專(zhuān)利名稱(chēng)：用于動(dòng)脈硬化性疾病的靶向Salusin的治療劑和檢測(cè)試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于動(dòng)脈硬化性疾病(arteriosclerotic disease)的靶向(target) salusin-a或salusin-p的預(yù)防和治療劑。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)耙向salusin-a來(lái)檢測(cè)動(dòng)脈硬化性疾病的方法或試劑。
背景技術(shù)：
根據(jù)2005年由厚生勞動(dòng)省(Ministry of Health, Labor and Welfare)發(fā)布的"人口動(dòng)態(tài)統(tǒng)計(jì)(Dynamic Statistics of the Population )"，在日本
由于癌癥造成的死亡人數(shù)為326,000，使其成為死亡的主要原因，其次是心臟病(173,000)，其是第二大死亡原因，以及中風(fēng)(133,000)，其是第三大死亡原因。心臟病和中風(fēng)的總死亡人數(shù)幾乎與癌癥相當(dāng)。具體地，缺血性心臟病(其是心臟病的代表性實(shí)例)和腦梗塞(其是中風(fēng)的典型疾病模式)的發(fā)展以動(dòng)脈硬化為基本病理狀態(tài)。因此，預(yù)防動(dòng)脈硬化的發(fā)病和發(fā)展對(duì)于保持和增強(qiáng)國(guó)民的健康是非常重要的。
在動(dòng)脈硬化的原發(fā)病灶中特征性的病理發(fā)現(xiàn)是巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的聚集，其中膽固醇酯積聚在細(xì)胞內(nèi)。巨噬細(xì)胞經(jīng)多種清道夫受體將修飾的LDL諸如氧化低密度脂蛋白(氧化LDL)結(jié)合至細(xì)胞內(nèi)。膽固醇酯是一種重要的氧化LDL膽固醇，其在溶酶體內(nèi)被降解為游離的膽固醇和脂肪酸。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇水平達(dá)到過(guò)度的程度時(shí)，其由兩種機(jī)制調(diào)節(jié)。第一種機(jī)制是通過(guò)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP-bindingcassette transporter) Al (ABCA-1)膽固醇外流至細(xì)胞外，第二種機(jī)制是通過(guò)酰基-CoA:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-1 (ACAT-l)轉(zhuǎn)變?yōu)槟懝檀减ァ．?dāng)膽固醇酯積聚在細(xì)胞質(zhì)中時(shí)，巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，形成動(dòng)脈硬化的原發(fā)病灶。
動(dòng)脈硬化的原發(fā)病灶中的另 一特征型病理發(fā)現(xiàn)是其中積聚了膽固醇酯的巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的聚集。巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞從動(dòng)脈的中膜遷移至動(dòng)脈內(nèi)膜，或誘導(dǎo)該血管平滑肌細(xì)胞在動(dòng)脈內(nèi)膜內(nèi)增殖。已經(jīng)遷移至動(dòng)脈內(nèi)膜的血 管平滑肌細(xì)胞合成并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，使動(dòng)脈內(nèi)膜變厚。這種內(nèi)膜增 厚導(dǎo)致血管腔變窄并減少血流。來(lái)自血管平滑肌細(xì)胞的泡沬細(xì)胞還見(jiàn) 于中期動(dòng)脈硬化時(shí)和之后。
Salusin是最近通過(guò)生物信息學(xué)分析鑒別的循環(huán)調(diào)節(jié)物質(zhì)。有兩種 稱(chēng)為salusin-a和salusin-(3的相關(guān)肽類(lèi)(見(jiàn)非專(zhuān)利文件1)。東京醫(yī)科齒 科大學(xué)(Tokyo Medical and Dental University)的Nanasato等人搜索了 人cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)，以篩選編碼具有明顯的信號(hào)序列的分泌性蛋白的基 因。將這些基因轉(zhuǎn)染進(jìn)培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中，然后將培養(yǎng)上清液加 入至培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞中，從而鑒別出誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)C,濃度增加 的基因salusin(見(jiàn)非專(zhuān)利文件2)。 Salusin-oc包括28個(gè)氨基酸，salusin-P 包括20個(gè)氨基酸。它們通過(guò)其前體preprosalusin的加工而產(chǎn)生。 Preprosalusin由242個(gè)氨基酸組成，并且在對(duì)TOR2A基因進(jìn)行選擇性 剪接使得發(fā)生移碼時(shí)得以生物合成，上述TOR2A基因是TOR1A (DYT1)的相關(guān)基因，已有報(bào)道TORIA (DYT1)是早發(fā)性扭轉(zhuǎn)性肌 張力障礙的致病基因。由于在N-端上有26個(gè)氨基酸的信號(hào)序列，推斷 兩種salusin從216個(gè)氨基酸的Prosalusin的C-端側(cè)生物合成。salusin-ot 和salusin-!3二者的表達(dá)分布在人血管壁細(xì)胞、內(nèi)分泌-中樞神經(jīng)系統(tǒng)等 中得以證實(shí)。目前，可以通過(guò)放射免疫測(cè)定來(lái)測(cè)量人血清和尿中的 salusin-a濃度。對(duì)于健康受試者，結(jié)果分別為23.3 ± 8.1 pM和156.8 ± 95.8pM (見(jiàn)非專(zhuān)利文件3)。其主要效應(yīng)已經(jīng)在大鼠中得到證實(shí)，包括 強(qiáng)降血壓效應(yīng)、強(qiáng)降心率效應(yīng)(P>a)、促進(jìn)腦垂體分泌加壓素的效應(yīng) (僅有P)以及促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖的效應(yīng)(P〉a)。
非專(zhuān)利文件1: ShichiriM等人，NatMed. 2003; 9: 1166-1172。
非專(zhuān)禾ll文件2 : Masayoshi Nanasato, Journal of Experimental Medicine Vol. 210， No. 4 2004. 7. 24， pp. 267-270
非專(zhuān)利文件3: SatoK等人，Peptides. 2006;27:2561-2566。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于動(dòng)脈硬化性疾病的預(yù)防和治療劑。 本發(fā)明的另一 目的是提供用于檢測(cè)動(dòng)脈硬化性疾病的方法和試劑。
5本發(fā)明的發(fā)明人己經(jīng)推知，新的控制血壓、心率等的血管活性物
質(zhì)salusin以類(lèi)似于已知血管活性物質(zhì)尾加壓素(urotensin) II和5-羥 色胺的方式作用于巨噬細(xì)胞，從而對(duì)巨噬細(xì)胞的泡沫化產(chǎn)生影響；艮P， 它們?cè)趧?dòng)脈硬化病變(arteriosclerotic lesion)的形成中發(fā)揮重要作用。 因此，發(fā)明人集中于控制巨噬細(xì)胞的泡沫化和這種控制所必需的酶 ACAT-1的表達(dá)調(diào)控。發(fā)明人還考察了 salusin-ot和salusin-(3的作用。由 此，發(fā)明人己經(jīng)發(fā)現(xiàn)，sakisin在動(dòng)脈硬化病變的形成中發(fā)揮重要的病 理生理作用。具體來(lái)說(shuō)，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，salusin-ot抑制巨噬細(xì)胞的泡 沫化，從而抑制動(dòng)脈硬化病變的形成，salusin-P則促進(jìn)巨噬細(xì)胞的泡沫 化，從而促進(jìn)動(dòng)脈硬化病變的形成。發(fā)明人由此進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，能夠抑 制salusin-(3或salusin-ct的作用的化合物可以用于預(yù)防或治療動(dòng)脈硬化 性疾病。此外，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈硬化病變與生物樣品中salusin-oc 的濃度呈負(fù)相關(guān)，salusin-ot可以用作檢測(cè)動(dòng)脈硬化性疾病的標(biāo)志物。由 此，發(fā)明人完成了本發(fā)明。 本發(fā)明如下。 一種用于動(dòng)脈硬化性疾病的治療劑，其包括salusin-a或 salusin-a的激動(dòng)劑(agonist)作為活性成分。 —種用于動(dòng)脈硬化性疾病的治療劑，其包括salusin-P的拮抗劑 (antagonist)作為活性成分。根據(jù)[2]所述的用于動(dòng)脈硬化性疾病的治療劑，其中所述 salusin-p的拮抗劑是抗salusin-(3抗體。根據(jù)[l]-[3]中任意一項(xiàng)所述的用于動(dòng)脈硬化性疾病的治療劑， 其中所述動(dòng)脈硬化性疾病選自急性冠狀動(dòng)脈綜合征、缺血性心臟病， 即心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血(encephalorrhagy)、主動(dòng)脈瘤、 主動(dòng)脈夾層、腎硬化和閉塞性動(dòng)脈硬化癥(arteriosclerosis obliterans)。 —種用于動(dòng)脈硬化性疾病的治療組合物，其包括salusin-a或 salusin-a的激動(dòng)劑和salusin-P的拮抗劑。根據(jù)[5]所述的用于動(dòng)脈硬化性疾病的治療組合物，其中所述 salusin-(3的拮抗劑是抗salusin-p抗體。根據(jù)[5]或[6]所述的用于動(dòng)脈硬化性疾病的治療組合物，其中 所述動(dòng)脈硬化性疾病選自急性冠狀動(dòng)脈綜合征、缺血性心臟病，即心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血、主動(dòng)脈瘤、主動(dòng)脈夾層、腎硬化和閉塞性動(dòng)脈硬化癥。 —種用于檢測(cè)動(dòng)脈硬化性疾病的方法，其包括化驗(yàn)(assay)生物樣品中的salusin-a。根據(jù)[8]所述的用于檢測(cè)動(dòng)脈硬化性疾病的方法，其中所述動(dòng)脈硬化性疾病選自急性冠狀動(dòng)脈綜合征、缺血性心臟病，即心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血、主動(dòng)脈瘤、主動(dòng)脈夾層、腎硬化和閉塞性動(dòng)脈硬化癥。根據(jù)[8]或[9]所述的用于檢測(cè)動(dòng)脈硬化性疾病的方法，其中所述生物樣品選自血清、血漿和尿。 一種用于確定動(dòng)脈硬化性疾病的嚴(yán)重性的方法，其包括化驗(yàn)生物樣品中的salusin-a。根據(jù)[ll]所述的用于確定動(dòng)脈硬化性疾病的嚴(yán)重性的方法，其中所述動(dòng)脈硬化性疾病選自急性冠狀動(dòng)脈綜合征、缺血性心臟病，即心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血、主動(dòng)脈瘤、主動(dòng)脈夾層、腎硬化和閉塞性動(dòng)脈硬化癥。根據(jù)[11]或[12]所述的用于確定動(dòng)脈硬化性疾病的嚴(yán)重性的方法，其中所述生物樣品選自血清、血漿和尿。 一種用于檢測(cè)動(dòng)脈硬化性疾病的診斷標(biāo)志物，其包括salusin-a。根據(jù)[14]所述的用于檢測(cè)動(dòng)脈硬化性疾病的診斷標(biāo)志物，其中所述動(dòng)脈硬化性疾病選自急性冠狀動(dòng)脈綜合征、缺血性心臟病，即心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血、主動(dòng)脈瘤、主動(dòng)脈夾層、腎硬化和閉塞性動(dòng)脈硬化癥。 —種用于檢測(cè)動(dòng)脈硬化性疾病的試劑，其包括抗salusin-a抗體并使用salusin-a作為檢測(cè)動(dòng)脈硬化性疾病的診斷標(biāo)志物。根據(jù)[16]所述的用于檢測(cè)動(dòng)脈硬化性疾病的試劑，其中所述動(dòng)脈硬化性疾病選自急性冠狀動(dòng)脈綜合征、缺血性心臟病，即心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血、主動(dòng)脈瘤、主動(dòng)脈夾層、腎硬化和閉塞性動(dòng)脈硬化癥。
本說(shuō)明書(shū)包括本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)文件日本專(zhuān)利申請(qǐng)第2007-127131號(hào)的說(shuō)明書(shū)和/或附圖所公開(kāi)的部分或全部?jī)?nèi)容。


圖1顯示了 salusin-ot和salusin-P及其氨基酸序列之前的關(guān)系。
圖2A顯示了 salusin-a和salusin-(3對(duì)人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞中?；?CoA:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶-l(ACAT-l)蛋白質(zhì)表達(dá)的劑量依賴(lài)性影響。具體地，圖2A顯示了 salusin的劑量依賴(lài)性影響(0 nM至0.6 nM)。
圖2B顯示了 salusin-a和salusin-卩對(duì)人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞中ACAT-1蛋白質(zhì)表達(dá)的劑量依賴(lài)性影響。具體地，圖2B顯示了 salusin的劑量依賴(lài)性影響(0nM至10nM)。
圖3顯示了在人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞的分化期期間salusin-a和salusin-p對(duì)ACAT-1蛋白質(zhì)表達(dá)的時(shí)間依賴(lài)性影響。
圖4顯示了 ACAT活性測(cè)定的原理。
圖5顯示了 salusin-ot和salusin-P對(duì)人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞的ACAT活性的影響。
圖6顯示了 salusin-oc和salusin-P對(duì)人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞的ACAT-1 mRNA表達(dá)的影響。
圖7圖示了膽固醇酯化測(cè)定的原理。在圖7中，CE表示膽固醇酯。
圖8顯示了 salusin-a和salusin-P對(duì)人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞的泡沫化(膽固醇酯[CE]的積聚)的影響。
圖9顯示了A型清道夫受體(SR-A)活性的測(cè)量原理。
圖10顯示了 salusin-a和salusin-P對(duì)人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞的A型清道夫受體(SR-A)活性的影響。圖IOA顯示結(jié)合測(cè)定(associationassay)的結(jié)果，圖10B顯示降解測(cè)定的結(jié)果。
圖11顯示了 salusin-ot和salusin-(3對(duì)人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞中ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體Al (ABCA-1)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。圖11A顯示salusin-ot的結(jié)果，圖11B顯示salusin-P的結(jié)果。
圖12顯示了 salusin-a和salusin-P對(duì)分化的培養(yǎng)的人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞的ACAT-1蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。圖12A顯示salusin-a的結(jié)果，圖12B顯示salusin-P的結(jié)果。
圖13所示的照片顯示了人冠狀動(dòng)脈的動(dòng)脈硬化病變中的salusin-P表達(dá)。照片B是A的高倍放大圖，照片D是C的高倍圖像。圖13A-D中的標(biāo)尺分別表示1.0 mm、 100|im、 200 |um和200 |iim。在死于急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)的患者(72歲男性)的左前降支(left anteriordescending artery)中，除了粥樣斑(atheroma)(斑塊)部分的平滑肌細(xì)胞(圖13B中的1)和成纖維細(xì)胞(圖13B中的2)以外，還證實(shí)了在右冠狀動(dòng)脈的脂紋內(nèi)的巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞(圖13D中的3)和中膜內(nèi)的成纖維細(xì)胞(圖13D中的4)中有很強(qiáng)的salusin-l3表達(dá)。
圖14顯示了中年男性受試者的血清salusin-oc濃度和頸動(dòng)脈內(nèi)膜-中膜厚度的最大值(最大IMT，頸動(dòng)脈硬化的指標(biāo))之間的關(guān)系。
圖15顯示了患有缺血性心臟病(穩(wěn)定性勞力型心絞痛、急性冠狀動(dòng)脈綜合征[ACS]和陳舊性心肌梗塞)的患者、高血壓患者和健康受試者的血清salusin-oc濃度的比較。選擇的病例為沒(méi)有ACS病史的穩(wěn)定性勞力型心絞痛病例、在ACS發(fā)作后6小時(shí)內(nèi)進(jìn)行檢査的ACS病例和在被選擇前6個(gè)月或更多月份發(fā)生ACS發(fā)作的陳舊性心肌梗塞病例。
圖16顯示了急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)患者的單支血管病變(1-VD)組、兩支血管病變(2-VD)組和三支血管病變(3-VD)組中的血清salusin-oc濃度。
圖17-1所示的照片顯示了 salusin-P對(duì)apoE缺陷小鼠的主動(dòng)脈中的動(dòng)脈硬化病變的影響。A-E顯示了用油紅O染色的主動(dòng)脈弓中的動(dòng)脈粥樣硬化性病變。F-J顯示了近端主動(dòng)脈橫截面的油紅O染色。
圖17-2顯示了 salusin-P對(duì)apoE缺陷小鼠的主動(dòng)脈中的動(dòng)脈硬化病變的效應(yīng)。在此顯示的均值士SEM是使用每組6只小鼠通過(guò)測(cè)定用油紅O染色的主動(dòng)脈弓的動(dòng)脈硬化病變的面積得到的。
圖17-3顯示了經(jīng)測(cè)定每組11只apoE缺陷小鼠獲得的血液數(shù)據(jù)的均值iSEM。
圖18-1顯示了 salusin-ot對(duì)apoE缺陷小鼠的主動(dòng)脈中的動(dòng)脈硬化病變的影響。A-C顯示用油紅O染色的胸主動(dòng)脈的動(dòng)脈硬化病變。D-F顯示近端主動(dòng)脈橫截面的油紅O染色。
圖18-2顯示了 salusin-a對(duì)apoE缺陷小鼠的主動(dòng)脈中的動(dòng)脈硬化病變的效應(yīng)。在此顯示的均數(shù)士SEM是使用每組5只小鼠通過(guò)測(cè)定用油紅O染色的胸主動(dòng)脈中的動(dòng)脈硬化病變的面積得的。
圖18-3顯示了經(jīng)測(cè)定每組8只apoE缺陷小鼠獲得的血液數(shù)據(jù)的均數(shù)iSEM。圖19A顯示了 apoE缺陷小鼠中的巨噬細(xì)胞泡沫化。每個(gè)數(shù)據(jù)都是經(jīng)測(cè)定每組6只小鼠得到的均數(shù)士 SEM。
圖19B顯示了 salusin-ot和salusin-(3對(duì)apoE缺陷小鼠的巨噬細(xì)胞中的膽固醇外流的影響。每個(gè)數(shù)據(jù)都是經(jīng)測(cè)定每組6只小鼠得到的均數(shù)士SEM。
圖20A顯示了 salusin-a和salusin-卩對(duì)apoE缺陷小鼠的巨噬細(xì)胞表達(dá)CD36的影響。每個(gè)數(shù)據(jù)都是經(jīng)測(cè)定每組6只小鼠得到的均數(shù)士 SEM。
圖20B顯示了 salusin-a和salusin-P對(duì)apoE缺陷小鼠的巨噬細(xì)胞表達(dá)SR-A的影響。每個(gè)數(shù)據(jù)都是經(jīng)測(cè)定每組6只小鼠得到的均數(shù)士 SEM。
圖20C顯示了 salusin-a和salusin-(3對(duì)apoE缺陷小鼠的巨噬細(xì)胞表達(dá)ACAT1的影響。每個(gè)數(shù)據(jù)都是經(jīng)測(cè)定每組6只小鼠得到的均數(shù)士SEM。
圖20D顯示了 salusin-oc和salusin-P對(duì)apoE缺陷小鼠的巨噬細(xì)胞表達(dá)ABCA1的影響。每個(gè)數(shù)據(jù)都是經(jīng)測(cè)定每組6只小鼠得到的均數(shù)士SEM。
圖20E顯示了 salusin-ot和salusin-p對(duì)apoE缺陷小鼠的巨噬細(xì)胞表達(dá)ABCG1的影響。每個(gè)數(shù)據(jù)都是經(jīng)測(cè)定每組6只小鼠得到的均數(shù)土SEM。
圖20F顯示了 salusin-a和salusin-P對(duì)apoE缺陷小鼠的巨噬細(xì)胞表達(dá)SR-BI的影響。每個(gè)數(shù)據(jù)都是經(jīng)測(cè)定每組6只小鼠得到的均數(shù)士SEM。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明將詳細(xì)解釋如下。
Salusin-a是包括28個(gè)氨基酸殘基的肽(SEQIDNO: 1)或包括29個(gè)氨基酸殘基的肽(SEQ ID NO: 2)，其在包括28個(gè)氨基酸殘基的肽的C-端上具有酰胺化甘氨酸。另夕卜，salusin-(3是包括20個(gè)氨基酸殘基的肽(SEQ ID NO: 3)。 Salusin-oc和salusin-P由包括242個(gè)氨基酸的preprosalusin (SEQIDNO:4)加工而產(chǎn)生。使preprosalusin N-端的包括26個(gè)氨基酸的信號(hào)序列缺失，產(chǎn)生包括216個(gè)氨基酸的prosalusin，然后從prosalusin的C-端側(cè)生成salusin-a和salusin-p。圖1顯示了
10salusin-a和salusin-P之間的關(guān)系(圖1A)及其氨基酸序列之間的關(guān)系 (圖1B)。
Salusin-oc抑制巨噬細(xì)胞的泡沫化，而salusin-P促進(jìn)巨噬細(xì)胞的泡沬 化。巨噬細(xì)胞的泡沬化是由于巨噬細(xì)胞參入(incorporate)氧化LDL 而發(fā)生的現(xiàn)象，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞中的脂質(zhì)沉積。巨噬細(xì)胞的泡沫化 由膽固醇酯的細(xì)胞內(nèi)生成和積聚而造成。氧化LDL經(jīng)巨噬細(xì)胞的多個(gè) 清道夫受體被參入，然后，由源于氧化LDL的膽固醇產(chǎn)生的膽固醇酯 發(fā)生積聚，從而發(fā)生巨噬細(xì)胞泡沬化。在巨噬細(xì)胞的泡沫化形成泡沫 細(xì)胞后，形成了動(dòng)脈硬化性疾病的原發(fā)病灶，例如粥樣斑形成。
Salusin-ot抑制巨噬細(xì)胞的泡沬化，從而抑制動(dòng)脈硬化性疾病的病 變形成。因此，salusin-a可以用于預(yù)防或治療動(dòng)脈硬化性疾病。此外， salusin-a的激動(dòng)劑也可以類(lèi)似于salusin-ot的方式用于預(yù)防或治療動(dòng)脈 硬化性疾病。在此，salusin-a的激動(dòng)劑的例子包括所有促進(jìn)salusin-a 的作用的化合物。這類(lèi)激動(dòng)劑的例子包括與salusin-a的受體結(jié)合、從 而發(fā)揮類(lèi)似于salusin-a的作用的化合物以及具有激動(dòng)劑活性的抗 salusin-a受體抗體。
另一方面，salusin-p促進(jìn)巨噬細(xì)胞的泡沫化，從而以促進(jìn)的方式作 用于動(dòng)脈硬化病變的形成。因此，與salusin-P結(jié)合從而抑制salusin-P 的作用的salusin-(3拮抗劑，抑制salusin-P導(dǎo)致巨噬細(xì)胞泡沫化的作用， 從而產(chǎn)生了抑制動(dòng)脈硬化性疾病的病變形成的能力。因此，salusin-P 的拮抗劑可以用于預(yù)防或治療動(dòng)脈硬化性疾病。本發(fā)明的這類(lèi)salusin-p 的拮抗劑的例子包括所有與salusin-P或salusin-p的受體結(jié)合從而抑制 salusin-P的體內(nèi)作用的化合物，例如中和抗體和受體拮抗劑。
統(tǒng)稱(chēng)為動(dòng)脈硬化性疾病的疾病特征在于由于動(dòng)脈硬化的危險(xiǎn)因 素造成內(nèi)膜中膜厚度(IMT)增加，導(dǎo)致動(dòng)脈的彈性喪失和硬化；膽固 醇酯沉積在動(dòng)脈內(nèi)(形成粥樣斑)，使血管通道變窄(狹窄)或使阻塞 (阻斷)；動(dòng)脈壁部分?jǐn)U張(動(dòng)脈瘤)；動(dòng)脈整體擴(kuò)張(動(dòng)脈擴(kuò)張)；或 內(nèi)皮破裂，造成中膜分離(分離)或破裂(出血)，導(dǎo)致遍及組織和器 官的循環(huán)不足。在本發(fā)明中，動(dòng)脈硬化性疾病的預(yù)防或治療不僅包括 預(yù)防或治療這些動(dòng)脈硬化性疾病，而且還包括預(yù)防或治療急性冠狀動(dòng) 脈綜合征(ACS; acute coronary syndrome)、缺血性心臟病心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血、主動(dòng)脈瘤、主動(dòng)脈夾層、腎硬化、閉塞性 動(dòng)脈硬化癥以及由這些動(dòng)脈硬化性疾病引起的疾病。在此，術(shù)語(yǔ)"急 性冠狀動(dòng)脈綜合征"是指由動(dòng)脈硬化粥樣斑(斑塊)破裂后形成血栓、 接著冠狀動(dòng)脈血流極度減少或阻塞所引起的病理狀況。該病理狀況的 臨床實(shí)例包括不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗塞和心臟猝死。此外，動(dòng) 脈硬化在相對(duì)粗的動(dòng)脈例如主動(dòng)脈、腦動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈中發(fā)生。動(dòng)脈 硬化的例子包括動(dòng)脈粥樣硬化，其中動(dòng)脈中膜中膽固醇酯(熔點(diǎn)40 °C )的動(dòng)脈粥樣化積累導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成及其厚度的逐漸 增加，從而使動(dòng)脈腔變窄；由于高血壓造成的改變而趨于在腦或腎中 的小動(dòng)脈中發(fā)生的動(dòng)脈毛細(xì)血管硬化，其與整個(gè)血管壁的破裂所引起 的堵塞(梗塞)和出血有關(guān)；以及動(dòng)脈中膜中的鈣沉積引起的門(mén)克伯 格氏動(dòng)脈硬化(Monckeberg，s arteriosclerosis),其使動(dòng)脈硬化并導(dǎo)致中 膜變脆。此外，本發(fā)明還可以主要應(yīng)用于預(yù)防或治療動(dòng)脈壁增厚或斑 塊形成。
salusin-財(cái)吉抗劑的實(shí)例包括所有抑制salusin-(3的作用的化合物，例 如具有拮抗活性的抗salusin-p抗體。
Salusin-ot可以根據(jù)氨基酸序列信息通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備，或者可 以通過(guò)基因工程技術(shù)制備。此外，由SEQIDNO: 1的氨基酸序列缺失、 取代或添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸、并具有salusin-ot的活性的氨基酸序列 組成的肽，也可以用作本發(fā)明的用于動(dòng)脈硬化性疾病的預(yù)防或治療劑。 在此，術(shù)語(yǔ)"1個(gè)或數(shù)個(gè)"是指"1-3"個(gè)，優(yōu)選1個(gè)或2個(gè)，進(jìn)一步 優(yōu)選1個(gè)。
抗salusin-(3抗體可以通過(guò)已知方法作為多克隆抗體或單克隆抗體 而獲得，并優(yōu)選作為單克隆抗體而獲得。單克隆抗體的例子包括由雜 交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體以及由用含有抗體基因的表達(dá)載體通過(guò)基因工 程技術(shù)轉(zhuǎn)化的宿主產(chǎn)生的單克隆抗體。產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可以 通過(guò)如下所述的已知技術(shù)而制備。具體地，產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤 可以通過(guò)如下方法制備使用salusin-P或其肽片段作為致敏性抗原通 過(guò)已知的免疫方法進(jìn)行免疫，通過(guò)通常的細(xì)胞融合法將由此獲得的免 疫細(xì)胞與已知的母細(xì)胞融合，然后通過(guò)已知的篩選方法篩選產(chǎn)生單克 隆抗體的細(xì)胞。在用salusin-p免疫后，可以將載體蛋白質(zhì)例如牛血清白蛋白(BSA)或鑰孔血藍(lán)蛋白與其結(jié)合，然后使用?？梢杂米鲉慰?隆抗體的重組單克隆抗體通過(guò)如下方法產(chǎn)生從雜交瘤克隆抗體基因， 將該基因結(jié)合到適當(dāng)?shù)妮d體中，將該載體導(dǎo)入至宿主中，然后由此經(jīng)
基因重組技術(shù)使抗體產(chǎn)生(例如，參見(jiàn)Vandamme， A. M.等人，Eur. J. Biochem. 1990; 192: 767-775)。這時(shí)，編碼抗體重鏈(H鏈)的DNA 和編碼輕鏈(L鏈)的DNA可以分別地合并到不同的表達(dá)載體中，然 后可以同時(shí)用這些表達(dá)載體對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。另外可選地，將編 碼H鏈和L鏈的DNA結(jié)合到單個(gè)表達(dá)載體中，然后可以用該表達(dá)載 體對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)WO 94/11523)。此外，還可以使用轉(zhuǎn)基 因動(dòng)物來(lái)產(chǎn)生重組抗體。例如，將抗體基因插入至編碼獨(dú)特地在奶中 產(chǎn)生的蛋白(例如，山羊p酪蛋白)的基因中間，從而制備融合基因。 將含有其中插入有抗體基因的融合基因的DNA片段注射到山羊胚胎 中，然后將胚胎導(dǎo)入到雌山羊中。所需抗體可以從由已接受該胚胎的 山羊所生的轉(zhuǎn)基因山羊、或該轉(zhuǎn)基因山羊的后代所產(chǎn)的奶中獲得(Ebert， K. M.等人，Bio/Technology 1994; 12: 699-702)。
本發(fā)明的抗salusin-P抗體的例子包括被人為改變以降低對(duì)人的異 種抗原性(heterologous antigenicity)的基因重組抗體，例如嵌合抗體 和人源化抗體。這些抗體的例子包括嵌合抗體、人源化抗體和人抗體， 其均可以使用已知方法產(chǎn)生。嵌合抗體可以通過(guò)如下方法獲得制備
編碼抗體V區(qū)的DNA，將該DNA與編碼人抗體C區(qū)的DNA連接， 將生成物結(jié)合到表達(dá)載體中，將該載體導(dǎo)入宿主中，然后使其產(chǎn)生。 人源化抗體也稱(chēng)作人重構(gòu)抗體。人源化抗體通過(guò)將非人哺乳動(dòng)物例如 鼠的抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植到人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)中而制備。 這種人源化抗體可以通過(guò)已知的方法制備(參見(jiàn)歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)第 EP 125023號(hào)和WO 96/02576)。人抗體的部分用于嵌合抗體或人源化 抗體的C區(qū)。例如，Cyl、 Cy2、 CY3和Q4可以用于H鏈，Ck禾卩CX 可以用于L鏈。此外，為了改善抗體或其生產(chǎn)穩(wěn)定性，人抗體的C區(qū) 可以加以修飾。
人抗體可以通過(guò)如下方法獲得例如，導(dǎo)入人抗體基因座位(gene locus)，然后將抗原給予能夠產(chǎn)生人源性抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因動(dòng) 物的例子包括小鼠。例如，產(chǎn)生能夠產(chǎn)生人抗體的小鼠的方法參見(jiàn)國(guó)
13際專(zhuān)利公開(kāi)WO02/43478的公開(kāi)文本。
本發(fā)明的抗salusin-P抗體的例子不僅包括完全抗體，而且還包括 其功能片段。術(shù)語(yǔ)"抗體的功能片段"是指保留了抗體對(duì)抗原的一種 或多種作用的抗體部分(部分片段)。其具體例子包括F(ab')2、 Fab'、 Fab、Fv、 二硫鍵Fv、單鏈Fv(scFv)及其聚合物[D. J. King., Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies, 1998 T. J. International Ltd]。
由此獲得的抗體是否具有對(duì)salusin-p的拮抗活性可以通過(guò)如下方 法確定例如，將抗體與salusin-卩結(jié)合，然后驗(yàn)證salusin-P的活性是否 受到了抑制。
對(duì)salusin-a或salusin-P具有拮抗活性的化合物可以用作用于動(dòng)脈 硬化性疾病的預(yù)防或治療劑。
劑量取決于癥狀、年齡、性別等而變化。通常來(lái)說(shuō)，在口服給藥 的情況下，對(duì)于成人，劑量范圍為每天約0.01 mg至1000 mg，可以一 次給藥或數(shù)次分別給藥。在胃腸外給藥的情況下，每次給藥約0.01mg 至1000 mg的劑量可以經(jīng)皮下注射、肌內(nèi)注射或靜脈內(nèi)注射來(lái)給藥。 而且，給藥時(shí)間可以是動(dòng)脈硬化性疾病的臨床癥狀出現(xiàn)之前或之后。
本發(fā)明的預(yù)防或治療劑可以多種形式給藥。這些形式的給藥途徑 的例子包括片劑、膠囊、顆粒劑、散劑、糖漿劑等的口服給藥，以及 注射制劑、滴劑、栓劑等的胃腸外給藥。
含有本發(fā)明的對(duì)salusin-a或salusin-l3具有拮抗活性的化合物的用 于動(dòng)脈硬化性疾病的預(yù)防或治療劑可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法配制 (Remington's Pharmaceutical Science,最近版本,Mark Publishing Company, Easton, U.S.A.),并且這些化合物可以一起含有藥物可接受的 載體和藥物可接受的添加劑。這些載體和藥物添加劑的例子包括水、 藥物可接受的有機(jī)溶劑、膠原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯垸酮、羧基乙 烯基聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、海藻酸鈉、水溶性葡聚 糖、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉 伯膠、酪蛋白、瓊脂、聚乙二醇、雙甘油、甘油、丙二醇、凡士林、 石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳 糖和可接受作為藥物添加劑的表面活性劑。實(shí)際的添加劑是取決于本 發(fā)明的預(yù)防或治療劑的劑型而從上述例子中單獨(dú)選擇的，或者從上述例子中選擇其合適的組合。但是，其實(shí)例并不限于此。
此外，本發(fā)明的用于動(dòng)脈硬化性疾病的預(yù)防或治療劑可以含有具
有salusin-P拮抗活性的化合物與salusin-a的組合。
本發(fā)明進(jìn)一步包括下列涉及生物樣品中的salusin-cx的化驗(yàn)的方法: 用于檢測(cè)從其中采集了生物樣品的待測(cè)受試者是否患有動(dòng)脈硬化性疾 病的方法、用于確定動(dòng)脈硬化性疾病的嚴(yán)重性的方法以及用于評(píng)價(jià)患 動(dòng)脈硬化性疾病的風(fēng)險(xiǎn)的方法。具體地，本發(fā)明可以?xún)?yōu)選地用于檢測(cè) 急性冠狀動(dòng)脈綜合征。
生物樣品的例子包括全血、血清、血漿和尿。這些生物樣品中的 Salusin-ot可以進(jìn)行定量或定性化驗(yàn)。
另外可選地，生物樣品可以直接用于其中salusin-oc的化驗(yàn)。然而， 由于生物樣品中的salusin-(x含量低，優(yōu)選地，從生物樣品中濃縮或分 離salusin-oc用于化驗(yàn)。這種分離或濃縮可以經(jīng)固相萃取從血清、血漿、 尿等中進(jìn)行。在此，術(shù)語(yǔ)"固相萃取"是指如下技術(shù)使用分離/純化 用的固定相(固相或吸附劑)例如化學(xué)結(jié)合硅膠、多孔聚合物、氧化 鋁、活性炭等，以選擇性的方式從具有復(fù)雜組成的樣品中專(zhuān)門(mén)地萃取 特定的目標(biāo)成分，從而可以去除樣品中的污染物。對(duì)于固相萃取，可 以廣泛地使用反相分配色譜用的固定相、離子交換色譜用的固定相等。 對(duì)于反相色譜用的固定相，可以使用具有例如十八碳烷基甲硅烷基 (C18)、辛基(C8)、 丁基(C4)、三甲基(C3)、苯基(Ph)、 丁基、 三十碳烷基(C30)等的基團(tuán)的填充劑。其中，優(yōu)選具有十八碳烷基甲 硅烷基(C18)或辛基(C8)的填充劑。使用市售的萃取柱(cartridge) 用于固相萃取?？梢允褂米⑸淦餍凸滔噍腿≈虮P(pán)型固相萃取柱。市 售萃取柱的例子包括Sep-Pak (注冊(cè)商標(biāo)，Waters)、 Autoprep (注冊(cè)商 標(biāo)，Showa Denko K.K.) 、 Discovery DSC-18 ( SUPELCO )禾B Discovery DSC-8 (SUPELCO)。用于洗脫salusin-a的溶劑的例子包括乙腈、甲醇 和四氫呋喃。在固相萃取之前，將生物樣品用三氟乙酸(TFA)進(jìn)行酸 處理，然后離心?？梢允褂糜纱双@得的上清液。
另外，可以使用反相色譜柱通過(guò)HPLC對(duì)預(yù)處理過(guò)的生物樣品進(jìn) 行分離和純化。
Salusin可以通過(guò)免疫測(cè)定例如放射免疫測(cè)定(RIA)、酶免疫測(cè)定(EIA)、 ELISA或熒光測(cè)定來(lái)進(jìn)行測(cè)定。在測(cè)定時(shí)，可以使用用放射 性同位素例如1251;酶諸如堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶或P-半乳糖苷 酶；或熒光物質(zhì)例如異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗salusin-a抗體。 這些免疫學(xué)測(cè)定可以通過(guò)己知的方法進(jìn)行。例如，將能夠與salusin-a 結(jié)合的第一配體例如抗salusin-a抗體固定化在塑料制微量滴定板孔等 的孔中的固相載體上。然后，使生物樣品與結(jié)合在固相上的能夠與 salusin-a結(jié)合的第一配體例如抗salusin-a抗體發(fā)生反應(yīng)。因此，作為配 體-受體結(jié)合反應(yīng)例如抗體-抗體反應(yīng)的結(jié)果，使樣品中的salusin-a經(jīng)結(jié) 合在固相上的第一配體而結(jié)合在固相上。隨后，進(jìn)行洗滌，然后使能 夠與salusin-a結(jié)合的第二配體與結(jié)合在固相上的樣品中的salusin-a發(fā) 生反應(yīng)。具體地，形成能夠與salusin-a結(jié)合的第一配體的復(fù)合體，例 如己經(jīng)結(jié)合在固相上的抗salusin-a抗體/salusin-a/第二配體?？梢允褂?抗salusin-a抗體等作為能夠與salusin-a結(jié)合的第二配體。隨后，進(jìn)行 洗滌，然后測(cè)定已經(jīng)結(jié)合在固相上的能夠與salusin-ot結(jié)合的第二配體 例如第二抗saliisin-a抗體。這種測(cè)定可以通過(guò)在免疫學(xué)分析領(lǐng)域中普 遍使用的多種方法進(jìn)行。例如，將能夠與salusin-ot結(jié)合的第二配體用 酶、熒光素、生物素、放射性標(biāo)記等標(biāo)記以便產(chǎn)生諸如酶標(biāo)記產(chǎn)物。 可以通過(guò)測(cè)定這種標(biāo)記來(lái)測(cè)定已經(jīng)結(jié)合在固相上的能夠與salusin-a結(jié) 合的第二配體。
在測(cè)定salusin-a時(shí)，不僅可以測(cè)定完整的salusin-ot，還可以測(cè)定 salusin-oc片段。
從生物樣品中分離和純化salusin-oc用的技術(shù)的實(shí)例描述如下。
(1) 將三氟乙酸(0.1% (v/v))加入至血清或血漿(2mL)中， 然后以3000rpm離心10分鐘。
(2) 將得到的上清液導(dǎo)入至Sep-Pak (注冊(cè)商標(biāo))C18萃取柱中。 萃取柱預(yù)先用99.8%甲醇(5mL)、純水(5mL)和0.1。/。TFA (5mL) 處理。
(3) 用0.1%TFA (lmL)和50%甲醇進(jìn)行萃取。得到的洗脫液用 離心濃縮機(jī)以2000 rpm濃縮至大約100 (iL。
(4) 將測(cè)定緩沖液(250 ^L)加入至樣品中，以測(cè)定其中含有的 salusin-a 。
16可以根據(jù)Sato K等人，Peptides, 2006; 27: 2561-2566進(jìn)行用于測(cè)定salusin-oc的分離和純化方法和RIA測(cè)定法。
對(duì)于健康受試者，人血清和尿中的salusin-ot濃度分別為23.3 ± 8.1pM和156.8 ±95.8 pM (各值均為均數(shù)土SD)。因此，當(dāng)待測(cè)受試者的血清或尿中的salusin濃度顯著低于健康受試者時(shí)，可以判斷出待測(cè)受試者患有動(dòng)脈硬化性疾病或處于患動(dòng)脈硬化性疾病的明顯危險(xiǎn)中。Sahisin濃度顯著低的情況的例子是如下情況當(dāng)與上述健康受試者的均數(shù)和SD相比較時(shí)，salusin濃度小于均數(shù)-lxSD，優(yōu)選均數(shù)-2xSD，進(jìn)一步優(yōu)選小于均數(shù)-3 x SD。另夕卜，動(dòng)脈硬化性疾病越嚴(yán)重，salusin-a的濃度越低。例如，對(duì)于急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)的情況，隨著病變的進(jìn)展程度以單支冠狀動(dòng)脈病變組、兩支冠狀動(dòng)脈病變組和3支冠狀動(dòng)脈病變組的順序增加，待測(cè)受試者的生物樣品中的salusin-oc濃度減少。另外，生物樣品中的salusin-oc濃度和用作動(dòng)脈硬化指標(biāo)的內(nèi)膜-中膜復(fù)合體厚度體(IMT:內(nèi)膜中膜厚度)之間呈負(fù)相關(guān)。IMT越厚，salusin-a的濃度越低。因此，salusin-a可以代替IMT來(lái)用作動(dòng)脈硬化性疾病進(jìn)展的指標(biāo)。此外，salusin-oc能有效地用于急性動(dòng)脈硬化性疾病的檢測(cè)。
此外，通過(guò)常規(guī)檢測(cè)從待測(cè)受試者采集的生物樣品的salusin-a，并監(jiān)測(cè)salusin-a的濃度，可以對(duì)動(dòng)脈硬化性疾病的進(jìn)展進(jìn)行管理。
Salusin-a可以用作檢測(cè)/診斷動(dòng)脈硬化性疾病的標(biāo)志物。本發(fā)明包括salusin-a作為檢測(cè)動(dòng)脈硬化性疾病的檢測(cè)標(biāo)志物的用途，并進(jìn)一步包括用于檢測(cè)/診斷動(dòng)脈硬化性疾病的包括salusin-a的疾病檢測(cè)/診斷標(biāo)志物。
下文參考下列實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不限于此。
在下面的實(shí)施例中，從人外周血制備單核細(xì)胞并培養(yǎng)7天，使其分化為巨噬細(xì)胞。這時(shí)，同時(shí)向其中加入salusin-ot(0-10nM)和salusin-p(0-10 nM)，并考察salusin的作用。
從人外周血獲得的單核細(xì)胞的培養(yǎng)通過(guò)已知方法進(jìn)行。分離的單核細(xì)胞添加RPMI-1640(15 mL)進(jìn)行培養(yǎng)，然后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)室(bloodcell counting chmber)對(duì)漂浮的單核細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞接種在6-cm皿中，以得到4 x 106細(xì)胞/2 mL。單核細(xì)胞在37。C下在5% C02 的存在下保溫1小時(shí)，使細(xì)胞粘附在皿上。培養(yǎng)基替換為含有10%人 血清的RPMI-1640，然后培養(yǎng)7天。培養(yǎng)基每3天更換一次。
實(shí)施例l:salusin-a和salusin-p對(duì)人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞中的ACAT-1 蛋白質(zhì)表達(dá)的影響
ACAT-1是一種將細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇轉(zhuǎn)化成膽固醇酯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)酶。 ACAT-1基因?qū)τ诰奘杉?xì)胞的泡沫化非常重要。為了考察salusin-a和 salusin-l3對(duì)ACAT-1表達(dá)的影響，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting) 考察ACAT-1蛋白質(zhì)的表達(dá)。
將己培養(yǎng)7天的單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞用PBS洗滌3次，然后向 每個(gè)皿中加入10。/。SDS (十二烷基硫酸鈉)(100 pL)進(jìn)行溶解。用細(xì) 胞刮棒鏟起每種細(xì)胞提取溶液，然后使用1-mL TERUMO注射器和破 碎(剪切)用23-G注射針進(jìn)行粉碎。生成物以15,000 rpm離心3分鐘 (Himac CF15D2高速微型低溫離心機(jī)；Hitach, Ltd.)。上清液中的蛋 白質(zhì)濃度通過(guò)二喹啉甲酸(bicinchoninic acid， BCA)法(Pierce)測(cè) 定，并用作蛋白質(zhì)印跡法用的細(xì)胞提取溶液。
將本發(fā)明實(shí)施例中獲得的每種培養(yǎng)上清液中的ACAT-1或ABCA-1 根據(jù)下面所述的方法通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行測(cè)定。 ACAT-1蛋白質(zhì)檢測(cè)
對(duì)于ACAT-1蛋白質(zhì)檢測(cè)，使用通過(guò)對(duì)兔進(jìn)行免疫制備的抗人 ACAT-1多克隆抗體(DMIO， Dr. Chang, Dartmouth Medical School惠 贈(zèng))[Chang CCY等人，J Biol Chem. 1995; 270: 29532-29540]作為第一 抗體(終濃度0.5|ag/mL)，用于在室溫下在轉(zhuǎn)移膜上反應(yīng)1小時(shí)。轉(zhuǎn) 移膜用PBS-0.1% Tween 20洗滌，然后與第二抗體(抗兔IgG抗體 結(jié)合有辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的抗兔IgG驢抗體(GE Healthcare Bio-Science))在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。對(duì)于第二抗體，用PBS-0.1% Tween 20 (5 mL)將原液(0.5 pL)稀釋10,000倍，使用生成物。用PBS-0.1% Tween 20進(jìn)行洗滌，然后使用Lumi-Light Plus (PerkinElmer Life Sciences)進(jìn)行ACAT-1蛋白質(zhì)檢測(cè)。 ABCA-1蛋白質(zhì)檢測(cè)對(duì)于ABCA-1蛋白檢測(cè)，與抗人ABCA-1抗體的反應(yīng)在轉(zhuǎn)移膜上 在室溫下進(jìn)行1小時(shí)。對(duì)于第一抗體(抗人ABCA-1兔多克隆抗體 (Funakoshi Corporation))，用PBS隱0.1 。/。 Tween 20 (5 mL )將原液(5 pL)稀釋1，000倍，使用稀釋液。轉(zhuǎn)移膜用PBS-0.1。/。Tween20洗滌。 然后，與第二抗體(抗兔IgG抗體結(jié)合有辣根過(guò)氧化物酶(HRP) 的抗兔IgG驢抗體(GE Healthcare Bioscience))的反應(yīng)在室溫下進(jìn)行 1小時(shí)。對(duì)于第二抗體，用PBS-0.1%Tween20 (5mL)將原液(0.5 pL) 稀釋10,000倍，使用稀釋液。用PBS-0.in/。 Tween 20進(jìn)行洗滌，然后 使用Lumi-Light Plus (PerkinElmer Life Sciences)進(jìn)行ABCA-1蛋白質(zhì) 檢測(cè)。
將人外周血單核細(xì)胞(4 x 1(^細(xì)胞/6-cm皿)在含有10%人血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基(2 mL)中培養(yǎng)7天，以分化成為巨噬細(xì)胞。為了 考察salusin對(duì)ACAT-1蛋白質(zhì)表達(dá)的劑量依賴(lài)性影響，在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí) 將salusin-a或salusin-p以0、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8或1.0 nM的濃度添力口 到培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)第7天時(shí)，將從單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞用PBS 洗滌，然后溶解在10% SDS (100 pL)中，然后使用ACAT-1特異性 抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)salusin-oc以依賴(lài)濃度的方式抑制 大約40。/。ACAT-l蛋白質(zhì)的表達(dá)(圖2A)。同時(shí)，salusin-(3在0-0.6 nM 的濃度下以依賴(lài)濃度的方式促進(jìn)ACAT-1蛋白質(zhì)的表達(dá)。Salusin-P的作 用在0.6 nM時(shí)達(dá)到峰值水平，這時(shí)ACAT-1蛋白質(zhì)表達(dá)水平增加至對(duì) 照的2.1倍。Salusin-P促進(jìn)ACAT-1蛋白質(zhì)表達(dá)的作用在0.6 nM以上的 濃度下逐漸衰減(圖2B)。
接下來(lái)，考察在單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞的分化期間salusin-a或 salusin-P對(duì)ACAT-1蛋白質(zhì)表達(dá)的時(shí)間依賴(lài)性影響。將人外周血單核細(xì) 胞(4x 1()S細(xì)胞/6cm皿)培養(yǎng)7天，以分化成巨噬細(xì)胞。這時(shí)，在培 養(yǎng)期間加入0.6 nM salusin-a或salusin-p。在接種后1、 3、 5或7天時(shí) 用PBS洗滌每個(gè)皿。將其中反應(yīng)已在第l、 3、 5天終止的皿暫時(shí)冷凍 在-8(TC下，并在第7天時(shí)解凍。將由此獲得的細(xì)胞以及接種后7天時(shí) 的細(xì)胞溶解在10n/。SDS (100 pL)中。作為通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法的考察 結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在接種后第1、 3或5天用salusin-a處理的細(xì)胞中的ACAT-1 蛋白質(zhì)表達(dá)沒(méi)有顯著地不同于對(duì)照細(xì)胞。但是，在第7天時(shí)表達(dá)受到
19了顯著的抑制。發(fā)現(xiàn)用salusin-(3處理的細(xì)胞中的ACAT-1蛋白質(zhì)表達(dá)水 平顯著地增加到高于對(duì)照細(xì)胞在第5天或更晚時(shí)的表達(dá)水平(圖3)。
實(shí)施例2: salusin-a和salusin-(3對(duì)人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞中的ACAT 活性的影響
對(duì)于ACAT活性測(cè)定，使用脂質(zhì)體重組法。該方法涉及使用如下 體系使用包括膽固醇/磷脂酰膽堿的混合膠束將存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的 ACAT-1蛋白質(zhì)重組到脂質(zhì)體中，從而達(dá)到可用作ACAT-1底物的膽固 醇的飽和濃度水平[Cheng D等人，J Biol Chem. 1995; 270: 685-695.]。 在常規(guī)使用的微粒體法中，使用內(nèi)源性地存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的膽固醇作 為底物。但是，通常地，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜缺乏膽固醇。因此，認(rèn)為沒(méi)有達(dá)到 能夠用作ACAT底物的膽固醇的飽和水平，導(dǎo)致低估ACAT的活性。 在此，通過(guò)向反應(yīng)體系中添加另一種底物^C]油酰基-CoA并測(cè)定通過(guò) ACAT反應(yīng)生成的膽固醇["C]油酸酯來(lái)測(cè)定ACAT的活性(圖4)。
該實(shí)施例中使用的細(xì)胞提取溶液說(shuō)明如下。
將外周血人單核細(xì)胞(4 x 106細(xì)胞/2 mL)接種在4-6個(gè)6-cm皿中， 并培養(yǎng)7天，以分化成巨噬細(xì)胞。這時(shí)，在培養(yǎng)期間加入salusin-a或 salusin-p。然后，考察salusin-a或salusin-P對(duì)ACAT活性的效應(yīng)。培養(yǎng) 7天后，將細(xì)胞用已經(jīng)冷卻至4"C的PBS洗滌兩次，向其中加入低滲緩 沖液(1 mM Tris-HCl， 1 mM EDTA， pH 7.4) (2mL/皿)，將生成物放置 5分鐘。這些操作的目的在于通過(guò)滲透壓來(lái)粉碎細(xì)胞膜，洗滌排出的細(xì) 胞質(zhì)蛋白質(zhì)，并濃縮含有ACAT-1的膜蛋白。將皿顛倒，以充分地去除 其中的緩沖液。在使用前立即向其中一皿中加入含有蛋白酶抑制劑雞 尾酒(cocktail) (SIGMA) (1/1000體積)的緩沖液A (50 mMTris-HCl， lmMEDTA，pH7.4) (100 pL)。用細(xì)胞刮棒從其中回收細(xì)胞。將緩沖 液(100 |LiL)轉(zhuǎn)移到在相同條件下培養(yǎng)的下一皿中，然后進(jìn)行相同的 操作。最后，將4-6個(gè)皿合并在一起，以濃縮膜蛋白。將回收的細(xì)胞提 取溶液(1 mL)導(dǎo)入到Teflon勻漿器中，然后進(jìn)行3組勻化作用(每 組20沖程)。在冰上進(jìn)行均化，組間的暫停時(shí)間為大約1分鐘。勻化 過(guò)的細(xì)胞提取溶液的蛋白質(zhì)濃度通過(guò)BCA法(Pierce)進(jìn)行定量測(cè)定。 將細(xì)胞提取溶液與4 M KC1 (1/3體積)和20% CHAPS (1/9體積)混合(使得KC1的終濃度為1M且CHAPS終濃度為2%)。蛋白質(zhì)濃度用 含有1 M KCl和2% CHAPS的緩沖液A調(diào)節(jié)。生成物在室溫下放置10 分鐘。
混合膠束如下制備。
將氯仿(172.4 [iL)中的100 mg/mL蛋黃L-a-磷脂酰膽堿(SIGMA) 和苯(62|uL)中的20 mg/mL膽固醇(SIGMA)導(dǎo)入至閃爍管中并進(jìn) 行渦旋，然后用氮?dú)飧稍铩Ｏ蚱渲屑尤?0%?；悄懰?SIGMA) (100 ILiL)、 10 x緩沖液A (100|liL)和無(wú)菌純凈水(800|liL)，生成物進(jìn)行 渦旋。在避光的同時(shí)，將瓶中的空氣用氮?dú)庵脫Q，然后超聲IO分鐘， 并在冰上冷卻5分鐘。上述操作重復(fù)約10次，從而獲得基本上透明的 生成物。超聲之后，向其中加入無(wú)菌純凈水(lmL)，然后充分混合。
通過(guò)制備含有1 mM ["C]油?；鵆oA (GE Healthcare Bio-Science, CFA634, 1.85 MBq) (16pL)、 34 mM冷的油?；?CoA (SIGMA) (10 ILiL)、 0.25 M Tris國(guó)HCl (pH 7.8)中30 mg/mL的BSA (834 pL)和無(wú) 菌純凈水(996 pL)的2，00(HiL溶液，得到0.25 mM ["C]油?；?CoA 混合物。
薄層色譜法(TLC)如下進(jìn)行。
通過(guò)將膽固醇油酸酯(SIGMA) (20 mg)加入到異丙醇(4mL) 中，將混合物在6(TC的熱浴中加熱進(jìn)行溶解，并進(jìn)一步向其中加入0.91 g/mL甘油三油酸酯(SIGMA) (20 pL)，從而制備TLC標(biāo)準(zhǔn)物。通過(guò) 毛細(xì)管點(diǎn)樣將TLC標(biāo)準(zhǔn)物(60 fiL)點(diǎn)在TLC鋁板(20 x 20 cm)上的 硅膠60F254 (Merck)上。制備己烷/二乙醚/乙酸(90:10:1， v/v)作為 展開(kāi)溶劑。
將混合膠束(140 jiL )加入到蛋白質(zhì)量恒定的細(xì)胞提取溶液(80-100 pg)中，將生成物緩慢混合并在冰上靜置10分鐘。然后，向其中加入 ["C]油?；?CoA混合物(20pL)，然后在不導(dǎo)致發(fā)泡的情況下進(jìn)行混 合。生成物在37'C下保溫30分鐘以進(jìn)行反應(yīng)。之后，向其中加入氯仿 /甲醇(2:l,v/v) (3mL)和無(wú)菌純凈水(lmL)，生成物進(jìn)行渦旋，使 反應(yīng)終止。以2，500rpm離心10分鐘(TOMYLC-120低速離心機(jī)，轉(zhuǎn) 子7015-06)。然后，從中去除上層(水層)，下層(油層)用氮?dú)飧稍铩?將提取出的脂質(zhì)用異丙醇(60 jiL)溶解。生成物在標(biāo)準(zhǔn)物點(diǎn)之間點(diǎn)樣。將脂質(zhì)展開(kāi)，直至展開(kāi)溶劑到達(dá)玻璃室中TLC板的上邊緣。將TLC板
轉(zhuǎn)移到另一玻璃室內(nèi)，該室內(nèi)已經(jīng)分散有少量的碘用來(lái)使TLC標(biāo)準(zhǔn)物
的脂質(zhì)顯色。將對(duì)應(yīng)于膽固醇油酸酯的部分用剪刀切下，置于瓶中，
然后添加閃爍雞尾酒(Perkin Elmer) (3 mL)進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于比活性 測(cè)定，測(cè)定["C]油?；?CoA混合物(10 ^L)的放射活性。將通過(guò)ACAT 反應(yīng)生成的膽固醇["C]油酸酯的放射活性(cpm)除以反應(yīng)系統(tǒng)中使用 的細(xì)胞蛋白質(zhì)的量(mg)、 ["C]油酰基-CoA的比活性(cpm/pmo1)和 反應(yīng)時(shí)間(10分鐘)，計(jì)算ACAT活性水平(pmol/mg細(xì)胞蛋白質(zhì)/min)。
發(fā)現(xiàn)Salusin-a或salusin-卩引起了 ACAT-1蛋白質(zhì)表達(dá)的改變。因 此，考察了 salusin-a或salusin-P對(duì)ACAT酶活性的效應(yīng)。將人外周血 單核細(xì)胞(4xl06細(xì)胞/皿)在含有10%人血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(2 mL)中培養(yǎng)7天，以分化成巨噬細(xì)胞。這時(shí)，在培養(yǎng)期間向培養(yǎng)基中 力口入0.6 nM salusin-a或salusin-(3。
通過(guò)向細(xì)胞提取溶液中加入混合膠束(膽固醇/磷脂酰膽堿)將 ACAT-1蛋白質(zhì)重組到脂質(zhì)體中。將["C]油?；?CoA加入到所得的樣 品中，然后在37"C下反應(yīng)10分鐘。測(cè)定通過(guò)ACAT反應(yīng)生成的膽固醇 ["C]油酸酯的放射活性，然后計(jì)算ACAT活性。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在用salusin-a 處理的細(xì)胞中的ACAT活性已經(jīng)被抑制到對(duì)照的50n/。。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)在 用salusin-P處理的細(xì)胞中的ACAT活性已經(jīng)增加到對(duì)照的1.8倍水平 (圖5)。
實(shí)施例3: salusin-cx和salusin-P對(duì)人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞中的ACAT-1 mRNA表達(dá)的影響
使用TRIzol試劑(LIFETECHNOLOGIES)進(jìn)行RNA提取。 將細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，然后去除培養(yǎng)基。細(xì)胞用PBS洗滌 3次。從中充分去除PBS，并向其中加入TRIzol (1 mL)用于細(xì)胞溶 解。將細(xì)胞提取溶液吸入吸出5次，然后轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管中。 然后，將該管在室溫下放置5分鐘。向其中加入氯仿(200jiL)，然后 劇烈振搖15秒。該管進(jìn)一步放置2-3分鐘，并以12,000 rpm離心15 分鐘(Himac CF15D2高速微型低溫離心機(jī)；Hitach, Ltd.)。將上層轉(zhuǎn) 移至新的Eppendorf管中，并向其中加入異丙醇(500 pL)，然后上下
22顛倒地混合。將該管放置10分鐘，并以12,000 rpm離心10分鐘。從 生成物中去除上清液。將75%乙醇(180 (iL)加入至剩余的沉淀中， 然后以15,000 rpm離心5分鐘。從生成物中去除上清液，然后風(fēng)干。 生成物溶解在無(wú)菌純凈水(90 pL)中，并在65"C下保溫10分鐘。向 其中加入脫氧核糖核酸酶(DNase) I溶液(IOjliL)，并將生成物在37 。C下保溫15分鐘。向其中加入3M乙酸鈉(10nL)和苯酚/氯仿(1:1， v/v) (IOOjiL)，然后振搖。以15,000 rpm離心3分鐘。將上清液收集 在新的Eppendorf管中。向其中加入氯仿/異戊醇(24:1, v/v) (100 pL), 并將該管進(jìn)一歩以15,000 rpm離心3分鐘。收集上清液，并向其中加 入乙醇(200|iiL)。將生成物在-8(TC下放置30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，然后 以15,000 rpm離心IO分鐘。去除上清液。將生成物用70%乙醇洗滌并 干燥。將得到的產(chǎn)物溶解在無(wú)菌蒸餾水(15pL)中。通過(guò)測(cè)定260nm 處的吸光度，得到由此獲得的RNA溶液的濃度。將無(wú)菌純凈水加入至 溶液中，以達(dá)到預(yù)定的濃度。
接下來(lái)，通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR法來(lái)分析ACAT-1 mRNA的RNA表達(dá)。 使用以下各個(gè)人mRNA序列，通過(guò)Primer Express 1.0版(PE Biosystems)確定引物序列。 卩-肌動(dòng)蛋白
正向引物5，-CCTGGCACCCAGCACAAT (SEQ ID NO: 5 ) 反向引物5'國(guó)GGGCCGGACTCGTCATAC (SEQ ID NO: 6) ACAT畫(huà)l
正向引物5，-TTCGGAATATCATCAAACAGGAGCC(SEQIDNO: 7) 反向引物5，畫(huà)CACACCTGGCAAGATGGAGTT (SEQ ID NO: 8 ) 將用salusin-a或salusin-(3處理的外周血人單核細(xì)胞(4 x 106細(xì)胞/6 cm皿)在含10%人血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(2 mL)中培養(yǎng)7天， 以分化成巨噬細(xì)胞。從用salusin-a或salusin-p處理的細(xì)胞和未經(jīng)處理 的細(xì)胞中提取總RNA。對(duì)每種總RNA (1 jig)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以進(jìn)行 cDNA合成。
進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，以便對(duì)使用qPCR MasterMix SYBR Greenl (Eurogentec)通過(guò)GeneAmp 5700序歹ll檢領(lǐng)lj系統(tǒng)(Applied Biosystems Japan)獲得的cDNA進(jìn)行定量。接下來(lái)，通過(guò)下述方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
將隨機(jī)引物(TaKaRa, 80nM) (0.5 pL)和無(wú)菌純凈水(10.5 |iL) 加入到各總RNA溶液(1 pg/(iL) (1 (iL)中，然后在7(TC下加熱10 分鐘。向其中加入核糖核酸酶(RNase)抑制劑(0.75 pL)、5 x First Strand Buffer (Invitrogen) (4 |tiL)、 O.IM二硫蘇糖醇(2 (iL)、 2.5 mM dNTP
(TaKaRa) (4 ^L)禾口 Superscript II (200 U/|uL; Invitrogen) (lpL)， 然后在37"C下反應(yīng)1小時(shí)。在95'C下變性5分鐘后，將生成物在冰上 冷卻，并向其中加入無(wú)菌純凈水(40pL)。
通過(guò)下述方法進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR。
將qPCR MasterMix SYBR Greenl (12.5 pL)、引物溶液(正向+反 向每種5pM) (2.5 pL)和無(wú)菌純凈水(8pL)加入到通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反 應(yīng)獲得的cDNA溶液(2)aL)中，然后進(jìn)行反應(yīng)。
PCR循環(huán)包括一個(gè)循環(huán)的95°C/10分鐘，以及40個(gè)循環(huán)的94°C/20 秒、55 °C/20秒和72 °C/30秒。
發(fā)現(xiàn)Salusin-a和salusin-卩引起ACAT-1蛋白質(zhì)表達(dá)和ACAT活性 的改變。因此，進(jìn)一歩考察salusin-a和salusin-P對(duì)ACAT-1 mRNA表 達(dá)的影響。將人外周血單核細(xì)胞(4xl(^細(xì)胞/皿)在含10%人血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基(2 mL)中培養(yǎng)7天，以分化成巨噬細(xì)胞。這時(shí)， 在培養(yǎng)期間加入0.6 nM salusin-ot或salusin-p， 以考察salusin-a或 salusin-p對(duì)ACAT-1 mRNA表達(dá)的影響。在培養(yǎng)第7天時(shí)，從細(xì)胞中提 取總RNA。通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR考察salusin-a和salusin-p對(duì)ACAT-1 mRNA的影響。因此，發(fā)現(xiàn)salusin-a將ACAT-1 mRNA的表達(dá)水平抑 制至對(duì)照的80%的水平，發(fā)現(xiàn)salusin-(3將ACAT-1 mRNA的表達(dá)水平 增加至對(duì)照的1.6倍(圖6)。
實(shí)施例4: salusin-a和salusin-p對(duì)人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞泡沫化(膽 固醇酯的積聚)的影響
采用膽固醇酯化測(cè)定作為巨噬細(xì)胞泡沫化的測(cè)定方法[Goldstein JL等人，Methods Enzymol. 1983; 98: 241-260]。巨噬細(xì)胞使乙?；疞DL (AcLDL)經(jīng)清道夫受體而結(jié)合到細(xì)胞中，從而引起溶酶體降解。將 在溶酶體中產(chǎn)生的游離膽固醇轉(zhuǎn)移至ACAT，并因ACAT反應(yīng)而轉(zhuǎn)化
24成膽固醇酯。如果向培養(yǎng)基中加入fH]油酸酯，貝1」[3司油酸酯被結(jié)合到 細(xì)胞中，并被?；鵆oA合成酶轉(zhuǎn)變?yōu)閇SH]油?；?CoA。 ACAT使用 AcLDL來(lái)源的游離膽固醇和如上所述獲得的[SH]油?；?CoA作為底 物，產(chǎn)生膽固醇[3司油酸酯。細(xì)胞中積聚的膽固醇[3司油酸酯的放射活 性可以用作膽固醇酯積聚的敏感指標(biāo)(圖7)。 人血漿LDL通過(guò)下述方法純化。
通過(guò)順序浮選超速離心從人血槳純化LDL (d = 1.019-1.063) [SchumakerVN等人，Methds Enzymol. 1986; 128: 155-170]。將人血漿 (350mL)分配到6個(gè)離心管中，使用RP-42轉(zhuǎn)子在4。C下以100,000 xg (36,000 rpm)超速離心20小時(shí)。從生成物中去除含有乳糜顆粒和 極低密度脂蛋白(VLDL)的混濁上層，使用抽吸器回收下層(黃色層)。 獲得的已經(jīng)去除乳糜顆粒和VLDL的血漿成分的體積用量瓶測(cè)量。其 比重用浮動(dòng)比重計(jì)(floatinghydrometer)測(cè)定。向其中加入固體KBr， 直至達(dá)到"d= 1.063"的條件。假設(shè)"V"代表獲得的已經(jīng)去除乳糜顆 粒和VLDL的血漿成分的體積，"D"代表其比重，則可以通過(guò)下式來(lái) 大致計(jì)算達(dá)到1.063 g/mL的比重所必須加入的KBr的量。 KBr (g) =V (1扁國(guó)D) / 0.68323
將已被調(diào)節(jié)達(dá)到"d= 1.063"的含LDL的血漿成分的一半體積分 配到6個(gè)離心管中。將密度溶液(d= 1.063)導(dǎo)入其中至每個(gè)離心管的 邊緣的水平。使用RP-42轉(zhuǎn)子在4。C下以100,000 xg (36,000rpm)超 速離心20小時(shí)。然后，用巴斯德吸管回收上層(黃色層)(粗LDL)。 上述成分的剩余一半體積用相同的方式分配，然后進(jìn)行超速離心。然 后，回收上層(黃色層)(粗制LDL)。將上述兩項(xiàng)操作獲得的各個(gè)部 分粗LDL混合在一起。將生成物分配到6個(gè)離心管中。將密度溶液(d =1.063)導(dǎo)入其中至每個(gè)離心管邊緣的水平。使用RP-42轉(zhuǎn)子在4。C 下以100，000xg (36,000 rpm)超速離心20小時(shí)。然后，回收上層(黃 色層)(純化LDL)。將LDL加入至透析膜，然后使用EDTA-鹽水(4 L) 在室內(nèi)在低溫下透析。重復(fù)3次12小時(shí)的透析。將生成物用 ULTRAFILTRATION CELL MODEL 8200 (AMICON)濃縮，使得蛋白 質(zhì)濃度為約2mg/mL，然后使用濾器無(wú)菌過(guò)濾。通過(guò)BCA法(Pierce) 測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。LDL用于制備下述的AcLDL。AcLDL以下述方式制備。
將等體積的LDL (蛋白質(zhì)30mg)(如果為2.0 mg蛋白質(zhì)/mL則 15mL)和飽和乙酸鈉混合在一起。將混合物在冰上冷卻，并用攪拌棒 攪拌，期間逐滴加入乙酸酐(150 pL) (5iuL/LDLmg蛋白質(zhì))(每滴5 pL) [Miyazaki A等人，J Biol Chem. 1994;269:5264-5269.]。這時(shí)，向 其中逐滴加入5 N NaOH，用pH計(jì)監(jiān)測(cè)pH，使得pH可以維持在6.5 以上。將生成物在冰上放置1小時(shí)，然后使用EDTA-鹽水(4L)在室 內(nèi)在低溫下透析。重復(fù)3次12小時(shí)的透析。將生成物用 ULTRAFILTRATION CELL MODEL 8200 (AMICON)濃縮。通過(guò)BCA 法(Pierce)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。由此獲得實(shí)驗(yàn)用的AcLDL。
用于下述操作的試劑如下。油酸(185MBq，在1 mL甲苯中，GE Healthcare Bio-Science) (油酸摩爾濃度0.625 mM)
3 mM油酸-牛血清白蛋白(SIGMA):白蛋白濃度為100 mg/mL (1.5 mM)， lmol試劑結(jié)合2-mol油酸。 制備3 mM [3司油酸混合物
將[9,10(n)-3H]油酸(50 |LiL) (9.25 MBq)導(dǎo)入至玻璃燒杯中，并 用氮?dú)飧稍铩?mM油酸-牛血清白蛋白(SIGMA) (5mL)倒入玻 璃燒杯，然后用攪拌棒攪拌5小時(shí)，然后用2卞m濾器無(wú)菌過(guò)濾。
將人外周血單核細(xì)胞(4 x 106細(xì)胞/6 cm皿)在含10%人血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基(2 mL)中培養(yǎng)7天，以分化成巨噬細(xì)胞。這時(shí)， 在培養(yǎng)其月間力B入0.6 nM salusin-oc或salusin畫(huà)p?？疾靤alusin國(guó)ot禾Q salusin-p 對(duì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯積聚(膽固醇酯化)的影響。在第7天，更換培養(yǎng) 基。向細(xì)胞中加入5 (ig/mLAcLDL、 3 mM [3司油酸混合物(67 |uL)(終 濃度0.1 mM)禾B 0.6 nM salusin-a或salusin-p。進(jìn)一步向其中加入適 當(dāng)量的培養(yǎng)基，以得到2mL的總量，然后再培養(yǎng)18小時(shí)。細(xì)胞用PBS 洗滌3次。向每個(gè)皿中加入己垸/異丙醇(3:2，v/v) (lmL)。每個(gè)皿在 室溫下放置l小時(shí)。將己垸/異丙醇回收到脂質(zhì)提取管中。此外，向每 個(gè)皿中加入1 mL己烷/異丙醇，以洗滌細(xì)胞和皿壁，然后回收到同一 脂質(zhì)提取管中。脂質(zhì)提取后，向每個(gè)皿中加入lNNaOH (lmL),以 進(jìn)行蛋白質(zhì)提取。將脂質(zhì)提取管渦旋，并在室溫下放置30分鐘，然后用氮?dú)飧稍?。將提取的?xì)胞脂質(zhì)進(jìn)行渦旋，并加入60)lL異丙醇溶解。
將其總量廣泛地在標(biāo)準(zhǔn)物點(diǎn)之間點(diǎn)樣。通過(guò)TLC進(jìn)行展開(kāi)，使得展開(kāi) 溶劑(己垸/二乙醚/乙酸(90: 10: 1，v/v))到達(dá)TLC板的上邊緣。將 TLC板置于玻璃室中，用碘使脂質(zhì)顯色。將對(duì)應(yīng)于膽固醇油酸酯的部 分用剪刀切下，并將該部分置于閃爍瓶中，然后加入閃爍雞尾酒(Perkin Elmer) (3 mL)進(jìn)行測(cè)定。回收之前加入至每個(gè)皿中的1NNaOH，并 通過(guò)BCA法(Pierce)對(duì)細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定。測(cè)定3 mM [3H] 油酸混合物的比活性(dpm/nmo1)。將細(xì)胞中產(chǎn)生的膽固醇[3司油酸酯 的放射活性(dpm)除以卩H]油酸的比活性(dpm/nmo1)和細(xì)胞蛋白質(zhì) 的量(mg)，從而計(jì)算膽固醇的酯化(nmol/mg細(xì)胞蛋白質(zhì))。
ACAT-1是促進(jìn)巨噬細(xì)胞泡沫化的重要因子。上述實(shí)驗(yàn)揭示了 salusin-oc和salusin-(3以相反的方式影響著ACAT-1的表達(dá)和ACAT的活 性。因此，考察salusin-a和salusin-p對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化的影響。
將人外周血單核細(xì)胞(4 x 106細(xì)胞/6 cm皿)培養(yǎng)7天，以分化成 巨噬細(xì)胞。這時(shí)，考察在培養(yǎng)期間同時(shí)加入的0.6 nM salusin-a和 salusin-P對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化的影響。在培養(yǎng)第7天，向細(xì)胞中加入5 嗎/mL AcLDL、 0.1 mM [3司油酸混合物和0.6 nM salusin-ot或salusin-(3。 細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)24小時(shí)，然后測(cè)定細(xì)胞中積聚的膽固醇[3司油酸酯。 當(dāng)對(duì)照細(xì)胞載有AcLDL時(shí)，觀察到積聚的膽固醇[3司油酸酯為5.6 nmol/mg細(xì)胞蛋白質(zhì)。該結(jié)果是載有AcLDL的細(xì)胞(未負(fù)載對(duì)照細(xì)胞) 所獲得結(jié)果的6.3倍。在用salusin-a處理的細(xì)胞中由AcLDL引起的膽 固醇[3司油酸酯的積聚程度降低至與對(duì)照細(xì)胞(負(fù)載對(duì)照)的50%對(duì)應(yīng) 的水平。在用salusin-P處理的細(xì)胞中積聚程度增加至對(duì)照細(xì)胞的1.6倍 的水平(圖8)。
實(shí)施例5:考察乙?；疞DL (AcLDL)的細(xì)胞參入量-測(cè)定A型清道夫 受體(SR-A)的活性
清道夫受體是在巨噬細(xì)胞上表達(dá)的脂蛋白受體。其識(shí)別修飾的 LDL例如氧化LDL或AcLDL，引起胞吞作用。己經(jīng)參入至細(xì)胞內(nèi)的 該受體的配體在溶酶體中降解。這種清道夫受體在巨噬細(xì)胞形成泡沫 細(xì)胞中發(fā)揮著非常重要的作用。清道夫受體的已知例子包括A型清道夫受體(SR-A)、 CD36、凝集素樣氧化LDL受體-1 (LOX-l)和CD68 [Greaves DR等人，J Lipid Res. 2005; 46: 11-20.]。氧化LDL可以與四 種類(lèi)型的上述清道夫受體結(jié)合。然而，與AcLDL結(jié)合的清道夫受體只 有SR-A。在該實(shí)驗(yàn)中，使用修飾LDL的代表性實(shí)例AcLDL作為配體， 測(cè)定作為能夠識(shí)別AcLDL的專(zhuān)用清道夫受體的SR-A的活性(圖9)。
將外周血人單核細(xì)胞(4 x 106細(xì)胞/6 cm皿)在含10%人血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基(2 mL)中培養(yǎng)7天，以分化成巨噬細(xì)胞。這時(shí)， 在培養(yǎng)期間加入0.6 nM salusin-ot或salusin-p， 以考察salusin-a和 salusin-P對(duì)[^I]AcLDL的胞吞活性(SR-A活性)的影響。在第7天， 更換培養(yǎng)基。將適當(dāng)量培養(yǎng)基加入[^I]AcLDL (5-10 (ig/mL)和0.6 nM salusin-a或salusin-J3中，以得到2 mL的總量。細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)18小時(shí)。
將細(xì)胞用含有3% BSA的PBS洗滌一次，然后用PBS洗滌兩次。 向其中加入0.1NNaOH (lmL)，生成物在室溫下放置30分鐘。將細(xì) 胞回收到聚苯乙烯管(12 x 75 mm, Fisher Scientific Company)中，進(jìn) 一步用0.1NNaOH (lmL)洗滌，并再次回收。細(xì)胞提取溶液的總量 使用Y計(jì)數(shù)儀測(cè)定。其一部分的蛋白質(zhì)濃度通過(guò)BCA法(Pierce)測(cè)定。 通過(guò)將細(xì)胞提取溶液的放射活性(cpm)除以[^I]AcLDL的比活性 (cpm/嗎)和每皿的細(xì)胞蛋白質(zhì)量(mg)，計(jì)算[^I]AcLDL的細(xì)胞結(jié) 合(嗎/mg細(xì)胞蛋白質(zhì))[Miyazaki A等人，J Biol Chem. 1994; 269: 5264-5269]。
降解測(cè)定通過(guò)下述方法進(jìn)行。
經(jīng)清道夫受體被巨噬細(xì)胞參入的["I]AcLDL在溶酶體中被降解。 [巧]AcLDL的蛋白質(zhì)部分——[125I] apo B-100被蛋白質(zhì)降解酶破碎以 形成肽，從而被分泌至細(xì)胞外，然后其可以在三氯乙酸可溶部分中發(fā) 現(xiàn)。同時(shí)，在培養(yǎng)基中沒(méi)有被巨噬細(xì)胞參入的[^I]AcLDL不溶于三氯 乙酸，因此可以通過(guò)離心以沉淀物的形式得以分離。
從每種培養(yǎng)上清液中收集一部分(750 |iL)到聚苯乙烯管(12x75 mm, Fisher Scientific Company)中。向其中加入40%三氯乙酸(250 )uL) 禾口0.7MAgNO3 (200 nL)，并將混合物渦旋，然后以2,500 rpm離心 10分鐘(TOMY, LC-120低速離心機(jī)，轉(zhuǎn)子7015-06)。通過(guò)凝膠過(guò)濾 去除大部分在以碘標(biāo)記AcLDL的步驟中未與蛋白質(zhì)反應(yīng)的游離125I。但是，發(fā)現(xiàn)其一部分仍然有剩余。在該步驟中，剩余部分的1251可以通 過(guò)加入AgN03而以Ag[^I]的形式沉淀出來(lái)。因此，培養(yǎng)上清液中不溶
于三氯乙酸的部分含有未被細(xì)胞參入的[^I]AcLDL和來(lái)源于游離1251 的Ag[1251]。另夕卜，已被細(xì)胞加工的來(lái)自[^I]AcLDL的肽專(zhuān)一地在可溶 于三氯乙酸的部分中檢測(cè)出。離心之后，將上清液(600 )LiL)收集到 不同的管中，并用Y計(jì)數(shù)儀測(cè)定?；跍y(cè)定結(jié)果，對(duì)每個(gè)皿計(jì)算培養(yǎng)上 清液中可溶于三氯乙酸的部分的總放射活性(cpm)。通過(guò)將總放射活 性除以[，]AcLDL的比活性(cpm/jig AcLDL蛋白質(zhì))和每皿的細(xì)胞 蛋白質(zhì)量(mg)，得到[^I]AcLDL的降解率()ng/mg細(xì)胞蛋白質(zhì))。
作為上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其揭示了 salusin-a和salusin-(3控制著巨噬 細(xì)胞的泡沫化。因此，考察受salusin控制的SR-A活性是否會(huì)影響上 述現(xiàn)象。細(xì)胞內(nèi)參入的AcLDL的蛋白質(zhì)部分(apoB-100)被溶酶體中 的蛋白質(zhì)降解酶降解成肽，從而被分泌至細(xì)胞外。在結(jié)合測(cè)定中，測(cè) 定存在于細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)部的1251的放射活性。在降解測(cè)定中，測(cè)定 已在溶酶體中被破碎成肽、并被分泌至細(xì)胞外的[^I]AcLDL(apoB-100 肽片段)的放射活性?；趦煞N測(cè)定，確定SR-A的活性。
將人外周血單核細(xì)胞(4x 1()S細(xì)胞/6cm皿)培養(yǎng)7天，以分化成 巨噬細(xì)胞。這時(shí)，在培養(yǎng)期間加入0.6nMsalusin-a或salusin-(3。然后， 考察salusin-oc和salusin-P對(duì)[^I]AcLD的參入和降解的影響。在此，在 培養(yǎng)第7天時(shí)，向細(xì)胞中加入5-10嗎/mL [125I]AcLDL禾口 0.6 nM salusin-a或salusin-(3，并將細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)18小時(shí)。然后，進(jìn)行結(jié)合 測(cè)定和降解測(cè)定。結(jié)果，在任一測(cè)定中，與對(duì)照細(xì)胞相比，都觀察不 到由salusin-ot和salusin-(3引起的顯著變化。(圖10A禾B IOB，圖10A 顯示結(jié)合測(cè)定結(jié)果，圖10B顯示降解測(cè)定結(jié)果。)因此，已經(jīng)揭示出， salusin-a和salusin-P影響AcLDL參入細(xì)胞后的膽固醇代謝，但不影響 SR-A的活性。
實(shí)施例6: salusin-a和salusin-P對(duì)人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞中的ATP結(jié) 合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1 (ABCA-1)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響
控制巨噬細(xì)胞泡沫化現(xiàn)象的一種機(jī)制是經(jīng)ABCA-1向細(xì)胞外分泌 游離膽固醇的機(jī)制(膽固醇外流)?？疾靤alusin對(duì)ABCA-l蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。將外周血人單核細(xì)胞(4x 1(^細(xì)胞/6cm皿)培養(yǎng)7天，以 分化成巨噬細(xì)胞。這時(shí)，在培養(yǎng)期間加入salusin-ot或salusin-P (0、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8或1.0nM)。然后，考察salusin-a和salusin-卩對(duì)ABCA國(guó)1 蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。在前述使用ABCA-1特異性抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡 法的情況下，發(fā)現(xiàn)salusin-oc和salusin-P均沒(méi)有引起ABCA-1蛋白質(zhì)表 達(dá)的顯著變化。(圖11A和11B:圖11A顯示salusin-ot的結(jié)果，圖11B 顯示salusin-p的結(jié)果。)
實(shí)施例7: salusin-a和salusin-P對(duì)分化后的培養(yǎng)的人單核細(xì)胞源性巨噬 細(xì)胞中的ACAT-1蛋白質(zhì)表達(dá)的影響
在實(shí)施例1-6中每一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在培養(yǎng)的人單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì) 胞的分化期加入salusin-a和salusin-p，使用培養(yǎng)第7天獲得的細(xì)胞來(lái) 考察salusin-a和salusin-(3的影響。在該實(shí)施例中，考察salusin-a和 salusin-(3是否對(duì)分化后獲得的巨噬細(xì)胞中的AC AT-1蛋白質(zhì)表達(dá)具有類(lèi) 似的影響。將外周血人單核細(xì)胞(4x 1()S細(xì)胞/6cm皿)培養(yǎng)7天，以 分化成巨噬細(xì)胞。在第7天時(shí)，向其中加入salusin-ot和salusin-P (0、 0.4、 0.6或1.0nM)，巨噬細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)3天。作為通過(guò)蛋白質(zhì)印跡 法對(duì)ACAT-1進(jìn)行考察的結(jié)果，1.0 nM salusin-ot將ACAT-1蛋白質(zhì)的表 達(dá)水平降低至與對(duì)照的60。/。對(duì)應(yīng)的水平。同時(shí)，0.6nMbsalusin-(3將上 述表達(dá)水平增加至對(duì)照的2.2倍水平(圖12A和12B，圖12A顯示 salusin-a的結(jié)果，圖12B顯示salusin-P的結(jié)果。)。基于這些結(jié)果己經(jīng)揭 示出，即使在單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞之后，salusin-ot或salusin-P對(duì) ACAT-1表達(dá)的控制仍然得以保持。
以下是在上述實(shí)施例中通過(guò)考察新的血管活性物質(zhì)(即salusin-a 和salusin-p)對(duì)培養(yǎng)的人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞的泡沫化(細(xì)胞內(nèi)膽 固醇酯積聚)以及與該泡沫化有關(guān)的基因表達(dá)的影響獲得的主要結(jié)果。
(1) salusin-ot抑制由AcLDL引起的巨噬細(xì)胞泡沫化，salusin-(3則 促進(jìn)由AcLDL引起的巨噬細(xì)胞泡沬化。
(2) salusin-ot抑制細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯化酶ACAT-l的表達(dá)，salusin-卩 則促進(jìn)該酶的表達(dá)。
(3) SR-A能夠識(shí)別并細(xì)胞內(nèi)參入AcLDL的活性不受salusin-a或salusin-p的影響。
(4)在細(xì)胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用的ABCA-1的表達(dá)不受 salusin-oc或salusin-p的影口向。
基于上述結(jié)果己經(jīng)揭示，培養(yǎng)的人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞的泡沫 化以相反的方式受salusin-a和salusin-P的控制，而且控制該泡沫化的 機(jī)制涉及到salusin-oc和salusin-P以相反的方式控制ACAT-1的表達(dá)。
另外，已有報(bào)道稱(chēng)salusin-(3對(duì)促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞或成纖維細(xì)胞 增殖的正面效果不受用salusin-oc預(yù)處理的抑制，因此，可以獲得 salusin-a和salusin-p的累加效應(yīng)[Shichiri M等人，Nat Med. 2003; 9: 1166-1172]。該報(bào)道提出，salusin-a和salusin-p可能經(jīng)由不同的受體作 用于這些細(xì)胞。另外，Wang等人已報(bào)道稱(chēng)，在其中已經(jīng)表達(dá)有小鼠 mas樣G蛋白偶聯(lián)受體Al (mMrgAl)的HEK293T細(xì)胞中，salusin-P 被認(rèn)為是配體[Wang Z等人，Eur J Pharmacol. 2006; 539: 145-150]。同 時(shí)，salusin-a不作為mMrgAl的受體，表明salusin-a和salusin-(3由不同 的受體識(shí)別[Wang Z等人，Eur J Pharmacol. 2006; 539: 145-150]。在該 研究中，獲得的結(jié)果表明salusin-a和salusin-P以相反的方式作用于巨 噬細(xì)胞的泡沫化和ACAT-1表達(dá)。因此，可以假設(shè)salusin-ot和salusin-P 經(jīng)由巨噬細(xì)胞中表達(dá)的不同受體發(fā)揮作用。
實(shí)施例8: salusin-a和salusin-(3在人冠狀動(dòng)脈的動(dòng)脈硬化病變中的表達(dá) 從死于急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)的患者(72歲男性)制備冠 狀動(dòng)脈病理切片，并用己純化的免疫化學(xué)組織染色用抗salusin-a和-p 抗體極性染色。不僅在冠狀動(dòng)脈的斑塊部分中的平滑肌細(xì)胞和成纖維 細(xì)胞中，而且在脂紋中的巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中，都觀察到強(qiáng)的 salusin-P表達(dá)(圖13A-13D)。 Salusin-a禾B salusin-卩被認(rèn)為由共用前體 (Preprosalusin)的共同部分產(chǎn)生。但是，在其中有強(qiáng)salusin-P表達(dá)的 冠狀動(dòng)脈的動(dòng)脈硬化病變中基本上觀察不到salusin-ot的表達(dá)。在其他3 名患者(一名40歲男性、 一名76歲女性和一名86歲女性)中也證實(shí) 了類(lèi)似的發(fā)現(xiàn)。作為上述考察的結(jié)果，已經(jīng)闡明，強(qiáng)的salusin-p表達(dá) 和降低的salusin-ot表達(dá)均深入地參與了人冠狀動(dòng)脈硬化的進(jìn)展。
31實(shí)施例9:使用salusin-a作為標(biāo)志物檢測(cè)動(dòng)脈硬化
考察64名中老年男性(40-86歲)的血清salusin-a濃度和動(dòng)脈硬 化之間的關(guān)系。對(duì)于動(dòng)脈硬化評(píng)價(jià)，使用可以簡(jiǎn)單、非侵入的方式進(jìn) 行的頸動(dòng)脈超聲波心動(dòng)描記法(模式B)。測(cè)定每一側(cè)頸動(dòng)脈內(nèi)膜-中膜 厚度(IMT)的最大水平(最大IMT)。在健康人中最大IMT為1 mm 或更小。已經(jīng)證明，最大IMT大于1 mm是急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)、 中風(fēng)等的危險(xiǎn)因素。通過(guò)Sato K等人，Peptides. 2006; 27: 2561-2566中 所述的放射免疫測(cè)定法來(lái)測(cè)定血清salusin-ot的濃度。血清salusin-a濃 度與頸動(dòng)脈最大IMT之間呈顯著的負(fù)相關(guān)(r = 0.29, P< 0.02;圖14)。 這表明，血清salusin-a的濃度越低，動(dòng)脈硬化的進(jìn)程越靠后期。
實(shí)施例10:使用salusin-a作為標(biāo)志物檢測(cè)急性冠狀動(dòng)脈綜合征、缺血 性心臟病和動(dòng)脈硬化
從以下病例中收集血清標(biāo)本由37名穩(wěn)定性勞力型心絞痛患者 (26名男性病例和11名女性病例)、60名急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者(發(fā) 作后6小時(shí)內(nèi))(41名男性病例和19名女性病例)以及76名陳舊性心 肌梗塞患者(自急性冠狀動(dòng)脈綜合征發(fā)作后已經(jīng)過(guò)了 6個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí) 間)(61名男性病例和15名女性病例)組成的缺血性心臟病病例(共 計(jì)173名病例)；以及由40名原發(fā)性高血壓患者(28名男性病例和12 名女性病例)和55名健康志愿者G5名男性病例和20名女性病例) 組成的對(duì)照病例。根據(jù)Sato K等人，Peptides. 2006; 27: 2561-2566的描 述通過(guò)放射免疫測(cè)定法來(lái)測(cè)定Salusin-a濃度。所有急性冠狀動(dòng)脈綜合 征病例均接受急診冠狀動(dòng)脈成像。基于發(fā)現(xiàn)具有動(dòng)脈硬化病變的冠狀 動(dòng)脈分支(右冠狀動(dòng)脈+左前降支+左回旋支=總計(jì)3個(gè)分支)的數(shù)目 來(lái)評(píng)價(jià)冠狀動(dòng)脈病變的嚴(yán)重性。另外，所有高血壓病例和23名健康志 愿者均接受頸動(dòng)脈超聲波心動(dòng)描記法。具有清晰邊界的IMT為1.1 mm 或更大的病變被指定為斑塊病變。斑塊分?jǐn)?shù)(plaque score)確定為所 有斑塊病變(右側(cè)和左側(cè))的厚度的總和。斑塊分?jǐn)?shù)1.1-5指定成對(duì)應(yīng) 于輕度動(dòng)脈硬化。斑塊分?jǐn)?shù)5-10指定成對(duì)應(yīng)于中度動(dòng)脈硬化，斑塊分 數(shù)10以上指定成對(duì)應(yīng)于重度動(dòng)脈硬化。
對(duì)于缺血性心臟病患者，血清salusin-a濃度為4.9 ± 0.6 pM。該數(shù)值顯著低于健康志愿者(21.7士1.5pM)(均值土SEM，下同)和高血壓 患者(15.4 ± 1.1 pM) (p< 0.0001)。在缺血性心臟病患者中，勞力型 心絞痛患者的血清salusin-oc濃度是穩(wěn)定的(6.4±0.9pM)，急性冠狀動(dòng) 脈綜合征患者為3.6土0.6pM，陳舊性心肌梗塞患者為5.2± 1.2pM (圖 15)。作為60名急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者的急診冠狀動(dòng)脈成像的結(jié)果， 其中23例發(fā)現(xiàn)有單支血管病變，17例發(fā)現(xiàn)有兩支血管病變，20例發(fā) 現(xiàn)有3支血管病變。單支血管病變患者的salusin-ot濃度為5.2 ± 1.0 pM， 兩支血管病變患者的salusin-ot濃度為3.1 ± 1.4 pM， 3支血管病變患者 的salusin-a濃度為2.3 ± 0.9 pM。 3支血管病變患者的結(jié)果要顯著低于 單支血管病變的患者(p<0.05，圖16)。
對(duì)于40名高血壓患者和23名健康志愿者，頸動(dòng)脈最大IMT和 salusin-a濃度之間呈負(fù)相關(guān)。另外，斑塊分?jǐn)?shù)隨著嚴(yán)重性增加而逐漸減 小。因此，認(rèn)為salusin-a濃度下降參與了動(dòng)脈硬化的進(jìn)展。
就上述而言，假設(shè)salusin-oc濃度下降反映了動(dòng)脈硬化、特別是缺 血性心臟病的存在。對(duì)于急性冠狀動(dòng)脈綜合征，所得到salusin-a的濃 度比任何其他缺血性心臟病病例中得到的濃度更低。另外，發(fā)現(xiàn) salusin-oc的濃度隨著冠狀動(dòng)脈病變的嚴(yán)重性增加而進(jìn)一步下降。這表明 具有抗動(dòng)脈硬化作用的sahisin-ot可以非常有效地用作指示急性冠狀動(dòng) 脈綜合征的發(fā)作或嚴(yán)重性的標(biāo)志物。
實(shí)施例11: salusin-a和salusin-p的連續(xù)給藥對(duì)動(dòng)脈硬化的影響
使用apoE缺陷小鼠作為動(dòng)脈硬化動(dòng)物模型，考察salusin-a和 salusin-p的連續(xù)給藥對(duì)動(dòng)脈硬化的影響。在此，還考察了 salusin-ot或 salusin-P的抗血清作用。除了考察動(dòng)脈硬化病變以外，研究還集中于對(duì) 于動(dòng)脈硬化原發(fā)病灶的形成非常重要的巨噬細(xì)胞泡沫化，并且還測(cè)定 了氧化LDL引起的膽固醇酯積聚。對(duì)于能夠識(shí)別氧化LDL的清道夫 受體(CD36和SR-A)、細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯化酶(酰基-CoA)(膽固醇酰 基轉(zhuǎn)移酶l (ACATl))以及參與過(guò)量細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇的細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn) (膽固醇外流)的機(jī)制的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體Al (ABCA1)、 ABCG1 和SR-BI，進(jìn)行了表達(dá)分析。
上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)根據(jù)ShowaUniversity (日本)制定的實(shí)驗(yàn)實(shí)踐指南
33進(jìn)行。該研究用的所有apoE缺陷小鼠均購(gòu)自Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, U.S.A.)。
將13周齡雄性apoE缺陷小鼠(72只小鼠)分成以下6組(i)生 理鹽水(對(duì)照);(ii) salusin-a (0.6畫(huà)l/kg/h); (iii) salusin-卩(0.6 nmol/kg/h); (iv) salusin-ot (0.6 nmol/kg/h) +抗salusin-a血清(1.4 嗎/kg/h ); ( v ) salusin-P (0.6 nmol/kg/h ) +抗salusin-p血清(1.4 jig/kg/h); 和(vi)抗salusin-(3血清(1.4嗎/kg/h)。使用微量滲透泵對(duì)小鼠連續(xù)皮 下給藥4-8周。微量滲透泵和其中所含的溶液每周更換。
對(duì)攝取正常飲食的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。測(cè)定以下參數(shù)。
1. 主動(dòng)脈的動(dòng)脈硬化病變的分析
將每條采集的主動(dòng)脈沿縱向切開(kāi)，然后進(jìn)行油紅O染色，用于考 察每個(gè)具有脂質(zhì)色素沉著的動(dòng)脈粥樣硬化病變的表面積。使用Adobe Photoshop (Adobe System Inc., San Jose, CA, U.S.A.)鑒別動(dòng)脈硬化病 變，然后使用NIH Scion Image (Scion Corp., Frederick, MD, U.S.A.)進(jìn) 行各處病變的表面積的定量分析。另外，制備主動(dòng)脈附近(緊接著主 動(dòng)脈瓣下方)的切片，然后進(jìn)行油紅O染色，用于對(duì)動(dòng)脈硬化病變進(jìn) 行詳細(xì)分析。
2. 巨噬細(xì)胞的分析
(1) 考察細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯積聚 在腹膜內(nèi)給予巰基乙酸鹽后的第4天，收集滲出的巨噬細(xì)胞，并
用含10%胎牛血清的RPMI1640溶液培養(yǎng)。向培養(yǎng)溶液中加入氧化LDL (10嗎/mL)禾口[3司油酸(0.1 mM)。 13小時(shí)后，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)積聚的膽 固醇[3司油酸的放射活性，以對(duì)巨噬細(xì)胞的泡沬化進(jìn)行評(píng)價(jià)。
(2) 考察膽固醇外流 將以上述方式收集的巨噬細(xì)胞在如上制備的含有用[3司膽固醇(74
kBq/mL)標(biāo)記的氧化LDL (10pg/ml)的培養(yǎng)溶液中保溫24小時(shí)，并 用PBS洗滌兩次。之后，將巨噬細(xì)胞在其中已添加有HDL (15 pg/mL) 的含0.1% BSA的RPMI1640溶液中保溫16小時(shí)。培養(yǎng)溶液以15,000 rpm離心10分鐘，以從中去除殘?jiān)?。?xì)胞用PBS洗滌兩次，然后溶解 在lNNaOH (0.3 mL)中。測(cè)定培養(yǎng)溶液和細(xì)胞提取溶液中的[3司膽 固醇放射活性膽固醇外流率(％)=培養(yǎng)溶液中的[3司膽固醇放射活性/培養(yǎng)溶液中的[3司膽固醇放射活性+細(xì)胞提取溶液中的[3司膽固醇 放射活性X 100 (3)考察與泡沫化有關(guān)的基因的表達(dá)
如(1)中的實(shí)驗(yàn)?zāi)菢邮占奘杉?xì)胞，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法分析參與
巨噬細(xì)胞泡沬化的基因(即清道夫受體CD36和能夠識(shí)別氧化LDL的 SR-A、細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯化酶ACAT1以及參與膽固醇外流的ABCA1、 ABCG1禾n SR-BI)的蛋白質(zhì)表達(dá)。對(duì)于巨噬細(xì)胞功能的內(nèi)標(biāo)，還考察 了P-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。為了對(duì)條帶濃度進(jìn)行定量，使用Analyzer(ATTO Corporation, Tokyo )。
作為上述考察的結(jié)果，獲得了以下結(jié)果。
1. 主動(dòng)脈的動(dòng)脈硬化病變
給藥后4周，與用生理鹽水處理的對(duì)照小鼠(圖17-1A)相比，在 用salusin-P處理的apoE缺陷小鼠中在從主動(dòng)脈根至頭臂動(dòng)脈分岔的廣 泛區(qū)域中觀察到用油紅O染成紅色的主動(dòng)脈弓的動(dòng)脈硬化病變(圖 17-lC，箭頭)。關(guān)于對(duì)各組(由6只小鼠組成)測(cè)定的動(dòng)脈硬化病變 表面積的平均值，發(fā)現(xiàn)salusin-p處理組的平均值已經(jīng)增加至對(duì)照組的 約2.5倍(P < 0.005,圖17-2)。在近端主動(dòng)脈切片中，與對(duì)照組(圖 17-1F)相比，在salusin-(3處理組中觀察到用油紅0染成紅色的粥樣斑 的形成和血管壁的增厚(圖17-lH，箭頭)。在除salusin-P之外還用抗 salusin-P血清處理的小鼠中，與單用salusin-P處理的小鼠相比，主動(dòng)脈 的動(dòng)脈硬化病變(圖17-1D)、粥樣斑和血管壁的增厚(圖17-11)得到 改善。在單用抗salusin-(3血清處理的小鼠中，觀察到與對(duì)照小鼠類(lèi)似 的動(dòng)脈硬化病變(圖17-lE和J)。
給藥后8周，在用生理鹽水處理的對(duì)照小鼠中，主動(dòng)脈弓中的動(dòng) 脈硬化病變的大小顯著增加(圖18-lA，箭頭)。但是，作為給予salusin-ot 的結(jié)果，動(dòng)脈硬化表面積減小至給予salusin-oc前的一半以下(圖18-1B 和18-2)。另夕卜，作為給予salusin-a的結(jié)果，觀察不到明顯的斑塊形成 (圖18-1B和E)。在抗salusin-a血清的存在下，salusin-a對(duì)動(dòng)脈硬化 病變的抑制效應(yīng)消失(圖18-lC和F和18-2)。
2. 巨噬細(xì)胞的分析
給藥后4周，在給予salusin-a的情況下，由氧化LDL (細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯積聚)引起的腹膜內(nèi)收集的滲出巨噬細(xì)胞的泡沫化減少到對(duì)照
的大約l/4的水平(P<0.05，圖19A)。在給予salusin-P的情況下，巨 噬細(xì)胞的泡沫化增加至對(duì)照的約2倍的水平(P〈0.01，圖19A)。但是， 在抗salusin-卩血清的存在下，其被抑制到對(duì)照的水平(P < 0.01，圖 19A)。在salusin-oc的存在下HDL引起的膽固醇外流增加到對(duì)照的約2 倍的水平(P<0.01，圖19B)。
圖20顯示了在同一時(shí)期參與巨噬細(xì)胞泡沬化的基因的蛋白質(zhì)表達(dá) 水平。Salusin-ot不影響能夠識(shí)別氧化LDL的清道夫受體(CD36， SR-A) 的表達(dá)(圖20A和B)。但是，salusin-ot將ACAT1的表達(dá)減少到初始 水平的大約一半的水平(P < 0.05，圖20C)，并將參與膽固醇外流的 ABCA1、 ABCG1和SR-BI的表達(dá)增加到初始水平的1.5-2倍的水平(P < 0.05，圖20D、 E和F)。同時(shí)，salusin-p將CD36、 SR國(guó)A和ACAT1 的表達(dá)增加到對(duì)照水平的大約1.5-2.8倍的水平(P<0.05，圖20A、 B 禾口C)。上述salusin-P的作用完全被抗salusin P血清所取消(圖20A、 B 和C)。
工業(yè)應(yīng)用性
如實(shí)施例中所述，salusin-oc抑制巨噬細(xì)胞的泡沫化，從而抑制動(dòng)脈 硬化病變的形成。因此，salusin-ot可以用作動(dòng)脈硬化性疾病的預(yù)防性治 療劑。同時(shí)，salusin-P促進(jìn)巨噬細(xì)胞的泡沬化，從而促進(jìn)動(dòng)脈硬化病變 的形成。因此，動(dòng)脈硬化性疾病可以通過(guò)抑制salusin-P的作用來(lái)預(yù)防 和治療?？箂alusin-(3抗體抑制salusin-P的作用，因此其可以用作動(dòng)脈硬 化性疾病的預(yù)防性治療劑。此外，生物樣品例如血清、尿等中的 salusin-a濃度與動(dòng)脈硬化病變的形成有關(guān)。因此，生物樣品中的 salusin-oc可以用作用于動(dòng)脈硬化性疾病的檢測(cè)或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的標(biāo)志物。
抑制salusin-a或salusin-p的作用的拮抗性化合物可以用于預(yù)防/治 療動(dòng)脈硬化性疾病。另外，salusin-a可以用作檢測(cè)動(dòng)脈硬化性疾病用的 標(biāo)志物。如上所述，本發(fā)明可以應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。
本文引用的所有出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)?jiān)诖巳咳牟⑷胱鳛?引證。
權(quán)利要求
1.一種用于動(dòng)脈硬化性疾病的治療劑，其包括salusin-α作為活性成分。
2. —種用于動(dòng)脈硬化性疾病的治療劑，其包括salusin-p的拮抗劑 作為活性成分。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于動(dòng)脈硬化性疾病的治療劑，其中所 述salusin-p的拮抗劑是抗salusin-p抗體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的用于動(dòng)脈硬化性疾病的治 療劑，其中所述動(dòng)脈硬化性疾病選自急性冠狀動(dòng)脈綜合征、缺血性心 臟病，即心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血、主動(dòng)脈瘤、主動(dòng)脈夾 層、腎硬化和閉塞性動(dòng)脈硬化癥。
5. —種用于動(dòng)脈硬化性疾病的治療組合物，其包括salusin-a，并 包括salusin-p的拮抗劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于動(dòng)脈硬化性疾病的治療組合物，其 中所述salusin-(3的拮抗劑是抗salusin-p抗體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的用于動(dòng)脈硬化性疾病的治療組合物， 其中所述動(dòng)脈硬化性疾病選自急性冠狀動(dòng)脈綜合征、缺血性心臟病， 即心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血、主動(dòng)脈瘤、主動(dòng)脈夾層、腎 硬化和閉塞性動(dòng)脈硬化癥。
8. —種用于檢測(cè)動(dòng)脈硬化性疾病的方法，其包括化驗(yàn)生物樣品中 的salusin-ou
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于檢測(cè)動(dòng)脈硬化性疾病的方法，其中 所述動(dòng)脈硬化性疾病選自急性冠狀動(dòng)脈綜合征、缺血性心臟病，即心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血、主動(dòng)脈瘤、主動(dòng)脈夾層、腎硬化 和閉塞性動(dòng)脈硬化癥。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的用于檢測(cè)動(dòng)脈硬化性疾病的方法，其中所述生物樣品選自血清、血漿和尿。
11. 一種用于確定動(dòng)脈硬化性疾病的嚴(yán)重性的方法，其包括化驗(yàn)生物樣品中的salusin-a。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的用于確定動(dòng)脈硬化性疾病的嚴(yán)重性的 方法，其中所述動(dòng)脈硬化性疾病選自急性冠狀動(dòng)脈綜合征、缺血性心 臟病，即心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血、主動(dòng)脈瘤、主動(dòng)脈夾 層、腎硬化和閉塞性動(dòng)脈硬化癥。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的用于確定動(dòng)脈硬化性疾病的嚴(yán)重 性的方法，其中所述生物樣品選自血清、血漿和尿。
14. 一種用于檢測(cè)動(dòng)脈硬化性疾病的診斷標(biāo)志物，其包括 salusin-ou
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的用于檢測(cè)動(dòng)脈硬化性疾病的診斷標(biāo)志 物，其中所述動(dòng)脈硬化性疾病選自急性冠狀動(dòng)脈綜合征、缺血性心臟 病，即心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血、主動(dòng)脈瘤、主動(dòng)脈夾層、 腎硬化和閉塞性動(dòng)脈硬化癥。
16. —種用于檢測(cè)動(dòng)脈硬化性疾病的試劑，其包括抗salusin-a抗 體，并使用salusin-a作為檢測(cè)動(dòng)脈硬化性疾病的診斷標(biāo)志物。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的用于檢測(cè)動(dòng)脈硬化性疾病的試劑，其 中所述動(dòng)脈硬化性疾病選自急性冠狀動(dòng)脈綜合征、缺血性心臟病，即 心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血、主動(dòng)脈瘤、主動(dòng)脈夾層、腎硬 化和閉塞性動(dòng)脈硬化癥。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于動(dòng)脈硬化性疾病的預(yù)防和治療劑以及用于檢測(cè)動(dòng)脈硬化性疾病的方法或試劑。此外，本發(fā)明提供包括salusin-α作為活性成分的用于動(dòng)脈硬化性疾病的治療劑、包括salusin-β的拮抗劑作為活性成分的用于動(dòng)脈硬化性疾病的治療劑、以及用于檢測(cè)動(dòng)脈硬化性疾病的方法，上述方法包括化驗(yàn)生物樣品中的salusin-α。
文檔編號(hào)C07K14/47GK101687008SQ20088002302
公開(kāi)日2010年3月31日 申請(qǐng)日期2008年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月11日
發(fā)明者七里真義, 渡部琢也 申請(qǐng)人:株式會(huì)社蛋白質(zhì)表達(dá);學(xué)校法人昭和大學(xué);國(guó)立大學(xué)法人東京醫(yī)科齒科大學(xué)