專利名稱：用于對iap抑制卡斯蛋白酶進(jìn)行去阻遏的方法及組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是在國家健康研究院(National Institute of Health)/國家癌癥研究院(National Cancer Institute)授予的許可號CA78040下由政府支持進(jìn)行的。美國政府對本發(fā)明擁有一定權(quán)利。

背景技術(shù)：
本發(fā)明總體上涉及分子醫(yī)學(xué)，更具體而言涉及用于改變與調(diào)節(jié)細(xì)胞程序性死亡有關(guān)的分子相互作用的組合物及方法。
身體內(nèi)的正常組織或是由已達(dá)到一最終分化狀態(tài)并不再進(jìn)行分裂的細(xì)胞形成或是由經(jīng)一段時(shí)間后死亡并由許多正在分裂的細(xì)胞所取代的細(xì)胞形成。舉例而言，神經(jīng)組織在發(fā)育早期形成且神經(jīng)組織的細(xì)胞在產(chǎn)生后不久即達(dá)到最終分化狀態(tài)。相反，身體具有許多可自我更新的組織，例如皮膚、腸、骨髓及性器官，這些組織的細(xì)胞經(jīng)歷著一產(chǎn)生與死亡的平衡變化過程。該變化過程導(dǎo)致一般成年人體內(nèi)每天產(chǎn)生500至700億個(gè)細(xì)胞，且在一若干年的時(shí)間內(nèi)，所產(chǎn)生的細(xì)胞總量等于整個(gè)體重，其通過以調(diào)節(jié)方式清除等量的細(xì)胞來保持平衡。在自我更新組織中，此種清除部分通過稱為細(xì)胞凋亡的細(xì)胞程序性死亡過程來維持，其中細(xì)胞在基因上被編程為在一定時(shí)間后死亡。
細(xì)胞凋亡在有機(jī)體發(fā)育過程期間特別突出，其間執(zhí)行過渡性功能的細(xì)胞被編程為在不再需要其功能后死亡。另外，經(jīng)受了重大基因改變的細(xì)胞亦可發(fā)生凋亡，由此為有機(jī)體提供了一種清除自身有缺陷并有可能形成癌癥的細(xì)胞的途徑。將一有機(jī)體暴露于各種外界刺激(包括，例如，細(xì)菌毒素、酒精及紫外線輻射)下亦可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。用于治療癌癥的化學(xué)治療試劑亦是強(qiáng)效的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。
程序性細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)是一個(gè)涉及若干途徑的復(fù)雜過程，其偶爾會出現(xiàn)缺陷。已知該過程對維持一組織中的穩(wěn)態(tài)細(xì)胞數(shù)量及在一有機(jī)體發(fā)育期間維持適當(dāng)?shù)募?xì)胞具有重要作用，所以程序性細(xì)胞死亡中的缺陷通常會伴隨有病理狀況。據(jù)估計(jì)，超過一半的目前尚無滿意療法的疾病與細(xì)胞死亡過少或過多有關(guān)。
有機(jī)體中程序性細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)異?？梢鸲喾N疾病狀態(tài)。舉例而言，有的缺陷導(dǎo)致一組織中細(xì)胞凋亡速度低于維護(hù)組織穩(wěn)定狀態(tài)所需的正常水平，從而導(dǎo)致該組織中細(xì)胞的數(shù)量增加。已在多種癌癥中發(fā)現(xiàn)了此一可增加細(xì)胞數(shù)量的機(jī)制，其中腫瘤并非由癌細(xì)胞的分裂速度比正常細(xì)胞快所致，而是因?yàn)檫@些細(xì)胞不以正常速度死亡。
由此，人們需要可對程序性細(xì)胞死亡途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)的試劑及用于對患有與細(xì)胞程序性死亡調(diào)節(jié)異常相關(guān)的疾病的個(gè)體進(jìn)行治療的方法。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供若干具有一核心肽的分離試劑，該核心肽選自由核心肽4至39及42至55組成的組群，其中該試劑可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏。本發(fā)明亦提供一種具有一選自任何圖5、9、10、14B及21至24中所示結(jié)構(gòu)的核心結(jié)構(gòu)的分離制劑，其中該試劑可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的方法。該方法包括使一IAP抑制卡斯蛋白酶與有效量的一試劑接觸，以除去該IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏，該試劑具有一核心基元及一核心結(jié)構(gòu)，其中該核心基元選自由具有任何核心肽4至39及42至55中所示的一序列的核心肽組成的組群，該核心結(jié)構(gòu)選自由TPI759、TPI882、TPI914或TPI927組成的組群。本發(fā)明的方法亦可用于促進(jìn)一細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡并用于減輕一特征為細(xì)胞凋亡速度降低的病狀的嚴(yán)重程度。本發(fā)明亦提供若干用于鑒別IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏試劑的方法。



圖1所示為一標(biāo)繪圖，其顯示在含與不含由若干六肽的混合物組成的TPI1328庫中各肽的情況下所獲得的乙?；?DEVD-7-胺基-4-三氟甲基香豆素(Ac-DEVD-AFC)水解的Vmax比值(其中Vmax等于RFU/min)。
圖2所示圖表列出了TPI1313庫的各個(gè)四肽及在含與不含各肽的情況下Ac-DEVD-AFC水解的Vmax比值。該比值＝(含肽、卡斯蛋白酶3及XIAP時(shí)的Vmax)/(含卡斯蛋白酶3及XIAP時(shí)的Vmax)。
圖3顯示了TPI1313庫中各四肽的結(jié)構(gòu)。
圖4顯示了TPI914N-?；肺恢脪呙杞M合庫中發(fā)現(xiàn)可作為XIAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的混合物中所定義的官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)。各方框下所列的第一個(gè)化學(xué)名稱為可從中獲得R基團(tuán)的試劑的名稱，而各方框下所列的第二個(gè)化學(xué)名稱為各R位置處的官能團(tuán)的名稱。各官能團(tuán)的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)與得出該官能團(tuán)的試劑的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)相同。
圖5顯示了TPI914N-酰基三胺庫中發(fā)現(xiàn)可作為一XIAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的各種化合物的結(jié)構(gòu)。圖表各條目處所列第一個(gè)化學(xué)名稱為從中獲得R基團(tuán)的試劑的名稱，所列第二個(gè)化學(xué)名稱為各R位置處的官能團(tuán)的名稱。各官能團(tuán)的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)與得出該官能團(tuán)的試劑的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)相同。
圖6顯示了TPI927多苯基脲位置掃描組合庫中發(fā)現(xiàn)可作為一XIAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的混合物中所定義的官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)。各方框中的化學(xué)名稱為從中獲得R基團(tuán)的試劑的名稱，而各方框下的化學(xué)名稱為各R位置處的官能團(tuán)的名稱。各官能團(tuán)的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)與得出該官能團(tuán)的試劑的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)相同。對于其中分子的核心結(jié)構(gòu)經(jīng)過修飾的結(jié)構(gòu)25、73、86及88而言，圖中所示為所生成的經(jīng)修飾核心結(jié)構(gòu)及R基團(tuán)。
圖7所示為TPI882 C-6-酰胺基雙環(huán)胍?guī)熘邪l(fā)現(xiàn)可作為XIAP-抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的混合物中所定義的官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)。各方框中的化學(xué)名稱為從中獲得R基團(tuán)的試劑的名稱，而各方框下的化學(xué)名稱為各R位置處的官能團(tuán)的名稱。各官能團(tuán)的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)與得出該官能團(tuán)的試劑的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)相同。
圖8顯示了TPI759 N-芐基-1，4，5-三取代-2，3-二酮基呱嗪位置掃描組合庫中發(fā)現(xiàn)可作為一XIAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的混合物中所定義的官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)。各方框下所列的第一個(gè)化學(xué)名稱為從中獲得R基團(tuán)的試劑的名稱，而各方框下所列的第二個(gè)化學(xué)名稱為各R位置處的官能團(tuán)的名稱。各官能團(tuán)的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)與得出該官能團(tuán)的試劑的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)相同。
圖9顯示了TPI927多苯基脲庫中發(fā)現(xiàn)可作為一XIAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的各化合物的結(jié)構(gòu)。各方框中的化學(xué)名稱為從中獲得R基團(tuán)的試劑的名稱，而各方框下的化學(xué)名稱為各R位置處的官能團(tuán)的名稱。各官能團(tuán)的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)與得出該官能團(tuán)的試劑的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)相同。
圖10顯示了TPI882 C-6-醯胺基雙環(huán)胍?guī)熘邪l(fā)現(xiàn)可作為一XIAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的各化合物的結(jié)構(gòu)。各方框中的化學(xué)名稱為從中獲得R基團(tuán)的試劑的名稱，而各方框下的化學(xué)名稱為各R位置處的官能團(tuán)的名稱。各官能團(tuán)的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)與得出該官能團(tuán)的試劑的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)相同。
圖11顯示了TPI1239庫中被視為XIAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的混合物的劑量反應(yīng)。所示值為含與不含各混合物的情況下Ac-DEVD-AFC的水解Vmax比值。所含卡斯蛋白酶或XIAP的劑量列于各欄的頂部。
圖12顯示了L-3-(2-噻吩基)-丙氨酰基-L-(2-萘基)-丙氨?；?L-對氯代-苯基丙氨酰基-L-(e-笏基甲氧基羰基)-賴氨酸(TPI792-33；核心肽16)及L-3-(2-噻吩基)-丙氨?；?L-(2-萘基)-丙氨酰基-D-(e-笏基甲氧基羰基)-賴氨酰-L-(e-笏基甲氧基羰基)-賴氨酸(TPI792-35；核心肽17)的結(jié)構(gòu)。
圖13顯示了VP-16(吡喃葡糖苷(etoposide))、TPI792-35、TPI792-33及SMAC AVPI四肽(SEQ ID NO4)對前列腺癌細(xì)胞存活率的影響。
圖14顯示了TPI1396庫中苯基脲化合物及TPI1391庫中二酮基呱嗪化合物(A組)的一般化結(jié)構(gòu)以及化合物TPI1391-28、TPI1391-21、TPI1396-34、TPI1396-22、TPI1396-11、TPI1396-12(B組)的結(jié)構(gòu)。
圖15顯示了TPI1391-28及TPI1396-34對居卡(Jurkat)白血病細(xì)胞的濃度依賴性殺傷力。
圖16顯示了TPI1391-28及TPI1396-34與分別具有類似核心藥效基團(tuán)但不同R基團(tuán)的對照化合物對居卡白血病細(xì)胞所具殺傷力的比較。
圖17顯示了TPI1396-34及TPI1391-28對正常骨髓細(xì)胞與居卡白血病細(xì)胞所具影響的對比。
圖18顯示了野生型XIAP的超表達(dá)對TPI1396-34的促細(xì)胞凋亡活性的影響。
圖19顯示了野生型XIAP的超表達(dá)對TPI1396-34的促細(xì)胞凋亡活性的影響。
圖20顯示了TPI792-3、TPI792-9、TPI792-15、TPI792-17、TPI792-19、TPI792-22、TPI792-27、TPI792-33及TPI792-35的結(jié)構(gòu)。
圖21顯示了試劑TPI1349-1至TPI1349-34的結(jié)構(gòu)及各試劑在SMAC競爭分析中具有1.8或更高比值時(shí)所具有的分子量、質(zhì)量以及最低濃度。
圖22顯示了試劑TPI1396-1至TPI1396-65的結(jié)構(gòu)及各試劑在SMAC競爭分析中具有1.8或更高比值時(shí)所具有的分子量、質(zhì)量以及最低濃度。
圖23顯示了試劑TPI1391-1至TPI1391-36的結(jié)構(gòu)及各試劑在SMAC競爭分析中具有1.8或更高比值時(shí)所具有的分子量、質(zhì)量以及最低濃度。
圖24顯示了試劑TPI1400-1至TPI1400-58的結(jié)構(gòu)及各試劑在SMAC競爭分析中具有1.8或更高比值時(shí)所具有的分子量、質(zhì)量以及最低濃度。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明提供了若干可阻止一細(xì)胞凋亡蛋白抑制劑(IAP)抑制一卡斯蛋白酶的蛋白酶活性或阻止其與一卡斯蛋白酶結(jié)合的試劑。本發(fā)明試劑的一優(yōu)點(diǎn)在于其可用于使其中細(xì)胞凋亡被一IAP的調(diào)節(jié)活性阻止的細(xì)胞中發(fā)生細(xì)胞凋亡。因此，本發(fā)明提供了若干通過向細(xì)胞中投予一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑來降低一細(xì)胞群在活體內(nèi)或活體外存活能力的方法。在此一方法中使用一對一特定IAP抑制卡斯蛋白酶具有特異性的試劑可選擇性地靶向并殺死一較大的混雜細(xì)胞群中的一子細(xì)胞群。本發(fā)明亦提供一種通過向一患病特征為細(xì)胞凋亡速度呈病理降低(例如癌癥或增生)的個(gè)體投予一本發(fā)明試劑來治療該個(gè)體所患病癥的方法，其中該試劑可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏，由此可提高細(xì)胞凋亡速度。
本發(fā)明亦提供若干用于鑒別細(xì)胞凋亡抑制劑調(diào)節(jié)試劑的方法。用本發(fā)明的方法可檢測一候選試劑在阻止一細(xì)胞凋亡蛋白抑制劑(IAP)抑制一卡斯蛋白酶的蛋白酶活性或阻止IAP結(jié)合至一卡斯蛋白酶方面的能力。卡斯蛋白酶在未受到抑制時(shí)可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，通過本發(fā)明方法測定為可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑可視為一使細(xì)胞凋亡能夠在存在負(fù)調(diào)節(jié)成分的情況下發(fā)生的試劑。本發(fā)明方法的一優(yōu)點(diǎn)在于，其能夠以一高處理量形式實(shí)施，由此可有效地篩選大規(guī)模的候選試劑庫，從而鑒別出多種IAP抑制卡斯蛋白酶的去阻遏劑。
本文所用術(shù)語“卡斯蛋白酶”意指半胱氨酸天冬氨?；禺愋缘鞍酌讣易宓囊怀蓡T，該蛋白酶家族可將一多肽中的C端解離為一天冬氨酸殘基并與導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的細(xì)胞死亡途徑有關(guān)。該術(shù)語意欲與其在本技術(shù)中的使用一致，如(例如)Martin及Green在Cell(82349-352(1995))中所闡述?？ㄋ沟鞍酌敢郧胺Q為“Ice”蛋白酶，這是基于其與該家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員介白素(IL-1β)轉(zhuǎn)化酶(Ice)的同源性，介白素轉(zhuǎn)化酶可將IL-1β的滅活33千道爾頓(kDa)形式轉(zhuǎn)化為活性17.5kDa形式。人們發(fā)現(xiàn)該Ice蛋白酶與秀麗新小桿線蟲(Caenorhabditis elegans)ced-3基因同源，其與秀麗新小桿線蟲發(fā)育期間的細(xì)胞凋亡有關(guān)，且轉(zhuǎn)染試驗(yàn)顯示Ice在纖維母細(xì)胞中的表達(dá)在細(xì)胞中誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡(參見Martin及Green，見上述文獻(xiàn)，1995)。因此，該術(shù)語包括Ice及ced-3。
人們已鑒別出其它與Ice及ced-3同源的多肽并將其稱為卡斯蛋白酶，各卡斯蛋白酶均通過一編號加以識別。舉例而言，最早鑒別出的Ice蛋白酶現(xiàn)稱為卡斯蛋白酶-1，稱為卡斯蛋白酶-3的蛋白酶以前曾分別被稱為CPP32、YAMA及凋亡素(apopain)，以前稱為Mch6或ICE-LAP6的蛋白酶現(xiàn)命名為卡斯蛋白酶-9。蛋白酶的卡斯蛋白酶家族的特征在于，每一卡斯蛋白酶均是一可將C端解離為一天冬氨酸殘基的半胱氨酸蛋白酶且各具有一通常包含氨基酸序列QACXG(SEQ ID NO1)的保守活性位點(diǎn)半胱氨酸，其中X可為任一氨基酸且通常為精氨酸?？ㄋ沟鞍酌缚蛇M(jìn)一步細(xì)分為具有DEVD(SEQ ID NO2)解離活性的卡斯蛋白酶(包括卡斯蛋白酶-3及卡斯蛋白酶-7)以及具有YVAD(SEQ ID NO3)解離活性的卡斯蛋白酶(包括卡斯蛋白酶-1(Martin及Green，見上述文獻(xiàn)，1995))。
本文所用術(shù)語“IAP”或“細(xì)胞凋亡抑制劑”意指一可抑制卡斯蛋白酶的蛋白酶解活性的蛋白質(zhì)。該術(shù)語可包括這樣一種蛋白質(zhì)，當(dāng)其與一卡斯蛋白酶結(jié)合時(shí)會抑制該卡斯蛋白酶的蛋白酶解活性。該術(shù)語亦可包括這樣一種蛋白質(zhì)，其通過抑制一上游卡斯蛋白酶的活性而將卡斯蛋白酶前體加工成一成熟形式來抑制一下游卡斯蛋白酶的活性。該術(shù)語亦包括一可誘導(dǎo)一卡斯蛋白酶的泛素化及降解的蛋白質(zhì)。
抗細(xì)胞凋亡蛋白的細(xì)胞凋亡蛋白抑制劑(IAP)家族成員在進(jìn)化過程中得到保留，在脊椎動物及非脊椎動物中均存在同源基因。桿狀病毒IAP、Cp-IAP及Op-IAP是該家族中的第一批被鑒別出來的成員，其鑒別的依據(jù)是其在功能上補(bǔ)充細(xì)胞死亡抑制劑p35(一可結(jié)合至并抑制卡斯蛋白酶的桿狀病毒蛋白)的缺陷的能力。后來，人們已鑒別出了至少7種另外的人類同源基因并證明其可抑制細(xì)胞死亡，其包括X染色體連接的IAP(XIAP，基因庫編號U32974)；細(xì)胞IAP蛋白c-IAP-1/HIAP-2hMIHB及c-IAP-2/HIAP-1/hMIHC(Liston等人，Nature379349-353(1996)；Rothe等人，Cell 831243-1252(1995))；神經(jīng)細(xì)胞凋亡抑制蛋白NAIP(Roy等人，Cell 80167-178(1995))；亦稱為LIVIN的ML-IAP(Vucic等人，Cur.Biol.101359-1366(2000)及Kasof等人，J.Biol.Chem.2763238-3246(2001))；Apollon(Chen等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.264847-854(1999))；及survivin(Ambrosini等人，Nature Med.3917-921(1997))。人們亦已鑒別出兩種果蠅同源基因(DIAP1與DIAP2)并證明其可抑制細(xì)胞死亡(Deveraux等人，Genes and Development 13239-252(1999))。以下發(fā)現(xiàn)表明了果蠅中IAP家族蛋白在程序性細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)中的重要作用蒼蠅中的數(shù)種細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白(包括reaper、hid及grim)作為其細(xì)胞毒性機(jī)制的一部分均可結(jié)合至IAP。其它IAP蛋白包括病毒IAP，例如CiIAP、PoIAP、CpIAP及ASFIAP(Deveraux等人，見上述文獻(xiàn)(1999))。
本發(fā)明的IAP蛋白包括那些可抑制一效應(yīng)卡斯蛋白酶(例如卡斯蛋白酶-3或卡斯蛋白酶-7)活性的蛋白質(zhì)及那些可抑制一啟動卡斯蛋白酶(例如卡斯蛋白酶-9)的蛋白質(zhì)。據(jù)報(bào)導(dǎo)，人類IAP(XIAP、cIAP1及cIAP2)可結(jié)合至并有效地抑制卡斯蛋白酶-3及卡斯蛋白酶-7，其中Kis介于0.2至10nM之間。這些卡斯蛋白酶在細(xì)胞凋亡級聯(lián)的遠(yuǎn)程活動，起細(xì)胞凋亡效應(yīng)物而不是啟動物的作用。
所有IAP家族成員的共同結(jié)構(gòu)特征為一稱為桿狀病毒IAP重復(fù)序列(BIR)的約70氨基酸的基元，其如(例如)Deveraux等人在Genes and Development(13239-252(1999))中所述，以1至3個(gè)拷貝形式存在。在BIR結(jié)構(gòu)域中觀察到的半胱氨酸與組氨酸的保守存在及間隔表明該結(jié)構(gòu)代表一鋅結(jié)合域。BIR結(jié)構(gòu)域已表現(xiàn)出若干截然不同的功能。舉例而言，XIAP的第二BIR結(jié)構(gòu)域(BIR2)為卡斯蛋白酶-3的強(qiáng)效抑制劑，而XIAP的第三BIR結(jié)構(gòu)域(BIR3)以卡斯蛋白酶-9為目標(biāo)(參見Wu等人，Nature 4081008-1012(2000))。除位于IAP的N端及中央部分的BIR基元外，IAP蛋白家族各成員的C端部分還有一環(huán)指結(jié)構(gòu)域(Birnbaum等人，J.Virol.682521-2528(1994))。
本文所用術(shù)語“IAP抑制卡斯蛋白酶”意指一半胱氨酸天冬氨酰基特異性蛋白酶，其蛋白酶解活性因存在一細(xì)胞凋亡蛋白抑制劑而受到抑制或阻抑。該術(shù)語可包括一半胱氨酸天冬氨酰基特異性蛋白酶，其活性因結(jié)合有一細(xì)胞凋亡蛋白抑制劑而降低。該術(shù)語亦可包括一半胱氨酸天冬氨?；禺愋缘鞍酌?，由于存在一細(xì)胞凋亡蛋白抑制劑，其受到阻止或阻抑而不能被加工成一具有蛋白酶水解活性的成熟形式。一用于本發(fā)明的未經(jīng)加工的半胱氨酸天冬氨?；禺愋缘鞍酌笇?shí)例為一結(jié)合有一原結(jié)構(gòu)域的原卡斯蛋白酶?；蛘?，本發(fā)明的組合物及方法可針對一不含一原結(jié)構(gòu)域或不是原卡斯蛋白酶的IAP抑制卡斯蛋白酶。
當(dāng)本文所用術(shù)語“去阻遏”與一IAP抑制卡斯蛋白酶有關(guān)時(shí)，其意指降低、抑制或阻止IAP對卡斯蛋白酶的蛋白酶解活性的抑制能力。因此，一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑為一分子，其可抑制或阻止IAP對卡斯蛋白酶的蛋白酶解活性的抑制能力。該術(shù)語可包括抑制或阻止一IAP對卡斯蛋白酶泛素化及降解的誘導(dǎo)能力。
本文所用術(shù)語“試劑”意指一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的合成或純生物分子，例如一簡單或復(fù)雜的有機(jī)分子、一肽、一擬肽、一蛋白質(zhì)或一寡核苷酸。
本文所用術(shù)語“醫(yī)藥上可接受的載劑”意指一其純度及質(zhì)量高至足以適用于人的介質(zhì)。此一介質(zhì)可為一人用藥物級無菌介質(zhì)，例如水、磷酸納緩沖液、磷酸緩沖鹽溶液、生理鹽水或林格溶液(Ringer’s solution)或其它生理緩沖鹽水，或其它溶劑或媒劑，例如乙二醇、甘油、一油(例如橄欖油)或一可注射有機(jī)酯。醫(yī)藥上可接受的介質(zhì)基本上不含污染粒子及生物體。
當(dāng)本文所用術(shù)語“抑制”與一蛋白質(zhì)活性有關(guān)時(shí)，其意指通過降低該蛋白質(zhì)對一底物的親和力或降低該蛋白質(zhì)將一底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的催化速度來降低活性。舉例而言，該術(shù)語包括降低一IAP對一卡斯蛋白酶底物的親和力，降低一卡斯蛋白酶對一多肽底物的親和力，降低一卡斯蛋白酶將一多肽C端解離為一天冬氨酸殘基的速度，或降低一卡斯蛋白酶泛素化或蛋白酶解的速度。
當(dāng)本文所用術(shù)語“分離的”與一試劑有關(guān)時(shí)，其意指該試劑與1或多種反應(yīng)試劑、前體或其它反應(yīng)物相分離。因此，一分離試劑為一種不含生成該試劑的合成反應(yīng)或反應(yīng)途徑中常見的一或多種化合物的試劑。該術(shù)語亦包括一種不含自然界中與其一起存在的一或多種化合物的試劑。一分離試劑亦包括一基本上純凈的試劑。該術(shù)語可包括一分子，其已通過一組合化學(xué)方法生成并通過化學(xué)提純法或通過結(jié)合至一第二分子以足夠的穩(wěn)定性與該第二分子一起純化的方式與前體及其它產(chǎn)物相分離。該術(shù)語可包括天然試劑(例如生物合成反應(yīng)的產(chǎn)物)或非天然試劑。
本文所用術(shù)語“肽”指一含有兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的分子，其中該些氨基酸通過一氨基酸的羧基與另一氨基酸的胺基之間的共價(jià)鍵連接。本發(fā)明的肽可包含于大分子或試劑中，例如較大的肽、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、類肽、擬肽及其諸如此類。一肽可為一非天然分子，其在自然界中不存在，但可用活體外方法生成，或其可為天然分子，例如一在一cDNA庫中表達(dá)的蛋白質(zhì)或其片段。肽可為線型、環(huán)狀或呈多價(jià)等，該些構(gòu)象可用本技術(shù)中的熟知方法獲得。該術(shù)語包括具有能生成蛋白質(zhì)的天然氨基酸以及非天然氨基酸(例如D-氨基酸及氨基酸類似物，其均可使用本技術(shù)中熟知的方法納入一肽中)的分子。根據(jù)該定義，除非另有說明，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，本文所提及的氨基酸包括(例如)能生成蛋白質(zhì)的天然L-氨基酸、D-氨基酸、經(jīng)化學(xué)修飾的氨基酸(例如氨基酸類似物)、不能生成蛋白質(zhì)的天然氨基酸(例如正亮氨酸)及化學(xué)合成試劑。下文進(jìn)一步闡述了可用于本發(fā)明的例示性氨基酸。
當(dāng)本文所用術(shù)語“能生成蛋白質(zhì)的”與一氨基酸有關(guān)時(shí)，其表明該氨基酸可通過習(xí)知的代謝途徑納入細(xì)胞中的一蛋白質(zhì)中?？筛鶕?jù)α碳處的構(gòu)形將該些氨基酸命名為D或L氨基酸。若未指明具體構(gòu)形，則本文所指氨基酸應(yīng)理解為在α碳處具有L構(gòu)形。能生成蛋白質(zhì)的氨基酸在本文中用1個(gè)或3個(gè)字母代碼表示且意欲與本技術(shù)中所用命名法一致，例如，如“Introduction to Protein Structure”(Branden及Tooze，Garland Publishing，New York，pp6-7(1991))中所述。其它氨基酸用本技術(shù)中習(xí)知的命名法表示，其中，舉例而言，pClPhe指對氯代苯丙氨酸，ThiAla指2-噻吩基-丙氨酸，Nal指3-(2-萘基)-丙氨酸，3I-Tyr指3-碘代酪氨酸，Cha指環(huán)己基丙氨酸，Lys-ε-Fmoc指賴氨酸(ε-笏基甲氧基羰基)，OEt-Tyr指酪氨酸(O-乙基)。
本文所用術(shù)語“核心”意指一分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)或基元或其一部分。舉例而言，該化學(xué)結(jié)構(gòu)或基元可為一肽或含肽分子的一氨基酸序列，或?yàn)橐淮硪环肿又懈髟拥墓矁r(jià)結(jié)合的化學(xué)式?？筛鶕?jù)對掌性進(jìn)一步界定該術(shù)語中所包括的化學(xué)結(jié)構(gòu)或基元。一核心肽或其它化學(xué)實(shí)體不需要位于一分子的中心。
本發(fā)明提供可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的分離試劑。一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑可具有一與下列對應(yīng)的核心肽或氨基酸序列基元 (L-Ala)-X1-(L-Trp)-X2(核心肽4) 其中X1為L-Trp或D-Trp，X2為L-ThiAla或L-pClPhe。核心肽4所包含的例示性核心肽包括，例如 (L-Ala)-(L-Trp)-(L-Trp)-(L-ThiAla)(核心肽5)， (L-Ala)-(L-Trp)-(L-Trp)-(L-pClPhe)(核心肽6)及 (L-Ala)-(D-Trp)-(L-Trp)-(L-ThiAla)(核心肽7)。
一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑可具有一與下列對應(yīng)的核心肽或氨基酸序列基元 X1-X2-X3-X4(核心肽23) 其中X1為L-Ala、L-Cha、L-Nal、D-Trp或D-Trp(CHO)；X2為D-Nal、D-Trp、D-Trp(CHO)、L-Trp、L-Trp(CHO)、D-Cha或D-ThiAla；X3為L-Trp、L-Trp(CHO)或D-Phe；及X4為L-Nal、D-Nal、D-Trp、D-Trp(CHO)、L-ThiAla、L-3I-Tyr或L-pClPhe。核心肽23所包含的例示性核心肽包括，例如 (L-Ala)-(D-Nal)-(L-Trp)-(L-Nal)(核心肽24) (D-Trp)-(D-Trp)-(L-Trp)-(D-Nal)(核心肽25) (L-Cha)-(D-Nal)-(L-Trp)-(L-ThiAla)(核心肽26) (L-Ala)-(L-Trp)-(L-Trp)-(L-3I-Tyr)(核心肽27) (L-Ala)-(D-Trp)-(L-Trp)-(L-ThiAla)(核心肽28) (L-Cha)-(L-Trp)-(L-Trp)-(L-pClPhe)(核心肽29) (L-Ala)-(D-Trp)-(L-Trp)-(D-Trp)(核心肽30) (L-Ala)-(D-Trp)-(D-Phe)-(D-Trp)(核心肽31) (L-Nal)-(D-Trp)-(D-Phe)-(D-Trp)(核心肽32) (L-Nal)-(D-Cha)-(L-Trp)-(D-Trp)(核心肽33) (L-Nal)-(D-ThiAla)-(D-Phe)-(D-Trp)(核心肽34)。
一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑可具有一與下列對應(yīng)的核心肽或氨基酸序列基元 X1-X2-X3-X4(核心肽8) 其中X1為D-Nal或L-ThiAla；X2為Lys-εFmoc、D-pClPhe或L-Nal；X3為D-Nal、L-pClPhe或D-Lys(Fm)；且X4為Lys-εFmoc或D-pFPhe。核心肽8所包含的例示性核心肽包括，例如 (D-Nal)-(Lys-εFmoc)-(L-pClPhe)-(Lys-εFmoc)(核心肽9) (D-Nal)-(D-pClPhe)-(L-pClPhe)-(Lys-εFmoc)(核心肽10) (D-Nal)-(L-Nal)-(L-pClPhe)-(Lys-εFmoc)(核心肽11) (D-Nal)-(L-Nal)-(D-Lys-εFmoc)-(Lys-εFmoc)(核心肽12) (L-ThiAla)-(Lys-εFmoc)-(D-Nal)-(Lys-εFmoc)(核心肽13) (L-ThiAla)-(Lys-εFmoc)-(L-pClPhe)-(pF-D-F)(核心肽14) (L-ThiAla)-(D-pClPhe)-(L-pClPhe)-(Lys-εFmoc)(核心肽15) (L-ThiAla)-(L-Nal)-(L-pClPhe)-(Lys-εFmoc)(核心肽16) (L-ThiAla)-(L-Nal)-(D-Lys-εFmoc)-(Lys-εFmoc)(核心肽17) 一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑可具有一與下列對應(yīng)的核心肽或氨基酸序列基元 X1-X2-X3-X4(核心肽35) 其中X1為L-ThiAla或Phe；X2為D-pClPhe或D-OEt-Tyr；X3為D-Nal或D-OEt-Tyr；及X4為D-pClPhe或D-pNO2Phe。核心肽35所包含的例示性核心肽包括，例如 (L-ThiAla)-(D-pClPhe)-(D-Nal)-(D-pClPhe)(核心肽36) (L-ThiAla)-(D-pClPhe)-(D-Nal)-(D-pNO2Phe)(核心肽37) (L-ThiAla)-(D-OEt-Tyr)-(D-OEt-Tyr)-(D-pClPhe)(核心肽38) (Phe)-(D-pClPhe)-(D-Nal)-(D-pClPhe)(核心肽39) 一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑可具有一與下列對應(yīng)的核心肽或氨基酸序列基元 A-X1-X2-X3(核心肽18) 其中X1為Met、Ser、Thr、Trp或ThiAla，且X2及X3選自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、D-Ala、D-Asp、D-Glu、D-Phe、D-His、D-Ile、D-Lys、D-Leu、D-Met、D-Asn、D-Pro、D-Gln、D-Arg、D-Ser、D-Thr、D-Val、D-Trp、D-Tyr、L-Nle、D-Nle、L-Cha、D-Cha、L-PyrAla、D-PyrAla、L-ThiAla、D-ThiAla、L-Tic、D-Tic，L-pClPhe、D-pClPhe、L-pIPhe、D-pIPhe、L-pNO2Phe、D-pNO2Phe、L-Nal、D-Nal、β-Ala、e-氨基己酸、L-Met[O2]、L-dehydPro或L-3I-Tyr。
一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑可具有一與下列對應(yīng)的核心肽或氨基酸序列基元 X1-X2-(L-Trp)-(D-Trp)(核心肽19) 其中X1及X2選自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、D-Ala、D-Asp、D-Glu、D-Phe、D-His、D-Ile、D-Lys、D-Leu、D-Met、D-Asn、D-Pro、D-Gln、D-Arg、D-Ser、D-Thr、D-Val、D-Trp、D-Tyr、L-Nle、D-Nle、L-Cha、D-Cha、L-PyrAla、D-PyrAla、L-ThiAla、D-ThiAla、L-Tic、D-Tic、L-pClPhe、D-pClPhe、L-pIPhe、D-pIPhe、L-pNO2Phe、D-pNO2Phe、L-Nal、D-Nal、β-Ala、e-氨基己酸、L-Met[O2]、L-dehydPro或L-3I-Tyr。
一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑可具有一與下列對應(yīng)的核心肽或氨基酸序列基元 X1-X2-X3-X4-W-W(核心肽55)， 其中X1、X2及X3選自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Cys或Tyr且X4選自Ala、His、Lys、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val。
一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑可具有一與下列任一結(jié)構(gòu)對應(yīng)的核心肽或氨基酸序列基元 X1-X2-A-A-W-W(核心肽43)序列識別號7， X1-X2-G-A-W-W(核心肽44)序列識別號8， X1-X2-R-A-W-W(核心肽45)序列識別號9， X1-X2-X4-A-W-W(核心肽46)， X1-X2-C-K-W-W(核心肽47)序列識別號10， X1-X2-L-X3-W-W(核心肽20)， X1-X2-R-X3-W-W(核心肽21)， X1-X2-G-X3-W-W(核心肽22)， X1-X2-T-X3-W-W(核心肽42)， X1-X2-V-X3-W-W(核心肽48)， X1-T-X2-X3-W-W(核心肽49)， X1-Y-X2-X3-W-W(核心肽50)， A-X1-X2-X3-W-W(核心肽51)， C-X1-X2-X3-W-W(核心肽52)， F-X1-X2-X3-W-W(核心肽53)或 K-X1-X2-X3-W-W(核心肽54)， 其中X1、X2及X4選自Ala、Asp、Glu、Phe、Gl y、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Cys或Tyr且X3選自Ala、Lys、Ser或Thr。
本發(fā)明的核心肽序列可為一分子或一分子的一部分的核心肽序列。舉例而言，上述具有4個(gè)位置的序列可為四肽分子且上述具有4個(gè)或六個(gè)位置的序列可為六肽分子。本發(fā)明的一核心肽亦可包含于大分子中，該些大分子包括，例如，一具有至少5個(gè)氨基酸、至少6個(gè)氨基酸、至少7個(gè)氨基酸、至少8個(gè)氨基酸、至少9個(gè)氨基酸、至少10個(gè)氨基酸、至少20個(gè)氨基酸或至少25個(gè)氨基酸的分子。在某些實(shí)施例中，將包含本發(fā)明肽的分子的氨基酸長度界定為最大長度為(例如)至多4個(gè)、至多5個(gè)、至多6個(gè)、至多7個(gè)、至多8個(gè)、至多9個(gè)、至多10個(gè)、至多20個(gè)、至多25個(gè)、至多50個(gè)、至多100個(gè)、至多150個(gè)、至多200個(gè)或更多氨基酸，只要該肽可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏。亦可將一具有本發(fā)明一核心肽的分子界定在由上述最小與最大長度的任一組合所限定的大小范圍內(nèi)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種具有一非肽基核心結(jié)構(gòu)的有效的IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑。因此，本發(fā)明提供一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑，其具有一對應(yīng)于一N-芐基-1，4，5-三取代-2，3-二酮基呱嗪的核心結(jié)構(gòu)(例如圖8中所示的TPI759)。舉例而言，一具有TPI759核心結(jié)構(gòu)的試劑可在位置R1、R2及R3處受到取代，其中R1衍生自正亮氨酸、NapAla、環(huán)己基丙氨酸、Lys、norvaleucine或纈氨酸的一氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)；R2衍生自Leu、NapAla、Phe、Ile或Val的一氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)；而R3的官能團(tuán)衍生自4-異丁基-α-甲基苯乙酸、3，5-雙(三氟甲基)-苯乙酸、庚酸、(α-α-α-三氟間甲苯基)乙酸、4-特丁基環(huán)己烷羧甲酸、間甲苯基乙酸、3，4-二氯代苯乙酸、3，3-二苯基丙酸、二環(huán)己基乙酸、環(huán)庚烷羧甲酸、對甲苯基乙酸或環(huán)己烷丁酸，如圖8中所示。
可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑可具有一對應(yīng)于C-6-酰胺基雙環(huán)胍的核心結(jié)構(gòu)，例如圖7中所示TPI882。舉例而言，一具有TPI882核心結(jié)構(gòu)的試劑可在位置R1、R2及R3處受到取代，其中R1衍生自下列各物的一氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)L-環(huán)己基丙氨酸、D-環(huán)己基丙氨酸、D-2-氯代Phe、O-乙基-D-Tyr、對碘代-L-Phe、對碘代-D-Phe、D-homo-Phe、L-homo-Phe、L-萘基Ala、D-萘基Ala或L-4，4-聯(lián)苯基丙氨酸；R2的官能團(tuán)衍生自2-苯丁酸、3-苯丁酸、間甲苯基乙酸、3-氟代苯乙酸、對甲苯基乙酸、4-氟代苯乙酸、3-甲氧基苯乙酸、4-甲氧基苯乙酸、4-乙氧基苯乙酸、4-聯(lián)苯基乙酸、苯乙酸、4-苯丁酸、庚酸、4-甲基戊酸、特丁酸、環(huán)己基羧酸、環(huán)己基乙酸、環(huán)己基丁酸、環(huán)庚烷羧酸、環(huán)丁烷羧酸、環(huán)戊基羧酸、3-環(huán)戊基丙酸、環(huán)己基丙酸、4-甲基-1-環(huán)己基羧酸、4-特丁基環(huán)己基羧酸、2-降冰片烷乙酸、1-金鋼烷乙酸、2-乙基丁酸、3，3-二苯基丙酸或環(huán)戊基乙酸；而R3的官能團(tuán)衍生自3-氟代苯乙酸、4-乙氧基苯乙酸、4-聯(lián)苯基乙酸或3，5-雙(三氟甲基)苯乙酸的，如圖7中所示。一具有TPI882核心結(jié)構(gòu)的試劑可在其官能團(tuán)衍生自苯乙酸的R2及R3處受到取代；在衍生自下列各物的一氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的R1處受到取代L-環(huán)己基丙氨酸、D-環(huán)己基丙氨酸、D-對氯代-Phe、D-對氟代-Phe、L-對氟代-Phe、D-2-氯代-Phe、O-乙基-T-Tyr、O-乙基-D-Tyr、O-甲基-D-Tyr、3，5-二碘-Tyr或L-萘基Ala；在具有Phe的一氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的R1處受到取代；在其官能團(tuán)衍生自苯乙酸的R3處受到取代，及在其官能團(tuán)衍生自下列各物的R2處受到取代對甲苯基乙酸、4-甲氧基苯乙酸、4-乙氧基苯乙酸、4-聯(lián)苯基乙酸、苯乙酸、4-苯丁酸、庚酸、3-甲基戊酸或4-甲基戊酸；或在具有Phe的一氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的R1處受到取代；在其官能團(tuán)衍生自苯乙酸的R2處受到取代；及在其官能團(tuán)衍生自下列各物的R3處受到取代4-聯(lián)苯基乙酸、環(huán)己烷羧酸、環(huán)己基乙酸、環(huán)乙基丁酸、環(huán)庚烷羧酸、3-環(huán)戊基丙酸或3，5-雙(三氟甲基)苯乙酸，如圖10中所示。
一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑可具有一對應(yīng)于多苯基脲的核心結(jié)構(gòu)，例如圖6中所示TPI927。舉例而言，一具有TPI927核心結(jié)構(gòu)的試劑可在位置R1、R2及R3處受到取代，其中R1衍生自D-Lys(Me)、L-3-(2Nap)Ala、D-Chala、L-Phe、Pro、Leu或Ser的一氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)；R2衍生自ε-Lys、L-Nle、D-Phe、Pro、D-Orn(Me)、Gln、L-3-(2-Nap)Ala或D-Thr的一氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)；而R3的官能團(tuán)衍生自4-甲氧基苯乙酸、1-金鋼烷乙酸、環(huán)己烷丁酸、4-特丁基環(huán)己烷羧酸、環(huán)庚烷羧酸、3-氟代苯乙酸、3，3-二苯基丙酸、4-乙氧基苯乙酸、1-苯基-1-環(huán)丙烷羧酸、1-萘基乙酸或環(huán)丁烷羧酸，如圖6中所示。一具有TPI927核心結(jié)構(gòu)的試劑可在具有Phe的一氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的R1及R2處受到取代且在其官能團(tuán)衍生自下列各物的R3處受到取代三甲基乙酸、氫化肉桂酸、4-特丁基環(huán)己烷羧酸、4-甲基-1-環(huán)己烷羧酸、環(huán)戊基乙酸、1-苯基-1-環(huán)丙烷羧酸、環(huán)己烷羧酸、苯乙酸、環(huán)庚烷羧酸、環(huán)丁烷羧酸、環(huán)己烷丁酸、1-金鋼烷乙酸、環(huán)戊烷羧酸、異丁酸、環(huán)己基乙酸、3-甲氧基苯乙酸、丁酸、3-(3，4，5)-三甲氧基苯丙酸、庚酸、2-降冰片烷乙酸、環(huán)己烷丙酸、特丁酸、4-乙氧基苯乙酸、3，3-二苯基丙酸、4-甲氧基苯乙酸、乙酸、甲基戊酸、對甲苯基乙酸或4-異丁基-α-甲基苯乙酸，如圖9中所示。
一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑可具有一對應(yīng)于一N-?；返暮诵慕Y(jié)構(gòu)，例如圖4中所示TPI914。舉例而言，一具有TPI914核心結(jié)構(gòu)的試劑可在位置R1、R2及R3處受到取代，其中R1衍生自Nap-Ala或4-氟代苯丙氨酸的一氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)；R2衍生自L-Trp、Nap-Ala、D-Trp、4-氯代苯丙氨酸、D-環(huán)己基丙氨酸或Tyr的一氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)；而R3的官能團(tuán)衍生自下列各物4-乙烯基苯甲酸、4-乙基-4-聯(lián)苯羧酸、3，5-雙(三氟甲基)-苯乙酸、4-聯(lián)苯羧酸、4-聯(lián)苯乙酸或3，5-雙-(三氟甲基)-苯甲酸，如圖4中所示。一具有TPI核心結(jié)構(gòu)的試劑可在R1、R2及R3處受到取代，其中R1的一官能團(tuán)衍生自Leu的一氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)，R2的一官能團(tuán)衍生自D-Trp的一氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)，而R3具有甲基；或者R1的一官能團(tuán)衍生自Leu的一氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)，R2的一官能團(tuán)衍生自Phe的一氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)，而R3的一官能團(tuán)衍生自3，5-雙(三氟甲基)-苯乙酸；或者R1的一官能團(tuán)衍生自Leu的一氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)，R2的一官能團(tuán)衍生自Phe的一氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)，而R3的一官能團(tuán)衍生自4-乙烯基苯甲酸；或者R1的一官能團(tuán)衍生自Leu的一氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)，R2的一官能團(tuán)衍生自Phe的一氨基酸側(cè)鏈，而R3的一官能團(tuán)衍生自4-乙基-4-聯(lián)苯羧酸，每一均如圖5中所示。
所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，具有核心結(jié)構(gòu)TPI914、TPI927、TPI759或TPI882的各庫可在一或多個(gè)位置處進(jìn)行組合。一組合位置指一可以不同方式受到不同部分取代的位置，以致在該位置上組合的一分子庫成為在該位置上化學(xué)結(jié)構(gòu)互不相同的分子的一混合物。該些庫可用于鑒別IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑，例如在如實(shí)例VI中所述的利用位置掃描的篩選中。因此，位置R1、R2或R3中的任一位置均可保持固定在一分立部分上，而剩余的兩個(gè)位置進(jìn)行組合，以產(chǎn)生若干據(jù)以固定位置的子庫。并且，核心結(jié)構(gòu)上可增加額外位置，該些位置在一或多個(gè)其它位置被組合時(shí)可進(jìn)行組合或保持不變。因此，根據(jù)一特定核心結(jié)構(gòu)或自該庫中鑒別為可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的一結(jié)構(gòu)可創(chuàng)建若干不同的或更為多樣的庫。
所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，具有一對應(yīng)于TPI914、TPI927、TPI759或TPI882的核心結(jié)構(gòu)的本發(fā)明試劑可進(jìn)一步結(jié)合有一或多個(gè)部分，例如一肽部分。本發(fā)明的試劑可為多價(jià)態(tài)，如上所述，在這種情況下所結(jié)合部分可為一或多個(gè)對應(yīng)于TPI914、TPI927、TPI759或TPI882的核心結(jié)構(gòu)；一具有上述序列的核心肽；或一或多個(gè)該些核心結(jié)構(gòu)與核心肽的組合。
不管是基于一肽還是非肽核心結(jié)構(gòu)，一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑均可包括一已知在生物蛋白中天然存在的部分。當(dāng)為一蛋白質(zhì)的一部分時(shí)，該些部分通常稱為氨基酸R基團(tuán)。該些R基團(tuán)可具有多種物理或化學(xué)特性。以基本氨基酸為例，Gly、Ala、Val、Leu或Ile上的R基團(tuán)的特征為非極性；極性R基團(tuán)包括Cys的巰基部分、Met的硫醚部分、Ser及Thr的羥基部分及Asn和Gln的酰胺部分；Asp及Glu因包含羧酸部分而為極性酸性基團(tuán)；極性堿性R基團(tuán)包括具有一胺基部分的Lys、具有一胍基部分的Arg及具有一帶仲胺的咪唑的His；Phe、Trp、Tyr及His因包含苯基或雜環(huán)而為芳香族氨基酸。本發(fā)明的試劑可包括一或多個(gè)該些部分或特征，該些部分或特征使得該試劑可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏。
本發(fā)明的一試劑亦可根據(jù)其它當(dāng)含有時(shí)可使該試劑除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的其它部分或該些部分的組合來進(jìn)行闡述或表征。下文闡述了本發(fā)明試劑中可含有的各種部分的定義。
本文所用術(shù)語“烷基”在單獨(dú)或組合使用時(shí)均指一飽和的直鏈或支鏈烴部分，該部分含有1至10個(gè)碳原子，較佳含有1至6個(gè)碳原子，更佳含有1至4個(gè)碳原子。該些部分的實(shí)例包括(但不限于)甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、特丁基、戊基、異戊基、己基、癸基及諸如此類。
術(shù)語“烯烴”在單獨(dú)或組合使用時(shí)均指一具有至少一個(gè)碳-碳雙鍵的直鏈或支鏈烴部分，該部分所含碳原子總數(shù)為2至10個(gè)，較佳為2至6個(gè)，更佳為2至4個(gè)。該些部分的實(shí)例包括(但不限于)乙烯基、E-和Z-丙烯基、異丙烯基、E-和Z-丁烯基、E-和Z-異丁烯基、E-和Z-戊烯基、癸烯基、亞甲基(＝CH2)、亞乙基(-CH＝CH-)、亞丙基(-CH2-CH＝CH-)及諸如此類。
術(shù)語“炔烴”在單獨(dú)或組合使用時(shí)均指一具有至少一個(gè)碳-碳三鍵的直鏈或支鏈烴部分，該部分所含碳原子總數(shù)為2至10個(gè)，較佳為2至6個(gè)，更佳為2至4個(gè)。該些部分的實(shí)例包括(但不限于)乙炔基、丙炔基、丁炔基、己炔基、癸炔基及諸如此類。
術(shù)語“環(huán)烷基”在單獨(dú)或組合使用時(shí)均指碳原子的一飽和的環(huán)形排列結(jié)構(gòu)，其中碳原子數(shù)為3至8，較佳為3至6。該些環(huán)烷基部分的實(shí)例包括(但不限于)環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基及諸如此類。
術(shù)語“芳基”指一選自由下列組成的組群的碳環(huán)(完全由碳與氫構(gòu)成)芳香族基團(tuán)苯基、萘基、茚基、二氫茚基、甘菊環(huán)基、笏基及蒽基；或一選自由下列組成的組群的雜環(huán)芳香族基團(tuán)呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、2-吡唑啉基、吡唑烷基、異噁唑基、異噻唑基、1，2，3-噁二唑基、1，2，3-三唑基、1，3，4-噻二唑基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、1，3，5-三嗪基、1，3，5-三噻烷基、中氮茚基、二氫茚酮基、異二氫茚酮基、3H-二氫茚酮基、二氫吲哚基、苯并[b]呋喃基、2，3-二氫苯并呋喃基、苯并[b]噻吩基、1H-吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、喹啉基、異喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹噁啉基、1，8-二氮雜萘基、蝶啶基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基及吩噁嗪基。
本申請案中所定義的“芳基”可獨(dú)立含有1至4個(gè)獨(dú)立選自由下列組成的組群的取代基氫、鹵素、羥基、胺基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、烷基、烯基、炔基、氰基、羧基、烷氧羰基、1，2-乙撐二氧基、烷氧基、烯氧基或炔氧基、烷胺基、烯胺基、炔胺基、脂肪族或芳香族?；?、烷氧基-羰基胺基、烷基磺酰胺基、嗎啉基羰基胺基、硫嗎啉基羰基胺基、N-烷基胍基、烷基胺基磺?；⒎纪檠趸榛?、N-芳烷氧基脲、N-羥基脲、N-烯基脲、N，N-(烷基，羥基)脲、雜環(huán)基、硫芳氧基取代的芳基、N，N-(芳基，烷基)肼基、Ar’-取代的磺酰基雜環(huán)基、芳烷基取代的雜環(huán)基、環(huán)烷基及環(huán)烯基取代的雜環(huán)基、環(huán)烷基稠合芳基、芳氧基取代的烷基、雜環(huán)胺基、脂肪族或芳香族酰胺基羰基、脂肪族或芳香族?；〈南┗?、Ar’取代的胺基羰氧基、Ar’，Ar’雙取代的芳基、脂肪族或芳香族?；〈孽；?、環(huán)烷基羰基烷基、環(huán)烷基取代的胺基、芳氧基羰基烷基、二胺基磷酸或酯。
“Ar’”為一如上所定義的碳環(huán)或雜環(huán)芳基，其具有1至3個(gè)選自由下列組成的組群的取代基氫、鹵素、羥基、胺基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、烷基、烯基、炔基、1，2-甲撐二氧基、1，2-乙撐二氧基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、烷胺基、烯胺基或炔胺基、烷基羰氧基、脂肪族或芳香族?；?、烷基羰基胺基、烷氧基羰基胺基、烷基磺酰胺基、N-烷基或N，N-二烷基脲。
術(shù)語“烷氧基”在單獨(dú)或組合使用時(shí)均指一烷基醚部分，其中術(shù)語“烷基”為如上所定義。適當(dāng)烷基醚部分的實(shí)例包括(但不限于)甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、特丁氧基及諸如此類。
術(shù)語“烯氧基”在單獨(dú)或組合使用時(shí)均指一結(jié)構(gòu)式為烯基-O的部分，其中術(shù)語“烯基”如上文所定義。適當(dāng)烯氧基部分的實(shí)例包括(但不限于)烯丙氧基、E-和Z-3-甲基-2-丙烯氧基及諸如此類。
術(shù)語“硫代烷氧基”指一結(jié)構(gòu)式為烷基-S-的硫醚部分，其中烷基如上文所定義。
術(shù)語“烷胺基”在單獨(dú)或組合使用時(shí)均指一經(jīng)單烷基或二烷基取代的胺基(即一結(jié)構(gòu)式為烷-NH-或(烷基)2-N-的基團(tuán))，其中術(shù)語“烷基”如上文所定義。適當(dāng)烷胺基部分的實(shí)例包括(但不限于)甲胺基、乙胺基、丙胺基、異丙胺基、特丁胺基、N，N-二乙胺基及諸如此類。
術(shù)語“酰胺”指-N(R1)-C(＝O)-或-C(＝O)-N(R1)-，其中(R1)在本文中定義為包括氫及其它基團(tuán)。術(shù)語“經(jīng)取代的酰胺”指其中(R1)不為氫的情況，而術(shù)語“未經(jīng)取代的酰胺”指其中(R1)為氫的情況。
術(shù)語“芳氧基”在單獨(dú)或組合使用時(shí)均指一結(jié)構(gòu)式為芳基-O-的部分，其中芳基如上文中所定義。芳氧基部分的實(shí)例包括(但不限于)苯氧基、萘氧基、吡啶氧基及諸如此類。
術(shù)語“芳胺基”在單獨(dú)或組合使用時(shí)均指一結(jié)構(gòu)式為芳基-NH-的部分，其中芳基如上文所定義。芳胺基部分的實(shí)例包括(但不限于)苯胺基、萘胺基、2-、3-及4-吡啶胺基及諸如此類。
術(shù)語“芳基稠合的環(huán)烷基”在單獨(dú)或組合使用時(shí)均指一與一芳基部分共有2個(gè)相鄰原子的環(huán)烷基部分，其中術(shù)語“環(huán)烷基”及“芳基”如上文所定義。一芳基稠合的環(huán)烷基部分的實(shí)例為苯并環(huán)丁基。
術(shù)語“烷基羰基胺基”在單獨(dú)或組合使用時(shí)均指一結(jié)構(gòu)式為烷基-CONH的部分，其中術(shù)語“烷基”如上文所定義。
術(shù)語“烷氧基羰基胺基”在單獨(dú)或組合使用時(shí)均指一結(jié)構(gòu)式為烷基-OCONH-的部分，其中術(shù)語“烷基”如上文所定義。
術(shù)語“烷基磺酰胺基”在單獨(dú)或組合使用時(shí)均指一結(jié)構(gòu)式為烷基-SO2NH-的部分，其中術(shù)語“烷基”如上文所定義。
術(shù)語“芳基磺酰胺基”在單獨(dú)或組合使用時(shí)均指一結(jié)構(gòu)式為芳基-SO2NH-的部分，其中術(shù)語“芳基”如上文所定義。
術(shù)語“N-烷基脲”在單獨(dú)或組合使用時(shí)均指一結(jié)構(gòu)式為烷基-NH-CO-NH-的部分，其中術(shù)語“烷基”如上文所定義。
術(shù)語“N-芳基脲”在單獨(dú)或組合使用時(shí)均指一結(jié)構(gòu)式為芳基-NH-CO-NH-的部分，其中術(shù)語“芳基”如上文所定義。
術(shù)語“鹵素”指氟、氯、溴及碘。
所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述定義可不難了解整個(gè)本申請案中所用的其它化學(xué)術(shù)語。各術(shù)語可單獨(dú)使用或根據(jù)公認(rèn)的化學(xué)命名法組合在一起來闡述各部分的組合。
本發(fā)明的試劑可使用習(xí)知試劑及條件進(jìn)行合成，以生成具有預(yù)定部分或特征的產(chǎn)物。舉例而言，能夠以相對較低的成本對肽進(jìn)行大量合成，且不難將其修飾至呈現(xiàn)多種不同的特性(參見，例如，Rees等人，Protein EngineeringA Practical Approach(IRL Press 1992))。IAP抑制卡斯蛋白酶的肽去阻遏劑既可使用一經(jīng)過改良的固相肽合成法合成(Merrifield J.Am.Chem.Soc.，85；2149(1964)；于1986年12月23日頒予Houghten的美國專利第4,631,211號)也可使用此項(xiàng)技術(shù)中熟知的標(biāo)準(zhǔn)溶液法合成(參見，例如，Bodanszky，M.，Principlesof Peptide Synthesis，2nd ed.(Springer-Verlag，1988和1993，suppl.))。通過Merrifield方法制備的肽可使用一自動肽合成器(例如Applied Biosystems 431A-01肽合成器(MountainView，CA))或使用一手動肽合成方法(Houghten，見上述文獻(xiàn)，1986)進(jìn)行合成。
此外，可使用下文所述的組合方法來制備一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏抑的試劑。可將一庫合成為具有含有特定部分(例如上文所定義或下文實(shí)例中所闡述的部分)的候選試劑。另外，可將合成條件選擇為可生成一具有一或多個(gè)本文所述部分所固有的特定特征(例如氨基酸R基團(tuán)的上述特征)的候選化合物庫。舉例而言，可將一庫合成為具有一種天然IAP抑制劑SMAC的特征。已表明SMAC的N端區(qū)域可介導(dǎo)與IAP的結(jié)合及對IAP的抑制作用(參見Srinivasula等人，Nature 410112-116(2001)，Wu等人，Nature 10081012(2000)，Liu等人，Nature 4081004-1008(2000))。因此，該N端結(jié)構(gòu)域可用于指導(dǎo)庫合成，以便選擇反應(yīng)劑及條件來選擇性地將類似部分及特征納入該庫的候選試劑中?？刹捎妙愃频姆椒?，該些方法使用本文所述試劑或通過本發(fā)明方法鑒別出的試劑，其中使一庫選擇性地含有一特定試劑所具有的或多種試劑所共有的特征或部分。此一設(shè)計(jì)方法可增加鑒別一IAP抑制卡斯蛋白酶的有效去阻遏的機(jī)率。
可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的本發(fā)明試劑可在一篩選中鑒別或者根據(jù)本文所述多種功能特性中的任何一種來表征。在一實(shí)施例中，一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑根據(jù)其在存在一IAP的情況下使卡斯蛋白酶具有活性的能力來鑒別。舉例而言，本發(fā)明一化合物的效力可根據(jù)一IAP抑制卡斯蛋白酶在存在及不存在本發(fā)明試劑兩種情況下的活性比來測定。
實(shí)例I中提供了一用于鑒別可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的化合物的例示性分析法，實(shí)例I至VI闡述了使用該分析法來鑒別該些去阻遏劑化合物的應(yīng)用。如下文實(shí)例中所述，視分析條件而定，一IAP抑制卡斯蛋白酶在存在及不存在該試劑兩種情況下Vmax的比率至少約為1.7，這表明該試劑為一IAP抑制卡斯蛋白酶的有效去阻遏劑。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，表明效力的該比率的值將取決于所用試劑的濃度及該試劑的IC50。因此，當(dāng)所用試劑的濃度較高時(shí)，在存在及不存在試劑兩種情況下Vmax的比率的閾值可至少約為2、至少約為2.5、至少約為3或至少約為4或更大。當(dāng)所用試劑的濃度較低時(shí)，該比率可低至至少約為1.5、至少約為1.3、至少約為1或更小。因此，結(jié)合分析中所含試劑對IAP的相對量來表達(dá)該比率較合適，例如，1摩爾當(dāng)量試劑/IAP、2摩爾當(dāng)量試劑/IAP、5摩爾當(dāng)量試劑/IAP、10摩爾當(dāng)量試劑/IAP或50摩爾當(dāng)量試劑/IAP或更高。
一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑亦可在(例如)一結(jié)合分析中通過其對一IAP或IAP的一卡斯蛋白酶結(jié)合片段的親和力來鑒別。應(yīng)了解，在一結(jié)合分析中可使用一IAP的功能片段、卡斯蛋白酶或兩者來鑒別一IAP抑制卡斯蛋白酶的去阻遏劑。若需要，使用一結(jié)合分析法測得的一試劑對一IAP的親和力可通過一平衡離解常數(shù)(Kd)或平衡締合常數(shù)(Ka)來定量。可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑可被視作一種其Kd處于包括(例如)小于約1×10-6M、1×10-7M或1×10-8M微摩爾范圍內(nèi)的試劑。亦可鑒別具有更高親和力的試劑，包括其親和力處于毫微摩爾范圍內(nèi)的試劑，例如Kd小于約1×10-9M、1×10-10M或1×10-11M。本發(fā)明的一試劑亦可具有微微摩爾的親和力，包括，例如，一小于1×10-12M的Kd。
或者，在(例如)一抑制結(jié)合分析中，可根據(jù)對一IAP與卡斯蛋白酶之間的締合的抑制程度來測定一試劑在除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏方面的效力。應(yīng)了解，一抑制結(jié)合分析可使用IAP的功能片段、卡斯蛋白酶或兩者?；蛘撸筛鶕?jù)抑制IAP與另一抑制劑(例如SMAC)之間的結(jié)合的能力來鑒別一IAP抑制卡斯蛋白酶的去阻遏劑。實(shí)例VII中提供了一種用于測定對IAP-SMAG結(jié)合的抑制作用的例示性分析法。若需要，可通過一平衡抑制常數(shù)(例如Ki)將抑制作用量化。Ki值可通過實(shí)施去阻遏分析(例如本文中所述的分析)來測定，其中試劑的濃度逐漸增加，而各結(jié)合配偶體的濃度固定不變?？墒褂靡阎膭恿W(xué)分析法(例如Segel在Enzyme Kinetics(John Wiley and Sons，New York(1975))中闡述的分析法)來分析結(jié)合或抑制作用，以便測定上述平衡常數(shù)。一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑可被視作其Ki處于微摩爾、毫微摩爾或微微摩爾范圍(例如上述的Kd的范圍及值)內(nèi)的試劑。
因此，本發(fā)明提供一種復(fù)合體，其具有一與一試劑結(jié)合的IAP，其中該試劑具有本發(fā)明的一核心肽或核心結(jié)構(gòu)(包括，例如，上述核心結(jié)構(gòu))。該復(fù)合體可自至少一種自然界中通常與IAP共生的其它細(xì)胞成分中分離。舉例而言，該復(fù)合體可處于純化狀態(tài)，基本上不含自然界中通常與IAP共生的其它細(xì)胞成分。該復(fù)合體亦可存在于一通常不表達(dá)IAP的重組細(xì)胞中。
本發(fā)明進(jìn)一步提供若干偶聯(lián)物，該些偶聯(lián)物包括一連接至一可除去IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的部分。本發(fā)明的一偶聯(lián)物可包括一部分，該部分用于將試劑靶向一特定細(xì)胞或用于增強(qiáng)一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏試劑的穩(wěn)定性或生物半衰期。舉例而言，一部分可為一其對一欲在其中促進(jìn)細(xì)胞凋亡的特定細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)具有特異性的特定抗體、其功能片段或其它結(jié)合多肽。任何可將試劑靶向一欲在其中除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的細(xì)胞的部分均可用作一偶聯(lián)物。
一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑的偶聯(lián)物亦可為一能將該試劑引入一細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠或者有助于該試劑通過細(xì)胞膜的部分。可通過(例如)一異源靶向結(jié)構(gòu)域或使用一基于脂質(zhì)的載體將一試劑引入細(xì)胞。因此，本發(fā)明可提供IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏試劑的胞質(zhì)輸送。
一部分亦可以是一藥物輸送媒劑，例如一分室微型裝置、一細(xì)胞、一脂質(zhì)體或一病毒，其可為投予IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑提供穩(wěn)定性及其它有利特性。該些微型裝置通常應(yīng)無毒且(若需要)可生物降解。各種包括微型膠囊的部分(其可含有一試劑)及用于將一部分(包括一分室微型裝置)連接至一治療試劑的方法在此項(xiàng)技術(shù)中已為人們所熟知且市場上有售(參見，例如，“Remington’s Pharmaceutical Sciences”18th ed.(Mach Publishing公司1990)，Chapters 89-91；Harlow and Lane，AntibodiesA laboratorymanual(ColdSpring Harbor Laboratory Press 1988)；亦參見Hermanson，見上述文獻(xiàn)，1996)。
另外，可將一IAP抑制卡斯蛋白酶調(diào)配物的去阻遏劑納入可容許該化合物持續(xù)釋放的生物可降解聚合物中，該等聚合物可在欲輸送藥物位置(例如腫瘤位點(diǎn))的附近植入或以可使試劑隨時(shí)間在全身釋放的方式植入。亦可使用微型滲透泵，以可控方式將特定濃度的IAP抑制卡斯蛋白酶類去阻遏劑調(diào)配物通過套管輸送到指定位點(diǎn)，例如直接介入腫瘤生長或腫瘤的脈管供應(yīng)。舉例而言，Brem等人在J.Neurosurg.(74441-446(1991))中詳細(xì)闡述了該些生物可降解聚合物及其應(yīng)用。
本發(fā)明的一偶聯(lián)物可包括一是一標(biāo)記物的部分。一可結(jié)合至IAP及/或卡斯蛋白酶的經(jīng)標(biāo)記試劑可用于鑒別IAP及/或卡斯蛋白酶的亞細(xì)胞定位或用于鑒別一以前未被認(rèn)識的IAP或卡斯蛋白酶。一可結(jié)合至一IAP及/或卡斯蛋白酶的經(jīng)標(biāo)記試劑亦可用于鑒別其它可與一IAP及/或卡斯蛋白酶相互作用的分子。如下文所述，此一結(jié)合競爭分析可用于鑒別一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑。一可作為一部分納入的標(biāo)記物包括(例如)一熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、順磁自旋標(biāo)記物、放射性核苷酸或?qū)α硪豢杀粰z測出的分子具有特異性的結(jié)合基團(tuán)。
本發(fā)明的一經(jīng)標(biāo)記試劑可用于鑒別一組織內(nèi)因受到一IAP抑制卡斯蛋白酶的抑制而不能發(fā)生凋亡的細(xì)胞。因此，該經(jīng)標(biāo)記試劑可用于一診斷方法中，以鑒別投予一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑即可發(fā)生凋亡的細(xì)胞。該方法可包括以下步驟向一組織投予本發(fā)明的一經(jīng)標(biāo)記試劑，鑒別一或更多已結(jié)合有該經(jīng)標(biāo)記試劑的細(xì)胞。該經(jīng)標(biāo)記試劑可使用上述活體內(nèi)輸送方法投予?？梢圆煌姆直媛适褂迷撔┰\斷方法。舉例而言，該方法可用于鑒別一含有若干被該試劑標(biāo)記的細(xì)胞的組織?；蛘?，可使用更高分辨率的方法鑒別一組織內(nèi)在存在一IAP抑制卡斯蛋白酶情況下被標(biāo)記的一特定細(xì)胞或細(xì)胞型。由于該些診斷方法可用于將一投予一IAP抑制卡斯蛋白酶抑制劑后即可發(fā)生凋亡的細(xì)胞與其它未經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞區(qū)分開來，所以，該些方法對于指導(dǎo)選擇靶向或輸送偶聯(lián)物在本發(fā)明一治療方法中的用途甚為有用。
可在活體外應(yīng)用該診斷方法，在此種情況下可通過注射或?qū)⒔M織浸泡在一含經(jīng)標(biāo)記試劑的溶液中投予經(jīng)標(biāo)記試劑。另外，亦可以高分辨率使用該等方法，以對一組織內(nèi)一具有IAP抑制卡斯蛋白酶的細(xì)胞與那些其凋亡不受該方式限制的細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分。此種分辨率可通過(例如)使用基于顯微鏡的技術(shù)實(shí)現(xiàn)。更高的分辨率可提供一IAP抑制卡斯蛋白酶的亞細(xì)胞定位。亞細(xì)胞定位可用于測定一適當(dāng)胞質(zhì)溶膠輸送偶聯(lián)物或用于進(jìn)一步鑒別細(xì)胞凋亡在所研究的特定組織或細(xì)胞中的作用。
本發(fā)明亦提供一含有一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑及一醫(yī)藥載劑的醫(yī)藥組合物。該些組合物可用于本發(fā)明的細(xì)胞凋亡促進(jìn)法中，以達(dá)到抑制、治療或降低一以細(xì)胞凋亡量病理性降低為特征的疾病的嚴(yán)重程度。舉例而言，一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑可與一醫(yī)藥上可接受的介質(zhì)一起作為溶液或懸浮液投予。
IAP抑制卡斯蛋白酶抑制劑調(diào)配物包括適于以非經(jīng)腸方式投予的調(diào)配物，例如以皮下、腹膜腔內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、顱內(nèi)、氣管內(nèi)及硬膜外方式投予。亦包括適于經(jīng)口、直腸、眼(包括玻璃體內(nèi)或眼房內(nèi))、鼻、局部(包括口腔及舌下)、子宮內(nèi)或陰道投予的調(diào)配物。IAP抑制卡斯蛋白酶抑制劑調(diào)配物可呈單位劑型且可通過所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的醫(yī)藥技術(shù)制備。該些技術(shù)包括使活性成分與一醫(yī)藥載劑或賦形劑結(jié)合的步驟。
適于以非經(jīng)腸方式投予的調(diào)配物包括無菌注射水溶液及非水溶液，例如上述醫(yī)藥上可接受的介質(zhì)。該些溶液可進(jìn)一步含有(例如)抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑及可使該調(diào)配物與預(yù)期接受者的血液等滲的溶質(zhì)。其它調(diào)配物包括(例如)無菌水懸浮液及非水懸浮液，其可包含懸浮劑及增稠劑。該些調(diào)配物可裝入單位劑量或多次劑量容器(例如，密封的安瓿及小玻璃瓶)中，并可在凍干條件下貯存，其要求(例如)在即將使用前加入無菌液體載劑。臨時(shí)配制的注射溶液及懸浮液可由上述類型的無菌粉劑、顆粒及片劑制備。
一醫(yī)藥上可接受的介質(zhì)可另外含有起(例如)穩(wěn)定該IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑作用的生理上可接受的化合物。該些生理上可接受的化合物包括，舉例而言，碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化劑，例如抗壞血酸或谷胱甘肽；鰲合劑，例如EDTA，其可破壞微生物膜；二價(jià)金屬離子，例如鈣或鎂；低分子量蛋白質(zhì)；脂質(zhì)或脂質(zhì)體；或其它穩(wěn)定劑或賦形劑。如上所述，IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑亦可用一醫(yī)藥上可接受的介質(zhì)(例如一可生物降解的聚合物)調(diào)配。所有上述醫(yī)藥載劑及介質(zhì)均可為此項(xiàng)技術(shù)中所定義的醫(yī)藥級，這表明其純度及質(zhì)量高至足以用于人類并有別于研究級調(diào)配物中的相當(dāng)試劑。
本發(fā)明亦提供一組合物，該組合物包括一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑及一具有治療活性的分子。本發(fā)明去阻遏劑中所含分子可為一化合物，該化合物具有活性，該活性可對抗以細(xì)胞凋亡呈病理降低為特征的疾病。舉例而言，該化合物可具有抗癌活性。一具有抗前列腺癌活性且可與本發(fā)明的去阻遏劑化合物一起使用的例示性化合物為VP-16(吡喃葡糖苷)。如實(shí)例X的結(jié)果所示，將VP-16與TPI792-33或TPI792-35一起投予對癌細(xì)胞的殺傷效力比單獨(dú)使用任一上述兩種化合物更有效。
其它抗癌藥物亦可在一組合物中與一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑一起使用，該些藥物包括(但不限于)一烷基化試劑，例如氮芥(mechlorethamine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、環(huán)磷酰胺、美法侖(melphalan)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)；一抗代謝物，例如胺甲蝶呤(methotrexate)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)或阿糖胞苷(cytarabine)；一抗體，例如利妥西單抗(Rituxan)、曲司佐單抗(Herceptin)或利妥?，?MabThera)；一植物生物堿，例如長春花堿(vinblastine)或長春新堿(vincristine)或吡喃葡糖苷；一抗生素，例如阿霉素(doxorubicin)、柔紅霉素(daunomycin)、博來霉素(bleomycin)或絲裂霉素(mitomycin)；一亞硝基脲，例如亞硝基脲氮芥(carmustine)或羅氮芥(lomustine)；一無機(jī)離子，例如順鉑；一生物響應(yīng)修飾劑，例如干擾素；一酶，你如天冬酰胺酶；或一激素，例如他莫昔芬(tamoxifen)或氟利坦(flutamide)。該些及其它抗癌化合物在此項(xiàng)技術(shù)中已為人們所熟知且適于醫(yī)藥應(yīng)用的調(diào)配物如(例如)The MerckManual(16th Ed.，Merck Res.Labs.，Rahway N.J.(1992))中所述亦已為人們知曉。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一套組，該套組包括至少一種具有IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑活性的本發(fā)明化合物及一具有治療活性的第二化合物?？砂谝惶捉M中的本發(fā)明化合物包括，例如，一具有一選自由核心肽4至39及42至55組成的組群的核心肽的化合物，或一具有任一選自圖5、9、10、14B、及21至24中所示核心結(jié)構(gòu)的化合物，其中該化合物可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏。該些套組可用于(例如)治療一以細(xì)胞凋亡呈病理降低為特征的疾病。舉例而言，一包括VP-16以及TPI792-33和TPI792-35兩者中任一種化合物的套組可用于治療前列腺癌。
一適當(dāng)套組中所包含的化合物既可為單獨(dú)封裝的調(diào)配物形式亦可為一混合調(diào)配物形式，只要所提供的每一化合物的量在投予至少一次后足以產(chǎn)生療效即可。該些調(diào)配物可為任一上述調(diào)配物，或者為已知適用于特定化合物及投予方式的調(diào)配物。
本發(fā)明一套組的容納物置于封裝材料或其它適宜的物理結(jié)構(gòu)中，較佳以提供一無菌且無污染物的環(huán)境。另外，該封裝材料含有說明書，其說明如何投予該套組內(nèi)的材料來治療一特征為細(xì)胞凋亡呈病理降低的疾病。典型地，該使用說明包括關(guān)于投予途徑的具體說明或(若需要)投予用調(diào)配物的制備方法。該說明書亦可包括對由使用該套組的容納物所產(chǎn)生的潛在效果的識別方法或關(guān)于不正確使用套組容納物的警告。
本發(fā)明提供一種鑒別一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的方法。該方法包括以下步驟(a)使一IAP及一卡斯蛋白酶與一被認(rèn)為能除去IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑接觸，其中該卡斯蛋白酶為一受IAP抑制的IAP抑制卡斯蛋白酶，其中接觸是在容許卡斯蛋白酶在不存在IAP的情況下具有活性的條件下進(jìn)行的；及(b)檢測該IAP抑制卡斯蛋白酶的去阻遏。
IAP抑制卡斯蛋白酶的去阻遏可檢測為一IAP抑制卡斯蛋白酶活性(包括，例如蛋白酶解活性)的增加。可使用一特定底物在一活體外分析中測量蛋白酶解活性。舉例而言，可使用一連續(xù)螢光分析法通過下列測量水解速度跟蹤7-胺基-4-三氟甲氧-香豆素(AFC)自DEVD(SEQ ID NO2，用一C端胺基甲基香豆素衍生)、YVAD(SEQ ID NO3，用一C端胺基甲基香豆素衍生(Tyr-Val-Ala-Asp-胺基甲基香豆素))的釋放或芐氧羰基-Glu-Val-Asp-胺基甲基香豆素的釋放；或跟蹤對硝基苯胺(pNA)自用pNA標(biāo)記的類似肽的釋放，如美國專利第6,228,603B1中所述。
可使用免疫印跡分析法或其它基于色譜的分析法根據(jù)產(chǎn)物相對于底物改變的分子量來檢測一底物被卡斯蛋白酶的蛋白酶解程度。舉例而言，在一如美國專利第6,228,603B1號中所述免疫印跡分析中，一上游啟動卡斯蛋白酶(例如卡斯蛋白酶-9)的蛋白酶解活性可根據(jù)將一下游效應(yīng)原卡斯蛋白酶(例如原卡斯蛋白酶-3)加工至成熟形式來測定。根據(jù)在存在本發(fā)明試劑時(shí)卡斯蛋白酶的活性會相對增強(qiáng)，此一分析對一IAP抑制卡斯蛋白酶在存在及不存在本發(fā)明試劑兩種情況下的結(jié)果的比較可用于鑒別IAP抑制卡斯蛋白酶抑制劑。
亦可通過鑒別一細(xì)胞或細(xì)胞核中標(biāo)志細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化來測定一卡斯蛋白酶的蛋白酶解活性。標(biāo)志細(xì)胞凋亡的變化包括，例如，染色質(zhì)聚集、核斷裂、細(xì)胞鄒縮、或細(xì)胞起泡導(dǎo)致最終分裂成稱為凋亡小體的圍繞有細(xì)胞膜的片段。因此，可根據(jù)以下鑒別一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑當(dāng)將其加至受IAP抑制卡斯蛋白酶的抑制而不能發(fā)生凋亡的細(xì)胞中時(shí)其具有可引起一標(biāo)志細(xì)胞凋亡的變化的能力。可對自此一細(xì)胞獲得的不含細(xì)胞的提取物進(jìn)行類似分析，只要在存在及不存在所添加試劑兩種情況下可辨別出一細(xì)胞凋亡變化，例如染色質(zhì)聚集或核斷裂。
IAP抑制卡斯蛋白酶的去阻遏亦可檢測為一IAP-卡斯蛋白酶類型的離解。使用此項(xiàng)技術(shù)中熟知的結(jié)合分析法，可將一IAP抑制卡斯蛋白酶鑒別為一締合有一IAP的卡斯蛋白酶?？墒褂?例如)未變性聚丙烯酰胺凝膠、大小排除色譜法或離心分析法根據(jù)分子量或大小來鑒別此一復(fù)合體。亦可用一共沉淀技術(shù)來鑒別一IAP卡斯蛋白酶復(fù)合體。舉例而言，因抗體具有可與兩個(gè)配偶體一起共沉淀但不能單獨(dú)與一個(gè)或另一個(gè)配偶體共沈淀的能力，據(jù)此可鑒別一IAP卡斯蛋白酶。類似地，當(dāng)IAP或卡斯蛋白酶已藉由一重組DNA方法進(jìn)行修飾后，可使用多種方法納入一親和標(biāo)簽，該親和標(biāo)簽可為(例如)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(AmershamPharmacia；Piscataway，NJ)，其可用谷胱甘肽珠沉淀；聚組氨酸標(biāo)簽(Qiagen；Chatsworth，CA)，其可用鎳NTA瓊脂糖凝膠沉淀；抗體抗原決定部位例如標(biāo)簽肽(Sigma，St Louis，MO)，可將其免疫沉淀；或其它熟知親和標(biāo)簽。在此一分析中可將一可阻止IAP卡斯蛋白酶復(fù)合體形成或者可使該復(fù)合體離解的試劑被鑒別為一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑。
卡斯蛋白酶以稱為原卡斯蛋白酶的多肽前體形式存在于細(xì)胞中。對原卡斯蛋白酶進(jìn)行蛋白酶解處理可激活卡斯蛋白酶。舉例而言，卡斯蛋白酶-3為一由約17至20kDa多肽與11kDa多肽組成的異四聚體，該些多肽通過蛋白酶解一32kDa多肽前體(即原卡斯蛋白酶-3)而形成。原卡斯蛋白酶-3的解離分兩步進(jìn)行。第一個(gè)解離步驟導(dǎo)致生成一仍含有原結(jié)構(gòu)域的部分加工的大亞單位(22至24kDa)及一較小的完全加工的亞單位(約11kDa)。在第二個(gè)步驟中，原結(jié)構(gòu)域從部分加工的大亞單位中解離出來(或許通過一自動催化方法)，生成酶卡斯蛋白酶-3的17至20kDa成熟且完全加工的大亞單位。然而，激活蛋白酶并非必須除去原結(jié)構(gòu)域，因?yàn)椴糠旨庸さ目ㄋ沟鞍酌高€具有卡斯蛋白酶活性。
用于鑒別一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的本發(fā)明方法可用于鑒別一因存在IAP而不能被加工成一成熟的完全蛋白酶解活性形式的卡斯蛋白酶。舉例而言，該些方法可用于鑒別一可防止或阻止原卡斯蛋白酶因受到IAP抑制而不能加工成卡斯蛋白酶的試劑。因?yàn)樵谝辉ㄋ沟鞍酌讣庸こ梢豢ㄋ沟鞍酌傅耐瑫r(shí)，卡斯蛋白酶的蛋白酶解活性會增強(qiáng)，所以用于測定蛋白酶解活性的上述方法可用于鑒別一可防止或阻止原卡斯蛋白酶因受到IAP抑制而不能加工成卡斯蛋白酶的試劑。同樣，一結(jié)合分析(例如上文所述的結(jié)合分析)可用于根據(jù)各配偶體結(jié)合后的分子量鑒別一卡斯蛋白酶-IAP復(fù)合體。在此一分析中，可將一防止形成復(fù)合體或使復(fù)合體離解的試劑鑒別為一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑。還可根據(jù)成熟的原卡斯蛋白酶形式在分子量或大小上的差異來鑒別一因存在IAP而不能加工成一成熟的完全蛋白酶解活性形式的卡斯蛋白酶。因此，當(dāng)一試劑在存在抑制性IAP的情況下與一原卡斯蛋白酶接觸時(shí)，其會導(dǎo)致分子量或大小的變化，此表明該成熟形式可被鑒別為一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑。
本發(fā)明的方法可用于鑒別一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑，其對一特定IAP或卡斯蛋白酶或二者的組合具有特異性。舉例而言，本發(fā)明提供若干用于鑒別一可改變一真核IAP(例如XIAP、c-IAP-1或c-IAP-2)與一卡斯蛋白酶(例如卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-7或卡斯蛋白酶-9)的特異性結(jié)合的篩選分析法。在本發(fā)明的方法中，任何IAP(包括任何真核IAP)均可與適當(dāng)?shù)目ㄋ沟鞍酌附M合使用。使用本文所揭示方法可鑒別出其它與調(diào)節(jié)特定卡斯蛋白酶相關(guān)的IAP蛋白，然后可在一篩選分析中使用卡斯蛋白酶與IAP的特定組合來鑒別一具有以下特征的試劑其可調(diào)節(jié)IAP對卡斯蛋白酶激活的控制作用或可改變IAP與卡斯蛋白酶的特異性締合。
如本文所揭示，本發(fā)明的核心肽是通過篩選具有核心四肽及六肽結(jié)構(gòu)的組合庫來鑒別的。根據(jù)所揭示方法，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可了解，還可對具有多于六個(gè)或少于4個(gè)氨基酸的組合庫進(jìn)行篩選，以鑒別出其它可除去IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的核心肽。此外，雖然所揭示方法可用于初步鑒別可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的核心肽，但所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，如下文所述，該些方法可疊合使用，以最優(yōu)化或鑒別其它可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的核心肽。
據(jù)預(yù)期，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員結(jié)合使用組合合成法及快速篩選法可最優(yōu)化及鑒別其它具有更強(qiáng)IAP結(jié)合親和力或在除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏方面具有更強(qiáng)活性(由此其治療潛能增強(qiáng))的去阻遏劑。
該疊代法在此項(xiàng)技術(shù)中已為人熟知，概言之，Houghten等人在Nature(354，84-86(1991))且Dooley等人在Science(266，2019-2022(1994))中闡述了該方法，上述兩份文獻(xiàn)均以引用方式并入本文中。在疊代法中，舉例而言，形成一具有3個(gè)可變基團(tuán)的分子的若干子庫，其中第一種可變基團(tuán)已定義。每一具有已定義可變基團(tuán)的化合物均可與所有的其它可能化合物在另兩個(gè)可變基團(tuán)處發(fā)生反應(yīng)。對該些子庫逐一進(jìn)行檢測，以便在篩選中在具有最高活性的子庫中界定第二個(gè)可變基團(tuán)的特性。一具有前兩個(gè)已定義可變位置的新子庫再次與所有其它可能的化合物在剩余的未定義可變位置處進(jìn)行反應(yīng)。如上所述，在具有最高活性的子庫中測定第三個(gè)可變位置的特性。若存在更多可變基團(tuán)，對于每一基團(tuán)均重復(fù)該步驟，生成其各可變基團(tuán)在篩選步驟中均有助于形成最高預(yù)期活性的化合物。然后，使用傳統(tǒng)的單一化合物合成法大規(guī)模合成由該步驟得出的活性較高的化合物，以用于進(jìn)一步的生物研究。
目前已有關(guān)于各種不同有機(jī)庫及肽庫用位置掃描方法的闡述(參見，例如，R.Houghten等人的PCT/US91/08694及美國專利第5,556,762號，其均以引用方式并入本文中)。在位置掃描方法中，使每一組子庫僅界定一個(gè)可變位置，生成并檢測所有可能的具有所定義各單個(gè)可變位置的子庫(及在所有其它可變位置處的所有其它可能的子庫)。通過本發(fā)明書，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可合成其中一次界定2個(gè)固定位置的庫。通過檢測每一單個(gè)可變位置所定義的庫，可確定該位置處的最佳取代基，由此得出最佳或至少一系列具有最大預(yù)期生物活性的化合物。因此，具有一單個(gè)所定義位置的化合物子庫的數(shù)量將為該位置處所需不同取代基的數(shù)量，且每一子庫中所有化合物的數(shù)量將為其它可變位置處的取代基數(shù)量的乘積。
噬菌體展示法提供了一種用于表達(dá)多種無規(guī)或以選擇性方式無規(guī)化的肽群的途徑。各種噬菌體展示法及生產(chǎn)多種肽群的方法在此項(xiàng)技術(shù)中已為人們所熟知。舉例而言，Ladner等人(美國專利第5,223,409號，頒布于1993年6月29日)闡述了在一噬菌體表面上制備多種結(jié)合結(jié)構(gòu)域群的若干方法。具體而言，Ladner等了闡述了可用于生成一噬菌體展示庫的噬菌體載體以及用于選擇潛在結(jié)合結(jié)構(gòu)域和生成以無規(guī)方式或選擇性方式突變的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
可使用氨基酸合成本發(fā)明含有肽部分的一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑，其活性基團(tuán)視需要用(例如)一二碳酸特丁酯(t-BOC)基團(tuán)或一笏甲氧羰基(FMOC)予以保護(hù)。氨基酸及氨基酸類似物可從市場上采購(Sigma Chemical公司，St.Louis MO；Advanced Chemtec，Louisville KY)或用此項(xiàng)技術(shù)中熟知的方法進(jìn)行合成。使用固相方法合成的肽可附著在多種樹脂上，包括(例如)4-甲基二苯甲基胺(MBHA)、4-(氧甲基)-苯乙酰胺基甲基及4-(羥甲基)苯氧基甲基共聚(苯乙烯-1％二乙烯基苯)(王氏樹脂(Wang resin))，其均可從市場上購得；或附著在對硝基苯基苯甲酮肟聚合物(肟樹脂)上，其可用Grado及Kaiser(J.Org.Chem.473258(1982))所述方法合成。
可納入一本發(fā)明肽中的氨基酸或氨基酸類似物將部分根據(jù)一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻抑劑的具體物理、化學(xué)或生理特征來選擇。該些特性根據(jù)(舉例而言)該肽是用于活體內(nèi)還是活體外來確定，當(dāng)用于活體內(nèi)時(shí)，根據(jù)本發(fā)明肽的投予途徑或該肽在一接受者中所欲到達(dá)的位置來確定。舉例而言，本文所闡述的IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏劑核心肽可僅用L-氨基酸合成。然而，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，本發(fā)明的一肽中的任一或所有氨基酸可為天然L-氨基酸、非天然的D-氨基酸或氨基酸類似物，只要該肽可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏。
在本發(fā)明肽中包括一L-氨基酸還是一D-氨基酸將部分視該肽的預(yù)期特性而定。舉例而言，納入一或多種D-氨基酸可使該肽在活體外或活體內(nèi)具有增強(qiáng)的穩(wěn)定性。納入一或多種D-氨基酸也可增強(qiáng)或降低該肽的活性，例如，IAP結(jié)合活性，該活性通過(例如)本文實(shí)例VII中所述分析法或其它用于測定一特定肽對一特定蛋白質(zhì)的結(jié)合活性的熟知方法測定。
如上所述，本發(fā)明肽可為線型、環(huán)狀或多價(jià)態(tài)及諸如此類，該些構(gòu)象可使用此項(xiàng)技術(shù)中為人們熟知的方法獲得。本文所用一“環(huán)狀肽”指合成線型肽的類似物，其可通過以化學(xué)方法將該些結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成環(huán)狀形式而獲得。線型肽的環(huán)化形式可通過增強(qiáng)或減弱與靶蛋白結(jié)合的效價(jià)來達(dá)到調(diào)節(jié)生物活性的目的(Pelton，J.T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，82236-239)。線型肽的柔性極大，其在溶液中往往呈現(xiàn)多種不同構(gòu)象。進(jìn)行環(huán)化可限制在溶液中可獲得的構(gòu)象的數(shù)量，由此可有利于形成一具有更高IAP親和力或具有更高IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑活性的構(gòu)象。
線型肽的環(huán)化可通過在游離N端與C端間形成一肽鍵(homodetic環(huán)肽)或通過在氨基酸主鏈與/或靠近N端或C端的側(cè)鏈基團(tuán)間形成一新的共價(jià)鍵(heterodetic環(huán)肽)來實(shí)現(xiàn)(Bodanszky，N.，1984，見上述文獻(xiàn))。環(huán)化使用另外的化學(xué)方法來形成共價(jià)鍵，例如二硫化物、內(nèi)酯、醚或硫醚。如本文所述，對具有5個(gè)或更多氨基酸殘基的線型肽進(jìn)行環(huán)化相對比較容易。肽往往會在中央四個(gè)殘基中形成一β-轉(zhuǎn)角構(gòu)象，這有助于形成homodetic及heterodetic環(huán)肽兩者。在N端或C端存在脯氨酸或甘氨酸也有助于形成環(huán)肽，特別是從長度上短于6個(gè)殘基的線型肽形成環(huán)肽。
相對于每個(gè)分子中所含IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏序列或部分的數(shù)目，本發(fā)明的一試劑可為多價(jià)態(tài)。一多價(jià)態(tài)試劑中所含的序列或部分可相同也可不同。例示性多價(jià)肽可用熟知的多抗原肽系統(tǒng)生成(MAPS；參見，例如Briand等人，1992，J.Immunol Meth.，156(2)255-265；Schott等人，1996，Cell Immun.，174(2)199-209，等)。一相對于所含IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏序列或部分呈多價(jià)態(tài)的試劑可用于與一具有多于1個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域的IAP發(fā)生相互作用。舉例而言，可將一單一試劑制備成含有兩個(gè)或更多可與同一IAP上的單獨(dú)BIR結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用的序列或部分。多價(jià)態(tài)試劑和IAP中存在多個(gè)相互作用的配偶體能夠增強(qiáng)親和力或相互作用的特異性。
在某些情況下，最好是使一IAP抑制卡斯蛋白酶僅在短時(shí)間內(nèi)保持活性。在該些情況下，舉例而言，在試劑中納入一或更多L-氨基酸可允許一接受者中的內(nèi)源性肽酶在活體內(nèi)消化該試劑，從而限制該受試者暴露于該去阻遏劑。在一實(shí)施例中，無論該試劑是基于一肽主鏈還是其它結(jié)構(gòu)，其均可包括一通過一L-天冬氨酸根部分或殘基形成的肽鍵。已由其除去阻遏的卡斯蛋白酶對含L-天冬氨酸根的試劑的降解可提供一反饋控制機(jī)制，該機(jī)制將該試劑所允許的細(xì)胞凋亡程度降至最低。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員在考慮(例如)接受者的年齡及一般健康狀況等因素后可確定本發(fā)明一試劑所需具有的預(yù)期特征。舉例而言，可使用醫(yī)藥領(lǐng)域中為人熟知的方法測定一其中用一或更多D-氨基酸取代了對應(yīng)L-氨基酸的肽在一接受者體中的半衰期。
對一肽中的反應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行選擇性修飾也可使一IAP抑制卡斯蛋白酶的去阻遏劑具有預(yù)期特性?？蓪σ蝗愿街跇渲谋景l(fā)明肽進(jìn)行處理，以獲得(例如)一N端經(jīng)修飾的肽，例如一N端乙酰基化了的肽?；蛘?，可使用氫氟酸或一等效解離劑將該肽自樹脂移除，然后對其進(jìn)行修飾?？稍诤蠧端羧基的合成試劑(王氏樹脂)從樹脂上解離下來后對其進(jìn)行修飾，或在某些情況下，在進(jìn)行液相合成前對其進(jìn)行修飾。用于修飾一肽的N端或C端的方法在此項(xiàng)技術(shù)中已為人們所熟知，其包括，例如，用于乙酰基N端的方法及用于酰胺化C端的方法。
本發(fā)明肽的范圍還涵蓋肽類似物。本文所用術(shù)語“肽類似物”包括任何具有一與本文中明確列出的序列大致相同的氨基酸序列的肽，例如核心肽1至55，其中一或更多殘基已保守地由一功能上類似的殘基所取代，該功能上類似的殘基在功能上與本文所述的一本發(fā)明凝集素結(jié)合肽極其相似。保守取代的實(shí)例包括用一非極性(疏水性)殘基(例如用異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或蛋氨酸)取代另一殘基；用一極性(親水性)殘基取代另一殘基，例如精氨酸與賴氨酸之間、谷氨酰胺與天冬酰胺之間、甘氨酸與絲氨酸之間；用一堿性殘基(例如賴氨酸、精氨酸或組氨酸)取代另一殘基；或者用一酸性殘基(例如天冬氨酸或谷氨酸)取代另一殘基。
本文所用短語“保守取代”還包括使用一化學(xué)衍生的殘基來代替一未經(jīng)衍生的殘基，只要該肽展現(xiàn)出所需的IAP結(jié)合或抑制活性。一化學(xué)衍生物可包括，例如，那些其中游離氨基已衍生形成胺鹽酸鹽、對甲苯磺?；?、特丁氧羰基、氯乙?；蚣柞；姆肿印Ｓ坞x羧基可衍生形成鹽、甲基及乙基酯或其它類型的酯或酰肼。游離羥基可衍生形成O-?；騉-烷基衍生物。組氨酸的咪唑氮可經(jīng)衍生形成N-im-芐基組氨酸。本發(fā)明的化學(xué)衍生物還包括那些含有20種基本氨基酸的一或多種天然氨基酸衍生物的肽。例如4-羥基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羥基賴氨酸或取代賴氨酸；3-甲基組氨酸可取代組氨酸；高絲氨酸可取代絲氨酸；及鳥氨酸或取代賴氨酸。本發(fā)明的肽還可包括任何具有下列特征的肽，即相對于本文所示的肽的序列，該肽增加了一或多個(gè)殘基或缺失了一或多個(gè)殘基，或兩種情況組合存在，只要其仍保留了所需的IAP結(jié)合或抑制活性。
所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本文所提供的指導(dǎo)可了解到，本發(fā)明的一試劑可包括一核心肽或核心結(jié)構(gòu)，其可由類似物或衍生物修飾、衍生或取代，只要該試劑可除去一IAP抑制卡期蛋白酶的阻遏。一核心肽或核心結(jié)構(gòu)中的該些改變可通過例如本文所述的習(xí)知合成方法來實(shí)現(xiàn)?？墒褂帽疚乃龇椒?例如實(shí)例I中所述去阻遏分析法或?qū)嵗齎II中所述偏光結(jié)合分析法)檢測發(fā)生了上述改變的試劑的活性。
可使用一分析法檢測一鑒別為一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的試劑，該方析法用于在存在或不存在該試劑的情況下測定卡斯蛋白酶的蛋白酶解活性或IAP與卡斯蛋白酶的結(jié)合情況，其中包括(例如)上述分析法?？墒褂蒙鲜霪B代法在一或多個(gè)位置處對一通過上述分析法鑒別為可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑進(jìn)一步進(jìn)行組合。另外，可以便用一或多種已識別的去阻遏劑作為基礎(chǔ)來合理地設(shè)計(jì)第二代試劑。舉例而言，可使用多種已證明有效的試劑之間的共同結(jié)構(gòu)特征來指導(dǎo)合成一種納入該些共有特征的一般性結(jié)構(gòu)。當(dāng)結(jié)合至一IAP或卡斯蛋白酶時(shí)，與試劑有關(guān)的結(jié)構(gòu)信息可用于設(shè)計(jì)一第二代試劑，該第二代試劑可保留或改進(jìn)鑒別為可提供有利相互作用的部分，同時(shí)除去了可導(dǎo)致與卡斯蛋白酶或IAP發(fā)生不利相互作用的部分。
本發(fā)明提供一種鑒別一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的方法。該方法包括以下步驟(a)檢測與一IAP或卡斯蛋白酶結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑；(b)使所結(jié)合的IAP或卡斯蛋白酶與一候選試劑相接觸，該候選試劑被懷疑能夠除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏；及(c)檢測經(jīng)標(biāo)記的一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑與IAP或卡斯蛋白酶之間發(fā)生的離解，藉此可將候選試劑鑒別為一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑。該方法中所用的經(jīng)標(biāo)記的IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑可具有一核心基元或核心結(jié)構(gòu)，其中該核心基元選自本發(fā)明的一核心肽，例如核心肽4至39及42至55，該核心結(jié)構(gòu)選自TPI759、TPI882、TPI914或TPI927。該些方法可用于在上述篩選格式及該些實(shí)例中鑒別一更佳的IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑。
本發(fā)明一方法中使用的一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑可標(biāo)有多種標(biāo)記物的任一種標(biāo)記，該等標(biāo)記物包括(例如)上文所述的標(biāo)記物?？筛鶕?jù)標(biāo)記物的一習(xí)知可測量特性檢測一結(jié)合至一IAP或卡斯蛋白酶的經(jīng)標(biāo)記去阻遏劑。舉例而言，可根據(jù)下列檢測一熒光團(tuán)熒光團(tuán)的激發(fā)或發(fā)射波長、熒光團(tuán)的熒光偏光度或熒光團(tuán)發(fā)出的熒光密度?；蛘?，可根據(jù)標(biāo)記物處于結(jié)合狀態(tài)與未結(jié)合狀態(tài)之間的差異來進(jìn)行檢測。舉例而言，如實(shí)例VII中所示，與一未經(jīng)結(jié)合的底物相比，結(jié)合至一IAP的底物的旋轉(zhuǎn)速度要慢，由此可使用由此造成的熒光偏光度差異來檢測締合作用?？捎糜跍y定一熒光標(biāo)記試劑與一IAP或卡斯蛋白酶之間締合作用的其它可測量差異包括(例如)由存在或不存在一猝滅劑而造成的發(fā)射密度差異、由存在或不存在一熒光共振能量傳遞(FRET)給體或受體而造成的發(fā)射波長差異、或由熒光團(tuán)構(gòu)象或環(huán)境而造成的發(fā)射波長差異。
IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏劑與IAP或卡斯蛋白酶發(fā)生離解現(xiàn)象可檢測為下述兩種情況在存在一競爭性結(jié)合候選試劑的情況下，來自IAP或卡斯蛋白酶的標(biāo)記物缺如或數(shù)量降低，或在存在一競爭性結(jié)合候選試劑的情況下，一旦經(jīng)標(biāo)記試劑與一卡斯蛋白酶或IAP進(jìn)行締合即刻發(fā)生相反的變化。因此，在存在一未經(jīng)標(biāo)記的候選試劑時(shí)，離解現(xiàn)象可檢測為在存在一用放射性核苷酸標(biāo)記的去阻遏劑的情況下，IAP或卡斯蛋白酶的放射性減弱或消失；在存在一用發(fā)色團(tuán)標(biāo)記的去阻遏劑的情況下，IAP或卡斯蛋白酶在一規(guī)定波長下的電磁吸收減弱或消失；在存在一順磁自旋標(biāo)記抑制劑的情況下，IAP或卡斯蛋白酶在一規(guī)定場強(qiáng)度或射頻下的磁信號減弱或消失，或在存在一標(biāo)記有一次級標(biāo)記用結(jié)合基團(tuán)的去阻遏劑的情況下，該與IAP或卡斯蛋白酶相關(guān)的次級標(biāo)記物減少或消失。實(shí)例VII中提供一根據(jù)締合時(shí)發(fā)生的相反變化來量測離解的實(shí)例，其中利用因一經(jīng)離解底物比IAP結(jié)合底物旋轉(zhuǎn)更快而造成的偏光度差異來檢測離解。
一標(biāo)記物特性中的其它可進(jìn)行檢測來測定一經(jīng)適當(dāng)標(biāo)記的去阻遏劑與IAP或卡斯蛋白酶之間的締合或離解的變化包括(例如)吸熱與放熱、電磁輻射的吸收與發(fā)射、對一受體的親和力、分子量、密度、質(zhì)量、電荷、導(dǎo)電性、核的磁矩、電子的自旋狀態(tài)、極性、分子形狀或分子大小?？筛淖円唤?jīng)適當(dāng)標(biāo)記的去阻遏劑與IAP或卡斯蛋白酶之間的締合或離解的周圍環(huán)境因素包括(例如)周圍溶劑的折射率及溫度?？墒褂昧?xí)知方法根據(jù)一經(jīng)標(biāo)記去阻遏劑或一去阻遏劑與IAP或卡斯蛋白酶的復(fù)合體的多種特性中的任一特性測量一去阻遏劑與一IAP或卡斯蛋白酶之間的締合或離解，該些習(xí)知方法包括(例如)平衡結(jié)合分析法、競爭分析法及動力學(xué)分析法，如Segel在Enzyme Kinetics(John Wiley and Sons，New York(1975))及Kyte在Mechanism in Protein Chemistry(Garland Pub.(1995))中所述。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于在一數(shù)據(jù)庫中鑒別一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的方法?？捎靡籌AP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的結(jié)構(gòu)來查詢一分子(例如肽或小分子)數(shù)據(jù)庫，以鑒別具有一與查詢結(jié)構(gòu)完全相同或類似的部分的候選試劑?？墒褂昧?xí)知方法合成、分離或者以其它方式獲得在數(shù)據(jù)庫搜尋中所鑒別的一候選試劑，然后使用上述及實(shí)例中所述分析法檢測其作為IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的活性。
若為基于肽的去阻遏劑，則可依據(jù)氨基酸序列(一級結(jié)構(gòu))或三維結(jié)構(gòu)(三級結(jié)構(gòu))或兩者的組合進(jìn)行查詢，以鑒別具有完全相同或大致類似的結(jié)構(gòu)的肽或蛋白質(zhì)。用來比較主要序列結(jié)構(gòu)來確定兩個(gè)序列是否大致與數(shù)據(jù)庫相同的的方法在此項(xiàng)技術(shù)中已為人們所熟知，其包括(例如)SwissProt及GenPept。舉例而言，一用于測定兩個(gè)序列是否大致相同的方法為BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)，其可根據(jù)Tatiana等人(FEMS Microbial Lett.174247-250(1999))或國家生物技術(shù)信息中心(the National Center for BiotechnologyInformation)網(wǎng)頁上所述的缺省參數(shù)加以使用。BLAST是一組設(shè)計(jì)用于檢查所有可用序列數(shù)據(jù)庫的相似性搜索程序，其可用于搜索氨基酸或核酸序列中的相似性。BLAST搜索可提供具有明確統(tǒng)計(jì)學(xué)解釋的得分。此外，BLAST使用一可尋找局部序列對比的啟發(fā)式算法，因此可檢測僅共享分離的類似性區(qū)域(包括，例如蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域)的各序列之間的關(guān)系(Altschul等人，J.Mol.Biol.215403-410(1990))。
除最初闡述的BLAST(Altschul等人，見上述文獻(xiàn)，1990)外，人們已對該算法進(jìn)行修改(Altschul等人，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997))。一種修改形式為GappedBLAST，其可容許缺口(插入或刪除)參與序列對比。容許缺口參與序列對比往往會更密切地反映生物關(guān)系。舉例而言，Gapped BLAST可用于鑒別兩種或更多種多肽的類似結(jié)構(gòu)域內(nèi)完全相同的序列。第二種修改形式為PSI-BLAST，其為一敏感的同源序列搜索方法。PSI-BLAST首先進(jìn)行一Gapped BLAST搜索并使用來自任何顯著的序列對比的信息來構(gòu)建一位置特異性得分矩陣，該矩陣代替該查詢序列進(jìn)行下一輪數(shù)據(jù)庫搜索。PSI-BLAST搜索通常對弱的但在生物上相關(guān)的序列類似性更為敏感。
另一可用于測定兩種序列是否大致相同的辦法為PROSITE，其可在ExPASy環(huán)球網(wǎng)上獲得。PROSITE為一種測定由基因組序列或cDNA序列轉(zhuǎn)譯而來且未經(jīng)表征的多肽(Bairoch等人，Nucleic Acids Res.25217-221(1997))的方法。PROSITE由一在生物上顯著的位置和模式數(shù)據(jù)庫組成，其可用于鑒別新序列屬于哪一已知的多肽家族(若有)。使用該算法或一類似算法，可根據(jù)下列情況鑒別一多肽與另一多肽大致相同在其序列中出現(xiàn)一特定的可稱作一模式、基元、特征或指紋的氨基酸殘基簇，該氨基基酸殘基簇與一參考多肽的一特定氨基酸殘基簇大致相同，其包括(例如)那些存在于類似結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基簇。PROSITE使用一計(jì)算機(jī)算法來搜尋可將多肽鑒別為家族成員的基元。PROSITE亦可對先前已鑒別出的基元進(jìn)行匯編，其可用于測定一新鑒別出的多肽是否為一已知家族的一員。
可使用此項(xiàng)技術(shù)中熟知的算法通過一理論性方法(例如從頭蛋白質(zhì)折疊)或通過一實(shí)驗(yàn)性方法(例如基于X射線晶體解析或核磁共振的結(jié)構(gòu)測定法)測定一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的三級結(jié)構(gòu)。一去阻遏劑的結(jié)構(gòu)模型可用于一對多肽結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較的算法中，該些多肽結(jié)構(gòu)包括(例如)SCOP、CATH或FSSP(其闡述于Hadley及Jones，Structure 71099-1112(1999))及具有一特定折疊或構(gòu)象的區(qū)域，該折疊或構(gòu)象可作為一區(qū)域用于與另一多肽的序列進(jìn)行比較以鑒別大致相同的區(qū)域。
類似數(shù)據(jù)庫搜索方法可用于非肽基去阻遏劑或用于基于結(jié)構(gòu)查詢一非肽基候選試劑的數(shù)據(jù)庫。舉例而言，可通過基于化學(xué)特性信息或結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行查詢的方式來搜索一數(shù)據(jù)庫。在后一種方法中，可使用一基于尋找一模板匹配者的算法，例如，如“Database Searching inDrug Design”(Martin，J.Med.Chem.352145-2154(1992))中所述。
也可在一數(shù)據(jù)庫中將一位置掃描合成組合庫的結(jié)果作為一查詢條件來鑒別一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑。可將該類結(jié)果視為一基元，該基元可用于搜索一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的數(shù)據(jù)庫?；阉髟醋晕恢脪呙韬铣山M合庫的篩選結(jié)果，每一位置中所包含的是與若干其活性閾值大于一規(guī)定值的混合物相對應(yīng)的氨基酸。一活性閾值實(shí)例為實(shí)例I中所述的在存在及不存在一候選試劑兩種情況下卡斯蛋白酶活性的Vmax的比率?；诨臄?shù)據(jù)庫搜索在此項(xiàng)技術(shù)中已為人們所熟知，例如，如Hemmer等人在Nat.Med.(51375-1382(1999))、J.Exp.Med.(1851651-1659(1997))及Immunol Today(19163-168(1998))中所述。
或者，可將由一位置掃描合成組合庫獲得的結(jié)果視為一得分矩陣，該得分矩陣可用于在一序列數(shù)據(jù)庫中查詢其它IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑。Zhao等人在J.Immunol.(1672130-2141(2001))中闡述了若干用于鑒別候選肽或蛋白質(zhì)的方法，該些方法以對一數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基于得分矩陣的搜索為基礎(chǔ)。簡言之，構(gòu)建一矩陣，其中列代表位置，行代表20種氨基酸，且每一均與一得分相關(guān)。一特定位置和氨基酸的得分基于對與該位置處所界定的氨基酸相對應(yīng)的一位置掃描合成組合庫混合物的分析結(jié)果。舉例而言，每一得分均可相當(dāng)于在存在及不存在與該特定位置處所界定的氨基酸相對應(yīng)的混合物的情況下卡斯蛋白酶活性的Vmax比率。然后，通過將得分矩陣以1個(gè)氨基酸的增量沿?cái)?shù)據(jù)庫條目移動，用該得分矩陣來搜索一IAP抑制卡斯蛋白酶的候選去阻遏劑。計(jì)算所搜索數(shù)據(jù)庫條目的得分并對每一條目進(jìn)行歸類。那些得分高于一預(yù)定截止值的被鑒別為一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑。
本發(fā)明提供一種除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的方法，其通過使一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑與一有效量的試劑相接觸來除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏，該試劑具有一選自本發(fā)明的一核心肽(例如核心肽4至39及42至55)的核心基元或本發(fā)明的一核心結(jié)構(gòu)(例如TPI759、TPI882、TPI9I4或TPI927)。
為了抑制一細(xì)胞凋亡蛋白抑制劑(IAP)的卡斯蛋白酶抑制活性，使IAP抑制卡斯蛋白酶與一定量的可除去該IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的去阻遏劑相接觸。因此，該試劑的一有效量即為一足以使經(jīng)去阻遏的IAP抑制卡斯蛋白酶的蛋白酶解活性比一IAP抑制卡斯蛋白酶的蛋白酶解活性增強(qiáng)的量?？墒褂萌我簧鲜龇椒ú⒄找挥糜阼b定IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的方法來測定一經(jīng)去阻遏的IAP抑制卡斯蛋白酶的蛋白酶解活性的增強(qiáng)程度。
可在一旦IAP受到抑制不能對卡斯蛋白酶產(chǎn)生抑制即出現(xiàn)卡斯蛋白酶活性的合適條件下，使本發(fā)明的一試劑與一IAP抑制卡斯蛋白酶相接觸。該些條件包括實(shí)例I中闡述的條件。與該IAP抑制卡斯蛋白酶相接觸的試劑可以分離形式或大致純凈的形式存在于一化合物混合物中。如上所述，在一利用位置掃描或疊代篩選方法中可將一化合物混合物與一IAP抑制卡斯蛋白酶相接觸。此一混合物可被鑒別為具有除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的能力。該混合物可在本發(fā)明的方法中用來除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏?；蛘?，可通過下列進(jìn)一步界定該混合物中具有該活性的一特定物種分離該混合物中的各單獨(dú)物種并重復(fù)該去阻遏分析或?qū)嵤┑诙蜪AP抑制卡斯蛋白酶去阻遏分析?？蓪⒁豢沙ヒ籌AP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑與IAP抑制卡斯蛋白酶相接觸，該試劑可呈一大致純凈的形式、作為一偶聯(lián)物或呈一上述調(diào)配物形式。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，可使一IAP抑制卡斯蛋白酶與本發(fā)明的試劑在一細(xì)胞中相接觸。因此，本發(fā)明提供一種通過使一細(xì)胞與一有效量的試劑接觸以除去IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏來促進(jìn)一細(xì)胞凋亡的方法，該試劑具有一選自本發(fā)明的一核心肽(例如核心肽4至39及42至55)的核心基元或本發(fā)明的一核心結(jié)構(gòu)(例如TPI759、TPI882、TPI914或TPI927)。
本文所述的用胞質(zhì)溶膠輸送一IAP抑制卡斯蛋白酶的方法(例如附著偶聯(lián)物的一部分)可在一促進(jìn)一細(xì)胞凋亡的方法中使用。該試劑的一有效量可視為一足以容許細(xì)胞發(fā)生凋亡的量。用于測定一細(xì)胞或細(xì)胞核中表征細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化的方法(例如上述那些有關(guān)鑒別一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的方法)可用于在實(shí)施一促進(jìn)細(xì)胞凋亡的方法時(shí)監(jiān)測細(xì)胞凋亡情況。
本發(fā)明還提供一種用于降低一細(xì)胞群在體外存活能力的方法。該方法可包括使細(xì)胞與本發(fā)明試劑接觸的步驟，其中本發(fā)明試劑除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏?？捎蒙鲜鲇糜诖龠M(jìn)一細(xì)胞凋亡的方法使該些細(xì)胞與該試劑接觸。該些方法可用于利用上述尋靶方法(例如將一尋靶部分附著至該試劑上)除去一試樣中的一特定細(xì)胞子群。
可在任何其中當(dāng)除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏時(shí)可發(fā)生細(xì)胞凋亡的生物體細(xì)胞中實(shí)施本發(fā)明的方法，該些細(xì)胞包括，舉例而言，真核細(xì)胞，例如哺乳動作細(xì)胞、人類細(xì)胞、非人類靈長類動物細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、倉鼠細(xì)胞或其它動物的細(xì)胞；無脊椎動物細(xì)胞，例如蒼蠅或線蟲細(xì)胞，或酵母細(xì)胞。本發(fā)明的方法中可使用多種細(xì)胞型，例如，腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、造血細(xì)胞、肝細(xì)胞或肌細(xì)胞。具體而言，該些方法可用于在調(diào)節(jié)異常的細(xì)胞中引發(fā)細(xì)胞凋亡，該些細(xì)胞包括，例如，細(xì)胞增生不受控制的細(xì)胞以及細(xì)胞循環(huán)的特定階段出現(xiàn)紊亂的細(xì)胞，從而導(dǎo)致增生特性或形態(tài)表現(xiàn)型改變。調(diào)節(jié)異常的細(xì)胞型的具體實(shí)例包括贅瘤細(xì)胞(例如癌)及特征為組織增生的增生細(xì)胞。另一具體實(shí)例包括啟動態(tài)變得異?；虿荒芟蛳抡{(diào)節(jié)后續(xù)刺激的免疫細(xì)胞。調(diào)節(jié)異常的細(xì)胞還包括在生物化學(xué)上或生理上功能異常的細(xì)胞。其它類型的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)異常及增生已為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，且同樣是適于使用本發(fā)明方法破壞細(xì)胞凋亡的本發(fā)明靶細(xì)胞。
因?yàn)樵S多與細(xì)胞凋亡相關(guān)的特性變化是由卡斯蛋白酶的蛋白酶解活性造成的，所以可使用該些方法誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生特性改變。舉例而言，由卡斯蛋白酶引發(fā)的核纖層蛋白B的蛋白酶解(其涉及將染色質(zhì)附著至核膜上)可導(dǎo)致與細(xì)胞凋亡相關(guān)的染色質(zhì)發(fā)生崩解(Martin及Green，見上述文獻(xiàn)，1995)?？ㄋ沟鞍酌敢l(fā)的45kDa DNA斷裂因子亞單位(DFF-45)的蛋白酶解可激活一導(dǎo)致基因組DNA斷裂成核小體片段的途徑(Liu等人，Cell 89175-184(1997))。另外，卡斯蛋白酶引發(fā)的PARP的蛋白酶解可阻礙PARP修復(fù)DNA損傷的能力，由此進(jìn)一步促使發(fā)生與細(xì)胞凋亡相關(guān)的形態(tài)變化。因此，本發(fā)明的方法可用于引發(fā)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的染色質(zhì)的崩解及基因組DNA的斷裂。其它卡斯蛋白酶靶蛋白包括甾醇調(diào)節(jié)因子結(jié)合蛋白；成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(RB)蛋白；DNA依賴性激酶；U170-K激酶；及DNA復(fù)制復(fù)合體的大亞單位(Wang等人，EMBO J.151012-1020(1996)；Takahashi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA938395-8400(1996)；Casciola-Rosen等人，J.Exp.Med.1831957-1964(1996)；Ubeda及Habener，J.Biol.Chem.27219562-19568(1997))，本發(fā)明的方法可致使此等蛋白均發(fā)生蛋白酶解。
在哺乳運(yùn)輸細(xì)胞中，卡斯蛋白酶的激活至少通過兩種獨(dú)立機(jī)制實(shí)現(xiàn)，該兩種機(jī)制通過不同的卡斯蛋白酶引發(fā)，卻激活共同的“執(zhí)行”卡斯蛋白酶。由結(jié)合至Fas受體的配體啟動的細(xì)胞凋亡為一已明確論述的細(xì)胞死亡途徑。在該途徑中，一配體與Fas的結(jié)合容許Fas的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞內(nèi)MORT1(FADD)蛋白結(jié)合，而細(xì)胞內(nèi)MORT1蛋白反過來又會與卡斯蛋白酶-8(MACH；FLICE；Mch5；參見Boldin等人，Cell 85803-815(1996)；Muzio等人，Cell85817-827(1996))結(jié)合。這些結(jié)果將卡斯蛋白酶-8界定為一與Fas細(xì)胞死亡途徑有關(guān)的上游卡斯蛋白酶。另外，卡斯蛋白酶-3在Fas細(xì)胞死亡途徑中被激活，這表明一上游蛋白酶(例如卡斯蛋白酶-8)或一由卡斯蛋白酶激活的蛋白酶與卡斯蛋白酶-3激活與關(guān)。因此，本發(fā)明的方法可用于直接除去IAP抑制卡斯蛋白酶-8的阻遏，藉此可有效除去下游卡斯蛋白酶-3蛋白酶的阻遏。
卡斯蛋白酶激活還可涉及細(xì)胞色素c，在哺乳動物中細(xì)胞色素c通常在細(xì)胞凋亡期間自線粒體釋放入胞質(zhì)溶膠中(Liu等人，Cell 86147-157(1996)；Kharbanda等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 946939-6942(1997)；Kluck等人，Science 2751132-1136(1997)；及Yang等人，Science 2751129-1132(1997))。進(jìn)入胞質(zhì)溶膠后，細(xì)胞色素c可使蛋白質(zhì)以依賴于ATP-或dATP的方式形成一復(fù)合體，從而激活原卡斯蛋白酶-3的蛋白酶解活性并使細(xì)胞核發(fā)生凋亡性破壞(Liu等人，見上述文獻(xiàn)，1996)。CED-4同源物Apaf-1及卡斯蛋白酶-9(Apaf-3；Liu等人，見上述文獻(xiàn)，1996；Li等人，Cell 91479-489(1997)；Zou等人，Cell 90405-413(1997))均為該復(fù)合體的一員。XIAP、c-IAP-1及c-IAP-2可遏制由已知可使線粒體釋放細(xì)胞色素c的刺激引發(fā)的細(xì)胞凋亡，且其可在活體外抑制由細(xì)胞色素引發(fā)的卡斯蛋白酶激活。因此，本發(fā)明的試劑及方法可用于通過使用XIAP、c-IAP-1或c-IAP-2抑制一卡斯蛋白酶的方式使細(xì)胞凋亡隨細(xì)胞色素從線粒體中的釋放而發(fā)生。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種方法，該方法通過向一患有以細(xì)胞凋亡量呈病理性降低為特征的疾病的個(gè)體投予一有效量的可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑來減輕一個(gè)體的疾病嚴(yán)重程度。以細(xì)胞凋亡量呈病理性降低為特征且可用本發(fā)明的一方法治療的疾病包括(但不限于)再狹窄癥；自身免疫病，例如狼瘡或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；同種異體移植排斥、皮膚的增生性損傷(例如濕疹)；或良性前列腺肥大。該試劑可具有一選自本發(fā)明一核心肽(例如核心肽4至39及42至55)的核心基元或一本發(fā)明的一核心結(jié)構(gòu)(例如TPI759、TPI882、TPI914或TPI927)。
當(dāng)一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑用于治療一疾病時(shí)，其一有效量是指一當(dāng)投予至一個(gè)體時(shí)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡所需的量。本發(fā)明一試劑達(dá)到在治療上有效所需的劑量將取決于(例如)待治療的疾病、給藥途徑及形式、個(gè)體的體重和健康狀況以及先前或并行的治療情況。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員使用本文所提供的指導(dǎo)說明可確定對于該方法的一特定應(yīng)用而言認(rèn)為是有效劑量的適宜用量。舉例而言，可由上述的活體外或活體內(nèi)分析法推知該劑量。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，可在整個(gè)治療期間對患者的狀況進(jìn)行監(jiān)測，所投予試劑可據(jù)此做出相應(yīng)調(diào)整。
對于治療或降低一疾病的嚴(yán)重程度而言，一有效量指該試劑能夠?qū)Τ什±斫档偷募?xì)胞凋亡產(chǎn)生增進(jìn)作用的有效量。一有效量視治療方案而定可，舉例而言，介于約10μg/kg至500mg/kg體重之間，例如介于約0.1mg/kg至100mg/kg之間，或更佳介于約1mg/kg至50mg/kg之間。舉例而言，若一天一次至數(shù)次投予一試劑或含有該試劑的調(diào)配物，則所需劑量將比一周或一月或更長時(shí)間投予一次調(diào)配物所用劑量要低。類似地，可容許試劑緩慢釋放的調(diào)配物(例如上述那些調(diào)配物)持續(xù)釋放的細(xì)胞凋亡去阻遏劑的量比作為單次大劑量投予的量要小。舉例而言，本發(fā)明的一試劑可以約1至5mg/kg/周的劑量投予。
一IAP抑制卡斯蛋白酶的調(diào)配物、其變體或組合還可交互投予方式輸送，以便隨時(shí)間組合它們的細(xì)胞凋亡增強(qiáng)效果。舉例而言，可將本發(fā)明的一具有一核心肽或結(jié)構(gòu)的試劑以一單次大劑量形式投予，隨后多次單獨(dú)投予一或更多該類試劑或變體，或與此一試劑的一不同調(diào)配物或一不同試劑的調(diào)配物組合投予。不論該試劑調(diào)配物、其變體或組合是同時(shí)還是交互輸送，投予方式均可為上述投予類型的任何一種且其將視所選用IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的特定治療需要及功效而定。確定在一臨時(shí)投予方案中組合哪種試劑、調(diào)配物、類型或變體將取決于待治療的疾病及患有該疾病的個(gè)體的具體身體狀況。根據(jù)本文所提供的教示和指導(dǎo)說明以及特定疾病技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)習(xí)知的診斷及臨床標(biāo)準(zhǔn)，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解或可確定一特定應(yīng)用的具體給藥方案。
治療一以細(xì)胞凋亡量呈病理降低為特征的疾病的方法還可聯(lián)合其它療法實(shí)施。舉例而言，對治療癌癥而言，本發(fā)明的方法可在傳統(tǒng)癌癥治療例如手術(shù)、化學(xué)治療(包括投予細(xì)胞因子及生長因子)、放射或此項(xiàng)技術(shù)中熟知的其它方法之前、期間或之后實(shí)施。如上所述以及如實(shí)例X的結(jié)果所顯示，TPI792-33或TPI792-35可與VP-16聯(lián)合投予來治療癌癥。
類似地，對于治療包括傳染病在內(nèi)的疾病而言，本發(fā)明的方法可在傳統(tǒng)治療例如投予抗生素、抗感染試劑或此項(xiàng)技術(shù)中熟知的其它方法之前、期間或之后實(shí)施。也可通過接合使用旨在除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的本發(fā)明方法與特定自身免疫病的傳統(tǒng)治療法來治療自身免疫病。傳統(tǒng)治療包括(例如)化學(xué)治療、類固醇治療、胰島素及其它生長因子及細(xì)胞因子結(jié)合以及T細(xì)胞受體接種。本發(fā)明的方法可聯(lián)合這些方法或此項(xiàng)技術(shù)中熟知的其它方法在傳統(tǒng)治療開始之前、期間或之后實(shí)施。關(guān)于治療以細(xì)胞生長異常為特征的疾病的闡述參見，例如，The Merck Manual(Sixteenth Ed，(Berkow，R.，Editor)Rahway，N.J.，1992)。此外，在一治療方法中，包括(例如)上述聯(lián)合性組合物中任一種藥物的抗癌藥物可在投予一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑之前、期間或之后投予。
如上所述，可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑調(diào)配物的投予可與傳統(tǒng)療法同時(shí)進(jìn)行或以交互形式進(jìn)行，包括多次投予。同時(shí)投予可為，舉例而言，在同一調(diào)配物中一起投予或在約在同一時(shí)間或迅速依次給藥的不同調(diào)配物中投予。交替投予可為，舉例而言，輸送本發(fā)明的一試劑與一傳統(tǒng)治療在時(shí)間上分開。如上所述，本發(fā)明一試劑的投予與傳統(tǒng)治療在時(shí)間上分開同樣可使用不同的輸送模式及途徑。
可用本發(fā)明的試劑及方法治療的一以細(xì)胞凋亡量呈病理降低為特征的疾病包括(例如)癌癥、增生、自身免疫病及再狹窄癥。越來越多的人類疾病被歸類為自身免疫病，其包括(例如)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、重癥肌無力、多發(fā)性硬化、干癬、全身性紅斑狼瘡、自身免疫性甲狀腺炎、葛雷夫斯氏病(Grave’s disease)、炎癥性腸病、自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎、多肌炎及糖尿病。人們已開發(fā)出用于多種以細(xì)胞凋亡量呈病理降低為特征的疾病的動物模型，該些模型可用于以預(yù)測形式評價(jià)使用一可除去IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑的治療效果。并且，從該些動物模型能夠可靠地推知含有一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的醫(yī)藥組合物可治療這些疾病。
所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員知道如何根據(jù)在一相關(guān)動物模型中的常規(guī)測試結(jié)果來測定本發(fā)明一試劑的功效或數(shù)量?？筛鶕?jù)一受治療個(gè)體的反應(yīng)在一臨床環(huán)境中測定一試劑的待投予量。功效的調(diào)控將取決于疾病以及治療或降低疾病嚴(yán)重程度所預(yù)期的細(xì)胞凋亡進(jìn)展程度。可通過調(diào)節(jié)用于除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的特定試劑、調(diào)配物或計(jì)量方案來實(shí)現(xiàn)調(diào)控?；诒疚乃峁┑闹笇?dǎo)說明，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將可根據(jù)所治療特定疾病嚴(yán)重程度的習(xí)知指征來調(diào)控功效。關(guān)于本文所述的或者已知以細(xì)胞凋亡量呈病理降低為特征的各種疾病指征的闡述，參見(例如)The Merck Manual(Sixteenth Ed，(Berkow，R.，Editor)Rahway，N.J.，1992)。
下列實(shí)例意欲舉例說明本發(fā)明而非對其加以限制。
實(shí)例I 從六肽庫中鑒別一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑 該實(shí)例闡述了一IAP去阻遏分析法。該實(shí)例進(jìn)一步闡述了一種鑒別各種可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑的位置掃描法。
由六肽的120種混合物組成的DCR390庫是使用諸如頒予R.Houghten等人的PCT/US9I/08694和美國專利第5,556,762號中所述的此項(xiàng)技術(shù)中已知的方法合成的。每一混合物均由一群六肽組成，其中所有六肽在一規(guī)定位置上均具有相同的氨基酸且在剩余的5個(gè)位置上具有20種基本氨基酸的任一組合。每一混合物均以該規(guī)定氨基酸所在的位置編號(自該六肽的胺基端至羧基端依次為1至6)及該規(guī)定氨基酸的標(biāo)識符進(jìn)行標(biāo)記。因此，如表I的第一列所示，位置I處具有一色氨酸且在位置2至5具有20種基本氨基酸的任一組合的混合物標(biāo)記為“位置1，W”。
用下述分析法篩選DCR390庫。根據(jù)從DCR390庫中鑒別出的可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的混合物，將另外的規(guī)定位置納入TPI1239及TPI1328子庫中，使用相同的分析法篩選該些子庫。
使用一Molecular Devices Spectromax 340并通過釋放Ac-DEVD-AFC合成肽的7-胺基-4-三氟甲基-香豆素(AFC)來分析卡斯蛋白酶活性(參見Zhou等人，J.Biol.Chem.2727797-7800(1997))。通過在存在及不存在候選試劑的情況下測量含有經(jīng)純化的重組卡斯蛋白酶-3、Ac-DEVD-AFC及GST-XIAP的混合物的AFC水解速率來鑒別候選混合物除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的能力。計(jì)算出在存在及不存在候選混合物情況下Ac-DEVD-AFC的水解Vmax比率，并將該比率用于鑒別那些含有一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的混合物。該比率＝(存在候選混合物、卡斯蛋白酶3及XIAP時(shí)的Vmax)/(存在卡斯蛋白酶3及XIAP時(shí)的Vmax)。
如下所述，使用上述分析法將每一混合物從DCR390、TPI1239或TPI1328中篩選出來。將每一混合物都均分為25μl的量并一式兩份加至一96孔微量滴定板的加樣孔中。在第一組加樣孔中添加25μl卡斯蛋白酶分析緩沖液(50mM HEPES，pH 7.4，100mM NaCl，10％蔗糖、10mM DTT、1mM EDTA及0.1％CHAPS)，在第二組加樣孔中加入25μl 40nM XIAP溶于卡斯蛋白酶分析緩沖液中的母液。每一微量滴定板還具有下列對照組(1)一緩沖液空白加樣孔，其中添加有25μl卡斯蛋白酶分析緩沖液及25μl肽載體溶劑，(2)一XIAP對照加樣孔，其中添加有25μl肽載體溶劑及25微米40nM XIAP溶于卡斯蛋白酶分析緩沖液中的母液，及(3)一SMAC對照加樣孔，其中添加有25μl 40nM XIAP溶于卡斯蛋白酶分析緩沖液中的母液以及2.5μl 4mM SMAC肽(H-Ala-Val-Pro-Ile-Ala-Gln-Lys-NH2，SEQ ID NO5)。向各試樣的加樣孔及對照加樣孔中添加25μl 0.64nM卡斯蛋白酶-3溶液，隨后添加25μl 0.4mMAc-DEVD-AFC底物。以30秒的間隔迅速檢測各加樣孔所釋放的AFC的熒光，該檢測持續(xù)30分鐘。使用softmax軟件包測量各加樣孔中Ac-DEVD-AFC水解的Vmax。
DCR390庫的篩選結(jié)果列于表I中。若干在同一位置上分別固著有不同氨基酸的混合物組排列在以位置編號標(biāo)識的6個(gè)部分中。該6個(gè)部分的每一個(gè)均分為3列，其顯示(1)固定氨基酸的標(biāo)識符，(2)存在候選混合物、卡斯蛋白酶3及XIAP時(shí)的反應(yīng)表觀速度，及(3)當(dāng)存在候選混合物及卡斯蛋白酶3時(shí)的反應(yīng)表觀速度。各部分中還顯示有XIAP對照反應(yīng)的結(jié)果。每一部分中的各混合物根據(jù)第二列中的表觀速度按降序排列。與XIAP對照反應(yīng)相比，那些具有明顯較更的表觀速度的混合物列于橫線以上，藉此標(biāo)記為含有一可除去一XIAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑。 表IDCR 390 基于DCR390篩選結(jié)果，合成并使用上述卡斯蛋白酶分析法篩選TPI1239庫。具體而言，將混合物合成為其位置5及6處規(guī)定為色氨酸，位置3及/或4處規(guī)定為不同的氨基酸，且剩余位置隨機(jī)從20種基本氨基酸中選擇，如表II中所列。所表II中所示，在不存在XIAP的情況下，該混合物對卡斯蛋白酶的影響并不明顯。在存在XIAP的情況下具有1.9或更高比率的混合物被鑒別為含有一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑。
表IITPI 1239 可對從TPI1239庫中鑒別出的含有一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的混合物進(jìn)一步進(jìn)行劑量反應(yīng)分析。圖11中提供了該劑量反應(yīng)資料，其顯示該些混合物對卡斯蛋白酶活性無影響。已發(fā)現(xiàn)活性最強(qiáng)的混合物在位置4處具有丙氨酸、賴氨酸或蘇氨酸，在位置5及6處具有色氨酸且在位置1至3處具有混合體。
基于DCR390及TPI1239庫的篩選結(jié)果，合成并使用上述卡斯蛋白酶分析法篩選TPI1328。對于TPI1328庫中的每一混合物而言，規(guī)定位置3至4，剩余位置用所有的20種基本氨基酸組合，這20種基本氨基酸包括Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Cys或Tyr。用Ala、Lys或Ala、Lys和Thr的一混合體(該混合體稱為“3X”或“A，K，T”)界定位置4。
圖1中標(biāo)繪有經(jīng)篩選的各種TPI1328子庫及在存在及不存在每一混合物情況下獲得的Ac-DEVD-AFC水解Vmax的比值。在圖1及表III中，“X”代表所有20種基本氨基酸的一混合體且“0”代表所規(guī)定位置的定位，規(guī)定位置處的氨基酸標(biāo)識符標(biāo)在X軸上。比率大于1.7的候選試劑被鑒別為XIAP抑制卡斯蛋白酶-3去阻遏劑。表III中列出了從TPI1328庫中鑒別出的XIAP抑制卡斯蛋白酶-3去阻遏劑。
表III 實(shí)例II 從TPI1332及TPI1352個(gè)體四肽庫中鑒別一IAP抑制卡斯蛋白酶的去阻遏劑 該實(shí)例闡述了鑒別TPI1332及TPI1352四肽庫中的一XIAP抑制卡斯蛋白酶-3去阻遏劑的方法。
TPI1332及TPI1352四肽以相同的方法合成，其不同之處在于色氨酸上的甲?；Ｗo(hù)基團(tuán)以不同的方法除去。TPI1332庫所用的去保護(hù)步驟不太完整，這可能會使該篩選中所用候選化合物中所含的某些色氨酸殘基保留有甲酰基保護(hù)基團(tuán)。TPI1352庫所用的去保護(hù)化學(xué)法基本完整，然而會使該庫中的一物質(zhì)亞組形成聚合結(jié)構(gòu)。
使用實(shí)例I中所述去阻遏分析法篩選TPI1332及TPI1352中的候選試劑。在存在及不存在TPI1332及TPI1352庫中每一物質(zhì)的情況下測定Ac-DEVD-AFC的水解Vmax比率，那些具有大于2.4的值的被鑒別為一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑。
表IV中列出了從TPI1332及TPI1352庫中鑒別出的XIAP抑制卡斯蛋白酶-3去阻遏劑。在兩個(gè)庫中鑒別出的試劑以“1332/1352”表示。
表IV 實(shí)例III 從TPI792庫中鑒別一IAP抑制卡斯蛋白酶的個(gè)體肽去阻遏劑 該實(shí)例闡述了鑒別TPI792庫中一XIAP抑制卡斯蛋白酶-3去阻遏劑的方法。
TPI792庫基于一四肽主鏈。在實(shí)例1中所述去阻遏分析中篩選TPI792庫的物質(zhì)。表V中列出了從TPI792庫中鑒別出的XIAP抑制卡斯蛋白酶-3去阻遏劑。所檢測的TPI792核心肽的結(jié)構(gòu)在圖20中示出。表V 通過使用各種濃度的試劑重復(fù)進(jìn)行去阻遏分析來確定從TPI792庫中鑒別出的試劑的劑量反應(yīng)。選擇使用4種濃度0.4、2、10及50μg/ml。根據(jù)該資料在去阻劑分析中測定出比率為2或更高的最低濃度(LC)并將其列于表V中。對于TPI792-33，從TPI792庫中測定的最低LC值為0.4μg/ml。實(shí)例IV 從TPI1313庫中鑒別一IAP抑制卡斯蛋白酶的去阻遏劑 該實(shí)例闡述了鑒別TPI1313庫中一XIAP抑制卡斯蛋白酶-3去阻遏劑的方法。
TPI1313庫基于一四肽主鏈。圖2及圖3分別列出并顯示了TPI1313庫的物質(zhì)，其使用實(shí)例I中所述去阻遏分析法篩選。表VI中列出了從TPI1313庫中鑒別出的XIAP抑制卡斯蛋白酶-3去阻遏劑。
表VI 通過使用各種濃度的試劑重復(fù)進(jìn)行去阻遏分析來測定從TPI1313庫中鑒別出的試劑的劑量反應(yīng)。選擇使用4種濃度0.4、2、10及50μg/ml。由該資料測定表觀IC50。從TPI1313庫中測定的最低IC50值介于3.9至6.3μg/ml TPI1313-7。 實(shí)例V 從TPI1325庫中鑒別一IAP抑制卡斯蛋白酶的去阻遏劑 該實(shí)例闡述了鑒別TPI1325庫中一XIAP抑制卡斯蛋白酶-3去阻遏劑的方法。
用實(shí)例I所述去阻遏分析法篩選TPI1325庫。對于每一種在分析中被均分的物質(zhì)，固定其中的1個(gè)位置并組合另外3個(gè)位置。因此，從TPI 1325庫中鑒別出的每一“混合物”均代表若干化合物的一混合物，在該些化合物中，X1及X2選自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr，X3包括Ala、Lys及Thr中的任一個(gè)。
表VII中列出了從TPI1325庫中鑒別出的XIAP抑制卡斯蛋白酶-3去阻遏劑。
表VII 通過使用各種濃度的試劑重復(fù)進(jìn)行去阻遏分析來測定從TPI1325庫中鑒別出的試劑的劑量反應(yīng)。選擇使用4種濃度0.4、2、10及50μg/ml。由該資料測定表觀IC50。對于TPI1325-15，從TPI1325庫中測定的最低IC50為12μg/ml。
實(shí)例VI 從TPI914、TPI927、TPI759及TPI882庫中鑒別一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑 該實(shí)例闡述了從基于非肽的庫中鑒別一XIAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的方法。
使用位置掃描(如美國專利第5,556,762號所述)并結(jié)合實(shí)例I中所述去阻遏分析法篩選TPI914、TPI927、TPI759及TPI882庫。
分析首先從其中已界定至少一個(gè)位置的組合庫開始進(jìn)行。所鑒別標(biāo)的為那些所產(chǎn)生的混合物/XIAP比大于或等于2的混合物。在對第一個(gè)庫進(jìn)行分析后，篩選界定位置增加的庫，直到制作出一其中所有的位置均界定的離散庫。然后檢查由該界定庫所得標(biāo)的的劑量反應(yīng)，其產(chǎn)生下文所列IC50值。
對于種類為125,000的總多樣性，TPI914N-?；穾煸谖恢肦1處包括50種氨基酸R基團(tuán)、在位置R2處包括50種氨基酸R基團(tuán)及位置R3處包括50種酸衍生物。在一個(gè)R位置處具有一規(guī)定官能團(tuán)并在去阻遏分析中通過對TPI914庫的位置掃描而鑒別為具有一大于或等于約1.8的肽/XIAP比率(當(dāng)存在濃度為25μg/ml時(shí))的混合物經(jīng)鑒別后列示在圖4中。在去阻遏分析中具有一大于或等于約1.8的肽/XIAP比率(當(dāng)存在濃度為6.25μg/ml或12.5μg/ml時(shí))的對照試劑經(jīng)鑒別后列示在圖5中。
對于種類為89,856的總多樣性，TPI927多苯基脲庫在位置R1處包括48種氨基酸R基團(tuán)、在位置R2處包括48種氨基酸R基團(tuán)及在位置R3處包括39種酸衍生物。在一個(gè)R位置處具有一規(guī)定官能團(tuán)并在去阻遏分析中通過對TPI927庫的位置掃描而鑒別為具有一大于或等于約1.8的肽/XIAP比率(當(dāng)存在濃度為4μg/ml時(shí))的混合物經(jīng)鑒別后列示在圖6中。在去阻遏分析中具有一大于或等于約1.8的肽/XIAP比率(當(dāng)存在濃度為25μg/ml時(shí))的對照試劑經(jīng)鑒別后列示在圖9中。
對于種類為31,320的總多樣性，TPI759N-芐基-1，4，5-三取代-2，3-二酮基呱嗪庫在位置R1處包括29種氨基酸R基團(tuán)、在位置R2處包括27種氨基酸R基團(tuán)及在位置R3處包括50種酸衍生物。在一個(gè)R位置處具有一規(guī)定官能團(tuán)并在去阻遏分析中通過對TPI759庫的位置掃描而鑒別為具有一大于或等于約1.8的肽/XIAP比率(或如果是R3固定的子庫，則比率為1.9或更大)(當(dāng)存在濃度為25μg/ml時(shí))的混合物經(jīng)鑒別后列示在圖8中。
對于種類為72,283的總多樣性，TPI882C-6-酰胺基雙環(huán)胍?guī)煸谖恢肦1處包括43種氨基酸R基團(tuán)、在位置R2處包括41種酸衍生物及在位置R3處包括41種酸衍生物。在一個(gè)R位置處具有一規(guī)定官能團(tuán)并在去阻遏分析中通過對TPI882庫的位置掃描而鑒別為具有一大于或等于約1.9的肽/XIAP比率(當(dāng)存在濃度為5μg/ml時(shí))的混合物經(jīng)鑒別后列示在圖7中。在去阻遏分析中具有一大于或等于約2.0的肽/XIAP比率(當(dāng)存在濃度為8μg/ml時(shí))的對照試劑經(jīng)鑒別后列示在圖10中。實(shí)例VII SMAC競爭分析 該實(shí)例闡述一用于測定一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑對一IAP或其功能片段的結(jié)合親和力的分析法。
使用一基于偏光的分析法檢測用羅丹明(rhodamine)標(biāo)記的SMAC(羅丹明-SMAC)與XIAP片段BIR2或BIR3RING之間的結(jié)合。該分析法基于當(dāng)羅丹明-SMAC與XIAP或其功能片段相結(jié)合時(shí)其遷移率降低，該降低可檢測為經(jīng)結(jié)合的羅丹明-SMAC的偏光度比游離(未結(jié)合)羅丹明-SMAC的偏光度降低。
按下列程序檢測羅丹明-SMAC對一谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶-BIR2融合蛋白(GST-BIR2)的結(jié)合親合力。配制1ml包括100mM NaPO4、0.01％牛的γ球蛋白及20nM羅丹明-SMAC的反應(yīng)混合劑。從該反應(yīng)混合劑中取出若干0.1ml的等分試樣并將其放入一96孔分析滴定板管柱的8個(gè)加樣孔中。裝備12個(gè)這樣的管柱，每一個(gè)管柱中的GST-BIR2的濃度均不同，其介于0至495nM之間。在一530nm激發(fā)波長及580nm發(fā)射波長的LJL Analyst HT中讀取每一個(gè)加樣孔中羅丹明的偏光度。求取具有相同的GST-BIR2濃度的8份試樣的平均數(shù)據(jù)，然后將其標(biāo)繪為毫偏光-GST-BIR2濃度曲線的一函數(shù)。隨后對BIR3RING實(shí)施相同的程序。20nM的羅丹明-SMAC對GST-BIR2的Kd為100nM且對BIR3RING的Kd為80nM。
使用該偏光分析鑒別能夠與SMAC競爭結(jié)合至XIAP的試劑。
對照一含有20nM羅丹明-SMAC及225nM GST-BIR2的溶液來滴定未經(jīng)標(biāo)記的SMAC。以4μM的增量在介于0至20μM的范圍內(nèi)滴定未經(jīng)標(biāo)記的SMAC。對于未標(biāo)記的SMAC的每一濃度，再次計(jì)算8份0.1ml試樣，藉此可測定一標(biāo)準(zhǔn)誤差。將數(shù)據(jù)標(biāo)繪為毫偏光-SMAC的一函數(shù)并測定IC50。SMAC滴定的IC50值為12μM。采用相同的程序?qū)φ找缓琒MAC及BIR3RING的溶液來滴定未經(jīng)標(biāo)記的SMAC。在此情況下，SMAC的IC50值為8μM。
將一庫的候選試劑添加至含有20nM羅丹明-SMAC及225nM GST-BIR2的溶液中。測定每一試樣的熒光偏光度，與一含有20nM羅丹明-SMAC及225nM GST-BIR2的對照反應(yīng)液相比，那些偏光度降低的候選試劑被鑒別為一IAP抑制卡斯蛋白酶的去阻遏劑。作為對照，還在不含GST-BIR2的情況下對庫試樣的熒光偏光度進(jìn)行了測定。
對照一羅丹明-SMAC及GST-BIR2的溶液來滴定一鑒別為一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的試劑。如上所述，測定該試劑每一濃度的偏光度。另外，如上所述，將所得資料標(biāo)繪為毫偏光—SMAC的一函數(shù)并測定結(jié)合常數(shù)。實(shí)例VIII 從TPI914、TPI927、TPI759及TPI882庫中篩選個(gè)體化合物 該實(shí)例闡述了從TPI914、TPI927、TPI759及TPI882庫中篩選個(gè)體試劑的方法以及鑒別可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的個(gè)體試劑的方法。
根據(jù)實(shí)例VI中所識別的活性試性合成個(gè)體試劑。對根據(jù)圖5所示TPI914去阻遏劑選出的試劑進(jìn)行合成并將其標(biāo)識為圖21中的試劑TPI1349-1至TPI1349-34。對根據(jù)圖9所示TPI927去阻遏劑選出的試劑進(jìn)行合成并將其標(biāo)識為圖22中的試劑TPI1396-1至TPI1396-65。根據(jù)圖8所示TPI759去阻遏劑選出的試劑進(jìn)行合成并將其標(biāo)識為圖23中的試劑TPI1391-1至TPI1391-36。對根據(jù)圖10所示TPI882去阻遏劑選擇的試劑進(jìn)行合成并將其標(biāo)識為圖24中的試劑TPI1400-1至TPI1400-58。
使用SMAC競爭分析對圖21至24中所示試劑進(jìn)行評價(jià)。在實(shí)例VII所述條件下，對照經(jīng)羅丹明標(biāo)記的SMAC四肽、AVPI(SEQ ID NO4)及全長XIAP的溶液來滴定每一化合物。測定IAP拮抗劑每一濃度下的偏光度，將所得資料標(biāo)繪為毫偏光—化合物濃度的一函數(shù)。每一種具有一1.8或更高比率(從標(biāo)繪圖中測得)的試劑的最低濃度列示于圖21至24中各表的最后一列中([最低]μg/ml)。實(shí)例IX肽基及非肽基化合物在活體外恢復(fù)IAP抑制卡斯蛋白酶的卡斯蛋白酶活性 該實(shí)例闡述了一種用于測定肽基及非肽基IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑在活體外的功效的分析法。該實(shí)例還鑒別了在活體外具有恢復(fù)IAP抑制卡斯蛋白酶的卡斯蛋白酶活性功效的肽基及非肽基化合物。
使用SMAC競爭分析來評價(jià)通過篩選TPI792庫鑒別出的肽基IAP拮抗劑及通過篩選TPI1391和TPI1396庫鑒別出的非肽基IAP拮抗劑。在實(shí)例VII所述條件下，對照一經(jīng)羅丹明標(biāo)記的SMAC四肽、AVPI(SEQ ID NO4)及全長XIAP的溶液來滴定每一化合物。測定IAP拮抗劑每一濃度下的偏光度并將其標(biāo)繪為毫偏光—化合物濃度的一函數(shù)。根據(jù)該些標(biāo)繪圖測定出EC50結(jié)合常數(shù)。作為對照，還對未經(jīng)標(biāo)記的SMAC四肽、AVPI(SEQ ID NO4)進(jìn)行了分析。
表VIII概述了從TPI792、TPI1391及TPI1396庫鑒別出的IAP拮抗劑的SMAC競爭分析結(jié)果。EC50的測定是通過計(jì)算卡斯蛋白酶-3的活性恢復(fù)至最大速率(Vmax)的50％所需的化合物量而實(shí)現(xiàn)的。兩種最有效的四聚體肽為TPI792-33及TPI792-35，其在活體外所展示出的酶去阻遏活性分別是SMAC肽的5.2和2.5倍?；谧钣行У亩舌旱幕衔锇═PI391-21、TPI391-28及TPI1391-34，其所展示出的功效是SMAC肽的3.4至4.8倍。最有效的苯基脲化合物包括TPI1396-22、TPI1396-34及TPI1396-28，其展示出的功效是SMAC肽的3.8至5.2倍。表VIII 這些結(jié)果表明，肽基化合物TPI792-33和TPI792-35、二酮基呱嗪基化合物TPI1391-21、TPI1391-28和TPI1391-34及苯基脲化合物TPI1396-22、TPI1396-34及TPI1396-28均可在活體外除去XIAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏，且其功效要強(qiáng)于SMAC AVPI四肽(SEQ ID NO4)。
實(shí)例X 肽基化合物TPI792-33和TPI792-35殺死腫瘤細(xì)胞 該實(shí)例闡述了一種用于測定IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑在細(xì)胞培養(yǎng)基中功效的分析法。該實(shí)例亦展示，TPI792-33和TPI792-35可降低培養(yǎng)基中腫瘤細(xì)胞的存活率。
對TPI792-33及TPI792-35進(jìn)行了分析，以測定其對腫瘤細(xì)胞存活率的影響。如圖12中所示，TPI792-33及TPI792-35由氨基酸序列在第三個(gè)位置處相異的非天然氨基酸組成。TPI792-33及TPI792-35化合物在位置1(N端)、2及4處均分別具有L-3-(2-噻吩基)-丙氨酰基、L-(2-萘基)-丙氨?；癓-(ε-笏基甲氧基羰基)-賴氨酸部分，但在位置3處不同，其中TPI792-33具有一L-對氯代苯基丙氨?；鳷PI792-35具有一D-(ε-笏基甲氧基羰基)-賴氨?；糠帧?br> 前列腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞ALVA31表達(dá)XIAP以及其它IAP家族蛋白質(zhì)。按下列程序測定TPI792-33或TPI792-35單獨(dú)使用或聯(lián)合細(xì)胞毒性抗癌藥物VP-16(吡喃葡糖苷)使用時(shí)在除去XIAP抑制卡斯蛋白酶阻遏及ALVA31細(xì)胞存活率方面的活體內(nèi)效果。將ALVA31前列腺癌細(xì)胞種到96孔板(104細(xì)胞/加樣孔)上的100μl含有2.5％胎牛血清(FBS)的RPMI中。24小時(shí)后，將IAP拮抗劑TPI792-33、TPI792-35或SMAC AVPI四肽(SEQ ID NO4)添加至最終濃度為40μM，同時(shí)可不添加或添加VP-16(最終濃度為100μM)。再培養(yǎng)24小時(shí)后，通過XTT染料還原分析法(Roche，Molecular Biochemicals；Indianapolis，Ind.)及錐蟲藍(lán)染料排除分析法測量細(xì)胞存活率。
在XTTXTT染料還原分析(圖13)及錐蟲藍(lán)染料排除分析中，當(dāng)抗癌藥物VP-16(吡喃葡糖苷)單獨(dú)投予至ALVA31細(xì)胞時(shí)對細(xì)胞存活率基本無影響。當(dāng)SMAC AVPI四肽(SEQ ID NO4)單獨(dú)投予至ALVA31細(xì)胞時(shí)對細(xì)胞存活率亦無影響。相反，TPI792-33及TPI792-35肽可使這些前列腺癌細(xì)胞的存活率幾乎降低一半。并且，與單獨(dú)使用VP-16相比，VI-16與這些肽一起使用可更有效地殺死腫瘤細(xì)胞。通過比較可發(fā)現(xiàn)，在相同的培養(yǎng)條件下SMAC肽無活性，不能顯著降低活腫瘤細(xì)胞的相對數(shù)量。
這些結(jié)果表明，與來自SMAC的野生型AVPI(SEQ ID NO4)相比，TPI792-33及TPI792-35均展示出明顯增強(qiáng)的細(xì)胞活性。此外，這些結(jié)果表明，TPI792-33及TPI792-35均可通過除去IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果還表明，TPI792-33及TPI792-35均可使前列腺癌細(xì)胞對抗癌藥劑VP-16變得敏感。實(shí)例XI非肽基化合物TPI1396-34及TPI1396-28殺死腫瘤細(xì)胞 該實(shí)例展示，從TPI1396庫中鑒別出的苯基脲化合物及從TPI1391庫鑒別出的二酮基呱嗪化合物可降低培養(yǎng)基中腫瘤細(xì)胞的存活率。該實(shí)例進(jìn)一步展示，TPI1396-34及TPI1391-28細(xì)胞殺傷活性對腫瘤細(xì)胞具有特異性。
使用下列分析法測試來自PTI1396及TPI1391庫的個(gè)體化合物誘導(dǎo)培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系發(fā)生細(xì)胞凋亡的能力。將表IX中所列的每一化合物以不同的濃度單獨(dú)加至RPMI(含有2.5％的FBS)中的居卡白血病細(xì)胞(6.25×105細(xì)胞/ml)內(nèi)并培養(yǎng)20小時(shí)。經(jīng)培養(yǎng)后，洗滌細(xì)胞并與偶聯(lián)有FITC的Annexin V抗體及碘化丙錠(propidium iodide)(Biovision；MountainView，CA)染色。將細(xì)胞在室溫下在暗處培養(yǎng)20分鐘并用流式細(xì)胞儀(FACScan，Immunocytometry system；Becton-Dickinson；Son Jose，CA)測量熒光。相對于Annexin V呈正染色的細(xì)胞被認(rèn)為非存活。
如表IX中所示，這些化合物可以濃度依賴方式誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。盡管當(dāng)SMAC的濃度為50μM時(shí)可將細(xì)胞存活率降低約16％，但數(shù)種PTI1396-34及TPI1391-28化合物可將細(xì)胞存活率降低約85至94％。因此，從TPI1396-34及TPI1391-28庫中鑒別出的化合物在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面的功效要比SMAC強(qiáng)5至6倍。
表IX 如下所述，對TPI1396-34及TPI1391-28化合物進(jìn)一步檢測。圖14(B組)顯示了苯基脲TPI1396-34及二酮基呱嗪TPI1391-28的結(jié)構(gòu)。通過上述分析法顯示，這兩類化合物均可以濃度依賴方式誘導(dǎo)培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系發(fā)生細(xì)胞凋亡，不同之處在于所加化合物的濃度介于0至20μM。
如圖15中所示，TPI1396-34及TPI1391-28在與居卡白血病細(xì)胞接觸一天后以約6.5μM的EC50值殺死居卡白血病細(xì)胞。具有相同核心藥效團(tuán)結(jié)構(gòu)但在R基團(tuán)處具有不同取代基(其可阻止與XIAP結(jié)合)的對照化合物在分析條件下不能顯著降低居卡白血病細(xì)胞的存活率。
TPI1396-34及TPI1391-28與相應(yīng)的對照化合物之間的細(xì)胞殺傷性比較顯示于圖16中。用5μM或8μM的TPI1396-34處理居卡白血病細(xì)胞一天可分別殺死約75％及85％的細(xì)胞。用5μM或8μM的TPI1391-28處理居卡白血病細(xì)胞一天可分別殺死約45％及80％的細(xì)胞。相反，與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，對照化合物對這些白血病細(xì)胞的存活率無顯著影響，這表明該些化合物的細(xì)胞毒性具有特異性。在相同的分析條件下，5或8μM的SMAC AVPI四肽(SEQID NO4)對這些白血病細(xì)胞的存活率無顯著影響，證實(shí)了TPI1396-34及TPI1391-28的功效遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于SMAC。
按照下列程序比較了TPI1396-34對骨髓細(xì)胞與居卡白血病細(xì)胞的效果。將TPI1396-34(5μM)與居卡細(xì)胞或正常骨髓單核細(xì)胞(6.25×105ml)一起在RPMI及2.5％FBS中培養(yǎng)20小時(shí)，經(jīng)培養(yǎng)后，洗滌細(xì)胞并用偶聯(lián)有FITC的Annexin V抗體及碘化丙錠染色，然后如上所述，使用流式細(xì)胞儀測量熒光。
如圖17中所示，在相同的培養(yǎng)條件下，TPI1396-34及TPI1391-28對正常骨髓細(xì)胞的毒性較小，但可觀察到其對白血病細(xì)胞的殺傷力極強(qiáng)。這些結(jié)果表明，與正常細(xì)胞相比，TPI1396-34及TPI1391-28可有選擇性地殺死腫瘤細(xì)胞。
實(shí)例XII TPI1396-34對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用通過XIAP介導(dǎo) 該實(shí)例闡述了超表達(dá)野生型及突變型XIAP對TPI1396-34的腫瘤細(xì)胞殺傷力的影響。
使用置于RPMI及2.5％FBS中的5或8μM TPI11396-34對已用一Neo-對照質(zhì)粒(U937-Neo細(xì)胞)或一質(zhì)粒編碼XIAP(U937-XIAP細(xì)胞)永久轉(zhuǎn)染的U937白血病細(xì)胞(6.25×105細(xì)胞/ml)進(jìn)行20小時(shí)處理。經(jīng)培養(yǎng)后，洗滌細(xì)胞并用偶聯(lián)有FITC的Annexin V抗體及碘化丙錠染色，然后如實(shí)例X中所述，使用流式細(xì)胞儀測量熒光。
如圖18中所示，XIAP的超表達(dá)使U937細(xì)胞對TPI1396-34具有抗性。TPI1396-34對U937-Neo與U937-XIAP的效果的比較表明，XIAP的超表達(dá)與由該試劑引發(fā)的對細(xì)胞凋亡的抗性相關(guān)。當(dāng)腫瘤細(xì)胞超表達(dá)XIAP時(shí)，該些細(xì)胞對TPI1396-34的促細(xì)胞凋亡作用的抵抗性增強(qiáng)，這表明TPI1396-34可通過與XIAP結(jié)合引發(fā)細(xì)胞凋亡。
與載體轉(zhuǎn)染對照細(xì)胞相比，XIAP在U937-XIAP細(xì)胞中的超表達(dá)通過免疫印跡確認(rèn)(右上組)。XIAP在K562細(xì)胞中的表達(dá)作為一對照被包括在內(nèi)，其原因是已知這些細(xì)胞可內(nèi)源性地表達(dá)XIAP。使等量的蛋白質(zhì)經(jīng)受SDS-PAGE(4-20％梯度凝膠，ISC BioExpress，Kaysville，UT)，隨后將其轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。用單拷貝小鼠抗人XIAP(0.25μg/ml)(TransductionLaboratories，Lexington，KV)或單拷貝小鼠抗β肌動蛋白(1∶3000v/v)(Sigma公司，Milwaukee，WI)探查硝化纖維素膜。二級抗體由偶聯(lián)有辣根過氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠IgG(Bio-Rad，Hercules，CA)組成。通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光法(ECL)實(shí)施檢測。
除使用全長XIAP轉(zhuǎn)染細(xì)胞外，還可使用HeLa細(xì)胞實(shí)施類似的分析，該些HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染有超表達(dá)多種XIAP突變株的質(zhì)粒?？墒褂孟铝匈|(zhì)粒短暫轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞其對全長野生型XIAP及各僅具有BIR2(遏制卡斯蛋白酶-3/7)結(jié)構(gòu)域、BIR3(遏制卡斯蛋白酶-9)結(jié)構(gòu)域的缺失突變株或一其中BIR2及BIR3中推定的SMAC結(jié)合袋均突變?yōu)椴辉俳Y(jié)合卡斯蛋白酶的突變株進(jìn)行編碼。該突變體是通過定點(diǎn)誘變來對位置148、219、223、314及323進(jìn)行修飾以使之含有丙氨酸而產(chǎn)生的。HeLa細(xì)胞亦可使用編碼Bcl-XL的質(zhì)粒進(jìn)行短暫轉(zhuǎn)染，Bcl-XL為一可在卡斯蛋白酶上游起作用來遏制線粒體釋放細(xì)胞色素C的抗細(xì)胞凋亡蛋白。將HeLa細(xì)胞(2.5×105)種入六個(gè)孔板上的2ml含有5％FBS的DMEM H21中。24小時(shí)后，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(珀特(Porter)基因)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，細(xì)胞用5μM的TPI1396-34處理20小時(shí)。然后，自培養(yǎng)基中回收漂浮的及附著的細(xì)胞，洗滌，并使用流式細(xì)胞儀通過Annexin V染色測定細(xì)胞凋亡。
如圖19中所示，TPI396-34在一使用對照載體轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中引發(fā)細(xì)胞凋亡。超表達(dá)Bcl-XL不能阻止由TPI1396-34引發(fā)的細(xì)胞凋亡，這與Bcl-XL在XIAP上游起作用這一事實(shí)一致。相反，超表達(dá)全長XIAP的HeLa細(xì)胞不受TPI1396-34的影響。另外，表達(dá)XIAP的一其中XIAP的SMAC結(jié)合袋發(fā)生突變的突變株的細(xì)胞受TPI1396-34的影響，表達(dá)一僅由BIR2結(jié)構(gòu)域組成的突變株的細(xì)胞亦受TPI1396-34的影響。表達(dá)BIR3結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞不受TPI1396-34的促細(xì)胞凋亡活性的影響。概言之，這些結(jié)果表明，TPI1396-34通過靶向XIAP引發(fā)培養(yǎng)基中腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡。
實(shí)例XIII 鑒別可抑制除XIAP之外的IAP的化合物 該實(shí)例闡述了一種可用于測定XIAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑對其他IAP的作用的分析法。
對前列腺癌的免疫組織化學(xué)分析表明，cIAP1及cIAP2在這些腫瘤中通常受到超表達(dá)。cIAP1及cIAP2均為卡斯蛋白酶抑制劑(Roy，EMBO J.166914-6925(1997))，其均結(jié)合SMAC(Du等人，Cell 10233-42(2000)；Chai等人，Nature 406855-862(2000))。并且，分子模擬研究表明，cIAP1及cIAP2的某些BIR可能結(jié)合SMAC，與XIAP具有極大的結(jié)構(gòu)類似性。這些觀察結(jié)果表明，XIAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑具有活性，能對抗受該些其它IAP抑制的卡斯蛋白酶。
為進(jìn)一步證實(shí)XIAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑具有對抗受該些不同IAP抑制的卡斯蛋白酶的活性，實(shí)施下列分析。分析該些化合物與SMAC肽在結(jié)合至XIAP上的BIR的競爭情況。為實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，在SMAC競爭分析中測試該些化合物，其中偶聯(lián)有FITC的SMAC四肽AVPI(SEQID NO4)或偶聯(lián)有FITC的HtrA2四肽AVPS(SEQ ID NO6)與XIAP的BIR結(jié)合。僅含有BIR2或BIR3結(jié)構(gòu)域的XIAP片段受到表達(dá)，而全長XIAP并未得到表達(dá)，如Takahashi等人在J.Biol.Chem(2737787-7790(1998))及Deveraux等人在EMBO J.(172215-2223(1998))中所述。該些分析將決定該化合物的功能是否酷似SMAC，以及該化合物是否靶向BIR2(抑制卡斯蛋白酶-3及卡斯蛋白酶-7的結(jié)構(gòu)域)、BIR3(抑制卡斯蛋白酶-9的結(jié)構(gòu)域)、既靶向BIR2也靶向BIR3，或既不靶向BIR2也不靶向BIR3。
另外，使用BIR2或BIR3結(jié)構(gòu)域進(jìn)行酶去阻遏分析，以在XIAP中找出一化合物所靶向的結(jié)構(gòu)域。將經(jīng)純化的重組BIR2與卡斯蛋白酶-3混合，BIR3與卡斯蛋白酶-9混合，然后在存在及不存在一化合物的情況下用特定熒光底物肽(卡斯蛋白酶-3使用Ac-DEVD-AFC，卡斯蛋白酶-9使用Ac-LEHD-AFC)測量這些蛋白酶的活性，以找出該化合物是否靶向XIAP蛋白中的BIR2、BIR3、既靶向BIR2又靶向BIR3或既不靶向BIR2也不靶向BIR3。
這些結(jié)果可用于通過對XIAP的已發(fā)表結(jié)構(gòu)BIR進(jìn)行分子模擬(Sun等人，Nature401818-821(1999)及Riedl等人，Cell 104791-800(2001))及BIR3(Liu等人，Nature4081004-1008(2000))來基于結(jié)構(gòu)對化合物進(jìn)行優(yōu)化。
對于cIAP1及cIAP2，使用全長cIAP1和cIAP2以及含有單個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域的片段進(jìn)行類似的去阻遏及SMAC競爭分析，藉此確定該些化合物是否交叉抑制IAP家族的這些另外的成員。
若一化合物確實(shí)可抑制cIAP1、cIAP2或同時(shí)抑制這兩種蛋白質(zhì)，則可通過藥物及組合化學(xué)法提高該化合物的功效。可進(jìn)行分析，以在基于細(xì)胞的分析中對cIAP1/cIAP2活性在活體外的保留—喪失與化合物的活性進(jìn)行比較。此類結(jié)構(gòu)活性關(guān)系研究可表明該最佳化合物是對XIAP具有選擇性特異性還是對數(shù)種IAP具有泛反應(yīng)性。將具有該些不同特性(選擇性活性相對于廣譜活性)的化合物就毒性等方面進(jìn)行對比，以獲得一中理想效能與安全性平衡的化合物。
本申請案中引用了許多專利公報(bào)。該些專利公報(bào)的整體揭示內(nèi)容以引用方式并入本申請案中，以便更全面地闡釋本發(fā)明所涉及領(lǐng)域的狀況。
盡管本文參照上述實(shí)例對本發(fā)明進(jìn)行了闡釋，但應(yīng)了解，可在不背離本發(fā)明精神的情況下對其進(jìn)行各種修改。因此，本發(fā)明僅受權(quán)利要求的限制。
序列表
<110>伯納姆研究院(The Burnham Institute)
托里派因斯分子學(xué)研究院(Torrey Pines Institute for Molecular Studies)
<120>用于對IAP抑制卡斯蛋白酶
進(jìn)行去阻遏的方法及組合物
<130>FP-LJ 5449
<140>PCT/US02/37577
<141>2002-11-21
<150>US 60/331,957
<151>2001-11-21
<160>5
<170>適用于微軟窗口4.0之FastSEQ
<210>1
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成構(gòu)筑體
<221>各種的
<222>4
<223>Xaa＝任何胺基酸
<400>1
Gln Ala Cys Xaa Gly
1 5
<210>2
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成構(gòu)筑體
<400>2
Asp Glu Val Asp
1
<210>3
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成構(gòu)筑體
<400>3
Tyr Val Ala Asp
1
<210>4
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成構(gòu)筑體
<400>4
Ala Val Pro Ile
1
<210>5
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成構(gòu)筑體
<221>酰胺化
<222>7
<223>在C端
<220>
<221>MOD_RES
<222>1
<223>在N端氫化
<400>5
Ala Val Pro Ile Ala Gln Lys
1 權(quán)利要求
1、一種分離試劑，其包含一選自如下所示的由核心肽5至39及42至55組成的組群中的核心肽，其中所述試劑可除去IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏
(L-Ala)-(L-Trp)-(L-Trp)-(L-ThiAla)(核心肽5)；
(L-Ala)-(L-Trp)-(L-Trp)-(L-pClPhe)(核心肽6)；
(L-Ala)-(D-Trp)-(L-Trp)-(L-ThiAla)(核心肽7)；
X1-X2-X3-X4(核心肽8)，其中X1為D-Nal或L-ThiAla；X2為Lys-εFmoc、D-pClPhe或L-Nal；X3為D-Nal、L-pClPhe或D-Lys(Fm)；且X4為Lys-εFmoc或D-pFPhe；
(D-Nal)-(Lys-εFmoc)-(L-pClPhe)-(Lys-εFmoc)(核心肽9)；
(D-Nal)-(D-pClPhe)-(L-pClPhe)-(Lys-εFmoc)(核心肽10)；
(D-Nal)-(L-Nal)-(L-pClPhe)-(Lys-εFmoc)(核心肽11)；
(D-Nal)-(L-Nal)-(D-Lys-εFmoc)-(Lys-εFmoc)(核心肽12)；
(L-ThiAla)-(Lys-εFmoc)-(D-Nal)-(Lys-εFmoc)(核心肽13)；
(L-ThiAla)-(Lys-εFmoc)-(L-pClPhe)-(pF-D-F)(核心肽14)；
(L-ThiAla)-(D-pClPhe)-(L-pClPhe)-(Lys-εFmoc)(核心肽15)；
(L-ThiAla)-(L-Nal)-(L-pClPhe)-(Lys-εFmoc)(核心肽16)；
(L-ThiAla)-(L-Nal)-(D-Lys-εFmoc)-(Lys-εFmoc)(核心肽17)；
A-X1-X2-X3(核心肽18)，其中X1為Met、Ser、Thr、Trp或ThiAla，且X2及X3選自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、D-Ala、D-Asp、D-Glu、D-Phe、D-His、D-Ile、D-Lys、D-Leu、D-Met、D-Asn、D-Pro、D-Gln、D-Arg、D-Ser、D-Thr、D-Val、D-Trp、D-Tyr、L-Nle、D-Nle、L-Cha、D-Cha、L-PyrAla、D-PyrAla、L-ThiAla、D-ThiAla、L-Tic、D-Tic，L-pClPhe、D-pClPhe、L-pIPhe、D-pIPhe、L-pNO2Phe、D-pNO2Phe、L-Nal、D-Nal、β-Ala、e-氨基己酸、L-Met[O2]、L-dehydPro或L-3I-Tyr；
X1-X2-(L-Trp)-(D-Trp)(核心肽19)，其中X1及X2選自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、D-Ala、D-Asp、D-Glu、D-Phe、D-His、D-Ile、D-Lys、D-Leu、D-Met、D-Asn、D-Pro、D-Gln、D-Arg、D-Ser、D-Thr、D-Val、D-Trp、D-Tyr、L-Nle、D-Nle、L-Cha、D-Cha、L-PyrAla、D-PyrAla、L-ThiAla、D-ThiAla、L-Tic、D-Tic、L-pClPhe、D-pClPhe、L-pIPhe、D-pIPhe、L-pNO2Phe、D-pNO2Phe、L-Nal、D-Nal、β-Ala、e-氨基己酸、L-Met[O2]、L-dehydPro或L-3I-Tyr；
X1-X2-L-X3-W-W(核心肽20)，
X1-X2-R-X3-W-W(核心肽21)，及
X1-X2-G-X3-W-W(核心肽22)，其中X1、及X2選自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Cys或Tyr且X3選自Ala、Lys、Ser或Thr；
X1-X2-X3-X4(核心肽23)，其中X1為L-Ala、L-Cha、L-Nal、D-Trp或D-Trp(CHO)；X2為D-Nal、D-Trp、D-Trp(CHO)、L-Trp、L-Trp(CHO)、D-Cha或D-ThiAla；X3為L-Trp、L-Trp(CHO)或D-Phe；及X4為L-Nal、D-Nal、D-Trp、D-Trp(CHO)、L-ThiAla、L-3I-Tyr或L-pClPhe；
(L-Ala)-(D-Nal)-(L-Trp)-(L-Nal)(核心肽24)；
(D-Trp)-(D-Trp)-(L-Trp)-(D-Nal)(核心肽25)；
(L-Cha)-(D-Nal)-(L-Trp)-(L-ThiAla)(核心肽26)；
(L-Ala)-(L-Trp)-(L-Trp)-(L-3I-Tyr)(核心肽27)；
(L-Ala)-(D-Trp)-(L-Trp)-(L-ThiAla)(核心肽28)；
(L-Cha)-(L-Trp)-(L-Trp)-(L-pClPhe)(核心肽29)；
(L-Ala)-(D-Trp)-(L-Trp)-(D-Trp)(核心肽30)；
(L-Ala)-(D-Trp)-(D-Phe)-(D-Trp)(核心肽31)；
(L Nal)-(D-Trp)-(D-Phe)-(D-Trp)(核心肽32)；
(L-Nal)-(D-Cha)-(L-Trp)-(D-Trp)(核心肽33)；
(L-Nal)-(D-ThiAla)-(D-Phe)-(D-Trp)(核心肽34)；
X1-X2-X3-X4(核心肽35)，其中X1為L-ThiAla或Phe；X2為D-pClPhe或D-OEt-Tyr；X3為D-Nal或D-OEt-Tyr；及X4為D-pClPhe或D-pNO2Phe；
(L-ThiAla)-(D-pClPhe)-(D-Nal)-(D-pClPhe)(核心肽36)；
(L-ThiAla)-(D-pClPhe)-(D-Nal)-(D-pNO2Phe)(核心肽37)；
(L-ThiAla)-(D-OEt-Tyr)-(D-OEt-Tyr)-(D-pClPhe)(核心肽38)；
(Phe)-(D-pClPhe)-(D-Nal)-(D-pClPhe)(核心肽39)；
X1-X2-T-X3-W-W(核心肽42)，
X1-X2-A-A-W-W(核心肽43)序列識別號7，
X1-X2-G-A-W-W(核心肽44)序列識別號8，
X1-X2-R-A-W-W(核心肽45)序列識別號9，
X1-X2-X4-A-W-W(核心肽46)，
X1-X2-C-K-W-W(核心肽47)序列識別號10，
X1-X2-V-X3-W-W(核心肽48)，
X1-T-X2-X3-W-W(核心肽49)，
X1-Y-X2-X3-W-W(核心肽50)，
A-X1-X2-X3-W-W(核心肽51)，
C-X1-X2-X3-W-W(核心肽52)，
F-X1-X2-X3-W-W(核心肽53)，和
K-X1-X2-X3-W-W(核心肽54)，其中X1、X2及X4選自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Cys或Tyr且X3選自Ala、Lys、Ser或Thr；以及
X1-X2-X3-X4-W-W(核心肽55)，其中X1、X2及X3選自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Cys或Tyr且X4選自Ala、His、Lys、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val。
2、一種分離試劑，其包含一選自如下任一結(jié)構(gòu)的核心結(jié)構(gòu)，其中該試劑可除去IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏
TPI914
TPI927
其中，R3選自下列基團(tuán)
TPI882
其中R1選自
其中R2選自
以及
其中，R3選自
3、如權(quán)利要求1或2所述的試劑，其中所述試劑可除去XIAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏。
4、如權(quán)利要求1或2所述的試劑，其中所述試劑可除去XIAP抑制卡斯蛋白酶-3的阻遏。
5、一種醫(yī)藥組合物，其包含權(quán)利要求1或2的試劑及一醫(yī)藥上可接受的載劑。
6、一種復(fù)合體，其包含IAP，所述IAP結(jié)合至選自由權(quán)利要求1中定義的核心肽5至39及42至55、以及(L-Ala)-X1-(L-Trp)-X2(核心肽4)，其中X1為L-Trp或D-Trp，X2為L-ThiAla或L-pClPhe中所示的核心肽組成的組群的一試劑，并且所述IAP結(jié)合至其核心結(jié)構(gòu)選自由TPI759N-芐基-1，4，5-三取代-2，3-二酮基呱嗪庫、TPI882C-6-酰胺基雙環(huán)胍?guī)?、TPI914N-酰基三胺庫或TPI927多苯基脲庫組成的組群的試劑。
7、如權(quán)利要求6所述的試劑，其中所述IAP選自由XIAP、c-IAP-1、c-IAP-2及survivin組成的組群。
8、一種除去IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的體外方法，其包含使IAP抑制卡斯蛋白酶與一有效量的試劑接觸，以除去IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏，所述試劑具有一核心基元及一核心結(jié)構(gòu)，其中所述核心基元選自由如權(quán)利要求1或6所定義的核心肽4至39及42至55中任一具有一所示序列的核心肽組成的組群，所述核心結(jié)構(gòu)選自由如權(quán)利要求6所定義的TPI759、TPI882、TPI914或TPI927組成的組群。
9、如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述IAP選自由XIAP、c-IAP-1、c-IAP-2及survivin組成的組群。
10、如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述卡斯蛋白酶選自由卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-7及卡斯蛋白酶-9組成的組群。
11、如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述接觸發(fā)生在細(xì)胞中。
12、一種除去IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏的試劑在制造用于除去IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏的藥物上的用途，所述試劑具有一核心基元及一核心結(jié)構(gòu)，其中所述核心基元選自由如權(quán)利要求1或6所定義的核心肽4至39及42至55中任一具有一所示序列的核心肽組成的組群，所述核心結(jié)構(gòu)選自由如權(quán)利要求6所定義的TPI759、TPI882、TPI914或TPI927組成的組群。
13、如權(quán)利要求12所述的用途，其中所述IAP選自由XIAP、c-IAP-1、c-IAP-2及survivin組成的組群。
14、如權(quán)利要求12所述的用途，其中所述卡斯蛋白酶選自由卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-7及卡斯蛋白酶-9組成的組群。
15、如權(quán)利要求12所述的用途，其中所述接觸發(fā)生在細(xì)胞中。
16、一種促進(jìn)細(xì)胞凋亡的體外方法，其包含使細(xì)胞與有效量的試劑接觸，以除去IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏，所述試劑具有一核心基元及一核心結(jié)構(gòu)，其中所述核心基元選自由如權(quán)利要求1或6所定義的核心肽4至39及42至55中任一具有一所示序列的核心肽組成的組群，所述核心結(jié)構(gòu)選自由如權(quán)利要求6所定義的TPI759、TPI882、TPI914或TPI927組成的組群。
17、如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述細(xì)胞為真核細(xì)胞。
18、如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述IAP選自由XIAP、c-IAP-1、c-IAP-2及survivin組成的組群。
19、如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述卡斯蛋白酶選自由卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-7及卡斯蛋白酶-9組成的組群。
20、一種除去IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏的試劑在制造用于促進(jìn)細(xì)胞凋亡的藥物上的用途，所述試劑具有一核心基元及一核心結(jié)構(gòu)，其中所述核心基元選自由如權(quán)利要求1或6所定義的核心肽4至39及42至55中任一具有一所示序列的核心肽組成的組群，所述核心結(jié)構(gòu)選自由如權(quán)利要求6所定義的TPI759、TPI882、TPI914或TPI927組成的組群。
21、如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述細(xì)胞為真核細(xì)胞。
22、如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述IAP選自由XIAP、c-IAP-1、c-IAP-2及survivin組成的組群。
23、如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述卡斯蛋白酶選自由卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-7及卡斯蛋白酶-9組成的組群。
24、一種除去IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏的試劑在制造用于減輕一個(gè)體中以細(xì)胞凋亡量呈病理降低為特征的疾病的嚴(yán)重程度的藥物上的用途，所述試劑具有一核心基元及一核心結(jié)構(gòu)，其中所述核心基元選自由如權(quán)利要求1或6所定義的核心肽4至39及42至55中任一具有一所示序列的核心肽組成的組群，所述核心結(jié)構(gòu)選自由如權(quán)利要求6所定義的TPI759、TPI882、TPI914或TPI927組成的組群。
25、如權(quán)利要求24所述的用途，其中所述疾病為癌癥。
26、如權(quán)利要求24所述的用途，其中所述疾病選自由干癬、增生、自身免疫病及再狹窄癥組成的組群。
27、如權(quán)利要求24所述的用途，其中所述IAP選自由XIAP、c-IAP-1、c-IAP-2及survivin組成的組群。
28、如權(quán)利要求24所述的用途，其中所述卡斯蛋白酶選自由卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-7及卡斯蛋白酶-9組成的組群。
29、一種鑒別可除去IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑的體外方法，其包含
(a)檢測與IAP或卡斯蛋白酶結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑，所述經(jīng)標(biāo)記的IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑包括一核心基元或一核心結(jié)構(gòu)，其中所述核心基元選自由如權(quán)利要求1或6所定義的核心肽4至39及42至55中任一具有一所示序列的核心肽組成的組群，所述核心結(jié)構(gòu)選自由如權(quán)利要求6所定義的TPI759、TPI882、TPI914或TPI927組成的組群。
(b)使所結(jié)合的IAP或卡斯蛋白酶與一候選試劑相接觸，所述候選試劑被懷疑能夠除去IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏；及
(c)檢測所述經(jīng)標(biāo)記的IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑與所述IAP或卡斯蛋白酶之間發(fā)生的離解，藉此可將所述候選試劑鑒別為可除去IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的試劑。
30、如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述IAP選自由XIAP、c-IAP-1、c-IAP-2及survivin組成的組群。
31、如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述IAP抑制卡斯蛋白酶選自由卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-7及卡斯蛋白酶-9組成的組群。
32、如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述接觸發(fā)生在細(xì)胞中。
33、一種包含一核心結(jié)構(gòu)的分離試劑，其中所述核心結(jié)構(gòu)選自下述任一所示的結(jié)構(gòu)，其中所述試劑可除去IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏
全文摘要
本發(fā)明提供了具有一核心肽的分離試劑，該核心肽選自由核心肽5至39及42至55組成的組群，其中該試劑可除去IAP抑制卡斯蛋白酶(caspase)的阻遏。本發(fā)明亦提供一種具有一選自任何圖5、9、10、14B及21至24中所示結(jié)構(gòu)的核心結(jié)構(gòu)的分離試劑，其中該試劑可除去IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種除去IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的方法。本發(fā)明的方法亦可用于促進(jìn)細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡并用于減輕以細(xì)胞凋亡速度降低為特征的病狀的嚴(yán)重程度。本發(fā)明亦提供若干用于鑒別IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏劑的方法。
文檔編號A61P43/00GK101029080SQ20061016226
公開日2007年9月5日 申請日期2002年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月21日
發(fā)明者約翰·C·里德, 理查德·A·霍頓, 阿德爾·內(nèi)夫茲, 約翰·M·奧斯特雷士, 克萊門西婭·派尼拉, 凱特·沃爾什 申請人:伯納姆研究院, 托里派因斯分子學(xué)研究院