劑(溴隱亭、doprexin)、脂肪酶/淀粉酶抑制劑、RXR(視黃醇類X受體)調(diào)節(jié)劑、TRβ激動劑；組胺H3拮抗劑。
應(yīng)該理解的是，根據(jù)本發(fā)明的化合物與一種或多種上面提及的化合物，以及任選一種或多種其它藥理活性物質(zhì)的任意合適的組合可以認(rèn)為是在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本文中引用的所有的參考文獻，包括出版物、專利申請和專利在此通過全文引用并入本文并且和引用程度如同每篇參考文獻單獨且具體地指出通過引用作為參考并且在本申請中以其全文列出(在法律允許的最大程度上)。
所有的標(biāo)題和副標(biāo)題在本申請中使用只是為了方便并且不應(yīng)該理解為以任何方式限制本發(fā)明。
在本申請中提供的任何以及所有實施例，或示范性語言(例如“例如”)的使用僅用于更好地闡明本發(fā)明并不造成對本發(fā)明范圍的限制，除非另外申明。本說明書中沒有語言應(yīng)該解釋為，表示任何未要求保護的要素是本發(fā)明的實踐所必需的。
在本申請中專利文獻的引用和引入只是為了方便并且不反映對這些專利文獻的有效性、專利性和/或可執(zhí)行性的任何觀點。在本申請中提及參考資料不是承認(rèn)它們構(gòu)成了現(xiàn)有技術(shù)。
在本申請中，詞語“包含”應(yīng)被廣泛解釋為“包括”、“含有”或“包含”。
本發(fā)明包括適用法律所允許的在本申請中附加的權(quán)利要求中列舉的主題的所有修飾形式和等價形式。
通過下面的實施例來進一步闡述本發(fā)明，然而，所述的實施例不應(yīng)理解為限制保護范圍。在前面描述和下面的實施例中公開的特征可以(分別地和以它們的任意組合)是用于以其多樣的形式實現(xiàn)本發(fā)明的材料。
實施例 下面的實施例和一般方法涉及在結(jié)構(gòu)說明和合成方案中鑒定的中間化合物和終產(chǎn)物。用下列實施例來詳細描述本發(fā)明化合物的制備，但是描述的化學(xué)反應(yīng)是就它們對所選擇的本發(fā)明支化聚合物的制備的普遍適用性而言來公開的。偶爾，所述的反應(yīng)可能不會如對包括在本發(fā)明公開范圍內(nèi)的每種化合物所描述的一樣適用。本領(lǐng)域那些熟練技術(shù)人員將容易識別出現(xiàn)這種情況的化合物。在這些情況下，所述的反應(yīng)可以通過本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的常規(guī)修飾，即通過適當(dāng)保護干擾基團，通過換成其它常規(guī)試劑，或通過常規(guī)修飾反應(yīng)條件來成功地完成?？商娲?，本申請中公開的其它反應(yīng)或另外的常規(guī)反應(yīng)將適用于制備相應(yīng)的本發(fā)明化合物。在所有的制備方法中，所有的原料是已知的或可以容易地從已知原料制備。所有溫度用攝氏溫度表示并且除非另外說明，當(dāng)涉及收率時，所有的份數(shù)和百分比按重量計算，并且當(dāng)涉及溶劑和洗脫劑時，所有的份數(shù)按體積計算。所有試劑具有標(biāo)準(zhǔn)級，由Aldrich、Sigma等提供。質(zhì)子、碳和磷的核磁共振(1H-、13C-和31P-NMR)在Bruker NMR儀器上記錄，報告了從四甲基硅烷或磷酸往低磁場移動的化學(xué)位移(δ)。LC-MS質(zhì)譜用如下所述的儀器和設(shè)置條件獲得 GLP-1綴合物通常使用下面的HPLC系統(tǒng)分析 HPLC(方法A)RP-分析用安裝有Waters 996二極管陣列檢測器的Waters 2690系統(tǒng)實施。紫外檢測在218TP54 4.6 mm x 250 mm5μC-18二氧化硅柱(The Seperations Group，Hesperia)上于214、254、276和301 nm處收集，所述的二氧化硅柱在42℃下以1 ml/分鐘洗脫。該柱用使用4M硫酸調(diào)節(jié)至pH 2.5的10％的0.5 M硫酸銨平衡。注射后，在50分鐘期間，樣品用相同的含水緩沖液中0％至60％的乙腈梯度洗脫。
LC-MS(方法A)分析(電噴射)在安裝有二元泵、柱室、二極管陣列檢測器和單個四級桿(quadropole)的質(zhì)譜檢測器的HP1100MSD上實施。該分析在40℃下在Waters Xterra Ms C-18X3mm柱上完成，柱用含有0.01％TFA的10％含水乙腈-100％乙腈的線性梯度洗脫7.5分鐘。UV檢測是在210nm下并且MS掃描范圍是100-1000原子質(zhì)量單位。
LC-MS(方法B)在由Hewlett Packard系列1100 G1312A BinPump、Hewlett Packard系列1100柱室、Hewlett Packard系列1100G1315A DAD二極管陣列檢測器、Hewlett Packard系列1100 MSD和由HP Chemstation軟件控制的Sedere 75蒸發(fā)光散射檢測器組成的裝置上實施。該HPLC泵連接至兩個洗脫劑貯液器，該貯液器含有(A)在水中的10 mM NH4OH和(B)在90％乙腈中的10 mM NH4OH。該分析在23℃下，通過將適當(dāng)體積的樣品(優(yōu)選為20μl)注射至柱上，用A和B的梯度洗脫該柱來進行。使用的HPLC條件、檢測器設(shè)置和質(zhì)譜儀設(shè)置如下 柱Waters Xterra MS C-18X3mm內(nèi)徑5um 梯度 在6.5分鐘內(nèi)以1.5 ml/分鐘的5％-100％的乙腈線性梯度 檢測210nm(從DAD模擬輸出) ELS(從ELS模擬輸出) MS離子化模式API-ES。掃描100-1000原子質(zhì)量單位步長為0.1原子質(zhì)量單位 在下面實施例中顯示的一些NMR數(shù)據(jù)只是選擇的數(shù)據(jù)。
在下面的實施例中，下列術(shù)語將具有下面的通用含義 縮寫 AEEAc 氨基乙氧基乙氧基乙酰基 AcOEt乙酸乙酯 Ala丙氨酸 tBu叔丁基 Boc叔丁氧羰基 CDI羰基二咪唑 CH3CN乙腈 DBU1，8-二氮雜二環(huán)[5，4，0]十一-7-烯 DCM二氯甲烷，氯化亞甲基 Dde1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亞環(huán)己基)乙基 DIC二異丙基碳二亞胺 DIPEAN，N-二異丙基乙胺 DhbtOH3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮 DMAP4-二甲基氨基吡啶 DMFN，N-二甲甲酰胺 DMSO二甲亞砜 DTT二硫蘇糖醇 Et乙基 Et2O乙醚 EtOH乙醇 Fmoc9-芴甲氧羰基 H2O水 HBTU2-(1H-苯并三唑-1-基-)-1，1，3，3四甲基脲六氟磷酸鹽 HCl鹽酸 HOBt1-羥基苯并三唑 iVDde1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亞環(huán)己基)-3-甲基丁基 MeCN乙腈 MeOH甲醇 Mtt4-甲基三苯甲基 Mmt4-甲氧基三苯甲基 NMPN-甲基-2-吡咯烷酮 NEt3三乙胺 OtBu叔丁酯 Pmc2，2，5，7，8-五甲基-苯并二氫吡喃-6-磺?；? PhMe甲苯 Rf保持因子 Rt保留時間 r.t.室溫 SiO2硅膠 THF四氫呋喃 TFA三氟乙酸 TIS三異丙基硅烷 TLC薄層色譜法 Trt三苯甲基 TSTU2-琥珀酰亞氨基-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽 下面的非限制性實例說明了單體的合成和采用固相合成或液相合成的聚合技術(shù)。
一般合成方法和步驟 樹脂結(jié)合肽的合成。
受保護的肽基樹脂在Applied Biosystems 431A肽合成儀上以0.25mmol或1.0mmol的規(guī)模，用制造商提供的FastMoc UV方法，根據(jù)Fmoc策略合成，所述的FastMoc UV方法采用在NMP(N-甲基吡咯烷酮(pyrrolidone))中的HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基-)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽)或HATU(O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽)介導(dǎo)的偶聯(lián)，并紫外線監(jiān)控Fmoc保護基團的去保護。用于合成GLP-1肽酰胺的起始樹脂是Rink-Amide樹脂并且將Wang或氯三苯甲基樹脂用于具有羧基C-末端的GLP-1肽。除了非天然的氨基酸例如Fmoc-Aib-OH(Fmoc-氨基異丁酸)以外，使用的受保護的氨基酸衍生物是裝于適合于ABI433A合成儀中的預(yù)稱重藥筒中的標(biāo)準(zhǔn)Fmoc-氨基酸(由例如Anaspec或Novabiochem提供)。N端氨基酸是在α氨基處保護的Boc(例如，將Boc-His(Boc)OH用于N端具有His的肽)。將必須進一步衍生的賴氨酸的ε氨基用Mtt、Mmt、Dde、ivDde或Boc保護，這取決于連接白蛋白結(jié)合部分和間隔區(qū)的途徑。
支化聚合物和連接體至結(jié)合粗制樹脂的受保護的肽上的特定賴氨酸殘基的連接，通過在自動化合成過程中摻入Fmoc-Lys(Dde)-OH、Lys(ivDde)-OH、Lys(Mtt)-OH或Lys(Mmt)-OH，之后使用肼或TFA選擇性去保護，來在特定位置實施。
除去ivDde或Dde-保護的方法。將樹脂(0.25mmol)置于一個手動振蕩器/過濾裝置中并用N-甲基吡咯烷酮中的2％肼(20ml，2×12分鐘)處理以除去DDE基團并用N-甲基吡咯烷酮(4×20ml)洗滌。
除去Mtt或Mmt-保護的方法。
將樹脂(0.25mmol)置于手動振蕩器/過濾裝置中并用DCM中的2％TFA(20ml，5-10分鐘，重復(fù)6-12次)處理以除去Mtt或Mmt基團，并用DCM(2×20ml)、DCM中的10％MeOH和5％DIPEA(2×20ml)以及N-甲基吡咯烷酮(4×20ml)洗滌。
用于在樹脂上將支化聚合物連接至賴氨酸殘基的一般方法。
將支化聚合物(相對于樹脂結(jié)合的肽，4摩爾當(dāng)量)溶解于NMP/DCM(1∶1)中。加入羥基苯并三唑(HOBt)(相對于樹脂結(jié)合的肽，4摩爾當(dāng)量)和二異丙基碳二亞胺(相對于樹脂結(jié)合的肽，4摩爾當(dāng)量)并將溶液攪拌15分鐘。將該溶液加入樹脂中并加入二異丙基乙胺(相對于樹脂結(jié)合的肽，4摩爾當(dāng)量)。在室溫下?lián)u動樹脂24小時。將樹脂用NMP洗滌兩次，用NMP/DCM(1∶1)洗滌兩次并用DCM洗滌兩次。
用于將肽從樹脂上裂解的方法 通過在室溫下與三氟乙酸、水和三異丙基硅烷(95∶2.5∶2.5)的混合物攪拌180分鐘來將肽從樹脂上裂解。過濾裂解混合物并將濾液通過氮氣流濃縮為油狀物。用45ml乙醚從該油狀物中沉淀出粗的肽并用45ml乙醚洗滌3次。
使用下面描述的方法之一純化肽產(chǎn)物(除非在實施例中另外描述) 在基于TFA(酸)的溶劑系統(tǒng)中的制備型HPLC方法在填充有7μC-18硅石的20mmx250mm柱上，通過半制備型HPLC純化粗肽。干燥后，將所述的粗肽溶解于5ml 50％的乙酸H2O中，并用H2O稀釋至20ml并將其注射至柱上，隨后將該柱在40℃下于50分鐘內(nèi)用0.1％TFA中的40-60％的CH3CN梯度以10ml/分鐘洗脫。收集含有肽的級分。用水稀釋洗脫物后，凍干經(jīng)純化的肽。
在基于硫酸銨(堿性的)的溶劑系統(tǒng)中的制備型HPLC方法在填充有7μC-18硅石的20mmx250mm柱上，通過半制備型HPLC純化該粗肽。該柱用經(jīng)濃H2SO4調(diào)節(jié)至pH 2.5的0.05M(NH4)2SO4中的40％CH3CN平衡。干燥后，將粗肽溶解于5ml 50％的乙酸H2O中，并用H2O稀釋至20ml并注射至柱上，隨后在40℃下在50分鐘內(nèi)將該柱用pH2.5的0.05M(NH4)2SO4中的40-60％的CH3CN梯度以10ml/分鐘洗脫。收集含有肽的級分并用3體積的H2O稀釋，并且使其通過已經(jīng)用0.1％TFA平衡的Sep-PakC18藥筒(Waters part.#51910)。隨后用含有0.1％TFA的70％CH3CN將其洗脫，并在用水稀釋洗脫物后，通過低壓凍干來分離經(jīng)純化的肽。
獲得的終產(chǎn)物通過分析型RP-HPLC(保留時間)和LCMS進行表征。RP-HPLC分析用214nm處的UV檢測和在42℃下以1ml/分鐘洗脫的Vydac 218TP544.6mmx250mm 5μC-18硅石柱(TheSeparations Group，Hesperia，USA)進行。使用兩種不同的洗脫條件 A1在由0.1M(NH4)2SO4組成的緩沖液中平衡該柱，并通過相同緩沖液中的0％-60％的CH3CN梯度洗脫50分鐘，其中將所述的(NH4)2SO4溶液用濃H2SO4調(diào)節(jié)至pH 2.5。
B1用0.1％TFA/H2O平衡該柱并用0％CH3CN/0.1％TFA/H2O至60％CH3CN/0.1％TFA/H2O的梯度洗脫50分鐘。
B6用0.1％TFA/H2O平衡該柱并用0％CH3CN/0.1％TFA/H2O至90％CH3CN/0.1％TFA/H2O的梯度洗脫50分鐘。單體結(jié)構(gòu)單元和連接體的合成 實施例l 2-[2-(2-氯乙氧基)乙氧甲基]環(huán)氧乙烷
將2-(2-氯乙氧基)乙醇(100.00g；0.802mol)溶解于二氯甲烷(100ml)中并加入催化量的醚合三氟化硼(2.28g；16mmol)。將該澄清溶液冷卻至0℃，并逐滴加入表溴醇(104.46g；0.762mol)，維持溫度在0℃。將該澄清溶液在0℃下另外攪拌3小時，然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。從乙腈中蒸發(fā)剩余的油狀物一次，得到粗的1-溴-3-[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]丙-2-醇，將其再溶解于THF(500ml)中。然后加入粉狀的叔丁醇鉀(85.0g；0.765mmol)，并且將混合物加熱至回流30分鐘。通過過濾除去未溶解的鹽，并在真空中濃縮濾液產(chǎn)生澄清的黃色油狀物。將該油狀物通過真空蒸餾進一步純化，以產(chǎn)生56.13g(41％)純的標(biāo)題物質(zhì)。
bp＝65-75℃(0.65mbar)。1H-NMR(CDCl3)δ＝2.61ppm(m，1H)；2.70(m，1H)；3.17(m，1H)；3.43(dd，1H)；3.60-3.85(m，9H)。13C-NMR(CDCl3)δ＝42.73ppm；44.18；50.80；70.64&70.69(可能塌縮)；71.37；72.65。
實施例2 1，3-雙[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]丙-2-醇
將2-[2-(2-氯乙氧基)乙氧甲基]環(huán)氧乙烷(2.20g；12.2mmol)溶解于DCM(20ml)中，并且加入2-(2-氯乙氧基)乙醇(1.52g；12.2mol)。將混合物冷卻至0℃并加入催化量的醚合三氟化硼(0.2ml；1.5mmol)。在0℃下攪拌該混合物2小時，然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。通過從乙腈中共蒸發(fā)兩次除去醚合三氟化硼殘留物。通過kuglerohr蒸餾純化因此獲得的油狀物。得到2.10g(45％)收率的澄清粘性油狀物的標(biāo)題物質(zhì)。bp.＝270℃，0.25mbar。1H-NMR(CDCl3)δ＝3.31(bs，1H)；3.55ppm(ddd，4H)；3.65-3.72(m，12H)；3.75(t，4H)；3.90(m，1H)。13C-NMR(CDCl3)δ＝43.12ppm；69.92；70.95；71.11；71.69；72.69。
實施例3 1，3-雙[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-醇
將1，3-雙[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]丙-2-醇(250mg；0.81mmol)溶解于DMF(2.5ml)中，并加入疊氮化鈉(200mg；3.10mmol)和碘化鈉(100mg；0.66mmol)。將該懸浮液加熱至100℃(內(nèi)部溫度)過夜。然后將混合物冷卻并過濾。將濾液處理至干燥，并將半結(jié)晶油狀物再懸浮于DCM(5ml)中。通過過濾除去不溶解的鹽；將濾液蒸發(fā)至干燥產(chǎn)生純的標(biāo)題物質(zhì)，為無色油狀物。收率210mg(84％)。1H-NMR(CDCl3)δ＝3.48ppm(t，4H)；3.60-3.75(m，16H)；4.08(m，1H)。13C-NMR(CDCl3)δ＝51.05ppm；69.10；70.24；70.53；70.78；71.37。LC-MSm/e＝319(M+1)+；341(M+Na)+；291(M-N2)+。Rt＝2.78分鐘。
實施例4 1，3-雙[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-基-對硝基苯基碳酸酯
將1，3-雙[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-醇(2.00g；6.6mmol)溶解于THF(50ml)中并加入二異丙基乙胺(10ml)。然后加入4-二甲基氨基吡啶(1.60g；13.1mmol)和對硝基苯基氯甲酸酯(2.64g；13.1mmol)至該澄清的黃色溶液中并在環(huán)境溫度下攪拌。沉淀物迅速形成。將該懸浮液在室溫下攪拌5小時，然后將其過濾并在真空中濃縮。將殘余物通過使用乙酸乙酯-庚烷-三乙胺(40/60/2)作為洗脫劑的色譜法進一步純化。獲得500mg(16％)收率的澄清黃色油狀物的產(chǎn)物。1H-NMR(CDCl3)δ＝3.38ppm(t，4H)；3.60-3.72(m，12H)；3.76(m，4H)；5.12(q，1H)；7.41(d，2H)；8.28(d，2H)。LC-MSm/e＝506(M+Na)+；456(M-N2)，Rt＝4.41分鐘。
實施例5 1，3-雙[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氯甲酸酯
將三氯乙酰氯(1.42g，7.85mmol)溶解于THF(10ml)中，并將該溶液冷卻至0℃。10分鐘內(nèi)緩慢逐滴加入THF(5ml)中的1，3-雙[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-醇(1.00g；3.3mmol)和三乙胺(0.32g，3.3mmol)溶液。移除冷浴，并在環(huán)境溫度下攪拌得到的懸浮液6小時。過濾該混合物，并蒸發(fā)濾液產(chǎn)生淺褐色油狀物。蒸發(fā)后，用乙腈處理油狀物兩次，并在沒有進一步純化下使用該產(chǎn)物。
1H-NMR(CDCl3)δ＝3.40(t，4H)；3.55-3.71(m，12H)；3.75(d，4H)；5.28(m，1H)。
實施例6 2-(1，3-雙[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸
用庚烷洗滌氫化鈉(7.50g；80％油懸浮液)三次，并然后再懸浮于無水THF(100ml)中。隨后在室溫下于30分鐘內(nèi)緩慢加入無水THF(100ml)中的1，3-雙[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-醇(10.00g；33.0mmol)溶液。然后20分鐘內(nèi)逐滴加入THF(100ml)中的溴乙酸(6.50mg；47mmol)溶液。-＞輕微放熱。形成米色的懸浮液。在環(huán)境溫度下攪拌該混合物過夜。通過加入水(20ml)小心地廢除過量的氫化鈉，同時冷卻混合物。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使懸浮液至干燥，并讓剩余物在DCM和水之間分配。用DCM萃取水相兩次，隨后通過加入乙酸(25ml)將其酸化。隨后用DCM萃取水相兩次，并且在硫酸鈉上干燥合并的有機相，并蒸發(fā)至干燥。這時剩余的油狀物含有標(biāo)題物質(zhì)以及溴乙酸。后者通過將該油狀物再溶解于含有哌啶(5ml)的DCM(50ml)中；攪拌30分鐘，并然后用1N含水HCl洗滌有機溶液三次(3×)。隨后在干燥(Na2SO4)和蒸發(fā)溶劑后，獲得純的標(biāo)題物質(zhì)。收率7.54g(63％)。
1H-NMR(CDCl3)δ＝3.48ppm(t，4H)；3.55-3.80(m，16H)；4.28(s，2H)；4.30(m，1H)；8.50(bs，1H)。13C-NMR(CDCl3)δ＝51.04ppm；69.24；70.50；70.72；71.39；71.57；80.76；172.68。LC-MSm/e＝399(M+Na)+；349(M-N2)。Rt＝2.34分鐘。
實施例7 咪唑-1-羧酸1，3-雙(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)丙-2-基酯
將1，3-雙[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-醇(1.00g；3.3mmol)溶解于DCM(5ml)中并加入羰基二咪唑(1.18g，6.3mmol)。在室溫下攪拌該混合物2小時。除去溶劑并將殘留物溶解于甲醇(20ml)中并攪拌20分鐘。除去溶劑并通過用DCM中的2％MeOH作為洗脫劑的硅石柱色譜法進一步純化因此獲得的澄清油狀物。收率372.4mg(35％)。1H-NMR(CDCl3)δ＝3.33(t，4H)；3.60-3.75(m，12H)；3.80(d，4H)；5.35(m，1H)；7.06(s，1H)；7.43(s，1H)；8.16(s，1H)。LC-MSm/e＝413(M+1)。Rt＝2.35分鐘。
實施例8 2-(1，3-雙[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸叔丁酯
將2-(1，3-雙[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸(5.0g；13.28mmol)溶解于甲苯(20ml)中，并且在惰性氣氛下將反應(yīng)混合物加熱至回流。然后30分鐘內(nèi)逐滴加入N，N-二甲基甲酰胺-二-叔丁基乙縮醛(13ml；54.21mmol)。繼續(xù)回流24小時。隨后通過硅藻土(Celite)過濾暗褐色溶液。在真空下除去溶劑，并通過用3％甲醇二氯甲烷作為洗脫劑的硅石急驟色譜法純化油狀殘留物。合并純的級分并蒸發(fā)至干燥。得到黃色澄清油狀物的標(biāo)題物質(zhì)。收率5.07g(88％)。1H-NMR(CDCl3)δ＝1.42ppm(s，9H)；3.35(t，4H)；3.54-3.69(m，16H)；3.75-3.85(m，1H)；4.16(s，2H)。13C-NMR(CDCl3，選擇的峰)δ＝30.35ppm；52.93；70.65；72.25；73.12；73.90；80.44；83.55；172.28。TLC在乙酸乙酯-庚烷(1∶1)中Rf＝0.33。
實施例9 2-(1，3-雙[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸叔丁酯
將2-(1，3-雙[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸叔丁酯(5.97g，11.7mmol)溶解于乙醇-水(25ml；2∶1)中，并且加入醋酸(5ml)，之后加入阮丙鎳(Raney-Nickel)的含水懸浮液(5ml)。隨后在3大氣壓下用Parr儀器氫化該混合物16小時。然后通過過濾除去催化劑，并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使反應(yīng)混合物至干燥。將油狀殘留物溶解于水中并將其冷凍干燥產(chǎn)生定量收率的標(biāo)題物質(zhì)。1H-NMR(CDCl3)δ＝1.45ppm(s，9H)；3.15(bs，4H)；3.48-3.89(寬峰m，17H)；4.15(s，2H)。13C-NMR(CDCl3，選擇的峰)δ＝28.44ppm；39.81；68.17；70.58；70.79；70.99；78.81；82.31；170.59。
實施例10 2-(1，3-雙[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸
將2-(1，3-雙[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸(1.00g；2.65mmol)溶解于1N含水鹽酸(10ml)中并加入5％炭上鈀(palladiumon carbon)的50％含水懸浮液(1ml)。在3.5大氣壓用Parr儀器氫化該混合物。在一小時后終止反應(yīng)，并且通過過濾除去催化劑。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，并從乙腈中蒸發(fā)殘留物兩次。收率930mg(88％)。1H-NMR(D2O)δ＝3.11ppm(t，4H)；3.53-3.68(m，16H)；3.80(m，1H)；4.25(s，2H)。13C-NMR(D2O)δ＝38.18ppm.；65.43；66.09；68.55；69.13；69.23；77.18；173.42。
實施例11 2-(1，3-雙[2-(2-{9-芴甲氧羰基氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸
將2-(1，3-雙[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸(9.35g；28.8mmol)加入DIPEA(10ml；57mmol)中。在冰浴上冷卻該反應(yīng)混合物，并逐滴加入溶解于DCM(50ml)中的三甲基氯硅烷(15ml；118mmol)，之后加入DIPEA(11ml；62.7mmol)。將DCM(50ml)中的Fmoc-Cl(15.0g；57mmol)溶液逐滴加入至幾乎澄清的該溶液中。攪拌反應(yīng)混合物過夜，隨后用DCM(500ml)稀釋并將其加入至0.01N HCl水溶液(500ml)中。分離有機層；用水(3×200ml)洗滌并在無水硫酸鈉上干燥。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。通過用乙酸乙酯-庚烷(1∶1)作為洗脫劑的硅石急驟色譜法純化粗產(chǎn)物。收集純的級分并干燥產(chǎn)生9.20g(42％)標(biāo)題物質(zhì)。
1H-NMR(D2O)δ＝3.34ppm(t，4H)；3.45-3.65(m，16H)；3.69(bs，1H)；4.20(t，2H)；4.26(s，2H)；4.38(d，4H)；5.60(t，2H)；7.30(t，4H)；3.35(t，4H)；7.58(d，4H)；7.72(d，4H)。13C-NMR(D2O；選擇的峰)δ＝21.20ppm.；30.75；34.64；67.66；68.90；70.38；70.51；80.02；120.37；125.54；127.48；128.09；128.67；136.27；141.69；173.63；176.80。
實施例12 2-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]乙醇
將二甲基甲酰胺(250ml)中的2-(2-(-2-氯乙氧基)乙氧基)乙醇(25.0g，148mmol)和疊氮化納(14.5g，222mmol)的漿液保持在100℃過夜。在冰浴上冷卻該反應(yīng)混合物，過濾并在真空中蒸發(fā)有機溶劑。將殘留物溶解于二氯甲烷(200ml)中，用水(75ml)洗滌，用另外的二氯甲烷(75ml)萃取水相，并用硫酸鎂(MgSO4)干燥合并的有機相，將其過濾并在真空中蒸發(fā)，產(chǎn)生油狀物，其無需進一步純化而使用。收率30.0g(100％)。13C-NMR(CDCl3)δ＝72.53；70.66-70.05；61.74；50.65 實施例13 (2-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙酸
將上面的2-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]乙醇(26g，148mmol)溶解于四氫呋喃(100ml)中并且在氮氣氣氛下緩慢加入至冰冷的四氫呋喃(250ml)中的氫化鈉漿液(24g，593mmol，60％于油中)(其預(yù)先已經(jīng)用庚烷(2×100ml)洗滌)中。將反應(yīng)混合物保持40分鐘。然后將其在冰浴上冷卻，之后緩慢加入溶解于四氫呋喃(150ml)中的溴乙酸(31g，223mmol)中并隨后在RT下保持約3小時。在真空中蒸發(fā)有機溶劑。將殘留物懸浮于二氯甲烷(400ml)中。當(dāng)在機械攪拌下保持該混合物30分鐘后，緩慢加入水(100ml)。將水相分離，用鹽酸(4N)酸化并用二氯甲烷(2×75ml)萃取。在真空中蒸發(fā)所有合并的有機相得到黃色的油狀物。將二氯甲烷(250ml)中的哌啶溶液(37ml，371mmol)緩慢加入至該油狀物中，在機械攪拌下保持該混合物1小時。將該澄清溶液用二氯甲烷(100ml)稀釋并用鹽酸(4N，2×100ml)洗滌。用額外的二氯甲烷(2×75ml)萃取水相并且在真空中蒸發(fā)合并的有機相，得到無需進一步純化而使用的黃色油狀物。收率27.0g(66％)。13C-NMR(CDCl3)δ＝173.30；71.36；70.66-70.05；68.65；50.65 實施例14 (S)-2，6-雙-(2-{2-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)己酸甲酯
將上面的(2-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙酸(13g，46.9mol)溶解于二氯甲烷(100ml)中。加入N-羥基琥珀酰亞胺(6.5g，56.3mmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基碳二亞胺鹽酸鹽(10.8g，56.3mmol)并且將反應(yīng)混合物保持1小時。加入二異丙基乙胺(39ml，234mmol)和L-賴氨酸甲酯二鹽酸鹽(6.0g，25.8mmol)并且將反應(yīng)混合物保持16小時。將反應(yīng)混合物用二氯甲烷(300ml)稀釋，用水(100ml)、鹽酸鹽(2N，2×100ml)、水(100ml)、50％飽和的碳酸氫鈉(100ml)和水(2×100ml)萃取。將有機相用硫酸鎂干燥、過濾并在真空中蒸發(fā)，得到無需進一步純化而使用的油狀物。收率11g(73％)。LCMSm/z＝591。13C-NMR(CDCl3)(選擇的)δ＝172.48；169.87；169.84；71.093-70.02；53.51；52.34；51.35；50.64；38.48；36.48；31.99；31.40；29.13；22.82。
實施例15 (S)-2，6-雙-(2-{2-[2-(2-叔丁氧羰基氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)己酸甲酯
將二碳酸二叔丁酯(0.9g，4.24mmol)和10％的Pd/C(0.35g)加入至乙酸乙酯(15ml)中的上面的(S)-2，6-雙-(2-{2-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)己酸甲酯(1.0g，1.7mmol)溶液中。然后將氫氣持續(xù)通入該溶液中鼓泡3小時。將反應(yīng)混合物過濾并在真空中除去有機溶劑。通過用乙酸乙酯/甲醇9∶1作為洗脫劑的急驟色譜法純化殘留物。合并含有產(chǎn)物的級分并在真空中除去有機溶劑得到油狀物。收率0.60g(50％)。LC-MSm/z＝739(M+1)。
實施例16 (S)-2，6-雙-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)己酸甲酯
將上面的(S)-2，6-雙-(2-{2-[2-(2-叔丁氧羰基氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)己酸甲酯(0.6g，0.81mmol)溶解于二氯甲烷中(5ml)。加入三氟乙酸(5ml)并將反應(yīng)混合物保持約1小時。將反應(yīng)混合物在真空中蒸發(fā)，得到無需進一步純化而使用的油狀物。收率0.437g(100％)。LC-MS m/z＝539(M+1) 實施例17 (S)-2，6-雙-(2-{2-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)己酸
將氫氧化鈉(4N，1.8ml，6.94mmol)加入至甲醇(10ml)中的上面的(S)-2，6-雙-(2-{2-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)己酸甲酯(2.0g，3.47mmol)溶液中并將該反應(yīng)混合物保持2小時。將有機溶劑在真空中蒸發(fā)，并且將殘留物溶解于水(45ml)中并用鹽酸(4N)酸化。用二氯甲烷(150ml)萃取混合物，將其用飽和的含水氯化鈉(2×25ml)洗滌。將有機相在硫酸鎂上干燥，過濾并在真空中蒸發(fā)，得到油狀物。LC-MS m/z＝577(M+1)。
實施例18 N-(叔丁氧羰基氨基氧基丁基)鄰苯二甲酰亞胺
將DBU(15.0ml，101mmol)分幾份加入至N-(4-溴丁基)鄰苯二甲酰亞胺(18.9g，67.0mmol)、MeCN(14ml)和N-Boc-羥胺(12.7g，95.4mmol)的攪拌混合物中。在50℃下攪拌得到的混合物24小時。加入水(300ml)和12M的HCl(10ml)，并且用AcOEt萃取產(chǎn)物三次。將合并的萃取物用鹽水洗滌、干燥(MgSO4)，并在減壓下濃縮。通過色譜法(140g SiO2，用庚烷/AcOEt梯度洗脫)純化得到油狀物形式的17.9g(80％)標(biāo)題化合物。1H NMR(DMSO-d6)δ＝1.36(s，9H)，1.50(m，2H)，1.67(m，2H)，3.58(t.J＝7Hz，2H)，3.68(t，J＝7Hz，2H)，7.85(m，4H)，9.90(s，1H)。
實施例19 4-(叔丁氧羰基氨基氧基)丁胺
將水合肼(20ml)加入至EtOH(10ml)中的N-(叔丁氧羰基氨基氧基丁基)鄰苯二甲酰亞胺(8.35g，25.0mmol)溶液中，并且在80℃下攪拌該混合物38小時。將混合物濃縮并且將殘留物與EtOH和PhMe共蒸發(fā)。將EtOH(50ml)加入至殘留物中，并將沉淀的鄰苯二甲酰肼濾出并用EtOH(50ml)洗滌。將合并的濾出液濃縮產(chǎn)生5.08g油狀物。將該油狀物與水(20ml)中的K2CO3(10g)溶液混合，并且將產(chǎn)物用DCM萃取。干燥(MgSO4)并濃縮產(chǎn)生2.28g(45％)油狀物形式的標(biāo)題化合物，其無需進一步純化而使用。1H NMR(DMSO-d6)δ＝1.38(m，2H)，1.39(s，9H)，1.51(m，2H)，2.51(t，J＝7Hz，2H)，3.66(t，J＝7Hz，2H)。
實施例20 2-(1，3-雙[2-(2-羥基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸叔丁酯
將1，3-雙[2-(2-三苯甲基氧基乙氧基)乙氧基]丙-2-醇(0.3g，0.40mmol)從無水吡啶中蒸發(fā)一次并從無水乙腈中蒸發(fā)一次。在氮氣下，將殘留物溶解于無水DMF(2ml)中，加入60％NaH-油懸浮液(24mg，0.6mmol)。在室溫下攪拌該混合物15分鐘。加入溴乙酸叔丁酯(0.07mL，0.48mmol)并將混合物另外攪拌60分鐘。用冰焠滅反應(yīng)，然后在乙醚(100mL)和水(100mL)之間分配。將有機相收集、干燥(Na2SO4)，并且在真空中除去溶劑以產(chǎn)生油狀物，將其用EtOAc/庚烷/Et3N(49∶50∶1)在硅膠柱上洗脫。收集含有主要產(chǎn)物的級分。在真空中除去溶劑并且將殘留物溶解于80％的含水乙酸(5mL)中，并在室溫下攪拌過夜。在真空中除去溶劑并且將粗物質(zhì)溶解于乙醚(25mL)中，并用水(2×5mL)洗滌。收集水相并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去水產(chǎn)生63mg的標(biāo)題化合物。1H NMR(CDCl3)δ＝4.19(s，2H)，3.78-3.55(m，21H)，1.49(s，9H)。
實施例21 N，N-雙(2-(2-苯二甲酰亞氨基乙氧基)乙基)-O-氨基甲酸叔丁酯
將N，N-雙(2-羥乙基)-O-氨基甲酸叔丁酯溶解于極性的，非質(zhì)子溶劑例如THF或DMF中。緩慢加入氫化鈉(礦物油中的60％懸浮液)至該溶液中。攪拌混合物3小時。加入N-(2-溴乙基)鄰苯二甲酰亞胺。攪拌該混合物直到反應(yīng)結(jié)束。通過緩慢加入甲醇焠滅反應(yīng)。加入乙酸乙酯。用含水碳酸氫鈉洗滌該溶液。將有機相干燥、過濾，并隨后在真空下盡可能地濃縮。將粗化合物通過標(biāo)準(zhǔn)的柱色譜法純化。
實施例22 N，N-雙(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-O-氨基甲酸叔丁酯
將N，N-雙(2-(2-苯二甲酰亞氨基乙氧基)乙基)-O-氨基甲酸叔丁酯溶解于極性溶劑例如乙醇中。加入肼(或已知可除去鄰苯二甲酰保護基的另一種試劑)。在室溫(或者如果需要則在提高的溫度)下攪拌該混合物直到反應(yīng)結(jié)束。將混合物在真空下盡可能地濃縮。將粗化合物通過標(biāo)準(zhǔn)的柱色譜法純化，或者如果需要通過真空蒸餾純化。
實施例23 N，N-雙(2-(2-芐氧基羰基氨基乙氧基)乙基)-O-氨基甲酸叔丁酯
將N，N-雙(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-O-氨基甲酸叔丁酯溶解于含水氫氧化鈉和THF的混合物或含水氫氧化鈉和乙腈的混合物中。加入芐氧基氯甲酸酯。在室溫下攪拌該混合物直到反應(yīng)結(jié)束。如果需要，在真空中減少體積。加入乙酸乙酯。用鹽水洗滌有機相。將有機相干燥、過濾，并隨后在真空中盡可能地濃縮。將粗化合物通過標(biāo)準(zhǔn)的柱色譜法純化。
實施例24 雙(2-(2-鄰苯二甲酰亞氨基乙氧基)乙基)胺
將雙(2-(2-鄰苯二甲酰亞氨基乙氧基)乙基)-氨基甲酸叔丁酯溶解于三氟乙酸中。在室溫下攪拌該混合物直到反應(yīng)結(jié)束。將混合物在真空中盡可能地濃縮。將粗化合物通過標(biāo)準(zhǔn)的柱色譜法純化。
實施例25 11-氧代-17-鄰苯二甲酰亞氨基-12-(2-(2-鄰苯二甲酰亞氨基乙氧基)乙基)-3，6，9，15-四氧雜-12-氮雜十七烷酸
將3，6，9-三氧雜十一烷酸溶解于二氯甲烷中。加入碳二亞胺(例如N，N-二環(huán)己基碳二亞胺或N，N-二異丙基碳二亞胺)。在室溫下攪拌該溶液過夜。過濾該混合物。如果需要，可以在真空中濃縮濾液。胺與形成的分子內(nèi)酐的?；瘡奈墨I中已知(例如，Cook，R.M.；Adams，J.H.；Hudson，D.Tetrahedron Lett.，1994，35，6777-6780或Stora，T.；Dienes，Z.；Vogel，H.；Duschl，C.Langmuir 2000，16，5471-5478)。將酐與非質(zhì)子溶劑例如二氯甲烷或N，N-二甲基甲酰胺中的雙(2-(2-鄰苯二甲酰亞氨基乙氧基)乙基)胺溶液混合。攪拌該混合物直到反應(yīng)結(jié)束。將粗化合物通過萃取并隨后通過標(biāo)準(zhǔn)的柱色譜法而純化。
實施例26 5-氧代-11-鄰苯二甲酰亞氨基-6-(2-(2-鄰苯二甲酰亞氨基乙氧基)乙基)-3，9-二氧雜-6-氮雜十一烷酸
將非質(zhì)子溶劑例如二氯甲烷或N，N-二甲基甲酰胺中的二甘醇酐溶液逐滴加入至非質(zhì)子溶劑例如二氯甲烷或N，N-二甲基甲酰胺中的雙(2-(2-鄰苯二甲酰亞氨基乙氧基)乙基)胺溶液中。攪拌該混合物直到反應(yīng)結(jié)束。將粗化合物通過萃取并隨后通過標(biāo)準(zhǔn)的柱色譜法而純化。
實施例27 乙酸雙-[2-(1，3-二氧代-1，3-二氫異吲哚-2-基)乙基]銨
將二亞乙基三胺(15.8ml，145.4mmol)緩慢加入至冰醋酸(175ml)中，同時將其在冰浴上冷卻。加入鄰苯二甲酸酐(43.1g，290.8mmol)。將得到的混合物回流20小時。冷卻該溶液。在真空中濃縮混合物。將得到的粘性油狀物從乙腈中共蒸發(fā)3次。將油狀物與乙腈(250ml)混合并且將該混合物加熱至短暫回流。將溶液保持在冷藏箱中過夜。通過過濾分離形成的晶體。將分離的明黃色晶體在真空烘箱中干燥。
收率33.5g，63％。
另外的材料可以通過在濃縮(真空中)后使濾液結(jié)晶而獲得。
1H-NMR(d6-DMSO)7.81-7.74(m，8H)，3.60(t，J＝6.32Hz，4H)，3.70-3.20(b，15H)，2.76(t，J＝6.32Hz，4H)，1.91(s，5H可能存在殘留的乙酸)。
13C-NMR(d6-DMSO)δ168.3，146.0，134.5，132.0，123.2，46.5，37.5-也觀察到由乙腈和乙酸產(chǎn)生的小峰。
LC-MS(ES-正模式)，m/z364 實施例28 2-[2-({雙-[2-(1，3-二氧代-1，3-二氫異吲哚-2-基)乙基]氨甲?；鶀甲氧基)乙氧基]-乙氧基}乙酸
將3，6，9-三氧雜十一烷二酸(Trioxaununcandioic acid)(2.67g，12mmol)和N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(2.48g，12mmol)在二氯甲烷(90ml)中混合。將得到的混合物攪拌30分鐘。過濾該混合物并隨后在真空中濃縮。將形成的化合物溶解于二氯甲烷(250ml)中。將雙-[2-(1，3-二氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-乙基]-乙酸銨(4.0g，9.45mmol)和N，N，N’，N’-四甲基胍(1.15g，10.0mmol)加入至該溶液中。將得到的混合物攪拌至少20小時。在真空中濃縮該混合物。加入乙酸乙酯(150ml)和含水碳酸氫鈉(5％w/w，150ml)。分離相。將濃鹽酸加入至水相中直到pH為1-2。用二氯甲烷(4×100ml)萃取該溶液。將合并的有機萃取物在硫酸鎂上干燥、過濾，并在真空中濃縮以產(chǎn)生明黃色漿液。
收率2.55g，48％ 1H-NMR(CDCl3)δ7.86-7.69(m，8H)，4.17(s，2H)，4.09(s，2H)，3.94-3.51(數(shù)個多重峰，16H)。
13C-NMR(CDCl3)δ172.2，170.4，168.3，168.0，134.4，134.0，132.0，131.7，123.6，123.4，71.3，70.5，70.4，70.3，69.2，69.0，44.6，44.0，35.7，35.4 LC-MS(ES-正模式)，m/z568[M+H]+和591[M+Na]+ 實施例29 ({雙-[2-(1，3-二氧代-1，3-二氫異吲哚-2-基)乙基]氨甲?；鶀甲氧基)乙酸
將乙酸雙-[2-(1，3-二氧代-1，3-二氫異吲哚-2-基)乙基]銨(25.8g，60.9mmol)懸浮于DCM(100ml)中。加入N，N，N’，N’-四甲基胍(7.00g，60.9mmol)，之后出現(xiàn)大量沉淀。加入另外的二氯甲烷(50ml)。將二甘醇酐(8.48g，73.0mmol)以一份加入。將該混合物攪拌至少20小時。在真空中濃縮該混合物。將得到的漿液溶解于乙酸乙酯(750ml)和飽和的含水碳酸氫鈉(750ml)的混合物中。有機相用飽和的含水碳酸氫鈉(2×200ml)萃取。將合并的水相用濃鹽酸酸化(pH1-2)-產(chǎn)生大量的白色固體沉淀。用二氯甲烷(400和2×200ml)萃取合并的水相。將有機相在硫酸鎂上干燥并過濾。在真空中濃縮有機相至約200ml，之后將其再次過濾。在過濾和濃縮過程中出現(xiàn)進一步的沉淀。蒸發(fā)濾出液得到白色固體。
收率6.04g 1H-NMR(d6-DMSO)δ12.65(b，1H)，7.89-7.80(m，8H)，4.08(s，2H)，3.81-3.75(m，6H)，3.59-3.50(m，4H)。
13C-NMR(CDCl3)δ171.4，169.4，168.3，168.1，134.9，134.7，131.9，131.8，123.5，123.3，68.4，67.4，44.3，43.5，35.9，35.5 LC-MS(ES-正模式)，m/z480[M+H]+ 實施例30 碳酸芐基苯酯
根據(jù)Pittelkow，M.；Lewinsky，R.；以及Christensen，J.B.Synthesis 2002，15，2195-2202。
將氯甲酸苯酯(54.1g，500mmol)逐滴加入至具有冷凝器和添加漏斗的1l燒瓶中的苯甲醇(78.3g，500mmol)、二氯甲烷(90ml)和吡啶(50ml)的混合物中。將該混合物攪拌1小時。加入水(125ml)。分離相。用稀硫酸(2M，2×125ml)洗滌有機相。在最后的洗滌中必須加入鹽水以便達到好的分離。將有機相在硫酸鈉上干燥、過濾，并在真空中濃縮。將粗化合物真空蒸餾以產(chǎn)生無色液體。
收率104.3g(91％)。
1H-NMR(CDCl3)δ7.46-7.17(2個多重峰，10H)，5.27(s，2H) 13C-NMR(CDCl3)δ152.5，149.9，133.5，128.3，127.6，127.5.127.3，124.8，119.8，69.1 實施例31 氯化雙-(2-芐氧基羰基氨基乙基)銨
根據(jù)Pittelkow，M.；Lewinsky，R.；以及Christensen，J.B.Synthesis 2002，15，2195-2202。
將碳酸芐基苯酯(25.1g，110mmol)逐滴加入至二氯甲烷(100ml)中的二亞乙基三胺(5.16g，50mmol)溶液中。將該混合物攪拌至少20小時。用磷酸鹽緩沖液(0.025M K2HPO4、0.025M NaH2PO4，2000ml，用2M硫酸調(diào)節(jié)pH至3)洗滌有機相。將有機相在硫酸鈉上干燥、過濾，并在真空中濃縮。
收率25.2g 將一份(5g)的粗油狀物與鹽酸(2M，15ml)混合。攪拌該混合物15分鐘。將混合物過濾。將分離的固體與無水乙醇(600ml)混合。讓該混合物達到回流。傾析沸騰的混合物以便除去不溶解的雜質(zhì)。在5℃下使該化合物結(jié)晶過夜。
收率2.84g(白色晶體) 1H-NMR(d6-DMSO)δ8.96(b，2H)，7.51(t，J＝5.56Hz，2H)，7.40-7.30(b，10H)，5，04(s，4H)，3.33(q，J＝6.06Hz，4H)，3.00(b，4H) 13C-NMR(d6-DMSO)δ156.6，137.2，128.7，128.3，128.2，66.0，46.8.37.1 LC-MS(ES-正模式)，m/z372.5[M+H]+ 實施例32 [2-(2-{[雙-(2-芐氧基羰基氨基乙基)氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙氧基]乙酸
將3，6，9-三氧雜十一烷二酸(1.83g，8.3mmol)和N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(1.70g，8.3mmol)在二氯甲烷(10ml)中混合。將得到的混合物攪拌30分鐘。過濾該混合物并隨后在真空中濃縮。將形成的化合物與N，N-二甲基甲酰胺(27ml)中的氯化雙-(2-芐氧基羰基氨基乙基)銨(2.8g，6.87mmol)和N，N，N’，N’-四甲基胍(791mg，6.87mmol)(250ml)混合。將得到的混合物攪拌20小時。在真空中濃縮該混合物。加入乙酸乙酯(150ml)和含水的碳酸氫鈉(5％w/w，150ml)。分離相。用含水的碳酸氫鈉(5％w/w，2×100ml)萃取有機相。將合并的含水萃取物與乙酸乙酯(200ml)混合。將濃鹽酸加入至該混合物中直到pH為2-3。立即分離相。用乙酸乙酯(2×200ml)萃取水相。將合并的萃取物用硫酸鎂干燥、過濾，并在真空中濃縮產(chǎn)生無色漿液。
收率2.17g，55％。
1H-NMR(CDCl3)δ10.2(b，1H)，7.31(b，10H)，6.10(b，1H)，5.84(b，1H)，5.06(s，2H)，5.04(s，2H)，4.17-4.09(m，4H)，3.72-3.22(數(shù)個多重峰，16H) 13C-NMR(CDCl3)δ172.9，171.2，157.3，137.0，128.9-128.4(數(shù)個信號)，71.3，70.8，70.7，70.3，68.9，67.1，67.0，47.5，46.0，39.6 LC-MS(ES-正模式)，m/z576[M+H]+ 實施例33 [2-(2-{[雙-(2-氨乙基)氨甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙氧基]乙酸
將[2-(2-{[雙-(2-芐氧基羰基氨基乙基)氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙氧基]乙酸(725mg，1.26mmol)溶解于甲醇(50ml)中。加入活性炭上的鈀(150mg，5％Pd，濕的，Degussa催化劑類型E101 NO/W)。在氫氣氣氛下攪拌該混合物20小時。過濾混合物。在真空中濃縮濾液。
LC-MS(ES-正-模式)，m/z309[M+H]+，291[M-H2O]+ 實施例34 [2-(2-{[雙-(2-芐氧基羰基氨基乙基)氨甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙氧基]乙酸2，5-二氧吡咯烷-1-基酯
將[2-(2-{[雙-(2-芐氧基羰基氨基乙基)氨甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙氧基]乙酸(1.45g，2.52mmol)與N-羥基丁二酰亞胺(291mg，2.53mmol)、1-乙基-3-(3′-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(485mg，2.53mmol)和N，N，N′，N′-四甲基胍(291mg，2.53mmol)混合。攪拌該混合物20小時。加入含水的硫酸氫鈉(5％w/w，150ml)和二氯甲烷(100ml)。分離相。用二氯甲烷(2×100和2×50ml)萃取水相。將合并的有機相在固體硫酸鈉上干燥、過濾，并在真空中濃縮。
LC-MS(ES-正模式)，m/z674[M+H]+，577(未反應(yīng)的原料)。
實施例35 1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮-3-基2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸酯
將3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(10.0g；61.3mmol)和2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸(10.9g；61.3mmol)懸浮于DCM(125ml)中并加入DIC(7，7g；61.3mmol)。在環(huán)境溫度下于干燥氣氛中攪拌該混合物過夜。形成二異丙基脲沉淀物，將其濾出。將有機溶液用含水的飽和碳酸氫鈉溶液充分洗滌，隨后在真空中干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)，產(chǎn)生標(biāo)題產(chǎn)物的明黃色油狀物。收率為16.15g(81％)。1H-NMR(CDCl3)δ＝3.39ppm(s，3H)；3.58(t，2H)；3.68(t，2H)；3.76(t，2H)；3.89(t，2H)；4.70(s，2H)；7.87(t，1H)；8.03(t，1H)；8.23(d，1H)；8.37(d，1H)。13C-NMR(CDCl3，選擇的峰)δ＝57.16ppm；64.96；68.71；68.79；69.59；69.99；120.32；123.87；127.17；130.96；133.63；142.40；148.22；164.97。
寡聚產(chǎn)物 固相寡聚化 下面描述的反應(yīng)都在經(jīng)Wang連接體官能化的聚苯乙烯上實施。一般而言，該反應(yīng)也會在其它類型的固相支持物上，以及用其它類型的官能化連接體來進行。
固相疊氮化物還原 該反應(yīng)是已知的(Schneider，S.E.等，Tetrahedron，1998，54(50)15063-15086)并且可以通過在THF和水的混合物中，用過量的三苯基膦室溫下處理結(jié)合支持物的疊氮化物12-24小時來完成?？商娲?，可以使用如Chan，T.-Y.等，Tetrahedron Lett.1997，38(16)，2821-2824描述的在含水THF中的三甲基膦。疊氮化物的還原也可以用硫化物例如二硫蘇糖醇(Meldal，M.等，Tetrahedron Lett.1997，38(14)，2531-2534)1，2-二巰基乙烷和1，3-二巰基丙烷(Meinjohanns，E.等，J.Chem.Soc，Perkin Trans 1，1997，6，871-884)或錫(II)鹽例如氯化錫(II)(Kim，J.M.等，Tetrahedron Lett，1996，37(30)，5305-5308)在固相上完成。
固相氨基甲酸酯形成 該反應(yīng)是已知的并且通常通過優(yōu)選在存在堿的情況下，將活化的碳酸酯或鹵代甲酸酯衍生物與胺反應(yīng)來完成。
實施例36 3-(1，3-雙{2-[2-([苯甲酰基氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基羰基)-氨基)丙酸
該實施例用實施例4中制備的1，3-雙[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-基-對硝基苯基碳酸酯單體結(jié)構(gòu)單元，來合成第二代基于氨基甲酸酯的支化聚合物，所述的支化聚合物用2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸加帽。該偶聯(lián)化學(xué)基于標(biāo)準(zhǔn)的固相氨基甲酸酯化學(xué)，并且保護方法基于如上描述的固相疊氮化物還原步驟。
步驟1將Fmoc-β-Ala-Wang樹脂(100mg；載荷0.31mmol/gBACHEM)懸浮于二氯甲烷中30分鐘，并隨后用DMF洗滌兩次。加入DMF中的20％哌啶溶液，并將該混和物在環(huán)境溫度下?lián)u動15分鐘。重復(fù)該步驟，并且將樹脂用DMF(3×)和DCM(3×)洗滌。
步驟2單體結(jié)構(gòu)單元的偶聯(lián)將1，3-雙[疊氮基乙氧基乙基]丙-2-基-對硝基苯基氨基甲酸酯(527mg；1,4mmol，4×)與DIPEA(240μl；1.4mmol，4×)一起加入至樹脂中。將樹脂搖動90分鐘，隨后排干并用DMF(3×)和DCM(3×)洗滌。
步驟3用乙酸酐加帽然后將樹脂在環(huán)境溫度下用乙酸酐、DIPEA、DMF(12∶4∶48)溶液處理10分鐘。除去溶劑并且用DMF(3×)和DCM(3×)洗滌樹脂。
步驟4去保護(疊氮基的還原)將樹脂在50℃下用DMF中的DTT(2M)和DIPEA(1M)溶液處理1小時。隨后用DMF(3×)和DCM(3×)洗滌樹脂。提取少量樹脂并用DMF中的苯甲酰氯(0.5M)和DIPEA(1M)溶液處理1小時。將樹脂用50％TFA/DCM裂解并將雙苯甲?；a(chǎn)物用NMR和LC-MS分析。1H-NMR(CDCl3)δ＝3.50-3.75(m，20H)；3.85(s，1H)；4.25(d，2H)；6.95(t，1H)；7.40-7.50(m，6H)；7.75(m，4H)。LC-MSm/z＝576(M+1)；Rt＝2.63分鐘。
實施例37 3-[2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]丙酸
步驟1將Fmoc-β-Ala連接的Wang樹脂(A22608，NovaBiochem，3.00g；載荷0.83mmol/g)在DCM中膨脹20分鐘。然后用DCM(2×20ml)和NMP(2×20ml)洗滌。隨后用NMP中的20％哌啶處理樹脂兩次(2×15分鐘)。用NMP(3×20ml)和DCM(3×20ml)洗滌樹脂。
步驟2將2-(1，3-雙[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸(3.70g；10mmol)溶解于NMP(30ml)中并加入DhbtOH(1.60g；10mmol)和DIC(1.55ml；10mmol)。將該混合物在環(huán)境溫度下攪拌30分鐘，然后與DIPEA(1.71ml；10mmol)一起加入至步驟1獲得的樹脂中。將反應(yīng)混合物搖動1.5小時，然后排干并用NMP(5×20ml)和DCM(3×20ml)洗滌。
步驟3隨后加入NMP(15ml)和DCM(15ml)中的SnCl2.2H2O(11.2g；49.8mmol)溶液。將該反應(yīng)混合物搖動1小時。將樹脂排干并用NMPMeOH(5×20ml；1∶1)洗滌。隨后將樹脂在真空中干燥。
步驟4將NMP(10ml)中的2-[2-(2-甲氧基乙基)乙氧基]乙酸(1.20g；6.64mmol)、DhbtOH(1.06g；6.60mmol)和DIC(1.05ml；6.60mmol)溶液在室溫下混合10分鐘，然后加入至步驟3中獲得的3-[2-(1，3-雙[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]丙酸連接的wang樹脂(1.0g；0.83mmol/g)中。加入DIPEA(1.15ml，6.60mmol)，并且將該反應(yīng)混合物搖動2.5小時。除去溶劑，并用NMP(5×20ml)和DCM(10×20ml)洗滌樹脂。
步驟5將步驟4的樹脂產(chǎn)物用TFA:DCM(10ml，1∶1)處理1小時。將樹脂過濾并用TFA:DCM(10ml，1∶1)洗滌一次。然后將合并的濾液和洗滌液干燥，產(chǎn)生黃色油狀物(711mg)。將油狀物溶解于10％乙腈-水(20ml)中，并在使用C18柱，以及15-40％乙腈-水梯度的制備型HPLC儀器上純化兩次。級分隨后通過LC-MS分析。將含有產(chǎn)物的級分合并并干燥。收率222mg(37％)。LC-MSm/z＝716(M+1)；Rt＝1.97分鐘。1H-NMR(CDCl3)δ＝2.56ppm(t，2H)；3.36(s，6H)；3.46-3.66(m，39H)；4.03(s，4H)；4.16(s，2H)；7.55(t，2H)；8.05(t，1H)。13C-NMR(CDCl3，選擇的峰)δ＝33.71ppm；34.90；58.89；68.94；69.40；69.98；70.09；70.33；70.74；70.91；71.07；71.74；79.07；171.62；171.97；173.63。
實施例38 3-(1，3-雙{2-(2-[2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)丙酸
通過重復(fù)步驟2-5，使用的試劑的量加倍，從實施例的步驟3獲得的3-[2-(1，3-雙[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]丙酸連接的wang樹脂(1.0g；0.83mmol/g)制備該物質(zhì)。收率460mg(33％)。MALDI-MS(α-氰基-4-羥基肉桂酸)m/z＝1670(M+Na)。1H-NMR(CDCl3)δ＝2.57ppm(t，2H)；3.38(s，12H)；3.50-3.73(m，85H)；4.05(s，8H)；4.17(s，2H)；4.19(s，4H)；7.48(m，4H)；7.97(m，3H)。13C-NMR(CDCl3，選擇的峰)δ＝38.81ppm；58.92；69.46；69.92；70.05；70.05；70.13；70.40；70.73；70.97；71.11；71.88；76.74；77.06；77.38；171.33；172.02。
可替代的制備方式 該實施例使用在實施例6中制備的2-(1，3-雙[疊氮基乙氧基乙基]丙-2-基氧基)乙酸單體結(jié)構(gòu)單元，來合成第二代基于酰胺的支化聚合物，所述的支化聚合物用2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸加帽。該偶聯(lián)化學(xué)基于標(biāo)準(zhǔn)的固相肽化學(xué)，并且保護方法基于如上描述的固相疊氮化物的還原步驟。
步驟1將Fmoc-β-Ala-Wang樹脂(100mg；載荷0.31mmol/gBACHEM)懸浮于二氯甲烷中30分鐘，并隨后用DMF洗滌兩次。加入DMF中的20％哌啶溶液，并將該混和物在環(huán)境溫度下?lián)u動15分鐘。重復(fù)該步驟，并且將樹脂用DMF(3×)和DCM(3×)洗滌。
步驟2單體結(jié)構(gòu)單元的偶聯(lián)將2-(1，3-雙[疊氮基乙氧基乙基]丙-2-基氧基)乙酸(527mg；1.4mmol，4×)和DhbtOH(225mg；1.4mmol，4×)溶液溶解于DMF(5ml)中并加入DIC(216μl，1.4mmol，4×)。將該混合物放置10分鐘(預(yù)活化)隨后與DIPEA(240ul；1.4mmol，4×)一起加入至樹脂中。將樹脂搖動90分鐘，隨后排干并用DMF(3×)和DCM(3×)洗滌。
步驟3用乙酸酐加帽然后將樹脂在環(huán)境溫度下用乙酸酐、DIPEA、DMF(12∶4∶48)的溶液處理10分鐘。除去溶劑并且將樹脂用DMF(3×)和DCM(3×)洗滌。
步驟4去保護(疊氮基的還原)將樹脂在50℃下用DMF中的DTT(2M)和DIPEA(1M)溶液處理1小時。隨后用DMF(3×)和DCM(3×)洗滌樹脂。提取少量樹脂并用DMF中的苯甲酰氯(0.5M)和DIPEA(1M)溶液處理1小時。將樹脂用50％TFA/DCM裂解并將二苯甲?；漠a(chǎn)物用NMR和LC-MS分析。1H-NMR(CDCl3)δ＝3.50-3.75(m，20H)；3.85(s，1H)；4.25(d，2H)；6.95(t，1H)；7.40-7.50(m，6H)；7.75(m，4H)。LC-MSm/e＝576(M+1)；Rt＝2.63分鐘。
步驟5-7如步驟2-4實施，使用雙倍摩爾量的試劑，但使用相同量的溶劑。
步驟8用2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸加帽將2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸(997mg；5.6mmol，相當(dāng)于樹脂載荷的16倍)和DhbtOH(900mg；5.6mmol，16×)溶液溶解于DMF(5ml)中并加入DIC(864ul，5.6mmol，16×)。將該混合物放置10分鐘(預(yù)活化)隨后與DIPEA(960ul；5.6mmol，16×)一起加入至樹脂中。將樹脂搖動90分鐘，隨后排干并用DMF(3×)和DCM(3×)洗滌。
步驟9從樹脂上裂解將樹脂在環(huán)境溫度下用50％TFA-DCM溶液處理30分鐘。收集溶劑并用50％TFA-DCM另外洗滌樹脂。將合并的濾液蒸發(fā)至干燥，并將殘留物通過色譜法純化。
實施例39 3-(1，3-雙{2-(2-[2-(1，3-雙{2-(2-[2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)丙酸
通過重復(fù)步驟2-3，使用2倍量的所用試劑，然后重復(fù)步驟2-5，使用4倍量的所用試劑，從實施例的步驟3獲得的3-[2-(1，3-雙[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]丙酸連接的wang樹脂(1.0g；0.83mmol/g)制備該物質(zhì)。收率84mg(4％)。LC-MS(m/2)+1＝1758；(m/3)+1＝1172；(m/4)+1＝879；(m/5)+1＝704。Rt＝2.72分鐘。1H-NMR(CDCl3)δ＝2.51ppm(t，2H)；3.33(s，24H)；3.44-3.70(m，213H)；3.93(s，16H)；4.08(s，14H)；7.25(m，8H)；7.69(m，7H)。13C-NMR(CDCl3，選擇的峰)δ＝38.94ppm；59.33；69.78；70.08；70.37；70.44；70.56；70.82；71.10；71.26；71.51；72.17；79.24；170.60；171.22。
實施例40 N-羥基琥珀酰亞氨基3-[2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]丙酸酯
將3-[2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]丙酸(67mg；82μmol)溶解于THF(5ml)中。將該反應(yīng)混合物在冰浴上冷卻。加入DIPEA(20μl；120μmol)和TSTU(34mg；120μmol)。將該混合物在環(huán)境溫度下攪拌過夜，此時根據(jù)LC-MS，反應(yīng)完成。LC-MSm/z＝813(M+H)；Rt＝2.22分鐘。
實施例41 N-羥基琥珀酰亞氨基3-(1，3-雙{2-(2-[2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)丙酸酯
與實施例40中描述類似地，從3-(1，3-雙{2-(2-[2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)丙酸和TSTU制備。LC-MS(m/2)+1＝873，Rt＝2.55分鐘。
實施例42 N-羥基琥珀酰亞氨基3-(1，3-雙{2-(2-[2-(1，3-雙{2-(2-[2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)丙酸酯
如實施例40中描述的，從N-羥基琥珀酰亞氨基3-(1，3-雙{2-(2-[2-(1，3-雙{2-(2-[2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)丙酸和TSTU制備。LC-MS(m/4)+1＝903，Rt＝2.69分鐘。
實施例43 N-(4-叔丁氧羰基氨基氧基丁基)3-(1，3-雙{2-(2-[2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)丙酰胺
將N-羥基琥珀酰亞氨基3-(1，3-雙{2-(2-[2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)丙酸酯(105mg；0.06mmol)溶解于DCM(2ml)中。隨后加入4-(叔丁氧羰基氨基氧基)丁胺(49mg；0.24mmol)的溶液，之后加入DIPEA(13μl；0.07mmol)。將該混合物在環(huán)境溫度下攪拌1小時，然后減壓濃縮。將殘留物溶解于20％乙腈-水(4ml)中，并且在使用C18柱，以及0、10、20、30和40％(各自為10ml洗脫)的乙腈-水的臺階式梯度的制備型HPLC儀器上純化。將含有純產(chǎn)物的級分濃縮并在真空烘箱中干燥16小時以產(chǎn)生黃色的油狀物。收率57mg(51％)。LC-MS(m/2)+1＝918，Rt＝2.75分鐘。1H-NMR(CDCl3)δ＝1.42ppm(s，9H)；2.40(t，2H)；3.21(dd，2H)；3.33(s，12H)；3.38-3.72(m，99H)；3.80(m，2H)；3.95(s，8H)；4.08(s，6H)；6.99(m，1H)；7.23(m，4H)；7.69(m，2H)；7.85(m，1H)；8.00(m，1H)。13C-NMR(CDCl3，選擇的峰)δ＝28.27ppm；38.58；58.97；69.42；69.72；70.01；70.08；70.20；70.41；70.46；70.73；70.91；71.16；71.22；71.81；78.89；81.33；170.27；170.89。
實施例44 N-(4-氨基氧基丁基)3-(1，3-雙{2-(2-[2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)丙酰胺
將N-(4-叔丁氧羰基氨基氧基丁基)3-(1，3-雙{2-(2-[2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)丙酰胺(19mg；10μmol)溶解于50％TFA/DCM(10ml)中，并將該澄清的溶液在環(huán)境溫度下攪拌30分鐘。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，并將殘留物從DCM除去溶劑(strip)兩次，產(chǎn)生定量收率(19mg)的標(biāo)題產(chǎn)物。LC-MS(m/2)+1＝868，(m/3)+1＝579，Rt＝2.35分鐘。
實施例45 2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸叔丁酯
將2-(1，3-雙[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸叔丁酯(1.74g；4.5mmol，實施例9)和1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮-3-基2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸酯(2.94g；9mmol，實施例35)溶解于DCM(100ml)中。加入DIPEA(3.85ml；22.3mmol)并將該澄清的混合物在室溫下攪拌90分鐘。在真空中除去溶劑，并通過使用MeOH-DCM(1∶16)作為洗脫劑的硅石色譜法純化殘留物。將純的級分合并并干燥產(chǎn)生澄清油狀物的標(biāo)題物質(zhì)。收率為1.13g(36％)。1H-NMR(CDCl3)δ＝1.46ppm(s，9H)；3.38(s，6H)；3.49-3.69(m，37H)；4.01(s，4H)；4.18(s，2H)；7.20(bs，2H)。
實施例46 2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸
將2-(1，3-雙[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸叔丁酯(470mg；0.73mmol)溶解于DCM-TFA(25ml，1∶1)中并將該混合物在環(huán)境溫度下攪拌30分鐘。在真空中除去溶劑，并將殘留物從DCM中除去溶劑兩次。LC-MS(M+1)＝645，Rt＝2.26分鐘。1H-NMR(CDCl3)δ＝3.45ppm(s，6H)；3.54-3.72(m，37H)；4.15(s，4H)；4.36(s，2H)。
實施例47 N-羥基琥珀酰亞氨基2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸酯
將2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸(115mg；0.18mmol)溶解于THF(5ml)中。將該反應(yīng)混合物置于冰浴上。加入TSTU(65mg，0.21mmol)和DIPEA(37μl；0.21mmol)并將該反應(yīng)混合物在0℃下攪拌30分鐘，隨后在室溫下攪拌過夜。然后將反應(yīng)至干燥，產(chǎn)生130mg標(biāo)題物質(zhì)的澄清油狀物。LC-MS(m+1)＝743，(m/2)+1＝372，Rt＝2,27分鐘。
實施例48 3-(1，3-雙{2-(2-[2-(1，3-雙{2-(2-[2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酸叔丁酯
使用實施例45中描述的方案和純化方法，從兩當(dāng)量的N-羥基琥珀酰亞氨基2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸酯和一當(dāng)量的2-(1，3-雙[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸叔丁酯制備該物質(zhì)。
進一步的樹枝狀生長可以這樣完成如實施例46中描述的除去叔丁基基團并隨后如實施例47中描述的形成N-羥基琥珀酰亞氨基酯，之后如本實施例中描述的偶聯(lián)至2-(1，3-雙[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸叔丁酯。
實施例49 (S)-2，6-雙(2-[2-(2-[2-(2，6-雙-[2-(2-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙酰氨基]己酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)己酸甲酯
將(S)-2，6-雙-(2-{2-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)己酸(1.8g，3.10mmol)溶解于二甲基甲酰胺/二氯甲烷1∶3(10ml)的混合物中，用二異丙基乙胺將pH調(diào)節(jié)成堿性反應(yīng)，加入N-羥基苯并三唑和N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽并將該反應(yīng)混合物保持30分鐘。然后將該反應(yīng)混合物加入至(S)-2，6-雙-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)己酸甲酯(0.37g，0.70mmol于二氯甲烷中)溶液中并將反應(yīng)混合物保持過夜。將反應(yīng)混合物用二氯甲烷(150ml)稀釋，用水(2×40ml)、50％飽和碳酸氫鈉(2×30ml)和水(3×40ml)洗滌。將有機相在硫酸鎂上干燥，過濾并在真空中蒸發(fā)得到油狀物。收率1.6g(89％)。LC-MSm/z＝1656(M+1)，828.8(M/2)+1和553(M/3)+1。
實施例50 (S)-2，6-雙(2-[2-(2-[2-((S)-2，6-雙-[2-(2-[2-(2-叔丁氧羰基氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙酰氨基]己酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)己酸甲酯
將二碳酸二叔丁酯(1.0g，4.8mmol)和Pd/C(10％，1.1g)加入至乙酸乙酯(60ml)中的上面的(S)-2，6-雙(2-[2-(2-[2-((S)-2，6-雙[2-(2-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙酰氨基]己酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)己酸甲酯(1.6g，0.97mmol)溶液中。將氫氣持續(xù)通入該反應(yīng)混合物中鼓泡2小時。過濾反應(yīng)混合物并在真空中除去有機溶劑，得到無需進一步純化而使用的油狀物。收率1.8g(98％)。LC-MSm/z＝1953(M+1)，977(M/2)+1。
實施例51 (S)-2，6-雙(2-[2-(2-[2-((S)-2，6-雙[2-(2-[2(2氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙酰氨基]己酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)己酸甲酯
將上面的(S)-2，6-雙(2-[2-(2-[2-((S)-2，6-雙[2-(2-[2-(2-叔丁氧羰基氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙酰氨基]己酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)己酸甲酯溶解于二氯甲烷(20ml)中并加入三氟乙酸(20ml)。保持反應(yīng)混合物2小時。在真空中蒸發(fā)有機溶劑，得到油狀物。
收率1.4g(100％)。LC-MSm/z＝1552(M+1)；777.3(M/2)+1；518.5(M/3)+1和389.1(M/4)+1。
實施例52 (S)-2，6-雙-(2-[2-(2-[2-((S)-2，6-雙-[2-(2-[2-(2-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙酰氨基]己酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)己酸甲酯
將N-羥基琥珀酰亞胺(0.8g，7.32mmol)和N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(1.4g，7.32mmol)加入至二氯甲烷和二甲基甲酰胺3∶1的混合物(20ml)中的2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸(1.3g，7.32mmol)溶液中。將該反應(yīng)混合物保持1小時，隨后將該混合物加入至二氯甲烷(10ml)中的(S)-2，6-雙(2-[2-(2-[2-((S)-2，6-雙[2-(2-[2(2氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙酰氨基]己酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)己酸甲酯(1.42g，0.92mmol)和二異丙基乙胺(2.4ml，14.64mmol)溶液中。將該反應(yīng)混合物保持過夜。將反應(yīng)混合物用二氯甲烷(100ml)稀釋并用水(3×25ml)萃取。用額外的二氯甲烷(2×75ml)萃取合并的水相。將合并的有機相在硫酸鎂上干燥、過濾并在真空中蒸發(fā)。通過用500ml乙酸乙酯，之后用500ml乙酸乙酯/甲醇9∶1并最后用甲醇作為洗脫劑的急驟色譜法純化殘留物。將含有產(chǎn)物的級分在真空中蒸發(fā)得到油狀物。收率0.75g(38％)。LC-MSm/z＝1097(M/2)+1；732(M/3)+1和549(M/4)+1。
(S)-2，6-雙-(2-[2-(2-[2-((S)-2，6-雙-[2-(2-[2-(2-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙酰氨基]己酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)己酸甲酯能夠皂化成游離酸，并可用活化酯連接至ITA的游離氨基上，例如賴氨酸殘基的ε氨基或末端α氨基上?？梢陨a(chǎn)所述的活化酯并通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)方法(例如二異丙基乙胺和N-羥基苯并三唑或其它活化條件)，將其偶聯(lián)至ITA肽的氨基基團。
可替代地，可以將上面的叔丁基保護的羧酸中間產(chǎn)物去保護并隨后活化為OSu酯(例如，如實施例40中描述的)，用于連接至ITA肽。
實施例53 [2-(2-{[雙-(2-{2-[2-(2-{[雙-(2-芐氧羰基氨基乙基)氨甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙基)氨甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙氧基]乙酸 將四氫呋喃(50ml)中的[2-(2-{[雙-(2-芐氧羰基氨基乙基)氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙氧基]乙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯(2.53mmol-來自先前的實驗，質(zhì)量未測定)溶液和含水碳酸氫鈉(5％w/w，50ml)中的[2-(2-{[雙-(2-氨乙基)氨甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙氧基]乙酸(1.26mmol-來自先前的實驗，質(zhì)量未測定)溶液混合。將該混合物攪拌至少20小時。加入固體硫酸氫鈉直到pH為2-3。分離相。用二氯甲烷(3×50ml)萃取水相。將合并的有機相用含水的硫酸氫鈉(5％w/w，50ml)洗滌。用二氯甲烷(2×50ml)萃取水相。將合并的有機相在硫酸鎂上干燥、過濾，并在真空中濃縮。
收率989mg LC-MS(ES-正模式)，m/z1423[M+H]+ 用于合成具有帶電荷磷酸酯主鏈的樹枝狀高分子的一般方法。

可替代地，可以將上面的叔丁基保護的羧酸中間產(chǎn)物去保護并隨后活化為OSu酯(例如，如實施例47中描述的)，用于連接至胰島素。
實施例54
2-(2-三苯甲基氧基乙氧基)乙醇
將三苯基氯甲烷(10g，35.8mmol)溶解于無水吡啶中，加入二甘醇(3.43mL，35.8mmol)并將該混合物在氮氣下攪拌過夜。在真空中除去溶劑。溶解于二氯甲烷(100mL)并用水洗滌。將有機相在Na2SO4上干燥并在真空中除去溶劑。通過從庚烷/甲苯(3∶2)中再結(jié)晶來純化粗產(chǎn)物得到標(biāo)題化合物。
1H NMR(CDCl3)δ＝7.46(m，6H)，7.28，(m，9H)，3.75(t，2H)，3.68(t，2H)，3.62(t，2H)，3.28(t，2H)。LC-MSm/z＝371(M+Na)；Rt＝2.13分鐘。
2-[2-(2-三苯甲基氧基乙氧基)乙氧甲基]環(huán)氧乙烷
將2-(2-三苯甲基氧基乙氧基)乙醇(6.65g，19mmol)溶解于無水THF(100mL)中。緩慢加入60％NaH(0.764mg，19mmol)。將該懸浮液攪拌15分鐘。加入表溴醇(1.58mL，19mmol)并將該混合物在室溫下于氮氣下攪拌過夜。用冰焠滅反應(yīng)，然后在乙醚(300mL)和水(300mL)之間分離。用二氯甲烷萃取水相。將有機相收集、干燥(Na2SO4)并在真空中除去溶劑得到油狀物，其在用DCM/MeOH/Et3N(98∶1∶1)洗脫的硅膠柱上純化產(chǎn)生標(biāo)題化合物。
1H NMR(CDCl3)δ＝7.45(m，6H)，7.25，(m，9H)，3.82(dd，1H)，3.68(m，6H)，3.45(dd，1H)，3.25(t，2H)，3.15(m，1H)，2.78(t，1H)，2.59(m，1H)。LC-MSm/z＝427(M+Na)；Rt＝2.44分鐘。
1，3-雙[2-(2-三苯甲基氧基乙氧基)乙氧基]丙-2-醇
將2-(2-三苯甲基氧基乙氧基)乙醇(1.14g，3.28mmol)溶解于無水DMF(5mL)中。緩慢加入60％NaH(144mg，3.61mmol)并將混合物在室溫下于氮氣下攪拌30分鐘。將混合物加熱至40℃。將2-[2-(2-三苯甲基氧基乙氧基)乙氧甲基]環(huán)氧乙烷(1.4g，3.28mmol)溶解于無水DMF(5mL)中并于氮氣下逐滴加入至上面的溶液中，同時保持?jǐn)嚢?。加入結(jié)束后，在40℃下于氮氣下攪拌該混合物過夜。移除熱浴并在冷卻至室溫后用冰焠滅反應(yīng)，并將其傾注入飽和的含水NaHCO3(100mL)中，用乙醚(3×75mL)萃取。將有機相收集、干燥(Na2SO4)，并在真空中除去溶劑得到油狀物，其在用EtOAc/庚烷/Et3N(49∶50∶1)洗脫的硅膠柱上純化產(chǎn)生標(biāo)題化合物。1H NMR(CDCl3)δ＝7.45(m，12H)，7.25，(m，18H)，3.95(m，1H)，3.78-3.45(m，16H)，3.22(t，4H)，LC-MSm/z＝775(M+Na)；Rt＝2.94分鐘。
1，3-雙[2-(2-三苯甲基氧基乙氧基)乙氧基]丙-2-醇(2-氰基乙基二異丙基亞磷酰胺)
將1，3-雙[2-(2-三苯甲基氧基乙氧基)乙氧基]丙-2-醇(0.95g，1.26mmol)從無水吡啶中蒸發(fā)兩次并從無水乙腈中蒸發(fā)一次。溶解于無水THF(15mL)，當(dāng)在氮氣下攪拌時，加入二異丙基乙胺(1.2mL，6.95mmol)。將該混合物用冰浴冷卻至0℃，在氮氣下加入2-氰基乙基二異丙基氯代亞磷酰胺(0.39mL，1.77mmol)。將混合物在0℃下攪拌10分鐘，之后在室溫下攪拌30分鐘。加入含水NaHCO3(50mL)并用DCM/Et3N(98∶2)(3×30mL)萃取該混合物。將有機相收集、干燥(Na2SO4)，并在真空中除去溶劑得到油狀物，其在用EtOAc/庚烷/Et3N(35∶60∶5)洗脫的硅膠柱上純化而產(chǎn)生703mg標(biāo)題化合物。31P-NMR(CDCl3)δ149.6ppm {2-[2-(2-羥基乙氧基)乙氧基]-1-[2-(2-羥基乙氧基)乙氧甲基]乙氧基}乙酸叔丁酯
將1，3-雙[2-(2-三苯甲基氧基乙氧基)乙氧基]丙-2-醇(0.3g，0.40mmol)從無水吡啶中蒸發(fā)一次并從無水乙腈中蒸發(fā)一次。在氮氣下溶解于無水DMF(2mL)中，加入60％的NaH(24mg，0.6mmol)。在室溫下攪拌該混合物15分鐘。加入溴乙酸叔丁酯(0.07mL，0.48mmol)并將混合物另外攪拌60分鐘。用冰焠滅該反應(yīng)。在乙醚(2×50mL)和水(2×50mL)之間分離，將有機相收集、干燥(Na2SO4)，并且在真空中除去溶劑得到油狀物，將其用EtOAc/庚烷/Et3N(49∶50∶1)在硅膠柱上洗脫。收集合有主要產(chǎn)物的級分，在真空中除去溶劑并且將其溶解于80％含水乙酸(5mL)中，并在室溫下攪拌過夜。在真空中除去溶劑。并將粗物質(zhì)溶解于乙醚(25mL)中，用水(2×5mL)洗滌。收集水相，并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去水產(chǎn)生63mg的標(biāo)題化合物。1H NMR(CDCl3)δ＝4.19(s，2H)，3.78-3.55(m，21H)，1.49(s，9H)。
將2-(1，3-雙[2-(2-羥基乙氧基)乙氧基]丙-2-氧基)乙酸叔丁酯(63mg，0.16mmol)在無水乙腈中蒸發(fā)兩次。將1，3-雙[2-(2-三苯甲基氧基乙氧基)乙氧基]丙-2-氧基β-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺(353mg，0.37mmol)從無水乙腈蒸發(fā)兩次，溶解于無水乙腈(2mL)中并將其加入。在氮氣下加入無水乙腈中的四唑溶液(0.25M，2.64mL)并在室溫下攪拌該混合物1小時。加入5.5mL的I2-溶液(0.1M于THF/盧剔啶/H2O 7∶2∶1中)并另外攪拌混合物1小時。將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(20mL)稀釋，并用2％含水亞硫酸鈉洗滌直到碘的顏色消失。將有機相干燥(Na2SO4)，并在真空中除去溶劑。將殘留物溶解于80％的含水乙酸(5mL)中并在室溫下攪拌過夜。在真空中除去溶劑，并加入乙醚(25mL)和水(10mL)至粗產(chǎn)物中。收集水相并在真空中除去水。將產(chǎn)物在含有0.1％TFA的0-40％乙腈梯度下，于反相制備型HPLC C-18柱上純化而產(chǎn)生標(biāo)題叔丁基保護的第二代支化聚合物產(chǎn)物。LC-MSm/z＝1171(M+Na)；1149(M+)，1093(MS中叔丁基的丟失)；Rt＝2.76分鐘。
隨后用如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)的堿和酸處理，來完成β-氰基乙基基團的去保護和叔丁酯基團的去除。
樹枝狀高分子至ITA的連接 實施例55 N-ε26，3-[2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]丙?；鵞Arg34]GLP-1-(7-37)-OH
將R34-GLP-1(7-37)(L.B.Knudsen等，J.Med.Chem.2000，43，1664-1669)(110mg；33umol)懸浮于水(30ml)中。加入DIPEA(156ul；1.6mmol)至該混濁的懸浮液中，并將混合物攪拌10分鐘，在該時間內(nèi)溶液變得澄清。測量pH為10。然后加入水(6.0ml)中的N-羥基琥珀酰亞氨基3-[2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]丙酸酯(80.4mg；99umol，實施例32)溶液。該反應(yīng)混合物變成黃色并變得稍微混濁。在室溫下攪拌混合物45分鐘。隨后加入甘氨酸溶液(5.3ml，濃度＝10mg/ml)。在室溫下攪拌該混合物5分鐘。然后使用C18柱(20×2cm)，用25-55％水-乙腈線性梯度和10ml/分鐘的流速，使用直接注射(分別為20ml和16ml)通過制備型HPLC純化反應(yīng)混合物兩次，收集10ml級分。使用LC-MS(電噴射)和HPLC(方法A)分析含有產(chǎn)物的單獨的級分。合并含有純化合物的樣品得總體積為80ml的樣品，其終濃度為1.05mg/ml，該濃度從λ＝276nm處的相對吸收測量而測定。將樣品冷凍并在-18℃保存，直到使用。收率84.6mg(67％)。MALDI-TOF-MS(α-氰基-4-羥基肉桂酸)m/z＝4080。LC-MS(電噴射)(m/3)+1＝1261；(m/4)+1＝1021；Rt＝3.54分鐘。HPLC(方法A)Rt＝36.46分鐘。
實施例56 N-ε26-3-(1，3-雙{2-[2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}-乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基])乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)-丙?；鵞Arg34]GLP-1-(7-37)-OH
將R34-GLP-1(7-37)(15.6mg；4.5umol)懸浮于水(10ml)中。加入DIPEA(86ul；0.88mmol)至該混濁的懸浮液中，并將混合物攪拌10分鐘，在該時間內(nèi)溶液變得澄清。測量pH為10。然后加入水(2.0ml)中的N-羥基琥珀酰亞氨基3-(1，3-雙{2-(2-[2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)丙酸酯(93.0mg；53umol，實施例33)溶液。反應(yīng)混合物保持澄清。在室溫下攪拌混合物40分鐘。隨后加入甘氨酸溶液(3.0ml，濃度＝10mg/ml)。在室溫下攪拌該混合物5分鐘。如下通過制備型RP-HPLC純化混合物將總樣品體積(15ml)注射至C18柱(20×2cm)上，并以10ml/分鐘的流速使用25％-55％水-乙腈線性梯度洗脫。收集10ml級分。使用LC-MS(電噴射)和HPLC(方法A)分析含有產(chǎn)物的單獨的級分。合并含有純化合物的樣品得總體積為24ml的樣品，其終濃度為0.25mg/ml，該濃度從λ＝276nm處的相對吸收測量而測定。將樣品冷凍并在-18℃保存，直到使用。收率5.8mg(24％)。LC-MS(電噴射)(m/3)+1＝1672；(m/4)+1＝1254；(m/5)+1＝1004；Rt＝3.25分鐘。HPLC(方法A)Rt＝35.64分鐘。
實施例57 Nε37-((S)-2，6-雙-(2-[2-(2-[2-((S)-2，6-雙-[2-(2-[2-(2-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙酰氨基]己酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)己?；?[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1(7-37)酰胺的制備
1.a受保護的肽基樹脂的合成。
Boc-His(Boc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Aib-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-Arg(Pmc)-Lys(Dde)-Rink酰胺樹脂用制造商提供的FastMoc UV方案，根據(jù)Fmoc策略在Applied Biosystems 433A肽合成儀上以0.25mmol規(guī)模制備，所述的FastMoc UV方案采用在NMP中HBTU介導(dǎo)的偶聯(lián)，并UV監(jiān)控Fmoc保護基團的去保護。為了提高偶聯(lián)效率，使用HATU而不是HBTU作為偶聯(lián)試劑，來偶聯(lián)這些殘基(Aib殘基和Aib后面的殘基)。用于合成的起始樹脂(438mg)是置換容量為0.57mmol/g的4-(2’，4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基樹脂(Rink酰胺樹脂)(Merck Biosciences GmbH，德國。cat.#01-12-0013)。使用的受保護的氨基酸衍生物是(2S)-6-[1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代-亞環(huán)己基)-乙氨基]-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)己酸(Fmoc-Lys(Dde)-OH)、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH和Boc-His(Boc)-OH。
收率為1.37g的無水肽基樹脂。
1.b肽基樹脂的表征 該樹脂通過將粗肽從50mg這種樹脂上裂解來表征，所述的裂解是通過用14μl TIS、14μl H2O和0.5ml TFA的混合物將其處理2小時來進行的。通過過濾除去樹脂并且將粗肽通過沉淀分離并用Et2O洗滌。HPLC和LC-MS分析在干沉淀物上實施。
分析結(jié)果 1.c Dde的去保護 將從(1.a)得到的受保護的肽基樹脂(1.35g，250μmol)在NMP:DCM 1∶1(15ml)中洗滌兩次。加入新鮮制備的NMP中的2％水合肼溶液(20ml)。在室溫下?lián)u動反應(yīng)混合物12分鐘，并隨后過濾。將所述的肼處理重復(fù)兩次。此后，將樹脂用NMP、DCM和NMP徹底洗滌。
1.d支化聚合物的連接 將Dde去保護的樹脂懸浮于NMP(20ml)中。將如實施例39中描述的用TSTU預(yù)活化的(S)-2，6-雙-(2-[2-(2-[2-((S)-2，6-雙-[2-(2-[2-(2-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙酰氨基]己酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)己酸與DIPEA一起加入并且將該懸浮液搖動過夜。然后通過過濾分離樹脂并且用NMP、DCM、2-丙醇、甲醇和Et2O徹底洗滌并在真空中干燥。
1.e產(chǎn)物的裂解 將來自1.d的樹脂與350μl TIS、350μl H2O和14ml TFA的混合物一起在室溫下攪拌3小時。將樹脂通過過濾除去并用3ml TFA洗滌。將收集的濾液在真空中濃縮至5ml，并將粗產(chǎn)物通過加入40mlEt2O沉淀，隨后離心。將沉淀顆粒用40ml Et2O洗滌兩次并隨后風(fēng)干。
1.f產(chǎn)物的純化 將粗肽溶解于H2O/AcOH(40∶4)(40ml)中并在裝填有7μC-18硅石的25mm×250mm柱上，通過半制備型HPLC純化兩次。在40℃溫度下，將該柱以10ml/分鐘用相對于0.1％TFA/H2O的40-62％的CH3CN梯度洗脫47分鐘。收集合有肽的級分，用3體積的H2O稀釋并將其低壓凍干。獲得的終產(chǎn)物通過HPLC表征。
本發(fā)明的其它化合物包括
實施例58 N-ε26，3-[2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]丙?；鵞Aib8，22，35]GLP-1(7-37)酰胺
Dde-Lys(Fmoc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pmc)-Aib-Arg(Pmc)-Gly-Rink酰胺樹脂用制造商提供的FastMocUV方案，根據(jù)Fmoc策略在Applied Biosystems 433A肽合成儀上以0.25mmol規(guī)模制備，所述的FastMoc UV方案采用在NMP中HBTU介導(dǎo)的偶聯(lián)，并UV監(jiān)控Fmoc保護基團的去保護。末端Fmoc基團通過用DMF中2％DBU處理(3×3分鐘)除去，并在賴氨酸側(cè)鏈上?；?，首先用Fmoc-AEEAc-OH，并在Fmoc去保護后用3-[2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸。隨后用NMP中10％的肼除去末端Dde基團。然后使用制造商提供的FastMoc UV方案，將肽的N端用Boc-His(Boc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Aib-Gln(Trt)-Ala-Ala-序列延長，所述的FastMoc UV方案采用NMP中HBTU介導(dǎo)的偶聯(lián)，并UV監(jiān)控Fmoc保護基團的去保護。用TFA中5％的三異丙基硅烷和5％的水將肽從樹脂上裂解。濾出樹脂，并用TFA洗滌。將合并的濾液減少至最小體積，并且通過加入冷的乙醚使肽沉淀，并通過離心分離。將沉淀物用冷的乙醚洗滌三次。
通過RP18-HPLC純化粗肽。將柱用相對于0.1％TFA/H2O的36-60％CH3CN梯度以10ml/分鐘洗脫。收集合有肽的級分，用H2O稀釋并低壓凍干。LC-MS(電噴射)(m/3)+1＝1409.8；(m/4)+1＝1057.0；(m/5)+1＝846.2；Rt＝3.28分鐘。HPLC(方法A)Rt＝29.08分鐘。
實施例59 N-α7-甲酰基，N-ε26，3-[2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]丙酰基[Arg34]GLP-1-(7-37)-OH
將N-ε26，3-[2-(1，3-雙[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]丙酰基[Arg34]GLP-1-(7-37)-OH(實施例55)溶解于水(20ml)中并用三乙胺調(diào)節(jié)pH為9。制備乙酸酐和蟻酸的1∶1混合物，并加入5ul該溶液(3當(dāng)量)，同時通過加入三乙胺保持pH為9。將反應(yīng)混合物攪拌1小時，然后另外加入5ul乙酸酐和蟻酸的1∶1混合物。將最后一步重復(fù)一次，然后將混合物在室溫下攪拌3小時。隨后將產(chǎn)物如實施例58中描述的進行純化，產(chǎn)生9mg標(biāo)題物質(zhì)。LC-MS(電噴射)(m/3)+1＝1370.7；(m/4)+1＝1028.7；Rt＝3.25分鐘。HPLC(方法A)Rt＝37.75分鐘。
用于測量肺生物利用度的方法。
本方案描述了用于開發(fā)用于肺部遞送氣溶膠的麻醉大鼠模型的方法和材料。氣溶膠通過使用噴霧器導(dǎo)管產(chǎn)生，其具有非常確定的小滴/粒度(平均質(zhì)量空氣動力學(xué)直徑，MMAD)。噴霧器導(dǎo)管是一種擠出的多腔導(dǎo)管，其提供細顆粒、無折流的、氣溶膠。它包括在一個液體腔周圍的多個(通常為4-6個)氣體腔。每個腔延長了導(dǎo)管長度，其逐漸變細為細小(～0.5mm直徑)的噴嘴，噴嘴在遠端具有微小的孔。在遠端處氣體和液體之間的緊密接觸產(chǎn)生無折流的精細氣溶膠。噴霧器導(dǎo)管被引導(dǎo)通過氣管內(nèi)導(dǎo)管并位于主支氣管支的正上方。氣溶膠以由控制元件管理的脈沖沉積。
裝置 用于肺部遞送的裝置從Trudell Medical International(London.Ontario，加拿大)獲得。
噴霧器導(dǎo)管 由廠商提供許多不同結(jié)構(gòu)和長度的噴霧器導(dǎo)管(Aeroprobe)。這些不同的設(shè)計將會適合多種不同的流體和流速，以及提供可以低到5μm MMAD(平均質(zhì)量空氣動力學(xué)直徑)的氣溶膠粒度。在本發(fā)明試驗中，使用具有下列尺寸的導(dǎo)管外腔氣體流量為1.4L/分鐘，內(nèi)腔流體流量為0.7ml/分鐘，以及MMAD為約7-8μm(PN 104504-050)，長度為50cm(1)。
控制元件 LABNeb導(dǎo)管控制系統(tǒng)(CCS)。將Aeroprobe導(dǎo)管與根據(jù)(2)的控制系統(tǒng)連接。
將壓強為100psi的空氣用作載氣并且通常最大流體壓強為98psi。將100μl注射器用作儲液器。LABNeb CCS使用80毫秒(msec)的脈沖時間和20毫秒的氣體延遲。因此，每個脈沖遞送2.3ml空氣和0.93μl試驗溶液。
動物 重為250和350g的Sprague Dawley

大鼠。將動物在能自由接觸食物(Altromine 1324)和飲水的標(biāo)準(zhǔn)化條件下圈養(yǎng)。在試驗當(dāng)天，使用其進食狀態(tài)下的動物。
用于麻醉的溶液 將Hypnorm(芬太尼0.2mg/ml、fluansol 10mg/ml)用無菌水1+1稀釋。將Dormicum(咪達唑侖5mg/ml)用無菌水1+1稀釋。將這兩種溶液1+1混合。
手術(shù)操作和氣管內(nèi)施用 通過皮下注射制備好的Hyponorm/Dormicum溶液0.25ml/100gBW，誘導(dǎo)麻醉。將氣管內(nèi)導(dǎo)管(PE 240，Becton Dickinson)插入并引導(dǎo)至兩根主支氣管支上方約cm的位置。通過用塑料屏蔽物包裹大鼠使任何熱量喪失最小化。
在施用試驗溶液至肺內(nèi)之前，確保注射器和導(dǎo)管系統(tǒng)無氣泡。在氣管內(nèi)施用試驗溶液之前，將其噴射進管形瓶中以隨后檢驗通過導(dǎo)管施用的物質(zhì)的量。然后，引導(dǎo)導(dǎo)管通過氣管內(nèi)導(dǎo)管，讓1-2mm導(dǎo)管管尖在氣管內(nèi)導(dǎo)管的管末端外并讓試驗溶液氣溶膠化進入麻醉大鼠的肺中。
在i.v.或s.c.施用后GLP-1衍生物的延長 用下面描述的方法，通過在sc施用給健康的豬后，監(jiān)控其在血漿中的濃度測定許多本發(fā)明GLP-1衍生物的延長。為了比較，也跟蹤在sc施用后血漿中GLP-1(7-37)的濃度。其它本發(fā)明GLP-1衍生物的延長可以用相同的方法測定。
迷你豬中GLP-1類似物的藥物動力學(xué)檢測 將試驗物質(zhì)溶解于適合于皮下或靜脈內(nèi)施用的載體中。調(diào)節(jié)濃度使給藥體積為約1ml。
該研究在購自Ellegaard Gttingen Minipigs ApS的12只雄性Gttingen迷你豬上進行。在動物進入研究前，允許約10天的適應(yīng)環(huán)境期。在適應(yīng)環(huán)境期的開始，迷你豬約5個月齡并且在8-10kg重量范圍內(nèi)。
該研究在合適的動物房中進行，室溫設(shè)置為21-23℃以及相對濕度為≥50％。動物房照明以提供12小時光照和12小時黑暗的循環(huán)。光照從06.00至18.00點。
將動物在用稻草作為草墊的圍欄中圈養(yǎng)，每個圍欄中共有6只動物。
在研究期間動物自由接觸家養(yǎng)質(zhì)量的飲用水，但是從給藥前那一天約4pm直到給藥后約12小時禁食。
將動物在到來時和給藥的天稱重。
動物接受單次靜脈內(nèi)或皮下注射。皮下注射在頸部右側(cè)，大約離耳朵5-7cm和離頸中部7-9cm處給予。注射用具有塞子的注射針進行，使得能引入0.5cm的針頭。
將每種試驗物質(zhì)給予三只動物。每只動物接受2nmol/kg體重的劑量。
每周給藥六只動物而剩下的六只動物不給藥。
從每只動物獲得完全血漿濃度-時間曲線。根據(jù)下面的時間表收集血樣 靜脈內(nèi)施用后 給藥前(O)、注射后0.17(10分鐘)、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96和120小時。
皮下施用后 給藥前(O)、注射后0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96和120小時。
在每次取樣時間，從每只動物抽取2ml血液。血樣從頸靜脈抽取。
將血樣收集進試管中，試管含有用于穩(wěn)定的緩沖液以便防止GLP-1類似物的酶促降解。
將血漿立即轉(zhuǎn)移至Micronic管中。大約200μl血漿轉(zhuǎn)移至每個Micronic管中。將血漿在-20℃下存儲直到被測定。使用免疫測定法測定血漿樣品的GLP-1類似物的含量。
通過非房室藥物動力學(xué)分析來分析血漿濃度-時間曲線。計算每一時刻的下列藥物動力學(xué)參數(shù)AUC、AUC/劑量、AUC％外推、Cmax、tmax、λz、t、CL、CL/f、Vz、Vz/f和MRT。
在Danish Landrace豬中測試選擇的本發(fā)明化合物。
GLP-1類似物在豬中的藥物動力學(xué)測試 將豬(50％Duroc，25％Yorkshire，25％Danish Landrace，大約40kg)從試驗開始時禁食。以50μM等滲溶液(5mM磷酸鹽，pH 7.4，0.02％Tween-20(Merck)，45mg/ml甘露醇(無熱原，Novo Nordisk))將每千克體重0.5nmol試驗化合物施用給每只豬。從頸靜脈中的導(dǎo)管抽取血樣。將5ml血樣注入含有175μl下列溶液的冷的玻璃杯中0.18M EDTA、15000KIE/ml抑酶肽(Novo Nordisk)和0.30mM纈氨酸-吡咯烷(Pyrrolidide)(Novo Nordisk)，pH 7.4。在30分鐘內(nèi)，將樣品在5-6000＊g下離心10分鐘。保持溫度在4℃。將上清液移液到不同的玻璃杯中并在-20℃下保持直到使用。
肽的血漿濃度使用不同的單-或多克隆抗體以夾層ELISA或通過RIA測定。抗體的選擇取決于GLP-1衍生物。根據(jù)選擇的特定GLP-1衍生物，達到血漿峰值濃度的時間在寬的范圍內(nèi)變化。
用于在96孔微量滴定板中夾層ELISA的一般測定方案 包被緩沖液(PBS)磷酸鹽緩沖鹽水，pH7.2 洗滌緩沖液(PBS-洗滌)磷酸鹽緩沖鹽水，0.05％v/v吐溫20，pH 7.2 檢測緩沖液(BSA-緩沖液)磷酸鹽緩沖鹽水，10g/l牛血清白蛋白(Fluka 05477)，0.05％v/v吐溫20，pH7.2 鏈霉抗生物素-緩沖液磷酸鹽緩沖鹽水，0.5M NaCl，0.05％v/v吐溫20，pH7.2 標(biāo)準(zhǔn)品血漿基質(zhì)中的單獨化合物 A-TNP無義(Nonsens)抗體 AMDEX鏈霉抗生物素(Streptavin)-辣根過氧化物酶(Amersham RPN4401V) TMB-底物3，3’，5，5’四甲基聯(lián)苯胺(＜0.02％)，過氧化氫測定法如下實施(容量/孔) 1.)用100μl捕獲抗體(PBS緩沖液中5μg/ml)包被 →孵育o/n，4℃ →5×PBS-洗滌→用最后的洗滌封閉至少30分鐘 →然后倒空平板 2.)20μl樣品+100μl生物素化的檢測抗體(具有10μg/ml A-TNP的BSA緩沖液中1μg/ml) →在室溫下于振蕩器上孵育2小時→5×PBS-洗滌，然后倒空平板 3.)100μl AMDEX，以1∶8000于鏈霉抗生物素緩沖液中 →在室溫下振蕩器上孵育45-60分鐘 →5×PBS-洗滌，然后倒空平板 4.)100μl TMB-底物 →在室溫下振蕩器上孵育X分鐘 →用100μl 4M H3PO4終止反應(yīng) 讀取在450nm處的吸光度，用620nm處的吸光度作為參照 從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中的濃度。
用于RIA的一般測定方案 DB-緩沖液80mM磷酸鹽緩沖液、0.1％人血清白蛋白、10mMEDTA，0.6mM硫柳汞，pH7.5 FAM-緩沖液40mM磷酸鹽緩沖液、0.1％人血清白蛋白，0.6mM硫柳汞，pH7.5 活性炭40mM磷酸鹽緩沖液、0.6mM硫柳汞、16.7％牛血漿，15g/l活性炭，pH7.5(在4℃下于使用前混合該懸浮液最少1小時) 標(biāo)準(zhǔn)品血漿基質(zhì)中的單獨化合物 測定法如下在minisorp管(12×75mm(容量/管))中實施 混合-在4℃下孵育30分鐘-在3000rpm下離心30分鐘-轉(zhuǎn)移上清液至新的試管后，立即用塞子密封并在γ計數(shù)器上計數(shù)1分鐘。
從各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中的濃度。
GLP-1放射受體測定法(RRA) 該方法是使用LEADseeker成像粒子的放射-配體結(jié)合測定法。該測定法由以下組成含有GLP-1受體的膜片段、未標(biāo)記的GLP-1類似物、用125I標(biāo)記的人GLP-1和用麥胚凝集素(WGA)包被的PS LEADseeker粒子。冷的和經(jīng)125I標(biāo)記的GLP-1將會競爭結(jié)合至受體。當(dāng)加入LEADseeker粒子時，它們將會通過WGA-殘基與膜片段上的糖殘基結(jié)合。125I-分子和LEADseeker粒子之間的接近引起粒子的光發(fā)射。LEADseeker將會使發(fā)射的光成像并將其可逆地與樣品中存在的GLP-1類似物的量相互關(guān)聯(lián)。
試劑&材料 動物血漿的預(yù)處理將動物血漿在56℃下加熱處理4小時并在10.000rpm下離心10分鐘。之后，加入Val-Pyr(10μM)和抑酶肽(aprotenin)(500KIE/mL)并在＜-18℃下保存直到使用。
GLP-1類似物校準(zhǔn)品將GLP-1類似物摻入熱處理的血漿中以產(chǎn)生約1μM至1pM范圍的稀釋種類(lines)。
GLP-1 RRA測定緩沖液25mM Na-HEPES(pH＝7.5)、2.5mMCaCl2、1mM MgCl2、50mM NaCl、0.1％卵清蛋白、0.003％吐溫20、0.005％桿菌肽、0.05％NaN3。
GLP-1受體懸浮液從表達人胰腺GLP-1受體的幼倉鼠腎(BHK)細胞純化GLP-1受體膜片段。在＜-80℃下保存直到使用。
WGA-偶聯(lián)的聚苯乙烯LEADseeker成像珠(RPNQ0260，Amersham)將珠用GLP-1RRA檢測緩沖液重構(gòu)為13.3mg/mL的濃度。隨后加入GLP-1受體膜懸浮液并且將其在使用前翻轉(zhuǎn)地(endover end)冷(2-8℃)孵育至少1小時。
[125I]-GLP-1(7-36)酰胺(Novo Nordisk A/S)。在＜-18℃下保存直到使用。
99.9％vol的乙醇(De Dansk Spritfabrikker A/S)在＜-18℃下保存直到使用。
MultiScreenSolvinert 0.45μm疏水性PTFE板(MSRPN0450.Millipore Corp.) 聚丙烯板(目錄號650201，Greiner Bio-One) 白色聚苯乙烯384-孔平板(目錄號781075，Greiner Bio-One) 儀器 水平式平板混合器 具有標(biāo)準(zhǔn)吊桶式微量滴定板轉(zhuǎn)頭部件的離心機 UltraVap-Drydown樣品濃縮儀(Porvair) LEADseekerTM多模式成像系統(tǒng)(Amersham) 測定方法 樣品制備 將MultiScreenSolvinert濾器板安裝于化學(xué)相當(dāng)?shù)慕邮掌靼?即，聚丙烯板)上用來收集濾液。
將150μL冰冷的99.9％乙醇加入MultiScreenSolvinert濾器板的空孔中，之后加入50μL校準(zhǔn)品或血漿樣品。將保存蓋置于濾板上。
在18-22℃下于水平式平板混合器上孵育15分鐘。
將具有蓋子的組裝的濾器和接收器板置入標(biāo)準(zhǔn)吊桶式微量滴定板轉(zhuǎn)頭部件中。隨后在1500rpm下將濾液收集于接收器板的空孔中2分鐘。
用UltraVap在熱的(40℃)N2下干燥濾液持續(xù)15分鐘。通過加入100μL GLP-1RRA測定緩沖液至每孔中，重構(gòu)所述干的材料。在水平式混合器中孵育5分鐘。
GLP-1放射受體測定法 使用下面的吸移方案和白色聚苯乙烯384-孔平板 ·35μL GLP-1RRA測定緩沖液 ·5μL重構(gòu)的濾液。
·10μL[125I]-GLP-1(7-36)酰胺。在使用前將儲液在GLP-1RRA測定緩沖液中稀釋至20.000cpm/孔。
·預(yù)包被至WGA-聚苯乙烯LEADseeker成像珠(0.2mg/孔)上的15μL GLP-1受體膜片段(≈0.5μg/孔)。
密封所述板并在18-22℃下孵育過夜。
每個孔的光發(fā)射用LEADseekerTM多模式成像系統(tǒng)檢測，持續(xù)10分鐘。
在表達克隆的人GLP-1受體的細胞系中cAMP形成的刺激。
將來自表達人GLP-1受體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系BHK467-12A(tk-ts13)的純化質(zhì)膜用GLP-1和肽類似物刺激，并采用購自PerkinElmer Life Sciences的AlphaScreenTM cAMP測定試劑盒測量cAMP產(chǎn)生的效力。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系已經(jīng)在NN制備并選擇高表達的克隆用于篩選。細胞在5％CO2下在DMEM、5％FCS、1％Pen/Strep和0.5mg/ml G418中生長。
將大約80％匯合的細胞用PBS洗滌2次并且用Versene收獲，在1000rpm下離心5分鐘并除去上清液。另外的步驟都在冰上進行。將細胞沉淀顆粒在10ml緩沖液1(20mM Na-HEPES、10mM EDTA，pH＝7.4)中用Ultrathurax均化20-30秒鐘，在20.000rpm下離心15分鐘并將沉淀顆粒再懸浮于10ml緩沖液2(20mM Na-HEPES、0.1mM EDTA，pH＝7.4)中。將懸浮液均化20-30秒鐘并在20.000rpm下離心15分鐘。將在緩沖液2中懸浮、均化和離心重復(fù)一次，并將膜再懸浮于緩沖液2中并準(zhǔn)備用于進一步分析或在-80℃存儲。功能受體測定法用AlphaScreen Technology通過測量肽誘導(dǎo)的cAMP產(chǎn)生來完成。AlphaScreen Technology的基本原理是內(nèi)源性cAMP和外來加入的生物素-cAMP之間的競爭。cAMP的捕獲通過使用與接受體珠綴合的特異性抗體來實現(xiàn)。計數(shù)形成的cAMP并在AlphaFusionMicroplate分析儀上測量。用Graph-Pad Prisme軟件計算EC50值。
權(quán)利要求
1.一種綴合物，它含有共價連接至促胰島素劑的結(jié)構(gòu)完全確定的支化聚合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的綴合物，它由如下通式I表示
ITA-L4-(L3)m-Y1(Y2(Y3(Y4(Y5(Y6)r)q)p)s)n(I)
其中，ITA表示促胰島素劑，從該促胰島素劑中一個氫被從該促胰島素劑中存在的α-氨基上除去，或從該促胰島素劑中任意位置的賴氨酸上存在的ε氨基上除去，
對于第一代二叉化合物，
Y1是Yb；Y2是Z；r、q、p和s都是0；并且n是2；
對于第二代二叉化合物，
Y1和Y2是Yb；Y3是Z；r、q和p都是0；s是4；并且n是2；
對于第三代二叉化合物，
Y1、Y2和Y3都是Yb；Y4是Z；r和q是0；p是8；s是4；并且n是2；
對于第四代二叉化合物，
Y1、Y2、Y3和Y4都是Yb；Y5是Z；r是0；q是16；p是8；s是4；并且n是2；
并且對于第五代二叉化合物，
Y1、Y2、Y3、Y4和Y5都是Yb；Y6是Z；r是32；q是16；p是8；s是4；并且n是2；
其中
對于第一代三叉化合物，
Y1是Yt；Y2是Z；r、q、p和s都是0；并且n是3；
對于第二代三叉化合物，
Y1和Y2是Yt；Y3是Z；r、q和p都是0；s是9；并且n是3；
對于第三代三叉化合物，
Y1、Y2和Y3都是Yt；Y4是Z；r和q是0；p是27；s是9；并且n是3；
并且對于第四代三叉化合物，
Y1、Y2、Y3和Y4都是Yt；Y5是Z；r是0；q是81；p是27；s是9；并且n是3；
其中
其中A是-CO-、-C(O)O-、-P(＝O)(OR)-或-P(＝S)(OR)-，其中R是氫、烷基或任選取代的芳基；
并且B是-NH-或-O-；
條件為，當(dāng)B是-NH-時，則A是-CO-或-C(O)O-，以及當(dāng)B是-O-時，則A是-P(＝O)(OR)-或-P(＝S)(OR)-；
并且其中一個單體層(代)(例如Y1、Y2和Y3)的基團B連接至其中Y具有后面下標(biāo)數(shù)字(例如分別為Y2；Y3和Y4)的鄰近的、后一層的基團A，或者連接至Z；
X3是氮原子、烷三基、芳烴三基、烷三氧基、式-CO-N＜的氨基羰基部分、式-CH2CO-N＜的乙酰氨基部分或下式的部分
-CO-NH-Q-NH-CO-
|
其中Q是烷三基；
X4是烷四基或芳烴四基；
L1是價鍵、氧、亞烷基、亞烷基氧烷基、聚烷氧二基、(聚烷氧基)烷基羰基、氧烷基或(聚烷氧基)烷基；
L2是價鍵、氧、亞烷基、亞烷基氧烷基、聚烷氧二基、(聚烷氧基)烷基羰基、氧烷基或(聚烷氧基)；
L3表示價鍵、亞烷基、氧、聚烷氧二基、氧烷基、烷基氨基、羰基烷基氨基、烷基氨基羰基烷基氨基、羰基烷基羰基氨基(聚烷氧基)烷基氨基、羰基烷氧烷基羰基氨基(聚烷氧基)烷基氨基、烷基羰基氨基(聚烷氧基)烷基氨基、羰基(聚烷氧基)烷基氨基或羰基烷氧烷基氨基；
m是0、1、2、或3；
L4選自價鍵和式-CO-L5-CH＝N-O-的部分，其中L5是價鍵、亞烷基或亞芳基，
Z是氫、烷基、烷氧基、羥烷基、聚烷氧基、氧烷基、?；?、聚烷氧烷基或聚烷氧烷基羰基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的綴合物，其中Y1是Yb(即二叉化合物)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的綴合物，其中X3是下列6個式之一的有分支的三價有機基團
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4的綴合物，其中Y1是Yt(即三叉化合物)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5任一項的綴合物，其中X4是苯-1，3，4，5-四基。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6任一項的綴合物，其中L1是價鍵、氧(-O-)、氧甲基(-OCH2-)或通式-CH2(OCH2CH2)n”-OCH2C(O)-的部分，其中n”是0至10的整數(shù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求2-7任一項的綴合物，其中L2是式(-CH2CH2O-)2的部分，也具有式
-CH2CH2OCH2CH2O-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2-、-CH2CH2OCH2CH2-或-CH2CH2-。
9.根據(jù)權(quán)利要求2-8任一項的綴合物，其中L3是價鍵或二價連接體基團，例如通過下列六個式所說明的那些基團
其中所述二價基團的每一端可以連接至ITA基團。
10.根據(jù)權(quán)利要求2-9任一項的綴合物，其中L4和鄰接的L3是二價連接體基團，例如通過下面8個式所說明的那些基團
其中所述的二價基團的每一端可以連接至ITA基團。
11.根據(jù)權(quán)利要求2-10任一項的綴合物，其中L4是兩種同分異構(gòu)(順式和反式)形式中的氧基亞氨基烷基羰基部分，兩種同分異構(gòu)(順式和反式)形式中的氧基亞氨基烷基芳基羰基部分，或者價鍵。
12.根據(jù)權(quán)利要求2-11任一項的綴合物，其中Z是可以與末端氨基或羥基反應(yīng)的加帽劑，優(yōu)選具有下列三個式之一的基團
其中Me是甲基。
13.根據(jù)權(quán)利要求2-12任一項的綴合物，其中A是如下三個部分之一-CO-、-P(O)O-和-P(S)O-。
14.根據(jù)權(quán)利要求2-13任一項的綴合物，其中B是氧或-NH-部分。
15.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項的綴合物，其中所述的促胰島素劑是GLP-1肽或毒蜥外泌肽-4肽。
16.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項的綴合物，其中所述的促胰島素劑(ITA)是DPPIV保護的肽。
17.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項的綴合物，其中所述的促胰島素劑(ITA)具有小于1nM的EC50，該EC50是通過本申請中公開的功能受體測定法測定的。
18.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項的綴合物，其中所述的促胰島素劑(ITA)具有小于300pM，小于200pM或小于100pM的EC50，該EC50是通過本申請中公開的功能受體測定法測定的。
19.根據(jù)上述權(quán)利要求任意一項的綴合物，其中所述的促胰島素劑(ITA)選自含有式(II)氨基酸序列的肽
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46
式(II)(SEQ ID No3)
其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、Nα-乙?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；
Xaa8是Ala、D-Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基環(huán)丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(1-氨基環(huán)戊基)羧酸、(1-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸；
Xaa16是Val或Leu；
Xaa18是Ser、Lys或Arg；
Xaa19是Tyr或Gln；
Xaa20是Leu或Met；
Xaa22是Gly、Glu或Aib；
Xaa23是Gln、Glu、Lys或Arg；
Xaa25是Ala或Val；
Xaa26是Lys、Glu或Arg；
Xaa27是Glu或Leu；
Xaa30是Ala、Glu或Arg；
Xaa33是Val或Lys；
Xaa34是Lys、Glu、Asn或Arg；
Xaa35是Gly或Aib；
Xaa36是Arg、Gly或Lys；
Xaa37是Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、酰胺或不存在；
Xaa38是Lys、Ser、酰胺或不存在；
Xaa39是Ser、Lys、酰胺或不存在；
Xaa40是Gly、酰胺或不存在；
Xaa41是Ala、酰胺或不存在；
Xaa42是Pro、酰胺或不存在；
Xaa43是Pro、酰胺或不存在；
Xaa44是Pro、酰胺或不存在；
Xaa45是Ser、酰胺或不存在；
Xaa46是酰胺或不存在；
條件是如果Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45或Xaa46不存在，則下游的每個氨基酸殘基也不存在。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的綴合物，其中所述的促胰島素劑(ITA)是包含式(III)氨基酸序列的肽
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38
式(III)(SEQ ID No4)
其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、Nα-乙?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；
Xaa8是Ala、D-Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基環(huán)丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(1-氨基環(huán)戊基)羧酸、(1-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸；
Xaa18是Ser、Lys或Arg；
Xaa22是Gly、Glu或Aib；
Xaa23是Gln、Glu、Lys或Arg；
Xaa26是Lys、Glu或Arg；
Xaa30是Ala、Glu或Arg；
Xaa34是Lys、Glu或Arg；
Xaa35是Gly或Aib；
Xaa36是Arg或Lys；
Xaa37是Gly、Ala、Glu或Lys；
Xaa38是Lys、酰胺或不存在。
21.根據(jù)上一權(quán)利要求任意一項的綴合物，其中所述的促胰島素劑(ITA)選自GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、GLP-1(7-36)-酰胺、GLP-1(7-37)、GLP-1(7-38)、GLP-1(7-39)、GLP-1(7-40)、GLP-1(7-41)或其類似物。
22.根據(jù)上述權(quán)利要求任意一項的綴合物，其中所述的促胰島素劑(ITA)與GLP-1(7-37)(SEQ ID No.1)比較，包含不多于15個經(jīng)交換、添加或缺失的氨基酸殘基，或者與GLP-1(7-37)(SEQ ID No.1)比較，包含不多于10個經(jīng)交換、添加或缺失的氨基酸殘基。
23.根據(jù)上一權(quán)利要求的綴合物，其中所述的促胰島素劑(ITA)與GLP-1(7-37)(SEQ ID No.1)比較，包含不多于6個經(jīng)交換、添加或缺失的氨基酸殘基。
24.根據(jù)上述權(quán)利要求任意一項的綴合物，其中所述的促胰島素劑(ITA)包含不多于4個不被遺傳密碼編碼的氨基酸殘基。
25.根據(jù)上述權(quán)利要求任意一項的綴合物，其中所述的促胰島素劑(ITA)包含Aib殘基作為N-端的第二個氨基酸殘基。
26.根據(jù)上述權(quán)利要求任意一項的綴合物，其中所述的促胰島素劑(ITA)的N-端氨基酸殘基(式II和III的位置7)選自D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、Nα-乙?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸。
27.根據(jù)上述權(quán)利要求任意一項的綴合物，其中所述的促胰島素劑(ITA)選自[Arg34]GLP-1(7-37)、[Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Lys36Arg26，34] GLP-1(7-36)、[Aib8，22，35]GLP-1(7-37)、[Aib8，35] GLP-1(7-37)、[Aib8，22]GLP-1(7-37)、[Aib8，22，35 Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22 Arg26，34] GLP-1(7-3 7)Lys、[Aib8，22，35Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35 Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35Arg26]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35 Arg26]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22Arg26]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35 Arg34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Arg34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22Arg34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35Ala37]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Ala37]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22Ala37]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35 Lys37]GLP-1(7-37)、[Aib8，35Lys37]GLP-1(7-37)、[Aib8，22Lys37]GLP-1(7-37)或其在C-端被酰胺化的衍生物、毒蜥外泌肽-4(1-39)、ZP-10，即[Ser38Lys39]毒蜥外泌肽-4(1-39)LysLysLysLysLys-酰胺(SEQ ID No.5)。
28.根據(jù)上述權(quán)利要求任意一項的綴合物，其中所述的促胰島素劑(ITA)通過羧基、氨基、酮基、羥基、巰基或酰肼基團連接至根據(jù)上述權(quán)利要求任意一項的支化聚合物。
29.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項的綴合物，其中所述的化合物具有小于1000pM、小于500pM、小于300pM、小于200pM、小于100pM、小于50pM或小于10pM的EC50，該EC50是通過本申請中公開的功能受體測定法測定的。
30.一種藥物組合物，它包含根據(jù)上述權(quán)利要求任意一項的化合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
31.根據(jù)權(quán)利要求1-29任意一項的化合物在制備藥物中的用途，所述的藥物用于治療或預(yù)防高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐量降低、1型糖尿病、肥胖癥、高血壓、X綜合征、血脂障礙、認(rèn)知障礙、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管疾病、中風(fēng)、炎性腸綜合征、消化不良和胃潰瘍。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的化合物在制備用于延緩或預(yù)防2型糖尿病中疾病發(fā)展的藥物中的用途。
33.一種通過施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-29任一項的化合物來治療或預(yù)防高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐量降低、1型糖尿病、肥胖癥、高血壓、X綜合征、血脂障礙、認(rèn)知障礙、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管疾病、中風(fēng)、炎性腸綜合征、消化不良和胃潰瘍的方法。
全文摘要
綴合有結(jié)構(gòu)完全確定的聚合物的新的GLP-1和它們的治療用途。
文檔編號A61K47/48GK101123992SQ200680005376
公開日2008年2月13日 申請日期2006年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月16日
發(fā)明者C·貝倫斯, J·勞, J·T·科德拉, M·考弗德-漢森, T·K·漢森 申請人:諾和諾德公司