專利名稱：治療和診斷Her-2/neu相關(guān)惡性腫瘤的組合物和方法
發(fā)明
背景技術(shù)：
領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及癌癥(尤其是乳腺癌)的治療和診斷。更具體地，本發(fā)明涉及至少含有Her-2/Neu蛋白的免疫原性片斷的多肽，以及編碼這些多肽的多核苷酸。這些多肽和多核苷酸可用于藥物組合物(如疫苗)以及其它用于診斷和治療人類(lèi)惡性腫瘤的組合物。
背景技術(shù)：
盡管財(cái)力和人力資源投資巨大，但癌癥仍然是死亡的主要原因之一。例如，癌癥是年齡在35到74歲之間的婦女死亡的主要原因。乳腺癌是婦女最常見(jiàn)的惡性腫瘤，而且乳腺癌的發(fā)病率仍在增長(zhǎng)。九分之一的婦女診斷有此疾病。治療乳腺癌的標(biāo)準(zhǔn)方法集中在組合采用手術(shù)、放射療法和化學(xué)療法。這些方法對(duì)某些惡性腫瘤獲得了一些驚人的成功。但是，這些方法并沒(méi)有對(duì)所有惡性腫瘤都成功，而且當(dāng)在某一階段以后試圖治療時(shí)乳腺癌常常不可治愈。需要預(yù)防和治療的替代方法。
惡性腫瘤的共同特征是細(xì)胞生長(zhǎng)不受控制。癌細(xì)胞似乎經(jīng)歷了從正常表型到能自主生長(zhǎng)的惡性表型的轉(zhuǎn)化過(guò)程。體細(xì)胞基因的擴(kuò)增和過(guò)表達(dá)被認(rèn)為是導(dǎo)致正常細(xì)胞向癌性細(xì)胞轉(zhuǎn)化的共同基本事件。致癌基因編碼的惡性表型特征在細(xì)胞分裂過(guò)程中傳遞給轉(zhuǎn)化細(xì)胞的子代細(xì)胞。
與癌基因有關(guān)的研究已經(jīng)鑒定了至少40個(gè)在惡性細(xì)胞中起作用、并負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)化或與轉(zhuǎn)化有關(guān)的癌基因。根據(jù)基因產(chǎn)物(如癌基因表達(dá)的蛋白質(zhì))的推測(cè)功能或定位，癌基因被分為不同類(lèi)群。
據(jù)信癌基因是正常細(xì)胞生理某些方面所必需的。在這點(diǎn)上，HER-2/neu癌基因是癌基因的酪氨酸蛋白激酶家族的成員，并與表皮生長(zhǎng)因子受體有高度的同源性。推測(cè)HER-2/neu在細(xì)胞生長(zhǎng)和/或分化中起作用。HER-2/neu似乎通過(guò)由本質(zhì)上正常的基因產(chǎn)物的增加表達(dá)或失控表達(dá)引起的定量機(jī)制誘導(dǎo)惡性腫瘤。
HER-2/neu(p185)是HER-2/neu癌基因的蛋白產(chǎn)物。在許多癌癥(包括乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌和血癌)中HER-2/neu基因被擴(kuò)增，HER-2/neu蛋白被過(guò)表達(dá)。HER-2/neu與惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。發(fā)現(xiàn)它在50％-60％導(dǎo)管原位癌(ductal in situ carcinoma)和20％-40％的全部乳腺癌以及相當(dāng)大比例的卵巢、前列腺、結(jié)腸和肺中發(fā)生的腺癌中存在。HER-2/neu不僅與惡性表型有密切聯(lián)系，而且與惡性腫瘤的進(jìn)攻性(aggressiveness)有密切聯(lián)系，這在四分之一的全部侵襲性乳腺癌中發(fā)現(xiàn)。HER-2/neu過(guò)表達(dá)與乳腺癌和卵巢癌的預(yù)后差有關(guān)。HER-2/neu是相對(duì)分子量為185kD的跨膜蛋白，大約長(zhǎng)1255個(gè)氨基酸(aa)。它具有與表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)有40％同源性的約645個(gè)氨基酸的細(xì)胞外結(jié)合域(ECD)、高度疏水的跨膜錨定域(TMD)和與EGFR有80％同源性的大約580個(gè)氨基酸的羧基端細(xì)胞質(zhì)域(CD)。
由于與HER-2/neu有關(guān)的癌癥的治療中存在的困難，本領(lǐng)域需要改進(jìn)的化合物和組合物。本發(fā)明滿足了該需要，并進(jìn)一步提供其它相關(guān)優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供具有免疫原性的Her-2/neu多肽和多核苷酸組合物，也就是說(shuō)，它們能引起免疫應(yīng)答，特別是體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答，如本文進(jìn)一步所述。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該組合物是包含SEQ ID NO3所示的HLA-B44限制的、天然加工的Her-2/neu表位的多肽序列，或編碼該多肽的多核苷酸組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供這里公開(kāi)的多肽和/或多核苷酸序列的片斷、變體和/或衍生物，其中，所述片斷、變體和/或衍生物優(yōu)選具有這里所示多肽序列免疫原活性(immunogenic activity)水平的至少約50％，優(yōu)選至少約70％，更優(yōu)選至少約90％的免疫原性水平。
本發(fā)明還提供包含所述多核苷酸的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染了這種表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
在其它方面，本發(fā)明提供包含上述多肽或多核苷酸和生理可接受載體的藥物組合物。
在本發(fā)明的有關(guān)方面，提供用于預(yù)防或治療的藥物組合物，例如疫苗組合物。這些組合物一般含有本發(fā)明的免疫原性多肽或多核苷酸和免疫刺激劑，如佐劑。
本發(fā)明還提供含有下列成分的藥物組合物(a)可與本發(fā)明的多肽或其片段特異結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段；和(b)生理學(xué)可接受的載體。
在其它方面，本發(fā)明提供含有下列成分的藥物組合物(a)表達(dá)如上所述的多肽的抗原呈遞細(xì)胞，和(b)藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。示例性抗原呈遞細(xì)胞包括樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和B細(xì)胞。
在相關(guān)方面，提供含有下列成分的藥物組合物(a)表達(dá)如上所述的多肽的抗原呈遞細(xì)胞，和(b)免疫刺激劑。
在其它方面，本發(fā)明還提供含有至少一個(gè)如上所述多肽的融合蛋白，以及編碼這種融合蛋白的多核苷酸，它們一般是采用藥物組合物的形式，例如疫苗組合物，含有生理學(xué)可接受的載體和/或免疫刺激劑。融合蛋白可含有如此處所述的多個(gè)免疫原性多肽或其部分/變體，還可含有一個(gè)或多個(gè)有助于多肽表達(dá)、純化和/或免疫原性的多肽片段。
在其它方面，本發(fā)明提供刺激患者免疫應(yīng)答，優(yōu)選地刺激病人的T細(xì)胞應(yīng)答的方法，包括施用Her-2/neu多核苷酸組合物，優(yōu)選編碼ICD區(qū)域中一些或全部的Her-2/neu多核苷酸，更優(yōu)選至少編碼HLA-B44限制的、天然加工的SEQ ID NO3所示Her-2/neu表位的多核苷酸?；颊呖赡芑加邪┌Y，在這種情況中，該方法提供對(duì)疾病的治療，或者可以預(yù)防性地處置認(rèn)為有患該病危險(xiǎn)的患者。
在其它方面，本發(fā)明還提供從生物樣品中除去腫瘤細(xì)胞的方法，包括使生物樣品接觸可與本發(fā)明的多肽特異反應(yīng)的T細(xì)胞，其中在足以從樣品中去除表達(dá)該多肽的細(xì)胞的條件下和時(shí)間內(nèi)進(jìn)行此接觸步驟。
在有關(guān)方面，提供抑制患者癌癥發(fā)展的方法，包括對(duì)患者施用如上所述處理的生物樣品。
在其它方面，還提供刺激和/或擴(kuò)增對(duì)于本發(fā)明的多肽特異的T細(xì)胞的方法，包括在足以刺激和/或擴(kuò)增T細(xì)胞的條件下和時(shí)間內(nèi)，使T細(xì)胞接觸下列成分中的一種或多種(i)如上所述的多肽；(ii)編碼這種多肽的多核苷酸；和/或(iii)表達(dá)這種多肽的抗原呈遞細(xì)胞。也提供含有如上所述制備的T細(xì)胞的分離的T細(xì)胞群體。
在其它方面，本發(fā)明提供抑制患者癌癥發(fā)展的方法，包括對(duì)患者施用有效量的如上所述的T細(xì)胞群體。
本發(fā)明還提供抑制患者癌癥發(fā)展的方法，包括下列步驟(a)將自患者分離的CD4+和/或CD8+T細(xì)胞與下列成分之一或多種一起孵育(i)含有此處公開(kāi)的多肽的至少免疫原性部分的多肽；(ii)編碼這種多肽的多核苷酸；和(iii)表達(dá)這種多肽的抗原呈遞細(xì)胞；和(b)對(duì)患者施用有效量的增殖T細(xì)胞，從而抑制患者癌癥的發(fā)展。在對(duì)患者施用前，增殖的細(xì)胞可以但不必須克隆化。
在其它方面，本發(fā)明提供確定患者是否患有癌癥(優(yōu)選癌)的方法，包括(a)使從患者獲得的生物樣品接觸能與上述多肽結(jié)合的結(jié)合劑；(b)檢測(cè)樣品中可與該結(jié)合劑結(jié)合的多肽的量；和(c)將多肽的量與預(yù)定的截?cái)嘀迪啾容^，從而確定患者是否患有癌癥。在優(yōu)選實(shí)施方案中，結(jié)合劑是抗體，更優(yōu)選地是單克隆抗體。
在其它方面，本發(fā)明也提供監(jiān)測(cè)患者癌癥進(jìn)展的方法。這些方法包括下列步驟(a)使第一時(shí)間點(diǎn)從患者獲得的生物樣品接觸能與上述多肽結(jié)合的結(jié)合劑；(b)檢測(cè)樣品中與該結(jié)合劑結(jié)合的多肽的量；(c)使用在隨后的時(shí)間點(diǎn)從患者獲得的生物樣品重復(fù)步驟(a)和(b)；和(d)比較步驟(b)和(c)中檢測(cè)的多肽的量，從而監(jiān)測(cè)患者癌癥的進(jìn)展。
在其它方面，本發(fā)明提供可與上述多肽結(jié)合的抗體，如單克隆抗體，以及含有這些抗體的診斷試劑盒。也提供含有一種或多種上述寡核苷酸探針或引物的診斷試劑盒。
在參考下列詳述和附圖后，本發(fā)明的這些和其它方面將是顯然的。此處公開(kāi)的所有參考文獻(xiàn)均在此完整地引入作為參考，就象每一篇文獻(xiàn)單獨(dú)引入一樣。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了51Cr釋放實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，說(shuō)明用AdV致敏的CD8+T細(xì)胞系的ICD反應(yīng)性。正常供體PBMC用感染了表達(dá)ICD的重組AdV的DC致敏。該實(shí)驗(yàn)是標(biāo)準(zhǔn)的4小時(shí)51Cr釋放實(shí)驗(yàn)；靶標(biāo)是未感染的或感染了表達(dá)ICD或EGFP的重組痘苗病毒的自體B-LCL，如圖所標(biāo)示。
圖2顯示了在MCF-7腫瘤細(xì)胞上進(jìn)行表面Her-2/neu的流式細(xì)胞計(jì)量分析的結(jié)果。細(xì)胞用抗表面Her-2/neu的mAb(單克隆抗體)染色，然后用與PE綴合的(conjugated)第二兔抗小鼠Ig抗體染色。用流式細(xì)胞術(shù)分析標(biāo)記的細(xì)胞。平均熒光強(qiáng)度值如下MCF-7＝32；MCF-7+RTV-H2N＝165；MCF-7+Ad-H2N＝683；MCF-7+RTV-H2N+Ad-H2N＝651。
圖3說(shuō)明了EL4-Her-2/neu的生長(zhǎng)被編碼Her-2/neu的質(zhì)粒DNA的接種所抑制。在第0天(d0)和21天(d21)用pVR101 Her-2/neu，pVR1012-ECD或pVR1012-ICD(100μg)免疫(i.m.(肌內(nèi)))小鼠(每組5只)。在第35天(d35)皮下用200,000個(gè)EL4-Her-2/neu細(xì)胞攻擊小鼠。在腫瘤攻擊后監(jiān)測(cè)腫瘤大小25天。
圖4說(shuō)明了EL4-Her-2/neu的生長(zhǎng)被Her-2/neu ICD而不被ECD蛋白亞單位的接種所部分抑制。在第0天(d0)和21天(d21)用Montanide 720中的Her-2/neu ICD或Her-2/neu ECD蛋白質(zhì)(50μg)免疫(s.q.)小鼠(每組4只)。在第35天(d35)皮下用200,000個(gè)EL4-Her-2/neu細(xì)胞攻擊小鼠。在腫瘤攻擊后監(jiān)測(cè)腫瘤大小25天。
序列標(biāo)識(shí)SEQ ID NO1描述了編碼Her-2/neu蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO2描述了Her-2/neu蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO3描述了Her-2/neu的天然加工的HLA-B44限制性表位的氨基酸序列，相當(dāng)于Her-2/neu蛋白質(zhì)的第1021-1030位氨基酸。
SEQ ID NO4是克隆HICD_CT_His_coding_region的測(cè)定的cDNA。
SEQ ID NO5是克隆HICD_plus_8_HIS的測(cè)定的cDNA。
SEQ ID NO6是克隆HICD_native_coding_region的測(cè)定的cDNA。
SEQ ID NO7是克隆HICD_in_pPDM_coding_sequence的測(cè)定的cDNA。
SEQ ID NO8是SEQ ID NO4公開(kāi)的cDNA所編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO9是SEQ ID NO6公開(kāi)的cDNA所編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO10是SEQ ID NO7公開(kāi)的cDNA所編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO11是SEQ ID NO5公開(kāi)的cDNA所編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO12是克隆68499(17D5 T細(xì)胞克隆的TCRβ鏈)的測(cè)定的cDNA。
SEQ ID NO13是克隆68498(17D5 T細(xì)胞克隆的TCRα鏈)的測(cè)定的cDNA。
SEQ ID NO14是SEQ ID NO12公開(kāi)的cDNA所編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO15是SEQ ID NO13公開(kāi)的cDNA所編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO16是引物PDM-44的DNA序列。
SEQ ID NO17是引物PDM-45的DNA序列。
SEQ ID NO18是引物PDM-591的DNA序列。
SEQ ID NO19是引物PDM-592的DNA序列。
SEQ ID NO20是引物PDM-72的DNA序列。
SEQ ID NO21是引物PDM-61的DNA序列。
SEQ ID NO22是引物TCRVα-16 5’的DNA序列。
SEQ ID NO23是引物TCRα3’的DNA序列。
SEQ ID NO24是引物TCRVβ-14. 5’的DNA序列。
SEQ ID NO25是引物TCRβ3’的DNA序列。
發(fā)明詳述本發(fā)明一般涉及組合物及其在癌癥(特別是乳腺癌)治療和診斷中的應(yīng)用。如下進(jìn)一步所述，本發(fā)明的示例性組合物包含但不限于Her-2/neu多肽，特別是免疫原性多肽，編碼這些多肽的多核苷酸，抗體和其它結(jié)合劑，抗原呈遞細(xì)胞(APC)和免疫系統(tǒng)細(xì)胞(例如T細(xì)胞)。
除非特別指明與之不同，本發(fā)明的實(shí)施將使用常規(guī)病毒學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)方法和本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的重組DNA技術(shù)，為了舉例說(shuō)明的目的，其中許多技術(shù)在下面描述。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分解釋。參見(jiàn)，例如，Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(Molecular CloningA Laboratory Manual)(第二版，1989)；Maniatis等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(Molecular CloningALaboratory Manual)(1982)；《DNA克隆使用手冊(cè)》(DNA CloningA Practical Approach)第I卷和第II卷(D.Glover編寫(xiě))；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(N.Gait編寫(xiě)，1984)；核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization)(B.Hames和S.Higgins編寫(xiě)，1985)；《轉(zhuǎn)錄和翻譯》(Transcription and Translation)(B.Hames和S.Higgins編寫(xiě)，1984)；《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)》(AnimalCell Culture)(R.Freshney編寫(xiě)，1986)；Perbal，《分子克隆實(shí)踐指南》(A practical Guide to Molecular Cloning)(1984)。
無(wú)論在上文還是在下文引用的所有公開(kāi)文本、專利和專利申請(qǐng)，在此均完整引用作為參考。
在本說(shuō)明書(shū)和附加權(quán)利要求書(shū)中使用時(shí)，單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)形式，除非該內(nèi)容清楚地指明。
Her-2/neu多肽組合物在此使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“多肽”為其普通含義，即，是一種氨基酸序列。多肽不限于特定長(zhǎng)度的產(chǎn)物；因此，多肽的定義中包括肽、寡肽和蛋白質(zhì)，這些術(shù)語(yǔ)在此可交換使用，除非另外特別指明。該術(shù)語(yǔ)也并非是指或排除多肽的表達(dá)后修飾，例如，糖基化、乙?；?、磷酸化等，以及本領(lǐng)域所知的自然發(fā)生的和非自然發(fā)生的其它修飾。多肽可以是完整的蛋白質(zhì)，或其亞序列。本發(fā)明中的特定目的多肽是含有表位(即主要負(fù)責(zé)多肽的免疫原性并且能引發(fā)免疫應(yīng)答的抗原決定簇)的氨基酸亞序列。
如上所述，本發(fā)明涉及在溫血?jiǎng)游镏幸l(fā)和增強(qiáng)對(duì)HER-2/neu癌基因表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的免疫(包括對(duì)惡性腫瘤)的組合物和方法，其中擴(kuò)增的HER-2/neu基因與惡性腫瘤有關(guān)聯(lián)。擴(kuò)增的HER-2/neu基因與惡性腫瘤相關(guān)聯(lián)并不要求該基因的蛋白表達(dá)產(chǎn)物存在于該腫瘤上。例如，蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物的過(guò)表達(dá)可能與腫瘤的起始有關(guān)，但蛋白質(zhì)表達(dá)可能隨后消失。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及體內(nèi)引發(fā)或增強(qiáng)對(duì)表達(dá)Her-2/neu的癌細(xì)胞的有效免疫應(yīng)答。
更具體地，一方面，本發(fā)明公開(kāi)基于以下事實(shí)提供多肽，即，HER-2/neu基因的蛋白表達(dá)產(chǎn)物的特定部分(HER-2/neu多肽)可以被胸腺依賴性淋巴細(xì)胞(以下稱“T細(xì)胞”)識(shí)別，因此，可以利用免疫T細(xì)胞應(yīng)答預(yù)防或治療其中這種蛋白質(zhì)正在或曾經(jīng)過(guò)量表達(dá)的惡性腫瘤。
在這方面，特別優(yōu)選的多肽組合物來(lái)自Her-2/neu蛋白質(zhì)的ICD區(qū)，優(yōu)選含有SEQ ID NO2的大約第676-1255位氨基酸區(qū)域的一些或全部，更優(yōu)選至少含有SEQ ID NO3所示天然加工的HLA-B44限制性Her-2/neu表位。
一般地，CD4+T細(xì)胞群被認(rèn)為在被特定抗原刺激時(shí)通過(guò)釋放淋巴因子而起輔助者/誘導(dǎo)者的作用；但是，CD4+細(xì)胞的一個(gè)亞群可充當(dāng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。類(lèi)似地，CD8+T細(xì)胞被認(rèn)為通過(guò)直接溶解抗原靶標(biāo)而起作用；但是，在許多情況下，它們能分泌淋巴因子以提供輔助細(xì)胞或DTH功能。盡管可能功能重疊，但CD4和CD8表型標(biāo)志與結(jié)合II類(lèi)或I類(lèi)MHC抗原的肽的識(shí)別相聯(lián)系。II類(lèi)或I類(lèi)MHC背景下抗原的識(shí)別要求CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答不同抗原或不同情況下呈遞的相同抗原。免疫原性肽與II類(lèi)MHC抗原結(jié)合最常發(fā)生在被抗原呈遞細(xì)胞攝取的抗原上。因此，CD4+T細(xì)胞一般識(shí)別已經(jīng)位于腫瘤細(xì)胞外部的抗原。相反，在正常情況下，肽與I類(lèi)MHC的結(jié)合僅發(fā)生在在胞質(zhì)溶膠中存在和由靶標(biāo)自身合成的蛋白質(zhì)上，外部環(huán)境中的蛋白質(zhì)被排除在外。這種情況的一個(gè)例外是外源肽與以高濃度存在于細(xì)胞外的精確的I類(lèi)結(jié)合基序的結(jié)合。因此，CD4+和CD8+T細(xì)胞具有十分不同的功能，并傾向于識(shí)別由抗原正常情況下存在位置所反應(yīng)的不同抗原。
正如本發(fā)明所公開(kāi)的，HER-2/neu癌基因表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的多肽部分被T細(xì)胞識(shí)別。循環(huán)的HER-2/neu多肽被降解成肽片斷。來(lái)自該多肽的肽片斷與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)抗原結(jié)合。通過(guò)與MHC抗原結(jié)合的肽在細(xì)胞表面的展示和宿主T細(xì)胞對(duì)肽加自身MHC抗原之組合的識(shí)別，HER-2/neu多肽(包括惡性細(xì)胞上表達(dá)的那些)對(duì)T細(xì)胞將是免疫原性的。T細(xì)胞受體的強(qiáng)烈特異性使得各T細(xì)胞能區(qū)分有單個(gè)氨基酸不同的肽。
在對(duì)來(lái)自該多肽的肽片斷的免疫應(yīng)答過(guò)程中，表達(dá)對(duì)該肽-MHC復(fù)合物有高親和性結(jié)合的T細(xì)胞受體的T細(xì)胞將結(jié)合此肽-MHC復(fù)合物，并由此被活化和誘導(dǎo)增殖。在初次遇到肽時(shí)，少量的免疫T細(xì)胞將分泌淋巴因子、增殖和分化成效應(yīng)和記憶T細(xì)胞。將在體內(nèi)發(fā)生初次免疫應(yīng)答，但體外難以檢測(cè)。記憶T細(xì)胞后來(lái)遇到相同抗原將導(dǎo)致更快更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。再次應(yīng)答將在體內(nèi)或體外發(fā)生。體外應(yīng)答可以通過(guò)測(cè)量再次接觸抗原的T細(xì)胞群的增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生程度或細(xì)胞毒活性的產(chǎn)生來(lái)容易地評(píng)價(jià)。T細(xì)胞群應(yīng)答特定抗原而大量增殖被認(rèn)為指示先前被抗原接觸或致敏。
本發(fā)明的某些化合物一般包含指導(dǎo)這些肽表達(dá)的HER-2/neu多核苷酸分子，其中該DNA分子可以存在于病毒或其它遞送載體中。如上所述，本發(fā)明多肽包括仍具有刺激免疫應(yīng)答的能力的變體。這些變體包括天然多肽的各種結(jié)構(gòu)形式。例如，由于存在可電離的氨基和羧基基團(tuán)，HER-2/neu多肽可以是酸式鹽或堿式鹽的形式，或可以是中性形式。還可以通過(guò)氧化或還原對(duì)各氨基酸殘基進(jìn)行修飾。
本發(fā)明還包括糖基化或未糖基化的HER-2/neu多肽。酵母或哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的多肽可以在分子量和糖基化方式上與天然分子類(lèi)似或稍有差別，這取決于表達(dá)系統(tǒng)。例如，在細(xì)菌如大腸桿菌中表達(dá)編碼多肽的DNA將典型地提供未糖基化的分子。真核蛋白質(zhì)的N-糖基化位點(diǎn)的特征在于氨基酸三聯(lián)體Asn-A1-Z，其中A1是除Pro之外的任何氨基酸，而Z是ser或Thr。具有失活的N-糖基化位點(diǎn)的HER-2/neu多肽變體可以通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)(如寡核苷酸合成和連接或位點(diǎn)特異性誘變技術(shù))來(lái)制備，并屬于本發(fā)明的范圍?；蛘?，可以將N-連接的糖基化位點(diǎn)添加至HER-2/neu多肽之上。
一般地，可以使用編碼HER-2/neu多肽的基因組或cDNA克隆來(lái)獲得該蛋白質(zhì)。編碼全長(zhǎng)HER-2/neu的基因組序列顯示在SEQ ID NO1中，推導(dǎo)的氨基酸序列顯示在SEQ ID NO2中。可以通過(guò)從適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)文庫(kù)中篩選表達(dá)HER-2/neu蛋白質(zhì)的克隆獲得這些克隆。文庫(kù)的制備和篩選一般可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法來(lái)進(jìn)行，例如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular CloningALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratories，ColdSpring Harbor，NY，1989(在此引入作為參考)中描述的方法。簡(jiǎn)而言之，可以將噬菌體表達(dá)文庫(kù)鋪板，并轉(zhuǎn)移至濾膜。然后可以將濾膜和檢測(cè)試劑一起孵育。在本發(fā)明上下文中，“檢測(cè)試劑”是能夠和HER-2/neu蛋白質(zhì)結(jié)合然后可以通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種方法中的任一種檢測(cè)的任何化合物。典型的檢測(cè)試劑含有與報(bào)道基團(tuán)偶聯(lián)的“結(jié)合劑”，如A蛋白、G蛋白、IgG或凝集素。優(yōu)選的報(bào)道基團(tuán)包括酶、底物、輔因子、抑制劑、染料、放射性核素、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、熒光基團(tuán)和生物素。更優(yōu)選該報(bào)道基團(tuán)是辣根過(guò)氧化物酶，其可以通過(guò)和底物如四甲基聯(lián)苯胺或2，2’-連氮基-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸一起孵育進(jìn)行檢測(cè)。分離含有表達(dá)HER-2/neu蛋白質(zhì)的基因組或cDNA序列的噬菌斑并通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)純化。適宜的方法可以參見(jiàn)例如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，ColdSpring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，NY，1989。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽組合物還可以包含與抗本發(fā)明多肽，尤其是具有此處公開(kāi)的氨基酸序列的多肽，或其免疫原性片斷或變體而產(chǎn)生的T細(xì)胞和/或抗體有免疫反應(yīng)活性的一種或多種多肽。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供包含一種或多種能夠引發(fā)如下T細(xì)胞和/抗體的多肽的多肽，所述T細(xì)胞和/或抗體與此處描述的一種或多種多肽、或此處公開(kāi)的多核苷酸序列中所含的連續(xù)核酸序列編碼的一種或多種多肽、或它們的免疫原性片斷或變體、或和這些序列中的一個(gè)或多個(gè)在中等至高等嚴(yán)緊條件下雜交的一個(gè)或多個(gè)核酸序列編碼的一種或多種多肽有免疫反應(yīng)性。
另一方面，本發(fā)明提供多肽片斷，其包含此處給出的多肽組合物(例如，SEQ ID NOs2-3，8-11和14-15中顯示的那些多肽組合物，或序列SEQ ID NOs1，4-7和12-13中所示多核苷酸序列編碼的那些多肽組合物)的至少約5、10、15、20、25、50或100個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸(包括所有的中間長(zhǎng)度)。
另一方面，本發(fā)明提供本文描述的多肽組合物的變體。本發(fā)明一般所包括的多肽變體典型地表現(xiàn)出在全長(zhǎng)范圍內(nèi)與本文給出的多肽序列有至少約70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更多的一致性(按下述方式確定的)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的多肽片斷和變體與能夠和本文具體給出的多肽反應(yīng)的抗體和/或T細(xì)胞具有免疫反應(yīng)性。
本文中，術(shù)語(yǔ)多肽“變體”是指典型地與本文具體公開(kāi)的多肽相差一個(gè)或多個(gè)替換、缺失、添加和/或插入的多肽。該變體可以是天然的或可以通過(guò)合成方式產(chǎn)生，例如通過(guò)修飾一個(gè)或多個(gè)上述本發(fā)明多肽序列并按本文所述和/或利用本領(lǐng)域熟知的眾多技術(shù)中的任一種評(píng)價(jià)它們的免疫原活性來(lái)產(chǎn)生。
例如，本發(fā)明多肽變體的一些例子包括其中一個(gè)或多個(gè)部分(如N端前導(dǎo)序列或跨膜域)已被除去的那些。變體的其它例子包括已從成熟蛋白質(zhì)的N端和/或C端除去一小部分(例如1-30個(gè)氨基酸，優(yōu)選5-15個(gè)氨基酸)的變體。
在許多情況下，變體將含有保守替代。“保守替代”是指一種氨基酸替換為具有相似性質(zhì)的另一種氨基酸，以致肽化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以預(yù)期該多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性質(zhì)基本上未發(fā)生改變。如上所述，可以對(duì)本發(fā)明多核苷酸和多肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾而仍獲得編碼具有期望特征(如具有免疫原性特征)的變體或衍生多肽的功能性分子。當(dāng)期望改變多肽的氨基酸序列以構(gòu)建本發(fā)明多肽的等價(jià)物，或甚至是改良的免疫原性變體或部分時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將典型地按照表1來(lái)改變編碼DNA序列的一個(gè)或多個(gè)密碼子。
例如，可以將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的某些氨基酸替換為其它氨基酸而不明顯喪失與諸如抗體的抗原結(jié)合區(qū)或底物分子上的結(jié)合位點(diǎn)等結(jié)構(gòu)的相互作用結(jié)合能力。由于蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能活性是由蛋白質(zhì)的相互作用能力和性質(zhì)定義的，故可以在蛋白質(zhì)序列，當(dāng)然也可以在其DNA編碼序列中進(jìn)行某些氨基酸序列替換，而仍獲得具有相似性質(zhì)的蛋白質(zhì)。因此，可以設(shè)想可能對(duì)本文公開(kāi)的組合物的肽序列或編碼所述肽的相應(yīng)DNA序列進(jìn)行各種改變而不使其明顯喪失生物學(xué)用途或活性。
表1氨基酸密碼子丙氨酸Ala AGCA GCC GCG GCU半胱氨酸 Cys CUGC UGU天冬氨酸 Asp DGAC GAU谷氨酸Glu EGAA GAG苯丙氨酸 Phe FUUC UUU甘氨酸Gly GGGA GGC GGG GGU組氨酸His HCAC CAU異亮氨酸 Ile IAUA AUC AUU賴氨酸Lys KAAA AAG亮氨酸Leu LUUA UUG CUA CUC CUG CUU甲硫氨酸 Met MAUG天冬酰胺 Asn NAAC AAU脯氨酸Pro PCCA CCC CCG CCU谷氨酰胺 Gln QCAA CAG精氨酸Arg RAGA AGG CGA CGC CGG CGU絲氨酸Ser SAGC AGU UCA UCC UCG UCU蘇氨酸Thr TACA ACC ACG ACU纈氨酸Val VGUA GUC GUG GUU色氨酸Trp WUGG酪氨酸Tyr YUAC UAU在實(shí)施這些改變時(shí)，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)(hydropathicindex)。氨基酸親水指數(shù)對(duì)賦予蛋白質(zhì)相互作用生物學(xué)功能所具有重要性是本領(lǐng)域通常明了的(Kyte和Doolittle，1982，在此并入作為參考)。氨基酸的相對(duì)親水特性被認(rèn)為與最終蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，而這又限定了蛋白質(zhì)與其它分子(如，酶，底物，受體，DNA，抗體，抗原等)的相互作用。每個(gè)氨基酸均基于其疏水性和電荷特征被分配了一個(gè)親水指數(shù)(Kyte和Doolittle，1982)。這些值是異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本領(lǐng)域已知，可以將某些氨基酸替換為具有類(lèi)似親水指數(shù)或分值的其它氨基酸而仍導(dǎo)致具有相似生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，即仍獲得生物學(xué)功能等價(jià)蛋白。在實(shí)施這些改變時(shí)，親水指數(shù)相差在±2范圍內(nèi)的氨基酸替換是優(yōu)選的，尤其優(yōu)選±1范圍內(nèi)的替換，甚至更優(yōu)選±0.5范圍內(nèi)的替換。本領(lǐng)域也明了，相似氨基酸的替換可以基于親水性有效地實(shí)現(xiàn)。美國(guó)專利4,554,101(特此完整地引入此處作為參考)描述了蛋白質(zhì)的最大局部平均親水性(由相鄰氨基酸的親水性控制)與蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)相關(guān)。
美國(guó)專利4,554,101中詳細(xì)描述了分配給氨基酸殘基的如下親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。應(yīng)當(dāng)理解，可以將一種氨基酸替換為具有相似親水性值的另一種氨基酸而仍獲得生物學(xué)等價(jià)物，尤其是免疫學(xué)等價(jià)蛋白。在這些改變中，優(yōu)選兩者的親水性值相差在±2范圍內(nèi)的氨基酸替換，尤其優(yōu)選±1范圍內(nèi)的替換，甚至更優(yōu)選±0.5范圍內(nèi)的替換。
如上所述，因此氨基酸替換一般以氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)相似性，例如它們的疏水性、親水性、電荷、大小等為基礎(chǔ)。考慮了前述各種性質(zhì)的替換的實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。
此外，還可以對(duì)任何多肽作進(jìn)一步修飾以增加其體內(nèi)穩(wěn)定性?？赡艿男揎棸ǎ幌抻?，在5’和/或3’末端添加側(cè)翼序列；在主鏈中使用硫代磷酸或2’O-甲基而非磷酸二酯鍵；和/或包括非常規(guī)堿基，如肌苷、queosine和wybutosine，以及乙?；?、甲基-、硫基-和其它修飾形式的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。
還可以基于氨基酸殘基在極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性質(zhì)方面的相似性進(jìn)行氨基酸替換。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；而具有不帶電荷的極性頭部基團(tuán)和相似的親水值的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；及絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸?？梢赃M(jìn)行保守改變的其它氨基酸組包括(1)ala，pro，gly，glu，asp，gln，asn，ser，thr；(2)csy，ser，tyr，thr；(3)val，ile，leu，met，ala，phe；(4)lys，arg，his；和(5)phe，tyr，trp，his。變體還可以，或者是作為備擇方案含有非保守改變。在優(yōu)選實(shí)施方案中，變體多肽與天然序列相差5個(gè)或更少的氨基酸替換、缺失或添加。還(或者是作為可選擇方案)可以通過(guò)例如缺失或添加對(duì)多肽的免疫原性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性質(zhì)有微小影響的氨基酸來(lái)修飾變體。
如上所述，多肽可以在蛋白質(zhì)的N端含有信號(hào)(或前導(dǎo))序列，該序列在翻譯時(shí)或在翻譯后引導(dǎo)該蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移。多肽也可以與接頭或其它序列偶聯(lián)，以便于多肽的合成、純化或鑒定(例如聚-His)，或增強(qiáng)該多肽與固體載體的結(jié)合。例如，多肽可以與免疫球蛋白Fc區(qū)偶聯(lián)。
當(dāng)比較多肽序列時(shí)，如果按如下所述進(jìn)行比對(duì)達(dá)到最大一致性時(shí)兩種序列的氨基酸序列相同，則稱這兩種序列“一致”。兩種序列的比較一般通過(guò)在比較窗口中比較序列以鑒定和比較局部區(qū)域的序列相似性來(lái)進(jìn)行。在此使用時(shí)，“比較窗口”是指具有至少約20個(gè)，通常30至約75個(gè)，40至約50個(gè)連續(xù)位置的片段，在該片段中可以在一個(gè)序列和具有相同數(shù)目連續(xù)位置的參考序列最佳比對(duì)后對(duì)這兩個(gè)序列進(jìn)行比較。
為了序列比較，可以采用Lasergene生物信息軟件包中的Megalign程序(DNASTAR公司，Madison，WI)，利用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行序列的最佳比對(duì)。該程序體現(xiàn)了以下文獻(xiàn)中所述的幾個(gè)比對(duì)策略Dayhoff，M.O.(1978)蛋白質(zhì)的進(jìn)化改變模型-檢測(cè)遠(yuǎn)緣關(guān)系的矩陣，見(jiàn)Dayhoff，M.O.(編)《蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖集》(Atlas of ProteinSequence and Structure)，國(guó)立生物化學(xué)研究基金會(huì)，Washington DC，第5卷，增刊3，第345-358頁(yè)；Hein J.(1990)比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)生的統(tǒng)一方法，第626-645頁(yè)，《酶學(xué)方法》(Methods in Enzymology)第183卷，Academic Press公司，San Diego，CA；Higgins，D.G.和Sharp，P.M.(1989)CABIOS 5151-153；Myers，E.W.和Muller W.(1988)CABIOS 411-17；Robinson，E.D.(1971)Comb.Theor.11105；Santou，N.Nes，M.(1987)Mol.Biol.Evol.4406-425；Sneath，P.H.A.和Sokal，R.R.(1973)《數(shù)值分類(lèi)學(xué)-數(shù)值分類(lèi)學(xué)的原理和實(shí)踐》(Numerical Taxonomy-the Principles and Practiceof Numerical Taxonomy)，F(xiàn)reeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.(1983)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80726-730。
或者，為了序列比較，可以利用以下方法進(jìn)行序列的最佳比對(duì)Smith和Waterman的局部一致性算法((1982)Add.APL.Math 2482)；Needleman和Wunsch的一致性比對(duì)算法((1970)J.Mol.Biol.48443)；Pearson和Lipman的相似性查詢方法((1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444)；這些算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行程序(Wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)；或目測(cè)。
適合于確定序列一致性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法的一個(gè)優(yōu)選例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它們分別描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.253389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-410。采用例如這里所述參數(shù)，BLAST和BLAST 2.0可以用于確定本發(fā)明的多核苷酸和多肽的序列一致性百分?jǐn)?shù)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可以通過(guò)國(guó)立生物技術(shù)信息中心為公眾所獲得。對(duì)于氨基酸序列，可以采用評(píng)分矩陣計(jì)算累積分。當(dāng)該比對(duì)累積分從其最大獲得值降低了量X；由于積累一或多個(gè)負(fù)分殘基比對(duì)，該累積分達(dá)到零或更低；或任一序列達(dá)到末端時(shí)，終止每個(gè)方向上字符命中(word hits)的延伸。BLAST算法的參數(shù)W、T和X確定了比對(duì)的敏感度和速度。
在一個(gè)優(yōu)選方法中，“序列一致性百分?jǐn)?shù)”通過(guò)在至少有20個(gè)位置的比較窗中比較兩個(gè)最佳比對(duì)的序列來(lái)確定，其中為了獲得兩個(gè)序列的最佳比對(duì)，與參考序列(不含有插入或缺失)相比，比較窗中的該多肽序列部分可以含有20％或更少，通常5-15％，或10-12％的插入或缺失(即間隔區(qū))。該百分?jǐn)?shù)的計(jì)算方法是確定這兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同氨基酸殘基的位置的數(shù)目以獲得匹配位置數(shù)，用該匹配位置數(shù)除以參考序列的總位置數(shù)(即窗的大小)，然后將所獲結(jié)果乘以100以產(chǎn)生該序列一致性百分?jǐn)?shù)。
在其它說(shuō)明性實(shí)施方案中，多肽可以是融合多肽，其含有如此處所述的多個(gè)多肽，或者含有至少一個(gè)此處所述的多肽和無(wú)關(guān)序列，如已知的腫瘤蛋白。例如，融合配偶體(fusion partner)可以幫助提供T輔助細(xì)胞表位(免疫學(xué)融合配偶體)，優(yōu)選地可被人體識(shí)別的T輔助細(xì)胞表位，或者可以有助于以高于原始重組蛋白的產(chǎn)量表達(dá)該蛋白質(zhì)(表達(dá)增強(qiáng)子)。某些優(yōu)選的融合配偶體既是免疫學(xué)的又是增強(qiáng)表達(dá)的融合配偶體?？梢赃x擇其它融合配偶體，以提高多肽的溶解度，或使多肽能導(dǎo)向希望的胞內(nèi)區(qū)室。再有其它融合配偶體包括有利于多肽純化的親和標(biāo)簽。
融合多肽一般可以利用包括化學(xué)偶聯(lián)(conjugation)在內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。優(yōu)選地，融合多肽表達(dá)為一種重組多肽，使得在表達(dá)系統(tǒng)中的生產(chǎn)水平高于非融合多肽。簡(jiǎn)言之，編碼多肽成分的DNA序列可以分開(kāi)裝配，并連接到合適的表達(dá)載體中。編碼一種多肽成分的DNA序列的3’端在有或沒(méi)有肽接頭的情況下與編碼第二多肽成分的DNA序列的5’端連接，使序列的閱讀框同步。這導(dǎo)致翻譯為保留了兩種成分多肽的生物活性的一種融合多肽。
可以采用肽接頭序列將該第一和第二多肽成分分開(kāi)一段足夠長(zhǎng)的距離，以保證每一個(gè)多肽都折疊成其二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。該多肽接頭序列可以采用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)并入融合蛋白中。適合的肽接頭序列可以基于以下因素進(jìn)行選擇(1)其能夠采取柔性伸展構(gòu)象；(2)不能采取能與該第一和第二多肽上的功能性表位相互作用的二級(jí)結(jié)構(gòu)；和(3)缺乏可以和該多肽的功能性表位反應(yīng)的疏水或帶電荷殘基。優(yōu)選的肽接頭序列含有Gly、Asn和Ser殘基。其它近中性氨基酸，例如Thr和Ala也可以用于該接頭序列中?？梢杂米鹘宇^的有用氨基酸序列包括那些公開(kāi)于如下文獻(xiàn)中的序列Maratea等，基因(Gene)4039-46，1985；Murphy等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊838258-8262，1986；美國(guó)專利4,935,233和美國(guó)專利4,751,180。接頭序列一般可以長(zhǎng)1-約50個(gè)氨基酸。當(dāng)該第一和第二多肽具有能夠用以分開(kāi)這些功能域并防止空間干擾的非必需N端氨基酸區(qū)域時(shí)，則無(wú)需接頭序列。
將這些相連的DNA序列可操作地與適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)元件連接在一起。負(fù)責(zé)DNA表達(dá)的調(diào)節(jié)元件僅置于編碼該第一多肽的DNA序列的5’端。同樣，終止翻譯所必需的終止密碼子和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)僅存在于編碼該第二多肽的DNA序列的3’端。
融合多肽能含有如此處所述的多肽和無(wú)關(guān)免疫原性蛋白質(zhì)，如一種能引發(fā)回憶反應(yīng)的免疫原性蛋白質(zhì)。這類(lèi)蛋白質(zhì)的例子包括破傷風(fēng)、結(jié)核和肝炎蛋白(參見(jiàn)，例如，Stoute等人，New Engl.J.Med.33686-91，1997)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫融合配偶體來(lái)源于分枝桿菌屬的種，如來(lái)自結(jié)核分枝桿菌的Ra12片段。美國(guó)專利申請(qǐng)60/158,585描述了Ra12組合物和方法提高異源多核苷酸/多肽序列的表達(dá)和/或免疫原性的用途，其公開(kāi)內(nèi)容在此完整引用作為參考。簡(jiǎn)言之，Ra12是指一個(gè)多核苷酸區(qū)，它是結(jié)核分枝桿菌MTB32A核酸的亞序列。MTB32A是一種分子量為32KD的絲氨酸蛋白酶，由結(jié)核分枝桿菌的毒力株和無(wú)毒力株的基因編碼。MTB32A的核苷酸序列和氨基酸序列已經(jīng)描述(例如，美國(guó)專利申請(qǐng)60/158,585；參見(jiàn)Skeiky等人，Infection and Immun.(1999)673998-4007，在此引用作為參考)。MTB32A編碼序列的C端片段高水平表達(dá)，在純化過(guò)程中保持為可溶性多肽。而且，Ra12可以提高與之融合的異源免疫原性多肽的免疫原性。一種優(yōu)選的Ra12融合多肽含有對(duì)應(yīng)于MTB32A的氨基酸殘基192-323的14KD的C端片段。其它優(yōu)選的Ra12多核苷酸一般含有編碼Ra12多肽之一部分的至少約15個(gè)連續(xù)核苷酸，至少約30個(gè)核苷酸，至少約60個(gè)核苷酸，至少約100個(gè)核苷酸，至少約200個(gè)核苷酸，或至少約300個(gè)核苷酸。Ra12多核苷酸可以含有天然序列(即，編碼一種Ra12多肽或其部分的內(nèi)源序列)，或者可以含有該序列的一種變體。Ra12多核苷酸變體可以含有一個(gè)或多個(gè)置換、添加、缺失和/或插入，使得編碼的融合多肽的生物活性基本上不低于含有天然Ra12多肽的融合多肽。這些變體優(yōu)選地顯示與編碼天然Ra12多肽或其部分的多核苷酸序列有至少約70％的一致性，更優(yōu)選地至少約80％的一致性，最優(yōu)選地至少約90％的一致性。
在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫融合配偶體來(lái)源于蛋白D——革蘭氏陰性菌B型流感嗜血菌(Haemophilus influenza)的一種表面蛋白(WO 91/18926)。優(yōu)選地，蛋白D衍生物含有該蛋白質(zhì)的大約前三分之一(例如，N端前100-110個(gè)氨基酸)，蛋白D衍生物可以脂化。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，在N端含有脂蛋白D融合配偶體的前109個(gè)殘基，以產(chǎn)生含有其它外源T細(xì)胞表位的多肽，并提高在大腸桿菌中的表達(dá)水平(從而作為表達(dá)增強(qiáng)子)。脂質(zhì)尾確?？乖蚩乖蔬f細(xì)胞最佳遞呈。其它融合配偶體包括來(lái)源于流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1(血凝素)。一般使用N端81個(gè)氨基酸，但也可使用含有T輔助細(xì)胞表位的不同片段。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫融合配偶體是被稱作LYTA的蛋白質(zhì)或其部分(優(yōu)選地C端部分)。LYTA來(lái)源于肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)，該菌合成一種N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶，被稱作酰胺酶LYTA(由LytA基因編碼；Gene 43265-292，1986)。LYTA是一種自溶素，可特異性降解肽聚糖主鏈中的某些鍵。LYTA蛋白的C端域負(fù)責(zé)與膽堿或某些膽堿類(lèi)似物(如DEAE)的親和力。這種性質(zhì)已用于發(fā)展用于融合蛋白表達(dá)的大腸桿菌C-LYTA表達(dá)質(zhì)粒。在氨基端含C-LYTA片段的雜種蛋白的純化已有描述(參見(jiàn)，Biotechnology10795-798，1992)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，LYTA的重復(fù)部分可以摻入融合蛋白中。在C端區(qū)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)開(kāi)始于殘基178的重復(fù)部分。一個(gè)特別優(yōu)選的重復(fù)部分含有殘基188-305。
另一個(gè)示例性實(shí)施方案涉及融合多肽，和編碼它們的多核苷酸，其中融合配偶體含有能將多肽導(dǎo)向內(nèi)體/溶酶體區(qū)室的導(dǎo)向信號(hào)，如美國(guó)專利號(hào)5,633,234所述。本發(fā)明的免疫原性多肽當(dāng)與這種導(dǎo)向信號(hào)融合時(shí)，將更有效地與MHC II類(lèi)分子結(jié)合，從而使該多肽特異的CD4+T細(xì)胞的體內(nèi)刺激增強(qiáng)。
本發(fā)明的多肽利用本領(lǐng)域周知的多種合成和/或重組技術(shù)制備，后者在下面有進(jìn)一步的描述。一般少于約150個(gè)氨基酸的多肽、部分和其它變體能利用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的技術(shù)通過(guò)合成法產(chǎn)生。在一個(gè)說(shuō)明性實(shí)例中，利用可商業(yè)獲得的固相技術(shù)，如Merrifield固相合成法合成這些多肽，其中向延長(zhǎng)的氨基酸鏈中連續(xù)添加氨基酸。參見(jiàn)Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149-2146，1963。多肽自動(dòng)合成裝置可購(gòu)自供應(yīng)商，如Perkin Elmer/Applied BioSystems Division(Foster City，CA)，可以按照使用說(shuō)明書(shū)操作。
本發(fā)明的多肽組合物(包括融合多肽)通常是分離的。“分離的”多肽是從其原始環(huán)境中分離出的多肽。例如，如果將一種自然存在的蛋白質(zhì)或多肽與自然系統(tǒng)中的一些或全部共存物質(zhì)分開(kāi)，則該蛋白質(zhì)或多肽是分離的。優(yōu)選地，這些多肽也是純化的，例如，純度至少約90％，更優(yōu)選地至少約95％，最優(yōu)選地至少約99％。
多核苷酸組合物在其它方面，本發(fā)明提供Her-2/neu多核苷酸組合物。術(shù)語(yǔ)“DNA”和“多核苷酸”在此基本上可交換使用，是指已經(jīng)分離不含特定物種的總基因組DNA的DNA分子?！胺蛛x的”在此使用時(shí)是指多核苷酸基本上不含其它編碼序列，而且DNA分子不含無(wú)關(guān)編碼DNA的較大部分(如大染色體片段或其它功能基因或多肽編碼區(qū))。當(dāng)然，是指最初分離的DNA分子，不排除后來(lái)人工加到該片段中的基因或編碼區(qū)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的多核苷酸組合物能包含基因組序列、基因組外和質(zhì)粒編碼的序列，和較小的工程化基因片段，它們表達(dá)或者可以被改造表達(dá)蛋白質(zhì)、多肽、肽等。這些片段可以是自然分離的，或是人工合成修飾的。
熟練技術(shù)人員也應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的多核苷酸可以是單鏈(編碼鏈或反義鏈)或雙鏈的，可以是DNA(基因組DNA、cDNA或合成DNA)或RNA分子。RNA分子可包括含有內(nèi)含子并一一對(duì)應(yīng)于DNA分子的HnRNA分子，和不含內(nèi)含子的mRNA分子。本發(fā)明的多核苷酸中可以但不必須存在其它編碼或非編碼序列，多核苷酸可以但不必須與其它分子和/或支持材料連接。
多核苷酸可以含有天然序列(即，編碼本發(fā)明的多肽/蛋白質(zhì)或其部分的內(nèi)源序列)，或可以含有編碼該序列的變體或衍生物(優(yōu)選地是一種免疫原性變體或衍生物)的序列。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供含有下列多核苷酸序列一部分或全部的多核苷酸組合物SEQ ID NO1、4-7和12-13所示的多核苷酸序列，SEQ ID NO1、4-7和12-13所示多核苷酸序列的互補(bǔ)序列，和它們的簡(jiǎn)并變體。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，此處所述的Her-2/neu多核苷酸序列編碼Her-2/neu蛋白質(zhì)ICD區(qū)域的免疫原性表位序列，優(yōu)選SEQ ID NO3中所示的表位序列。
在其它有關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與本文公開(kāi)的序列基本一致的多核苷酸變體，例如，通過(guò)用此處所述的方法(例如使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析，如下所述)與本發(fā)明的多核苷酸序列比較，具有至少70％的序列一致性，優(yōu)選地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列一致性的那些。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)這些值，以便在考慮密碼子簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、閱讀框定位等之后，確定兩種核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的相應(yīng)一致性。
多苷酸變體一般含有一個(gè)或多個(gè)置換、添加、缺失和/或插入，優(yōu)選地使變體多核苷酸編碼的多肽的免疫原性基本上不低于此處具體給出的多核苷酸序列編碼的多肽。應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語(yǔ)“變體”也包括異種來(lái)源的同源基因。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供含有以下序列各種不同長(zhǎng)度的連續(xù)序列段的多核苷酸片段，該序列與這里公開(kāi)的一種或多種序列相同或互補(bǔ)。例如，本發(fā)明提供這樣的多核苷酸它們含有這里公開(kāi)的一種或多種序列的至少約10、15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000個(gè)或更多連續(xù)核苷酸，以及所有中間長(zhǎng)度。應(yīng)當(dāng)理解，“中間長(zhǎng)度”在本文中是指介于所述值之間的任何長(zhǎng)度，如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括200-500、500-1000等等之間的所有整數(shù)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供在中度到高度嚴(yán)緊條件下能與此處所述多核苷酸序列或其片段或其互補(bǔ)序列雜交的多核苷酸組合物。雜交技術(shù)在分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知。為舉例說(shuō)明，用于檢測(cè)本發(fā)明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴(yán)緊條件包括用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液預(yù)洗；在50-65℃下在5×SSC中雜交過(guò)夜；隨后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗滌20分鐘兩次。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，能容易地操作雜交嚴(yán)格性，如通過(guò)改變雜交溶液的含鹽量和/或雜交溫度。例如，在另一個(gè)實(shí)施方案中，合適的高度嚴(yán)格雜交條件包括上述條件，不同之處在于雜交溫度升高到例如60-65℃或65-70℃。
在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，上述多核苷酸，如多核苷酸變體、片段和雜交序列，編碼與此處所述Her-2/neu多肽序列有免疫學(xué)交叉反應(yīng)性的多肽。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，這些多核苷酸編碼免疫原活性水平為此處所述多肽序列的至少約50％、優(yōu)選地至少約70％、更優(yōu)選地至少約90％的多肽。
本發(fā)明的多核苷酸或其片段，無(wú)論編碼序列本身的長(zhǎng)度如何，都可以與其它DNA序列(如啟動(dòng)子、聚腺苷酸化信號(hào)、其它限制酶位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、其它編碼片段等)結(jié)合，使其總長(zhǎng)度可能大大改變。因此預(yù)期可以使用幾乎任何長(zhǎng)度的核酸片段，總長(zhǎng)度優(yōu)選地受限于制備和在預(yù)期重組DNA方案中的應(yīng)用的容易程度。例如，總長(zhǎng)度為約10000、約5000、約3000、約2000、約1000、約500、約200、約100、約50個(gè)堿基對(duì)等(包括所有中間長(zhǎng)度)的示例性多核苷酸片段考慮可用于本發(fā)明許多實(shí)施方案中。
當(dāng)比較多核苷酸序列時(shí)，如果在如下所述比對(duì)最大對(duì)應(yīng)性時(shí)兩種序列的核苷酸序列相同，則稱這兩種序列“一致”。兩種序列的比較一般通過(guò)在比較窗口中比較序列，鑒定和比較序列相似性的局部區(qū)域來(lái)進(jìn)行。在此使用時(shí)，“比較窗口”是指至少約20個(gè)，通常30至約75個(gè)，優(yōu)選地40至約50個(gè)連續(xù)位置的片段，其中可以在最佳比對(duì)兩種序列后將一種序列與連續(xù)位置數(shù)量相同的參照序列相比較。
序列的最佳比對(duì)可以利用Lasergene生物信息學(xué)軟件包(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)中的Megalign程序進(jìn)行，使用缺省參數(shù)。該程序包括下列參考文獻(xiàn)中所述的幾種比對(duì)方案Dayhoff，MO(1978)“蛋白質(zhì)進(jìn)化改變模型-用于檢測(cè)遠(yuǎn)緣關(guān)系的矩陣”，在Dayhoff，M.O.編寫(xiě)的《蛋白質(zhì)序列與結(jié)構(gòu)圖譜》中，國(guó)家生物醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)，華盛頓，第5卷，增3，345-358；Hein J.(1990)“比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)生的統(tǒng)一方法”，626-645，《酶學(xué)方法》，183卷，學(xué)院出版社，San Diego，CA；Higgins，D.G.和Sharp，P.M.(1989)CABIOS5151-153；Myers，E.W.和Muller W.(1988)CABIOS 411-17；Robinson，E.D.(1971)Comb.Theor.11105；Santou，N.Nes，M.(1987)Mol.Biol.Evol.4406-425；Sneath，P.H.A.和Sokal，R.R.(1973)《數(shù)量分類(lèi)學(xué)——數(shù)量分類(lèi)學(xué)原理與實(shí)踐》，F(xiàn)reeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80726-730。
或者，序列的最佳對(duì)比也可以如下進(jìn)行利用Smith和Waterman(1981)Add.APL.Math 2482的局部一致性算法、利用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443的一致性比對(duì)算法、利用Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444的相似性檢索法、通過(guò)這些算法的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法(GAP，BESTFIT，BLAST，F(xiàn)ASTA和TFASTA，Wisconsin遺傳學(xué)軟件包，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)，或通過(guò)觀察。
適于確定百分序列一致性和序列相似性的算法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例是BLAST和BLAST 2.0算法，分別在Altschul等人(1977)Nucl.AcidsRes.253389-3402和Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215403-410描述。例如能以此處所述的參數(shù)使用BLAST和BLAST 2.0，確定本發(fā)明的多核苷酸的百分序列一致性。進(jìn)行BLAST分析的軟件可以通過(guò)國(guó)家生物技術(shù)信息中心公開(kāi)獲得。在一個(gè)示例性實(shí)施例中，對(duì)于核苷酸序列，能用參數(shù)M(匹配殘基對(duì)的獎(jiǎng)分＞0)和N(錯(cuò)配殘基的罰分；總是＜0)計(jì)算累積得分。在下列情況時(shí)每個(gè)方向的字段命中延伸停止累積比對(duì)得分從獲得的最大值降低數(shù)值X時(shí)；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)分殘基比對(duì)的積累，累積得分為0或更低時(shí)；或到達(dá)每個(gè)序列的末端時(shí)。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定該算法的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默認(rèn)使用11的字長(zhǎng)(W)、10的期望值(E)，BLOSUM62評(píng)分矩陣(參見(jiàn)Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915)比對(duì)，(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4，比較兩條鏈。
優(yōu)選地，通過(guò)在至少20個(gè)位置的比較窗口上比較兩種最佳比對(duì)的序列測(cè)定“百分序列一致性”，其中與用于最佳比對(duì)兩種序列的參照序列(不含添加或缺失)相比，比較窗口中多核苷酸序列的部分可含有20％或更低、通常5％-15％或10％-12％的添加或缺失(即缺口)。此百分?jǐn)?shù)的計(jì)算方法是測(cè)定在兩種序列中存在相同核酸堿基的位置數(shù)，得到匹配的位置數(shù)，匹配位置數(shù)除以參照序列中的位置總數(shù)(即窗口大小)，結(jié)果乘以100，得到百分序列一致性。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，存在許多編碼此處所述的多肽的核苷酸序列。其中一些與任一天然基因的核苷酸序列有最小同源性。但是，本發(fā)明特別涉及由于密碼子使用的差異而不同的多核苷酸。另外，含有此處所述多核苷酸序列的基因的等位基因也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。等位基因是由于核苷酸的一個(gè)或多個(gè)突變(如核苷酸的缺失、添加或置換)而改變的內(nèi)源基因。得到的mRNA和蛋白質(zhì)可能，但不必須具有改變的結(jié)構(gòu)或功能。等位基因可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(如雜交、擴(kuò)增和/或數(shù)據(jù)庫(kù)序列比較)鑒定。
因此，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，利用誘變法(如位點(diǎn)特異性誘變)制備此處所述多肽的免疫原性變體和/或衍生物。使用該方法，能通過(guò)誘變編碼多肽的基本多核苷酸進(jìn)行多肽序列的特定修飾。這些技術(shù)提供制備和檢測(cè)序列變體的直接方法，例如，通過(guò)向多核苷酸中引入一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列改變，摻入前述一個(gè)或多個(gè)考慮。
位點(diǎn)特異性誘變可產(chǎn)生突變體，這是通過(guò)使用編碼帶有希望突變的DNA序列的特異性寡核苷酸序列，以及足夠量的相鄰核苷酸，以提供足夠大小和序列復(fù)雜性的引物序列，在橫穿的缺失連接處兩側(cè)形成穩(wěn)定的雙鏈來(lái)進(jìn)行的?？梢栽谶x擇的多核苷酸序列中應(yīng)用突變，以提高、改變、降低、修飾或以其它方式改變多核苷酸本身的性質(zhì)，和/或改變編碼的多肽的性質(zhì)、活性、組成、穩(wěn)定性或一級(jí)序列。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，發(fā)明者想誘變公開(kāi)的多核苷酸序列以改變編碼的多肽的一種或多種性質(zhì)，如多肽疫苗的免疫原性。位點(diǎn)特異性誘變技術(shù)在本領(lǐng)域中眾所周知，廣泛用于產(chǎn)生多肽和多核苷酸的變體。例如，位點(diǎn)特異性誘變通常用于改變DNA分子的特定部分。在這些實(shí)施方案中，使用一般含有大約14-25個(gè)核苷酸的引物，待改變序列連接處兩側(cè)有約5-約10個(gè)殘基。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，位點(diǎn)特異性誘變技術(shù)通常使用存在單鏈和雙鏈形式的噬菌體載體。在位點(diǎn)特異性誘變中有用的典型載體包括載體，如M13噬菌體。這些噬菌體易于購(gòu)得，它們的使用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知。在定點(diǎn)誘變中也通常使用雙鏈質(zhì)粒，這省去了從質(zhì)粒向噬菌體轉(zhuǎn)移目的基因的步驟。
此處所述的定點(diǎn)誘變通常如下進(jìn)行首先獲得單鏈載體，或者解開(kāi)雙鏈載體的兩條鏈，在載體的序列中包含編碼希望的多肽的DNA序列。制備(通常是合成)含有希望的突變序列的寡核苷酸引物。該引物然后與單鏈載體退火，與DNA聚合酶(如大腸桿菌聚合酶I Klenow片段)反應(yīng)，以完成含突變鏈的合成。于是形成異源雙鏈，其中一條鏈編碼原始的未突變序列，第二條鏈含有希望的突變。然后用該異源雙鏈載體轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞，選擇包含具有突變序列排列的重組載體的克隆。
利用定點(diǎn)誘變制備選擇的肽編碼DNA片段的序列變體提供了一種產(chǎn)生可能有用的種類(lèi)的方法，并非意在限制，因?yàn)榇嬖讷@得肽的序列變體和編碼它們的DNA序列的其它方法。例如，可以用誘變劑(如羥胺)處理編碼希望的肽序列的重組載體，獲得序列變體。關(guān)于這些方法和方案的具體細(xì)節(jié)見(jiàn)Maloy等人，1994；Segal，1976；Prokop和Bajpai，1991；Kuby，1994；Maniatis等人，1982所述，在此均引用作為參考。
在此使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸指導(dǎo)的誘變法”是指模板依賴的方法和載體介導(dǎo)的繁殖，它導(dǎo)致特異核酸分子的濃度比最初的濃度提高，或者可檢測(cè)信號(hào)的濃度提高(如擴(kuò)增)。在此使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸指導(dǎo)的誘變法”是指涉及引物分子依賴模板延長(zhǎng)的方法。術(shù)語(yǔ)依賴模板的方法是指RNA或DNA分子的核酸合成，其中新合成的核酸鏈的序列遵循眾所周知的互補(bǔ)堿基配對(duì)原則(參見(jiàn)，例如，Watson，1987)。載體介導(dǎo)的方法一般包括向DNA或RNA載體中導(dǎo)入核酸片段，載體的克隆性擴(kuò)增，擴(kuò)增的核酸片段的回收。美國(guó)專利號(hào)4,237,224中給出了這些方法的實(shí)例，在此完整引用作為參考。
在制備本發(fā)明的多肽變體的另一種方法中，如美國(guó)專利號(hào)5,837,458所述，可以使用循環(huán)序列重組(recursive sequencerecombination)。在該方法中，進(jìn)行重組和篩選或選擇的重復(fù)循環(huán)，以“進(jìn)化”本發(fā)明的多核苷酸變體，它們具有例如提高的免疫原性。
在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，此處所述的多核苷酸序列能方便地用作核酸雜交的探針或引物。因而，含有至少約15個(gè)連續(xù)核苷酸的序列區(qū)(其與此處公開(kāi)的15個(gè)核苷酸長(zhǎng)的連續(xù)序列有相同序列或與之互補(bǔ))的核酸片段預(yù)計(jì)將特別有用。更長(zhǎng)的相同或互補(bǔ)的連續(xù)序列，例如約20、30、40、50、100、200、500、1000(包括所有中間長(zhǎng)度)、甚至可達(dá)全長(zhǎng)的序列，在某些實(shí)施方案中也是有用的。
這些核酸探針與目的序列特異性雜交的能力將使它們能用于檢測(cè)特定樣品中互補(bǔ)序列的存在。然而，也可設(shè)想有其它用途，如序列信息的應(yīng)用，用于制備突變種引物，或可用于制備其它遺傳構(gòu)建體的引物。
具有由與此處公開(kāi)的多核苷酸序列相同或互補(bǔ)的大約10-14、15-20、30、50乃至100-200個(gè)核苷酸的連續(xù)核苷酸段(也包括中間長(zhǎng)度)組成的序列區(qū)的多核苷酸分子特別可用作雜交探針，例如用于Southern和Northern印跡。這將能分析基因產(chǎn)物或其片段，無(wú)論是在不同細(xì)胞類(lèi)型中還是在不同細(xì)菌細(xì)胞中。片段的總大小以及互補(bǔ)延伸片段的大小最終取決于特定核酸片段的預(yù)期用途。較小的片段一般用于雜交實(shí)施方案，其中連續(xù)互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度可能不同，如約15-約100個(gè)核苷酸，但是也可以根據(jù)希望檢測(cè)的互補(bǔ)序列的長(zhǎng)度，使用較大的相鄰互補(bǔ)序列段。
利用長(zhǎng)度約為15-25個(gè)核苷酸的雜交探針能形成既穩(wěn)定又具選擇性的雙鏈分子。通常優(yōu)選在長(zhǎng)度超過(guò)15個(gè)堿基的序列段上含有連續(xù)互補(bǔ)序列的分子，以提高雜合體的穩(wěn)定性和選擇性，從而提高獲得的特異雜種分子的質(zhì)量和程度。通常優(yōu)選設(shè)計(jì)含有15-25個(gè)連續(xù)核苷酸乃至更長(zhǎng)(希望時(shí))的基因互補(bǔ)序列段的核酸分子。
雜交探針可以選自此處公開(kāi)的任一序列的任一部分。所需要的只是檢查希望用作探針或引物的此處所述的序列，或者這些序列的連續(xù)部分，長(zhǎng)度從約15-25個(gè)核苷酸到包括全長(zhǎng)序列。探針和引物序列的選擇可取決于多種因素。例如，可能希望使用朝向全序列末端的引物。
例如可以通過(guò)化學(xué)法直接合成片段，容易地制備小的多核苷酸片段，通常應(yīng)用自動(dòng)寡核苷酸合成儀。也可通過(guò)應(yīng)用核酸增殖技術(shù)，如美國(guó)專利4,683,202(在此引用作為參考)的PCRTM技術(shù)，通過(guò)向用于重組生產(chǎn)的重組載體中導(dǎo)入選擇的序列，通過(guò)分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它重組DNA技術(shù)，獲得這些片段。
可以根據(jù)與完整基因或目的基因片段的互補(bǔ)片段選擇性形成雙鏈分子的能力，使用本發(fā)明的核苷酸序列。根據(jù)目的用途，典型地希望使用不同的雜交條件實(shí)現(xiàn)探針對(duì)靶序列的不同程度的選擇性。對(duì)于需要高選擇性的應(yīng)用，一般希望使用相對(duì)嚴(yán)格的條件形成雜合體，例如，選擇相對(duì)低鹽和/或高溫的條件，如約0.02M-約0.15M的鹽和約50℃-約70℃的溫度產(chǎn)生的條件。這種選擇性條件允許極少的(如果有的話)探針與模板或靶鏈之間的錯(cuò)配，特別適用于分離有關(guān)序列。
當(dāng)然，對(duì)于某些用途，例如，在希望利用可與基本模板雜交的突變引物鏈制備突變體時(shí)，一般需要較低的嚴(yán)格(嚴(yán)格性降低)雜交條件形成異源雙鏈。在這些情況中，可能希望使用0.15M-約0.9M的鹽和約20℃-約55℃的溫度。從而能把交叉雜交種容易地確定為相對(duì)于對(duì)照雜交的陽(yáng)性雜交信號(hào)。在任何情況下，一般認(rèn)為，通過(guò)添加含量提高的甲酰胺——用來(lái)以與溫度升高相同的方式使雜合雙鏈去穩(wěn)定，能使條件更加嚴(yán)格。因此，雜交條件能容易地操作，一般是根據(jù)希望的結(jié)果進(jìn)行選擇的方法。
多核苷酸鑒定、表征和表達(dá)可以使用多種成熟技術(shù)中的任一種(一般參見(jiàn)，Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold SpringHarbor，NY，1989，和其它類(lèi)似參考文獻(xiàn))鑒定、制備和/或操作本發(fā)明的多核苷酸組合物。
許多依賴模板的方法可用來(lái)擴(kuò)增樣品中存在的靶序列。最著名的擴(kuò)增方法之一是聚合酶鏈反應(yīng)(PCRTM)，在美國(guó)專利號(hào)4,683,195、4,683,202、4,800,159中有詳細(xì)描述，均在此引用作為參考。簡(jiǎn)言之，在PCRTM中，制備兩條與靶序列相對(duì)互補(bǔ)鏈上的區(qū)域互補(bǔ)的引物序列。向反應(yīng)混合物中加入過(guò)量的脫氧核苷三磷酸以及DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)。如果樣品中存在靶序列，引物將與靶序列結(jié)合，聚合酶將通過(guò)加入核苷酸使引物沿靶序列延伸。提高和降低反應(yīng)混合物的溫度，延伸的引物就可從靶序列上分離下來(lái)，形成反應(yīng)產(chǎn)物，過(guò)量的引物將與靶序列和反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)合，該過(guò)程重復(fù)進(jìn)行。為了確定擴(kuò)增的mRNA的量，優(yōu)選地可以進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCRTM擴(kuò)增過(guò)程。聚合酶鏈反應(yīng)方法在本領(lǐng)域眾所周知。
其它許多依賴模板的方法在本領(lǐng)域已知并可使用，其中許多是PCRTM擴(kuò)增技術(shù)的變型。例如，這些方法包括連接酶鏈反應(yīng)(稱為L(zhǎng)CR)，如歐洲專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)320,308和美國(guó)專利號(hào)4,883,750所述；Qβ復(fù)制酶，如PCT國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)PCT/US87/00880所述；鏈置換擴(kuò)增(SDA)和修復(fù)鏈反應(yīng)(RCR)。英國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?202328和PCT國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)PCT/US89/01025還描述了其它擴(kuò)增方法。其它核酸擴(kuò)增方法包括基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)(PCT國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO 88/10315)，包括基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)和3SR。歐洲專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)329,822描述了一種核酸擴(kuò)增方法，它包括循環(huán)合成單鏈RNA(“ssRNA”)、ssDNA和雙鏈DNA(dsDNA)。PCT國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO 89/06700描述了一種核酸序列擴(kuò)增方法，它是基于啟動(dòng)子/引物序列與單鏈靶DNA(“ssRNA”)雜交，隨后該序列的許多RNA拷貝轉(zhuǎn)錄。其它擴(kuò)增方法如“RACE”(Frohman，1990)和“單向PCR”(Ohara，1989)也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知。
利用眾所周知的技術(shù)，本發(fā)明的多核苷酸的擴(kuò)增部分可用來(lái)從適當(dāng)?shù)奈膸?kù)(例如腫瘤cDNA文庫(kù))中分離全長(zhǎng)基因。在這些技術(shù)中，用一種或多種多核苷酸探針或適于擴(kuò)增的引物篩查文庫(kù)(cDNA或基因組文庫(kù))。優(yōu)選地，按大小選擇文庫(kù)，使之包含較大的分子。為了鑒定基因的5’和上游區(qū)，也優(yōu)選隨機(jī)引物文庫(kù)。為了獲得內(nèi)含子和延伸的5’序列，優(yōu)選基因組文庫(kù)。
對(duì)于雜交技術(shù)，部分序列可以用眾所周知的技術(shù)標(biāo)記(例如通過(guò)切口平移或用32P末端標(biāo)記)。通過(guò)用標(biāo)記探針與含有變性菌落(或含有噬斑的菌苔)的濾紙雜交，篩查細(xì)菌或噬菌體文庫(kù)(參見(jiàn)，Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NY，1989)。篩選并擴(kuò)增雜交菌落或噬斑，分離DNA進(jìn)一步分析。例如，可以使用來(lái)自部分序列的引物或來(lái)自載體的引物進(jìn)行PCR，分析cDNA克隆，確定其它序列的含量?？僧a(chǎn)生限制酶切圖譜和部分序列，鑒定一種或多種重疊克隆。然后可利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定完整序列，這可能包括產(chǎn)生一系列缺失克隆。然后將產(chǎn)生的重疊序列裝配為一個(gè)連續(xù)序列。利用眾所周知的技術(shù)，通過(guò)連接合適的片段，產(chǎn)生全長(zhǎng)cDNA分子。
或者，還能利用如上所述的擴(kuò)增技術(shù)由部分cDNA序列獲得全長(zhǎng)編碼序列。一種這樣的擴(kuò)增技術(shù)是反向PCR(參見(jiàn)，Triglia等人，Nucl.Acids Res.168186，1988)，它使用限制酶產(chǎn)生已知基因區(qū)中的一條片段。然后通過(guò)分子內(nèi)連接環(huán)化該片段，在使用來(lái)源于已知區(qū)的趨異引物的PCR中用作模板。在一種備選方法中，通過(guò)利用接頭序列的引物和對(duì)已知區(qū)域特異的引物擴(kuò)增，可得到與部分序列相鄰的序列。通常利用相同的接頭引物和已知區(qū)域特異的第二條引物，對(duì)擴(kuò)增的序列進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。WO 96/38591描述了該方法的一種變型，它使用兩條引物，起始從已知序列以相反方向延伸。另一種這樣的技術(shù)被稱為“快速cDNA末端擴(kuò)增”或RACE。該技術(shù)包括利用可與polyA區(qū)或載體序列雜交的內(nèi)部引物和外部引物鑒定位于已知序列5’和3’的序列。其它技術(shù)包括捕獲PCR(Lagerstrom等人，PCR Methods Applic.1111-119，1991)和步移PCR(Parker等人，Nucl.Acids Res.193055-60，1991)。也可利用其它擴(kuò)增方法獲得全長(zhǎng)cDNA序列。
在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，可以在重組DNA分子中使用編碼本發(fā)明的多肽或融合蛋白或其功能相當(dāng)物的多核苷酸序列或其片段，指導(dǎo)該多肽在適當(dāng)宿主細(xì)胞中表達(dá)。由于遺傳密碼固有的簡(jiǎn)并性，可能產(chǎn)生編碼基本上相同或功能相當(dāng)?shù)陌被嵝蛄械钠渌麯NA序列，這些序列可用來(lái)克隆和表達(dá)特定多肽。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在某些情況下產(chǎn)生含有非自然存在的密碼子的多肽編碼核苷酸序列是有利的。例如，能選擇特定原核或真核宿主優(yōu)選的密碼子，來(lái)提高蛋白質(zhì)表達(dá)的速度，或產(chǎn)生具有希望的特性(如半衰期長(zhǎng)于由自然存在的序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物)的重組RNA轉(zhuǎn)錄物。
而且，也能利用本領(lǐng)域周知的方法改造本發(fā)明的多核苷酸序列，以期為了多種原因改變多肽編碼序列，包括但不限于基因產(chǎn)物克隆、加工和/或表達(dá)的改變。例如，可以利用通過(guò)隨機(jī)片段化及基因片段和合成寡核苷酸的PCR再裝配的DNA改組改造核苷酸序列。另外，也可利用定點(diǎn)誘變插入新的限制位點(diǎn)，改變糖基化模式，改變密碼子偏倚性，產(chǎn)生剪接變體或引入突變，等等。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，天然、修飾或重組的核酸序列可以與異源序列連接，使之編碼一種融合蛋白。例如，為了從肽庫(kù)篩選多肽活性的抑制劑，可有利地編碼能被購(gòu)得的抗體識(shí)別的嵌合蛋白。也可改造融合蛋白，使之在多肽編碼序列與異源蛋白質(zhì)序列之間含有一個(gè)酶切位點(diǎn)，以便將該多肽從異源部分上切下并純化。
可以利用本領(lǐng)域眾所周知的化學(xué)方法整個(gè)或部分地合成編碼希望的多肽的序列(參見(jiàn)，Caruthers，M.H.等人，(1980)Nucl.AcidsRes.Symp.Ser.215-223，Horn，T.等人，(1980)Nucl.Acids Res.Symp.Ser.225-232)?；蛘?，利用化學(xué)方法合成多肽的氨基酸序列或其一部分也可產(chǎn)生蛋白質(zhì)本身。例如，肽合成能用多種固相技術(shù)進(jìn)行(Roberge，J.Y.等人(1995)Science 269202-204)，自動(dòng)合成例如可用ABI 43A肽合成儀(Perkin Elmer，Palo Alto，CA)完成。
一種新合成的肽可以用制備型高效液相層析(例如Creighton，T.(1983)《蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)和分子原理》WH Freeman and Co.，紐約，N.Y.)或本領(lǐng)域使用的其它類(lèi)似技術(shù)充分純化。合成肽的組成可通過(guò)氨基酸分析或測(cè)序(例如Edman降解法)證實(shí)。此外，在直接合成過(guò)程中也可改變多肽的氨基酸序列或其任一部分，和/或利用化學(xué)方法與其它蛋白質(zhì)的序列或其任一部分組合，產(chǎn)生一種變體多肽。
為了表達(dá)希望的多肽，編碼多肽或功能相當(dāng)物的核苷酸序列可以插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，即，含有插入的編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯所需元件的載體?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法構(gòu)建含有編碼目的多肽的序列和適當(dāng)轉(zhuǎn)錄和翻譯控制元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組。例如，Sambrook，J.等人，(1989)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，Plainview，NY，和Ausubel，F(xiàn).M.等人(1989)《現(xiàn)代分子生物學(xué)方法》，John Wiley &Sons，紐約，N.Y.描述了這些技術(shù)。
可利用大量表達(dá)載體/宿主系統(tǒng)含有和表達(dá)多核苷酸序列。這些包括但不限于微生物，如用重組噬菌體、質(zhì)?；蛘沉NA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；用酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母；用病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)轉(zhuǎn)化的昆蟲(chóng)細(xì)胞；用病毒表達(dá)載體(例如花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)或細(xì)菌表達(dá)載體(例如Ti或pBR322質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。
表達(dá)載體中存在的“控制元件”或“調(diào)節(jié)序列”是載體的非翻譯區(qū)——增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、5’和3’非翻譯區(qū)——它們與宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄和翻譯。這些元件的強(qiáng)度和特異性可能不同。根據(jù)所用的載體系統(tǒng)和宿主，可以使用任何數(shù)量的適當(dāng)轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。例如，當(dāng)克隆于細(xì)菌系統(tǒng)中時(shí)，可以使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如PBLUESCRIPT噬粒(Stratagene，La Jolla，Calif.)或PSPORT1質(zhì)粒(Gibco BRI，Gaithersburg，MD)等的雜合lacZ啟動(dòng)子。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中，通常優(yōu)選來(lái)自哺乳動(dòng)物基因或哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子。如果必須產(chǎn)生含有多個(gè)拷貝的多肽編碼序列的細(xì)胞系，可以方便地使用含有適當(dāng)選擇性標(biāo)記、基于SV40或EBV的載體。
在細(xì)菌系統(tǒng)中，可以根據(jù)表達(dá)的多肽的目的用途選擇許多表達(dá)載體。例如，當(dāng)需要大量時(shí)，例如為了誘生抗體，可以使用指導(dǎo)易于純化的融合蛋白高水平表達(dá)的載體。這些載體包括但不限于多功能大腸桿菌克隆和表達(dá)載體，如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中編碼目的多肽的序列可以與β-半乳糖苷酶的氨基端Met的序列和隨后的7個(gè)殘基連接于載體中，產(chǎn)生雜種蛋白；pIN載體(van Heeke，G和S.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.2645503-5509)；等等。也可以利用pGEX載體(Promega，Madison，Wis.)表達(dá)外源多肽，作為與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。這些融合蛋白通常是可溶的，通過(guò)吸附于谷胱甘肽-瓊脂糖珠，隨后在谷胱甘肽存在下洗脫，易于從裂解的細(xì)胞中純化。這些系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可設(shè)計(jì)為包含肝素、凝血酶或因子X(jué)A蛋白酶切位點(diǎn)，以便能隨意從GST部分釋放克隆的目的多肽。
對(duì)于酵母，釀酒酵母，可以使用許多含有組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(如α因子、醇氧化酶和PGH)的載體。綜述見(jiàn)Ausubel等人(見(jiàn)上文)和Grant等人(1987)Methods Enzymol.153516-544。
在使用植物表達(dá)載體時(shí)，編碼多肽的序列的表達(dá)可以由大量啟動(dòng)子中的任一種驅(qū)動(dòng)。例如，可以單獨(dú)使用病毒啟動(dòng)子，如CaMV的35S和19S啟動(dòng)子，或與TMV的ω前導(dǎo)序列組合使用(Takamatsu，N.(1987)EMBO J.6307-311)?；蛘撸部墒褂弥参飭?dòng)子，如RUBISCO的小亞基或熱休克啟動(dòng)子(Coruzzi，G.等人(1984)EMBO.J.31671-1680；Broglie，R.等人(1984)Science 224838-843；Winter，J.等人(1991)Results Probl.Cell Differ.1785-105)。這些構(gòu)建體能通過(guò)直接DNA轉(zhuǎn)化或病原體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染導(dǎo)入植物細(xì)胞中。這些技術(shù)在大量綜述中有描述(參見(jiàn)，例如，Hobbs，S.或Murry，L.E.《McGraw Hill科學(xué)技術(shù)年鑒》(1992)McGraw Hill，紐約，N.Y.；191-196頁(yè))。
也可以利用昆蟲(chóng)系統(tǒng)表達(dá)目的多肽。例如，在這樣一種系統(tǒng)中，用苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核多角體病毒(AcNPV)作為載體在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞或夜蛾(Trichoplusia)幼蟲(chóng)中表達(dá)外源基因。編碼該多肽的序列可以克隆到病毒的非必需區(qū)，如多角體蛋白基因，并置于多角體蛋白啟動(dòng)子控制下。多肽編碼序列的成功插入將使多角體蛋白基因失活，產(chǎn)生缺乏外殼蛋白的重組病毒。然后可用該重組蛋白感染如草地夜蛾細(xì)胞或夜蛾幼蟲(chóng)，其中可以表達(dá)目的多肽(Engelhard，E.K.等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.913224-3227)。
在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，通?？梢允褂枚喾N基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。例如，在使用腺病毒作為表達(dá)載體時(shí)，編碼目的多肽的序列可以連接到由晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)前導(dǎo)序列組成的腺病毒/轉(zhuǎn)錄翻譯復(fù)合物中。在非必需E1或E3區(qū)中插入病毒基因組可以用來(lái)獲得能在感染的宿主細(xì)胞中表達(dá)該多肽的活病毒(Logan，J.和Shenk，T.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.813655-3659)。另外，也可利用轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子如勞斯肉瘤病毒(RSV)增強(qiáng)子增強(qiáng)在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
也可用特異起始信號(hào)實(shí)現(xiàn)編碼目的多肽的序列的更有效翻譯。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子和相鄰序列。在編碼多肽的序列、其起始密碼子和上游序列插入適當(dāng)表達(dá)載體中時(shí)，可不需要其它轉(zhuǎn)錄或翻譯控制信號(hào)。然而，在只插入編碼序列或其部分時(shí)，應(yīng)當(dāng)使用外源翻譯控制信號(hào)，包括ATG起始密碼子。此外，起始密碼子應(yīng)當(dāng)在正確的閱讀框內(nèi)，以確保整個(gè)插入片段的翻譯。外源翻譯元件和起始密碼子可以是不同來(lái)源的，包括自然的和合成的。含有適于所用特定細(xì)胞系統(tǒng)的增強(qiáng)子，如文獻(xiàn)中所述的增強(qiáng)子(Scharf，D.等人(1994)ResultsProbl.Cell Differ.20125-162)，可提高表達(dá)效率。
另外，也可以根據(jù)調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)或以希望的方式加工表達(dá)蛋白的能力，選擇宿主細(xì)胞株。多肽的這類(lèi)修飾包括但不限于乙?；Ⅳ然?、糖基化、磷酸化、脂化和?；?。也可以利用切割蛋白質(zhì)的“前原”形式的翻譯后加工促進(jìn)正確的插入、折疊和/或功能?？梢赃x擇不同的宿主細(xì)胞，如CHO、COS、HeLa、MDCK、HEK293和WI38，它們具有翻譯后活性的特殊細(xì)胞機(jī)器和特有機(jī)制，來(lái)確保外源蛋白質(zhì)的正確修飾和加工。
為了長(zhǎng)期、高產(chǎn)量地生產(chǎn)重組蛋白，通常優(yōu)選穩(wěn)定的表達(dá)。例如，可以用在相同或不同載體上含有病毒來(lái)源的復(fù)制起點(diǎn)和/或內(nèi)源表達(dá)元件和選擇性標(biāo)記基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化穩(wěn)定表達(dá)目的多核苷酸的細(xì)胞系。在載體導(dǎo)入后，細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2天，然后轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基中。選擇性標(biāo)記的目的在于提供對(duì)選擇的抗性，它的存在允許培養(yǎng)和回收成功表達(dá)導(dǎo)入序列的細(xì)胞。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的抗性克隆可以用適于該細(xì)胞類(lèi)型的組織培養(yǎng)技術(shù)增殖。
許多篩選系統(tǒng)可用來(lái)回收轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。包括但不限于單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler，M.等人(1977)Cell 11223-32)和腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Wowy，I.等人(1990)Cell 22817-23)基因，它們分別能在tk.sup-或aprt.sup.-細(xì)胞中使用?？勾x物、抗生素或除草劑抗性也能用作選擇根據(jù)；例如，賦予氨甲喋呤抗性的dhfr(Wigler，M.等人(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.773567-70)；賦予氨基糖苷類(lèi)、新霉素和G-418抗性的npt(Colbere-Garapin，F(xiàn).等人(1981)J.Mol.Biol.1501-4)；和分別賦予chlorsulfuron和膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶抗性的als或pat(Murry，同上文)。也描述了其它選擇性基因，例如trpB，它允許細(xì)胞利用吲哚代替色氨酸，或hisD，它允許細(xì)胞利用組氨醇代替組氨酸(Hartman，S.C.和R.C.Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.858047-51)。應(yīng)用可見(jiàn)標(biāo)記受到歡迎，如花色素苷、β-葡糖苷酸酶及其底物GUS、螢光素酶及其底物螢光素，它們不僅廣泛用于鑒定轉(zhuǎn)化子，而且用于定量由特定載體系統(tǒng)引起的瞬時(shí)或穩(wěn)定蛋白質(zhì)表達(dá)的量(Rhodes，C.A.等人(1995)Methods Mol.Biol.55121-131)。
盡管標(biāo)記基因表達(dá)的存在/不存在提示也存在目的基因，但是它的存在和表達(dá)可能需要證實(shí)。例如，如果在標(biāo)記基因序列中插入編碼多肽的序列，能根據(jù)標(biāo)記基因功能的缺乏鑒定含有這些序列的重組細(xì)胞?；蛘?，標(biāo)記基因也能與多肽編碼序列串聯(lián)置于一個(gè)啟動(dòng)子控制下。由誘導(dǎo)或選擇引起的標(biāo)記基因的表達(dá)通常也表明串聯(lián)基因的表達(dá)。
或者，含有并表達(dá)希望的多核苷酸序列的宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的多種方法鑒定。這些方法包括但不限于DNA-DNA或DNA-RNA雜交和蛋白質(zhì)生物測(cè)定或免疫測(cè)定技術(shù)，包括如基于膜、溶液或芯片的技術(shù)，用于核酸或蛋白質(zhì)的檢測(cè)和/或定量。
利用產(chǎn)物特異的多克隆或單克隆抗體檢測(cè)和測(cè)定多核苷酸編碼產(chǎn)物的多種方法在本領(lǐng)域周知。例子包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)和熒光激活細(xì)胞分選(FACS)。利用與特定多肽上兩個(gè)不干擾表位有反應(yīng)性的單克隆抗體、基于單克隆的雙向免疫測(cè)定法對(duì)于某些用途可能是優(yōu)選的，但是也可使用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定。Hampton，R.等人(1990；《血清學(xué)方法，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，APS出版社，St Paul.Minn.)和Maddox，D.E.等人(1983；J.Exp.Med.1581211-1216)描述了這些及其它測(cè)定法。
許多標(biāo)記和結(jié)合技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，可以在多種核酸和氨基酸測(cè)定中使用。為檢測(cè)多核苷酸相關(guān)序列產(chǎn)生標(biāo)記的雜交或PCR探針的方法包括寡聚物標(biāo)記、切口平移、末端標(biāo)記或使用標(biāo)記核苷酸的PCR擴(kuò)增?；蛘撸@些序列或其任一部分也可克隆到一個(gè)載體中，用于產(chǎn)生mRNA探針。這些載體在本領(lǐng)域周知，可商業(yè)獲得，并且可以用來(lái)通過(guò)加入適當(dāng)RNA聚合酶(如T7、T3或SP6)和標(biāo)記的核苷酸在體外合成RNA探針。這些方法可以用多種商品試劑盒進(jìn)行?？梢詰?yīng)用的合適的報(bào)道分子或標(biāo)記物包括放射性核素、酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)色劑，以及底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒等。
用目的多核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以在適于從細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)和回收蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)。根據(jù)序列和/或所用的載體，重組細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以分泌或包含于細(xì)胞內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，含有本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)載體可以設(shè)計(jì)為含有信號(hào)序列，該信號(hào)序列引導(dǎo)編碼的多肽通過(guò)原核或真核細(xì)胞膜分泌。其它重組構(gòu)建可用來(lái)將編碼目的多肽的序列與編碼有助于可溶性蛋白質(zhì)純化的多肽域的核苷酸序列連接。這些便于純化的結(jié)構(gòu)域包括但不限于金屬螯合肽，如允許在固定金屬上純化的組氨酸-色氨酸分子，允許在固定免疫球蛋白上純化的蛋白A域，在FLAGS延伸/親和純化系統(tǒng)(ImmunexCorp.，Seattle，Wash.)中使用的域。在純化域與編碼的多肽之間含有可切割的連接序列(如因子X(jué)A或腸激酶(Invitrogen.San Diego，Calif.)特異序列)有利于純化。一種這樣的表達(dá)載體用于表達(dá)含有目的多肽和在硫氧還蛋白或腸激酶酶切位點(diǎn)之前編碼6組氨酸殘基的核酸的融合蛋白。組氨酸殘基有利于在如Porath，J.等人(1992，Prot.Exp.Purif.3263-281)所述的IMIAC(固定金屬離子親和層析)上純化，而腸激酶酶切位點(diǎn)提供了從融合蛋白中純化希望的多肽的方法。Kroll，D.J.等人(1993；DNA Cell Biol.12441-453)討論了含有融合蛋白的載體。
除了重組生產(chǎn)方法外，還可以利用固相技術(shù)通過(guò)直接肽合成產(chǎn)生本發(fā)明的多肽及其片段(Merrifield J.(1963)J.Am.Chem.Soc.852149-2154)。蛋白質(zhì)合成可以利用手工技術(shù)或自動(dòng)進(jìn)行。自動(dòng)合成可以用例如Applied Biosystems 431A肽合成儀(Perkin Elmer)實(shí)現(xiàn)。此外，也可以利用化學(xué)法分別化學(xué)合成不同片段，然后組合，產(chǎn)生全長(zhǎng)的分子。
抗體組合物、其片段及其它結(jié)合劑根據(jù)另一方面，本發(fā)明還提供結(jié)合劑，如抗體及其抗原結(jié)合片段，它們顯示與此處公開(kāi)的腫瘤多肽或與其部分、變體或衍生物免疫學(xué)結(jié)合。如果一種抗體或其抗原結(jié)合片段與本發(fā)明的多肽以可檢測(cè)的水平反應(yīng)(例如在ELISA測(cè)定中)，而在類(lèi)似條件下不與無(wú)關(guān)多肽可檢測(cè)地反應(yīng)，則稱其可與該多肽“特異結(jié)合”、“免疫學(xué)結(jié)合”和/或是“免疫反應(yīng)性的”。
在此使用時(shí)，免疫結(jié)合通常是指在免疫球蛋白分子與免疫球蛋白特異的抗原之間發(fā)生的非共價(jià)作用。免疫結(jié)合作用的強(qiáng)度和親和力能用相互作用的解離常數(shù)(Kd)表示，其中較小的Kd表示較大的親和力。選擇的多肽的免疫結(jié)合性質(zhì)能用本領(lǐng)域周知的方法定量。一種這樣的方法需要測(cè)定抗原結(jié)合位點(diǎn)/抗原復(fù)合物形成和解離的速率，其中這些速率取決于復(fù)合物配偶體的濃度、相互作用的親和力和在兩個(gè)方向同樣影響該速率的幾何參數(shù)(geometric parameters)。因此，通過(guò)計(jì)算濃度及結(jié)合和解離的實(shí)際速率能確定“形成速率常數(shù)(on rateconstant)”(Kon)“解離速率常數(shù)(off rate constant)”(Koff)。Koff/Kon之比能消除與親和力無(wú)關(guān)的所有參數(shù)，因而等同于解離常數(shù)Kd。參見(jiàn)Davies等人(1990)Annual Rev.Biochem.59439-473。
抗體的“抗原結(jié)合位點(diǎn)”或“結(jié)合部分”是指免疫球蛋白分子參與抗原結(jié)合的部分?？乖Y(jié)合位點(diǎn)由重鏈( “H”)和輕鏈(“L”)N端可變(“V”)區(qū)的氨基酸殘基形成。重鏈和輕鏈V區(qū)內(nèi)的三個(gè)非常趨異的區(qū)段被稱為“超變區(qū)”，它們分散于被稱為“構(gòu)架區(qū)”或“FR”的多個(gè)保守側(cè)翼區(qū)段之間。因此術(shù)語(yǔ)“FR”是指在免疫球蛋白超變區(qū)之間和與之相鄰處自然發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列。在抗體分子中，輕鏈的三個(gè)超變區(qū)和重鏈的三個(gè)超變區(qū)在三維空間上彼此相對(duì)排列，形成一個(gè)抗原結(jié)合表面。該抗原結(jié)合表面互補(bǔ)于結(jié)合抗原的三維表面，每個(gè)重鏈和輕鏈的三個(gè)超變區(qū)被稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”。
利用此處所述的典型測(cè)定法，結(jié)合劑還能區(qū)分患有或未患癌癥(如乳腺癌)的患者。例如，可與腫瘤蛋白結(jié)合的抗體或其它結(jié)合劑優(yōu)選地在至少約20％的疾病患者中，更優(yōu)選地在至少約30％的患者中產(chǎn)生表明存在癌癥的信號(hào)?；蛘?，或此外，該抗體將在至少約90％的無(wú)癌癥個(gè)體中產(chǎn)生表明未患病的陰性信號(hào)。為了確定一種結(jié)合劑是否滿足這一要求，可以如此處所述測(cè)定患有或未患癌癥的患者(用標(biāo)準(zhǔn)臨床試驗(yàn)確定)的生物樣品(例如血液、血清、痰、尿和/或腫瘤活檢)中是否存在能與該結(jié)合劑結(jié)合的多肽。優(yōu)選地，應(yīng)當(dāng)測(cè)定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著數(shù)量的患有或未患疾病的樣品。每種結(jié)合劑都應(yīng)滿足以上標(biāo)準(zhǔn)；然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，為了提高靈敏度，可組合使用結(jié)合劑。
滿足以上要求的任何試劑都可以是結(jié)合劑。例如，結(jié)合劑可以是含或不含肽成分的核糖體，RNA分子或多肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，結(jié)合劑是抗體或其抗原結(jié)合片段?？贵w可用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的多種技術(shù)制備。參見(jiàn)，例如，Harlow和Lane，《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1988。通常能用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生抗體，包括此處所述的單克隆抗體的產(chǎn)生方法，或通過(guò)抗體基因轉(zhuǎn)染合適的細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主，產(chǎn)生重組抗體。在一種技術(shù)中，首先用含多肽的免疫原注射任一種哺乳動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、兔、綿羊或山羊)中。在該步驟中，本發(fā)明的多肽可不加修飾作為免疫原。或者，特別是對(duì)于相對(duì)較短的多肽，如果多肽與一種載體蛋白(如牛血清白蛋白或匙孔血藍(lán)蛋白)連接，可引發(fā)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地按照包括一次或多次加強(qiáng)免疫的預(yù)定方案，對(duì)動(dòng)物宿主注射免疫原，并且定期對(duì)動(dòng)物采血。然后利用與適當(dāng)固體載體偶聯(lián)的多肽，通過(guò)親和層析法，從這些抗血清中純化該多肽特異的多克隆抗體。
目的抗原性多肽特異的單克隆抗體可用Kohler和Milstein，Eur，J.Immunol.6511-519，1976的技術(shù)及其改進(jìn)方法制備。簡(jiǎn)言之，這些方法包括制備能產(chǎn)生具有希望特異性(即與目的多肽的反應(yīng)性)的抗體的無(wú)限增殖化細(xì)胞系。例如，可以用從如上所述免疫的動(dòng)物中獲得的脾細(xì)胞產(chǎn)生這些細(xì)胞系。然后通過(guò)例如與骨髓瘤細(xì)胞融合配偶體融合，優(yōu)選地與免疫動(dòng)物同源的骨髓瘤細(xì)胞融合配偶體融合，使脾細(xì)胞無(wú)限增殖化?？梢允褂枚喾N融合技術(shù)。例如，脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞可以與非離子型去污劑結(jié)合幾分鐘，然后以低密度接種于支持雜種細(xì)胞生長(zhǎng)但不支持骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的選擇性培養(yǎng)基中。一種優(yōu)選的篩選技術(shù)使用HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤、胸苷)篩選。經(jīng)足夠的時(shí)間后，通常1至2周，觀察到雜種集落。選擇單集落，檢測(cè)其培養(yǎng)上清液對(duì)多肽的結(jié)合活性。優(yōu)選具有高反應(yīng)性和特異性的雜交瘤。
可從生長(zhǎng)的雜交瘤集落的上清液中分離單克隆抗體。另外，也可以利用多種技術(shù)提高產(chǎn)量，如向合適的脊椎動(dòng)物宿主(如小鼠)的腹膜腔中注射雜交瘤細(xì)胞系。然后從腹水或血液中收集單克隆抗體?？梢岳贸Ｒ?guī)技術(shù)，如層析、凝膠過(guò)濾、沉淀和抽提，從抗體中除去雜質(zhì)。本發(fā)明的多肽可在純化方法(如親和層析步驟)中使用。
許多治療上有用的分子在本領(lǐng)域已知，它們含有能顯示抗體分子的免疫結(jié)合性質(zhì)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。蛋白水解酶木瓜蛋白酶優(yōu)先切割I(lǐng)gG分子，產(chǎn)生幾個(gè)片段，其中兩個(gè)(“F(ab)”片段)均含有一個(gè)含有完整抗原結(jié)合位點(diǎn)的共價(jià)異二聚體。胃蛋白酶能切割I(lǐng)gG分子，產(chǎn)生幾個(gè)片段，包括含有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的“F(ab’)2”片段?！癋v”片段能通過(guò)優(yōu)先蛋白切割I(lǐng)gM、在極少數(shù)情況中切割I(lǐng)gG或IgA免疫球蛋白分子產(chǎn)生。然而，F(xiàn)v片段更常見(jiàn)地是利用本領(lǐng)域周知的重組技術(shù)產(chǎn)生。Fv片段包含非共價(jià)VH:VL異二聚體，它含有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，后者保留原始抗體分子的許多抗原識(shí)別和結(jié)合能力。Inbar等人(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 692659-2662；Hochman等人(1976)Biochem 152706-2710；Ehrlich等人(1980)Biochem194091-4096。
單鏈Fv(“sFv”)多肽是一種共價(jià)連接的VH∷VL異二聚體，它從包括通過(guò)編碼肽的接頭連接起來(lái)的VH編碼基因和VL編碼基因的基因融合物表達(dá)而來(lái)。Huster等Proc.Nat.Acad.Sci.USA85(16)5879-5883。已經(jīng)描述了許多方法鑒別化學(xué)結(jié)構(gòu)用于將天然聚集但化學(xué)上分離的輕和重多肽鏈從抗體V區(qū)轉(zhuǎn)化成將折疊為基本上類(lèi)似于抗原結(jié)合位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)的sFv分子。參見(jiàn)美國(guó)專利5,091,513和5,132,405，Huston等；和美國(guó)專利4,946,778，Ladner等。
上述每一種分子都含有重鏈和輕鏈CDR組，后者分別插入重鏈與輕鏈FR組之間，F(xiàn)R組提供對(duì)CDRS的支持，并確定CDR相對(duì)于彼此的空間聯(lián)系。在此使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“CDR組”是指重鏈或輕鏈V區(qū)的三個(gè)超變區(qū)。這些區(qū)域從重鏈或輕鏈的N端起，分別被稱為“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原結(jié)合位點(diǎn)包含6個(gè)CDR，含有來(lái)自每個(gè)重鏈和輕鏈V區(qū)的CDR組。含有一個(gè)CDR(例如CDR1、CDR2或CDR3)的多肽在此被稱為“分子識(shí)別單位”。對(duì)大量抗原-抗體復(fù)合物的結(jié)晶分析證明，CDR的氨基酸殘基形成與結(jié)合抗原的廣泛接觸，其中最廣泛的抗原接觸是與重鏈CDR3。因此，分子識(shí)別單位主要負(fù)責(zé)抗原結(jié)合位點(diǎn)的特異性。
在此使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“FR組”是指4種側(cè)翼氨基酸序列，它們構(gòu)成重鏈或輕鏈V區(qū)的CDR組CDR的框架。某些FR殘基可接觸結(jié)合抗原；然而，F(xiàn)R主要負(fù)責(zé)將V區(qū)折疊為抗原結(jié)合位點(diǎn)，特別是直接與CDRS相鄰的FR殘基。在FR內(nèi)，某些氨基酸殘基和某些結(jié)構(gòu)特征非常保守。在這點(diǎn)上，所有V區(qū)序列都含有一個(gè)約90個(gè)氨基酸殘基的內(nèi)部二硫環(huán)。當(dāng)V區(qū)折疊為結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，CDR表現(xiàn)為凸出的環(huán)形基序，形成抗原結(jié)合表面。一般認(rèn)為存在保守的FR結(jié)構(gòu)區(qū)，它們影響CDR環(huán)折疊為某些“典型”結(jié)構(gòu)，而無(wú)論精確的CDR氨基酸序列如何。另外，已知某些FR殘基參與非共價(jià)域間接觸，這穩(wěn)定了抗體重鏈和輕鏈的相互作用。
已經(jīng)描述了含有來(lái)自非人類(lèi)免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點(diǎn)的大量“人源化”抗體分子，包括嵌合抗體，其含有與人類(lèi)恒定域融合的嚙齒動(dòng)物V區(qū)和相關(guān)CDR(Winter等人(1991)Nature 349293-299；Lobuglio等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 864220-4224；Shaw等人(1987)J Immunol.1384534-4538；Brown等人(1987)Cancer Res.473577-3583)，在與適當(dāng)人類(lèi)抗體恒定域融合之前嫁接到人支持FR中的嚙齒動(dòng)物CDR(Riechmann等人(1988)Nature332323-327；Verhoeyen等人(1988)Science 2391534-1536；Jones等人(1986)Nature 321522-525)和重組鑲飾嚙齒動(dòng)物FR支持的嚙齒動(dòng)物CDR(1992年12月23日公布的歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?19,596)。這些“人源化”分子設(shè)計(jì)為使對(duì)嚙齒動(dòng)物抗人抗體分子的不希望的免疫應(yīng)答降至最低，這種應(yīng)答限制這些部分在人類(lèi)受體中的治療用途的持續(xù)時(shí)間和有效性。
在此使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“鑲飾FR(veneered FRs)”和“重組鑲飾FR”是指將例如嚙齒動(dòng)物重鏈或輕鏈V區(qū)的FR殘基選擇性置換為人類(lèi)FR，以期產(chǎn)生含有抗原結(jié)合位點(diǎn)、基本上保留全部天然FR多肽折疊結(jié)構(gòu)的異種分子。鑲飾(veneering)技術(shù)基于這一認(rèn)識(shí)抗原結(jié)合位點(diǎn)的配體結(jié)合特征主要由抗原結(jié)合表面內(nèi)重鏈和輕鏈CDR組的結(jié)構(gòu)和相對(duì)位置決定。Davies等人(1990)Annual Rev.Biochem.59439-473。因此，抗原結(jié)合特異性只能在如下情況下保持在人源化抗體中，其中謹(jǐn)慎保留CDR結(jié)構(gòu)、它們彼此之間的相互作用和與其余V區(qū)結(jié)構(gòu)域的相互作用。利用鑲飾技術(shù)將免疫系統(tǒng)容易遇到的外部(例如溶劑可達(dá)的)FR殘基選擇性替換為人類(lèi)殘基，產(chǎn)生含有弱免疫原性或基本上無(wú)免疫原性的鑲飾表面的雜種分子。
鑲飾方法利用可獲得的人類(lèi)抗體可變域的序列數(shù)據(jù)庫(kù)(Kabat等人匯編，《具有免疫學(xué)意義的蛋白質(zhì)的序列》第4版(美國(guó)衛(wèi)生與人類(lèi)部，美國(guó)政府印刷所，1987))，Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)的更新版和其它可獲得的美國(guó)和國(guó)外數(shù)據(jù)庫(kù)(核酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù))。V區(qū)氨基酸的溶劑可及性能由人和鼠抗體片段的已知三維結(jié)構(gòu)推斷。鑲飾鼠抗原結(jié)合位點(diǎn)一般包括兩個(gè)步驟。首先，將目的抗體分子可變域的FR與由上述來(lái)源獲得的人可變域的相應(yīng)FR序列相比較。然后將同源性最大的人類(lèi)V區(qū)與相應(yīng)的鼠氨基酸逐個(gè)殘基地比較。利用本領(lǐng)域周知的重組技術(shù)將鼠FR中不同于人類(lèi)相應(yīng)殘基的殘基替換為人類(lèi)部分中存在的殘基。只對(duì)至少部分暴露(溶劑可及)的部分進(jìn)行殘基變換，在替換對(duì)V區(qū)結(jié)構(gòu)域的三級(jí)結(jié)構(gòu)可能有明顯影響的氨基酸殘基(如脯氨酸、甘氨酸和帶電氨基酸)時(shí)加以注意。
這樣，產(chǎn)生的“鑲飾”鼠抗原結(jié)合位點(diǎn)保留鼠CDR殘基，與CDR基本相鄰的殘基，確定為掩蓋或大部分掩蓋(溶劑不可及)的殘基，認(rèn)為參與重鏈與輕鏈域非共價(jià)(例如靜電和疏水)接觸的殘基，被認(rèn)為影響CDR環(huán)“典型”三級(jí)結(jié)構(gòu)的FR保守結(jié)構(gòu)區(qū)的殘基。這些設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)用來(lái)制備重組核苷酸序列，將鼠抗原結(jié)合位點(diǎn)的重鏈和輕鏈的CDR組合到類(lèi)似人類(lèi)的FR中，它能用來(lái)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，用于表達(dá)顯示鼠抗體分子的抗原特異性的重組人類(lèi)抗體。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的單克隆抗體可與一種或多種治療劑偶聯(lián)。就此而言，合適的治療劑包括放射性核素、分化誘導(dǎo)劑、藥物、毒素及其衍生物。優(yōu)選的放射性核素包括90Y、123I、125I、131I、186Re、188Re、211At和212Bi。優(yōu)選的藥物包括氨甲喋呤和嘧啶和嘌呤類(lèi)似物。優(yōu)選的分化誘導(dǎo)劑包括佛波醇酯和丁酸。優(yōu)選的毒素包括篦麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素、霍亂毒素、gelonin、假單胞菌內(nèi)毒素、志賀菌毒素和美洲商陸抗病毒蛋白。
治療劑可與合適的單克隆抗體直接或間接(例如通過(guò)連接基團(tuán))偶聯(lián)(例如共價(jià)鍵合)。當(dāng)治療劑和抗體均含有能彼此反應(yīng)的取代基時(shí)，它們的直接反應(yīng)是可能的。例如，一個(gè)上的親核基團(tuán)，如氨基或巰基，能與另一個(gè)上的含羰基基團(tuán)(如酐或?；u)，或含有容易離去的基團(tuán)(如鹵化物)的烷基反應(yīng)。
或者，可能希望通過(guò)連接基團(tuán)偶聯(lián)治療劑與抗體。連接基團(tuán)能作為間隔區(qū)使抗體遠(yuǎn)離治療劑，以避免對(duì)結(jié)合能力的干擾。連接基團(tuán)也能用來(lái)提高治療劑或抗體上取代基的化學(xué)反應(yīng)性，從而提高偶聯(lián)效率?；瘜W(xué)反應(yīng)性的提高也可促進(jìn)治療劑或治療劑官能團(tuán)的應(yīng)用，這種應(yīng)用本來(lái)是不可能的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，許多相同及不同功能的雙功能或多功能試劑(如Pirece Chemical Co.，Rockford，IL目錄所述)可用作連接基團(tuán)。例如，通過(guò)氨基、羧基、巰基或氧化的碳水化合物殘基可實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)。有大量參考文獻(xiàn)描述了這些方法，如授予Rodwell等人的美國(guó)專利號(hào)4,671,958。
當(dāng)不含本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物的抗體部分時(shí)，治療劑更加有效，此時(shí)可能希望使用一種在細(xì)胞內(nèi)化期間或之后能被切割的連接基團(tuán)。曾經(jīng)描述了大量不同的可切割連接基團(tuán)。從這些連接基團(tuán)胞內(nèi)釋放治療劑的機(jī)制包括通過(guò)二硫鍵還原(例如，授予Spitler的美國(guó)專利號(hào)4,489,710)、通過(guò)照射光不穩(wěn)定鍵(例如，授予Senter等人的美國(guó)專利號(hào)4,625,014)、通過(guò)衍生的氨基酸側(cè)鏈的水解(例如，授予Kohn等人的美國(guó)專利號(hào)4,638,045)、通過(guò)血清補(bǔ)體介導(dǎo)的水解(例如，授予Rodwell等人的美國(guó)專利號(hào)4,671,958)和酸催化的水解(參見(jiàn)，授予Blattler等人的美國(guó)專利號(hào)4,569,789)切割。
將一種以上的試劑與一種抗體偶聯(lián)可能是希望的。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種試劑的多個(gè)分子與一個(gè)抗體分子偶聯(lián)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種以上的試劑與一個(gè)抗體偶聯(lián)。無(wú)論特定實(shí)施方案如何，可用多種方法制備含一個(gè)以上試劑的免疫偶聯(lián)物。例如，一個(gè)以上的試劑可直接與抗體分子偶聯(lián)，或者能使用提供多個(gè)連接位點(diǎn)的接頭?；蛘?，也能使用載體。
載體可能以多種方式攜帶試劑，包括直接或通過(guò)連接基團(tuán)共價(jià)鍵合。合適的載體包括蛋白質(zhì)如白蛋白(例如，授予Kato等人的美國(guó)專利號(hào)4,507,234)、肽和多糖如氨基葡聚糖(例如，授予Shih等人的美國(guó)專利號(hào)4,699,784)。載體也可通過(guò)非共價(jià)結(jié)合或通過(guò)包封于如脂質(zhì)體囊中攜帶試劑(例如，美國(guó)專利號(hào)4,429,008和4,873,088)。放射性核素試劑特異的載體包括放射性鹵化小分子和螯合化合物。例如，美國(guó)專利號(hào)4,735,792公開(kāi)了代表性的放射性鹵化小分子及其合成。放射性核素螯合物可由螯合化合物形成，包括含有氮及硫原子作為供體原子的螯合化合物，用于結(jié)合金屬或金屬氧化物、放射性核素。例如，授予Davison等人的美國(guó)專利號(hào)4,673,562公開(kāi)了代表性螯合化合物及其合成。
T細(xì)胞組合物另一方面，本發(fā)明提供對(duì)于此處公開(kāi)的Her-2/neu多肽或其變體或衍生物特異的T細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該T細(xì)胞對(duì)SEQ IDNO3所示Her-2/neu肽具有特異性。這些細(xì)胞一般可用標(biāo)準(zhǔn)方法在體外或離體制備。例如，可用購(gòu)得的細(xì)胞分離系統(tǒng)，如可購(gòu)自NexellTherapeutics，Inc.的IsolexTM系統(tǒng)(Irvine，CA；參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,240,856；美國(guó)專利號(hào)5,215,926；WO 89/06280；WO 91/16116和WO92/07243)，從患者的骨髓、外周血或骨髓或外周血級(jí)分中分離T細(xì)胞?；蛘?，也可由有關(guān)和無(wú)關(guān)的人、非人類(lèi)哺乳動(dòng)物、細(xì)胞系或培養(yǎng)物產(chǎn)生T細(xì)胞。
可以用多肽、編碼多肽的多核苷酸和/或表達(dá)這種多肽的抗原呈遞細(xì)胞(APC)刺激T細(xì)胞。這種刺激在足以產(chǎn)生目的多肽特異的T細(xì)胞的條件下和時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。優(yōu)選地，本發(fā)明的腫瘤多肽或多核苷酸存在于輸送載體(如小球體)中，以促進(jìn)特異性T細(xì)胞的產(chǎn)生。
如果T細(xì)胞特異增殖、分泌細(xì)胞因子或殺傷由多肽包被的或表達(dá)編碼該多肽的基因的靶細(xì)胞，則認(rèn)為這種T細(xì)胞對(duì)于本發(fā)明的多肽是特異的。T細(xì)胞特異性可以用多種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)評(píng)價(jià)。例如，在鉻釋放測(cè)定或增殖測(cè)定中，裂解和/或增殖比陰性對(duì)照提高兩倍以上的刺激指數(shù)表明T細(xì)胞特異性。這些測(cè)定可如Chen等人，Cancer Res.541065-1070，1994所述進(jìn)行?；蛘?，對(duì)T細(xì)胞增殖的檢測(cè)也可利用多種已知技術(shù)進(jìn)行。例如，通過(guò)測(cè)定DNA合成率的提高(例如，通過(guò)用氚化胸苷脈沖標(biāo)記T細(xì)胞培養(yǎng)物，并測(cè)定摻入DNA中的氚化胸苷的量)，能檢測(cè)T細(xì)胞的增殖。與腫瘤多肽(100ng/ml-100μg/ml，優(yōu)選地200ng/ml-25μg/ml)接觸3-7天一般將導(dǎo)致T細(xì)胞增殖至少提高2倍。如上所述接觸2-3小時(shí)將導(dǎo)致T細(xì)胞激活，如用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞因子測(cè)定所測(cè)，其中細(xì)胞因子釋放(例如TNF或IFN-γ)水平提高2倍表明T細(xì)胞激活(參見(jiàn)Coligan等人，《現(xiàn)代免疫學(xué)方法》，第一卷，Wiley Interscience(Greene 1998))。由腫瘤多肽、多核苷酸或表達(dá)多肽的APC激活的T細(xì)胞可以是CD4+和/或CD8+。腫瘤多肽特異的T細(xì)胞可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)擴(kuò)增。在優(yōu)選實(shí)施方案中，T細(xì)胞來(lái)自患者、有關(guān)或無(wú)關(guān)供體，在刺激和擴(kuò)增后對(duì)患者施用。
為了治療目的，響應(yīng)腫瘤多肽、多核苷酸或APC增殖的CD4+或CD8+T細(xì)胞能在體外或體內(nèi)大量擴(kuò)增。這些T細(xì)胞的體外增殖可用多種方法實(shí)現(xiàn)。例如，可使T細(xì)胞重復(fù)暴露于腫瘤多肽，或?qū)?yīng)于這種多肽免疫原性部分的短肽，可加入或不加T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，如白介素-2，和/或可合成腫瘤多肽的刺激細(xì)胞?；蛘?，也能通過(guò)克隆大量擴(kuò)增在腫瘤多肽存在下增殖的一種或多種T細(xì)胞?？寺〖?xì)胞的方法在本領(lǐng)域眾所周知，包括有限稀釋法。
T細(xì)胞受體組合物T細(xì)胞受體(TCR)由2個(gè)不同的高變多肽鏈(稱為T(mén)細(xì)胞受體α和β鏈)組成，這兩條鏈通過(guò)二硫鍵連接(Janeway，Travers，Walport，Immunobiology，第4版，148-159，Elsevier Science Ltd/GarlandPublishing，1999)。此α/β異二聚體與細(xì)胞膜上的恒定CD3鏈復(fù)合。該復(fù)合物識(shí)別與MHC分子結(jié)合的特異抗原肽。TCR特異性的巨大多樣性與免疫球蛋白的多樣性極為相似，均是由體細(xì)胞基因重排造成的。β鏈基因含有50多個(gè)可變(V)區(qū)段、2個(gè)多樣性(D)區(qū)段、10多個(gè)連接(J)區(qū)段和2個(gè)恒定區(qū)區(qū)段(C)。α鏈基因含有70多個(gè)V區(qū)段和60多個(gè)J區(qū)段以及一個(gè)C區(qū)段，但沒(méi)有D區(qū)段。當(dāng)T細(xì)胞在胸腺中發(fā)育時(shí)，β鏈的D和J基因發(fā)生重排，之后V基因區(qū)段和DJ之間發(fā)生重排。這種功能性的VDJβ外顯子在轉(zhuǎn)錄后經(jīng)剪切與Cβ連接。對(duì)于α鏈，Vα基因區(qū)段和Jα基因區(qū)段重排形成功能性外顯子，然后該外顯子轉(zhuǎn)錄并與Cα拼接。在重組過(guò)程中，P和N核苷酸在β鏈的V、D和J區(qū)段之間和α鏈的V和J區(qū)段之間的隨機(jī)添加使得多樣性進(jìn)一步增加(Janeway，Travers，Walport，Immunobiology，第4版，98和150，ElsevierScience Ltd/Garland Publishing，1999)。
另一方面，本發(fā)明提供對(duì)此處公開(kāi)的Her-2/Neu多肽、或其變體或衍生物具有特異性的TCR。具體地，本發(fā)明提供確定給定TCR的特異性的VJ或VDJ連接序列的核酸和氨基酸序列。例如，可以從對(duì)Her-2/Neu多肽具有特異性的T細(xì)胞中使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)分離對(duì)Her-2/Neu肽有特異性的TCR的編碼cDNA。
本發(fā)明還提供適宜的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，例如非特異性T細(xì)胞，該宿主細(xì)胞已用對(duì)此處描述的Her-2/Neu多肽具有特異性的TCR的編碼多核苷酸轉(zhuǎn)染，由此使該宿主細(xì)胞對(duì)Her-2/Neu多肽具有特異性。TCR的α和β鏈可以包含在不同的表達(dá)載體上，或者作為可選擇方案包含在一個(gè)表達(dá)載體上，而該表達(dá)載體還含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)從而使得IRES下游的基因可以發(fā)生帽子不依賴性翻譯。可以使用表達(dá)Her-2/Neu多肽特異性TCR的所述宿主細(xì)胞進(jìn)行Her-2/Neu相關(guān)惡性腫瘤的過(guò)繼免疫治療，見(jiàn)以下詳細(xì)討論。
在本發(fā)明的其它方面，可以在診斷Her-2/Neu相關(guān)癌癥的試劑盒中使用此處所述對(duì)Her-2/Neu多肽具有特異性的克隆化TCR。例如，可以將Her-2/Neu相關(guān)腫瘤特異性TCR的核酸序列或其部分用作探針或引物以檢測(cè)生物樣品中編碼該特異TCR的重排基因的表達(dá)。因此，本發(fā)明還提供用于檢測(cè)編碼Her-2/Neu多肽特異性TCR的信使RNA或DNA的測(cè)試方法。
藥物組合物在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及此處公開(kāi)的一種或多種多核苷酸、多肽、T細(xì)胞和/或抗體組合物在藥學(xué)可接受的載體中的制劑，用于單獨(dú)或與一種或多種其它治療形式組合對(duì)細(xì)胞或動(dòng)物施用。
應(yīng)當(dāng)理解，希望時(shí)，此處公開(kāi)的組合物也可以與其它試劑(如其它蛋白質(zhì)或多肽或不同的藥學(xué)活性劑)組合施用。實(shí)際上，假定其它試劑在接觸靶細(xì)胞或宿主組織后不引起明顯的負(fù)面影響，則對(duì)可能包含的其它成分沒(méi)有限制。因此在特定情況需要時(shí)，這些組合物可與其它不同的試劑一起施用。這些組合物可從宿主細(xì)胞或其它生物來(lái)源純化，或者也可如此處所述化學(xué)合成。這些組合物也可能進(jìn)一步包括取代的或衍生的RNA或DNA組合物。
因此，本發(fā)明另一方面提供藥物組合物，其含有一種或多種此處所述的多核苷酸、多肽、抗體和/或T細(xì)胞組合物，以及生理學(xué)可接受的載體。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物含有本發(fā)明的免疫原性多核苷酸和/或多肽組合物，用于預(yù)防和治療疫苗用途。疫苗的制備如M.F.Powell和M.J.Newman編著的《疫苗設(shè)計(jì)(亞基和佐劑方法)》，Plenum出版社(NY，1995)所概述。這些組合物通常含有一種或多種本發(fā)明的免疫原性多核苷酸和/或多肽組合物以及一種或多種免疫刺激劑。
顯然此處所述的任何藥物組合物可含有本發(fā)明的多核苷酸和多肽的藥學(xué)可接受的鹽。這些鹽能由藥學(xué)可接受的無(wú)毒堿制備，包括有機(jī)堿(例如伯胺、腫胺和叔胺和堿性氨基酸的鹽)和無(wú)機(jī)堿(例如鈉、鉀、鋰、銨、鈣和鎂鹽)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的示例性免疫原性組合物(如疫苗組合物)含有編碼一種或多種上述多肽的DNA，使得多肽原位產(chǎn)生。如上所述，該多核苷酸可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的任一種輸送系統(tǒng)內(nèi)施用。的確，大量基因輸送技術(shù)在本領(lǐng)域眾所周知，如Rolland，Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Systems 15143-198，1998和此處引用的參考文獻(xiàn)所述。合適的多核苷酸表達(dá)系統(tǒng)當(dāng)然含有在患者中表達(dá)所必需的DNA調(diào)節(jié)序列(如合適的啟動(dòng)子和終止信號(hào))?；蛘?，細(xì)菌輸送系統(tǒng)還包括施用在細(xì)胞表面表達(dá)多肽免疫原性部分或分泌這種表位的細(xì)菌(如卡介苗)。
因此，在某些實(shí)施方案中，利用周知的多種基于病毒的系統(tǒng)之一，將編碼此處所述免疫原性多肽的多核苷酸導(dǎo)入適當(dāng)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)。在一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒提供了一種方便、有效的基因輸送系統(tǒng)平臺(tái)。能利用本領(lǐng)域周知的技術(shù)將選擇的編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列插入載體并包裝于逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中。然后能分離重組病毒并對(duì)患者施用。曾經(jīng)描述了大量說(shuō)明性逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)(例如美國(guó)專利號(hào)5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7980-990；Miller，A.D.(1990)Human Gene Therapy15-14；Scarpa等人(1991)Virology 180849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908033-8037；Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3102-109)。
另外也描述了許多基于腺病毒的示例性系統(tǒng)。與整合到宿主基因組中的逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，腺病毒存在于染色體外，從而使得與插入誘變有關(guān)的危險(xiǎn)最小(Haj-Ahmad和Graham(1986)J.Virol.57267-274；Bett等人(1993)J.Virol.675911-5921；Mittereder等人(1994)Human Gene Therapy 5717-729；Seth等人(1993)J.Virol.68933-940；Barr等人(1994)Gene Therapy 151-58；Berkner，K.L.(1998)BioTechniques 6616-629；Rich等人(1993)Human GeneTherapy 4461-476)。
也發(fā)展了用于多核苷酸輸送的多種腺伴隨病毒(AAV)載體系統(tǒng)。AAV載體能用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)容易地構(gòu)建。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5,173,414和5,139,941；國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 92/01070和WO93/03769；Lebkowski等人(1988)Molec.Cell.Biol.83988-3996；Vincent等人(1990)Vaccines 90(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)；Carter，B.J.(1992)Current Opinion in Biotechnology 3533-539；Muzyczka，N.(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol.15897-129；Kotin，R.M.(1994)Human Gene Therapy 5793-801；Shelling和Smith(1994)Gene Therapy 1165-169；Zhou等人(1994)J.Exp.Med.1791867-1875。
可用于通過(guò)基因轉(zhuǎn)移輸送編碼本說(shuō)明的多肽的多核苷酸的其它病毒載體包括來(lái)自痘病毒科的載體，如痘苗病毒和禽痘病毒。例如，表達(dá)新分子的痘苗病毒重組體能如下構(gòu)建。首先將編碼多肽的DNA插入適當(dāng)載體中，使它與痘苗啟動(dòng)子和側(cè)翼痘苗DNA序列(如編碼胸苷激酶(TK)的序列)相鄰。然后用該載體轉(zhuǎn)染同時(shí)用痘苗病毒感染的細(xì)胞。利用同源重組向病毒基因組中插入痘苗啟動(dòng)子加編碼目的多肽的基因。通過(guò)在5-溴脫氧尿苷存在下培養(yǎng)細(xì)胞并挑取對(duì)它有抗性的病毒噬斑，篩選產(chǎn)生的TK.sup.(-)重組體。
以痘苗病毒為基礎(chǔ)的感染/轉(zhuǎn)染系統(tǒng)能方便地用于引起此處所述的一種或多種多肽在生物宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)型、瞬時(shí)表達(dá)或共表達(dá)。在這種特定系統(tǒng)中，首先用編碼噬菌體T7 RNA聚合酶的痘苗病毒重組體體外感染細(xì)胞。該聚合酶顯示強(qiáng)烈的特異性，因?yàn)樗晦D(zhuǎn)錄含有T7啟動(dòng)子的模板。在感染后，用T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的多核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞。痘苗病毒重組體在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的聚合酶把轉(zhuǎn)染的DNA轉(zhuǎn)錄為RNA，然后由宿主翻譯機(jī)器翻譯為多肽。該方法導(dǎo)致大量RNA及其翻譯產(chǎn)物的高水平、瞬時(shí)、細(xì)胞質(zhì)的產(chǎn)生。參見(jiàn)，例如，Elroy-Stein和Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)876743-6747；Fuerst等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)838122-8126。
或者，也能利用禽痘病毒(如雞痘和金絲雀痘病毒)輸送目的編碼序列。已知表達(dá)哺乳動(dòng)物病原體的免疫原的重組禽痘病毒在對(duì)非禽類(lèi)物種施用時(shí)可引起保護(hù)性免疫。在人和其它哺乳動(dòng)物種中使用禽痘病毒載體是特別希望的，因?yàn)榍荻徊《緦俚某蓡T只能在易感禽類(lèi)種中生產(chǎn)性復(fù)制，因此不感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞。產(chǎn)生重組禽痘病毒的方法在本領(lǐng)域周知，使用遺傳重組，如上文對(duì)于痘苗病毒的產(chǎn)生所述。參見(jiàn)，例如，WO 91/12882；WO 89/03429；WO 92/03545。
許多甲病毒也能用于輸送本發(fā)明的多核苷酸組合物，如美國(guó)專利號(hào)5,843,723；6,015,686；6,008,035和6,015,694所述的載體。也能使用某些基于委內(nèi)瑞拉馬腦炎(VEE)的載體，其示例性例子見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,505,947和5,643,576。
此外，分子偶聯(lián)載體，如Michael等人，J.Biol.Chem.(1993)2686866-6869和Wanger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)896099-6103所述的腺病毒嵌合載體也能用于本發(fā)明的基因輸送。
關(guān)于這些和其它基于病毒的已知輸送系統(tǒng)的其它說(shuō)明性信息可見(jiàn)于，例如Fisher-Hoch等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86317-321，1989；Flexner等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.56986-103，1989；Flexner等人，Vaccine 817-21，1990；美國(guó)專利號(hào)4,603,112、4,769,330和5,017,487；WO 89/01973；美國(guó)專利號(hào)4,777,127；GB2,200,651；EP 0,345,242；WO 91/02805；Berkner，Biotechniques6616-627，1988；Rosenfeld等人，Science 252431-434，1991；Kolls等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91215-219，1994；Kass-Eisler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9011498-11502，1993；Guzman等人，Circulation 882838-2848，1993；Guzman等人，Cir.Res.731202-1207，1993。
在某些實(shí)施方案中，多核苷酸可以整合到靶細(xì)胞的基因組中。這種整合可以以特定位置和方向經(jīng)同源重組(基因置換)，或者可以非特定位置地隨機(jī)整合(基因擴(kuò)增)。在其它實(shí)施方案中，多核苷酸在細(xì)胞中可穩(wěn)定保持為分開(kāi)的附加型DNA片段。這些多核苷酸片段或“附加體”編碼足以不依賴于宿主細(xì)胞周期或與之同步保持和復(fù)制的序列。向細(xì)胞輸送表達(dá)構(gòu)建體的方式和細(xì)胞中該多核苷酸保持的位置取決于所使用的表達(dá)構(gòu)建體的類(lèi)型。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，如Ulmer等人，Science2591745-1749，1993所述，和Cohen，Science 2591691-1692，1993所綜述，多核苷酸也可以作為“裸露的”DNA施用/輸送。將DNA包被于可生物降解的珠上可提高裸露DNA的攝取，這種珠能被有效地輸送到細(xì)胞內(nèi)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物能通過(guò)粒子轟擊法輸送，其中許多已經(jīng)描述。在一個(gè)說(shuō)明性實(shí)例中，能用如PowderjectPharmaceuticals PLC(Oxford，UK)和Powderject Vaccines Inc.(Madison，WI)制造的裝置實(shí)現(xiàn)氣體驅(qū)動(dòng)的粒子加速，美國(guó)專利號(hào)5,846,796；6,010,478；5,865,796；5,584,807；歐洲專利號(hào)0500799描述了其中一些實(shí)例。該方法提出一種無(wú)針輸送法，其中用手持式裝置產(chǎn)生的氦氣氣流將顯微顆粒(如多核苷酸或多肽顆粒)的干粉制劑加速到高速，推動(dòng)顆粒進(jìn)入靶組織。
在有關(guān)實(shí)施方案中，可用于氣體驅(qū)動(dòng)無(wú)針注射本發(fā)明的組合物的其它裝置和方法包括Bioject，Inc.(Portland，OR)所提供的，美國(guó)專利號(hào)4,790,824；5,064,413；5,312,335；5,383,851；5,399,163；5,520,639和5,993,412中描述了其中一些實(shí)例。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，此處所述的藥物組合物除本發(fā)明的免疫原性多核苷酸、多肽、抗體、T細(xì)胞和/或APC組合物外還含有一種或多種免疫刺激劑。免疫刺激劑是指增強(qiáng)或加強(qiáng)對(duì)外源抗原的免疫應(yīng)答(抗體和/或細(xì)胞介導(dǎo)的)的基本上所有的物質(zhì)。一種優(yōu)選的免疫刺激劑包含佐劑。許多佐劑含有用來(lái)保護(hù)抗原免于快速分解代謝的物質(zhì)，如氫氧化鋁或礦物油，和免疫應(yīng)答的刺激物，如脂質(zhì)A、Bortadellapertussis或結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)來(lái)源的蛋白質(zhì)。某些佐劑可以購(gòu)得，如弗氏不完全佐劑和完全佐劑(DifcoLaboratories，Dtroit，MI)；Merck佐劑65(Merck Company，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(SmithKline Beecham，Philadelphia，PA)；鋁鹽，如氫氧化鋁膠體(明礬)或磷酸鋁；鈣、鐵或鋅鹽；?；野彼岬牟豢扇軕乙?；?；?；陽(yáng)離子或陰離子衍生的多糖；聚磷腈；可生物降解的小球體；單磷酰脂類(lèi)A和quil A。細(xì)胞因子如GM-CSF、白介素-2、-7或-12和其它類(lèi)似生長(zhǎng)因子也可用作佐劑。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，佐劑組合物優(yōu)選地誘導(dǎo)以Th1型為主的免疫應(yīng)答。高水平的Th1型細(xì)胞因子(例如IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-12)傾向于利于誘導(dǎo)針對(duì)施用抗原的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。相反，高水平的Th2型細(xì)胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)傾向于誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。在施用此處所述的疫苗后，患者將支持包括Th1型和Th2型應(yīng)答的免疫應(yīng)答。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，其中應(yīng)答主要是Th1型，Th1型細(xì)胞因子的水平將增加到比Th2型細(xì)胞因子水平更高的程度。這些細(xì)胞因子的水平可用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法評(píng)價(jià)。關(guān)于細(xì)胞因子家族的綜述參見(jiàn)Mosmann和Coffman，Ann.Rev.Immunol.7145-173，1989。
用于引發(fā)以Th1型為主的應(yīng)答的某些優(yōu)選佐劑包括，例如，單磷酰脂類(lèi)A(優(yōu)選地3-脫-O-?；瘑瘟柞Ｖ?lèi)A)與鋁鹽的組合。MPL佐劑可從Corixa公司(Seattle，WA)獲得(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094)。含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲基化)也誘導(dǎo)以Th1為主的應(yīng)答。這些寡核苷酸眾所周知，例如在WO 96/02555、WO 99/33488和美國(guó)專利號(hào)6,008,200和5,856,462中描述。例如，Sato等人，Science 273352，1996也描述了免疫刺激性DNA序列。另一種優(yōu)選佐劑含有皂角苷，如Quil A或其衍生物，包括QS21和QS7(Aquila BiopharmaceuticalsInc.，F(xiàn)ramingham，MA)、七葉皂苷、毛地黃皂苷或Gypsophila或Chenopodium quinoa皂角苷。其它優(yōu)選的制劑包括在本發(fā)明的佐劑組合中的一種以上的皂角苷，例如QS21、QS7、Quil A、β-七葉皂苷或毛地黃皂苷中的至少兩種的組合。
或者，皂角苷制劑也可與疫苗載體組合，這些載體包含殼聚糖或其它聚陽(yáng)離子聚合物、聚交酯和聚交酯-共-乙交酯顆粒、基于聚-N-乙酰葡糖胺的聚合基質(zhì)、由多糖或化學(xué)修飾的多糖組成的顆粒、基于脂質(zhì)體和脂類(lèi)的顆粒、由甘油單酯組成的顆粒等。皂角苷也可在膽固醇存在下配制，以形成顆粒結(jié)構(gòu)如脂質(zhì)體或ISCOM。此外，皂角苷也可與聚氧乙烯醚或酯在非顆粒溶液或懸液中配制，或?yàn)轭w粒結(jié)構(gòu)如少層(paucilamelar)脂質(zhì)體或ISCOM。皂角苷也可與賦形劑(如CarbopolR)配制以提高粘度，或者可以以干粉形式與粉末賦形劑(如乳糖)配制。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，佐劑系統(tǒng)包括單磷酰脂類(lèi)A和皂角苷衍生物的組合，如QS21和3D-MPL佐劑的組合，如WO 96/00153所述，或用膽固醇滅活QS21的低反應(yīng)性組合物，如WO 96/33739所述。其它優(yōu)選制劑含有水包油乳劑和生育酚。在WO 95/17210中描述了在水包油乳劑中應(yīng)用QS21、3D-MPL佐劑和生育酚的一種特別優(yōu)選的佐劑制劑。
另一種增強(qiáng)的佐劑系統(tǒng)包括含CpG寡核苷酸與皂角苷衍生物的組合，特別是WO 00/09159中公開(kāi)的CpG與QS21的組合。優(yōu)選地，該制劑還含有水包油乳劑和生育酚。
用于本發(fā)明的藥物組合物的其它說(shuō)明性佐劑包括Montanide ISA720(Seppic，法國(guó))、SAF(Chiron，加利福尼亞，美國(guó))、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、SBAS系列佐劑(例如SBAS-2或SBAS-4，可獲自SmithKline Beecham，Rixensart，比利時(shí))、Detox(Enhanzyn；Corixa，Hamilton，MT)、RC-529(Corixa，Hamilton，MT)和其它氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸(AGP)，如未決的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)08/853,826和09/074,720所述，其公開(kāi)內(nèi)容在此引用作為參考，和如WO 99/52549A1所述的聚氧乙烯醚佐劑。
其它優(yōu)選佐劑包括通式(I)HO(CH2CH2O)n-A-R的佐劑分子，其中n是1-50，A是一個(gè)鍵或-C(O)-，R是C1-50烷基或苯基C1-50烷基。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括含有通式(I)的聚氧乙烯醚的疫苗制劑，其中n是1-50，優(yōu)選地是4-24，最優(yōu)選地是9；R成分是C1-50，優(yōu)選地是C4-C20烷基，最優(yōu)選地是C12烷基，A是一個(gè)鍵。聚氧乙烯醚的濃度應(yīng)當(dāng)為0.1-20％，優(yōu)選地0.1-10％，最優(yōu)選地0.1-1％。優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-9-硬脂基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂基醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。Merck目錄(第12版條目7717)描述了聚氧乙烯醚，如聚氧乙烯月桂醚。WO 99/52549中描述了這些佐劑分子。
根據(jù)通式(I)的聚氧乙烯醚希望時(shí)可與另一種佐劑組合。例如，優(yōu)選的佐劑組合是優(yōu)選地與如未決的英國(guó)專利申請(qǐng)GB 9820956.2所述的CpG組合。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞(APC)向宿主輸送此處所述的免疫原性組合物，APC如樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和可改造為有效APC的其它細(xì)胞。這些細(xì)胞可以但不是必須遺傳修飾來(lái)提高遞呈抗原的能力，促進(jìn)T細(xì)胞應(yīng)答的激活和/或保持，本身具有抗腫瘤作用，和/或與受體免疫學(xué)相容(即匹配的HLA單體型)。APC一般可從多種生物液體和器官(包括腫瘤和腫瘤周?chē)M織)中分離，可以是自體、異體、同源或異種的細(xì)胞。
本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案使用樹(shù)突細(xì)胞或其祖細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞。樹(shù)突細(xì)胞是十分有效的APC(Banchereau和Steinman，Nature 392245-251，1998)，作為生理佐劑可有效地引發(fā)預(yù)防或治療性抗腫瘤免疫(參見(jiàn)Timmerman和Levy，Ann.Rev.Med.50507-529，1999)。通?？筛鶕?jù)典型形狀(原位星形，在體外可見(jiàn)的明顯的胞質(zhì)突起(樹(shù)突))、高效吸收、加工和遞呈抗原的能力及其激活幼稚T細(xì)胞應(yīng)答的能力鑒定樹(shù)突細(xì)胞。當(dāng)然可以改造樹(shù)突細(xì)胞，使之表達(dá)在體內(nèi)或離體的樹(shù)突細(xì)胞上不常見(jiàn)到的特異性細(xì)胞表面受體或配體，本發(fā)明涉及這些修飾的樹(shù)突細(xì)胞。作為樹(shù)突細(xì)胞的一個(gè)備選方案，在疫苗中可使用分泌的載有囊泡抗原的樹(shù)突細(xì)胞(稱為外來(lái)體)(參見(jiàn)Zitvogel等人，Nature Med.4594-600，1998)。
樹(shù)突細(xì)胞及其祖細(xì)胞可從外周血、骨髓、腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞、腫瘤周?chē)M織浸潤(rùn)細(xì)胞、淋巴結(jié)、脾臟、皮膚、臍帶血或其它任何合適的組織或液體中獲得。例如，通過(guò)向從外周血中收集的單核細(xì)胞的培養(yǎng)物中加入細(xì)胞因子，如GM-CSF、IL-4、IL-13和/或TNFα的組合，樹(shù)突細(xì)胞可以離體分化?；蛘?，通過(guò)向培養(yǎng)基中加入GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40配體、LPS、flt3配體和/或可誘導(dǎo)樹(shù)突細(xì)胞分化、成熟和增殖的其它化合物的組合，從外周血、臍帶血或骨髓中收集的CD34陽(yáng)性細(xì)胞也可分化為樹(shù)突細(xì)胞。
樹(shù)突細(xì)胞常規(guī)分類(lèi)為“未成熟”和“成熟”的細(xì)胞，這是區(qū)別兩種明確表征的表型的一種簡(jiǎn)單方法。然而，這種命名法不應(yīng)被視為排除分化中所有可能的中間階段。未成熟樹(shù)突細(xì)胞被表征為具有高抗原攝取和加工能力的APC，這與Fcγ受體和甘露糖受體的高表達(dá)有關(guān)。成熟表型的特征一般在于這些標(biāo)記的表達(dá)較低，但負(fù)責(zé)T細(xì)胞激活的細(xì)胞表面分子如I類(lèi)和II類(lèi)MHC、粘附分子(例如，CD54和CD11)和共刺激分子(例如CD40、CD80、CD86和4-1BB)高表達(dá)。
通?？梢杂帽景l(fā)明的多核苷酸(或其部分或其它變體)轉(zhuǎn)染APC，使得編碼的多肽或其免疫原性部分在細(xì)胞表面表達(dá)。如此處所述，這種轉(zhuǎn)染可以離體發(fā)生，含有這些轉(zhuǎn)染細(xì)胞的藥物組合物可用于治療目的?；蛘?，也可以向患者施用導(dǎo)向樹(shù)突或其它抗原呈遞細(xì)胞的基因輸送載體，引發(fā)在體內(nèi)發(fā)生的轉(zhuǎn)染。例如，樹(shù)突細(xì)胞的體內(nèi)和離體轉(zhuǎn)染通?？捎帽绢I(lǐng)域周知的任何方法進(jìn)行，如WO 97/24447所述的方法，或Mahvi等人，Immunology and Cell Biology 75456-460，1997所述的基因槍法。樹(shù)突細(xì)胞負(fù)載抗原可如下實(shí)現(xiàn)將樹(shù)突細(xì)胞或祖細(xì)胞與腫瘤多肽、(裸露的或質(zhì)粒載體內(nèi)的)DNA或RNA或與表達(dá)抗原的重組細(xì)菌或病毒(例如，痘苗、禽痘、腺病毒或慢病毒載體)溫育。在負(fù)載前，多肽可與提供T細(xì)胞幫助的免疫配偶體(例如載體分子)共價(jià)結(jié)合?；蛘撸瑯?shù)突細(xì)胞也可以用未結(jié)合的免疫配偶體脈沖單獨(dú)地或在多肽存在下脈沖。
盡管在本發(fā)明的藥物組合物中可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何適當(dāng)載體，但載體的類(lèi)型一般因施用方式而不同?？蔀榱巳魏魏线m的施用方式配制本發(fā)明的組合物，包括，例如，局部、口服、鼻、粘膜、靜脈內(nèi)、顱內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下和肌內(nèi)施用。
這些藥物組合物中使用的載體是生物相容的，也可以是可生物降解的。在某些實(shí)施方案中，該制劑優(yōu)選地引起相對(duì)恒定水平的活性成分釋放。然而在其它實(shí)施方案中，施用后更快的釋放速度可能是希望的。這些組合物的配制為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在這方面有用的說(shuō)明性載體包括聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚丙烯酸酯、乳膠、淀粉、纖維素、葡聚糖等的微粒。其它說(shuō)明性緩釋載體包括超分子生物載體，它含有非脂親水性核心(例如交聯(lián)的多糖或寡糖)，和任選地一個(gè)含有兩親性化合物(如磷脂)的外層(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5,151,254和PCT申請(qǐng)WO 94/20078、WO 94/23701和WO 96/06638)。緩釋制劑中所含的活性成分的量取決于植入部位、釋放速度和預(yù)期的持續(xù)時(shí)間和將要治療或預(yù)防的病情。
在另一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案中，用可生物降解的小球體(例如polylactate polyglycolate)作為本發(fā)明的組合物的載體。例如，美國(guó)專利號(hào)4,897,268；5,075,109；5,928,647；5,811,128；5,820,883；5,853,763；5,814,344；5,407,609和5,942,252中公開(kāi)了合適的可生物降解的小球體。修飾的乙型肝炎核心蛋白載體系統(tǒng)，如WO 99/40934和此處引用的參考文獻(xiàn)所述，也可用于多種用途。另一種說(shuō)明性載體/輸送系統(tǒng)使用一種含有顆粒-蛋白質(zhì)復(fù)合物的載體，如美國(guó)專利號(hào)5,928,647所述，它能在宿主中誘發(fā)I類(lèi)限制的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。
本發(fā)明的藥物組合物通常還含有一種或多種緩沖液(例如，中性緩沖鹽水或磷酸緩沖鹽溶液)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸(如甘氨酸)、抗氧化劑、抑菌劑、螯合劑(如EDTA)或谷胱甘肽、佐劑(如氫氧化鋁)、使制劑相對(duì)于受體血液等滲、低滲或弱高滲的溶質(zhì)、懸浮劑、增稠劑和/或防腐劑?；蛘撸景l(fā)明的組合物也可配制為凍干品。
此處所述的藥物組合物可存在于單劑量或多劑量的容器中，如密封的安瓿或小瓶中。這些容器一般密封，以在使用前保持制劑的無(wú)菌和穩(wěn)定性。制劑通?？少A存為油狀或水狀載體中的懸液、溶液或乳液。此外，藥物組合物也可在凍干條件下貯存，在臨用前只需加入無(wú)菌液體載體。
為了在多種治療方案中使用此處所述的特定組合物，發(fā)展適當(dāng)給藥和治療方案，包括例如口服、腸胃外、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)和肌內(nèi)施用和配制，為本領(lǐng)域眾所周知，為舉例說(shuō)明，其中一些在下面簡(jiǎn)要描述。
在某些用途中，可以通過(guò)口服向動(dòng)物施用此處公開(kāi)的藥物組合物。這樣，這些組合物可以用惰性稀釋劑或可同化的食用載體配制，或者可以包封于硬殼或軟殼的明膠膠囊中，或者可以壓制成片劑，或者可以直接摻入食物中。
活性化合物中甚至可以摻入賦形劑，并以可攝入的片劑、頰含片、錠劑、膠囊、酏劑、懸液、糖漿、薄膜等的形式使用(參見(jiàn)，例如，Mathiowitz等人，Nature 1997 Mar 27；386(6623)410-4；Hwang等人，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1998；15(3)243-84；美國(guó)專利5,641,515；美國(guó)專利5,580,579；美國(guó)專利5,792,451)。片劑、錠劑、丸劑、膠囊等也可含有多種其它成分，例如，粘合劑，如黃蓍樹(shù)膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑，如磷酸二鈣；崩解劑，如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、褐藻酸等；潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂；甜味劑，如可以加入蔗糖、乳糖或糖精，或增香劑，如薄荷、冬青油或櫻桃香料。當(dāng)單位劑型是膠囊時(shí)，除上述材料之外還可含有液體載體。其它不同材料可以是包被或以其它方式修飾劑量單位的物理形式。例如，片劑、丸劑或膠囊可以用紫膠、糖或其兩者包被。當(dāng)然，在制備任何單位劑型中使用的任何材料都應(yīng)當(dāng)是藥物純的，并且所使用的量基本上無(wú)毒。另外，也可以向緩釋制劑中摻入活性化合物。
這些制劑一般含有至少約0.1％的活性化合物或更多，盡管活性成分的百分?jǐn)?shù)肯定會(huì)變化，通常為總制劑重量或體積的約1或2％到約60％或70％或更多。一般按照在給定單位劑量的化合物中獲得適當(dāng)劑量，準(zhǔn)備每種治療上有用的組合物中活性化合物的量。制備這些藥用制劑的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)考慮溶解度、生物利用率、生物半衰期、施用途徑、產(chǎn)品保存期及其它藥理學(xué)因素，因此，多種劑量和治療方案可能是希望的。
對(duì)于經(jīng)口施用，本發(fā)明的組合物還可以與一種或多種賦形劑結(jié)合，為漱口藥、潔齒劑、頰含片、噴口劑或舌下經(jīng)口施用制劑的形式?；蛘撸钚猿煞忠部梢該饺肟诜芤?如含有硼酸鈉、甘油和碳酸氫鉀的溶液)中，或分散于潔齒劑中，或以治療有效的量加入可含有水、粘合劑、研磨劑、增香劑、發(fā)泡劑和濕潤(rùn)劑的組合物中。此外，組合物也可制成可置于舌下或以其它方式溶解于口中的片劑或溶液形式。
在某些情況下，希望經(jīng)腸胃外、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)乃至腹膜內(nèi)施用此處公開(kāi)的藥物組合物。這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知，其中一些例如在美國(guó)專利5,543,158；美國(guó)專利5,641,515和美國(guó)專利5,399,363中進(jìn)一步描述。在某些實(shí)施方案中，活性化合物作為游離堿或藥理學(xué)可接受的鹽的溶液可以在與表面活性劑(如羥丙基纖維素)適當(dāng)混合的水中制備。也可以在甘油、液體聚乙二醇及其混合物和油中制備分散體。在普通貯存和使用條件下，這些制劑通常含有防腐劑防止微生物生長(zhǎng)。
適于注射用的說(shuō)明性藥物形式包括無(wú)菌水溶液或分散體和用于臨時(shí)制備無(wú)菌注射溶液或分散體的無(wú)菌粉末(例如，參見(jiàn)美國(guó)專利5,466,468)。在所有情況中，該形式必須是無(wú)菌的，必須是易注射的液體。在生產(chǎn)和貯存條件下必須穩(wěn)定，必須能防止微生物(如細(xì)菌和真菌)的污染作用。載體可以是溶劑或分散基質(zhì)，例如含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、它們的適當(dāng)混合液和/或植物油。例如，利用包被，如卵磷脂，在分散的情況下保持需要的顆粒大小，和/或利用表面活性劑，可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。利用各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，例如paraben、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，有利于防止微生物的作用。在許多情況中，優(yōu)選地含有等滲劑，如糖或氯化鈉。在組合物中使用延緩吸收的試劑，如單硬脂酸鋁和明膠，能使注射組合物的吸收延長(zhǎng)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于水溶液的腸胃外施用，必要時(shí)溶液應(yīng)當(dāng)適當(dāng)?shù)鼐彌_，首先用足夠的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。這些水溶液特別適用于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)施用。就此而言，根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可了解能夠使用的無(wú)菌水介質(zhì)。例如，一劑量可溶解于1ml等滲NaCl溶液中，并加入1000ml皮下灌注液中或在所述注射部位注射(參見(jiàn)，例如，《Remington藥物學(xué)》第15版，1035-1038和1570-1580頁(yè))。根據(jù)治療的患者病情，必須進(jìn)行劑量上的某些改變。此外，對(duì)于人體施用，制品必須優(yōu)選地滿足FDA生物制劑標(biāo)準(zhǔn)所要求的無(wú)菌、致熱性和一般安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，此處公開(kāi)的組合物可配制為中性或鹽形式。示例性藥學(xué)可接受的鹽包括酸加成鹽(與蛋白質(zhì)的游離氨基形成)，其是與無(wú)機(jī)酸(如鹽酸或磷酸)或有機(jī)酸(如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的。與游離羧基形成的鹽也能來(lái)自于無(wú)機(jī)堿，如氫氧化鈉、鉀、銨、鈣或鐵，和有機(jī)堿，如異丙胺、三甲胺、組胺、普魯卡因等。在配制后，以與劑量制劑相容的方式并以治療有效的量施用該溶液。
載體還能含有任一種和所有溶劑、分散介質(zhì)、載體、包衣、稀釋劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑、緩沖液、載體溶液、懸液、膠體等。這些介質(zhì)和試劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)的應(yīng)用在本領(lǐng)域眾所周知。除了任何常規(guī)介質(zhì)和試劑與活性成分不相容的情況，考慮它在治療組合物中的使用。補(bǔ)充的活性成分也能加入組合物中。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接受的”是指在對(duì)人體施用時(shí)不引起過(guò)敏或類(lèi)似的不利反應(yīng)的分子體和組合物。
在某些實(shí)施方案中，可以通過(guò)鼻內(nèi)噴霧、吸入和/或其它氣溶膠輸送載體施用藥物組合物。例如，美國(guó)專利5,756,353和美國(guó)專利5,804,212中描述了通過(guò)經(jīng)鼻氣溶膠噴霧直接向肺輸送基因、核酸和肽組合物的方法。利用鼻內(nèi)微粒樹(shù)脂(Takenaga等人，J ControlledRelease 1998 Mar 2；52(1-2)81-7)和溶血磷脂酰甘油(美國(guó)專利5,725,871)輸送藥物在制藥領(lǐng)域也是眾所周知的。美國(guó)專利5,780,045也描述了聚四氟乙烯支持基質(zhì)形式的說(shuō)明性穿粘膜藥物輸送。
在某些實(shí)施方案中，利用脂質(zhì)體、納米囊(nanocapsule)、微粒、脂質(zhì)顆粒、囊泡等向合適的宿主細(xì)胞/生物導(dǎo)入本發(fā)明的組合物。特別是，為了輸送可以配制包封于脂質(zhì)顆粒、脂質(zhì)體、囊泡、納米球或納米顆粒等中的本發(fā)明的組合物。此外，本發(fā)明的組合物也能與這類(lèi)載體表面共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合。
脂質(zhì)體和脂質(zhì)體樣制品的形成及作為可能的藥物載體的應(yīng)用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知(參見(jiàn)，例如，Lasic，Trends Biotechnol 1998Jul；16(7)307-21；Takakura，Nippon Rinsho 1998Mar；56(3)691-5；Chandran等人，Indian J Exp Biol.1997Aug；35(8)801-9；Margalit，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.1995；12(2-3)233-61；美國(guó)專利5,567,434；美國(guó)專利5,552,157；美國(guó)專利5,565,213；美國(guó)專利5,738,868和美國(guó)專利5,795,587，均在此引用作為參考)。
脂質(zhì)體已經(jīng)成功地用于通常難以用其它方法轉(zhuǎn)染的大量細(xì)胞類(lèi)型，包括T細(xì)胞懸液、原代肝細(xì)胞培養(yǎng)物和PC 12細(xì)胞(Renneisen等人，J Biol Chem.1990 Sep 25；265(27)16337-42；Muller等人，DNA Cell Biol.1990 Apr；9(3)221-9)。另外，脂質(zhì)體沒(méi)有基于病毒的輸送系統(tǒng)所具有的DNA長(zhǎng)度限制。脂質(zhì)體已經(jīng)有效地用于向多種培養(yǎng)細(xì)胞系和動(dòng)物中導(dǎo)入基因、不同藥物、放療劑、酶、病毒、轉(zhuǎn)錄因子、變構(gòu)效應(yīng)物等。此外，脂質(zhì)體的應(yīng)用似乎與全身施用后的自身免疫反應(yīng)或無(wú)法接受的毒性無(wú)關(guān)。
在某些實(shí)施方案中，由分散于水介質(zhì)中的磷脂形成脂質(zhì)體，并且自發(fā)形成多層同心雙層小泡(也稱為多層小泡(MLV))。
或者，在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的組合物的藥學(xué)可接受的納米囊制劑。納米囊通常能以穩(wěn)定和可重復(fù)的方式包封化合物(參見(jiàn)，例如，Quintanar-Guerrero等人，Drug Dev Ind Pharm.1998Dec；24(12)1113-28)。為了避免胞內(nèi)聚合物過(guò)載引起的副作用，可以利用能在體內(nèi)降解的聚合物設(shè)計(jì)這些超細(xì)顆粒(大小約為0.1μm)。能如Couvreur等人，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.1988；5(1)1-20；zur Muhlen等人，Eur J Pharm Biopharm.1998Mar；45(2)149-55；Zambaux等人，J Controlled Release 1998 Jan2；50(1-3)31-40；和美國(guó)專利5,145,684所述制備這種顆粒。
癌癥治療方法在本發(fā)明的其它方面，此處所述的藥物組合物可用于癌癥的治療，特別是乳腺癌和其它Her-2/neu相關(guān)惡性腫瘤的免疫治療。在這些方法中，對(duì)患者，一般是溫血?jiǎng)游铮瑑?yōu)選地是人，施用此處所述的藥物組合物。患者可患有或未患癌癥。因此，上述藥物組合物可用于防止癌癥的發(fā)展或治療癌癥患者。藥物組合物和疫苗可在手術(shù)切除原發(fā)腫瘤和/或治療(如施以放療或常規(guī)化療藥物)之前或之后施用。如上所述，藥物組合物可以通過(guò)靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、真皮內(nèi)、肛門(mén)、陰道、局部和口服途徑施用。
在某些實(shí)施方案中，免疫治療可以是主動(dòng)免疫治療，其中治療依賴于施用免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(如此處所述的多肽和多核苷酸)體內(nèi)刺激內(nèi)源宿主免疫系統(tǒng)，使之對(duì)腫瘤反應(yīng)。
在其它實(shí)施方案中，免疫治療也可以是被動(dòng)免疫治療，其中治療包括施用具有明確的腫瘤免疫反應(yīng)性的試劑(如效應(yīng)細(xì)胞或抗體)，它們能直接或間接地介導(dǎo)抗腫瘤作用，而不必依賴完整的宿主免疫系統(tǒng)。效應(yīng)細(xì)胞的例子包括如上所述的T細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞(例如CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和CD4+T輔助腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞)、殺傷細(xì)胞(如自然殺傷細(xì)胞和淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞)、B細(xì)胞或和表達(dá)此處所述的多肽的抗原呈遞細(xì)胞(如樹(shù)突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)。可以克隆、表達(dá)對(duì)于此處所述多肽特異的T細(xì)胞受體和抗體受體，并轉(zhuǎn)移到其它載體或效應(yīng)細(xì)胞中，進(jìn)行過(guò)繼免疫治療。也可以利用此處所述的多肽產(chǎn)生抗體或抗獨(dú)特型抗體(如上文及美國(guó)專利號(hào)4,918,164所述)進(jìn)行被動(dòng)免疫治療。
如此處所述，通過(guò)在體外生長(zhǎng)，一般能獲得足以進(jìn)行過(guò)繼免疫治療的效應(yīng)細(xì)胞。使單個(gè)抗原特異性效應(yīng)細(xì)胞擴(kuò)充為幾十億個(gè)而保留體內(nèi)抗原識(shí)別能力的培養(yǎng)條件在本領(lǐng)域中周知。這些體外培養(yǎng)條件一般在細(xì)胞因子(如IL-2)和不分裂的飼養(yǎng)細(xì)胞存在下用抗原斷續(xù)刺激。如上所述，此處所述的免疫反應(yīng)性多肽可用來(lái)快速擴(kuò)充抗原特異性T細(xì)胞培養(yǎng)物，以產(chǎn)生足以進(jìn)行免疫治療的細(xì)胞。特別是，抗原呈遞細(xì)胞，如樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和/或B細(xì)胞，可以利用本領(lǐng)域周知的多種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用免疫反應(yīng)性多肽脈沖，或用一種或多種多核苷酸轉(zhuǎn)染。例如，抗原呈遞細(xì)胞可用一種多核苷酸轉(zhuǎn)染，該多核苷酸含有適于增強(qiáng)在重組病毒或其它表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的啟動(dòng)子。在治療中使用的培養(yǎng)的效應(yīng)細(xì)胞必須能夠生長(zhǎng)且廣泛分布，并能在體內(nèi)長(zhǎng)期存活。研究表明，通過(guò)用補(bǔ)充有IL-2的抗原重復(fù)刺激，能誘導(dǎo)培養(yǎng)的T細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)，并且能大量地長(zhǎng)期存活(參見(jiàn)，例如，Cheever，M.等人，Immunological Reviews 157177，1997)。
或者，也可將表達(dá)此處所述多肽的載體導(dǎo)入取自患者的抗原呈遞細(xì)胞中，并離體無(wú)性繁殖，用于移植回相同患者?？梢岳帽绢I(lǐng)域周知的任何方法將轉(zhuǎn)染細(xì)胞重新導(dǎo)入患者中，優(yōu)選地以無(wú)菌形式通過(guò)靜脈內(nèi)、腔內(nèi)、腹腔內(nèi)或腫瘤內(nèi)施用。
此處所述的治療組合物的施用途徑和頻率以及劑量因個(gè)體而異，可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定。藥物組合物和疫苗通常通過(guò)注射(例如，皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)、鼻內(nèi)(例如吸入)或經(jīng)口施用。優(yōu)選地，可在52周內(nèi)施用1-10次。優(yōu)選地，以1個(gè)月的間隔施用6次，之后可定期進(jìn)行加強(qiáng)接種。備選方法可能適于個(gè)體患者。一種合適的劑量是，當(dāng)如上所述施用時(shí)，能增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答，并且比基礎(chǔ)(即未處理)水平至少高10-50％的化合物的量。這種應(yīng)答可如下監(jiān)測(cè)測(cè)量患者中的抗腫瘤抗體，或能在體外殺傷患者腫瘤細(xì)胞的溶細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞的疫苗依賴的產(chǎn)生。這些疫苗應(yīng)該也能引起免疫應(yīng)答，致使接種患者的臨床后果比未接種患者改善(例如，更頻繁的緩解，完全或部分或更長(zhǎng)的無(wú)病存活)。通常，對(duì)于含有一種或多種多肽的藥物組合物和疫苗，劑量中所含的每種多肽的量約為每kg宿主約25μg至5mg。合適的劑量大小因患者體重而異，但一般為約0.1mL至約5mL。
合適的劑量和治療方案一般提供足以提供治療和/或預(yù)防益處的量的活性化合物。通過(guò)確定治療患者比未治療患者改善的臨床后果(例如，更頻繁的緩解，完全或部分或更長(zhǎng)的無(wú)病存活)，能監(jiān)測(cè)這種反應(yīng)。預(yù)先存在的對(duì)腫瘤蛋白免疫應(yīng)答的增強(qiáng)一般與改善的臨床結(jié)果有關(guān)。這些免疫應(yīng)答一般可用標(biāo)準(zhǔn)增殖、細(xì)胞毒性或細(xì)胞因子測(cè)定法評(píng)價(jià)，這些方法可用治療前和治療后從患者中獲得的樣品進(jìn)行。
癌癥檢測(cè)和診斷組合物、方法和試劑盒另一實(shí)施方案中，可根據(jù)在患者的生物樣品(例如血液、血清、痰、尿和/或腫瘤活檢)中存在一種或多種Her-2/neu蛋白和/或編碼這些蛋白質(zhì)的多核苷酸，檢測(cè)患者的癌癥。換言之，本發(fā)明的多肽和多核苷酸可用作標(biāo)志，表明癌癥的存在與否。此處所述的結(jié)合劑一般允許檢測(cè)生物樣品中可與該試劑結(jié)合的抗原的水平。可以利用多核苷酸引物和探針檢測(cè)編碼腫瘤蛋白的mRNA水平，這也表明癌癥的存在與否。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知多種測(cè)定法，利用結(jié)合劑檢測(cè)樣品中的多肽標(biāo)志。參見(jiàn)，例如，Harlow和Lane，《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1988。患者中癌癥的存在與否通常如下確定(a)將從患者中獲得的生物樣品與結(jié)合劑接觸；(b)檢測(cè)樣品中可與該結(jié)合劑結(jié)合的多肽的水平；(c)將多肽水平與預(yù)定的截?cái)嘀迪啾容^。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該測(cè)定法包括用固定于固體載體上的結(jié)合劑結(jié)合并從剩余的樣品中除去多肽。然后可用一種含有報(bào)道基團(tuán)并可與結(jié)合劑/多肽復(fù)合物特異結(jié)合的檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)合的多肽。這些檢測(cè)試劑可包括，例如，可與該多肽特異結(jié)合的結(jié)合劑，或可與該結(jié)合劑特異結(jié)合的抗體或其它試劑，如抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A或凝集素。或者，也可使用競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法，其中多肽用報(bào)道基團(tuán)標(biāo)記，并在結(jié)合劑與樣品溫育后使之與固定的結(jié)合劑結(jié)合。樣品成分抑制標(biāo)記多肽與結(jié)合劑結(jié)合的程度表明樣品對(duì)固定的結(jié)合劑的反應(yīng)性。固體載體可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的、腫瘤蛋白可以附著的任何材料。例如，固體載體可以是微量板中的檢測(cè)孔，或硝酸纖維素或其它合適的膜。此外，載體也可以是珠或盤(pán)，如玻璃、玻璃纖維、乳膠或塑料材料，如聚苯乙烯或聚氯乙烯。載體也可以是磁粉或光纖傳感器，如美國(guó)專利號(hào)5,359,681所公開(kāi)的。可以利用專利和科學(xué)文獻(xiàn)中詳述的、本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的多種技術(shù)將結(jié)合劑固定于固體載體上。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“固定”是指非共價(jià)結(jié)合如吸附和共價(jià)結(jié)合(可以是試劑與載體上功能基團(tuán)之間的直接連接，或者可以是通過(guò)交聯(lián)劑的連接)。通過(guò)吸附固定于微量板孔或膜上是優(yōu)選的。在這些情況中，可通過(guò)使適當(dāng)緩沖液中的結(jié)合劑與固體載體接觸適當(dāng)時(shí)間實(shí)現(xiàn)這種吸附。接觸時(shí)間因溫度而異，但一般為約1小時(shí)至約1天。塑料微量板孔(如聚苯乙烯或聚氯乙烯)與約10ng至約10μg、優(yōu)選地約100ng至約1μg的結(jié)合劑接觸通常足以固定足量的結(jié)合劑。
結(jié)合劑與固體載體共價(jià)結(jié)合一般可如下實(shí)現(xiàn)首先使載體與可與載體和結(jié)合劑的功能基團(tuán)(如羥基或氨基)反應(yīng)的雙功能試劑反應(yīng)。例如，使用苯醌，或通過(guò)載體上的醛基與結(jié)合配偶體上的氨和活性氫縮合，結(jié)合劑可與帶有適當(dāng)聚合物包被的載體共價(jià)結(jié)合(參見(jiàn)，例如，Pierce免疫技術(shù)目錄和手冊(cè)，1991，A12-A13)。
在某些實(shí)施方案中，測(cè)定法是雙抗體夾心測(cè)定。這種測(cè)定法可如下進(jìn)行首先使固定于固體載體(通常是微量板孔)上的抗體與樣品接觸，使樣品中的多肽與固定的抗體結(jié)合。然后從固定的多肽-抗體復(fù)合物中除去未結(jié)合的樣品，加入含有報(bào)道基團(tuán)的檢測(cè)試劑(優(yōu)選地是能與該多肽上不同部位結(jié)合的第二抗體)。然后利用適于特定報(bào)道基團(tuán)的方法測(cè)定結(jié)合于固體載體上的檢測(cè)試劑的量。
更具體而言，一旦抗體固定于如上所述的載體上，一般就封閉載體上其余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員周知的任何合適的封閉劑，如牛血清白蛋白或吐溫20TM(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。然后使固定的抗體與樣品一起溫育，使多肽與抗體結(jié)合。在溫育前樣品可用合適的稀釋劑如磷酸緩沖液(PBS)稀釋。適當(dāng)?shù)慕佑|時(shí)間(即溫育時(shí)間)一般為足以檢測(cè)到取自乳腺癌患者的樣品中存在多肽的時(shí)間。優(yōu)選地，接觸時(shí)間足以實(shí)現(xiàn)一定水平的結(jié)合，該水平至少為結(jié)合與未結(jié)合多肽之間平衡時(shí)所達(dá)到的95％。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，通過(guò)測(cè)定一段時(shí)間中發(fā)生的結(jié)合水平可輕易地確定達(dá)到平衡所需的時(shí)間。在室溫下，約30分鐘的溫育時(shí)間一般足夠。
然后可利用合適的緩沖液(如含有0.1％吐溫20TM的PBS)洗滌固體載體，去除未結(jié)合的樣品。然后向固體載體上加入含有報(bào)道基團(tuán)的第二抗體。優(yōu)選的報(bào)道基團(tuán)包括以上所述的基團(tuán)。
然后將檢測(cè)試劑與固定的抗體-多肽復(fù)合物溫育，持續(xù)足以檢測(cè)到結(jié)合多肽的一段時(shí)間。適當(dāng)?shù)臅r(shí)間長(zhǎng)度一般可通過(guò)測(cè)定一段時(shí)間中發(fā)生的結(jié)合水平確定。然后去除未結(jié)合的檢測(cè)試劑，并用報(bào)道基團(tuán)檢測(cè)結(jié)合的檢測(cè)試劑。用于檢測(cè)報(bào)道基團(tuán)的方法取決于報(bào)道基團(tuán)的性質(zhì)。對(duì)于放射性基團(tuán)，閃爍計(jì)數(shù)或放射自顯影法一般是合適的。分光法可用來(lái)檢測(cè)染料、發(fā)光基團(tuán)和熒光基團(tuán)。生物素可以用與不同報(bào)道基團(tuán)(通常是放射性或熒光基團(tuán)或酶)偶聯(lián)的親和素檢測(cè)。酶報(bào)道基團(tuán)一般可通過(guò)加入底物(一般經(jīng)過(guò)特定的一段時(shí)間)，隨后對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分光或其它分析來(lái)檢測(cè)。
為了確定癌癥(如乳腺癌)的存在與否，通常將保持與固體載體結(jié)合的報(bào)道基團(tuán)的檢測(cè)信號(hào)與對(duì)應(yīng)于預(yù)定的截?cái)嘀档男盘?hào)相比較。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，檢測(cè)癌癥的截?cái)嘀凳钱?dāng)固定抗體與來(lái)自非癌癥患者的樣品溫育后獲得的平均信號(hào)。通常，產(chǎn)生的信號(hào)比預(yù)定截?cái)嘀蹈呷齻€(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的樣品被認(rèn)為是癌癥陽(yáng)性。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，按照Sackett等人，《臨床流行病學(xué)臨床醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)科學(xué)》，Little Brownand Co.，1985，106-107的方法，用接收工作曲線(Receiver OperaterCurve)確定截?cái)嘀怠：?jiǎn)言之，在該實(shí)施方案中，根據(jù)對(duì)應(yīng)于診斷檢查結(jié)果的每一可能截?cái)嘀档某蓪?duì)真陽(yáng)性率(即敏感度)和假陽(yáng)性率(100％特異性)的圖，可確定截?cái)嘀?。圖上最接近左上角的截?cái)嘀?即，包圍最大面積的值)是最精確的截?cái)嘀?，產(chǎn)生的信號(hào)高于用該方法所確定的截?cái)嘀档臉悠繁徽J(rèn)為是陽(yáng)性。此外，截?cái)嘀狄部裳厍€轉(zhuǎn)移到左側(cè)，使假陽(yáng)性率最低，或移到右側(cè)，使假陰性率最低。產(chǎn)生的信號(hào)高于用該方法確定的截?cái)嘀档臉悠吠ǔ１徽J(rèn)為是癌癥陽(yáng)性。
在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，以流過(guò)(flow-through)或條形試驗(yàn)形式進(jìn)行測(cè)定，其中結(jié)合劑固定于膜(如硝酸纖維素)上。在流過(guò)試驗(yàn)中，當(dāng)樣品通過(guò)膜時(shí)，樣品中的多肽與固定的結(jié)合劑結(jié)合。然后當(dāng)含有第二結(jié)合劑的溶液流經(jīng)該膜時(shí)，標(biāo)記的第二結(jié)合劑與結(jié)合劑-多肽復(fù)合物結(jié)合。然后可如上所述對(duì)結(jié)合的第二結(jié)合劑進(jìn)行檢測(cè)。在條形試驗(yàn)中，與結(jié)合劑結(jié)合的膜的一端浸于含有樣品的溶液中。樣品沿膜遷移，通過(guò)含有第二結(jié)合劑的區(qū)域到達(dá)固定結(jié)合劑的區(qū)域。固定抗體區(qū)域中第二結(jié)合劑的濃度表明癌癥的存在。一般而言，該部位中第二結(jié)合劑的濃度產(chǎn)生一種可目測(cè)的模式，如一條線。沒(méi)有這種模式表明為陰性結(jié)果。一般選擇固定于膜上的結(jié)合劑的量，使得當(dāng)生物樣品含有足以在上述形式的雙抗體夾心測(cè)定中產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)的多肽水平時(shí)，能產(chǎn)生可目視辨別的模式。在這些測(cè)定中使用的優(yōu)選結(jié)合劑是抗體及其抗原結(jié)合片段。優(yōu)選地，固定于膜上的抗體的量約25ng至約1μg，更優(yōu)選地約50ng至約500ng。這些試驗(yàn)一般可用極少量的生物樣品進(jìn)行。
當(dāng)然，存在大量其它測(cè)定方法適用于本發(fā)明的腫瘤蛋白或結(jié)合劑。以上敘述只是旨在舉例。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，可容易地修改上述方法，利用腫瘤多肽檢測(cè)生物樣品中可與這些多肽結(jié)合的抗體。這些腫瘤蛋白特異性抗體的檢測(cè)可能與癌癥的存在有關(guān)。
也可或作為替代方案根據(jù)生物樣品中存在與腫瘤蛋白特異反應(yīng)的T細(xì)胞檢測(cè)癌癥。在某些方法中，從患者中分離的含有CD4+和/或CD8+T細(xì)胞的生物樣品與腫瘤多肽、編碼該多肽的多核苷酸和/或表達(dá)該多肽的至少免疫原性部分的APC溫育，檢測(cè)是否存在T細(xì)胞的特異激活。合適的生物樣品包括但不限于分離的T細(xì)胞。例如，可用常規(guī)技術(shù)(如Ficoll/Hypaque密度梯度離心外周血淋巴細(xì)胞)從患者中分離T細(xì)胞。T細(xì)胞可在37℃下與多肽(例如5-25μg/ml)體外溫育2-9天(典型4天)。在不含Her-2/neu多肽的情況下溫育另一等份T細(xì)胞樣品，作為對(duì)照。對(duì)于CD4+T細(xì)胞，優(yōu)選地通過(guò)評(píng)價(jià)T細(xì)胞增殖檢測(cè)其激活。對(duì)于CD8+T細(xì)胞，優(yōu)選地通過(guò)評(píng)價(jià)溶細(xì)胞活性檢測(cè)其激活。增殖水平比無(wú)病患者至少高2倍和/或溶細(xì)胞活性至少高20％表明患者患有癌癥。
如上所述，也可或備選地根據(jù)生物樣品中編碼腫瘤蛋白的mRNA水平檢測(cè)癌癥。例如，在基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的測(cè)定中可利用至少兩條寡核苷酸引物擴(kuò)增來(lái)源于生物樣品的腫瘤cDNA的一部分，其中至少一條寡核酸引物對(duì)于編碼腫瘤蛋白的多核苷酸特異(即，可與之雜交)。然后用本領(lǐng)域周知的技術(shù)(如凝膠電泳)分離并檢測(cè)擴(kuò)增的cDNA。類(lèi)似地，在雜交測(cè)定中可以利用可與編碼腫瘤蛋白的多核苷酸特異雜交的寡核苷酸探針檢測(cè)生物樣品中是否存在編碼該腫瘤蛋白的多核苷酸。
為了可在測(cè)定條件下雜交，寡核苷酸引物和探針應(yīng)當(dāng)含有一種寡核苷酸序列，該序列與編碼本發(fā)明的腫瘤蛋白的多核苷酸的一部分(長(zhǎng)度至少為10個(gè)核苷酸，優(yōu)選地至少20個(gè)核苷酸)有至少約60％、優(yōu)選地至少約75％、更優(yōu)選地至少約90％的一致性。優(yōu)選地，在如上所述的中度嚴(yán)緊條件下，寡核苷酸引物和/或探針可與編碼此處所述多肽的多核苷酸雜交。在此處所述的診斷方法中有用的寡核苷酸引物和/或探針長(zhǎng)度優(yōu)選地為至少10-40個(gè)核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸引物含有具有此處公開(kāi)序列的DNA分子的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸，更優(yōu)選地至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。基于PCR的測(cè)定和雜交測(cè)定技術(shù)在本領(lǐng)域周知(參見(jiàn)，例如Mullis等人，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51263，1987；Erlich編寫(xiě)，《PCR技術(shù)》，Stockton出版社，NY，1989)。
一種優(yōu)選的測(cè)定使用RT-PCR，其中PCR與反轉(zhuǎn)錄聯(lián)合使用。一般從生物樣品(如活檢組織)中提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA分子。應(yīng)用至少一條特異引物的PCR擴(kuò)增將產(chǎn)生cDNA分子，它可利用如凝膠電泳分離并顯示?？梢詫?duì)來(lái)自受試患者和未患癌癥的患者的生物樣品進(jìn)行擴(kuò)增?？梢詫?duì)橫跨兩個(gè)數(shù)量級(jí)的幾個(gè)稀釋度的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。受試患者樣品的幾個(gè)稀釋度中的表達(dá)比非癌樣品相同稀釋度中的表達(dá)高兩倍或以上一般認(rèn)為是陽(yáng)性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，此處所述的組合物可用作癌癥進(jìn)展的標(biāo)志。在該實(shí)施方案中，如上所述用于癌癥診斷的測(cè)定可以在一段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，并評(píng)價(jià)反應(yīng)性多肽或多核苷酸水平的改變。例如，可以在6個(gè)月到1年時(shí)間內(nèi)，每24-72小時(shí)進(jìn)行測(cè)定，之后在需要時(shí)進(jìn)行。在檢測(cè)到多肽或多核苷酸水平隨時(shí)間推移而提高的患者中，癌癥通常發(fā)展。相反，當(dāng)反應(yīng)性多肽或多核苷酸水平經(jīng)一段時(shí)間仍恒定或降低時(shí)，癌癥未發(fā)展。
可直接對(duì)腫瘤進(jìn)行某些體內(nèi)診斷測(cè)定。一種這樣的測(cè)定包括使腫瘤細(xì)胞接觸結(jié)合劑。然后可通過(guò)報(bào)道基團(tuán)直接或間接檢測(cè)結(jié)合的結(jié)合劑。這類(lèi)結(jié)合劑也可用于組織學(xué)用途。或者，在這些用途中也可使用多核苷酸探針。
如上所述，為了提高靈敏度，可以測(cè)定一種給定樣品中的多種腫瘤蛋白標(biāo)志。顯然，在一種測(cè)定中可以組合使用對(duì)于此處所述不同蛋白質(zhì)特異的多種結(jié)合劑。而且，可以同時(shí)使用多種引物或探針。腫瘤蛋白標(biāo)志的選擇可基于確定產(chǎn)生最佳靈敏度的組合的常規(guī)實(shí)驗(yàn)。另外，或作為備選方案，測(cè)定此處所述的腫瘤蛋白可與測(cè)定其它已知腫瘤抗原相結(jié)合。
本發(fā)明還提供可在上述任何診斷方法中使用的試劑盒。這些試劑盒一般含有兩種或多種進(jìn)行診斷測(cè)定所必需的成分。這些成分可以是化合物、試劑、容器和/或裝置。例如，試劑盒中的一個(gè)容器可含有一種可與腫瘤蛋白特異結(jié)合的單克隆抗體或其片段。這些抗體或片段可以如上所述與支持材料結(jié)合。另外一個(gè)或多個(gè)容器可包封將在測(cè)定中使用的成分，如試劑或緩沖液。這些試劑盒也可作為備選方案含有如上所述的檢測(cè)試劑，該試劑含有適于直接或間接檢測(cè)抗體結(jié)合的報(bào)道基團(tuán)。
或者，可設(shè)計(jì)試劑盒用來(lái)檢測(cè)生物樣品中編碼腫瘤蛋白的mRNA的水平。這些試劑盒一般含有至少一種如上所述的寡核苷酸探針或引物，它可與編碼腫瘤蛋白的多核苷酸雜交。這種寡核苷酸例如可在PCR或雜交測(cè)定中使用。這些試劑盒內(nèi)可能含有的其它成分包括第二種寡核苷酸和/或診斷試劑或容器，以利于檢測(cè)編碼腫瘤蛋白的多核苷酸。
下列實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明，絕非意在限制。
實(shí)施例實(shí)施例1使用重組腺病毒感染的樹(shù)突細(xì)胞致敏Her-2/neu特異性CD8+T細(xì)胞構(gòu)建缺失EIA并與Her-2/neu的細(xì)胞內(nèi)域(ICD；SEQ ID NO1的大約第2026-3765位核苷酸)重組的腺病毒(AdV)載體，將其用于感染從健康供體獲得的樹(shù)突細(xì)胞(DC)。最初的致敏培養(yǎng)物含有AdV-ICD感染的DC作為刺激物及自體PBMC作為應(yīng)答者。在第一次重復(fù)刺激之前，富集培養(yǎng)物中的CD8+細(xì)胞，然后用AdV-ICD感染的DC再刺激此CD8+富集群體。隨后的再刺激在用ICD重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的自體成纖維細(xì)胞上進(jìn)行。第4次體外刺激后，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的4小時(shí)51Cr釋放試驗(yàn)檢測(cè)所獲T細(xì)胞系的ICD特異性CTL活性。如圖1所示，粗T細(xì)胞系含有ICD特異性活性，因?yàn)樵摷?xì)胞系裂解痘苗-ICD感染的自體B-LCL但不裂解痘苗-EGFP感染的C-LCL或未感染的B-LCL靶標(biāo)。圖1中各數(shù)據(jù)點(diǎn)是3次測(cè)量的平均值。
再經(jīng)過(guò)兩次刺激之后，測(cè)試T細(xì)胞系響應(yīng)表達(dá)ICD的自體成纖維細(xì)胞而分泌γ-IFN的能力。γ-IFN ELISPOT分析使用應(yīng)答者ICD致敏的CD8+T細(xì)胞系針對(duì)ICD或EGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的自體成纖維細(xì)胞進(jìn)行。在該分析中，按一式三份，每孔接種2×103個(gè)成纖維細(xì)胞刺激物和2×104個(gè)應(yīng)答T細(xì)胞。對(duì)于三份重復(fù)孔，ICD成纖維細(xì)胞的平均Elispot數(shù)目為344，而EGFP成纖維細(xì)胞的平均Elispot數(shù)目為22。由此，證實(shí)該T細(xì)胞系有ICD特異性-γ-IFN分泌。
為了研究該CD8+ICD特異性T細(xì)胞系的I類(lèi)限制，使用特異針對(duì)各種I類(lèi)分子的抗體進(jìn)行抗體阻斷實(shí)驗(yàn)。刺激物與單克隆抗體W6/32(HLA-A，-B和-C反應(yīng)性的)、單克隆抗體BB123.2(HLA-B和-C反應(yīng)性的)或單克隆抗體BB7.2(HLA-A2特異的)一起預(yù)孵育。使用標(biāo)準(zhǔn)過(guò)夜γ-IFN Elispot試驗(yàn)測(cè)定T細(xì)胞應(yīng)答。應(yīng)答細(xì)胞是體外培養(yǎng)7個(gè)刺激循環(huán)后的ICD特異性CTL細(xì)胞系，每孔使用15,000個(gè)細(xì)胞。刺激物是用ICD或EGFP通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的自體成纖維細(xì)胞，每孔使用2,000個(gè)細(xì)胞。刺激物和所指明的mAb(50μg/ml)一起孵育20分鐘，之后加入到試驗(yàn)中。一式三份地進(jìn)行該試驗(yàn)。
如表2所示，刺激細(xì)胞和W6/32或BB123.2抗體一起孵育完全阻斷了對(duì)ICD轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的識(shí)別，而與BB7.2一起孵育對(duì)γ-IFN的分泌沒(méi)有影響。這些結(jié)果說(shuō)明，ICD特異性活性受HLA-B或-C等位基因的限制。
表2I類(lèi)HLA抗體對(duì)ICD特異性γ-IFN分泌的阻斷

擴(kuò)增從該粗細(xì)胞系分離的ICD特異性克隆，并進(jìn)一步表征其識(shí)別全長(zhǎng)Her-2/neu的能力。此外，使用I類(lèi)HLA特異的單克隆抗體檢測(cè)該克隆的HLA限制。該實(shí)驗(yàn)是標(biāo)準(zhǔn)過(guò)夜γ-IFN Elispot試驗(yàn)。應(yīng)答細(xì)胞是ICD特異性T細(xì)胞克隆17D5。刺激物是未轉(zhuǎn)導(dǎo)的或通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)了EGFP、ICD或全長(zhǎng)Her-2/neu(H2N)的自體成纖維細(xì)胞。每孔使用10,000個(gè)17D5細(xì)胞和10,000個(gè)刺激細(xì)胞。在該實(shí)驗(yàn)中以25μg/ml使用抗體。試驗(yàn)按一式三份進(jìn)行，標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)于三次重復(fù)試驗(yàn)為0至±18。
如表3所示，該克隆特異地識(shí)別ICD或全長(zhǎng)Her-2/neu轉(zhuǎn)導(dǎo)的自體成纖維細(xì)胞，但不識(shí)別未轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細(xì)胞和無(wú)關(guān)抗原EGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細(xì)胞。而且，該反應(yīng)性被加入的泛I類(lèi)HLA單克隆抗體w6/32和特異針對(duì)HLA-B和-C等位基因的單克隆抗體(BB123.2)完全阻斷，但不被HLA-A2特異性抗體(BB7.2)阻斷。這些結(jié)果說(shuō)明，此Her-2/neu特異性克隆是HLA-B或-C等位基因限制性的，在該克隆來(lái)源的粗細(xì)胞系中也觀察到同樣的HLA限制方式。
進(jìn)一步的分析說(shuō)明，該應(yīng)答是HLA-B4402限制性的。這些分析通過(guò)測(cè)試克隆17D5對(duì)一組同種異體成纖維細(xì)胞的識(shí)別能力來(lái)實(shí)施，該組細(xì)胞在不同的HLA-B和-C等位基因上匹配并感染了AdV-ICD或AdV-EGFP。使用轉(zhuǎn)導(dǎo)了重組逆轉(zhuǎn)錄病毒或感染了重組AdV的自體成纖維細(xì)胞作為對(duì)照。
表3用γ-IFN Elispot試驗(yàn)測(cè)定ICD特異性克隆17DS的Her-2/neu反應(yīng)性的HLA限制

我們測(cè)試了Her-2/neu特異性克隆對(duì)表達(dá)Her-2/neu的人腫瘤細(xì)胞的識(shí)別能力。乳腺癌細(xì)胞系MCF-7天然在細(xì)胞表面表達(dá)低水平的Her-2/neu，也表達(dá)HLA-b4402。用Her-2/neu的逆轉(zhuǎn)錄病毒重組體轉(zhuǎn)導(dǎo)MCF-7時(shí)，在用Her-2/neu特異性單克隆抗體染色后使用流式細(xì)胞術(shù)分析進(jìn)行測(cè)定，表面Her-2/neu水平增加大約5倍。用AdV-Her-2/neu感染MCF-7細(xì)胞導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞表面的Her-2/neu增加20倍。這些結(jié)果顯示在圖2中。
該T細(xì)胞克隆響應(yīng)感染了編碼Her-2/neu的腺病毒的MCF-7細(xì)胞分泌γ-IFN。然而，該克隆看來(lái)不識(shí)別MCF-7細(xì)胞或轉(zhuǎn)導(dǎo)了表達(dá)Her-2/neu的逆轉(zhuǎn)錄病毒的MCF-7細(xì)胞。由于該克隆確實(shí)能夠識(shí)別ICD或Her-2/neu轉(zhuǎn)導(dǎo)的人成纖維細(xì)胞，而且由于該轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細(xì)胞與轉(zhuǎn)導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞表達(dá)相似水平的蛋白質(zhì)，所以此結(jié)果不可能僅是由抗原表達(dá)水平造成。
實(shí)施例2鑒定Her-2/neu的HLA-B44限制性天然加工表位本實(shí)施例描述了可被上述一個(gè)T細(xì)胞克隆17D5識(shí)別的表位的表征。該克隆識(shí)別表達(dá)ICD或全長(zhǎng)Her-2/neu蛋白質(zhì)的APC。我們使用在各種HLA等位基因上和該T細(xì)胞克隆匹配的一組同種異體細(xì)胞作為APC在γ干擾素Elispot試驗(yàn)中確定了該克隆的HLA限制元件是HLA-B4402。這被采用B4402重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)HLA-B44陰性、Her-2/neu陽(yáng)性APC可賦予識(shí)別所證實(shí)。使用表達(dá)一系列5個(gè)ICD片斷的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)B44+APC，縮小了該克隆識(shí)別的ICD區(qū)域。該克隆對(duì)其中兩個(gè)片斷的識(shí)別(通過(guò)γ干擾素釋放所測(cè)定的)說(shuō)明，該表位包含在Her-2/neu序列第975位開(kāi)始的235個(gè)氨基酸的片斷中。從此片斷中選擇預(yù)測(cè)與B44結(jié)合的9肽和11肽，并進(jìn)行合成。合成的13個(gè)肽中，一個(gè)被該克隆識(shí)別，被確定為該表位。這已通過(guò)γ干擾素釋放和TNF-α釋放試驗(yàn)得到證實(shí)。此天然加工的Her-2/neu表位的序列是EEYLVPQQGF(SEQ ID NO3)，位于Her-2/neu蛋白質(zhì)序列的第1021-1030位。
實(shí)施例3接種Her-2/neu DNA和多肽可抑制表達(dá)Her-2/neu的腫瘤的生長(zhǎng)材料和方法動(dòng)物8-12周齡雌性C57B1/6小鼠，獲自Charles RiverLaboratories(Wilmington，MA)，飼喂在Corixa公司的動(dòng)物房中。
抗體和試劑從ATCC獲得大鼠抗鼠CD4(GK1.5)和大鼠抗鼠CD8(2.43)雜交瘤細(xì)胞系。從腹水中純化出抗體?？谷薍er-2/neu ECD特異性抗體Ab-5購(gòu)自O(shè)ncogene Research Products(Cambrige，MA)。Montanide 720購(gòu)自Seppic公司(Fairfield，NJ)。
腫瘤細(xì)胞系從ATCC獲得最初來(lái)源于C57BL小鼠的小鼠胸腺瘤EL4。用全長(zhǎng)人Her-2/neu，使用標(biāo)準(zhǔn)電穿孔操作轉(zhuǎn)染EL4細(xì)胞。體外使用新霉素進(jìn)行藥物篩選后，獲得穩(wěn)定地表達(dá)Her-2/neu的EL4細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析驗(yàn)證Her-2/neu的表達(dá)。
Her-2/neu疫苗Her-2/neu質(zhì)粒DNA疫苗(pVR1012-Her-2/neu)由插入VR102(Vical，San Diego，CA)中的全長(zhǎng)人Her-2/neu cDNA組成。ECD質(zhì)粒DNA疫苗(pVR1012-ICD)由編碼Her-2/neu氨基酸第1-695位的DNA組成，而ICD質(zhì)粒DNA疫苗(pVR1012-ECD)由VR1012中的編碼氨基酸第692-1256位的DNA組成。使用Qiagen公司(Valencia，CA)試劑盒的試劑和標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備大量無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA。通過(guò)肌內(nèi)途徑在第0天(d0)和第21天(d21)遞送質(zhì)粒DNA疫苗(100μg)。ICD(氨基酸第676-1256位)和ECD(氨基酸第22-653位)重組亞單位蛋白由Corxia公司生產(chǎn)。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染L細(xì)胞并聯(lián)合使用DEAE、反向HPLC和Mono S柱色譜進(jìn)行純化，產(chǎn)生ECD蛋白質(zhì)。ICD蛋白質(zhì)在大腸桿菌中產(chǎn)生并通過(guò)High Q陰離子交換層析及隨后的鎳樹(shù)脂親和層析從溶解的包含體中純化出來(lái)。將重組蛋白質(zhì)疫苗和Montandie 720以7∶2(Montanide 720∶蛋白質(zhì))比例混合后進(jìn)行皮下遞送。
體內(nèi)腫瘤模型為了確保用于腫瘤保護(hù)實(shí)驗(yàn)的EL4-Her-2/neu細(xì)胞的一致來(lái)源，通過(guò)體內(nèi)傳代(腹膜內(nèi))擴(kuò)增細(xì)胞并等分冷凍以便在各個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用。使用200,000個(gè)EL4-Her-2/neu細(xì)胞皮下注射在脅腹處，以建立腫瘤。典型地，在注射的第8-10天內(nèi)形成可觸知的腫瘤。腫瘤大小以千分尺測(cè)量的腫瘤面積(長(zhǎng)度×寬度)表示為mm2。
體內(nèi)耗竭效應(yīng)T細(xì)胞用質(zhì)粒DNA或蛋白質(zhì)在第0和21天免疫小鼠以產(chǎn)生效應(yīng)T細(xì)胞。通過(guò)在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第35、38和42天腹膜內(nèi)施用100μg/天的純化抗CD4或抗CD8抗體，耗竭CD4和CD8細(xì)胞。對(duì)耗竭的脾細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析說(shuō)明，耗竭了98％以上的靶群體。
過(guò)繼轉(zhuǎn)移免疫血清從Her-2/neu質(zhì)粒DNA或ICD蛋白質(zhì)免疫的小鼠采血，獲得免疫血清。匯合每一組的12只不同小鼠的血清，將其轉(zhuǎn)移(靜脈內(nèi))給6只受體幼稚小鼠。血清轉(zhuǎn)移前通過(guò)ELISA評(píng)價(jià)了免疫血清的抗Her-2/neu抗體效價(jià)。
體外細(xì)胞因子分析用100μg pVR1012或pVR1012-Her-2/neu(肌內(nèi)，i.m.)或Montanide中的50μg ICD蛋白質(zhì)(s.q.)或單純的Montanide在d0和d21天免疫小鼠(4只/組)。第二次免疫后2周，收獲2.5×105個(gè)脾細(xì)胞并體外用單純的培養(yǎng)基、ICD或ECD蛋白質(zhì)(10μg/ml)進(jìn)行刺激。通過(guò)ELISA分析體外刺激后48小時(shí)分泌至上清液中的IFNγ。數(shù)值為4只小鼠三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)孔的平均值。
結(jié)果Her-2/neu蛋白質(zhì)亞單位和質(zhì)粒DNA疫苗介導(dǎo)腫瘤保護(hù)評(píng)價(jià)由全長(zhǎng)或截短形式的Her-2/neu構(gòu)成的Her-2/neu疫苗引起抵抗表達(dá)Her-2/neu的同基因腫瘤細(xì)胞系的保護(hù)性免疫應(yīng)答的能力。用編碼全長(zhǎng)人Her-2/neu、Her-2/neu的ICD或ECD部分的質(zhì)粒DNA免疫C57B1/6小鼠。兩次DNA免疫后，用轉(zhuǎn)染了全長(zhǎng)人Her-2/neu的EL4細(xì)胞(EL4-Her-2/neu)皮下攻擊小鼠，并監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)。在幼稚( )小鼠中，EL4-Her-2/neu細(xì)胞在皮下施用的14至20天內(nèi)形成巨大的實(shí)體瘤。用Her-2/neu質(zhì)粒DNA(全長(zhǎng)、ICD或ECD亞單位)接種基本上抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖3)。大多數(shù)小鼠完全避免了腫瘤的產(chǎn)生，而小部分動(dòng)物表現(xiàn)出腫瘤攻擊后多達(dá)3周的腫瘤發(fā)生延遲。有趣的是我們注意到，用截短和全長(zhǎng)Her-2/neu構(gòu)建體得到相似水平的腫瘤保護(hù)。
為了確定蛋白質(zhì)亞單位疫苗是否也可有效地引起腫瘤保護(hù)，用ICD或ECD蛋白質(zhì)加上佐劑免疫小鼠，用EL4-Her-2/neu攻擊，然后監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)。結(jié)果顯示在圖4中，這些結(jié)果說(shuō)明用ICD蛋白質(zhì)接種可引起部分保護(hù)性免疫應(yīng)答，其中小鼠產(chǎn)生腫瘤的頻率和攜帶腫瘤的小鼠的腫瘤平均大小均降低。在這個(gè)典型實(shí)驗(yàn)中，ICD接種導(dǎo)致一只動(dòng)物得到完全的保護(hù)，而且出現(xiàn)腫瘤的小鼠的腫瘤平均大小降低(在d23天為162mm2)。這是與幼稚組的4/4小鼠(腫瘤平均大小527mm2)和接種ECD的組的4/4小鼠(腫瘤平均大小462mm2)的腫瘤生長(zhǎng)比較而言的。
出乎意料的是，與接種Her-2/neu DNA相比，接種蛋白質(zhì)明顯沒(méi)有接種DNA有效。
為了確定在此模型中觀察到的保護(hù)作用是否是Her-2/neu特異的，用全長(zhǎng)Her-2/neu或載體對(duì)照質(zhì)粒DNA接種小鼠，隨后用親本EL4或EL4-Her-2/neu細(xì)胞進(jìn)行攻擊。在接下來(lái)的10至25天監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明，僅在用Her-2/neu質(zhì)粒DNA免疫的小鼠中腫瘤生長(zhǎng)被抑制，這提示，引起了針對(duì)Her-2/neu的免疫而且該免疫是保護(hù)作用所必需的。以下觀察提供了有關(guān)腫瘤保護(hù)是Her-2/neu特異性的進(jìn)一步的證據(jù)，即用Her-2/neu質(zhì)粒DNA接種不能阻止親代EL4細(xì)胞的生長(zhǎng)。在使用ICD蛋白質(zhì)作為疫苗時(shí)也觀察到了類(lèi)似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。綜合起來(lái)，這些結(jié)果說(shuō)明，Her-2/neu疫苗介導(dǎo)的腫瘤保護(hù)是Her-2/neu特異的。
Her-2/neu蛋白亞單位或質(zhì)粒DNA疫苗介導(dǎo)的腫瘤保護(hù)的機(jī)制為了確定接種Her-2/neu質(zhì)粒DNA或蛋白質(zhì)時(shí)負(fù)責(zé)介導(dǎo)腫瘤保護(hù)的免疫應(yīng)答的性質(zhì)，我們接下來(lái)進(jìn)行了一系列體內(nèi)耗竭和過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。最初的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用于評(píng)價(jià)CD4和CD8效應(yīng)T細(xì)胞的各自作用。用全長(zhǎng)Her-2/neu或?qū)φ召|(zhì)粒DNA免疫小鼠兩次。第二次免疫后2周，用抗CD4或抗CD8抗體體內(nèi)處理小鼠以耗竭效應(yīng)T細(xì)胞。經(jīng)過(guò)7天內(nèi)3次施用抗體后達(dá)到98％以上的CD4或CD8脾T細(xì)胞耗竭。3天后，用EL4-Her-2/neu攻擊小鼠，并監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)。與圖1所示前面實(shí)驗(yàn)一致，在用Her-2/neu質(zhì)粒DNA(未處理組)接種的小鼠中觀察到完全的腫瘤保護(hù)。相反，體內(nèi)耗竭CD4但不耗竭CD8效應(yīng)T細(xì)胞的情況下，Her-2/neu DNA疫苗接種介導(dǎo)的腫瘤保護(hù)作用完全喪失。在過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中得到了相似的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)中觀察到過(guò)繼轉(zhuǎn)移CD8而非CD4耗竭的效應(yīng)T細(xì)胞賦予了對(duì)腫瘤攻擊的保護(hù)作用(數(shù)據(jù)未顯示)。總之，這些結(jié)果提示，該系統(tǒng)中接種質(zhì)粒DNA所介導(dǎo)的保護(hù)作用依賴于CD4而非CD8效應(yīng)T細(xì)胞的存在。
我們?cè)谑褂肐CD蛋白質(zhì)接種后進(jìn)行了相似的實(shí)驗(yàn)，以確定CD4和CD8 T細(xì)胞在該疫苗引起的免疫應(yīng)答中的作用。再次，用佐劑中的ICD蛋白質(zhì)免疫并加強(qiáng)免疫小鼠，通過(guò)體內(nèi)抗體處理耗竭CD4和CD8效應(yīng)T細(xì)胞，并隨后用EL4-Her-2/neu進(jìn)行攻擊。結(jié)果揭示，CD4或CD8 T細(xì)胞的耗竭均會(huì)造成用ICD接種獲得的保護(hù)作用部分喪失，這提示CD4和CD8效應(yīng)T細(xì)胞均在ICD蛋白質(zhì)介導(dǎo)的腫瘤保護(hù)作用中起作用。過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也指出，CD4和CD8效應(yīng)T細(xì)胞在ICD蛋白質(zhì)接種引起的免疫應(yīng)答中均是重要的(數(shù)據(jù)未顯示)。
由于已知抗Her-2/neu抗體可以表現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗增殖作用，我們研究了質(zhì)粒DNA或蛋白質(zhì)接種引起的抗體是否對(duì)所觀察到的保護(hù)作用有貢獻(xiàn)。為了回答此問(wèn)題，用全長(zhǎng)Her-2/neu DNA或ICD蛋白質(zhì)免疫和加強(qiáng)免疫小鼠。收集Her-2/neu免疫小鼠的血清或未免疫小鼠的對(duì)照血清，然后將其轉(zhuǎn)移至幼稚小鼠中，之后用EL4-Her-2/neu攻擊幼稚小鼠。從Her-2/neu DNA免疫血清得到的結(jié)果指出，抗體的轉(zhuǎn)移并沒(méi)有賦予保護(hù)作用。在用質(zhì)粒DNA接種獲得的抗Her-2/neu抗體水平十分低的情況下(數(shù)據(jù)未顯示)，這些結(jié)果在某種程度上是可預(yù)見(jiàn)的。類(lèi)似地，盡管在含有抗ICD抗體的血清中存在相當(dāng)大效價(jià)(10,000-100,000)的抗ICD抗體，轉(zhuǎn)移該血清也不具有保護(hù)性。綜合起來(lái)，這些結(jié)果提示，在使用EL4-Her-2/neu腫瘤細(xì)胞的此模型中所觀察到的保護(hù)作用并非是由抗體介導(dǎo)的。
這些體內(nèi)耗竭和過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說(shuō)明，在此模型中CD4+T細(xì)胞在引起保護(hù)性抗腫瘤免疫應(yīng)答中起著主要作用。為了更全面的闡明CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)保護(hù)作用的機(jī)制，我們檢測(cè)了用Her-2/neu DNA或ICD蛋白接種后T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌譜。結(jié)果總結(jié)在下表中，這些結(jié)果表明了用重組ICD或ECD蛋白質(zhì)體外重復(fù)刺激時(shí)，來(lái)自Her-2/neu質(zhì)粒DNA接種的小鼠的脾細(xì)胞與未刺激細(xì)胞相比分泌相當(dāng)高水平的IFNγ。來(lái)自接種ICD蛋白質(zhì)的小鼠的脾細(xì)胞也響應(yīng)體外ICD刺激但不響應(yīng)ECD蛋白質(zhì)刺激產(chǎn)生IFNγ。這些相同培養(yǎng)物中的IL-4和IL-5水平在檢測(cè)水平之下，這與Th1型免疫應(yīng)答相符。綜合起來(lái)，這些結(jié)果提示，在該模型中IFNγ可能在Her-2/neu疫苗介導(dǎo)的保護(hù)作用中起作用。
表4接種Her-2/neu DNA或蛋白質(zhì)后IFNγ的產(chǎn)生

a用Montanide中的100μg pVR1012或VR1012-Her-2/neu(肌內(nèi))或50μg ICD蛋白質(zhì)(s.q.)或單純的Montanide在d0和d21免疫小鼠(4只/組)。
b第二次免疫后兩周，收獲脾細(xì)胞并體外用單純培養(yǎng)基、ICD或ECD蛋白質(zhì)(10μg/ml)刺激。
c體外刺激后48小時(shí)通過(guò)ELISA測(cè)定IFNγ分泌。數(shù)值是4只小鼠的三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)孔的平均值。
實(shí)施例4Her-2/neu特異性的T細(xì)胞克隆可識(shí)別人腫瘤細(xì)胞按實(shí)施例1所述，通過(guò)用感染了Her-2/neu ICD的腺病毒重組體的自體樹(shù)突細(xì)胞體外致敏，得到對(duì)Her-2/neu具有特異性的T細(xì)胞克隆。為確定該T細(xì)胞克隆識(shí)別內(nèi)源性表達(dá)Her-2/neu的人腫瘤的能力，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。
人腫瘤細(xì)胞系SKBR3(胸腺癌)和SKOV3(卵巢癌)均過(guò)量表達(dá)Her-2/neu。人腫瘤細(xì)胞系HCT-116(結(jié)腸癌)和MCF-7(胸腺癌)表達(dá)非常低的Her-2/neu蛋白質(zhì)或不表達(dá)該蛋白質(zhì)。HLA分型指出，這些腫瘤中僅MCF-7天然表達(dá)HLA-B4402(該克隆的限制性等位基因)。使用HLA-B4402的逆轉(zhuǎn)錄病毒重組體轉(zhuǎn)導(dǎo)SKOV3、SKBR3和HCT-116腫瘤細(xì)胞系。用流式細(xì)胞術(shù)分析測(cè)定親本和轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞系及對(duì)照成纖維細(xì)胞系上I類(lèi)HLA、HLA-B44和Her-2/neu的表達(dá)。用如下FITC標(biāo)記的單克隆抗體染色腫瘤細(xì)胞系或成纖維細(xì)胞系IgG(BectonDickinson，陰性對(duì)照)；抗I類(lèi)HLA抗體(Sigma)；與HLA-B分子(包括HLA-B44)亞類(lèi)結(jié)合的抗Bw4抗體(One Lambda)；抗Her-2/neu抗體CN2(來(lái)自O(shè)ncogene Sciences的Ab2)。固定樣品并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。
結(jié)果說(shuō)明，如預(yù)期的，所有測(cè)試的細(xì)胞系均在細(xì)胞表面表達(dá)I類(lèi)HLA。自體成纖維細(xì)胞和MCF-7腫瘤細(xì)胞表達(dá)HLA-B44，而親代腫瘤細(xì)胞系SKBR3、SKOV3或HCT-116不表達(dá)HLA-B44。用HLA-B44逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后，所有的腫瘤細(xì)胞系均表達(dá)HLA-B44。正如預(yù)期的，SKBR3和SKOV3腫瘤細(xì)胞系均在細(xì)胞表面上表達(dá)Her-2/neu，而且水平與通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)了Her-2/neu的自體成纖維細(xì)胞表達(dá)的Her-2/neu量相當(dāng)。相反，MCF-7、HCT-116和未轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細(xì)胞在細(xì)胞表面上表達(dá)非常少的Her-2/neu或不表達(dá)Her-2/neu。用Her-2/neu的逆轉(zhuǎn)錄病毒重組體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞表達(dá)Her-2/neu，其水平與SKBR3和SKOV3表達(dá)的水平相當(dāng)。
在IFNγ ELISA和TNFα生物測(cè)定試驗(yàn)中我們測(cè)試了Her-2/neu特異性CTL克隆(克隆17D5)識(shí)別上述細(xì)胞系的能力。表5顯示了IFNγELISA的結(jié)果。克隆17D5特異地響應(yīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)Her-2/neu的自體HLA-B4402陽(yáng)性成纖維細(xì)胞而分泌IFNγ。重要的是，克隆17D5特異地響應(yīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)了HLA-B4402的SKBR3和SKOV3腫瘤細(xì)胞，但不響應(yīng)HLA-B4402陰性的親代腫瘤細(xì)胞系或?qū)φ辙D(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞系分泌IFNγ。克隆17d5不識(shí)別HLA-B4402轉(zhuǎn)導(dǎo)的HCT-116腫瘤細(xì)胞系。此結(jié)果正如預(yù)期的一樣，因?yàn)镠CT-116腫瘤細(xì)胞系僅表達(dá)非常低水平的Her-2/neu?？寺?7D5也不識(shí)別乳腺腫瘤細(xì)胞系MCF-7或Her-2/neu轉(zhuǎn)導(dǎo)的MCF-7。對(duì)這些結(jié)果的最有可能的解釋是MCF-7表達(dá)的HLA-B4402水平不夠，因?yàn)镠er-2/neu逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的MCF-7上的Her-2/neu水平與相應(yīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細(xì)胞上的Her-2/neu水平相似。(這可以通過(guò)使用Her-2/neu重組腺病毒感染MCF-7細(xì)胞使其表達(dá)非常高水平的Her-2/neu來(lái)克服)。
表5IFNγ ELISA證明ICD特異性T細(xì)胞克隆17D5對(duì)腫瘤的識(shí)別1

1使用從與所示刺激物或單純培養(yǎng)基孵育的克隆17D5 T細(xì)胞獲得的24小時(shí)上清液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)IFNγELISA。在該測(cè)定中17D5 T細(xì)胞和刺激物均以10,000個(gè)細(xì)胞/孔的量使用。在96孔板上一式三份地進(jìn)行測(cè)定。從無(wú)T細(xì)胞孵育的刺激物獲得的上清液作為對(duì)照，其值均不超過(guò)本底(數(shù)據(jù)未顯示)。ELISA顯色后，在450nm讀取O.D.，使用570nm作為參照。
2顯示的數(shù)據(jù)為三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)孔的O.D.讀數(shù)的平均值。
TNFα生物測(cè)定試驗(yàn)的結(jié)果與此IFN-γ結(jié)果相符。
ELISA克隆17D5特異地響應(yīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)了表達(dá)HLA-B4402的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體的SKBR3和SKOV3而分泌TNFα(表6)。
表6TNFα生物測(cè)定試驗(yàn)證明T細(xì)胞克隆17D5對(duì)腫瘤的識(shí)別1

196孔板中一式三份地將克隆17D5 T細(xì)胞(10,000個(gè)細(xì)胞/孔)與所示APC(10,000個(gè)細(xì)胞/孔)一起或在單純培養(yǎng)基中孵育。收獲4小時(shí)上清液并將其加入TNFα敏感細(xì)胞系WEHI(以30,000個(gè)細(xì)胞/孔接種在96孔板中)。將WEHI細(xì)胞和上清液一起孵育過(guò)夜，并每孔加入1/10終體積的alomarblue。加入Alomar blue后7小時(shí)和24小時(shí)，讀取O.D.570nm-630nm。所示結(jié)果為24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)上的結(jié)果。
2O.D.數(shù)據(jù)為三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)孔的平均值，指示了TNFα敏感WEHI細(xì)胞的相對(duì)存活力，較低的值指示細(xì)胞死亡增加，也即TNFα的分泌增加。
由于以上結(jié)果證明了使用ICD重組腺病毒體外致敏的CD8+T細(xì)胞能夠識(shí)別過(guò)表達(dá)Her-2/neu的人腫瘤細(xì)胞，故該結(jié)果是有意義的。20％至40％的人乳腺癌以及一定比例的卵巢、肺和結(jié)腸癌過(guò)表達(dá)Her-2/neu。這些數(shù)據(jù)支持了ICD作為Her-2/neu陽(yáng)性腫瘤疫苗的用途。
實(shí)施例5在大腸桿菌中表達(dá)人Her-2/neu HICD本實(shí)施例描述了構(gòu)建用于表達(dá)重組人Her-2/neu ICD(HICD)蛋白質(zhì)的構(gòu)建體。
PCR擴(kuò)增人ICD的開(kāi)放閱讀框，并將其亞克隆至修飾的pET28載體中用于在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白質(zhì)。制備具有N端組氨酸標(biāo)簽的兩個(gè)構(gòu)建體，其中一個(gè)具有蛋白酶切割位點(diǎn)，而另一個(gè)沒(méi)有此位點(diǎn)。制備一個(gè)帶有C端組氨酸標(biāo)簽的構(gòu)建體，和一個(gè)不帶組氨酸標(biāo)簽的構(gòu)建體。
HICD_plus_8_HIS(SEQ ID NOs5和11)的構(gòu)建首先從pGS10 ATG質(zhì)粒使用如下引物PCR擴(kuò)增ICD編碼區(qū)PDM-44(SEQ ID NO16)5′atctctggcgcgctggatgacgatgacaagaaacgacggcagcagaagPDM-45(SEQ ID NO17)5′cagggcgcgccactcgagtcattacactggcacgtccagacccagPCR條件如下10μl 10×Pfu緩沖液(Stratagene，La Jolla，CA)，1.25μl 10mM dNTP(Sigma，St.Louis，MO)，3μl 10μM PDM-44寡聚物，3μl 10μM PDM-45寡聚物，80μl無(wú)菌水，2μl Pfu DNA聚合酶，約5ng pGS10Δ ATG DNA。熱循環(huán)條件如下96℃ 2分鐘的單個(gè)變性步驟；之后40個(gè)循環(huán)96℃ 30秒，68℃ 15秒和72℃ 6分鐘45秒；最后72℃延伸10分鐘。樣品在進(jìn)一步分析之前保存在4℃。將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆在修飾的pT7blue質(zhì)粒中，該質(zhì)粒含有與在PDM-44引物中包括的BssHII位點(diǎn)符合閱讀框的8His標(biāo)簽編碼區(qū)。用BssHII和AscI消化載體和PCR產(chǎn)物。篩選方向正確的構(gòu)建體，然后測(cè)序。之后將該構(gòu)建體克隆至pET14b(Novagen，Madison，WI)的NcoI和AscI位點(diǎn)處。然后將該構(gòu)建體克隆至pET28b(Novagen，Madison，WI)載體的NcoI和HindIII位點(diǎn)處。最終的構(gòu)建體含有8組氨酸標(biāo)簽以及腸激酶切割位點(diǎn)。
構(gòu)建HICD_in_pPDM_coding_sequence(SEQ ID NOs7和10)使用如下引物從cDNA模板PCR擴(kuò)增ICD編碼區(qū)PDM-591(SEQ ID NO18)5′cacaaacgacggcagcagaagatccggaag 3’PDM-592(SEQ ID NO19)5′gcgccactcgagtcattacactggcacgtc 3’PCR條件如下10μl 10×Pfu緩沖液(Stratagene，La Jolla，CA)，1μl 10mM dNTP(Sigma，St.Louis，MO)，10μM PDM-591和-592寡聚物各2μl，83μl無(wú)菌水，1.5μl Pfu DNA聚合酶，1μl cDNA。熱循環(huán)條件如下首先96℃變性2分鐘；之后40個(gè)循環(huán)96℃ 30秒，66℃ 15秒和72℃ 5分鐘；之后72℃最終延伸6分鐘。用XhoI消化PCR產(chǎn)物，并將其克隆在經(jīng)Eco 72I和XhoI消化的pPDM His(一種具有符合閱讀框的His標(biāo)簽的修飾pET28構(gòu)建體)中。通過(guò)序列分析驗(yàn)證正確的構(gòu)建體，然后用其轉(zhuǎn)化BLR pLys S細(xì)胞以便進(jìn)行表達(dá)。
構(gòu)建HICD_CT_His_coding_region(SEQ ID NOs4和8)使用如下引物從cDNA模板PCR擴(kuò)增ICD編碼區(qū)PDM-72(SEQ ID NO20)5′cgacttcatatgaaacgacggcagcagaagatc 3’PDM-61(SEQ ID NO21)5′ccacgtctagagaaggcgcgccatctggatcattaatgatgatgatgatgatgcactggcacgtccagacccaggta 3’PCR條件如下10μl 10×Pfu緩沖液(Stratagene，La Jolla，CA)，1μl 10mM dNTP(Sigma，St.Louis，MO)，2μl 10μM PDM-72寡聚物，2μl 10μM PDM-61寡聚物，83μl無(wú)菌水，1.5μl Pfu DNA聚合酶，1μlcDNA。熱循環(huán)條件如下首先96℃變性2分鐘；之后40個(gè)循環(huán)96℃ 30秒，66℃ 15秒和72℃ 5分鐘；之后72℃最后延伸6分鐘。用NdeI和NotI消化PCR產(chǎn)物，并將其克隆在經(jīng)NdeI和NotI消化的pPDMHis(一種具有符合閱讀框的His標(biāo)簽的修飾pET28構(gòu)建體)中。通過(guò)序列分析驗(yàn)證正確的構(gòu)建體，然后用其轉(zhuǎn)化BLR pLys S細(xì)胞以便進(jìn)行表達(dá)。
構(gòu)建HICD_native_coding_region(SEQ ID NOs6和9)用KpnI和AscI消化VR102人Her-2/neu，分離出人Her-2/neu的ICD區(qū)域的C端部分。將此704bp插入片斷亞克隆至同樣用KpnI和AscI消化(該消化從此構(gòu)建體中除去了C端His標(biāo)簽，之后替換為所述704bp插入片斷)的具有C端His標(biāo)簽的pET28HICD中。通過(guò)序列分析驗(yàn)證正確的構(gòu)建體。
實(shí)施例6克隆并測(cè)序來(lái)源于her-2/neu特異性CD8 T細(xì)胞的TCRα和β鏈本實(shí)施例描述了實(shí)施例4所述Her-2/neu特異性CD8 T細(xì)胞克隆的T細(xì)胞受體(TCR)α和β鏈的克隆和測(cè)序。序列分析證明，該TCR的α鏈屬于Vα16家族而β鏈屬于Vβ14家族。此外，鑒定到獨(dú)特的多樣性和連接區(qū)段(負(fù)責(zé)應(yīng)答的特異性)。
使用Trizol試劑從CTL克隆17D5的2×106個(gè)細(xì)胞中分離出總mRNA，并用Ready-to-go試劑盒(Pharmacia)合成cDNA。為了確定該克隆的Vα和Vβ序列，合成了一組Vα和Vβ亞型特異性引物(基于Clontech，Palo Alto，CA產(chǎn)生的引物序列)并將其和從各個(gè)克隆制備的cDNA用于RT-PCR反應(yīng)。RT-PCR反應(yīng)說(shuō)明，所有的克隆均表達(dá)相應(yīng)于Vβ14亞家族的共同Vβ序列。而且，使用從該克隆產(chǎn)生的cDNA，我們確定了表達(dá)的Vα序列是Vα16。為了從克隆17D5克隆全長(zhǎng)TCRα和β鏈，設(shè)計(jì)了橫跨TCR起始密碼子和終止密碼子的編碼核苷酸的引物。引物如下TCRVα-16 5’(有義)(BamHI位點(diǎn)---Kozak--TCRα序列)(SEQ IDNO22)GGATCC---GCCGCCACC--ATGGCCTCTGCACCCATCTCGATCRα3’(反義)(SalI位點(diǎn)---TCRα恒定序列)(SEQ ID NO23)GTCGAC---TCAGCTGGACCACAGCCGCAGTCRVβ-14. 5’(有義)(BamHI位點(diǎn)---Kozak--TCRα序列)(SEQ IDNO24)GGATCC---GCCGCCACC--ATGGGCCCCCAGCTCCTTGGCTATCRβ3’(反義)(SalI位點(diǎn)---TCRβ恒定序列)(SEQ ID NO25)GTCGAC---TCAGAAATCCTTTCTCTTGAC.
使用從CTL克隆合成的cDNA及上述引物，并使用校正熱穩(wěn)定聚合酶PWO(Roche，Basel，瑞士)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的35循環(huán)RT-PCR反應(yīng)。將所獲特異條帶(對(duì)于α鏈為約850bp而對(duì)于β鏈為約950bp)連接在PCR平端載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。鑒定含有全長(zhǎng)α和β鏈的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，大規(guī)模制備相應(yīng)質(zhì)粒。對(duì)含有全長(zhǎng)TCRα和β鏈的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序反應(yīng)驗(yàn)證了全長(zhǎng)TCRα和β鏈的克隆。α和β鏈的cDNA序列分別公開(kāi)在SEQ ID NOs13和12中，而氨基酸序列分別公開(kāi)在SEQ ID NOs15和14中。BLAST檢索證實(shí)，該Vα屬于Vα16家族而該Vβ屬于Vβ14家族。負(fù)責(zé)該TCR特異性的多樣性-連接(DJ)區(qū)是獨(dú)特的。
從上文所述，應(yīng)當(dāng)理解，盡管為了舉例說(shuō)明的目的這里描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但可以進(jìn)行多種修飾而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求的限制。
序列表<110>Corixa CorporationHand-Zimmerman，SusanCheever，Martin A.
Foy，Teresa M.
Lodes，Michael J.
Kalos，Michael D.
McNeill，Patricia D.
Vedvick，Thomas S.
<120>治療和診斷Her-2/neu相關(guān)惡性腫瘤的組合物和方法<130>210121.544PC<140>PCT<141>2001-08-14<160>25<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>3768<212>DNA<213>人(Homo sapien)<220>
<221>CDS<222>(1)...(3765)<400>1atg gag ctg gcg gcc ttg tgc cgc tgg ggg ctc ctc ctc gcc ctc ttg 48Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu1 5 10 15ccc ccc gga gcc gcg agc acc caa gtg tgc acc ggc aca gac atg aag 96Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys20 25 30ctg cgg ctc cct gcc agt ccc gag acc cac ctg gac atg ctc cgc cac 144Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His35 40 45ctc tac cag ggc tgc cag gtg gtg cag gga aac ctg gaa ctc acc tac 192Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr50 55 60ctg ccc acc aat gcc agc ctg tcc ttc ctg cag gat atc cag gag gtg 240Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val65 70 75 80cag ggc tac gtg ctc atc gct cac aac caa gtg agg cag gtc cca ctg 288Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu85 90 95cag agg ctg cgg att gtg cga ggc acc cag ctc ttt gag gac aac tat 336Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
100 105 110gcc ctg gcc gtg cta gac aat gga gac ccg ctg aac aat acc acc cct 384Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro115 120 125gtc aca ggg gcc tcc cca gga ggc ctg cgg gag ctg cag ctt cga agc 432Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser130 135 140ctc aca gag atc ttg aaa gga ggg gtc ttg atc cag cgg aac ccc cag 480Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln145 150 155 160ctc tgc tac cag gac acg att ttg tgg aag gac atc ttc cac aag aac 528Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn165 170 175aac cag ctg gct ctc aca ctg ata gac acc aac cgc tct cgg gcc tgc 576Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys180 185 190cac ccc tgt tct ccg atg tgt aag ggc tcc cgc tgc tgg gga gag agt 624His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser195 200 205tct gag gat tgt cag agc ctg acg cgc act gtc tgt gcc ggt ggc tgt 672Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys210 215 220gcc cgc tgc aag ggg cca ctg ccc act gac tgc tgc cat gag cag tgt 720Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys225 230 235 240gct gcc ggc tgc acg ggc ccc aag cac tct gac tgc ctg gcc tgc ctc 768Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu245 250 255cac ttc aac cac agt ggc atc tgt gag ctg cac tgc cca gcc ctg gtc 816His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val260 265 270acc tac aac aca gac acg ttt gag tcc atg ccc aat ccc gag ggc cgg 864Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg275 280 285tat aca ttc ggc gcc agc tgt gtg act gcc tgt ccc tac aac tac ctt 912Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu290 295 300tct acg gac gtg gga tcc tgc acc ctc gtc tgc ccc ctg cac asc caa 960Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys pro Leu His Asn Gln305 310 315 320gag gtg aca gca gag gat gga aca cag cgg tgt gag aag tgc agc aag 1008Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys325 330 335ccc tgt gcc cga gtg tgc tat ggt ctg ggc atg gag cac ttg cga gag 1056Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu340 345 350
gtg agg gca gtt acc agt gcc aat atc cag gag ttt gct ggc tgc aag1104Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys355 360 365aag atc ttt ggg agc ctg gca ttt ctg ccg gag agc ttt gat ggg gac1152Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp370 375 380cca gcc tcc aac act gcc ccg ctc cag cca gag cag ctc caa gtg ttt1200Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe385 390 395 400gag act ctg gaa gag atc aca ggt tac cta tac atc tca gca tgg ccg1248Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro405 410 415gac agc ctg cct gac ctc agc gtc ttc cag aac ctg caa gta atc cgg1296Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg420 425 430gga cga att ctg cac aat ggc gcc tac tcg ctg acc ctg caa ggg ctg1344Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu435 440 445ggc atc agc tgg ctg ggg ctg cgc tca ctg agg gaa ctg ggc agt gga1392Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly450 455 460ctg gcc ctc atc cac cat aac acc cac ctc tgc ttc gtg cac acg gtg1440Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val465 470 475 480ccc tgg gac cag ctc ttt cgg aac ccg cac caa gct ctg ctc cac act1488Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr485 490 495gcc aac cgg cca gag gac gag tgt gtg ggc gag ggc ctg gcc tgc cac1536Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His500 505 510cag ctg tgc gcc cga ggg cac tgc tgg ggt cca ggg ccc acc cag tgt1584Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys515 520 525gtc aac tgc agc cag ttc ctt cgg ggc cag gag tgc gtg gag gaa tgc1632Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys530 535 540cga gta ctg cag ggg ctc ccc agg gag tat gtg aat gcc agg cac tgt1680Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys545 550 555 560ttg ccg tgc cac cct gag tgt cag ccc cag aat ggc tca gtg acc tgt1728Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys565 570 575ttt gga ccg gag gct gac cag tgt gtg gcc tgt gcc cac tat aag gac1776Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp580 585 590cct ccc ttc tgc gtg gcc cgc tgc ccc agc ggt gtg aaa cct gac ctc1824Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu
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Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu500 505 510Glu Arg Pro Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp515 520 525Val Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro530 535 540Gln Gly Gly Ala Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro545 550 555 560Ala Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly565 570 575Ala Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu580 585 590Tyr Leu Gly Leu Asp Val Pro Val595 600<210>12<211>957<212>DNA<213>人<400>12atgggccccc agctccttgg ctatgtggtc ctttgccttc taggagcagg ccccctggaa 60gcccaagtga cccagaaccc aagatacctc atcacagtga ctggaaagaa gttaacagtg 120acttgttctc agaatatgaa ccatgagtat atgtcctggt atcgacaaga cccagggctg 180ggcttaaggc agatctacta ttcaatgaat gttgaggtga ctgataaggg agatgttcct 240gaagggtaca aagtctctcg aaaagagaag aggaatttcc ccctgatcct ggagtcgccc 300agccccaacc agacctctct gtacttctgt gccagcagtt tagattgggg cggactagcg 360ggagggttgg gcacagatac gcagtatttt ggcccaggca cccggctgac agtgctcgag 420gacctgaaaa acgtgttccc acccgaggtc gctgtgtttg agccatcaga agcagagatc 480tcccacaccc aaaaggccac actggtatgc ctggccacag gcttctaccc cgaccacgtg 540gagctgagct ggtgggtgaa tgggaaggag gtgcacaagt ggggtcagca cagacccgca 600gcccctcaag gagcaagccc gccctcaatg actccagata ctgctgagca gccgcctgag 660ggtctcggcc acttctggca gaacccccgc aaccacttcc gctgtcaagt ccagttctac 720gggctctcgg agaatgacga gtggacccag gatagggcca aacctgtcac ccagatcgtc 780agcgccgagg cctggggtag agcagactgt ggcttcacct ccgagtctta ccagcaaggg 840gtcctgtctg ccaccatcct ctatgagatc ttgctaggga aggccacctt gtatgccgtg 900ctggtcagtg ccctcgtgct gatggccatg gtcaagagaa aggattccag aggctag957<210>13<211>686<212>DNA<213>人<400>13atggcctctg cacccatctc gatgcttgcg atgctcttca cattgagtgg gctgagagct 60cagtcagtgg ctcagccgga agatcaggtc aacgttgctg aagggaatcc tctgactgtg 120aaatgcacct attcagtctc tggaaaccct tatctttttt ggtatgttca ataccccaac 180cgaggcctcc agttccttct gaaatacatc acaggggata acctggttaa aggcagctat 240ggctttgaag ctgaatttaa caagagccaa acctccttcc acctgaagaa accatctgcc 300cttgtgagcg actccgcttt gtacttctgt gctgtgagac cgaattcagg atacagcacc 360ctcacctttg ggaaggggac tatgcttcta gtctctccag atatccagaa ccctgaccct 420gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat 480tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa 540actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac 600aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca ttattccaga agacaccttc 660ttccccagcc cagaaagttc ctgtga 686<210>14<211>318<212>PRT<213>人
<400>14Met Gly Pro Gln Leu Leu Gly Tyr Val Val Leu Cys Leu Leu Gly Ala5 10 15Gly Pro Leu Glu Ala Gln Val Thr Gln Asn Pro Arg Tyr Leu Ile Thr20 25 30Val Thr Gly Lys Lys Leu Thr Val Thr Cys Ser Gln Asn Met Asn His35 40 45Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Gln50 55 60Ile Tyr Tyr Ser Met Asn Val Glu Val Thr Asp Lys Gly Asp Val Pro65 70 75 80Glu Gly Tyr Lys Val Ser Arg Lys Glu Lys Arg Asn Phe Pro Leu Ile85 90 95Leu Glu Ser Pro Ser Pro Asn Gln Thr Ser Leu Tyr Phe Cys Ala Ser100 105 110Ser Leu Asp Trp Gly Gly Leu Ala Gly Gly Leu Gly Thr Asp Thr Gln115 120 125Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn130 135 140Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile145 150 155 160Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr165 170 175Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His180 185 190Lys Trp Gly Gln His Arg Pro Ala Ala Pro Gln Gly Ala Ser Pro Pro195 200 205Ser Met Thr Pro Asp Thr Ala Glu Gln Pro Pro Glu Gly Leu Gly His210 215 220Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr225 230 235 240Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val245 250 255Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe260 265 270Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr275 280 285Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala290 295 300Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly305 310 315<210>15<211>228<212>PRT<213>人<400>15Met Ala Ser Ala Pro Ile Ser Met Leu Ala Met Leu Phe Thr Leu Ser5 10 15Gly Leu Arg Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val20 25 30Ala Glu Gly Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly35 40 45Asn Pro Tyr Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln50 55 60Phe Leu Leu Lys Tyr Ile Thr Gly Asp Asn Leu Val Lys Gly Ser Tyr65 70 75 80Gly Phe Glu Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys85 90 95
Lys Pro Ser Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val100 105 110Arg Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Met115 120 125Leu Leu Val Ser Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln130 135 140Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp145 150 155 160Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr165 170 175Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser180 185 190Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn195 200 205Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro210 215 220Glu Ser Ser Cys225<210>16<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PDM-44<400>16atctctggcg cgctggatga cgatgacaag aaacgacggc agcagaag 48<210>17<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PDM-45<400>17cagggcgcgc cactcgagtc attacactgg cacgtccaga cccag 45<210>18<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PDM-591<400>18cacaaacgac ggcagcagaa gatccggaag 30<210>19<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PDM-592<400>19
gcgccactcg agtcattaca ctggcacgtc 30<210>20<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PDM-72<400>20cgacttcata tgaaacgacg gcagcagaag atc 33<210>21<211>77<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PDM-61<400>21ccacgtctag agaaggcgcg ccatctggat cattaatgat gatgatgatg atgcactggc 60acgtccagac ccaggta77<210>22<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物TCR Valpha-16 5′<400>22ggatccgccg ccaccatggc ctctgcaccc atctcga 37<210>23<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物TCR alpha 3′<400>23gtcgactcag ctggaccaca gccgcag 27<210>24<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物TCR Vbeta-14.5′<400>24ggatccgccg ccaccatggg cccccagctc cttggcta 38<210>25<211>27<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物TCR beta 3′<400>25gtcgactcag aaatcctttc tcttgac 2權(quán)利要求
1.有效地在患者體內(nèi)引起免疫應(yīng)答的分離的多核苷酸組合物，所述多核苷酸編碼包含基本上由SEQ ID NO3組成的氨基酸序列的多肽。
2.有效引起免疫應(yīng)答的分離的多肽組合物，所述多肽包含基本上由SEQ ID NO3組成的氨基酸序列。
3.包含權(quán)利要求1的多核苷酸或權(quán)利要求2的多肽以及藥學(xué)可接受載體的藥物組合物。
4.權(quán)利要求3的藥物組合物，還包含免疫刺激劑。
5.權(quán)利要求4的藥物組合物，其中所述免疫刺激劑包含佐劑。
6.在患者體內(nèi)引起免疫應(yīng)答的方法，包括給患者施用有效量的權(quán)利要求1的多核苷酸。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述患者是HLA-B44陽(yáng)性的。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述患者患有乳腺癌。
9.在患者體內(nèi)引起免疫應(yīng)答的方法，包括給患者施用有效量的具有SEQ ID NO1大約第2026-3765位核苷酸的序列的多核苷酸。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述患者患有乳腺癌。
11.分離的多核苷酸組合物，其包含SEQ ID NO13所示的TCR-α序列。
12.分離的多核苷酸組合物，其包含SEQ ID NO12所示的TCR-β序列。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了用于治療和診斷癌癥，尤其是Her－2/neu相關(guān)癌癥的組合物和方法。示例性組合物含有一種或多種Her－2/Neu多肽、其免疫原性片斷，編碼這些多肽的多核苷酸，表達(dá)這些多肽的抗原呈遞細(xì)胞，和對(duì)表達(dá)這些多肽的細(xì)胞具有特異性的T細(xì)胞。這些公開(kāi)的組合物可用于例如診斷、預(yù)防和/或治療Her－2/neu相關(guān)惡性腫瘤。
文檔編號(hào)C07K14/71GK1537164SQ01816447
公開(kāi)日2004年10月13日 申請(qǐng)日期2001年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月14日
發(fā)明者S·漢德－齊姆默爾曼, M·A·齊弗, T·M·福伊, M·J·洛德斯, M·D·卡洛斯, P·D·麥克尼爾, T·S·維德威克, S 漢德-齊姆默爾曼, 卡洛斯, 洛德斯, 福伊, 維德威克, 麥克尼爾, 齊弗 申請(qǐng)人:科里克薩有限公司