專利名稱：：高分子巖藻依聚糖、其制備方法及化妝品組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：,[平成18年2月22日檢索]，internet〈http://www.rike-vita.co.jp/prouse/health/mekabufukoidan.html>
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的問題05本發(fā)明的課題在于提供制備預(yù)計可作為化妝品或皮膚科領(lǐng)域的藥劑的高分子量巖藻依聚糖的制備方法和含有高分子量巖藻依聚糖的化妝品等。06I本發(fā)明人為了解決上述問題進行了積極的研究，其結(jié)果是用pH6.0以上的中性-堿性熱水提取枝管藻屬(Cladosiphon)的海蘊，通過將最終的pH調(diào)整成6.5以上獲得的重量平均分子量為1,000,000-2，000,000的巖藻依聚糖。進而發(fā)現(xiàn)這樣獲得的巖藻依聚糖可以長期穩(wěn)定地保存，從而完成本發(fā)明。也就是說，第1發(fā)明為一種重量平均分子量為1，000,000-2,000，000并且穩(wěn)定的巖藻依聚糖的制備方法，其特征在于通過用pH6.0以上的熱7jc提取枝管藻屬(Cladosiphon)的海蘊藻體，維持在pH6.5以上，進行除去低分子化合物的操作，并且將最終pH值調(diào)整成6.5以上來獲得。<比較例2〉加水分解巖藻依聚糖水溶液及其乙醇沉淀物的制備用2規(guī)定的硫酸將實施例1獲得的100g高分子量巖藻依聚糖水溶液調(diào)整至pH=5,在各溫度，時間進行加熱處理(7(TC下1小時，7(TC下2小時，9(TC下1小時)，獲得了加水分解巖藻依聚糖水溶液。以下將這些加水分解巖藻依聚糖水溶液分別稱為加水分解巖藻依聚糖水溶液(7tTC,1小時)，加水分解巖藻依聚糖水溶液(7(TC,2小時)，加水分解巖藻依聚糖水溶液(9(TC,l小時)。對100ml這些加水分解巖藻依聚糖水溶液進行同樣的乙醇沉淀，獲得加水分解巖藻依聚糖的乙醇沉淀物。以下將這些加水分解巖藻依聚糖的乙醇沉淀物分別稱為"加水分解巖藻依聚糖(70'C,l小時)"，"加水分解巖藻依聚糖(70'C，2小時)","加水分解巖藻依聚糖(90'C,1小時)，'。[24<實施例3〉重量平均分子量的測定將實施例2獲得的高分子量巖藻依聚糖和比較例2獲得的加水分解巖藻依聚糖的各乙醇沉淀物分別溶解于濃度為Q.lmol/L(升)的氯化鈉水溶液，制成0.05重量％的溶液后，施加到高效液相色譜(HPLC)(柱SB-806HQ(Shodex制)，柱溫度室溫(25'C),洗脫液濃度為0.1mol/L(升)的氯化鈉水溶液，流速1.0ml/min，檢測器RI;f全測器)上，用多角度光散亂檢測器(DAWNEOS(注冊商標第4377194號)Wyatt制)分析各巖藻依聚糖的重量平均分子量(Mw)。其結(jié)果示于表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表5<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>[371在15,30和45分鐘后，高分子量巖藻依聚糖水溶液與純化水相比均顯示出具有保濕性。[381<實施例8〉透明質(zhì)酸酶抑制活性的測定按照專利文獻13中記載的方法，用牛睪丸來源的透明質(zhì)酸酶(Sigma,TypeIV-S)測定由化合物48/80產(chǎn)生的非活性型透明質(zhì)酸酶的活性化階段的抑制活性。也就是說，將實施例2中獲得的高分子量巖藻依聚糖的乙醇沉淀物和比較例2的加水分解巖藻依聚糖(9(TC,1小時)的乙醇沉淀物(加氷分解巖藻依聚糖(9(TC,1小時))分別溶于0.2ml濃度為0.lmot/L(升)的醋酸緩沖液(pH4.0)中，裝入試管中，加入溶解于0.lml相同緩沖液中的透明質(zhì)酸酶(IOO單位)，于37'C溫育20分鐘。然后，加入溶解于0.2ml相同緩沖液中的化合物48/80(0.lmg),再于37'C溫育20分鐘。在其中加入溶解于0.5ral相同緩沖液中的透明質(zhì)酸鈉鹽(O.4mg),于37'C溫育40分鐘后，加入0.2ml濃度為0.4mol/L(升)的氫氧化鈉水溶液，然后置于冰上冷4卩，加入0.2ml正硼酸溶液(將4.5g四硼酸鈣4水合物溶于水中形成100ml溶液)(pH9.1)，煮沸3分鐘。置于冰上冷卻后，加入6mlp-二曱氨基笨曱醛試劑，于37'C溫育20分鐘后，測定585nm處的吸光度。用下式計算抑制率。根據(jù)由各濃度的抑制率制成的透明質(zhì)酸酶的抑制曲線求出50%抑制濃度(IC50)。[39(數(shù)1)抑制率—A-B)/Ax100(%)[40A:對照(使用代替巖藻依聚糖的醋酸緩沖液)的吸光度B:巖藻依聚糖溶液的吸光度[41測定結(jié)果示于表6。[42表6<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>[43!根據(jù)這些結(jié)果，發(fā)現(xiàn)高分子量巖藻依聚糖的透明質(zhì)酸酶抑制活性比加水分解巖藻依聚糖強l.6倍。44<實施例9>保存穩(wěn)定性試驗(加速試樣)對于實施例5制備的高分子量巖藻依聚糖的化妝水，評價其在40'C。2000Lux(勒克斯)的照明下保存4周的穩(wěn)定性。用E型粘度計(EHD型)，圓錐3°，20rpm的旋轉(zhuǎn)數(shù)測定粘度。通過目視評價外觀。其結(jié)果示于表7。45表7<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>[46沒有發(fā)現(xiàn)4(TC，保存4周后粘度降低，外觀發(fā)生變化，從而可知保存穩(wěn)定性優(yōu)異。[47<實施例10>保濕性的評價(2)(與實施例7不同的另一個實驗)用肥皂清洗受試者的前腕內(nèi)側(cè)部。干燥后，于21。C，相對濕度50°/下調(diào)節(jié)后，在兩腕的平均4個試驗區(qū)(2個試驗區(qū)/腕)上的每一個試驗區(qū)上畫直徑為2cm的圓，在圓的內(nèi)側(cè)涂布平均10nL通過將蒸餾水，高分子量巖藻依聚糖水溶液(實施例1),加水分解巖藻依聚糖水溶液(70C，1小時)，加水分解巖藻依聚糖水溶液(7(TC,2小時)，加水分解巖藻依聚糖水溶液(90°C,1小時)的各乙醇沉淀物溶解于純化水中調(diào)制的1重量°/。的水溶液。處理200分鐘后于上述環(huán)境下穩(wěn)定，用CORNEOMETERCM825(CKelectronicGmbH)測量皮膚水分，計算4區(qū)的平均值。以純化水涂布區(qū)的數(shù)值為1,計算相對皮膚水分。其結(jié)果示于表8。[48表8<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>[49高分子量巖藻依聚糖與純化水，加水分解巖藻依聚糖相比，顯示出顯著的高保濕性。50<實施例u〉保水性評價將平均10liL通過將蒸餾水，高分子量巖藻依聚糖水溶液(實施例i),加水分解巖藻依聚糖水溶液(70。C,l小時)，加水分解巖藻依聚糖水溶液(7(TC,2小時)，加水分解巖藻依聚糖水溶液(90。C,1小時)的各乙醇沉淀物溶解于純化水中調(diào)制的0.5重量％的水溶液用濾紙?zhí)幚?，?1'C，相對濕度50°/。的環(huán)境下，用電子天平測定每一份的重量，求出水分蒸發(fā)量。通過10分鐘后的測量計算水分蒸發(fā)速度，求出純化水的蒸發(fā)速度為1時的相對蒸發(fā)速度。其結(jié)果示于表9。[51表9<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>521<實施例12〉美容美發(fā)溶液的制備用實施例1制備的高分子量巖藻依聚糖水溶液(干燥殘渣的重量1.2%),實施例2制備的加水分解巖藻依聚糖水溶液(90'C，1小時)，純化水，乙醇制備美容美發(fā)溶液。各美容美發(fā)溶液的組成示于表10。[53表10美容美發(fā)溶液巖藻依聚糖水溶液純化水乙醇A206020B206020注表中的數(shù)值表示巖藻依聚糖水溶液，純化水和乙醇的重量比在美容美發(fā)溶液A中，巖藻依聚糖水溶液使用高分子量巖藻依聚糖水溶液(實施例1)，在美容美發(fā)溶液B中，巖藻依聚糖水溶液使用加水分解巖藻依聚糖水溶液(90'C,1小時)。54j<實施例13〉采用損傷人毛的感觀評價通過用市售的漂白劑處理5次人毛黑發(fā)(匕'工D，少夕7制，10g)制備損傷人毛。清洗，干燥后，通過對2ml實施例12的美容美發(fā)溶液A進行噴射處理，使之干燥。干燥后，比較與美容美發(fā)溶液B的指尖的光滑，潮濕感，柔軟感。其結(jié)果示于表ll。并且，優(yōu)于比較例2時為0，同等時為厶，比其差時為x。[55J表i1試樣名光滑潮濕感柔軟感美容美發(fā)溶液AOo〇美容美發(fā)溶液B△△〇[56<實施例14>細胞活化評價將人表皮纖維母細胞(NB1RGB抹)以5.0x103細胞/孔接種于96孔板上，在DMEM培養(yǎng)基(牛血清1W上培養(yǎng)48小時。將培養(yǎng)基換成含有預(yù)定濃度的實施例1中制備的高分子量巖藻依聚糖水溶液(干燥殘渣的重量1.2W，實施例2中制備的加水分解巖藻依聚糖水溶液(70'C,1小時)，加水分解巖藻依聚糖水溶液(70'C，2小時)的各乙醇沉淀物的DMEM培養(yǎng)基后，再培養(yǎng)48小時，提供給WST-1測試。以與陰性對照(不添加巖藻依聚糖的DMEM培養(yǎng)基(牛血清1%))的值作為100°/。的相對值表示細胞活化活性。均連續(xù)實施兩次。其結(jié)果示于表12中。57表12<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>[581表中的數(shù)值表示以與陰性對照(DMEM培養(yǎng)基(牛血清1%))的值作為100%的細胞活化活性的相對值。[591<實施例15>巖藻依聚糖的構(gòu)成成分用曱酸(135'C，6小時)，接著用2M三氟醋酸(U0。C,6小時)對實施例2中獲得的高分子量巖藻4衣聚糖沉淀物進行加水分解，用HPLC(柱Cosmosi1Sugar-D，六力，4亍X夕制，溶劑乙腈10mM磷酸緩沖液=75:25,流速=1.OmL/rain,RI檢測器)分析。其結(jié)果表明，主要構(gòu)成糖為巖藻糖，還含有葡糖醛酸。而且，用口^;/》酸法分析高分子量巖藻依聚糖沉淀物，通過溶解于重水中于60'CNMR(500MHz,日本電子制)測定硫酸基含量，根據(jù)1.3ppm附近的巖藻糖的甲基峰和2.2ppm的乙?；宓拿娣e比求出乙?；斜?。巖藻糖為1.0時的葡糖醛酸和乙?；斜仁居诒?3。60表13構(gòu)成分子比<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>[611而對于沉淀中的硫酸基，測得其含量為16.9重量％。權(quán)利要求1.重量平均分子量為1,000,000-2,000,000的巖藻依聚糖的制備方法，其包括用pH6.0以上的熱水提取枝管藻屬(Cladosiphon)的海蘊藻體的步驟，通過將pH值維持在6.5以上除去低分子化合物的步驟，以及將最終pH值調(diào)整成6.5以上的步驟。2.通過包括用pH6.0以上的熱水提取枝管藻屬(Cladosiphon)的海蘊藻體的步驟，將pH值維持在6.5以上除去低分子化合物的步驟，以及將最終pH值調(diào)整成6.5以上的步驟的制備方法獲得的重量平均分子量為1,000,000-2，000,000的巖藻依聚糖。3.重量平均分子量為1,000,000-2,000,000的巖藻依聚糖。4.權(quán)利要求2或權(quán)利要求3中記載的巖藻依聚糖，其中，用C型粘度計于20rpm,25'C下測得干燥殘渣重量為1.0-2.0重量y。的水溶液的粘度為600-1500mPa.s。5.含有權(quán)利要求2-4中任一項記栽的巖藻依聚糖的巖藻依聚糖含有組合物。6.根據(jù)權(quán)利要求5中記載的巖藻依聚糖含有組合物，所述巖藻依聚糖含有組合物為化妝品，皮膚細胞活化劑或抗過敏劑。全文摘要本發(fā)明提供一種預(yù)計作為化妝品和皮膚科領(lǐng)域的藥劑的高分子量巖藻依聚糖的制備方法以及含有高分子量巖藻依聚糖的組合物。用pH6.0以上的中性-堿性熱水提取枝管藻屬(Cladosiphon)的海蘊，通過超濾除去低分子化合物，最后將pH調(diào)整成6.5以上，從而獲得重量平均分子量為1,000,000-2,000,000的巖藻依聚糖含有物，該含有物可作為有效的化妝品和皮膚科領(lǐng)域藥劑，且保存穩(wěn)定性優(yōu)異。文檔編號A61K8/73GK101098894SQ200680001708公開日2008年1月2日申請日期2006年3月1日優(yōu)先權(quán)日2005年3月1日發(fā)明者中本泰,秦野耕司,金築祐申請人:宇部興產(chǎn)株式會社