專利名稱：草原瘋草毒素疫苗的制作方法
一、所屬領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物化學(xué)合成的一種植物毒素疫苗，涉及到毒理學(xué)、有機(jī)合成和免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種草原瘋草毒素疫苗。背景技術(shù)：
瘋草是豆科黃芪屬和棘豆屬有毒植物的總稱，也是世界范圍內(nèi)危害草原畜牧業(yè)最嚴(yán)重的一類(lèi)毒草。在我國(guó)，瘋草廣泛分布于西北、華北、西南的廣大牧區(qū)，危害面積達(dá)400萬(wàn)公頃。瘋草所含主要有毒成分吲哚茲定生物堿—苦馬豆素(swainsonine，SW)，能導(dǎo)致大批動(dòng)物中毒死亡，更為嚴(yán)重的是引起母畜流產(chǎn)、不孕、胎兒畸形和公畜不育，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。盡管近20年來(lái)國(guó)內(nèi)外在瘋草的有毒成分、毒理機(jī)制、化學(xué)防除等方面取得了一定進(jìn)展，但迄今還沒(méi)有特效的防治動(dòng)物瘋草中毒的方法，致使瘋草中毒問(wèn)題日趨嚴(yán)重，成為草原畜牧業(yè)地大患。
目前，國(guó)內(nèi)外所采取的防治動(dòng)物瘋草中毒的方法包括
①禁止在瘋草多的草場(chǎng)放牧動(dòng)物。
②人工挖除。為了創(chuàng)建安全牧場(chǎng)，可以人工將瘋草挖除，由于發(fā)芽部位多在地表下2m-3m深處，而且瘋草的再生能力很強(qiáng)，只有挖除的深度達(dá)到地下10m，瘋草才不會(huì)再度發(fā)芽。由于瘋草落入土壤的種子可數(shù)年不失發(fā)芽能力，因此挖除應(yīng)在結(jié)莢前進(jìn)行，并要連續(xù)挖除幾年才能根除。也可深翻后種植其它優(yōu)良牧草，達(dá)到以草治草的目的。
③化學(xué)防除。從1952年開(kāi)始，美國(guó)就多次報(bào)道用2，4-D丁酯滅除蘭伯氏棘豆和絹毛棘豆。我國(guó)也先后用2，4-D丁酯滅除莖直黃芪、甘肅棘豆、黃花棘豆、小花棘豆、毛瓣棘豆和冰川棘豆。但是結(jié)果都不理想，因其不能殺死瘋草的地下發(fā)芽點(diǎn)，所以翌年又會(huì)再生，而且對(duì)其它牧草藥害也較重。
百草敵單獨(dú)使用，對(duì)黃花棘豆的防除效果為80％左右，不甚理想，但對(duì)其它牧草安全性好。
李建科等篩選出JDC-II藥劑，殺滅棘豆草的效果可達(dá)100％，并且可以使根部腐爛。缺點(diǎn)是對(duì)伴生牧草有一定的殺傷作用。
瘋草屬豆科植物，除含有毒素外，還具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，粗蛋白的含量在12％-20％，上述的方法都不能合理利用瘋草，變廢為寶，變害為利，使動(dòng)物能充分利用我國(guó)豐富的瘋草資源。瘋草的抗逆性強(qiáng)，能抗干旱、抗風(fēng)沙、耐寒冷，特別適合于我國(guó)西部的草原生長(zhǎng)。目前所采用的人工挖除和化學(xué)防除的方法，會(huì)使草原進(jìn)一步沙漠化，破壞草原生態(tài)系統(tǒng)，化學(xué)防除還會(huì)有大量的藥物殘留，給環(huán)境帶來(lái)污染。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種應(yīng)用毒理學(xué)、免疫學(xué)及有機(jī)化學(xué)的原理制備的草原瘋草毒素疫苗。用該疫苗接種動(dòng)物，達(dá)到兩個(gè)目的一是，獲得高滴度的抗苦馬豆素抗血清，建立分析苦馬豆素特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便的分析方法。二是，使動(dòng)物獲得瘋草毒素的免疫力并在采食瘋草時(shí)得到保護(hù)，這樣不僅可以大大減少瘋草造成的損失，而且動(dòng)物還可以安全利用瘋草資源。動(dòng)物安全利用了瘋草，不僅能變害為利、變廢為寶，而且也控制了瘋草的蔓延，保護(hù)了環(huán)境，從而獲得巨大的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，首先將溴乙酸與N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)成活性酯，再與苦馬豆素合成為N-羧甲基苦馬豆素，最后與牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)縮合成為SW-BSA，透析后冰凍干燥，完全福氏佐劑乳化即為SW疫苗。
具體制備按以下步驟進(jìn)行
第一步，SW—活性酯(季銨鹽)的合成
反應(yīng)式
操作程序?yàn)槿W 17.3mg～173mg(0.1mmol～1mmol)在干燥的丙酮液中完全溶解后，加入用溴乙酸制備的活性酯23.6mg～236mg(0.1mmol～1mmol)，80±5℃攪拌回流反應(yīng)9±0.5h，過(guò)濾，丙酮洗滌，五氧化二磷真空干燥。計(jì)算產(chǎn)率。MP、IR、元素分析鑒定。
第二步，SW—BSA的合成
反應(yīng)式
操作程序?yàn)槿【頑SA 167.5mg～1675mg(0.0025mmol～0.025mmol)，完全溶于4～20mL蒸餾水后，加入制備的季銨鹽40.9mg～409mg(0.1mmol～1mmol)，冰浴攪拌反應(yīng)18±0.5h。測(cè)定結(jié)合率后反應(yīng)產(chǎn)物裝入透析袋中，蒸餾水中透析24±0.5h，中間更換3次蒸餾水。凍干透析袋中共軛物。計(jì)算產(chǎn)率。
第三步，SW—BSA的結(jié)合率計(jì)算
分別按季銨鹽與BSA(牛血清白蛋白)80∶1、60∶1、40∶1、20∶1和10∶1摩爾比12±0.5h完成合成反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)p-Amino Benzmidine-4B凝膠(LKB)過(guò)柱分離(柱體積25cm3；上樣量每次0.7mL；蒸餾水洗脫，洗脫速度0.2mL/cm2.min)，得到合成物、未反應(yīng)的BSA及未反應(yīng)的季銨鹽，并分別進(jìn)行定量分析。
第四步，完全福氏佐劑乳化合成物，凍干得到SW-BSA疫苗。具體實(shí)施例方式
為了更清楚的理解本發(fā)明，以下結(jié)合發(fā)明人給出的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
實(shí)施例1按照本發(fā)明的技術(shù)方案，制備草原瘋草毒素疫苗，按以下步驟進(jìn)行
第一步，SW—活性酯(季銨鹽)的合成
反應(yīng)式
操作程序?yàn)槿W 17.3mg(0.1mmol)在干燥的丙酮液中完全溶解后，加入用溴乙酸制備的活性酯23.6mg(0.1mmol)，80℃攪拌回流反應(yīng)9h，過(guò)濾，丙酮洗滌，五氧化二磷真空干燥。計(jì)算產(chǎn)率。MP、IR、元素分析鑒定。
第二步，SW—BSA的合成
反應(yīng)式
操作程序?yàn)槿【頑SA 167.5mg(0.0025mmol)，完全溶于4mL蒸餾水后，加入制備的季銨鹽40.9mg(0.1mmol)，冰浴攪拌反應(yīng)18h。測(cè)定結(jié)合率后反應(yīng)產(chǎn)物裝入透析袋中，蒸餾水中透析24h，中間更換3次蒸餾水。凍干透析袋中共軛物。計(jì)算產(chǎn)率。
第三步，SW—BSA的結(jié)合率計(jì)算
分別按季銨鹽與BSA(牛血清白蛋白)80∶1、60∶1、40∶1、20∶1和10∶1摩爾比12h完成合成反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)p-Amino Benzmidine-4B凝膠(LKB)過(guò)柱分離(柱體積25cm3；上樣量每次0.7mL；蒸餾水洗脫，洗脫速度0.2mL/cm2.min)，得到合成物、未反應(yīng)的BSA及未反應(yīng)的季銨鹽，并分別進(jìn)行定量分析。
第四步，完全福氏佐劑乳化合成物，凍干得到SW-BSA疫苗。
實(shí)施例2按照本發(fā)明的技術(shù)方案，制備草原瘋草毒素疫苗，按以下步驟進(jìn)行
第一步，SW—活性酯(季銨鹽)的合成
反應(yīng)式
操作程序?yàn)槿W 34.6mg(0.2mmol)在干燥的丙酮液中完全溶解后，加入用溴乙酸制備的活性酯47.2mg(0.1mmol)，75℃攪拌回流反應(yīng)9.5h，過(guò)濾，丙酮洗滌，五氧化二磷真空干燥。計(jì)算產(chǎn)率。MP、IR、元素分析鑒定。
第二步，SW—BSA的合成
反應(yīng)式
操作程序?yàn)槿【頑SA335mg(0.005mmol)，完全溶于6mL蒸餾水后，加入制備的季銨鹽81.8mg(0.2mmol)，冰浴攪拌反應(yīng)18.5h。測(cè)定結(jié)合率后反應(yīng)產(chǎn)物裝入透析袋中，蒸餾水中透析24.5h，中間更換3次蒸餾水。凍干透析袋中共軛物。計(jì)算產(chǎn)率。
第三步，SW—BSA的結(jié)合率計(jì)算
分別按季銨鹽與BSA(牛血清白蛋白)80∶1、60∶1、40∶1、20∶1和10∶1摩爾比12.5h完成合成反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)p-Amino Benzmidine-4B凝膠(LKB)過(guò)柱分離(柱體積25cm3；上樣量每次0.7mL；蒸餾水洗脫，洗脫速度0.2mL/cm2.min)，得到合成物、未反應(yīng)的BSA及未反應(yīng)的季銨鹽，并分別進(jìn)行定量分析。
第四步，完全福氏佐劑乳化合成物，凍干得到SW-BSA疫苗。
實(shí)施例3按照本發(fā)明的技術(shù)方案，制備草原瘋草毒素疫苗，按以下步驟進(jìn)行
第一步，SW—活性酯(季銨鹽)的合成
反應(yīng)式
操作程序?yàn)槿W 86.5mg(0.5mmol)在干燥的丙酮液中完全溶解后，加入用溴乙酸制備的活性酯118mg(0.5mmol)，85℃攪拌回流反應(yīng)8.5h，過(guò)濾，丙酮洗滌，五氧化二磷真空干燥。計(jì)算產(chǎn)率。MP、IR、元素分析鑒定。
第二步，SW—BSA的合成
反應(yīng)式
操作程序?yàn)槿【頑SA 837.5mg(0.0125mmol)，完全溶于16mL蒸餾水后，加入制備的季銨鹽204.5mg(0.5mmol)，冰浴攪拌反應(yīng)17.5h。測(cè)定結(jié)合率后反應(yīng)產(chǎn)物裝入透析袋中，蒸餾水中透析23.5h，中間更換3次蒸餾水。凍干透析袋中共軛物。計(jì)算產(chǎn)率。
第三步，SW—BSA的結(jié)合率計(jì)算
分別按季銨鹽與BSA(牛血清白蛋白)80∶1、60∶1、40∶1、20∶1和10∶1摩爾比11.5h完成合成反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)p-Amino Benzmidine-4B凝膠(LKB)過(guò)柱分離(柱體積25cm3；上樣量每次0.7mL；蒸餾水洗脫，洗脫速度0.2mL/cm2.min)，得到合成物、未反應(yīng)的BSA及未反應(yīng)的季銨鹽，并分別進(jìn)行定量分析。
第四步，完全福氏佐劑乳化合成物，凍干得到SW-BSA疫苗。
實(shí)施例4按照本發(fā)明的技術(shù)方案，制備草原瘋草毒素疫苗，按以下步驟進(jìn)行第一步，SW—活性酯(季銨鹽)的合成
反應(yīng)式
操作程序?yàn)槿W 173mg(1mmol)在干燥的丙酮液中完全溶解后，加入用溴乙酸制備的活性酯236mg(1mmol)，80℃攪拌回流反應(yīng)9h，過(guò)濾，丙酮洗滌，五氧化二磷真空干燥。計(jì)算產(chǎn)率。MP、IR、元素分析鑒定。
第二步，SW—BSA的合成
反應(yīng)式
操作程序?yàn)槿【頑SA 1675mg(0.025mmol)，完全溶于20mL蒸餾水后，加入制備的季銨鹽409mg(1mmol)，冰浴攪拌反應(yīng)18h。測(cè)定結(jié)合率后反應(yīng)產(chǎn)物裝入透析袋中，蒸餾水中透析24h，中間更換3次蒸餾水，凍干透析袋中共軛物，計(jì)算產(chǎn)率。
第三步，SW—BSA的結(jié)合率計(jì)算
分別按季銨鹽與BSA(牛血清白蛋白)80∶1、60∶1、40∶1、20∶1和10∶1摩爾比12±0.5h完成合成反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)p-Amino Benzmidine-4B凝膠(LKB)過(guò)柱分離(柱體積25cm3；上樣量每次0.7mL；蒸餾水洗脫，洗脫速度0.2mL/cm2.min)，得到合成物、未反應(yīng)的BSA及未反應(yīng)的季銨鹽，并分別進(jìn)行定量分析。
第四步，完全福氏佐劑乳化合成物，凍干得到SW-BSA疫苗。
上述實(shí)施例只是本發(fā)明較優(yōu)的例子，按照本發(fā)明制備的草原瘋草毒素疫苗與現(xiàn)有技術(shù)相比有如下的明顯效果
1)SW—活性酯(季銨鹽)的合成結(jié)果
用溴乙酸制備的活性酯與SW的反應(yīng)，產(chǎn)物真空干燥后得到白色粉末狀物，產(chǎn)率為77％，具有很強(qiáng)的吸水性，MP為324～325℃，IRmax(KBr壓片)3335.75(-OH吸收峰)，2941.55(CH吸收峰)，2703.65、2562.92(-CH2CO-O-吸收帶)，1759.82、1722.99(母核吸收帶)，1082.51(C-O吸收峰)。產(chǎn)物所有基團(tuán)在圖中都有出峰。元素分析結(jié)果見(jiàn)表1。N、C和H的理論和測(cè)定百分含量之差分別為0.07％、0.11％和0.09％，均在誤差范圍內(nèi)。
表1季銨鹽元素分析結(jié)果
數(shù)值 N％ C％ H％
理論值6.85 41.085.13
測(cè)定值6.78 40.975.22
差值 0.07 0.11 0.09
根據(jù)MP測(cè)定、IR鑒定和元素分析結(jié)果判定，白色粉末狀物即為所要制備的季銨鹽。
2)SW—BSA的合成結(jié)果
透析袋中的共軛物凍干后呈白色針狀結(jié)晶，按BSA計(jì)算，產(chǎn)率為61％～65％。
3)SW—BSA的結(jié)合率計(jì)算結(jié)果
分別按季銨鹽與BSA(牛血清白蛋白)10∶1、20∶1、40∶1、60∶1和80∶1摩爾比12h完成合成反應(yīng)，測(cè)得季銨鹽濃度為2.344mg/mL、4.688mg/mL、9.375mg/mL、12.500mg/mL、18.750mg/mL時(shí)A259處吸光值0.10、0.20、0.64、0.76、0.86。作標(biāo)準(zhǔn)曲線。合成的SW-BSA在A259處吸光值為0.182，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得到它的濃度為4.266mg/mL，產(chǎn)物的摩爾比(結(jié)合率)為18.2∶1，即平均每個(gè)BSA分子上結(jié)合了18.2個(gè)季銨鹽分子。
4)SW-BSA疫苗
凍干得到的SW-BSA疫苗技術(shù)性能指標(biāo)見(jiàn)表2。
表2 SW-BSA疫苗技術(shù)性能指標(biāo)
權(quán)利要求
1.一種草原瘋草毒素疫苗，其特征在于，首先將溴乙酸與N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)成活性酯，再與苦馬豆素合成為N-羧甲基苦馬豆素，最后與牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)縮合成為SW-BSA，透析后冰凍干燥，完全福氏佐劑乳化即為SW疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草原瘋草毒素疫苗，其特征在于，具體制備按以下步驟進(jìn)行
第一步，SW—活性酯(季銨鹽)的合成
反應(yīng)式
操作程序?yàn)槿W 17.3mg～173mg(0.1mmol～1mmol)在干燥的丙酮液中完全溶解后，加入用溴乙酸制備的活性酯23.6mg～236mg(0.1mmol～1mmol)，80±5℃攪拌回流反應(yīng)9±0.5h，過(guò)濾，丙酮洗滌，五氧化二磷真空干燥。計(jì)算產(chǎn)率。MP、IR、元素分析鑒定；
第二步，SW—BSA的合成
反應(yīng)式
操作程序?yàn)槿【頑SA 167.5mg～1675mg(0.0025mmol～0.025mmol)，完全溶于4～20mL蒸餾水后，加入制備的季銨鹽40.9mg～409mg(0.1mmol～1mmol)，冰浴攪拌反應(yīng)18±0.5h。測(cè)定結(jié)合率后反應(yīng)產(chǎn)物裝入透析袋中，蒸餾水中透析24±0.5h，中間更換3次蒸餾水。凍干透析袋中共軛物。計(jì)算產(chǎn)率。
第三步，SW—BSA的結(jié)合率計(jì)算
分別按季銨鹽與BSA(牛血清白蛋白)80∶1、60∶1、40∶1、20∶1和10∶1摩爾比12±0.5h完成合成反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)p-Amino Benzmidine-4B凝膠(LKB)過(guò)柱分離(柱體積25cm3；上樣量每次0.7mL；蒸餾水洗脫，洗脫速度0.2mL/cm2.min)，得到合成物、未反應(yīng)的BSA及未反應(yīng)的季銨鹽，并分別進(jìn)行定量分析。
第四步，完全福氏佐劑乳化合成物，凍干得到SW-BSA疫苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草原瘋草毒素疫苗，其特征在于，具體制備按以下步驟進(jìn)行
第一步，SW—活性酯(季銨鹽)的合成
反應(yīng)式
操作程序?yàn)槿W 17.3mg(0.1mmol)在干燥的丙酮液中完全溶解后，加入用溴乙酸制備的活性酯23.6mg(0.1mmol)，80℃攪拌回流反應(yīng)9h，過(guò)濾，丙酮洗滌，五氧化二磷真空干燥，計(jì)算產(chǎn)率，MP、IR、元素分析鑒定。
第二步，SW—BSA的合成
反應(yīng)式
操作程序?yàn)槿【頑SA 167.5mg(0.0025mmol)，完全溶于4mL蒸餾水后，加入制備的季銨鹽40.9mg(0.1mmol)，冰浴攪拌反應(yīng)18h。測(cè)定結(jié)合率后反應(yīng)產(chǎn)物裝入透析袋中，蒸餾水中透析24h，中間更換3次蒸餾水；凍干透析袋中共軛物；計(jì)算產(chǎn)率。
第三步，SW—BSA的結(jié)合率計(jì)算
分別按季銨鹽與BSA(牛血清白蛋白)80∶1、60∶1、40∶1、20∶1和10∶1摩爾比12h完成合成反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)p-Amino Benzmidine-4B凝膠(LKB)過(guò)柱分離(柱體積25cm3；上樣量每次0.7mL；蒸餾水洗脫，洗脫速度0.2mL/cm2.min)，得到合成物、未反應(yīng)的BSA及未反應(yīng)的季銨鹽，并分別進(jìn)行定量分析；
第四步，完全福氏佐劑乳化合成物，凍干得到SW-BSA疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草原瘋草毒素疫苗，其特征在于，具體制備按以下步驟進(jìn)行
第一步，SW—活性酯(季銨鹽)的合成
反應(yīng)式
操作程序?yàn)槿W 34.6mg(0.2mmol)在干燥的丙酮液中完全溶解后，加入用溴乙酸制備的活性酯47.2mg(0.1mmol)，75℃攪拌回流反應(yīng)9.5h，過(guò)濾，丙酮洗滌，五氧化二磷真空干燥。計(jì)算產(chǎn)率。MP、IR、元素分析鑒定。
第二步，SW—BSA的合成
反應(yīng)式
操作程序?yàn)槿【頑SA 335mg(0.005mmol)，完全溶于6mL蒸餾水后，加入制備的季銨鹽81.8mg(0.2mmol)，冰浴攪拌反應(yīng)18.5h。測(cè)定結(jié)合率后反應(yīng)產(chǎn)物裝入透析袋中，蒸餾水中透析24.5h，中間更換3次蒸餾水。凍干透析袋中共軛物。計(jì)算產(chǎn)率。
第三步，SW—BSA的結(jié)合率計(jì)算
分別按季銨鹽與BSA(牛血清白蛋白)80∶1、60∶1、40∶1、20∶1和10∶1摩爾比12.5h完成合成反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)p-Amino Benzmidine-4B凝膠(LKB)過(guò)柱分離(柱體積25cm3；上樣量每次0.7mL；蒸餾水洗脫，洗脫速度0.2mL/cm2.min)，得到合成物、未反應(yīng)的BSA及未反應(yīng)的季銨鹽，并分別進(jìn)行定量分析。
第四步，完全福氏佐劑乳化合成物，凍干得到SW-BSA疫苗。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草原瘋草毒素疫苗，其特征在于，具體制備按以下步驟進(jìn)行
第一步，SW—活性酯(季銨鹽)的合成
反應(yīng)式
操作程序?yàn)槿W 86.5mg(0.5mmol)在干燥的丙酮液中完全溶解后，加入用溴乙酸制備的活性酯118mg(0.5mmol)，85℃攪拌回流反應(yīng)8.5h，過(guò)濾，丙酮洗滌，五氧化二磷真空干燥。計(jì)算產(chǎn)率。MP、IR、元素分析鑒定。
第二步，SW—BSA的合成
反應(yīng)式
操作程序?yàn)槿【頑SA 837.5mg(0.0l25mmol)，完全溶于16mL蒸餾水后，加入制備的季銨鹽204.5mg(0.5mmol)，冰浴攪拌反應(yīng)17.5h。測(cè)定結(jié)合率后反應(yīng)產(chǎn)物裝入透析袋中，蒸餾水中透析23.5h，中間更換3次蒸餾水。凍干透析袋中共軛物。計(jì)算產(chǎn)率。
第三步，SW—BSA的結(jié)合率計(jì)算
分別按季銨鹽與BSA(牛血清白蛋白)80∶1、60∶1、40∶1、20∶1和10∶1摩爾比11.5h完成合成反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)p-Amino Benzmidine-4B凝膠(LKB)過(guò)柱分離(柱體積25cm3；上樣量每次0.7mL；蒸餾水洗脫，洗脫速度0.2mL/cm2.min)，得到合成物、未反應(yīng)的BSA及未反應(yīng)的季銨鹽，并分別進(jìn)行定量分析。
第四步，完全福氏佐劑乳化合成物，凍干得到SW-BSA疫苗。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草原瘋草毒素疫苗，其特征在于，具體制備按以下步驟進(jìn)行
第一步，SW—活性酯(季銨鹽)的合成
反應(yīng)式
操作程序?yàn)槿W 173mg(1mmol)在干燥的丙酮液中完全溶解后，加入用溴乙酸制備的活性酯236mg(1mmol)，80℃攪拌回流反應(yīng)9h，過(guò)濾，丙酮洗滌，五氧化二磷真空干燥。計(jì)算產(chǎn)率。MP、IR、元素分析鑒定。
第二步，SW—BSA的合成
反應(yīng)式
操作程序?yàn)槿【頑SA 1675mg(0.025mmol)，完全溶于20mL蒸餾水后，加入制備的季銨鹽409mg(1mmol)，冰浴攪拌反應(yīng)18h；測(cè)定結(jié)合率后反應(yīng)產(chǎn)物裝入透析袋中，蒸餾水中透析24h，中間更換3次蒸餾水，凍干透析袋中共軛物，計(jì)算產(chǎn)率；
第三步，SW—BSA的結(jié)合率計(jì)算
分別按季銨鹽與BSA(牛血清白蛋白)80∶1、60∶1、40∶1、20∶1和10∶1摩爾比12±0.5h完成合成反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)p-Amino Benzmidine-4B凝膠(LKB)過(guò)柱分離(柱體積25cm3；上樣量每次0.7mL；蒸餾水洗脫，洗脫速度0.2mL/cm2.min)，得到合成物、未反應(yīng)的BSA及未反應(yīng)的季銨鹽，并分別進(jìn)行定量分析；
第四步，完全福氏佐劑乳化合成物，凍干得到SW-BSA疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種草原瘋草毒素疫苗，首先將溴乙酸與N－羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)成活性酯，再與苦馬豆素合成為N－羧甲基苦馬豆素，最后與BSA縮合成為SW－BSA，透析后冰凍干燥，完全福氏佐劑乳化得到SW疫苗。該疫苗為白色結(jié)晶，易溶于水，無(wú)沉淀，無(wú)菌，有效含量3mg/ml，免疫有效期12個(gè)月，保護(hù)率達(dá)85％以上。用該疫苗接種動(dòng)物，一是，可以獲得高滴度的抗苦馬豆素抗血清，建立分析苦馬豆素特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便的分析方法。二是，使動(dòng)物獲得免疫力并在采食瘋草時(shí)得到保護(hù)，這樣不僅可以大大減少瘋草造成的損失，而且動(dòng)物還可以安全利用瘋草資源。不僅能變害為利、變廢為寶，而且也控制了瘋草的蔓延，保護(hù)了環(huán)境，從而獲得巨大的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。
文檔編號(hào)A61K38/38GK1395967SQ0211459
公開(kāi)日2003年2月12日 申請(qǐng)日期2002年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月24日
發(fā)明者童德文, 曹光榮, 趙寶玉, 葛鵬斌 申請(qǐng)人:楊凌大農(nóng)生物技術(shù)有限公司