專利名稱：用于預(yù)防或治療惡性腫瘤的HER－2/neu蛋白胞內(nèi)區(qū)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要針對用于誘導(dǎo)或增強(qiáng)對HER-2/neu蛋白免疫反應(yīng)的多肽及編碼該多肽的核酸分子，包括其在與HER-2/neu癌基因相關(guān)的惡性腫瘤治療中的應(yīng)用。
發(fā)明的背景盡管在經(jīng)濟(jì)和人力資源方面做了大量的投資，癌癥仍是一個主要的死亡原因。例如，癌癥是35到74歲婦女的主要死亡原因。乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤并且發(fā)病率在繼續(xù)上升。有1/9的婦女將被診斷患有此病。治療乳腺癌的標(biāo)準(zhǔn)方法以聯(lián)合應(yīng)用外科手術(shù)、放療和化療為主。這些方法在某些惡性腫瘤的治療上取得了巨大的成功。然而，這些方法并不能成功地治療所有的惡性腫瘤，當(dāng)試圖治療超過某個階段的乳腺癌時，通常是不能治愈的。用于預(yù)防和治療的其它方法是必需的。
惡性腫瘤的一個共同特點(diǎn)是不受控制的細(xì)胞生長。癌細(xì)胞經(jīng)過了由正常細(xì)胞向能自主生長的惡性細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。體細(xì)胞基因的擴(kuò)增和過度表達(dá)被認(rèn)為是導(dǎo)致正常細(xì)胞向惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化的一個共同的首要事件。在細(xì)胞分裂時，由癌基因編碼的惡性表型特征被傳遞給已轉(zhuǎn)化的子代細(xì)胞。
正在進(jìn)行的涉及瘤基因的研究工作已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了至少40個在惡性細(xì)胞中起作用及引起或與轉(zhuǎn)化相關(guān)的癌基因。癌基因基于其推定的功能或其基因產(chǎn)物(如由癌基因表達(dá)的蛋白)的定位而被分成不同的類。
癌基因被認(rèn)為對正常細(xì)胞生理學(xué)的某些方面是至關(guān)重要的。在這點(diǎn)上，HER-2/neu癌基因是酪氨酸蛋白激酶癌基因家族的一個成員，并與表皮生長因子受體有著高度的同源性。HER-2/neu可能在細(xì)胞的生長和/或分化中起作用。HER-2/neu可能通過由增加或下調(diào)一種必要的正?；虍a(chǎn)物的表達(dá)而導(dǎo)致的數(shù)量上的機(jī)理誘導(dǎo)了惡性腫瘤。
HER-2/neu(p185)是HER-2/neu癌基因的蛋白產(chǎn)物。在包括乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌及前列腺癌在內(nèi)的許多癌癥中HER-2/neu基因被擴(kuò)增并有HER-2/neu蛋白的過度表達(dá)。HER-2/neu與惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)。在50％-60％的管狀原發(fā)性肉瘤、20％-40％的乳腺癌及相當(dāng)部分出現(xiàn)在卵巢、前列腺、結(jié)腸及肺的腺癌都發(fā)現(xiàn)了HER-2/neu。HER-2/neu不僅與惡性表型緊密相關(guān)，而且與腫瘤的浸潤也緊密相關(guān)，在1/4的浸潤性乳腺癌中發(fā)現(xiàn)了這一點(diǎn)。在乳腺癌和卵巢癌中，HER-2/neu的過度表達(dá)與預(yù)后較差相關(guān)。HER-2/neu是一個相對分子量為185kd，長度是大約1255個氨基酸(aa)的跨膜蛋白。它含有一個與表皮生長因子(EGFR)有40％同源性的大約645氨基酸的細(xì)胞膜外結(jié)合區(qū)(ECD)、一個高度疏水的穿膜錨定區(qū)(TMD)以及一個與EGFR有80％同源性的約有580個氨基酸的羧基端胞質(zhì)區(qū)(CD)。
由于目前在治療與HER-2/neu相關(guān)腫瘤中的困難，因而本領(lǐng)域需要改進(jìn)的化合物和組合物。本發(fā)明滿足了這種需要并進(jìn)一步提供了其它相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明小結(jié)簡言之，本發(fā)明提供了用于免疫溫血動物抗與HER-2/neu相關(guān)的惡性腫瘤或用于生產(chǎn)進(jìn)行免疫的藥物的多肽、核酸分子(指導(dǎo)該多肽的表達(dá))以及病毒載體(指導(dǎo)該多肽的表達(dá))。根據(jù)本發(fā)明的多肽或核酸分子可存在于一種包括藥物學(xué)上可用的載體或稀釋劑的組合物中?？蓪⑦@樣一種多肽、核酸分子、病毒載體或藥物組合物用于一次性免疫(如當(dāng)疑有惡性腫瘤時)或周期性免疫(如發(fā)生惡性腫瘤或惡性腫瘤復(fù)發(fā)的危險增加的個體)。用于免疫的藥物可能在治療已存在的腫瘤或防止腫瘤的發(fā)生或復(fù)發(fā)中發(fā)揮作用。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種由一段選自于(a)序列號1的2026位到3765位核苷酸；和(b)在中度嚴(yán)格的條件下，能同互補(bǔ)于序列號1的2026位到3765位核苷酸的序列雜交的DNA序列的DNA序列編碼的多肽，這段DNA序列編碼一種能刺激產(chǎn)生對HER-2/neu蛋白免疫反應(yīng)的多肽。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，一種多肽具有序列號2中從676號賴氨酸到1255號纈氨酸的氨基酸序列或其產(chǎn)生至少一種等價的免疫反應(yīng)的變體。所提供的組合物包括本發(fā)明的一種多肽并聯(lián)合一種藥學(xué)上可用的載體或稀釋劑。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽或組合物被用于免疫一種溫血動物以對抗與HER-2/neu癌基因相關(guān)的惡性腫瘤。在另一實(shí)施方案中，這種多肽或組成物被用于生產(chǎn)一種用來免疫溫血動物以對抗與HER-2/neu癌基因相關(guān)惡性腫瘤的藥物。
在另一實(shí)施方案中，一種指導(dǎo)本發(fā)明的多肽表達(dá)的核酸分子被用于通過用核酸分子轉(zhuǎn)染溫血動物的細(xì)胞進(jìn)行免疫。在另一實(shí)施方案中，這種核酸分子被用于生產(chǎn)一種用來免疫溫血動物以對抗與HER-2/neu癌基因相關(guān)惡性腫瘤的藥物。
在另一實(shí)施方案中，一種指導(dǎo)本發(fā)明的多肽表達(dá)的病毒載體被用于通過用載體感染溫血動物的細(xì)胞進(jìn)行免疫。在另一實(shí)施方案中，這種病毒載體被用于生產(chǎn)一種用來免疫溫血動物以對抗與HER-2/neu癌基因相關(guān)惡性腫瘤的藥物。
參考下面的詳細(xì)描述和附圖，本發(fā)明的這些和其它方面將變得清楚。
圖的簡要描述

圖1顯示幼稚T細(xì)胞通過樹突狀細(xì)胞由HER-2/neu多肽的致敏結(jié)果。骨髓來源的DC是由CD34+干細(xì)胞通過GM-CSF和IL-6刺激產(chǎn)生。由HER-2/neu刺激的DC在和T細(xì)胞培養(yǎng)7天后誘導(dǎo)自體CD4+/CD45RA+T淋巴細(xì)胞的蛋白質(zhì)特異性增殖。將在含有GM-CSF和IL-6的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)一周的骨髓來源的CD34+干細(xì)胞用作APC。將APC以各種濃度接種于圓底96孔板中(Corning，Corning，NY，USA)并和20-25ug/ml重組HER-2/neu多肽孵育16-18小時。利于免疫親和柱(CellPro，Inc.，Bothell，WA，USA)通過陽性篩選從自體外周血單核細(xì)胞中分離CD4+T淋巴細(xì)胞。對抗原刺激的APC進(jìn)行照射(10Gy)，并以每孔105加入CD4+T淋巴細(xì)胞。通過對在第7天加入(3H)胸苷(1μCi/孔)的16-18小時的攝取量來評價T細(xì)胞的增殖反應(yīng)。在無血清和無細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中5孔平行進(jìn)行增殖檢測。符號代表-●-DC+HER-2/neu多肽+CD4+/CD45RA+T細(xì)胞；-○-DC+CD4+/CD45RA+T細(xì)胞；及-□-DC+HER-2/neu多肽。
圖2顯示CD4+細(xì)胞對HER-2/neu多肽的反應(yīng)。利用對圖1所描述的引發(fā)檢測來測試正常供者的CD4+T細(xì)胞對重組人HER-2/neu多肽的反應(yīng)。符號代表-■-SC+CD4及…◆…SC+CD4+HER-2/neu多肽。“SC”為干細(xì)胞。
圖3顯示用大鼠HER-2/neu多肽免疫的大鼠產(chǎn)生大鼠neu特異性抗體。用25ug在MPL或vacell佐劑中的重組大鼠HER-2/neu多肽免疫大鼠。每隔20天進(jìn)行一次，共給予三次免疫。最后一次免疫后20天評價大鼠對大鼠neu的抗體反應(yīng)。用大鼠HER-2/neu多肽和vaccel佐劑免疫的動物顯示高滴度大鼠neu特異反性。以用人HER-2/neu多肽(外源蛋白)免疫的動物作為對照。在獨(dú)立的試驗(yàn)中，用100ug和300ug純化的全長大鼠neu免疫的大鼠未產(chǎn)生可檢測到的neu特異性抗體(數(shù)據(jù)未示)。數(shù)據(jù)代表3個動物的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。符號代表-■-大鼠HER-2/neu多肽/MPL；…●…大鼠HER-2/neu多肽/vacell；…□…單獨(dú)MPL；…○…單獨(dú)vacell；及… …對照?！癕PL”和“vaccel”為佐劑(Ribi，Bozcman，MT，USA)?！癗eu”為HER-2/neu蛋白。
圖4顯示乳腺癌患者對HER-2/neu多肽有預(yù)存在的免疫性。通過氘化胸苷的摻入在平行的24孔中評價患者PBMC。反應(yīng)孔計高于對照孔的均值和3倍標(biāo)準(zhǔn)差(372cpm)。這種HER-2/neu陽性II期乳腺癌患者對重組人HER-2/neu多肽有顯著的反應(yīng)。符號“p”代表HER-2/neu蛋白的肽，“tt”代表破傷風(fēng)毒素，而“hHNP”代表重組人HER-2/neu多肽。
本發(fā)明的詳細(xì)描述在闡明本發(fā)明前，闡明此后所用的某些術(shù)語的定義可能對其理解有幫助。
HER-2/neu多肽-此中所用的該術(shù)語指具有序列號2中從676位賴氨酸到1255位纈氨酸的氨基酸序列的HER-2/neu蛋白(此蛋白也被稱為p185或c-erbB2)的一部分，并且可天然獲得、合成產(chǎn)生、基因工程生產(chǎn)，或如一個或多個氨基酸被其它氨基酸或非氨基酸取代而并不嚴(yán)重影響對HER-2/neu蛋白免疫反應(yīng)的引發(fā)或增強(qiáng)的功能等價變體(例如，變體通過輔助T細(xì)胞或細(xì)胞毒性T細(xì)胞刺激一種反應(yīng))。
T細(xì)胞的增殖-此中所用的該術(shù)語包括T細(xì)胞的擴(kuò)增和導(dǎo)致擴(kuò)增的對T細(xì)胞刺激，即引起有絲分裂的啟始事件和有絲分裂本身。下面對檢測T細(xì)胞增殖的方法進(jìn)行討論。
如上面提到的，本發(fā)明針對用于引發(fā)或增強(qiáng)對HER-2/neu癌基因表達(dá)蛋白產(chǎn)物、包括對溫血動物中與擴(kuò)增的HER-2/neu基因相關(guān)的惡性腫瘤的免疫性的化合物和組合物。擴(kuò)增的HER-2/neu基因與惡性腫瘤的聯(lián)系并不需要基因的蛋白表達(dá)產(chǎn)物存在于腫瘤上。例如，蛋白表達(dá)產(chǎn)物的過度表達(dá)可能涉及一種腫瘤的發(fā)生，但隨后蛋白的表達(dá)可能消失。本發(fā)明的一個用途是引發(fā)或增強(qiáng)局部的免疫反應(yīng)來將HER-2/neu陽性的腫瘤轉(zhuǎn)變?yōu)镠ER-2/neu陰性。
更具體地，本發(fā)明的公開一方面表明基于HER-2/neu基因蛋白表達(dá)產(chǎn)物的一特定部分的多肽(HER-2/neu多肽)可被胸腺依賴淋巴細(xì)胞(此后為“T細(xì)胞”)識別，因而局部的免疫T細(xì)胞反應(yīng)可被預(yù)防性利用或用來治療這種蛋白正被或已經(jīng)被過度表達(dá)的惡性腫瘤。另一方面，本發(fā)明的公開也表明指導(dǎo)這種肽表達(dá)的核酸分子可被單獨(dú)或在一病毒載體中用以進(jìn)行免疫。
大體上認(rèn)為CD4+T細(xì)胞群在被一特定抗原刺激時通過釋放淋巴因子而發(fā)揮輔助細(xì)胞/誘導(dǎo)細(xì)胞的功能；然而，CD4+細(xì)胞的一個亞群可作為細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)。類似地，認(rèn)為CD8+T細(xì)胞通過直接裂解抗原性靶子發(fā)揮作用；然而，在多種情況下它們可以分泌淋巴因子來提供輔助細(xì)胞或DTH功能。盡管有潛在重疊的功能，CD4和CD8的表型標(biāo)志與識別結(jié)合于I類或II類MHC抗原的肽有關(guān)。在II類或I類MHC情況下遞呈對抗原的識別使得CD4+和CD8+T細(xì)胞對不同抗原或在不同情況下遞呈的相同抗原發(fā)生反應(yīng)。免疫原性肽與II類MHC抗原的結(jié)合最常發(fā)生于被抗原提呈細(xì)胞攝取的抗原。因此，CD4+T細(xì)胞通常識別在腫瘤細(xì)胞外的抗原。相反，在正常情況下，肽對I類MHC的結(jié)合只發(fā)生于存在于胞漿中的和由靶細(xì)胞自己合成的蛋白，而不包括在外環(huán)境中的蛋白。對此的一個例外是外源肽與以高濃度存在于細(xì)胞外的一種精確的I類結(jié)合區(qū)的結(jié)合。因此，CD4+和CD8+T細(xì)胞具有廣泛不同的功能并趨于識別不同的抗原作為一種對抗原的正常停留位點(diǎn)的反映。
如在本發(fā)明中公開的，由HER-2/neu癌基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物的一個多肽部分被T細(xì)胞識別。循環(huán)HER-2/neu多肽降解為肽片段。來自多肽的肽片段結(jié)合于主要組織相容性復(fù)合體(MHC)抗原。通過展示在細(xì)胞表面結(jié)合于MHC抗原的肽和宿主T細(xì)胞對肽與自身MHC抗原的結(jié)合體的識別，HER-2/neu多肽(包括表達(dá)于惡性細(xì)胞表面的)對T細(xì)胞具有免疫原性。T細(xì)胞受體的精確特異性使得單個T細(xì)胞能夠區(qū)別僅有一個氨基酸殘基不同的肽。
在對來自多肽的一個肽片段的免疫反應(yīng)過程中，表達(dá)一種以高親和力結(jié)合于肽-MHC復(fù)合體的T細(xì)胞受體的T細(xì)胞結(jié)合于肽-MHC復(fù)合體，由此被活化并被誘導(dǎo)增殖。在與肽的首次相遇中，少量的免疫T細(xì)胞將分泌淋巴因子、增殖并分化成為效應(yīng)細(xì)胞和記憶T細(xì)胞。初次免疫反應(yīng)發(fā)生在體內(nèi)但難以在體外檢測。由記憶T細(xì)胞隨后再次遇到同一抗原將導(dǎo)致一種更快更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。再次應(yīng)答將發(fā)生在體內(nèi)或體外。體外應(yīng)答通過衡量增殖的程度、細(xì)胞因子產(chǎn)生的程度或再次暴露于抗原的T細(xì)胞群的裂解細(xì)胞活性的產(chǎn)生而易于計量。T細(xì)胞群對一特異抗原反應(yīng)而大量增殖被認(rèn)為指示著對抗原的首次暴露或致敏。
本發(fā)明的化合物大體上包括HER-2/neu多肽或指導(dǎo)這種肽表達(dá)的DNA分子，其中DNA分子可存在于一病毒載體之中。如上面提到的，本發(fā)明的多肽包括序列號2中從676位氨基酸到1255位氨基酸的多肽的變體，它們保持有刺激免疫反應(yīng)的能力。這些變體包括原始多肽的各種結(jié)構(gòu)形式。由于存在可離子化的氨基和羧基基團(tuán)，例如，一種HER-2/neu多肽可能是以一種酸性或堿生鹽的形式或者可能以中性的形式存在。單個氨基酸殘基也可被氧化或還原修飾。
在本發(fā)明范圍中的變體還包括原始的HER-2/neu多肽的一級氨基酸結(jié)構(gòu)通過與其它肽、多肽或者如糖基、脂質(zhì)、磷酸、乙酰基等化學(xué)成分形成共價的或凝集的偶聯(lián)物而被修飾的多肽?？赏ㄟ^例如在氨基酸側(cè)鏈或者在N-末端或C-末端上連接特定功能的基團(tuán)來制備共價衍生物。
本發(fā)明還包括糖基化和未糖基化的HER-2/neu多肽。根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)，在酵母或哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的多肽在分子量和糖基化模式上可能與原始的分子類似或稍有不同。例如，在細(xì)菌如大腸桿菌中編碼多肽的DNA的表達(dá)典型地產(chǎn)生非糖基化的分子。真核蛋白的N-糖基化位點(diǎn)以氨基酸三聯(lián)體Asn-A1-Z為特征，其中A1為除Pro外的任何氨基酸，而Z為Ser或Thr?？赏ㄟ^本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解的技術(shù)如寡核苷酸合成和連接或位點(diǎn)特異性突變技術(shù)制備具有失活的N-糖基化位點(diǎn)的HER-2/neu多肽的變體，它們也屬于本發(fā)明的范圍。另外，N-連接糖基化位點(diǎn)可被加到HER-2/neu多肽中。
本發(fā)明的多肽還包括序列號2多肽的變體(即具有序列號2中676號氨基酸到1255號氨基酸的氨基酸序列的多肽的變體)，它具有因一個或多個缺失、插入、置換或其它修飾而具有與該序列不同的氨基酸序列。在一個實(shí)施方案中，這種變體與天然HER-2/neu多肽具有高度的同源性并保持刺激免疫反應(yīng)的能力。這里所用的“高度的同源性”指可由在中度嚴(yán)格的條件下能夠與同此中編碼序列號2的特定多肽部分的天然DNA序列(即序列號1中的2026到3765位核苷酸)互補(bǔ)的核苷酸序列雜交的DNA序列編碼的氨基酸序列。合適的中度嚴(yán)格的條件包括在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)組成的溶液中預(yù)沖洗；在50℃-65℃、5×SSC條件下雜交過夜；隨后分別用2×、0.5×和0.2×SSC(含有0.1％SDS)在65℃沖洗兩次每次20分鐘。這種雜交的DNA序列也屬于本發(fā)明的范圍。任何這種修飾對HER-2/neu多肽引起免疫反應(yīng)的能力的影響可很容易地測定(例如，用如此中所描述的方法通過分析突變的HER-2/neu多肽誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)的能力)。
一般，可通過多種方法達(dá)到氨基酸置換以提供本發(fā)明的其它變體。例如，首先，可保守地進(jìn)行氨基酸置換；即一個置換氨基酸取代具有相似性質(zhì)的氨基酸以便肽化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠預(yù)期多肽的二級結(jié)構(gòu)和親水性不被嚴(yán)重地改變。大體上，下組的氨基酸代表保守改變(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。一個非保守改變的例子是將一組中的一個氨基酸用另一組中的氨基酸取代。
制備氨基酸置換以產(chǎn)生本發(fā)明的變體的另一方法是在有潛能結(jié)合II類MHC分子(對于CD4+T細(xì)胞反應(yīng))或I類MHC分子(對于CD8+T細(xì)胞反應(yīng))的T細(xì)胞基元中鑒定和取代氨基酸?？赏ㄟ^計算機(jī)分析來鑒定帶有理論上有潛能結(jié)合于II類MHC分子基元的肽片段(HER-2/neu肽的)。例如，可用一種包括幾種設(shè)計用來區(qū)別T細(xì)胞識別的潛在位點(diǎn)的計算機(jī)參數(shù)蛋白質(zhì)序列分析軟件包，T Sites(Feller和de la Cruz，《自然》(Nature)349720-721，1991)。利用兩個搜索參數(shù)(1)由Margalit等描述的AMPHI參數(shù)(Feller和de la Cruz，《自然》349720-721；Margalit等《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)1382213-2229，1987)根據(jù)α-螺旋周期性和雙親性鑒別表位基元；(2)Rothbard和Taylor參數(shù)根據(jù)電荷和極性模型鑒別表位基元(Rothbard和Taylor，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》(EMBO)793-100，1988)。具有兩種基元的片段最適于結(jié)合II類MHC分子。CD8+T細(xì)胞識別結(jié)合于I類MHC分子的肽。Falk等已經(jīng)證明結(jié)合于特異的MHC分子的肽具有可辨的序列基元(Falk等，《自然》351290-296，1991)。通過Edman降解從一種培養(yǎng)細(xì)胞系的HLA-A2.1分子剝離的肽已經(jīng)確定了用于在HLA-A2.1的溝中結(jié)合的一種肽基元(表2，摘自Falk等，supra)。該方法將典型的或普通的HLA-A2.1結(jié)合肽鑒定為帶有在位點(diǎn)2(L)和9(V)上的主要錨定殘基的9個氨基酸。通常的強(qiáng)結(jié)合殘基被鑒定在位點(diǎn)2(M)、4(E、K)、6(V)和8(K)。所鑒定的基元代表許多結(jié)合肽的平均。
HLA-A2.1限制性基元

續(xù)表

按這里定義的所衍生的肽基元并不特別嚴(yán)格。一些HLA-A2.1結(jié)合肽不合有這兩種主要錨定殘基而且在主要錨定殘基兩側(cè)的氨基酸在允許或不允許結(jié)合方面發(fā)揮主導(dǎo)作用。并非每個帶有這里所描述的結(jié)合基元的肽都會結(jié)合，而一些沒有這種基元的肽也會結(jié)合。值得注意的是，這里的HLA-A2.1基元在位于2號和9號殘基上的主要錨定氨基酸之間置有6個氨基酸。
在HER-2/neu多肽中的肽基元鑒定后，可制備保守的或非保守的氨基酸置換。后一類型的置換意在產(chǎn)生一種改進(jìn)的更有效和/或可更廣泛交叉反應(yīng)(MHC多態(tài)性)的多肽。更有效多肽的一個例子是一種象天然多肽一樣以更高的親和力結(jié)合于相同的MHC分子，而不影響T細(xì)胞對天然多肽的特異性識別的多肽?？筛鼜V泛交叉反應(yīng)的多肽的一個例子是一種比天然多肽誘導(dǎo)更廣泛交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答(即結(jié)合更大范圍的MHC分子)的多肽。類似地，定位在肽基元之間和具有間隔區(qū)功能(即不與一種MHC分子或T細(xì)胞受體相互作用)的一個或多個氨基酸可被保守地或非保守地置換。對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說顯然可通過多種檢測包括此中所描述的用于檢測刺激T細(xì)胞識別的能力的那些方法來對含有一個或多個氨基酸置換的多肽測試其有利或不利的免疫學(xué)相互作用。
在本發(fā)明范圍內(nèi)的變體也可以含有或者替代地含有對多肽預(yù)期的免疫學(xué)特性具有最小影響的其它修飾，包括氨基酸的缺失或加入。那些本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會認(rèn)識到可使用HER-2/neu多肽的截短形式或非天然伸展形式，只要其預(yù)期的免疫學(xué)特性至少粗略地與全長的天然HER-2/neu多肽相當(dāng)。半胱氨酸可被刪除或用其它氨基酸取代以阻止在復(fù)性時不正確分子內(nèi)二硫橋連的形成。引起突變的其它方法包括對鄰近的二元氨基酸殘基的修飾以提高在有KEX2蛋白酶活性存在的酵母系統(tǒng)中的表達(dá)。
一般可利用一個編碼HER-2/neu蛋白的基因組或cDNA克隆來獲得HER-2/neu多肽。在序列號1中列出編碼全長HER-2/neu的基因組序列，并且在序列號2中列出推導(dǎo)的氨基酸序列。這些克隆可通過篩選一合適的表達(dá)文庫以尋找表達(dá)HER-2/neu蛋白的克隆而被分離出來。文庫的制備和篩選大體上可利用被本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員了解的方法進(jìn)行，如在Sambrook等《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，N.Y.，1989中所描述的方法，這里并入本文作為參考。簡言之，可將一噬菌體表達(dá)文庫鋪板并轉(zhuǎn)移至濾膜上。然后用一種檢測劑孵育濾膜。在本發(fā)明的情況中，“檢測劑”是任何能夠結(jié)合于HER-2/neu蛋白的化合物，然后可以通過那些本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解的許多方法中的任何方法將其檢測出來。典型的檢測劑含有一種偶聯(lián)有一個報道基團(tuán)的“結(jié)合劑”，如蛋白A、蛋白G、IgG或一種凝集素。優(yōu)選的報道基團(tuán)包括酶、底物、輔助因子、抑制劑、染料、放射性核素、發(fā)光基團(tuán)、熒光基團(tuán)和生物素。報道基團(tuán)更優(yōu)選為可通過與如四甲基聯(lián)苯胺或2，2′-連氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉磺酸的一種底物孵育而進(jìn)行檢測的辣根過氧化物酶。利用那些本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所了解的技術(shù)將含有表達(dá)HER-2/neu蛋白的基因組或cDNA序列的菌斑分離和純化。例如，在Sambrook等《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，N.Y.，1989中可以找到合適的方法。
大體上可通過在上面所描述的一個或多個方面對序列進(jìn)行修飾并對所得多肽檢測刺激免疫反應(yīng)如T細(xì)胞反應(yīng)的能力來鑒定保持有刺激免疫反應(yīng)能力的多肽的變體。例如，大體上可通過用修飾的多肽接觸T細(xì)胞并檢測其反應(yīng)來進(jìn)行這些檢測。例如也可通過篩選帶有一編碼多肽或其變體的DNA序列的cDNA或基因組文庫分離多肽的天然變體。
可用標(biāo)準(zhǔn)的重組技術(shù)或通過被修飾多肽的自動合成引入上面所描述的序列修飾。例如，可通過合成帶有一突變序列的由能夠連接到天然序列片段上的限制性位點(diǎn)作為側(cè)翼序列的寡核苷酸在特異的位點(diǎn)引入突變。在連接后，所得的重建序列編碼一種帶有預(yù)期的氨基酸插入、置換或缺失的類似物。
另外，定向寡核苷酸位點(diǎn)特異性突變方法可被用于提供一根據(jù)所要求的置換、缺失或插入而改變特定密碼子的基因。上面提出的進(jìn)行改變的典型方法由Walder等，《基因》(Gene)42133，1986；Bauer等，《基因》3773，1985；Craik，《生物技術(shù)》(BioTechniques)1985年一月，12-19；Smith等，《遺傳工程原理和方法》(GeneticEngineeringPrinciples and Methods)，Plenum出版社，1981；和U.S.專利4,518,584和4,737,462號公開。
當(dāng)然，在構(gòu)建的用于這種HER-2/neu多肽表達(dá)的核苷酸序列中的突變必須保留編碼序列的閱讀框，并且優(yōu)選不產(chǎn)生能夠雜交以形成二級mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)，如環(huán)或發(fā)夾，這些可能不利地影響mRNA的翻譯。雖然可以預(yù)先確定一個突變位點(diǎn)，但不必預(yù)先確定突變本身的性質(zhì)。例如，為了尋找在一給定位點(diǎn)的突變體的最佳特點(diǎn)，可在靶密碼子上進(jìn)行隨機(jī)突變并對所表達(dá)的HER-2/neu多肽突變體篩選預(yù)期的活性。
并非在編碼HER-2/neu多肽的核苷酸序列中的所有突變在終產(chǎn)物中都將被表達(dá)。例如，可制備核苷酸置換來提高表達(dá)，首要地在被轉(zhuǎn)錄的mRNA中來避免二級結(jié)構(gòu)環(huán)(例如見歐洲專利申請75,444A)，或來提供更易被所選宿主翻譯的密碼子，如已知大腸桿菌優(yōu)先密碼子用于大腸桿菌表達(dá)。
本發(fā)明的多肽不論天然的和修飾的都優(yōu)選通過重組DNA方法制備。這些方法包括在一重組表達(dá)載體中插入一個編碼HER-2/neu多肽的DNA序列，和在一種重組微生物、哺乳動物或昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中在促進(jìn)表達(dá)的條件下表達(dá)該DNA序列。編碼本發(fā)明所提供多肽的DNA序列可由cDNA片段和短的寡核苷酸接頭或由一系列寡核苷酸組裝以提供一個能夠被插入一個重組表達(dá)載體并在一個重組的轉(zhuǎn)錄單位中表達(dá)的合成基因。
重組表達(dá)載體含有一個被可操作地連接到源自哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因的適宜轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)元件上的編碼HER-2/neu多肽的DNA序列。這種調(diào)節(jié)元件包括一個轉(zhuǎn)錄啟動子、一個可有可無的的控制轉(zhuǎn)錄的操縱子序列、一個編碼適宜的mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。另外應(yīng)加入一個復(fù)制起點(diǎn)和一個便于識別轉(zhuǎn)化體的可篩選標(biāo)志。
當(dāng)DNA區(qū)彼此功能上相關(guān)時它們被可操作地連接。例如，如果一種信號肽(分泌性前導(dǎo)序列)的DNA被表達(dá)為一種參與多肽分泌的前體，則將其可操作地連于一種多肽的DNA；如果一個啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，則將其可操作地連于一編碼序列；或如果一個核糖體結(jié)合位點(diǎn)被定位以便允許翻譯，則將其可操作地連于一編碼序列。大體上，可操作地連接意味著毗鄰和在分泌性前導(dǎo)序列情況下意味著在閱讀框中。編碼要在一微生物中表達(dá)的HER-2/neu多肽的DNA序列將優(yōu)選不含有能夠提前終止DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA的內(nèi)含子。
用于細(xì)菌的表達(dá)載體可含有一個可篩選標(biāo)志和由含有所熟知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)的遺傳學(xué)元件的商品化質(zhì)粒衍生來的細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)。例如，這些商業(yè)的載體包括pKK223-3(Pharmacia FineChemicals，Uppsala，Sweden)和pGEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。將這些pBR322“骨架”部分與一種合適的啟動子和所要表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列連接起來。利用pBR322(一種源自大腸桿菌的質(zhì)粒(Bolivar等，《基因》295，1977))的衍生物典型地轉(zhuǎn)化大腸桿菌。pBR322含有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性的基因，因此提供了用于鑒別被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的簡便工具。
在重組微生物表達(dá)載體中通常所用的啟動子包括β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動子系統(tǒng)(Chang等，《自然》275615，1978；和Goeddel等，《自然》281544，1979)、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)(Goeddel等，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)84057，1980；和歐洲專利申請36,776)和tac啟動子(Maniatis，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，412頁，1982)。一種特別有用的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)利用噬菌體λPL啟動子和cI857ts熱不穩(wěn)定阻遏物。從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的連有λPL啟動子衍生物的質(zhì)粒載體包括存在于大腸桿菌JMB9(ATCC 37092)中的質(zhì)粒pHUB2和存在于大腸桿菌RR1(ATCC 53082)中的質(zhì)粒pPLc28。
在酵母載體中合適的啟動子序列包括金屬硫蛋白的、3-磷酸甘油酸激酶的(Hitzeman等，《生物和化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)2552073，1980)或其它糖酵解的酶(Hess等，《高級酶注冊雜志》(J.Adv.Enzyme Reg.)7149，1968；和Holland等，《生物化學(xué)》(Biochem)174900，1978)如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶和葡糖激酶的啟動子。用在酵母表達(dá)中的適宜的載體和啟動子在R.Hitzeman等的歐洲專利申請73,657中有進(jìn)一步描述。
可以利用來自pBR322的用于在大腸桿菌中篩選和復(fù)制的DNA序列(Ampr基因和復(fù)制起點(diǎn))和包括一個葡萄糖可抑制ADH2啟動子和α-因子分泌前導(dǎo)序列的酵母DNA序列來組裝優(yōu)選的酵母載體。ADH2啟動子已經(jīng)由Russell等(《生物學(xué)和化學(xué)雜志》2582674，1982)和Beier等(《自然》300724，1982)描述?？蓪⒅笇?dǎo)異源性蛋白分泌的酵母α-因子前導(dǎo)序列插到啟動子和所要表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因之間(例如見Kurjan等，《細(xì)胞》(Cell)30933，1982；和Bitter等，《美國國家科學(xué)院進(jìn)展》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)815330，1984)。前導(dǎo)序列可被修飾使之在靠近其3′末端處含有一個或多個有用的限制性酶切位點(diǎn)以利于前導(dǎo)序列與外源基因的融合。用于轉(zhuǎn)化脊椎動物細(xì)胞的表達(dá)載體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列可由病毒來源的提供。例如，常用的啟動子和增強(qiáng)子源自多瘤病毒、腺病毒2、猴病毒40(SV40)和人巨細(xì)胞病毒。源自SV40病毒基因組的DNA序列，如SV40起點(diǎn)、早期和晚期啟動子、增強(qiáng)子、剪接和聚腺苷酸化位點(diǎn)可被用于提供表達(dá)一種外源DNA序列所需的其它遺傳學(xué)元件。早期和晚期啟動子因?yàn)槎家子谝砸粋€還含有SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)的片段從病毒獲得而特別有用(Fiers等，《自然》273113，1978)。只要包括從Hind III位點(diǎn)向位于病毒復(fù)制起點(diǎn)的Bgl II位點(diǎn)延伸的大約250bp的序列，則較小或較大的SV40片段也可使用。此外，只要這些控制序列與所選的宿主細(xì)胞相容，則可利用病毒基因組的啟動子、控制和/或信號序列?？砂凑誒kayama和Berg，《分子細(xì)胞生物學(xué)》(Mol.Cell.Biol.)3280，1983所公布的構(gòu)建典型的載體。
可基本按照Cosman等所描述的(《分子免疫學(xué)》(Mol.mmunol.)23935，1986)構(gòu)建一種用于在C127小鼠乳腺上皮細(xì)胞中哺乳動物受體cDNA穩(wěn)定高水平表達(dá)的有效系統(tǒng)。用于表達(dá)LbeIF4A蛋白DNA的一種優(yōu)選的真核載體為pDC406(McMahan等，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》(EMBOJ.)102821，1991)，而且包括源自SV40、人免疫缺陷病毒(HIV)和Epstein-Barr病毒(EBV)的調(diào)節(jié)序列。其它優(yōu)選的載體包括pDC409和pDC410，它們都源自pDC406。pDC410是通過用編碼SV40大T抗原的序列置換EBV復(fù)制起點(diǎn)而從pDC406衍生來。pDC409與pDC406的不同之處在于缺失了一個位于多克隆位點(diǎn)外的Bgl II限制性酶切位點(diǎn)，使得在多克隆位點(diǎn)內(nèi)的Bgl II位點(diǎn)成為單一位點(diǎn)。
一種允許含有EBV復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，如pDC406和pDC409，游離型復(fù)制的有用的細(xì)胞系為CV-1/EBNA(ATCC CRL 10478)。CV-1/EBNA細(xì)胞系是通過用一編碼Epstein-Barr病毒核抗原-I(EBNA-1)的基因轉(zhuǎn)染CV-1細(xì)胞系而獲得，并且組成性地表達(dá)由人CMV立即早期增強(qiáng)子/啟動子驅(qū)動的EBNA-1轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞是已經(jīng)用通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建的含有編碼一種本發(fā)明的HER-2/neu多肽的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以表達(dá)預(yù)期的HER-2/neu多肽，但為了克隆或擴(kuò)增HER-2/neu DNA的目的而轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞不需要表達(dá)HER-2/neu多肽。根據(jù)所選的DNA，表達(dá)的多肽優(yōu)選被分泌到培養(yǎng)上清中，而且也可沉積在細(xì)胞膜上。
用于表達(dá)重組蛋白的合適的宿主細(xì)胞包括在適宜啟動子控制下的原核細(xì)胞、酵母或高等真核細(xì)胞。原核細(xì)胞包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如大腸桿菌或芽胞桿菌。高等真核細(xì)胞包括按照下面的描述建立的昆蟲或哺乳動物起源的細(xì)胞系。利用由DNA結(jié)構(gòu)得來的RNA也可用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)來制備HER-2/neu多肽。例如，用于細(xì)菌、真菌、酵母和哺乳動物細(xì)胞宿主的適宜的克隆和表達(dá)載體由Pouwels等，《克隆載體實(shí)驗(yàn)室指南》(Cloning VectorsA Laboratory Manual)，Elsevier，NewYork，1985描述。
原核表達(dá)宿主可被用于不需要廣泛蛋白酶解和二硫鍵加工的HER-2/neu多肽的表達(dá)。原核表達(dá)載體一般包括一個或多個可篩選的表型標(biāo)志例如編碼傳遞抗生素抗性或提供自養(yǎng)需要的蛋白的基因和一個被宿主識別以保證在宿主內(nèi)擴(kuò)增的復(fù)制起點(diǎn)。雖然也可用其它宿主，但用于轉(zhuǎn)化的合適的原核宿主包括大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鼠傷寒沙門氏菌以及假單胞桿菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬的各種菌。
重組的HER-2/neu多肽也可在酵母宿主中表達(dá)，優(yōu)選來自酵母菌屬如釀酒酵母。還可以用其它屬的酵母如畢赤酵母或克羅維氏酵母屬。酵母載體一般含有一個來自2μ酵母質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)或一個自主復(fù)制序列(ARS)、一個啟動子、編碼HER-2/neu多肽的DNA、用于聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止的序列以及一篩選基因。酵母載體優(yōu)選包括一個復(fù)制起點(diǎn)和允許轉(zhuǎn)化酵母和大腸桿菌的可篩選標(biāo)志，例如大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因和為在色氨酸中不能生長的酵母突變菌株提供了一個篩選標(biāo)志的釀酒酵母的trp1基因，以及源自一高度表達(dá)酵母基因來誘導(dǎo)下游的結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的啟動子。在酵母宿主細(xì)胞基因組中trp1缺損的存在為在缺少色氨酸時通過生長檢測轉(zhuǎn)化提供了有效的環(huán)境。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解合適的酵母轉(zhuǎn)化方法。由Hind等(《美國國家科學(xué)院進(jìn)展》751929，1978)描述的一個典型的技術(shù)涉及在一由0.67％酵母氮堿、0.5％酪蛋白氨基酸、2％葡萄糖、10mg/ml腺嘌呤和20mg/ml尿嘧啶組成的選擇性培養(yǎng)基中篩選Trp+轉(zhuǎn)化體。由含有ADH2啟動子的載體轉(zhuǎn)化的宿主菌株可以在一由1％酵母提取物、2％胨和1％葡萄糖組成的補(bǔ)加80mg/ml腺嘌呤和80mg/ml尿嘧啶的豐富培養(yǎng)基中生長進(jìn)行表達(dá)。在培養(yǎng)基中的葡萄糖耗盡時，ADH2啟動子受到抑制。通過過濾收獲粗制酵母上清并在進(jìn)一步純化前保持在4℃。
也可以利用各種哺乳動物或昆蟲細(xì)胞(如草地夜蛾或粉紋夜蛾)培養(yǎng)系統(tǒng)來表達(dá)重組多肽。例如用于在昆蟲細(xì)胞中制備外源性多肽的桿狀病毒系統(tǒng)由Luckow和Summers，《生物技術(shù)》(Bio/Technology)647，1988綜述。合適的哺乳動物宿主細(xì)胞系的例子包括由Gluzman(《細(xì)胞》(Ce11)23175，1981)描述的猴腎細(xì)胞COS-7細(xì)胞系和能夠表達(dá)一種適宜載體的包括如CV-1/EBNA(ATCC CRL 10478)、L細(xì)胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、COS、NS-1、HeLa和BHK細(xì)胞系的其它細(xì)胞系。哺乳動物表達(dá)載體可含有非轉(zhuǎn)錄元件如一個復(fù)制起點(diǎn)、一個連接到要表達(dá)基因上的合適的啟動子和增強(qiáng)子、和其它5′或3′側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列以及5′或3′非翻譯序列，如必要的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)、剪接供者和受者位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)錄終止序列。
可通過培養(yǎng)合適的宿主/載體系統(tǒng)以表達(dá)本發(fā)明的DNA的重組翻譯產(chǎn)物，然后從培養(yǎng)基或細(xì)胞提取物中將之純化來制備純化的HER-2/neu多肽。例如，取自將重組的多肽分泌入培養(yǎng)基中的系統(tǒng)的上清首先可以用一種商品化的蛋白質(zhì)濃縮濾膜如一種Amicon或Millipore Pellicon超濾單位來濃縮。在濃縮步驟后，濃縮物可被注入一種合適的純化基質(zhì)。例如，一種合適的親和基質(zhì)可能含有一個對應(yīng)的結(jié)構(gòu)蛋白(即基于結(jié)構(gòu)，HER-2/neu多肽以一種特異性的相互作用與之結(jié)合的蛋白質(zhì))或凝集素或結(jié)合于一合適載體的抗體分子。另外，可利用一種陰離子交換樹脂，例如具有側(cè)基二乙氨乙基(DEAE)基團(tuán)的基質(zhì)。基質(zhì)可以為丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或在蛋白質(zhì)純化中常用的其它類型。另外，可以利用一個陽離子交換步驟。合適的陽離子交換劑包括各種含有磺丙基或羧甲基基團(tuán)的不可溶基質(zhì)。優(yōu)選磺丙基基團(tuán)。凝膠過濾層析也提供了一種純化HER-2/neu的方法。
親和層析是一種優(yōu)選的純化HHER-2/neu多肽的方法。例如，通過利用本領(lǐng)域所熟知的方法，抗HER-2/neu多肽的單克隆抗體在親和層析純化中可能也有用。
最后，利用疏水RP-HPLC介質(zhì)(如，具有側(cè)基甲基或其它脂肪族基團(tuán)的硅膠)的一次或多次反相高效液相色譜(RP-HPLC)步驟可被用來進(jìn)一步純化HER-2/neu多肽。一些或所有的前述純化步驟以各種組合也可被用來提供一均質(zhì)的重組多肽。
在細(xì)菌培養(yǎng)中產(chǎn)生的重組HER-2/neu多肽優(yōu)選從細(xì)胞沉淀中通過初次提取來分離，隨后進(jìn)行一個或多個濃縮、脫鹽、水性離子交換或大小排阻層析步驟。高效液相色譜(HPLC)可以用于最后純化步驟?？梢酝ㄟ^任何方便的方法，包括凍溶循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破壞或用細(xì)胞裂解劑來破壞在重組LbeIF4A蛋白表達(dá)中所用的微生物細(xì)胞。
以分泌蛋白形式表達(dá)HER-2/neu多肽的酵母的發(fā)酵大大地簡化了純化。由大規(guī)模發(fā)酵所獲的分泌的重組蛋白可通過與Urdal等(《層析雜志》(J.Chromatog.)296171，1984)公布的那些方法類似的方法來純化。這個參考文獻(xiàn)描述了在一制備性HPLC柱上進(jìn)行重組人GM-CSF純化的兩個順序的反相HPLC步驟。
在重組培養(yǎng)中合成的HER-2/neu多肽制備物可能含有依所采取的用來從培養(yǎng)中回收HER-2/neu的純化步驟所定的數(shù)量和特點(diǎn)的非HER-2/neu的細(xì)胞成分，包括蛋白質(zhì)。這些成分通常是酵母、原核細(xì)胞或非人真核細(xì)胞來源的。這些制備典型地不含有在HER-2/neu蛋白來源的物種中天然發(fā)現(xiàn)它時可能與它正常相連的其它蛋白質(zhì)。
自動合成為制備本發(fā)明的多肽提供了另一種方法。例如，可以利用任何商品化的固相技術(shù)如Merrifield固相合成方法，其中氨基酸被順序地加至一延伸的氨基酸鏈(見Merrifield，《美國化學(xué)會雜志》(J.Am.Chem.Soc.)852149-2146，1963)。用于多肽自動合成的設(shè)備由供應(yīng)商如Applied Biosystem，Inc.of Foster City，CA商業(yè)性提供，并且大體上可按制造商的指令來操作。
在本發(fā)明的一個方面中，可以檢測到用一種HER-2/neu多肽(或指導(dǎo)該多肽表達(dá)的DNA分子)來產(chǎn)生對HER-2/neu蛋白(包括表達(dá)在與HER-2/neu癌基因相關(guān)的惡性腫瘤表面的HER-2/neu蛋白)的免疫反應(yīng)。這些惡性腫瘤的代表性例子包括乳腺癌、卵巢癌、直腸癌、肺癌和前列腺癌。一旦通過HER-2/neu多肽產(chǎn)生了一種對HER-2/neu蛋白的免疫反應(yīng)，這種免疫反應(yīng)變能夠長期存在，并且在免疫后的很長時間仍能檢測到，而不論在檢測時體內(nèi)是否存在或缺乏該蛋白。一種經(jīng)與HER-2/neu多肽反應(yīng)而產(chǎn)生的對HER-2/neu蛋白的免疫反應(yīng)可以通過測試CD4+或CD8+T細(xì)胞的特異性活化的存在或不存在或增強(qiáng)來檢測。更特別的是，將利用常規(guī)技術(shù)(如通過外周血淋巴細(xì)胞的Ficoll/Hypaque密度梯度離心)從一被免疫的個體分離的T細(xì)胞與HER-2/neu蛋白孵育。例如，可在體外37℃用HER-2/neu蛋白(典型地是5ug/ml的全蛋白或分級數(shù)量的合成HER-2/neu蛋白的細(xì)胞)孵育T細(xì)胞2-9天(典型地4天)。最好在缺少HER-2/neu蛋白的情況下孵育另一份T細(xì)胞樣品作為對照。
可以多種方式檢測CD4+或CD8+T細(xì)胞的特異性活化。用于檢測特異性T細(xì)胞活化的方法包括T細(xì)胞增殖檢測、細(xì)胞因子(例如淋巴因子)的產(chǎn)生或溶細(xì)胞活性的產(chǎn)生(即特異性針對HER-2/neu蛋白的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的產(chǎn)生)。對于CD4+T細(xì)胞，用于檢測特異性T細(xì)胞活化的一種優(yōu)選的方法是檢測T細(xì)胞的增殖。對于CD8+T細(xì)胞，用于檢測特異性T細(xì)胞活化的一種優(yōu)選的方法是檢測溶細(xì)胞活性的產(chǎn)生。
T細(xì)胞增殖的檢測可以通過許多已知的技術(shù)來完成。例如，可以通過測定DNA合成率檢測T細(xì)胞的增殖。已被刺激增殖的細(xì)胞表現(xiàn)出增加的DNA合成率。例如測定DNA合成率的一個典型的方法是通過用氚化胸苷(一種摻入新合成DNA的核苷酸前體)脈沖標(biāo)記培養(yǎng)T細(xì)胞。摻入的氚化胸苷的量可用一個液體閃爍分光光度計測定。檢測T細(xì)胞增殖的其它方法包括測定白細(xì)胞介素-2(IL-2)產(chǎn)生的增長、Ca2+流或染料攝取，如3-(4，5-二甲基噻唑-2-y1)-2，5-二苯基-四唑。另外，可測定淋巴因子(如γ干擾素)的合成或者可以定量能對完整p185HER-2/neu蛋白發(fā)生反應(yīng)的T細(xì)胞的相對數(shù)。
通過利用或表達(dá)HER-2/neu多肽，識別HER-2/neu蛋白的T細(xì)胞能夠在體內(nèi)增殖。例如，一種用HER-2/neu肽來進(jìn)行免疫的藥物(即如一種疫苗)可以誘導(dǎo)用于治療性攻擊抗HER-2/neu癌基因相關(guān)腫瘤所必需的T細(xì)胞在數(shù)量上的持續(xù)擴(kuò)增。典型地，通過皮內(nèi)、皮下或靜脈內(nèi)途徑給予大約0.01ug/kg到大約100mg/kg體重。一個優(yōu)選的劑量是大約1ug/kg到1mg/kg，特別優(yōu)選大約5ug/kg到200ug/kg。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說顯然給藥的數(shù)量和頻率應(yīng)依患者的反應(yīng)而定。理想的是反復(fù)地給予HER-2/neu多肽。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說顯然可以同時或順序地給予一種以上的HER-2/neu多肽。優(yōu)選的用在進(jìn)行免疫的藥物中的肽是那些包括序列號2中從大約在676號氨基酸位點(diǎn)上的賴氨酸殘基開始并延伸到大約在1255號氨基酸位點(diǎn)上的纈氨酸殘基的氨基酸序列的肽。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到，本發(fā)明考慮使用一種完整的HER-2/neu多肽和將該多肽分裂而成的多種肽。完整的p185HER-2/neu蛋白和具有其完整細(xì)胞外區(qū)的氨基酸序列的肽(即一種具有序列號2中從氨基酸位點(diǎn)1到氨基酸位點(diǎn)650的氨基酸序列的，加上或減去大約1到5個位點(diǎn)，并帶有或沒有前面21個氨基酸位點(diǎn)的肽)都未單獨(dú)用于免疫。
優(yōu)選將HER-2/neu多肽(或核酸)配制成用于上述方法中的一種藥物組合物(如疫苗)。藥物組合物大體上含有聯(lián)合一種藥學(xué)可用的載體、賦形劑或稀釋劑的一種或多種多肽。這些載體在所用的劑量和濃度下應(yīng)對受者無毒。也考慮與化療藥聯(lián)合應(yīng)用一種EER-2/neu多肽。
除了HER-2/neu多肽外(發(fā)揮抗原的功能)，理想的是在疫苗中包括其它成分如抗原傳遞載體和設(shè)計用于提高蛋白質(zhì)免疫原性的免疫刺激物。用于抗原傳遞的載體的例子包括鋁鹽、油包水乳劑、生物可降解油載體、水包油乳劑、生物可降解微囊和脂質(zhì)體。免疫刺激物(佐劑)的例子包括N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸-D-異谷氨酰胺(MDP)、脂多糖(LPS)、葡聚糖、IL-12、GM-CSF、γ-干擾素和IL-15。對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，顯然可合成制備或天然獲得用于疫苗的HER-2/neu多肽。
盡管在本發(fā)明的藥物組合物中可以使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所了解的任何合適的載體，但載體的類型根據(jù)給藥的方式和是否需要持續(xù)的釋放而變化。對于非腸道給藥，如皮下注射，載體優(yōu)選包括水、鹽水、酒精、脂肪、蠟或緩沖液。對于口服給藥，可以使用上述的任何載體或一種固體載體，如甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂。生物可降解微球(例如聚乳糖半乳糖苷)也可用作本發(fā)明藥物組合物的載體。例如，合適的生物可降解微球在美國專利號4,897,268和5,075,109中被公開。HER-2/neu多肽可被包在生物可降解微球中或連接在微球的表面。例如，在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，將具有序列號2中從676號氨基酸到l255號氨基酸的氨基酸序列的多肽包在一種生物可降解微球中。在這點(diǎn)上，微球優(yōu)選大于大約25微米。
藥物組合物(包括疫苗)還可含有稀釋劑如緩沖液、抗氧化劑如抗壞血酸、低分子量(少于大約10個殘基)多肽、蛋白質(zhì)、氨基酸、碳水化合物包括葡萄糖、蔗糖或糊精、螯合劑如EDTA、谷胱甘肽以及其它穩(wěn)定劑和賦形劑。中性緩沖鹽水或與非特異的血清白蛋白混合的鹽水是典型適宜的稀釋劑。優(yōu)選利用適宜的賦形劑溶液(如蔗糖)作為稀釋劑將產(chǎn)物制成一種凍干物。
作為HER-2/neu多肽提呈的一種替換物，本發(fā)明包括能夠傳遞編碼一種HER-2/neu多肽的核酸分子的組合物。這些組合物包括重組病毒載體(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒(見WO 90/07936，WO 91/02805，WO 93/25234，WO93/25698和WO 94/03622)、腺病毒(見Berkner，《生物技術(shù)》(Biotechniques)6616-627，1988；Li等，《人基因治療》(Hum.Gene Ther.)4403-409，1993；Vincent等，《自然遺傳學(xué)》(Nat.Genet.)5130-134，1993；和Kolls等，《美國國家科學(xué)院進(jìn)展》91215-219，1994)、痘病毒(見美國專利4,769,330號；美國專利5,017,487號；和WO 89/01973))、裸DNA(見WO 90/11092)、復(fù)合到一種聚陽離子分子上的核酸分子(見WO 93/03709)和結(jié)合于脂質(zhì)體的核酸(見Wang等，《美國國家科學(xué)院進(jìn)展》847851，1987)。在某些實(shí)施方案中，可將DNA連接至被殺死或滅活的腺病毒(見Curiel等，《人基因治療》3147-154，1992；Cotton等《美國國家科學(xué)院進(jìn)展》896094，1992)。其它合適的組合物包括DNA-配體結(jié)合體(見Wu等，《生物學(xué)和化學(xué)雜志》26416985-16987，1989)和脂質(zhì)-DNA結(jié)合體(見Felgner等，《美國國家科學(xué)院進(jìn)展》847413-7417，1989)。另外，通過將DNA包被在生物可降解珠表面可提高裸DNA被攝入細(xì)胞的效率。
除了直接體內(nèi)方法，可以利用離體方法，在這個方法中細(xì)胞從一個動物體內(nèi)取出、修飾并植入同一個或另一個動物。顯然，在離體方法中可以利用任何上面提到的組合物來將HER-2/neu核酸分子引入組織細(xì)胞。病毒的、物理的和化學(xué)的攝取方法是本領(lǐng)域眾所周知的。
相應(yīng)地，本發(fā)明在患者或細(xì)胞培養(yǎng)中用于提高或引發(fā)一種細(xì)胞免疫反應(yīng)(如，抗原特異性溶細(xì)胞T細(xì)胞的產(chǎn)生)是有效的。本文所用術(shù)語“患者”指任何溫血動物，優(yōu)選為人?；颊呖梢曰加邪┌Y，如乳腺癌，或者可以正常(即，沒有可檢測的疾病或感染)。“細(xì)胞培養(yǎng)”是任何T細(xì)胞或被分離的成分細(xì)胞(包括但不限于巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)的制備物。這些細(xì)胞可通過被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的許多技術(shù)中的任何技術(shù)來(如Ficoll-hypaque密度梯度離心)分離。細(xì)胞可以(但不需要)從患有HER-2/neu相關(guān)惡性腫瘤的患者分離，并在處理后可被重新引入患者。
本發(fā)明還揭示HER-2/neu多肽除了對T細(xì)胞有免疫原性外，似乎刺激B細(xì)胞產(chǎn)生能夠識別HER-2/neu多肽的抗體。在包括血清和腹水的多種體液中可發(fā)現(xiàn)對HER-2/neu蛋白的特異性抗體(即表現(xiàn)一種大約107升/摩爾或更好的結(jié)合親和力)。簡言之，一種體液標(biāo)本是從一溫血動物如人分離的，意在確定HER-2/neu多肽的特異性抗體是否存在。將體液和HER-2/neu多肽在一些條件下孵育并持續(xù)一段足以允許在多肽和針對蛋白的特異性抗體之間形成免疫復(fù)合物的時間。例如，可以將一種體液和HER-2/neu多肽在4℃孵育24-48小時。孵育后，檢測反應(yīng)混合物中免疫復(fù)合物的存在。通過多種已知的技術(shù)如放射免疫分析(RIA)和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)進(jìn)行在HER-2/neu多肽和針對HER-2/neu多肽的特異性抗體之間所形成的一種或多種免疫復(fù)合物的檢測。
合適的免疫檢測法包括David等的雙單克隆抗體夾心免疫測定技術(shù)(美國專利4,376,110)；單克隆-多克隆抗體夾心測定法(Wide等，Kirkham和Hunter編，《放射免疫分析方法》(RadioimmunoassayMethods)，E.and S.Livingstone，Edinburgh，1970)；Gordon等的“蛋白質(zhì)印跡”方法(美國專利4,452,901)；標(biāo)記配體的免疫沉淀(Brown等，《生物學(xué)和化學(xué)雜志》2554980-4983，1980)；由例如Raines和Ross所描述的酶聯(lián)免疫吸附測定(《生物學(xué)和化學(xué)雜志》2575154-5160，1982)；包括使用熒光染料的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(Brooks等，《臨床試驗(yàn)免疫學(xué)》(Clin.Exp.Immunol.)39477，1980)；和活性的中和作用〔Bowen-Pope等，《美國國家科學(xué)院進(jìn)展》812396-2400(1984)〕，所有這些全部并入本文作為參考。除了上面描述的免疫檢測法，許多其它的免疫檢測法也可用，包括那些在美國專利號3,817,827；3,850,752；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；和4,098,876中所描述的方法，所有這些全部并入本文作為參考。
為了測定的目的，HER-2/neu多肽(“抗原”)可以是標(biāo)記的或非標(biāo)記的。當(dāng)為非標(biāo)記的時，抗原用在凝集檢測法中。另外，非標(biāo)記的抗原可以和與免疫復(fù)合物有反應(yīng)的標(biāo)記的分子聯(lián)合使用，或者和與針對HER-2/neu多肽的抗體有反應(yīng)的標(biāo)記的抗體(二抗)如特異性針對免疫球蛋白的抗體聯(lián)合使用?；蛘?，可以直接標(biāo)記抗原。在所標(biāo)記的之處，報道基團(tuán)可以包括放射性同位素、熒光團(tuán)、酶、發(fā)光物或染料顆粒。這些和其它的標(biāo)記在本領(lǐng)域中是眾所周知的并且被描述，例如在下列的美國專利3,766,162；3,791,932；3,817,837；3,966,345；和4,233,402中。
典型地在一個ELISA檢測中，抗原被吸附于微量滴定孔的表面。然后用一種合適的試劑如牛血清白蛋白(BSA)、熱滅活正常山羊血清(NGS)或BLOTTO(也含有一種防腐劑、鹽和一種消泡劑的脫脂奶粉的緩沖溶液)來阻斷在表面殘留的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。然后用一可疑含有特異性抗體的標(biāo)本對加樣孔進(jìn)行孵育。標(biāo)本可以利用純凈的，或者，更常用的是，它通?？杀幌♂層谝环N含有少量(0.1％-5.0％重量)蛋白質(zhì)如BSA、NGS或BLOTTO的緩沖溶液中。在孵育一段允許發(fā)生特異性結(jié)合的足夠長的時間后，沖洗加樣孔移走未結(jié)合的蛋白質(zhì)，然后用由一報道基團(tuán)標(biāo)記的抗種特異性免疫球蛋白抗體孵育。報道基團(tuán)可以選自多種酶，包括辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶和葡萄糖氧化酶。允許孵育足夠長的時間以便產(chǎn)生特異性結(jié)合，然后再一次沖洗加樣孔來移走未結(jié)合的偶聯(lián)物，并加入酶的底物。進(jìn)行成色反應(yīng)，并目測或用儀器測定加樣孔中內(nèi)容物的光密度。
在本發(fā)明該方面的一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，將一種報道基團(tuán)結(jié)合于HER-2/neu蛋白。檢測免疫復(fù)合物的步驟包括基本除去任何未結(jié)合的HER-2/neu蛋白，然后檢測報道基團(tuán)的存在或不存在。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，將一種報道基團(tuán)結(jié)合于一種能夠與特異性針對HER-2/neu蛋白的抗體結(jié)合的二抗。檢測免疫復(fù)合物的步驟包括(a)基本除去任何未結(jié)合的抗體，(b)加入二抗，(c)基本除去任何未結(jié)合的二抗，然后(d)檢測報道基團(tuán)的存在或不存在。特異性針對HER-2/neu蛋白的抗體源自人，二抗是抗人抗體的抗體。
在用于檢測免疫復(fù)合物的第三個優(yōu)選的實(shí)施方案中，將一種報道基團(tuán)結(jié)合于一種能夠與免疫復(fù)合物結(jié)合的分子。檢測的步驟包括(a)加入該分子，(b)基本除去任何未結(jié)合的分子，然后(c)檢測報道基團(tuán)的存在或不存在。一個能夠結(jié)合于免疫復(fù)合物的分子的例子是蛋白A。
對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在本發(fā)明中顯然可以使用多種檢測免疫復(fù)合物的方法。適于在任何方法中使用的報道基團(tuán)包括放射性同位素、熒光團(tuán)、酶、發(fā)光物和染料顆粒。
在本發(fā)明的一個相關(guān)方面，對于在HER-2/neu多肽和體液中特異性針對HER-2/neu多肽的抗體之間所形成的免疫復(fù)合物的檢測可以用于對與HER-2/neu癌基因相關(guān)的惡性腫瘤監(jiān)測，包括HER-2/neu多肽的癌癥治療的效果。可以通過上面所描述的方法對在治療前和治療開始后從個體所取的體液標(biāo)本進(jìn)行免疫復(fù)合物的分析。簡言之，將在兩種標(biāo)本中所檢測的免疫復(fù)合物的量進(jìn)行比較。第二個標(biāo)本(治療開始后)中在免疫復(fù)合物數(shù)量上相對于第一個標(biāo)本(治療前)的巨大變化反映成功的治療。
提供下面的實(shí)施例以求說明而不是為了限定。
實(shí)施例實(shí)施例1重組人HER-2/neu多肽的表達(dá)和純化通過PCR方法利用額外地在5′端引入一個BssH II限制性酶切位點(diǎn)和一個腸激酶蛋白酶位點(diǎn)以及在3′端引入一個EcoR I位點(diǎn)的寡核苷酸引物從按照Di Fiore等(King等，《科學(xué)》(Science)229974-976，1985；Di Fiore等，《科學(xué)》237178-182，1987)制備的質(zhì)粒中回收人HER-2/neu多肽(如，美國專利4,683,195；4,683,202；4,800,159號)。5′端引物為5′-TCTGGCGCGCTGGATGACGATGACAAGAAACGACGGCAGCAGAAGATC-3′(序列號3)，而3′端引物為5′-TGAATTCTCGAGTCATTACACTGGCACGTCCAGACCCAG-3′(序列號4)。將所獲的1.8kb PCR片段亞克隆到來自Novagen(Madison，WI，USA)的T-載體中，并用重疊測序引物在ABI 373自動DNA測序儀(Applied Biosystem Inc.，F(xiàn)oster City，CA，USA)上測定所篩選的克隆的序列。然后將具有與公布的人HER-2/neu cDNA的DNA序列(序列號1；Coussens等，《科學(xué)》2301132，1985；Yamamoto等，《自然》319230，1986)一致的序列的PCR片段經(jīng)BssH II位點(diǎn)以正確的閱讀框架連接至一個修飾過的大腸桿菌硫氧還蛋白還原酶上。將一個在所表達(dá)融合蛋白的Ni-NTA親和純化中所用的6X組氨酸親和標(biāo)志物摻入硫氧還蛋白還原酶融合伙伴中。為了在大腸桿菌中表達(dá)，將這種trxA-人HER-2/neu多肽融合蛋白的cDNA亞克隆至一個修飾過的pET表達(dá)載體中。
雖然硫氧還蛋白還原酶被報道可以使其它在大腸桿菌中表達(dá)的異源蛋白穩(wěn)定和可溶，但它對人HER-2/neu多肽在大腸桿菌中的表達(dá)似乎沒有提供任何顯著的好處。雖然有顯著比例的trxA-HER-2/neu多肽融合蛋白是可溶的，但大部分都表達(dá)在包涵體中。在大腸桿菌中表達(dá)的過程中，融合蛋白也遭到降解。然而，硫氧還蛋白還原酶融合伙伴的存在可以在純化過程中使蛋白穩(wěn)定。針對硫氧還蛋白還原酶的單克隆抗體的可用性在純化過程中為追蹤提供了一種方便的標(biāo)志物。
為純化人HER-2/neu多肽和含有6XHis親和標(biāo)志物的硫氧還蛋白還原酶融合伙伴，用蛋白酶抑制劑和溶菌酶重懸大腸桿菌沉淀并用超聲波處理。通過離心分離包涵體，并用脫氧膽酸鹽洗滌3次，最后一次洗滌過夜以除去LPS。為進(jìn)行Ni純化將洗滌過的包涵體溶于GuHCl。在尿素中用咪唑洗脫Ni柱并以pH8的10mM Tris透析。利用這種方法回收的HER-2/neu多肽是以被降解的蛋白為主要污染物的80％-95％純的全長蛋白。從500ml發(fā)酵液中回收20mg。它含有大于98％的HER-2/neu多肽。這里所用的技術(shù)為本領(lǐng)域的人員所熟知，并在例如J.Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，1989，冷泉港，美國紐約)中被描述。
實(shí)施例2樹突狀細(xì)胞可以遞呈人HER-2/neu多肽A.來自骨髓的DC培養(yǎng)物的產(chǎn)生DC培養(yǎng)物由CD34+造血祖細(xì)胞(HPC)產(chǎn)生。用細(xì)胞分離系統(tǒng)CeprateLC試劑盒(CellPro，Bothell，WA，USA)從正常供者的骨髓中分離CD34+細(xì)胞。通過流式細(xì)胞術(shù)分析確定回收的CD34+細(xì)胞的純度為80％到95％。將CD34+細(xì)胞培養(yǎng)于補(bǔ)充有L-谷氨酰胺(584ug/l)、青霉素(10IU/ml)、鏈霉素(100ug/ml)、100ng/ml人rGM-CSF和50ng/ml人rIL-6的無血清培養(yǎng)基(X-VIVO 10，Biowhittaker，Inc.，Walkersville，MD，USA)中。在培養(yǎng)0到17天后，收獲細(xì)胞并用于表型檢測和T細(xì)胞刺激測試。已經(jīng)報道單獨(dú)GM-CSF和與IL-4或TNFα聯(lián)合使用誘導(dǎo)DC的體外生長。在用KLH和OVA作為抗原來致敏幼稚T細(xì)胞的試驗(yàn)中，與GM-CSF加IL-4或TNFα相比GM-CSF加IL-6持續(xù)產(chǎn)生一種類似的總刺激但卻具有較低的本底因而具有較高的刺激指數(shù)。
B.T細(xì)胞致敏測試將在含有GM-CSF和IL-6的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的骨髓來源的CD34+HPC經(jīng)0-17天培養(yǎng)后用作APC。DC的致敏能力是通過將它們與自體的幼稚T淋巴細(xì)胞在蛋白抗原重組人HER-2/neu多肽(hHNP)(10ug/ml)存在或不存在的條件下培養(yǎng)來檢測的。利用免疫親和柱(CellPro，Inc.，Bothell，WA，USA)通過陽性選擇法從外周血單核細(xì)胞中分離CD4+T淋巴細(xì)胞。用一種直接偶聯(lián)至FITC(Immunotech，Westbrook，ME，USA)的抗CD45RA mAb通過流式細(xì)胞術(shù)分選法從CD4+T淋巴細(xì)胞中篩選CD4+CD45RA+(幼稚)T淋巴細(xì)胞。所獲CD4+CD45RA+T細(xì)胞的純度為99％。將DC培養(yǎng)物以各種濃度接種于圓底96孔板(Corning，Corning，NY，USA)中并與10ug/ml終濃度的hHNP孵育16-18小時。將抗原刺激的DC照射(10Gy)，并加入自體CD4+CD45RA+T淋巴細(xì)胞(5×104/孔)。通過對在第6天加入的(3H)胸苷(1uCi/孔)的16-18小時攝取量來測定T細(xì)胞的增殖反應(yīng)。在無血清和無細(xì)胞因子培養(yǎng)液中進(jìn)行增殖檢測。結(jié)果顯示在圖1中。圖2顯示來自一個正常供者的CD4+T細(xì)胞對hHNP的反應(yīng)的測試結(jié)果。用取自10個正常個體中的9個的T細(xì)胞獲得類似的數(shù)據(jù)。
實(shí)施例3檢測低頻數(shù)淋巴細(xì)胞前體的測試法3種測試法可用于檢測CD4+反應(yīng)一種標(biāo)準(zhǔn)的增殖測試法、一種低頻數(shù)事件篩選方法和一種有限稀釋測試法(LDA)。傳統(tǒng)的增殖測試法能夠很容易地檢測致敏反應(yīng)。增殖反應(yīng)刺激指數(shù)提供了一種與抗原反應(yīng)性T細(xì)胞的前體頻數(shù)的粗略的相關(guān)性。由PBL檢測到的任何特異性增殖反應(yīng)被認(rèn)為是一種致敏反應(yīng)。
為了提供一種對CD4+T細(xì)胞反應(yīng)的更定量化的解釋，使用一種用于檢測低淋巴細(xì)胞前體頻數(shù)反應(yīng)而發(fā)展的測試系統(tǒng)(下面描述的)。這種測試簡單而且經(jīng)濟(jì)有效。在需要更精確的條件下，通過有限稀釋測試法證實(shí)前體的頻數(shù)(Bishop和Orosz，《移植》(Transplantation)47671-677，1989)。
比在正常個體中所檢測到的反應(yīng)更強(qiáng)烈的反應(yīng)被定義為一種致敏反應(yīng)，并且它表明存在的免疫力。只有通過LDA條件才可檢測到的低的反應(yīng)被認(rèn)為是未致敏的反應(yīng)。通過LDA而無反應(yīng)或一種比通過正常群體分析所定義的反應(yīng)低的反應(yīng)被認(rèn)為是耐受/無反應(yīng)。
大體上，可以通過傳統(tǒng)的增殖測試法來檢測致敏的CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，而用同樣的方法則無法檢測未致敏的反應(yīng)。包括對自身MHC抗原的自身混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(AMLR)加上對加工過的自身血清蛋白和外源加入的血清蛋白的反應(yīng)在內(nèi)的復(fù)雜的本底胸苷攝取量限制了對少量未致敏T細(xì)胞的檢測。
為了引發(fā)和檢測未致敏T細(xì)胞，利用了一種基于Poisson取樣統(tǒng)計的低頻數(shù)反應(yīng)測試系統(tǒng)(于Pinnacles，Chiron Corporation，11-2，1991)。這種類型的分析特異性地用于低頻事件，其中如果前體頻數(shù)低于在一個重復(fù)培養(yǎng)中的細(xì)胞數(shù)，則需要許多重復(fù)來檢測一種統(tǒng)計學(xué)上顯著的陽性數(shù)量。理論上，該測試法可通過設(shè)立一個已知的陽性對照(如PHA或破傷風(fēng)類毒素)和已知的陰性對照(無抗原)并不考慮它們屬于哪個實(shí)驗(yàn)組評價從最低到最高的所有數(shù)據(jù)點(diǎn)來糾正自身反應(yīng)。基于等式截斷值＝M+(F+SD)計算截斷值，其中M＝算術(shù)均數(shù)，F(xiàn)＝3.29，一種來自所選標(biāo)準(zhǔn)化的正態(tài)分布表中的參數(shù)使在截斷值以上不超過0.1％的正態(tài)分布本底的“真陰性”，而SD＝標(biāo)準(zhǔn)差。在這種篩選測試法中，在截斷值以上的加樣孔被認(rèn)為是可能含有一個對抗原的刺激發(fā)生特異性增殖的淋巴細(xì)胞的真陽性。雖然用這種方法對淋巴細(xì)胞前體頻數(shù)進(jìn)行估計是可能的，但精確的測定需要正規(guī)的LDA分析。
實(shí)施例4HER-2/neu多肽為基礎(chǔ)的疫苗引起對HER-2/neu蛋白的免疫A.動物在本研究中所用的大鼠為Fischer系344(CDF(F-344)/CrlBR)(Charles River實(shí)驗(yàn)室，Portage MI)。將動物在華盛頓大學(xué)的動物實(shí)驗(yàn)室于無特異性病原體條件下飼養(yǎng)，并在3和4個月月齡之間常規(guī)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。
B.免疫用在多種佐劑(MPL，Vaccel；Ribi，Bozeman，MT，USA)中的重組大鼠HER-2/neu多肽(rHNP)免疫Fischer大鼠。在皮下給動物注射50ug與佐劑混合的rHNP。20天后將50ug rHNP以同樣的方式給藥，對動物用第二次免疫來加強(qiáng)。20天后測試加強(qiáng)免疫的動物中針對大鼠HER-2/neu蛋白(neu)的抗體的存在。
C.細(xì)胞系利用2個細(xì)胞系作為neu蛋白的來源。將SKBR3，一種顯著過度表達(dá)HER-2/neu的乳腺癌細(xì)胞系(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD)維持在10％胎牛血清(FBS)(Gemini Bioproducts，Inc.，Calabasas，CA)和RPMI的培養(yǎng)物中。DHFR-G8，一種用cneu-p和pSV2-DHFR共轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞系(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD)被用作非轉(zhuǎn)化大鼠neu蛋白的來源(Bernards等，《美國國家科學(xué)院進(jìn)展》846854-6858，1987)。將該細(xì)胞系維持在10％FBS和含有4.5g/L葡萄糖的Dulbecco′s改良的Eagle′s培養(yǎng)基中。DHFR-G8細(xì)胞在每3次傳代時用加有0.3μM氨甲蝶呤的相同的培養(yǎng)基傳代來維持neu轉(zhuǎn)染子。
D.細(xì)胞裂解液的制備制備SKBR3和DHFR-G8的裂解液，并將之用作neu蛋白的來源。簡言之，制備一種由tris堿、氯化鈉和Triton-X(1％)pH7.5組成的裂解緩沖液。加入蛋白酶抑制劑抑蛋白酶(1ug/ml)、苯甲脒(1mM)和PMSF(1mM)。用1ml裂解緩沖液懸浮107細(xì)胞。將細(xì)胞每10分鐘旋振15秒持續(xù)1小時直至被裂解。所有的步驟均在一個4℃房間中于冰上進(jìn)行。裂解后4℃微離心細(xì)胞20分鐘。從細(xì)胞碎片中移走上清，并以小份儲存于-70℃?zhèn)溆?。通過蛋白質(zhì)印跡分析確定在裂解液中人和大鼠neu的存在。E.ELISA檢測大鼠neu抗體反應(yīng)將96孔Immulon 4板(Baxter SP，Redmond，WADynatechLaboratorie)于4℃用在碳酸鹽鹽緩沖液(等摩爾濃度的Na2CO3和NaHCO3，pH9.6)中稀釋的濃度為10ug/ml的大鼠neu特異性單克隆抗體孵育過夜。孵育后，在室溫用PBS-1％BSA(Sigma Chemical，St.Louis，MO，USA)100ul/孔將所有加樣孔封閉3小時，用PBS-0.5％Tween沖洗培養(yǎng)板并在交替的行中加入一種大鼠neu蛋白的來源DHFR-G8，一種用大鼠neu DNA轉(zhuǎn)染的小鼠細(xì)胞系(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD，USA)，的裂解液。將培養(yǎng)板于4℃孵育過夜。然后用PBS-0.5％Tween沖洗培養(yǎng)板并以下列的稀釋度1∶25到1∶200加入實(shí)驗(yàn)血清。將血清稀釋于PBS-1％BSA-1％FBS-25ug/ml小鼠IgG-0.01％NaN3中然后序列地稀釋于PBS-1％BSA。在每孔加入50ul稀釋的血清并于室溫孵育1小時。將每種實(shí)驗(yàn)血清加入含有和不含有大鼠neu的加樣孔中。將羊抗大鼠IgF(ab′)2辣根過氧化物酶(HRP)在PBS-1％BSA中以1∶5000稀釋度加入加樣孔并于室溫孵育45分鐘(Amersham Co，Arlington Heights，1L，USA)。經(jīng)最后沖洗后，加入TMB(Kirkegaard and Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)顯色試劑。在450nm的光密度下讀取成色反應(yīng)。以大鼠neu包被的加樣孔的OD減去PBS-1％BSA包被的加樣孔的OD計算每種血清稀釋度的OD。也以類似的方式評價來源于單獨(dú)用佐劑免疫的動物和用hHNP(外源蛋白)免疫的動物的血清。結(jié)果顯示在圖3中。
F.T細(xì)胞增殖測試為測試HER-2/neu多肽特異性反應(yīng)通過機(jī)械破碎和線網(wǎng)過濾以及洗滌來收獲新鮮的脾和淋巴結(jié)細(xì)胞。將2×105脾細(xì)胞/孔和1×105淋巴結(jié)細(xì)胞/孔以每個實(shí)驗(yàn)組重復(fù)6次接種于96孔圓底微量滴定板中(Corning，Corning，NY)。培養(yǎng)基由含L-谷氨酰胺的EHAA 120(Biofluids)、青霉素/鏈霉素、2-巰基乙醇和5％FBS組成。將細(xì)胞與多肽孵育。4天后，用1μCi的[3H]胸苷將加樣孔脈沖6-8小時并計數(shù)。數(shù)據(jù)由一種被定義為實(shí)驗(yàn)孔的均值除以對照孔(無抗原)的均值的刺激指數(shù)(SI)來表示。為測試HER-2/neu蛋白特異性反應(yīng)培養(yǎng)脾或淋巴結(jié)細(xì)胞進(jìn)行3次體外刺激。在測試時，如上所述將1×105培養(yǎng)的脾或淋巴結(jié)T細(xì)胞接種于96孔微量滴定板中。用1ug/ml免疫親和柱純化的大鼠neu(來自作為大鼠neu來源的DHFR-G8細(xì)胞)孵育細(xì)胞。4天后，用1uCi的[3H]胸苷將加樣孔脈沖6-8小時并計數(shù)。數(shù)據(jù)由一種被定義為實(shí)驗(yàn)孔的均值除以對照孔(無抗原)的均值的刺激指數(shù)來表示。
實(shí)施例5在乳腺癌患者中可以檢測到對人HER-2/neu多肽的致敏反應(yīng)從患有II期HER-2/neu過度表達(dá)乳腺癌的患者獲得肝素化的血。通過Ficoll Hypaque密度離心分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。將PBMC以2×105/孔的濃度接種于96孔圓底板(Corning，Corning，NY，USA)中。每個實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行24孔的重復(fù)。在每個24重復(fù)孔中加入由HER-2/neu衍生的肽(帶有在所列的序列中第一個氨基酸號的長度為15-20個氨基酸)組成的抗原25ug/ml、人HER-2/neu多肽(hHNP)1ug/ml、破傷風(fēng)類毒素1ug/ml和一種來自破傷風(fēng)的肽p30 25ug/ml。在含有10％人血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行測試。通過在第4天加入的(3H)胸苷(1μCi/孔)的10小時攝取量來測定T細(xì)胞的增殖反應(yīng)。如果cpm大于無抗原孔的均值和3倍標(biāo)準(zhǔn)差，則陽性孔，抗原反應(yīng)孔，被計數(shù)為陽性。結(jié)果顯示于圖4中。該II期乳腺癌患者對重組hHNP具有顯著的反應(yīng)。
從前面的描述中，顯然雖然為了說明此中已經(jīng)描述了本發(fā)明的特定實(shí)施方案，但是可以進(jìn)行各種修飾而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人華盛頓大學(xué)(ii)發(fā)明題目用于引發(fā)或提高對HER-2/neu蛋白的免疫活性以預(yù)防或治療與HER-2/neu癌基因相關(guān)的惡性腫瘤的化合物(iii)序列數(shù)4(iv)聯(lián)系地址(A)收信人Seed和Berry LLP(B)街6300哥倫比亞中心，第五大街701(C)城市西雅圖(D)州華盛頓(E)國家美國(F)由編98104-7092(V)計算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release#1.0，版本#1.30(vi)本申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日期1996年3月28日
(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Sharky，Richard G.
(B)注冊號32,629(C)參考/案卷號920010.448PC(ix)通訊信息(A)電話(206)622-4900(B)傳真(206)682-6031(2)序列號1的資料(i)序列特征(A)長度3768個堿基(B)類型核酸(C)成鏈類型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ix)特征(A)名字/解釋(KEY)CDS(B)位置1..3765(xi)序列描述序列號1
ATG GAG CTG GCG GCC TTG TGC CGC TGG GGG CTC CTC CTC GCC CTC TTG48Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu1 5 10 15CCC CCC GGA GCC GCG AGC ACC CAA GTG TGC ACC GGC ACA GAC ATG AAG96Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys20 25 30CTG CGG CTC CCT GCC AGT CCC GAG ACC CAC CTG GAC ATG CTC CGC CAC144Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His35 40 45CTC TAC CAG GGC TGC CAG GTG GTG CAG GGA AAC CTG GAA CTC ACC TAC192Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr50 55 60CTG CCC ACC AAT GCC AGC CTG TCC TTC CTG CAG GAT ATC CAG GAG GTG240Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val65 70 75 80CAG GGC TAC GTG CTC ATC GCT CAC AAC CAA GTG AGG CAG GTC CCA CTG288Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu85 90 95CAG AGG CTG CGG ATT GTG CGA GGC ACC CAG CTC TTT GAG GAC AAC TAT336Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr100 105 110GCC CTG GCC GTG CTA GAC AAT GGA GAC CCG CTG AAC AAT ACC ACC CCT384Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro115 120 125GTC ACA GGG GCC TCC CCA GGA GGC CTG CGG GAG CTG CAG CTT CGA AGC432Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser130 135 140CTC ACA GAG ATC TTG AAA GGA GGG GTC TTG ATC CAG CGG AAC CCC CAG480Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln145 150 155 160CTC TGC TAC CAG GAC ACG ATT TTG TGG AAG GAC ATC TTC CAC AAG AAC528Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn165 170 175AAC CAG CTG GCT CTC ACA CTG ATA GAC ACC AAC CGC TCT CGG GCC TGC576Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys180 185 190
CAC CCC TGT TCT CCG ATG TGT AAG GGC TCC CGC TGC TGG GGA GAG AGT 624His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser195 200 205TCT GAG GAT TGT CAG AGC CTG ACG CGC ACT GTC TGT GCC GGT GGC TGT 672Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys210 215 220GCC CGC TGC AAG GGG CCA CTG CCC ACT GAC TGC TGC CAT GAG CAG TGT 720Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys225 230 235 240GCT GCC GGC TGC ACG GGC CCC AAG CAC TCT GAC TGC CTG GCC TGC CTC 768Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu245 250 255CAC TTC AAC CAC AGT GGC ATC TGT GAG CTG CAC TGC CCA GCC CTG GTC 816His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Alā Leu Val260 265 270ACC TAC AAC ACA GAC ACG TTT GAG TCC ATG CCC AAT CCC GAG GGC CGG 864Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg275 280 285TAT ACA TTC GGC GCC AGC TGT GTG ACT GCC TGT CCC TAC AAC TAC CTT 912Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu290 295 300TCT ACG GAC GTG GGA TCC TGC ACC CTC GTC TGC CCC CTG CAC AAC CAA 960Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln305 310 315 320GAG GTG ACA GCA GAG GAT GGA ACA CAG CGG TGT GAG AAG TGC AGC AAG 1008Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys325 330 335CCC TGT GCC CGA GTG TGC TAT GGT CTG GGC ATG GAG CAC TTG CGA GAG 1056Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu340 345 350GTG AGG GCA GTT ACC AGT GCC AAT ATC CAG GAG TTT GCT GGC TGC AAG 1104Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys355 360 365AAG ATC TTT GGG AGC CTG GCA TTT CTG CCG GAG AGC TTT GAT GGG GAC 1152Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp370 375 380
CCA GCC TCC AAC ACT GCC CCG CTC CAG CCA GAG CAG CTC CAA GTG TTT 1200Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe385 390 395 400GAG ACT CTG GAA GAG ATC ACA GGT TAC CTA TAC ATC TCA GCA TGG CCG 1248Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro405 410 415GAC AGC CTG CCT GAC CTC AGC GTC TTC CAG AAC CTG CAA GTA ATC CGG 1296Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg420 425 430GGA CGA ATT CTG CAC AAT GGC GCC TAC TCG CTG ACC CTG CAA GGG CTG 1344Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu435 440 445GGC ATC AGC TGG CTG GGG CTG CGC TCA CTG AGG GAA CTG GGC AGT GGA 1392Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly450 455 460CTG GCC CTC ATC CAC CAT AAC ACC CAC CTC TGC TTC GTG CAC ACG GTG 1440Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val465 470 475 480CCC TGG GAC CAG CTC TTT CGG AAC CCG CAC CAA GCT CTG CTC CAC ACT 1488Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr485 490 495GCC AAC CGG CCA GAG GAC GAG TGT GTG GGC GAG GGC CTG GCC TGC CAC 1536Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His500 505 510CAG CTG TGC GCC CGA GGG CAC TGC TGG GGT CCA GGG CCC ACC CAG TGT 1584Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys515 520 525GTC AAC TGC AGC CAG TTC CTT CGG GGC CAG GAG TGC GTG GAG GAA TGC 1632Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys530 535 540CGA GTA CTG CAG GGG CTC CCC AGG GAG TAT GTG AAT GCC AGG CAC TGT 1680Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Gys545 550 555 560TTG CCG TGC CAC CCT GAG TGT CAG CCC CAG AAT GGC TCA GTG ACC TGT 1728Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys565 570 575
TTT GGA CCG GAG GCT GAC CAG TGT GTG GCC TGT GCC CAC TAT AAG GAC 1776Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp580 585 590CCT CCC TTC TGC GTG GCC CGC TGC CCC AGC GGT GTG AAA CCT GAC CTC 1824Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu595 600 605TCC TAC ATG CCC ATC TGG AAG TTT CCA GAT GAG GAG GGC GCA TGC CAG 1872Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln610 615 620CCT TGC CCC ATC AAC TGC ACC CAC TCC TGT GTG GAC CTG GAT GAC AAG 1920Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys625 630 635 640GGC TGC CCC GCC GAG CAG AGA GCC AGC CCT CTG ACG TCC ATC ATC TCT 1968Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser645 650 655GCG GTG GTT GGC ATT CTG CTG GTC GTG GTC TTG GGG GTG GTC TTT GGG 2016Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly660 665 670ATC CTC ATC AAG CGA CGG CAG CAG AAG ATC CGG AAG TAC ACG ATG CGG 2064Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg675 680 685AGA CTG CTG CAG GAA ACG GAG CTG GTG GAG CCG CTG ACA CCT AGC GGA 2112Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly690 695 700GCG ATG CCC AAC CAG GCG CAG ATG CGG ATC CTG AAA GAG ACG GAG CTG 2160Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu705 710 715 720AGG AAG GTG AAG GTG CTT GGA TCT GGC GCT TTT GGC ACA GTC TAC AAG 2208Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys725 730 735GGC ATC TGG ATC CCT GAT GGG GAG AAT GTG AAA ATT CCA GTG GCC ATC 2256Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile740 745 750AAA GTG TTG AGG GAA AAC ACA TCC CCC AAA GCC AAC AAA GAA ATC TTA 2304Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu755 760 765
GAC GAA GCA TAC GTG ATG GCT GGT GTG GGC TCC CCA TAT GTC TCC CGC 2352Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg770 775 780CTT CTG GGC ATC TGC CTG ACA TCC ACG GTG CAG CTG GTG ACA CAG CTT 2400Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu785 790 795 800ATG CCC TAT GGC TGC CTC TTA GAC CAT GTC CGG GAA AAC CGC GGA CGC 2448Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg805 810 815CTG GGC TCC CAG GAC CTG CTG AAC TGG TGT ATG CAG ATT GCC AAG GGG 2496Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly820 825 830ATG AGC TAC CTG GAG GAT GTG CGG CTC GTA CAC AGG GAC TTG GCC GCT 2544Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala835 840 845CGG AAC GTG CTG GTC AAG AGT CCC AAC CAT GTC AAA ATT ACA GAC TTC 2592Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe850 855 860GGG CTG GCT CGG CTG CTG GAC ATT GAC GAG ACA GAG TAC CAT GCA GAT 2640Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp865 870 875 880GGG GGC AAG GTG CCC ATC AAG TGG ATG GCG CTG GAG TCC ATT CTC CGC 2688Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg885 890 895CGG CGG TTC ACC CAC CAG AGT GAT GTG TGG AGT TAT GGT GTG ACT GTG 2736Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val900 905 910TGG GAG CTG ATG ACT TTT GGG GCC AAA CCT TAC GAT GGG ATC CCA GCC 2784Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala915 920 925CGG GAG ATC CCT GAC CTG CTG GAA AAG GGG GAG CGG CTG CCC CAG CCC 2832Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro930 935 940CCC ATC TGC ACC ATT GAT GTC TAC ATG ATC ATG GTC AAA TGT TGG ATG 2880Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met945 950 955 960
ATT GAC TCT GAA TGT CGG CCA AGA TTC CGG GAG TTG GTG TCT GAA TTC 2928Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe965 970 975TCC CGC ATG GCC AGG GAC CCC CAG CGC TTT GTG GTC ATC CAG AAT GAG 2976Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu980 985 990GAC TTG GGC CCA GCC AGT CCC TTG GAC AGC ACC TTC TAC CGC TCA CTG 3024Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu995 10001005CTG GAG GAC GAT GAC ATG GGG GAC CTG GTG GAT GCT GAG GAG TAT CTG 3072Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu101010151020GTA CCC CAG CAG GGC TTC TTC TGT CCA GAC CCT GCC CCG GGC GCT GGG 3120Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly Ala Gly1025103010351040GGC ATG GTC CAC CAC AGG CAC CGC AGC TCA TCT ACC AGG AGT GGC GGT 3168Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly104510501055GGG GAC CTG ACA CTA GGG CTG GAG CCC TCT GAA GAG GAG GCC CCC AGG 3216Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg106010651070TCT CCA CTG GCA CCC TCC GAA GGG GCT GGC TCC GAT GTA TTT GAT GGT 3264Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly107510801085GAC CTG GGA ATG GGG GCA GCC AAG GGG CTG CAA AGC CTC CCCAsp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His109010951100GAC CCC AGC CCT CTA CAG CGG TAC AGT GAG GAC CCC ACA GTA CCC CTG 3360Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu1105111011151120CCC TCT GAG ACT GAT GGC TAC GTT GCC CCC CTG ACC TGC AGC CCC CAG 3408Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln112511301135CCT GAA TAT GTG AAC CAG CCA GAT GTT CGG CCC CAG CCC CCT TCG CCC 3456Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro114011451150
CGA GAG GGC CCT CTG CCT GCT GCC CGA CCT GCT GGT GCC ACT CTG GAA 3504Arg Glu Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu115511601165AGG CCC AAG ACT CTC TCC CCA GGG AAG AAT GGG GTC GTC AAA GAC GTT 3552Arg Pro Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val117011751180TTT GCC TTT GGG GGT GCC GTG GAG AAC CCC GAG TAC TTG ACA CCC CAG 3600Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln1185119011951200GGA GGA GCT GCC CCT CAG CCC CAC CCT CCT CCT GCC TTC AGC CCA GCC 3648Gly Gly Ala Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala120512101215TTC GAC AAC CTC TAT TAC TGG GAC CAG GAC CCA CCA GAG CGG GGG GCT 3696Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala122012251230CCA CCC AGC ACC TTC AAA GGG ACA CCT ACG GCA GAG AAC CCA GAG TAC 3744Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr123512401245CTG GGT CTG GAC GTG CCA GTG TGA 3768Leu Gly Leu Asp Val Pro Val12501255
(2)序列號2的資料(i)序列特征(A)長度1255個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述序列號2Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu1 5 10 15Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys20 25 30Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His35 40 45Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr50 55 60Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val65 70 75 80Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu85 90 95
Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr100 105 110Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro115 120 125Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser130 135 140Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln145 150 155 160Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn165 170 175Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys180 185 190His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser195 200 205Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys210 215 220Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys225 230 235 240Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu245 250 255His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val260 265 270Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg275 280 285Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu290 295 300Ser Thr Asp Vel Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln305 310 315 320Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys325 330 335
Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu340 345 350Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys355360 365Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe AsP Gly Asp370 375 380Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe385 390 395 400Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro405 410 415Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg420 425 430Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu435 440 445Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly450 455 460Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val465 470 475 480Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr485 490 495Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His500 505 510Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys515 520 525Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys530 535 540Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys545 550 555 560Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys565 570 575
Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp580 585 590Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu595 600 605Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln610 615 620Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys625 630 635 640Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser645 650 655Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly660 665 670Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg675 680 685Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly690 695 700Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu705 710 715 720Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys725 730 735Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile740 745 750Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu755 760 765Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg770 775 780Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu785 790 795800Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg805 810 815
Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly820 825 830Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala835 840 845Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe850 855 860Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp865 870 875 880Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg885 890 895Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val900 905 910Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala915 920 925Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro930 935 940Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met945 950 955 960Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe965 970 975Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu980 985 990Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu995 10001005Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu101010151020Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly Ala Gly1025103010351040Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly104510501055
Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg106010651070Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly107510801085Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His109010951100Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu1105111011151120Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln112511301135Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro114011451150Arg Glu Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu115511601165Arg Pro Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val117011751180Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln1185119011951200Gly Gly Ala Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala120512101215Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala122012251230Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr123512401245Leu Gly Leu Asp Val Pro Val1250 1255
(2)序列號3的資料(i)序列特征(A)長度48個堿基(B)類型核酸(C)成鏈類型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述序列號3TCTGGCGCGC TGGATGACGA TGACAAGAAA CGACGGCAGC AGAAGATC48(2)序列號4的資料(i)序列特征(A)長度39個堿基(B)類型核酸(C)成鏈類型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述序列號4TGAATTCTCG AGTCATTACA CTGGCACGTC CAGACCCAG 39
權(quán)利要求
1.用于產(chǎn)生T細(xì)胞應(yīng)答的組合物，其中包含佐劑以及由選自下組的DNA序列編碼的多肽(a)SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸；和(b)在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與和SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列可雜交的DNA序列，該DNA序列編碼可產(chǎn)生針對HER-2/neu蛋白的免疫應(yīng)答的多肽，前提條件是該多肽不是完整HER-2/neu蛋白。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述多肽具有SEQ ID NO2的從第676位氨基酸至第1255位氨基酸的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述多肽是截短的。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述多肽與肽或多肽相連接。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述多肽與肽或多肽相連接。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的組合物在制備用于免疫溫血動物以抗與HER-2/neu癌基因相關(guān)的惡性腫瘤的藥物中的用途。
7.通過用核酸分子與佐劑聯(lián)合轉(zhuǎn)染溫血動物細(xì)胞用于免疫的核酸分子組合物，所述核酸分子指導(dǎo)由選自下組的DNA序列編碼的多肽的表達(dá)(a)SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸；和(b)在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與和SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列可雜交的DNA序列，該DNA序列編碼可產(chǎn)生針對HER-2/neu蛋白的免疫應(yīng)答的多肽，前提條件是該多肽不是完整HER-2/neu蛋白。
8.核酸分子與佐劑聯(lián)合在制備通過轉(zhuǎn)染溫血動物細(xì)胞用于免疫溫血動物以抗與HER-2/neu癌基因相關(guān)的惡性腫瘤的藥物中的用途，其中所述核酸分子指導(dǎo)由選自下組的DNA序列編碼的多肽的表達(dá)(a)SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸；和(b)在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與和SEQIDNO1的第2026-3765位核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列可雜交的DNA序列，該DNA序列編碼可產(chǎn)生針對HER-2/neu蛋白的免疫應(yīng)答的多肽，前提條件是該多肽不是完整HER-2/neu蛋白。
9.核酸分子與佐劑聯(lián)合在制備用于免疫溫血動物以抗與HER-2/neu癌基因相關(guān)的惡性腫瘤的藥物中的用途，其中所述核酸分子指導(dǎo)由選自下組的DNA序列編碼的多肽的表達(dá)(a)SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸；和(b)在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與和SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列可雜交的DNA序列，該DNA序列編碼可產(chǎn)生針對HER-2/neu蛋白的免疫應(yīng)答的多肽，前提條件是該多肽不是完整HER-2/neu蛋白。
10.通過病毒載體與佐劑聯(lián)合感染溫血動物細(xì)胞用于免疫的病毒載體，所述病毒載體指導(dǎo)由選自下組的DNA序列編碼的多肽的表達(dá)(a)SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸；和(b)在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與和SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列可雜交的DNA序列，該DNA序列編碼可產(chǎn)生針對HER-2/neu蛋白的免疫應(yīng)答的多肽，前提條件是該多肽不是完整HER-2/neu蛋白。
11.病毒載體與佐劑聯(lián)合在制備通過轉(zhuǎn)染溫血動物細(xì)胞用于免疫溫血動物以抗與HER-2/neu癌基因相關(guān)的惡性腫瘤的藥物中的用途，其中所述病毒載體指導(dǎo)由選自下組的DNA序列編碼的多肽的表達(dá)(a)SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸；和(b)在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與和SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列可雜交的DNA序列，該DNA序列編碼可產(chǎn)生針對HER-2/neu蛋白的免疫應(yīng)答的多肽，前提條件是該多肽不是完整HER-2/neu蛋白。
12.病毒載體與佐劑聯(lián)合在制備用于免疫溫血動物以抗與HER-2/neu癌基因相關(guān)的惡性腫瘤的藥物中的用途，其中所述病毒載體指導(dǎo)由選自下組的DNA序列編碼的多肽的表達(dá)(a)SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸；和(b)在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與和SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列可雜交的DNA序列，該DNA序列編碼可產(chǎn)生針對HER-2/neu蛋白的免疫應(yīng)答的多肽，前提條件是該多肽不是完整HER-2/neu蛋白。
13.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的組合物在制備可用于激發(fā)或增強(qiáng)針對HER-2/neu蛋白的免疫應(yīng)答的藥物中的用途。
14.權(quán)利要求7的核酸分子在制備可用于激發(fā)或增強(qiáng)針對HER-2/neu蛋白的免疫應(yīng)答的藥物中的用途。
15.權(quán)利要求7的核酸分子，其中所述多肽具有SEQ ID NO2的從第676位氨基酸-賴氨酸至第1255位氨基酸-纈氨酸的氨基酸序列。
16.權(quán)利要求13的核酸分子，其中所述多肽是截短的。
17.權(quán)利要求16的核酸分子，其中所述多肽與肽或多肽相連接。
18.權(quán)利要求7的核酸分子，其中所述多肽與肽或多肽相連接。
19.權(quán)利要求8或9的核酸分子的用途，其中所述多肽具有SEQ ID NO2的從第676位氨基酸-賴氨酸至第1255位氨基酸-纈氨酸的氨基酸序列。
20.權(quán)利要求19的核酸分子的用途，其中所述多肽是截短的。
21.權(quán)利要求20的核酸分子的用途，其中所述多肽與肽或多肽相連接。
22.權(quán)利要求8或9的核酸分子的用途，其中所述多肽與肽或多肽相連接。
23.權(quán)利要求10的病毒載體在制備可用于激發(fā)或增強(qiáng)針對HER-2/neu蛋白的免疫應(yīng)答的藥物中的用途。
24.權(quán)利要求10的病毒載體，其中所述多肽具有SEQ ID NO2的從第676位氨基酸-賴氨酸至第1255位氨基酸-纈氨酸的氨基酸序列。
25.權(quán)利要求24的病毒載體，其中所述多肽是截短的。
26.權(quán)利要求25的病毒載體，其中所述多肽與肽或多肽相連接。
27.權(quán)利要求10的病毒載體，其中所述多肽與肽或多肽相連接。
28.權(quán)利要求11或12的病毒載體的用途，其中所述多肽具有SEQ ID NO2的從第676位氨基酸-賴氨酸至第1255位氨基酸-纈氨酸的氨基酸序列。
29.權(quán)利要求28的病毒載體的用途，其中所述多肽是截短的。
30.權(quán)利要求29的病毒載體的用途，其中所述多肽與肽或多肽相連接。
31.權(quán)利要求11或12的病毒載體的用途，其中所述多肽與肽或多肽相連接。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于引發(fā)和提高對HER－2/neu蛋白的免疫反應(yīng)性的化合物和組合物。這些化合物包括多肽和編碼該多肽的核酸分子。這些化合物可被用于預(yù)防或治療與HER－2/neu癌基因相關(guān)的惡性腫瘤。
文檔編號A61K38/10GK1951398SQ20061009991
公開日2007年4月25日 申請日期1996年3月28日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月31日
發(fā)明者M·A·切夫, M·L·狄希斯 申請人:華盛頓大學(xué)