專利名稱：重組融合毒素VEGF₁₆₅-melittin及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程藥物領(lǐng)域，具體涉及一種重組融合毒素VEGF165-Hielittin及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤的預(yù)防與治療一直是世界難題，血管生成對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有著至關(guān)重要的作用。腫瘤發(fā)生時(shí)能促進(jìn)血管生成因子分泌，其中最主要的是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF )。大量研究結(jié)果表明 VEGF 通過其加速新血管生長(zhǎng)的作用而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和擴(kuò)散，與多種實(shí)體瘤如肝癌、乳腺癌、肺癌、 結(jié)腸癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。而以血管定向的靶向藥物，尤其以VEGF受體為靶向的融合毒素兼具與VEGF受體結(jié)合，阻斷VEGF/VEGFR信號(hào)通路與殺傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的雙重作用，除了抑制腫瘤新生血管形成外，還能夠破壞已生成的腫瘤血管，是更有前景的治療手段，同時(shí)在視網(wǎng)膜疾病、艾滋病等方面亦有潛在的應(yīng)用價(jià)值。VEGF 的mRNA經(jīng)過剪切可形成四種不同的異構(gòu)體，VEGF121, VEGF165, VEGF189和VEGF2tl6,它們的主要區(qū)別是與肝素及細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合力不同。已有研究報(bào)道在這四種VEGF的異構(gòu)體中，以 VEGF121和VEGF165為靶向載體，可以產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞毒性效果，這可能與VEGFm、VEGF165有更多的特異性受體有關(guān)。國(guó)外已有學(xué)者將VEGF165與白喉毒素結(jié)合形成大分子融合蛋白靶向抑制腫瘤血管的生成，Hotz等也將VEGF121與志賀祥菌毒素融合并進(jìn)行了抗腫瘤活性檢測(cè)，但是這些常用的毒素分子量大，而且必須首先要通過細(xì)胞內(nèi)化作用才能進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用，這些都影響了其抗腫瘤作用的發(fā)揮。蜂毒肽(melittin)是由沈個(gè)氨基酸組成的小分子毒素，具有分子量小、易于深入實(shí)體瘤內(nèi)部的優(yōu)點(diǎn)，其發(fā)揮作用的主要機(jī)理是使細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞內(nèi)容物泄露， 細(xì)胞裂解，無(wú)需經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)化而直接發(fā)揮作用，這使得melittin非常適合作為“彈頭”用來(lái)制造融合毒素進(jìn)行抗腫瘤的靶向治療。但目前還沒有相關(guān)方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)僅僅以阻斷VEGF/VEGFR信號(hào)通路抑制腫瘤新生血管為目的的靶向治療方法存在的問題，提供一種兼具血管靶向與破壞已生腫瘤血管，并能殺死腫瘤細(xì)胞的雙重作用的新型重組融合毒素VEGF165-melittin，為抗腫瘤靶向治療技術(shù)的研究和發(fā)展提供基礎(chǔ)。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的
一種重組融合毒素VEGF165-melittin，是通過連接肽在蜂毒素短肽melittin的氨基端連接VEGF165得到，或通過連接肽在VEGF165的氨基端連接蜂毒素短肽melittin得到；所述連接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。也就是說(shuō)，融合毒素分子中，VEGF165與蜂毒素的連接次序或位置是可以互換的。
其中所述VEGF165和蜂毒素短肽melittin分別與天然人VEGF165和天然蜂毒素至少有90%的序列同源性。所述重組融合毒素的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示?；?yàn)閷EQ ID NO: 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還保護(hù)上述重組融合毒素VEGF165-Hielittin的編碼基因。該編碼基因的核苷酸序列為編碼SEQ ID N0:2所示蛋白序列的基因，具體核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示， 或者與SEQ ID N0:3所示序列具有90%以上同源性且具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的核苷酸序列?；蛘咴诟邍?yán)謹(jǐn)條件下可以與SEQ ID NO:3所示序列雜交的核苷酸序列。一種重組融合毒素VEGF165-Hielittin的表達(dá)載體，由VEGF165Ielittin的編碼基因插入到出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)構(gòu)成，所述出發(fā)載體優(yōu)選為pPICZa，pPIC9或pHIL-sl。含有上述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或宿主菌。本發(fā)明所述重組融合毒素VEGF165-Hielittin可以通過DNA重組技術(shù)制備，所使用的表達(dá)系統(tǒng)是酵母表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)選畢赤酵母，而畢赤酵母X-33最佳?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的方法如PCR、RT-PCR方法、人工合成方法和構(gòu)建篩選cDNA 文庫(kù)等方法獲得編碼人VEGF165的多聚核苷酸和編碼蜂毒素melittin的多聚核苷酸。用作 PCR模板和用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)的mRNA或cDNA可以來(lái)源于任何含有相應(yīng)mRNA或cDNA的組織、細(xì)胞及文庫(kù)等，如從人肝癌組織和工蜂毒腺cDNA文庫(kù)獲得，也可以用人工合成的方法獲得。人工合成時(shí)可選用宿主偏愛的密碼子，借以提高產(chǎn)物的表達(dá)效率。必要時(shí)，可采用本領(lǐng)域周知的方法對(duì)多聚核苷酸進(jìn)行突變、缺失、插入和與其它多聚核苷酸連接等。可以使用本領(lǐng)域周知的各種方法，如通過PCR的方法，在保持各自閱讀框不變的前提下，在編碼序列的兩側(cè)引入適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)，通過酶切產(chǎn)生粘性末端，并在DNA連接酶作用下，實(shí)現(xiàn)編碼人VEGF165和編碼蜂毒素的多聚核苷酸的粘性末端彼此連接，得到編碼本發(fā)明融合毒素的基因。如果需要，可在本發(fā)明的融合毒素基因兩側(cè)引入適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。 可用本領(lǐng)域公知的方法將含編碼融合毒素序列的基因序列克隆到各種適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中。 所用標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆方法參見J.薩姆布魯克等《分子克隆試驗(yàn)指南》第三版，科學(xué)出版社， 2002。許多表達(dá)載體和其對(duì)應(yīng)的宿主如酵母表達(dá)載體pPICZa，pPIC9，pHIL-sl (Invitrogerl Corp. San Diego, California, USA.)均可從市場(chǎng)上購(gòu)得?？梢詫⒕幋a本發(fā)明融合毒素或多肽的核苷酸序列克隆至酵母表達(dá)載體中。本發(fā)明優(yōu)選的巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)可以是胞內(nèi)表達(dá)的，也可以是分泌表達(dá)的。這些載體都包括一個(gè)由大約0. 9kb的 5’醇氧化酶操縱子(A0X1)序列和大約0. 3kb的轉(zhuǎn)錄終止基因的3’序列組成的表達(dá)盒，因此可以便于目的基因在酵母染色體中整合與表達(dá)。表達(dá)融合毒素的宿主可以是酵母、細(xì)菌、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞等，但本發(fā)明優(yōu)選的是酵母。融合毒素或多肽可以存在于宿主細(xì)胞內(nèi)，也可以是從宿主中分泌出來(lái)，但最好是在信號(hào)肽的幫助下從宿主細(xì)胞內(nèi)分泌出來(lái)。本發(fā)明優(yōu)選的信號(hào)肽是α因子(a MF)。α因子信號(hào)序列由87個(gè)氨基酸組成，來(lái)自于啤酒酵母(S. cerevsia)的α性成熟因子前導(dǎo)序列。 編碼融合蛋白的核酸序列，可以插入至宿主染色體，或以游離質(zhì)粒形式存在。
得到攜帶融合毒素基因的重組表達(dá)載體后，可使用通常的方法，如鋰鹽法、PEG法、 原生質(zhì)球法和電穿孔法等方法轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。其中，本發(fā)明優(yōu)選的轉(zhuǎn)化方法是電穿孔法。可通過人們熟知的技術(shù)加以鑒定，如收集并裂解細(xì)胞，提取DNA，然后用PCR方法鑒定被成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的細(xì)胞?；蛘?，可用抗人VEGF165或抗蜂毒素的抗體檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清或細(xì)胞破碎液中的蛋白。可以使用搖瓶或生物反應(yīng)器，培養(yǎng)含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，以生產(chǎn)本發(fā)明的融合毒素。所使用的培養(yǎng)基應(yīng)能提供菌體(或細(xì)胞)生長(zhǎng)和產(chǎn)物表達(dá)所需的物質(zhì)， 包含氮源、碳源、PH調(diào)節(jié)成分等，培養(yǎng)基配方應(yīng)根據(jù)不同培養(yǎng)對(duì)象，通過試驗(yàn)獲得。培養(yǎng)可分為兩個(gè)階段，第一階段主要用于菌體(或細(xì)胞)生長(zhǎng)，第二階段主要用于產(chǎn)物的合成?？梢杂酶鞣N蛋白分離的方法自含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的細(xì)菌或細(xì)胞培養(yǎng)物中分離、純化融合蛋白，如鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、超濾、液相層析等技術(shù)及這些技術(shù)的組合。其中液相層析可以用分子篩、親和、離子交換、疏水、反相等層析技術(shù)。經(jīng)過多種方案的優(yōu)化組合，最終確定出效率最高的一種重組融合毒素 VEGF165-Hielittin的制備方法，步驟如下
(1)以SEQID NO:4 5為引物，擴(kuò)增VEGF165基因；
(2)合成蜂毒素短肽melittin基因，兩端分別連接限制性酶切位點(diǎn)和損al，連接到載體pPICZa的多克隆位點(diǎn)，得到重組載體；
(3)分別用&ORI和損ol對(duì)VEGF165基因和重組載體進(jìn)行雙酶切，連接后，電穿孔法轉(zhuǎn)化宿主畢赤酵母菌，構(gòu)建VEGF165-Melittin基因工程菌；
(4)培養(yǎng)VEGF165-Melittin基因工程菌，培養(yǎng)基為BMGY培養(yǎng)基，下培養(yǎng)，誘導(dǎo)其產(chǎn)生可溶性重組融合蛋白VEGF165-Melittin ；
(5)將步驟(4)的培養(yǎng)物離心、收集上清，進(jìn)行親和柱層析純化VEGF165-Melittin蛋白， 柱層析所述填料為Ni-NTA樹脂，吸附條件為pH 5. 5-8. 5之間，洗脫條件為降低pH、逐步提高咪唑的濃度或加入EDTA或者EGTA，pH為4_6之間，咪唑濃度為0. 02-0. 5M ；
(6)采用分子量1000道爾頓的超濾膜超濾，采用半透膜透析(透析液10mMTris -HCl, 150mM NaCl)，凍干得到 VEGF165-Melittin 蛋白。生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的融合毒素可以與肝癌細(xì)胞表面的受體靶向結(jié)合并且能夠抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，可用于制備靶向抗腫瘤藥物。本發(fā)明中的重組融合毒素VEGF165-Hielittin可以有各種衍生物，這些衍生物可以是但不局限于其不同形式的鹽、修飾后產(chǎn)物等。如在多肽的氨基、羧基、羥基、巰基上再進(jìn)行修飾。所用的修飾劑可以是但不局限于聚乙二醇，葡聚糖等。本發(fā)明中的重組融合毒素VEGF165-Hielittin或其衍生物可以單獨(dú)使用，優(yōu)選的為與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體一起組成藥物制劑。藥物載體一般應(yīng)與融合毒素相容且不能對(duì)受體自身有害，典型的載體為水、鹽水、糖類、醇類或氨基酸，它們須無(wú)菌且無(wú)致熱原。藥物制劑可通過本領(lǐng)域己知的方法制備。這些方法包括將融合毒素與一種或多種輔助成分混合的步驟。優(yōu)選的藥物制劑包括含水的液體制劑和含水量低于10%或不含水的凍干制劑。這些制劑可以含有緩沖劑，鹽類，小分子糖類等。本發(fā)明中的重組融合毒素VEGF165-Hielittin及其衍生物或其藥物組合物可以通過任何已知的方法，包括注射(如皮下或肌肉)、靜脈輸注、透皮、吸入等方法給藥。優(yōu)選的方
5法為靜脈輸注或注射給藥。治療包括在一段時(shí)間內(nèi)使用單一劑量或復(fù)合劑量。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明將人VEGF165分子，或其有至少90%序列同源性的類似物與蜂毒素或其有至少 90%序列同源性的類似物相融合，所形成的融合毒素既保留了與VEGFR、EGFR相結(jié)合的活性，又保留了蜂毒素溶解細(xì)胞的活性。因此本發(fā)明的融合毒素既可以通過人VEGF165與表達(dá) VEGFR、EGFR的腫瘤細(xì)胞結(jié)合，在腫瘤細(xì)胞周圍富集高濃度的VEGF165-蜂毒素，借助蜂毒素的溶解細(xì)胞的活性，達(dá)到靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的目的，同時(shí)，當(dāng)VEGF165-Hielittin與VEGFR、 EGFR結(jié)合后，還可以與內(nèi)源性的VEGF競(jìng)爭(zhēng)VEGFR、EGFR的結(jié)合位點(diǎn)，從而阻斷VEGF/VEGFR 信號(hào)的酪氨酸激酶活化作用，阻斷多種VEGFs、EGFs過強(qiáng)信號(hào)，最終達(dá)到抑制腫瘤的增殖、 遷移，尤其抑制新生血管的生成的作用。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)本發(fā)明的VEGF165-蜂毒素融合毒素具有高效結(jié)合、靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的活性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明將VEGF165與小分子毒素melittin融合，構(gòu)建新型重組毒素VEGF165-Hielittin， 在真核表達(dá)體系巴氏畢赤酵母中獲得可溶性表達(dá)，并對(duì)其腫瘤細(xì)胞的殺傷作用進(jìn)行檢測(cè)， 篩選出具有更強(qiáng)靶向性和腫瘤細(xì)胞殺傷活性的新型重組毒素，將有助于進(jìn)一步研究和發(fā)展相關(guān)的抗腫瘤靶向治療技術(shù)，具有較好的市場(chǎng)前景。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明獲得的融合毒素VEGF165-Hielittin同時(shí)具備與腫瘤細(xì)胞的VEGFR、EGFR結(jié)合，釋放蜂毒素殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，并且當(dāng)VEGF165-Hielittin與 VEGFR、EGFR結(jié)合后，阻斷VEGF/VEGFR信號(hào)的酪氨酸激酶活化作用，阻斷多種VEGFs、EGFs過強(qiáng)信號(hào)，最終達(dá)到抑制腫瘤的增殖、遷移，尤其抑制新生血管的生成的作用。本發(fā)明將VEGF/ VEGFR系統(tǒng)作為治療腫瘤的靶點(diǎn)，構(gòu)建融合毒素VEGF165-Hielittin，實(shí)現(xiàn)特異性靶點(diǎn)、高效結(jié)合、靶向殺傷腫瘤細(xì)胞，為腫瘤的治療開辟一個(gè)全新的設(shè)計(jì)思路與途徑。


圖1. RT-PCR擴(kuò)增VEGF165基因圖譜，其中，泳道1為VEGF165PCR產(chǎn)物，泳道2為DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)品。圖2. pPICZ α /VEGF165-Melittin表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定圖，泳道1為Xho I和Xba I雙酶切的重組質(zhì)粒pPICZ α /VEGF165-Melittin ；泳道2為DNA分子標(biāo)志物；泳道3為未酶切的重組質(zhì)粒。圖3. VEGF165-Hielittin的表達(dá)鑒定圖，其中，泳道1為空載體轉(zhuǎn)化菌株誘導(dǎo)后；泳道3為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品；泳道2、4、5為重組質(zhì)粒pPICZ α /VEGF165-Hielittin轉(zhuǎn)化菌株誘導(dǎo)后的條帶。圖 4. VEGF165-Hielittin 的純化及 western-blotting 鑒定圖。其中，圖 A 為純化后的VEGF165-Hielittin鑒定圖譜，泳道1為純化的VEGF165-Hielittin，泳道2為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品；圖B為western-blotting鑒定圖，泳道1為空載體轉(zhuǎn)化菌株誘導(dǎo)后蛋白檢測(cè)， 泳道2、3為純化VEGF165-Hielittin蛋白檢測(cè)。圖 5. RT-PCR 檢測(cè)腫瘤細(xì)胞系 AsPC-1、MHCC97-H 禾Π HepG-2 中 VEGF、VEGFRl、 VEGFR2的表達(dá)情況。圖6. MTT法測(cè)定VEGF-Melittin融合毒素對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，其中為A肝癌細(xì)胞H印G-2、B為胰腺癌細(xì)胞AsPC-I，C為肝癌細(xì)胞MHCC97-H。
具體實(shí)施例方式以下借助實(shí)施例描述本發(fā)明的最佳實(shí)施方式。這些實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例闡明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明待批權(quán)利要求的范圍。實(shí)施例1
(1)取VEGF高表達(dá)的肝癌細(xì)胞H印G2，使用Trizol試劑(Invitrogen Corp. San Diego, California, USA.)，以一步法提取總RNA。具體步驟如下具體地說(shuō)，將培養(yǎng)狀態(tài)良好的 HepG2細(xì)胞計(jì)數(shù)后，約IO6 IO7個(gè)細(xì)胞加入ImL Trizol，然后移入1. 5mL無(wú)RNA酶EP管中。再加入200 μ L氯仿，劇烈振蕩搖勻，室溫下放置30秒。4°C離心(12 000 r/min) 5分鐘后，將上清液小心轉(zhuǎn)移到另一個(gè)無(wú)RNA酶的EP管中。向其中加入等體積異丙醇，室溫放置5分鐘，并于4°C離心(12 000 r/min) 5分鐘，棄去上清。加入70% (體積)乙醇ImL洗滌沉淀兩次，4°C離心(12 000 r/min) 5分鐘。室溫下空氣蒸發(fā)殘存乙醇后，將沉淀溶于50 μ L DEPC水中，進(jìn)行RNA的分析與定量，取1 μ L樣品稀釋100倍后經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定0擬60 和0擬80，按下列公式計(jì)算其濃度和純度RNA含量ΚΝΑ(μβ/πιυ=40Χ0^60Χ稀釋倍數(shù)， 0D260/0D280=1. 8 2. 0表示純度合格。以瓊脂糖凝膠電泳法，觀察RNA的完整性。(2) RT-PCR 法克隆人 VEGF165 基因取如上提取的總 RNA lyg，WAlyL Oligo dT，70°C 變性 lOmin，冰浴 Imin ；然后加入 10XRNA PCR 緩沖液 2yL，MgCl2 (25 mmol/L) 4μ L, RNA 酶抑制劑 QOU/μ L)0. 5μ L，dNTPs (各 10mmol/L) 2 μ L，AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 QOOU/ μ L) 1 μ L，Oligo dT (20pmol/μ L) 1 μ L，無(wú)RNA酶滅菌水加入至終體積20 μ L，建立逆轉(zhuǎn)錄 (RT)反應(yīng)體系。于PCR儀上42 °C反應(yīng)60分鐘，然后99 °C 5分鐘使逆轉(zhuǎn)錄酶滅活，合成cDNA。通過在NCBI上搜索到VEGF165的序列(序列號(hào)NM_001204384. 1)，設(shè)計(jì)上游引物 5，-AAT CTC GAG AAC TTT CTG CTG TCT TGG G_3，( SEQ ID N0:4)，下游引物 5，-AAT GAA TTC CCG CCT CGG CTT GTC ACA T-3，( SEQ ID N0:5);委托上海英駿公司合成。再按如下 PCR 體系擴(kuò)增 VEGF165 基因上述 cDNA 反應(yīng)液 20 μ L ；MgCl2 (25 mmol/L) 6 μ L ； 10 X LA PCR 緩沖液 8 μ L ；上游引物 1 μ L (20pmol/μ L)；下游引物 1 μ L (20pmol/μ L) ；TaKaRa LA Taq (5U/ μ L) 1 μ L ；滅菌超純水至終體積 100 μ L0 PCR 條件是 94°C，5min，94°C，30s， 57°C，lmin，72°C，30s，35個(gè)循環(huán)，72°C，IOmin ；1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察片段大小與預(yù)計(jì)產(chǎn)物大小是否相吻合，擴(kuò)增結(jié)果見圖1，可見約500bp條帶。(3)克隆載體的構(gòu)建與鑒定回收RT-PCR擴(kuò)增的人VEGF165基因片段后，與T載體 16°C連接30分鐘。連接反應(yīng)體系包括人VEGF165基因RT-PCR產(chǎn)物0. 1 0. 3pmol ；T載體 0. 03pmol ；溶液I (含DNA連接酶和連接緩沖液，見Takara公司T載體試劑盒)5 μ L ；滅菌超純水至終體積10 μ L0按照常規(guī)方法，制備大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，加入上述連接產(chǎn)物，進(jìn)行常規(guī)方法轉(zhuǎn)化。然后取200 μ L已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布于含X-Gal、IPTG和氨芐青霉素(100 μ g/ mL)的LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 16小時(shí)。隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化后的白色單菌落(藍(lán)白篩選)，接種于含氨芐青霉素(100yg/mL)的 LB培養(yǎng)基中，37°C強(qiáng)烈震蕩培養(yǎng)過夜，然后常規(guī)提取質(zhì)粒DNA。取1 μ L溶解的DNA沉淀物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳定量分析和酶切鑒定。37°C下用ZAo I和I雙酶切鑒定消化2
7小時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳后根據(jù)內(nèi)切酶譜鑒定為正確克隆。挑選酶切鑒定正確的克隆，提取質(zhì)粒，用于DNA測(cè)序分析。(4)人工合成沈肽臨1丨《^1基因，N端攜帶(GGGGQ2柔性短肽，兩端分別攜帶酶切位點(diǎn)和損a I，以供與VEGF融合后連接表達(dá)載體pPICZ α構(gòu)建重組載體pPICZ α / melittin，并且我們?cè)谶B接肽與melittin之間引入酶切位點(diǎn)如al，以便可以將融合毒素分子中的VEGF165與蜂毒素的連接次序進(jìn)行互換。feoRI和損al雙酶切上述人工合成基因后與同樣雙酶切的PPICZ α載體進(jìn)行常規(guī)連接，16°C連接過夜后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，Zeocin抗生素(25yg/mL)抗性篩選，隨機(jī)挑取陽(yáng)性克隆接種于5mL LB培養(yǎng)基中，37°C 震蕩培養(yǎng)過夜，然后常規(guī)提取質(zhì)粒DNA。瓊脂糖凝膠電泳定量分析和酶切鑒定(37°C下用損ο I和I雙酶切鑒定，消化2小時(shí))。挑選酶切鑒定正確的克隆，提取質(zhì)粒，用于 DNA測(cè)序分析。(5)切膠回收經(jīng)PCR擴(kuò)增后的VEGF165基因，用feoR I和煬ο I雙酶切VEGF165基因后和同樣雙酶切的pPICZ α /melittin重組載體按照常規(guī)方法連接，并轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，在平板上隨機(jī)挑選幾個(gè)克隆，抽提質(zhì)粒，用損ο I和損al雙酶切鑒定重組子pPICZ α / VEGF165-melittin，鑒定結(jié)果見圖2，泳道3為未酶切的重組質(zhì)粒，可見約750bp的條帶，同時(shí)重組子通過北京六合華大公司測(cè)序確定序列準(zhǔn)確度，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)一致。(6)取測(cè)序正確的培養(yǎng)菌液，按質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒DNA并用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行定量分析。取20 25 μ g表達(dá)載體pPICZ α /VEGF165IeIittin，經(jīng)Sac I 酶消化(線性化)后用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。線性化的質(zhì)粒用10 μ L超純水溶解后置冰上備用。從畢赤酵母Χ-33的YPD陰性培養(yǎng)板上(不含抗生素的YPD瓊脂平板)挑取單個(gè)菌落，接種于5mL YPD培養(yǎng)基中，250rpm, 30°C震蕩培養(yǎng)8小時(shí)，常規(guī)方法制備酵母感受態(tài)細(xì)胞。然后取80 μ L上述感受態(tài)細(xì)胞，與20 25 μ g線性化的重組表達(dá)質(zhì)?；旌希迫?0. 2cm電轉(zhuǎn)化杯內(nèi)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。取50 100 μ L轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含kocin(100 μ g/mL) 的YPD平板上，30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 3天，觀察轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)狀況。然后用PCR方法(所使用的引物為上游引物5，-AAC TTT CTG CTG TCT TGG G -3，<SEQ ID N0:6>和下游引物 5，-CCG CCT CGG CTT GTC ACA T-3，<SEQ ID NO: 7>，反應(yīng)條件同上)篩選轉(zhuǎn)化酵母菌。離心回收菌體后，以玻璃珠法提取酵母基因組DNA并進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否得到預(yù)期大小的基因片段。(7)融合毒素VEGF165-Hielittin的表達(dá)、鑒定取上述鑒定結(jié)果陽(yáng)性的克隆接種于 IOmL BMGY (pH 6. 0)培養(yǎng)基中，28°C震蕩培養(yǎng)24小時(shí)，至OD600達(dá)到2. 0 6. 0時(shí)收集細(xì)胞。用等體積(IOmL) BMMY (pH 6.0)重懸細(xì)胞沉淀，28°C震蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)，在培養(yǎng)的第0、24、48、72、96、120、144和168小時(shí)等時(shí)間點(diǎn)各取0. 5mL發(fā)酵液，離心收集上清，加入樣品緩沖液制備電泳樣品，SDS-PAGE^estern-blotting鑒定重組融合蛋白的分泌表達(dá)，鑒定結(jié)果見圖3，圖3顯示誘導(dǎo)后的融合毒素蛋白表達(dá)條帶約^kD。同時(shí)，在誘導(dǎo)過程中，每M 小時(shí)補(bǔ)充一次甲醇至終濃度0. 5%，同時(shí)補(bǔ)充滅菌超純水，使發(fā)酵液總體積保持不變。(8)融合毒素的western-blotting鑒定表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，然后用封閉液(TBS + 1%吐溫20 + 10%脫脂奶粉)封閉池，接著分別與兔抗VEGF蛋白抗體、兔抗melittin抗體(用封閉液按1:2500的比例稀釋)在4°C反應(yīng)過夜，用洗脫液 (TBS + 1%吐溫20)洗膜5次；然后加入封閉液稀釋的羊抗兔(1: 6000)，室溫反應(yīng)1 h ，用洗脫液洗膜5次；最后將PVDF膜置于含有辣根過氧化物酶底物的顯色液中顯色。(9)挑取表達(dá)量高的重組子，按1%接種量將其接入裝有5mL YPD培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，過夜，次日按1%轉(zhuǎn)接至500mL BMGY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至0D_達(dá)到2. 0 6. 0，用等體積 BMMY (pH 6.0)重懸細(xì)胞沉淀，28°C震蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)96小時(shí)時(shí)收集發(fā)酵液，離心收集上清。(10)融合毒素的純化(Ni柱親和層析結(jié)合超濾膜超濾、透析)
a、用去離子水洗柱料；加入0. 5倍柱床體積0. IM硫酸鎳，充分振蕩柱料；加入5倍體積去離子水洗柱，重復(fù)2遍后，平衡緩沖液平衡，破碎上清樣品以0. 5mL/min上樣，然后分管收集；1. 5倍樣品體積平衡緩沖液洗去未吸附的樣品，流速l-2mL/min，分管收集；用1/2倍體積洗脫緩沖液洗脫，流速l-2mL/min，分管收集流出峰。SDS-PAGE、western-blotting電泳檢測(cè)純化蛋白VEGF165-melittin，鑒定結(jié)果見圖4。b、蛋白通過分子量10000道爾頓的超濾膜超濾，然后采用IOmM Tris · HCl，150mM NaCl透析后，凍干。(11) MTT法測(cè)定融合毒素VEGF165-Hie 1 ittin對(duì)肝癌細(xì)胞H印G-2、胰腺癌細(xì)胞 AsPC-I和肝癌細(xì)胞MHCC97-H生長(zhǎng)的抑制作用
分別取指數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞H印G-2、胰腺癌細(xì)胞AsPC-I和肝癌細(xì)胞MHCC97-H (1 X IO4)接種96孔板。每種細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組加入VEGF165-melittin，濃度分另Ij為 0. 2μ g/mL、0. 4μ g/mL、0. 8μ g/mL、l. 6μ g/mL、3. 2μ g/mL、6. 4μ g/mL、12. 8μ g/mL， 每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入10%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)液至等體積。放入37°C， 5% CO2孵箱培養(yǎng)。M小時(shí)后取出96孔板，向各孔內(nèi)加入MTT溶液20 μ L (5 mg/mL),37°C 5% CO2孵育4小時(shí)后終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入100 μ L DMS0，振蕩10分鐘。待沉淀完全溶解后在Bio-red 550酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度值(0D值)。按下列公式分別計(jì)算兩組在不同濃度VEGF165-Hielittin作用后的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(三次重復(fù)的平均值)。 以細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率對(duì)藥物濃度做曲線，求出IC50。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(％)=(對(duì)照組細(xì)胞OD 值一實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞OD值)/對(duì)照組細(xì)胞OD值X 100%。圖5為VEGF、VEGFRU VEGFR2表達(dá)的半定量RT-PCR檢測(cè)圖譜。分別檢測(cè)了三株腫瘤細(xì)胞系(人胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-I、人肝癌細(xì)胞系MHCC97-H和H印G-2)中VEGF、VEGFR1、 VEGFR2的表達(dá)，結(jié)果顯示三株細(xì)胞系中均呈現(xiàn)VEGF的高表達(dá)，并且VEGFRl、VEGFR2的表達(dá)情況有所不同其中AsPC-I胰腺癌細(xì)胞和MHCC97-H肝癌細(xì)胞中VEGFRl的表達(dá)均呈陽(yáng)性， 同時(shí)MHCC97-H中VEGFR2的表達(dá)也呈陽(yáng)性，而H印G-2肝癌細(xì)胞中只有VEGFR2呈陽(yáng)性。純化VEGF165-Hielittin蛋白與肝癌細(xì)胞H印G-2、胰腺癌細(xì)胞AsPC-I和肝癌細(xì)胞 MHCC97-H共孵育后，MTT法測(cè)定VEGF165-Hielittin融合毒素對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用結(jié)果如圖6所示?？梢奦EGF165-Hielittin對(duì)VEGFR2高表達(dá)的肝癌細(xì)胞H印G-2生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng)；對(duì)VEGFRl高表達(dá)而VEGFR2表達(dá)相對(duì)較低的肝癌細(xì)胞MHCC97-H的生長(zhǎng)抑制作用次之；而VEGFRl高表達(dá)，VEGFR 2陰性表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞AsPC-I的生長(zhǎng)情況與對(duì)照組相比最弱。結(jié)果顯示，重組融合毒素VEGF165-Hielittin具有良好的腫瘤細(xì)胞殺傷作用，并且對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性顯示出靶向作用于VEGFR2的特征。
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上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種重組融合毒素VEGF165-Hielittin，其特征在于是通過連接肽在蜂毒素短肽 melittin的氨基端連接VEGF165得到，或通過連接肽在VEGF165的氨基端連接蜂毒素短肽 melittin得到；所述連接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組融合毒素VEGF165-melittin，其特征在于其氨基酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。
3.權(quán)利要求1或2所述重組融合毒素VEGF165-Hielittin的編碼基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述重組融合毒素VEGF165-Hielittin的編碼基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.權(quán)利要求1或2所述重組融合毒素VEGF165-Hielittin的表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其特征在于是由權(quán)利要求3所述重組融合毒素 VEGF165-Hielittin的編碼基因插入出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)得到，所述出發(fā)載體為pPICh， pPIC9 或pHIL-sl。
7.含有權(quán)利要求5所述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
8.含有權(quán)利要求5所述表達(dá)載體的宿主菌。
9.一種重組融合毒素VEGF165-Hielittin的制備方法，其特征在于步驟如下(1)以SEQID NO:4 5為引物，擴(kuò)增VEGF165基因；(2)合成蜂毒素短肽melittin基因，兩端分別連接限制性酶切位點(diǎn)和損al，連接到載體pPICZa的多克隆位點(diǎn)，得到重組載體；(3)分別用和損ol對(duì)VEGF165基因和重組載體進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物連接后，電穿孔法轉(zhuǎn)化宿主畢赤酵母菌，構(gòu)建VEGF165-Melittin基因工程菌；(4)培養(yǎng)VEGF165-Melittin基因工程菌，培養(yǎng)基為BMGY培養(yǎng)基，28°C下培養(yǎng)，誘導(dǎo)其產(chǎn)生可溶性重組融合蛋白VEGF165-Melittin ；(5)將步驟(4)的培養(yǎng)物離心、收集上清，進(jìn)行親和柱層析純化VEGF165-Melittin蛋白， 柱層析所述填料為Ni-NTA樹脂，吸附條件為pH 5. 5^8. 5之間，洗脫條件為降低pH、逐步提高咪唑的濃度或加入EDTA或者EGTA，pH在4 6之間，咪唑濃度為0. 02 0. 5M ；(6)采用分子量1000道爾頓的超濾膜超濾，采用半透膜透析，透析液為IOmMTris -HCl 禾口 150mM NaCl、凍干得到 VEGF165-Melittin 蛋白。
10.權(quán)利要求1或2所述重組融合毒素VEGF165-Hielittin在制備靶向抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了重組融合毒素VEGF165-melittin及其制備方法和應(yīng)用，屬于基因工程藥物領(lǐng)域。本發(fā)明通過連接肽將VEGF165與小分子毒素melittin融合，構(gòu)建新型重組毒素VEGF165-melittin，可通過巴氏畢赤酵母進(jìn)行可溶性表達(dá)。經(jīng)檢測(cè)，本發(fā)明的VEGF165-melittin同時(shí)具備與腫瘤細(xì)胞的VEGFR、EGFR結(jié)合，釋放蜂毒素殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，并且當(dāng)VEGF165-melittin與VEGFR、EGFR結(jié)合后，阻斷VEGF/VEGFR信號(hào)的酪氨酸激酶活化作用，阻斷多種VEGFs、EGFs過強(qiáng)信號(hào)，最終達(dá)到抑制腫瘤的增殖、遷移，尤其抑制新生血管的生成的作用，為腫瘤的治療開辟一個(gè)全新的設(shè)計(jì)思路與途徑。
文檔編號(hào)C07K1/36GK102558359SQ20121001056
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月14日
發(fā)明者孫艷, 王丁丁, 胡麗莉, 黃宏靚 申請(qǐng)人:廣東藥學(xué)院