專利名稱:一種用于預(yù)防和治療i型糖尿病的藥物復(fù)合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防和治療I型糖尿病的藥物復(fù)合物及其應(yīng)用。具體地,本發(fā)明涉及一種包括1)能夠治療I型糖尿病的多肽;2)包括分別與胰島素原、GAD65和可以結(jié)合T細胞負調(diào)節(jié)蛋白CTLA-4的B7-1wa多肽具有至少50%同源性的多肽的核酸疫苗的用于預(yù)防和治療I型糖尿病的藥物復(fù)合物,及其應(yīng)用。
背景技術(shù):
糖尿病是造成人類死亡的主要病因之一,嚴重危及人類健康。I型糖尿病和II型糖尿病是糖尿病的兩種主要形式。凋亡即程序性死亡是I型和II型糖尿病胰島細胞死亡的主要原因。I型和II型糖尿病人都表現(xiàn)有進行性的胰島B-細胞質(zhì)量減少和B-細胞功能降低。
胰高血糖素類似肽(GLP-1,從7位到36位氨基酸的氨基化合物)是一種主要的生理性胰島素類似激素。由于天然GLP-1獨特的促胰島素樣作用和抗高血糖素樣作用,以及對胰臟B細胞的營養(yǎng)作用,因此在治療糖尿病方面展現(xiàn)了極大的藥學(xué)應(yīng)用前景。這一點與臨床治療糖尿病重新制定的治療目標不謀而合。其藥學(xué)的重要意義還在于,與當(dāng)今使用的磺基脲、胰島素等治療糖尿病的一線藥物相比,它并不會產(chǎn)生增加體重等副作用。實際上,由于GLP-1能促進漲飽的感覺,可自然減少食物的攝取,因此限制了患者體重的增加,甚至有可能造成體重的降低。
進行治療的主要困難在于一些酶類(如二肽酰二肽酶(DPPIV))可以使GLP-1快速失活,再加腎臟對GLP-1的排出作用,使得GLP-1本身的半衰期很短(t1/2<2min)。因此采取持續(xù)性的皮下灌流可以維持機體內(nèi)GLP-1的功效。DPPIV抑制劑能夠延長GLP-1的半衰期并且正在臨床實驗中進行測試,但是這種方法仍然缺乏特異性,這是因為DPPIV同時還能使其他幾種多肽激素和趨化因子失活,將其抑制會產(chǎn)生各種不利反應(yīng)。
Exendin-4(Ex-4)是一種39個殘基的蜥蜴唾液腺多肽,是GLP-1的同功因子,有55%的序列同源性,藥學(xué)性質(zhì)與GLP-1相似。與GLP-1相反,Ex4在水溶液中能形成單體螺旋。這種螺旋由于疏水性C端的首尾相互作用,表現(xiàn)出罕見的熱穩(wěn)定性。由于GLP-1缺乏C端首尾的相互作用、其自身的柔韌性以及16位的甘氨酸殘基(是指甘氨酸還是氨基酸的殘基)被認為是降低單體螺旋狀態(tài)穩(wěn)定性的因素。而Ex4螺旋內(nèi)部的穩(wěn)定性可減少結(jié)合受體時的正位功效,這一結(jié)合需要C末端保持螺旋狀態(tài)。
此外,白蛋白偶聯(lián)的GLP-1(Albugon)也同樣具有和較長的半衰期和治療糖尿病的功能。
盡管像Ex4一樣具有DPP-IV-抗性的GLP-1受體激動劑在治療糖尿病方面展示很大的藥用價值前景,但這些多肽需每日注射1-2次或配合口服藥物使用。由于Albugon分子較大,由腎臟排出量較少,因而也具有較長的半衰期。然而體外實驗結(jié)果顯示融合蛋白的功效不如Ex-4。而且,更重要的是多肽類藥物可以產(chǎn)生危險的致敏反應(yīng)。這使得人們投入更多精力去開發(fā)在體內(nèi)功效更持久,穩(wěn)定性更高的效應(yīng)分子。
I型糖尿病是一種復(fù)雜的自體免疫性疾病,當(dāng)胰島抗原反應(yīng)性T細胞侵潤到胰島蘭氏小島,會啟動炎癥過程殺死胰島細胞。這種由T殺傷細胞對胰島細胞造成的傷害是自體免疫主要的和持續(xù)性的效應(yīng),也是I型糖尿病難以治愈的主要原因之一?;蛑委熌壳耙褢?yīng)用到糖尿病動物模型上。例如,基因療法已經(jīng)應(yīng)用于調(diào)節(jié)性的淋巴因子如IL-4,IL-10,TGF-beta-1的全身給藥方面,或是用于體內(nèi)B細胞移植的體外修飾方面。研究人員也選擇了將bcl-2基因轉(zhuǎn)染至用于細胞移植的B細胞,以防治細胞的凋亡。但這些治療措施都有極大的局限性。在臨床應(yīng)用方面可能有許多負面效應(yīng),如將基因?qū)胍浦驳囊葝u中會受到抗胰島免疫反應(yīng)和某些質(zhì)粒相對較短的表達時間所限。此外,已經(jīng)通過基因療法投送胰島素或胰島素類似物到肝臟,肌肉和其它組織,但并沒有取得預(yù)期的對血糖水平的生理調(diào)節(jié)。另類療法涉及到體內(nèi)投送基因(如PDX-1)誘導(dǎo)肝細胞分化胰島細胞,但初期的成功實驗卻很難重復(fù)。近年來確實提出了許多以基因為基礎(chǔ)的治療方法,但這些療法幾乎都建立在病毒載體基因轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)上,有許多局限性諸如病原性和免疫原性,還沒有一例可以應(yīng)用于人類。顯然,只要I型糖尿病的自體免疫反應(yīng)得不到控制,新移植的胰島或是由于再生而產(chǎn)生的新的胰島終究會被肌體排斥。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是一種用于預(yù)防和治療I型糖尿病的藥物復(fù)合物。組成藥物復(fù)合物之一的GLP-1-IgG-Fc融合蛋白及其類似物能促進胰島B細胞增殖、再生和減少凋亡,從而增加胰島細胞質(zhì)量,并且能促進胰臟B細胞分泌胰島素和對葡萄糖的耐受性,激活cAMP和其耦聯(lián)的第二信使途徑和促進B細胞中蛋白激酶(Akt1和MAPK)的表達以及增加其含量,降低caspase-3的活性。
組成藥物復(fù)合物之一的核酸疫苗,通過與CTLA-4配體結(jié)合,使得提供負調(diào)節(jié)信號的T-細胞受體與抗原識別的聯(lián)結(jié),通過持續(xù)產(chǎn)生的T-調(diào)節(jié)細胞(Tr)抑制了肌體T-細胞對胰島素或GAD65多肽的反應(yīng),因此控制了存在于1型糖尿病的持續(xù)的自體免疫反應(yīng)。解除了由T-殺傷細胞造成的胰島B細胞損傷和肌體持續(xù)的自體免疫狀態(tài)。加上GLP-1促進胰島B-細胞再生的效應(yīng),從而在控制了自體免疫的同時,促進了胰島B細胞的增殖和功能的改善??傊撍幬飶?fù)合物有針對性地對導(dǎo)致1型糖尿病無法治愈的兩個關(guān)鍵病因雙管齊下,從根本上為預(yù)防與治療1型糖尿病提供了嶄新的思路與有效的途徑。
本發(fā)明的再一目的是提供上述藥物復(fù)合物的給藥途徑。
本發(fā)明的再一目的是提供上述藥物復(fù)合物的給藥劑量。
本發(fā)明的再一目的是提供上述藥物復(fù)合物用于制備治療糖尿病的藥物的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案,本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防和治療I型糖尿病的藥物復(fù)合物,其中,該藥物復(fù)合物包括1)能夠治療I型糖尿病的多肽,或含有該多肽的基因的表達質(zhì)粒;2)包括分別與胰島素原、GAD65和可以結(jié)合T細胞負調(diào)節(jié)蛋白CTLA-4的B7-1wa多肽具有至少50%同源性的多肽的核酸疫苗。
根據(jù)本發(fā)明的藥物復(fù)合物,其中,所述多肽能夠治療I型糖尿病的多肽為胰高血糖素類似肽GLP-1或與其具有50%以上同源性的同功因子與IgG-Fc的融合蛋白,所述IgG-Fc可以為鼠IgG-Fc或人IgG-Fc。
在上述藥物復(fù)合物中,所述融合蛋白可以為胰高血糖素類似肽GLP-1與IgG1-Fc的融合蛋白,其中的IgG-Fc為IgG1、IgG2或IgG3;或GLP-1的同功因子extendin-4與IgG1-Fc的融合蛋白,其中的IgG-Fc為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
根據(jù)本發(fā)明的藥物復(fù)合物,其中,所述融合蛋白為突變體GPL-1-A8G-IgG-Fc,并且IgG-Fc為IgG1、IgG2或IgG3。其中GPL-1的氨基酸序列的第8位的丙氨酸被甘氨酸取代,或者被其它氨基酸取代,或者對GLP-1序列其它氨基酸修飾使得突變體GPL-1耐受其降解酶(如二肽酰二肽酶,DPPIV)。
根據(jù)本發(fā)明的上述藥物復(fù)合物可以口服、肌肉注射、靜脈注射、經(jīng)皮給藥、經(jīng)粘膜給藥,并且,被給藥的具有蛋白活性的藥物復(fù)合物的量為0.05nmol~1nmol/kg體重,或有效cDNA的量為1μg-10μg/kg體重。
根據(jù)本發(fā)明的藥物復(fù)合物可以用于制備治療糖尿病的藥物。
根據(jù)本發(fā)明的藥物復(fù)合物,GLP-1-IgG-Fc結(jié)合核酸疫苗(胰島素原,GAD65和能結(jié)合CTLA-4(CD152)的突變體B7(B7-1wa)接種以促進B細胞再生和同時控制自體免疫過程。這樣,可以完全免除有高度危險發(fā)生I型糖尿病患者的發(fā)病,或者完全治愈新近診斷為I型糖尿病的病人或是那些多年的1型糖尿病人只要他們的胰臟仍然有少量有活性的胰島B細胞。
用于本研究的NOD鼠是自體免疫性糖尿病極佳的實驗?zāi)P?。NOD鼠發(fā)生糖尿病與T-helper 1(Th1)和細胞毒T淋巴細胞(CTL)對胰島抗原反應(yīng)有關(guān),也與T調(diào)節(jié)細胞(Tr)失調(diào)有關(guān)。改變產(chǎn)生生長因子B1(TGF-β1)-的Tr細胞對該病可起保護作用,但其功能隨年齡而下降。我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1基因療法可以預(yù)防NOD鼠發(fā)生糖尿病,多種治療措施如CD3Ab療法可以部分誘導(dǎo)Tr細胞產(chǎn)生TGF-β1,其他Tr細胞也可能參與其中,如CD4+CD25+細胞通過引導(dǎo)細胞接觸,來誘導(dǎo)天然Tr細胞(nTr)。
研究發(fā)現(xiàn),通過核酸疫苗接種,即通過遞送抗原基因與CTLA-4(CD152)配體結(jié)合可以產(chǎn)生Tr細胞。核酸疫苗接種對預(yù)防NOD鼠I型糖尿病效果顯著。CTLA-4是高效的T細胞負調(diào)節(jié)因子,它對某些Tr細胞的活性是必不可少。CTLA-4與其相關(guān)分子CD28之間有天然配體的區(qū)別,因為二者都結(jié)合B7-1和B7-2(由抗原呈現(xiàn)細胞[APCs]表達)。我們使用了突變體B7-1分子(B7-1wa),該分子有氨基酸點突變(W88 to A),其能結(jié)合CTLA-4但不能結(jié)合CD28。如果用前胰島素原1(PPIns)作為核酸疫苗接種的目標分子并與B7-1wa同時接種,則因Tr細胞無法識別而只有部分的保護作用。因此用PPIns/GAD65融合(Ins-GAD)作為目標抗原以誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的自體抗原目標抗原決定簇(autoantigenic target epitopes)。雙核酸疫苗的接種使得提供負調(diào)節(jié)信號的T-細胞受體(TCR)與抗原識別的聯(lián)結(jié),這樣持續(xù)產(chǎn)生的Tr細胞抑制了對胰島素或GAD65多肽的反應(yīng),保護機體免于自體免疫疾病。重要的是特異性抑制作用只針對免疫胰島抗原。
I型糖尿病是T-細胞依賴性的自體免疫性疾病。由于患者廣泛的胰島B細胞損傷和持續(xù)的自體免疫狀態(tài),因此很難治愈。成功的治療手段必須能補充胰島細胞質(zhì)量,控制自體免疫過程。根據(jù)本發(fā)明,GLP-1-IgG-Fc結(jié)合核酸疫苗(胰島素原,GAD65和能結(jié)合CTLA-4(CD152)的突變體B7(B7-1wa)是一種雙管齊下的治療方法。它既能夠通過GLP-1的作用促進B細胞再生和增殖,改善B細胞功能,進而恢復(fù)胰島B細胞正常分泌胰島素,增加胰島B細胞質(zhì)量,和減少分泌高血糖素,從根本上解除了患者高血糖癥狀的病因,改變以往治標不治本的治療方法;同時通過核酸疫苗的作用控制患者的自體免疫過程,終止T殺傷細胞對胰島B細胞的持續(xù)傷害所造成的B細胞程序性死亡過程,結(jié)束I型糖尿病患者必須終生依賴外源胰島素但仍然無法逆轉(zhuǎn)病程惡化的悲慘局面。本發(fā)明的藥物復(fù)合物的應(yīng)用可以完全免除有高度危險發(fā)生I型糖尿病患者的發(fā)病,或者完全治愈新近診斷為I型糖尿病的病人或是那些多年的1型糖尿病人只要他們的胰臟仍然有少量有活性的胰島B細胞。此外,使用本發(fā)明的藥物復(fù)合物的方法簡便、療效持久、副作用少、費用低廉,從而為徹底戰(zhàn)勝I型糖尿病提供了一條嶄新的途徑。
圖1說明構(gòu)建GLP-1-IgG-Fc質(zhì)粒示意圖,其中圖A和圖B表示鼠GLP-1-IgG1-Fc;圖C和圖D表示人GLP-1-IgG2-Fc。
圖2說明IgG-Fc融合蛋白在COS-7細胞中的表達和檢測。
圖3說明檢測轉(zhuǎn)染COS-7細胞分泌的GLP-1。
圖4(A)說明COS-7細胞大量表達IgG-Fc融合蛋白,圖4(B)說明GLP-1在哺乳細胞和大腸桿菌中的表達。
圖5說明GLP-1融合蛋白在COS-7細胞系穩(wěn)定表達。
圖6說明GLP-1-IgG-Fc融合蛋白對INS-1細胞胰島素分泌的影響。
圖7說明GLP-1-IgG-FC對INS-1細胞產(chǎn)生cAMP與Ex-4有相似的功效。
圖8說明GLP-1-IgG-IgG-Fc在二型糖尿病模型db/db受試鼠中表達的效果。
圖9說明在經(jīng)STZ誘導(dǎo)形成的胰島素分泌缺陷的I型糖尿病模型鼠體內(nèi)表達GLP-1-IgG-Fc的效果。
圖10說明GLP1-IgG-Fc在大型哺乳動物豬中表達對血糖的影響。
圖11說明用PPI/GAD和B7.1-wa進行雙重疫苗接種的效果。
圖12說明移植雙重疫苗接種的鼠脾細胞能夠預(yù)防由糖尿病NOD鼠脾細胞誘導(dǎo)的自家免疫疾病。
圖13抗原刺激引起的致糖尿病細胞(D)釋放IFNγ在體外被給以雙重疫苗接種鼠(V)脾細胞所抑制。只有CD4+,而不是CD8+抑制了致糖尿病細胞的反應(yīng)。
圖14顯示抗原刺激所致致糖尿病細胞(D)被來自雙重疫苗接種的鼠脾懸浮培養(yǎng)細胞CD4+B7.1+級分所抑制。
圖15顯示致糖尿病脾細胞抗原刺激引起的IFNγ釋放被雙重疫苗接種的鼠脾細胞抑制。
圖16說明顯型抑制細胞實驗的結(jié)果。
具體實施例方式
糖尿病動物模型體內(nèi)實驗體內(nèi)實驗是用來自JacksonLaboratories(Bar Harbor,ME,USA)4周齡的雌性db/db模型鼠(BKS.Cg-m+/+Leprdb,批號000642),來自Charles River Canada(Montreal,QC,Canada)作為對照的C57BLKS/J鼠和CD1鼠。購自Taconic Farms(Germantown,NY)的雌性NOD鼠。受試鼠飼養(yǎng)在有控光照(12hs/12hs)、恒溫、無病原菌的條件下,提供充足的適宜嚙齒類的食物和飲水。NOD鼠給以常規(guī)的滅菌的Charles River#5075食物。每日注射低劑量的STZ(55mg/kg,i.p.)連續(xù)5天誘導(dǎo)產(chǎn)生胰島素分泌缺陷的糖尿病鼠。
糖尿病的診斷受試鼠血糖水平每周用AccuSoft AdvantageTM測試儀或血糖儀(Roche Diagnostics)測試。當(dāng)連續(xù)2次測量血糖水平高于17.0mmol/L即診斷為糖尿病。
核酸疫苗的制備裝有鼠野生型GAD65 cDNA的Bluescript KS+質(zhì)粒為市售可得。無終止密碼子的全長PPIns I序列已由本發(fā)明人于2002年在Hum.Gene Therapy雜志公開。。重疊PCR法將PPIns I與全序列的GAD65融合,得到5‘-PPIns-GAD65-3’的PCR產(chǎn)物Ins-GAD,然后通過限制性酶切位點裝入已經(jīng)刪除熒光素酶基因的VR1255表達質(zhì)粒(Vical Inc.,San Diego,CA),起名VR-Ins-GAD。在COS-7細胞表達裝有VR-Ins-GAD基因的質(zhì)粒,得到分泌到細胞培養(yǎng)液的Ins-GAD雜交分子,并經(jīng)免疫印跡法確認。同樣,注射這個質(zhì)粒并結(jié)合電轉(zhuǎn)移,在肌肉細胞里產(chǎn)生Ins-GAD蛋白。提取后經(jīng)免疫印跡和ELISA實驗確認??盏腣R1255-質(zhì)粒取名VR作為對照。VR-B7-1wa的序列編碼B7-1分子并在88位點以色氨酸置換丙氨酸,置換方法為現(xiàn)有點突變技術(shù)。這些VR1255衍生的質(zhì)粒有人細胞巨化病毒(CMV)直接早期強化子和啟動子(IE-EP)元件,CMV內(nèi)含子A,以及兔球蛋白終結(jié)序列。
質(zhì)粒構(gòu)建為擴增GLP-1的全序列和鼠IgG-Fc cDNAs序列,以GLP-1/PCR2.1和IgG質(zhì)粒為模板,以下列特異性序列5’-CCGGATATCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCA-3’和5’-TGCTGAAGGGACCTTTACCAGTG-3’為引物進行第一輪交迭PCR(overlap PCR)。以PCR產(chǎn)物為模板進行第二輪交迭PCR產(chǎn)生GLP-1-IgG-Fc cDNA序列。將擴增的產(chǎn)物亞克隆到質(zhì)粒Vmew的BamHI和Eco RV位點。為擴增GLP-1和人IgG-Fc cDNAs序列,以GLP-1/PCR2.1和IgG質(zhì)粒為模板,以下列特異性序列構(gòu)建人IgG2 FC(鉸鏈-CH2-CH3)所用引物為5’-AAGGATATCGATCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCA-3’和5’-CGTAAGCTTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’。所用載體同上。為構(gòu)建IgG-Fc對照質(zhì)粒,以下列特異性序列5’-CCGGATATCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCCCAGCGAGACCGTCACC-3’;和5’-CGCGGATCCCTATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGG-3’為引物進行PCR,擴增產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒Vmew的Bam HI和Eco RV位點。載體含有CMV增強子和啟動子,單一真核生物轉(zhuǎn)錄單元,兔最小貝它球蛋白多聚腺嘌呤尾和轉(zhuǎn)錄終止序列。
Vrnew載體是由VR1255載體刪除熒光素酶報告基因的衍生載體,并添加了限制性內(nèi)切酶位點。為使GLP-1或Exendin-4序列分泌,通過PCR于5‘端引入Igκ鏈信號肽或GHRH信號肽序列。為在細菌中表達GLP-1-IgG-Fc融合蛋白,通過PCR擴增Vrnew載體的融合cDNA序列,并亞克隆至pET-28a質(zhì)粒(Novagen)。構(gòu)建質(zhì)粒的示意圖如圖1所示。
GLP-1-IgG-Fe融合蛋白的表達在哺乳動物細胞中的表達,是將GLP-1-IgG-Fc或IgG-Fc的cDNA通過脂質(zhì)體Lipofectamine2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染到COS-7細胞系。其過程是先將密度為每孔2.5×105個的COS-7細胞生長在6孔細胞培養(yǎng)板。添加含有4μg DNA IgG-Fc cDNAs和10μL轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體的無血清無抗菌素的DMEM培養(yǎng)液(Invitrogen)在37℃的CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。6h后,轉(zhuǎn)換為DMEM全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48h分別收集培養(yǎng)液和細胞,轉(zhuǎn)染的COS-7細胞分泌的融合蛋白見圖3。為了大規(guī)模地表達GLP-1-IgG-Fc融合蛋白,將COS-7細胞培養(yǎng)在150mm培養(yǎng)皿,分別用150mM NaCl將陽離子轉(zhuǎn)染試劑Poly(ethyleneimine)(PEI,25kDa)和80μg相關(guān)cDNA稀釋,混合后放置20min.然后將DNA/PEI復(fù)合物加到盛有無血清無抗菌素DMEM培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)皿在37℃的CO2培養(yǎng)箱放置6h后,以加有10%FBS和1%P/S的DMEM培養(yǎng)液取代。該方法的轉(zhuǎn)染率可高達85%。大量表達融合蛋白的結(jié)果見圖4A。
為建立穩(wěn)定表達GLP-1-IgG-Fc融合蛋白的COS-7細胞系,細胞以每孔2.5×105的密度在6孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng),并按照上述步驟轉(zhuǎn)染4μg線性化的GLP-1/IgG-Fc質(zhì)?;蜃鳛閷φ盏腎gG-Fc質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染以后24h,細胞在含有G418(500μg/mL)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),以篩選已經(jīng)穩(wěn)定整合重組外源cDNA的細胞。培養(yǎng)過程中,每3天換培養(yǎng)液一次直至穩(wěn)定表達外源基因的細胞克隆形成。分離單克隆細胞培養(yǎng)成穩(wěn)定表達細胞系。培養(yǎng)在24孔培養(yǎng)板的細胞以及細胞培養(yǎng)液分別用鼠GLP-1 RIA試劑盒檢測融合蛋白。將能分泌融合蛋白的細胞揀出并供以后的特性分析。穩(wěn)定表達融合蛋白的COS-7細胞系RIA測定結(jié)果見圖5。在細菌細胞系中表達GLP-1-IgG-Fc融合蛋白,是將GLP-1-IgG-Fc/pET28a質(zhì)?;?qū)⒆鳛閷φ盏腎gG-Fc/pET28a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta gami 2細胞系(Novagen,EMD biosciences,San Diego,CA)。方法可以是傳統(tǒng)的氯化鈣法或是應(yīng)用電穿孔儀進行電轉(zhuǎn)化。其具體參數(shù)可以從任何分子生物學(xué)實驗手冊中查到。轉(zhuǎn)化后的細菌涂布于培養(yǎng)皿過夜培養(yǎng),挑揀并篩選最佳表達融合蛋白的細菌菌斑。挑揀單個菌斑在50mL加有卡那霉素的2XYT培養(yǎng)液于37℃以225rpm過夜培養(yǎng)。而后將培養(yǎng)液以1∶50稀釋到新培養(yǎng)液,直至細胞密度達到O.D600讀數(shù)值0.6后,再在培養(yǎng)液中添加1mM的IPTG(EMD)以誘導(dǎo)融合蛋白表達。添加后3hr離心收集細菌細胞并在-80度保存。融合蛋白在哺乳動物細胞系和大腸桿菌的表達結(jié)果見圖4B。
GLP-1-IgG-Fc融合蛋白的純化本發(fā)明的實例是從轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞系或是大腸桿菌中以中小規(guī)模提取純化融合蛋白。小規(guī)模提取純化的具體做法是從培養(yǎng)哺乳動物轉(zhuǎn)染細胞的6孔培養(yǎng)板中每孔取2.5mL培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)移至以含100mM Tris pH 8.0和150mM NaCl的緩沖液平衡過的裝有70μL滿體積事先結(jié)合G蛋白的葡聚糖凝膠4快速洗脫樹脂(Amersham-Pharmacia)。經(jīng)過4℃過夜后,以Tris緩沖液沖洗,然后以30μL含SDS的樣品緩沖液將融合蛋白洗脫。
中規(guī)模提取純化是用來獲得較大量的融合蛋白。其具體步驟是從轉(zhuǎn)染后48h的哺乳動物細胞,或是從穩(wěn)定表達的細胞中,收集50mL的DMEM培養(yǎng)液。裝入1mL滿體積事先結(jié)合G蛋白的葡聚糖凝膠柱(Amersham-Pharmacia).并在1%Triton X-100下4℃過夜。而后反復(fù)用含0.1%Triton X-100的PBS沖洗,最后一步用150mM NaCl沖洗。用1mL 0.1 M glycine(pH 2.7)洗脫融合蛋白。洗脫液用Tris緩沖液(pH 9.0)中和,融合蛋白用PD-10柱(Amersham-Pharmacia)脫鹽并用PBS洗脫。經(jīng)凝膠柱純化的蛋白經(jīng)以上洗脫、中和、除鹽后的最終體積為1mL。
用同樣的方法也可以從細菌中純化融合蛋白。將轉(zhuǎn)化有融合蛋白基因質(zhì)粒的細菌過夜培養(yǎng),次日離心后的沉淀重新溶于含有多種蛋白酶抑制劑(Sigma,MO)的冷PBS緩沖液并通過超聲波裂解細胞。緩沖液中加入1%Triton X-100保持30min后離心(12,000g,10min),得到含有融合蛋白的上清液。其經(jīng)凝膠柱純化的過程以及洗脫、中和、除鹽的過程與上述相似。
GLP-1-IgG-Fc融合蛋白的檢測1.使用一步法RT-PCR試劑盒(Qiagen,Valencia,CA)確定GLP-1-IgG-Fc融合蛋白基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達。設(shè)計基因特異性引物5’-CCGGATATCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCCCAGCGAGACCGTCACC-3’和5’-CGCGGATCCCTATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGG-3’。
從轉(zhuǎn)染融合蛋白質(zhì)粒的COS-7細胞系取100ng的總RNA作為模板和添加0.6μM的引物5’-CCGGATATCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCATGCTGAAGGGACCTTTACCAGTG-3’和
5’-CGCGGATCCCTATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGG-3’。其它條件無特殊要求。一步RT-PCR的條件是50℃,30min;95oC,15Min;40循環(huán)。94℃,30sec,55℃,30sec;72℃,60sec,最后10min,72℃.RT-PCR產(chǎn)物通過1%agarose電泳分離,用溴化乙錠染色檢測。2.SDS-PAGE和免疫印跡反應(yīng)對表達的融合蛋白進行翻譯水平上的檢測。取小規(guī)模提取的融合蛋白30μL經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜,并用抗鼠抗體(15000,Amersham-Pharmacia)探測,用ECL顯影(Amersham-Pharmacia)。30μL中等規(guī)模提取的融合蛋白則經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離后用考馬斯亮蘭染色檢測。融合蛋白在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上的表達分別見圖2a和圖2b。
模型鼠體內(nèi)表達GLP-1-IgG-Fc對糖尿病db/db模型鼠、NOD模型鼠和注射STZ的CD1鼠分別于肌肉注射GLP-1-IgG-Fc/Vmew載體或注射IgG-FcVRnew對照載體。注射后進行電轉(zhuǎn)化用來促進基因體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。對受試鼠施行麻醉,用27號針頭于肌肉注射50mg溶于PBS的GLP-1-IgG-Fc或IgG-Fc質(zhì)粒。注射針頭套以塑料套以限制針頭進入肌肉深度小于5mm。注射后進行電轉(zhuǎn)移,在電極之間施加100V方波電脈沖(1S間隔)。注射DNA后4、6、32周在空腹情況下取隱靜脈血??崭寡呛坑靡徊椒ɑ狙怯?Lifescan Canada)測定,GLP-1,胰島素和高血糖素含量的檢測見下述。GLP-1-IgG-Fc在受試鼠中表達效果見圖8。
大型哺乳動物體內(nèi)表達GLP1-IgG-Fc將GLP-1-IgG-Fc或?qū)φ誌gG-Fc質(zhì)粒肌肉注射到Y(jié)orkshire公豬,每頭4mg/23kg隨后用ADViSYS電轉(zhuǎn)移儀進行電轉(zhuǎn)移。注射3天后,將能引起高血糖癥的Alloxan水化物(80mg/kg,Sigma)溶于25ml鹽水,PH調(diào)中性,在麻醉條件下靜脈注射。因該中性溶液不能有效引起高血糖,隨后又在僅注射空白IgG-Fc質(zhì)粒的對照組注射以引起中等程度高血糖。每周測量空腹血糖2次并用ELISA檢測Fc蛋白,結(jié)果見圖10。
GLP-1分泌實驗GLP-1分泌實驗的檢測是采用GLP-1放射免疫試劑盒(Linco),對瞬時或永久表達GLP-1-IgG-Fc或IgG-Fc融合蛋白的COS-7細胞系的培養(yǎng)液或轉(zhuǎn)化融合蛋白基因的細菌裂解液檢測其總GLP-1(包括各種形式的GLP-1)水平。對體內(nèi)實驗GLP-1水平的檢測是用GLP-1 ELISA試劑盒(Linco)對取自db/db受試鼠的血漿GLP-1水平進行檢測。實驗結(jié)果見圖6。
胰臟胰島素含量檢測為了比較GLP-1-IgG-Fc(Ex4-IgG-Fc,或GLP-1A8G-IgG-Fc)基因注射的鼠與僅注射Fc片斷的鼠胰臟胰島素總量的差別,將胰臟提取液按照已發(fā)表的方法用鼠胰島素RIA試劑盒(Linco,St.Charles,MO)測量。
胰島灌注實驗為了比較GLP-1-Fc(Ex4-Fc,或GLP-1A8G-Fc)基因注射的鼠與僅注射Fc片斷的鼠胰臟胰島素分泌量的不同,按照已發(fā)表的方法進行胰島灌注實驗。
B細胞質(zhì)量測定胰腺切片(4mm)按如前描述的處理.簡言之,通過脫蠟,脫水和在檸檬酸鹽緩沖液中煮沸進行抗原修復(fù),切片與豚鼠抗胰島素抗體(Dako Diagnostics)在4℃孵育過夜,然后樣品用生物素標記的抗豚鼠抗體(Vector Laboratories)孵育1h,隨后用抗生物素蛋白/生物素復(fù)合物(Vectastain Elite ABC試劑盒;Vector Laboratories,Burlingame,CA)處理1h。切片然后用DAB(Sigma-Aldrich)染色10min。DAB染色后,切片用自來水沖洗,并用蘇木精復(fù)染。通過連接帶有彩色監(jiān)視器和圖像采集軟件的視頻照像設(shè)備的Nikon(ECLIPSE-E1000)顯微鏡,從切片上胰島素抗體著色程度測定B細胞質(zhì)量。由B細胞占據(jù)的樣品切面區(qū)和所有胰腺組織的樣品切面區(qū)進行定量。B細胞質(zhì)量測定和以下B細胞質(zhì)量分析結(jié)果見圖9。
胰島B細胞質(zhì)量分析胰島細胞質(zhì)量,特別是B細胞質(zhì)量,是評估胰島B細胞功能的重要指標。為了弄清GLP-1-Fc(Ex4-Fc或GLP-1A8G-Fc)受試鼠或Fc對照鼠以及空白對照鼠細胞質(zhì)量的不同,我們對先前的方法進行了改進,A-,B-和D細胞依次用抗胰島素、抗高血糖素和抗生長激素抑制素抗體(11,000;DAKO)和相關(guān)的熒光二抗(DAKO)染色。所有3次染色的胰島細胞以及胰臟組織切片置于裝有數(shù)碼相機和ImagePlus軟件(NIH)的熒光顯微鏡定量檢測。通過測定切面3重染色的胰島細胞面積除以總的組織切面面積和固定前的胰腺重量,得到每個胰腺的總的B細胞質(zhì)量。同樣,胰臟總的B細胞(或alpha細胞)是通過測定切面胰島素陽性染色的B細胞(或A細胞)面積除以總的組織面積和固定前的胰腺重量。
B細胞增殖和凋亡是應(yīng)用文獻所述BrdU和Tunel染色技術(shù)。胰臟切片用抗胰島素和抗BrdU鼠IgG抗體(Sigma)雙重染色,或是Tunel染色(ApopTag試劑盒;Intergen)并用Nikon顯微鏡(x1000)觀察。BrdU+或Tunel+陽性B細胞計數(shù)以得到BrdU+或Tunel+的數(shù)值/B細胞總數(shù)。由于淋巴因子誘導(dǎo)的B細胞破壞是伴隨著細胞壞死,B細胞壞死是用DAPI/propidium iodide染色技術(shù)確定。
胰島再生的檢測是采用現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)使用的方法,即切片上總的胰島數(shù)目(包括單個的B細胞或3-5個B細胞群)除以切片上總的胰島素陽性細胞。
口服葡萄糖耐受實驗是為了確定GLP-1-Fc治療的胰島素分泌和體內(nèi)葡萄糖利用情況,實驗方法采用以前發(fā)表的文獻的方法。
胰島素和高血糖素分泌實驗將胰島素分泌細胞系INS-1細胞以每孔2.5×105的密度在24孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)。使用含10%FBS血清的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液。次日,以無葡萄糖的新鮮KRB緩沖液培養(yǎng)2次每次30min。然后細胞分別接受加有0.5或20mM的葡萄糖及不同濃度的純化的GLP-1 IgG融合蛋白的KRB緩沖液處理1hr。按照使用說明書用鼠胰島素RIA試劑盒(Linco,St.Charles,MO)測量25 LKRB緩沖液中的胰島素水平。
cAMP的測量將INS-1細胞以每孔62,500個細胞的密度在24孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)。在次日的實驗前,細胞在加有100 M IBMX的450mL的無血清SF-RPMI培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)5h。而后細胞在加有提純的Fc融合多肽(120nM)或Exendin-4(100nM)的SF-RPMI培養(yǎng)液培養(yǎng)10min后,加入1mL冰凍乙醇結(jié)束反應(yīng)。提取物保持在-20℃條件下3h或過夜。然后將每200μL分裝并凍干。凍干的樣品重新溶于50μL醋酸鈉緩沖液并用cAMP RIAs試劑盒檢測(Biomedical Technologies)。
實驗結(jié)果見圖7。
核酸疫苗的應(yīng)用肌肉注射和體內(nèi)電轉(zhuǎn)移的方法為現(xiàn)有技術(shù)常規(guī)使用的方法。核酸疫苗的應(yīng)用包括組成藥物復(fù)合物的3種核酸疫苗分別單獨使用,或共同使用,以及與GLP-1-IgG-Fc(或其突變體或Ex4-IgG-Fc)同時聯(lián)合使用。簡言之,小鼠麻醉后在后腿肌注射總量50μg的DNA。注射后立即實施電轉(zhuǎn)移。使用ECM830型電轉(zhuǎn)移儀的卡鉗式電極(Genetronics Inc)以200V/cm電壓,對受試鼠涂以傳導(dǎo)膠的皮膚表面實施8次電脈沖,每次持續(xù)時間20ms。3-4周后重復(fù)注射。核酸疫苗的應(yīng)用結(jié)果見圖11-16。
體外脾細胞刺激實驗從核酸疫苗免疫的受試鼠得到的脾懸浮培養(yǎng)細胞經(jīng)去除血紅細胞后置于無血清AIM V培養(yǎng)液(Invitrogen)并添加0.05mM B巰基乙醇。將免疫抗原加入培養(yǎng)液使其終濃度為0.05mg/ml。同時合成了同樣摩爾數(shù)的3份GAD65多肽,這3份多肽的序列分別是TYEIAPVFVLLEYVTLKKMREIIGWPGGSGD(amino acids206-236);AALGIGTDSVILIKCDERGK(amino acids 290-309)和VPPSLRTLEDNEERMSRLSKVAPVIKARMMEYGTT(amino acids509-543).它們覆蓋了T細胞識別的大多數(shù)抗原決定簇。牛胰島素購自Sigma Chemicals,MO.用MTT法測定細胞增殖。簡言之,免疫抗原刺激后72h將MTT溶液加入96孔細胞培養(yǎng)板,終濃度為1mg/ml。實驗平行做4份樣品。4h后,加入異丙醇終止反應(yīng)并加入0.04 M HCl酸化。溶解的MTT反應(yīng)產(chǎn)物在540nm比色。以抗原刺激細胞MTT減少量的光密度增加值與非抗原刺激的對照組的光密度值的比值來評估細胞增殖。
淋巴因子白介素分泌實驗上述脾細胞以每孔5×105cell的密度培養(yǎng)在96孔細胞培養(yǎng)板。培養(yǎng)72h后,取細胞培養(yǎng)液并分裝后冷凍保存,用以測定IL-10,IFN和TGF釋放量。在每100μL培養(yǎng)液加入10μL1NHCl酸化處理活化后測定TGF1含量。用BD Biosciences公司ELISA試劑盒按操作手冊規(guī)定的程序測定淋巴因子白介素水平。
不同淋巴細胞的分離和調(diào)節(jié)性T細胞實驗用干細胞技術(shù)公司(Toronto,Canada)生產(chǎn)的鼠CD4+和CD8+淋巴細胞EasySep試劑盒將分離紅血細胞后懸浮培養(yǎng)的脾細胞中的CD4+和CD8+細胞進行分離。該試劑盒是采用負磁性分揀技術(shù)。分揀后的細胞純度經(jīng)流式細胞儀證實為92-95%。用該公司所產(chǎn)鼠生物素選擇EasySep試劑盒將CD4+細胞又進一步分為CD25+和CD25-兩類。并用生物素標記的大鼠抗小鼠CD25抗體(BD Pharmingen)、抗小鼠B7.1抗體(BD Pharmingen)、抗人/小鼠LAP-TGF抗體以及兔抗大鼠/小鼠Nrp1抗體和生物素標記的羊抗兔IgG(BD Pharmingen)與上述正篩選試劑盒聯(lián)用,將B7.1+,Nrp1+,or LAP-TGF.淋巴細胞由總CD4+淋巴細胞中分離。以上操作都依照試劑盒實驗手冊進行,分離后淋巴細胞純度經(jīng)由流式細胞儀測定。流式細胞儀分析實驗如下所述,實驗結(jié)果見圖11-16。
流式細胞儀分析實驗FITC-或PE-標記大鼠抗小鼠CD4,CD25,CD 86(B7.1),CD152(CTLA-4)和IgG同系物購自BD Pharmingen公司。非標記的和生物素標記的大鼠抗人/小鼠LAP-TGF購自R&D Systems公司。兔抗鼠neuropilinl(Nrp1)多克隆IgG購自O(shè)ncogene公司??筁AP-TGF以及鼠IgG同系物標記了Molecular Probes公司的Alexa Fluor 488染料??笰nti-Nrp1IgG和兔正常IgG標記了Alexa Fluor 647染料。由于抗Nrp1抗體含有0.2%明膠,豬明膠也標記了Alexa Fluor 647染料并加到抗體同系物中,其最終濃度為0.2%以便校正標記的作為細胞外基質(zhì)蛋白的明膠結(jié)合可能造成的誤差。
核酸疫苗誘導(dǎo)免疫耐受性的實驗為了確認GLP-1-Fc融合蛋白基因治療方法對NOD自體免疫糖尿病的有效性,我們同時進行了核酸疫苗誘導(dǎo)免疫耐受性的實驗,同時設(shè)立對照。使用了Ins-GAD核酸疫苗(pIns-GAD質(zhì)粒)作為抗原。該疫苗特性已經(jīng)了解得很清楚并在我們先前的疫苗接種實驗中取得了鼓舞人心的結(jié)果。該疫苗編碼I型糖尿病2種主要目標分子大部分的抗原決定簇,即前胰島素原和GAD65。該疫苗將與第2個質(zhì)粒同用,如pB7-1wa編碼選擇性的CTLA-4配體(B7-1分子的突變體B7-1wa)?;蜣D(zhuǎn)移如我們先前所進行的由體內(nèi)電轉(zhuǎn)移進行強化,基因電轉(zhuǎn)移可以大大增加基因轉(zhuǎn)移的效率并可能在人類和大型動物中應(yīng)用,之前人類中使用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)較嚙齒類動物中效率低的多。先前的實驗我們已經(jīng)觀察到同時使用Ins-GAD/B7-1wa這2種核酸疫苗改善了新發(fā)糖尿病的NOD鼠葡萄糖的動態(tài)平衡,并獲約32%的受試鼠完全的治愈率,對比只接受空質(zhì)粒治療的對照組只有<5%的治愈率(p<0.01)。多數(shù)受試鼠沒有治愈是由于在治療之前胰島細胞受損程度太高,或是疫苗不完全誘導(dǎo)耐受性。在疫苗接種的同時施加GLP-1-Fc基因轉(zhuǎn)移,目的在于確定胰島細胞的再生是否可獲治愈,并分析在已經(jīng)出現(xiàn)糖尿病的受試鼠中是否能誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T-細胞的活性。實驗結(jié)果見圖11-16。
統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)都以平均值+標準差(mean±SEM)的形式表示。用SAS軟件(Statistical Analysis Systems,Cary,NC)進行學(xué)生T檢驗和ANOVA”n-1”分析,以p<0.05表示顯著性差異。并應(yīng)用SAS軟件(StatisticalAnalysis Systems,Cary,NC)或是GraphPad Prism 3.0軟件(GraphPadSoftware Inc.,San Diego,CA)。用Kaplan-Meier法對糖尿病影響范圍作圖,應(yīng)用對數(shù)歸類檢驗進行統(tǒng)計學(xué)比較。insulitis scores的顯著性差異用Chi方檢驗。體外增殖實驗各組之間差別以及淋巴因子釋放實驗用ANOVA分析確定,p<0.05表示顯著性差異。
以上列舉對本專利的描述僅僅是一些實施舉例說明。此將意識到,由于計算機系統(tǒng)或是由于提交本發(fā)明專利的方法引起的一些明顯的誤差包括筆誤將很容易被行內(nèi)專別。這些差異所寓本意也應(yīng)屬于本發(fā)明的描述和權(quán)利范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防和治療I型糖尿病的藥物復(fù)合物,其特征在于,該藥物復(fù)合物包括1)能夠治療I型糖尿病的多肽或含有該多肽的基因的表達質(zhì)粒;2)包括分別與胰島素原、GAD65和可以結(jié)合T細胞負調(diào)節(jié)蛋白CTLA-4的B7-1wa多肽具有至少50%同源性的多肽的核酸疫苗。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物復(fù)合物,其特征在于,所述能夠治療I型糖尿病的多肽為胰高血糖素類似肽GLP-1或與其具有50%以上同源性的同功因子與IgG-Fc的融合蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的藥物復(fù)合物,其特征在于,所述IgG-Fc為鼠IgG-Fc或人IgG-Fc。
4.如權(quán)利要求2所述的藥物復(fù)合物,其特征在于,所述融合蛋白為胰高血糖素類似肽GLP-1與IgG-Fc的融合蛋白,其中IgG-Fc為IgG1、IgG2或IgG3;或GLP-1的同功因子為蜥蜴唾液腺多肽extendin-4與IgG-Fc的融合蛋白,其中的IgG-Fc為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
5.如權(quán)利要求2所述的藥物復(fù)合物,其特征在于,所述的融合蛋白的突變體GPL-1-A8G-IgG-Fc,其中GPL-1的氨基酸序列的第8位的丙氨酸被甘氨酸取代,并且IgG-Fc為IgG1、IgG2或IgG3。
6.權(quán)利要求1所述的藥物復(fù)合物的給藥途徑,其特征在于,所述給藥途徑為口服、肌肉注射、靜脈注射、經(jīng)皮給藥、經(jīng)粘膜給藥。
7.權(quán)利要求1所述的藥物復(fù)合物的給藥劑量,其特征在于,被給藥的具有蛋白活性的藥物復(fù)合物的量為0.05nmol~1nmol/kg體重,或有效cDNA的量為1μg-10μg/kg體重。
8.權(quán)利要求1所述的藥物復(fù)合物用于制備治療糖尿病的藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防和治療I型糖尿病的藥物復(fù)合物及其應(yīng)用,該藥物復(fù)合物包括1)能夠治療I型糖尿病的多肽;2)包括分別與胰島素原、GAD65和可以結(jié)合T細胞負調(diào)節(jié)蛋白CTLA-4的B7-1wa多肽具有至少50%同源性的多肽的核酸疫苗。根據(jù)本發(fā)明的藥物復(fù)合物可以有效地預(yù)防和治療糖尿病。本發(fā)明的藥物復(fù)合物能夠促進B細胞再生和同時控制自體免疫過程,這樣,可以完全免除有高度危險發(fā)生I型糖尿病患者的發(fā)病,或者完全治愈新近診斷為I型糖尿病的病人或是那些多年的Ⅰ型糖尿病人。
文檔編號A61K48/00GK1935261SQ200610127238
公開日2007年3月28日 申請日期2006年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月14日
發(fā)明者王慶華, 黃曉航 申請人:王慶華, 黃曉航