專利名稱：多巴胺受體新亞型d5b基因及編碼的蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其是涉及一個(gè)多巴胺受體新亞型的基因及編碼的蛋白與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
某些神經(jīng)精神病(包括Parkinson病、精神分裂癥、藥物依賴、偏頭痛、狂躁、抑郁癥和抽動(dòng)穢語綜合征等)、心血管疾病、腎病與多巴胺受體有關(guān)，多巴胺受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，控制運(yùn)動(dòng)功能、情緒、內(nèi)分泌生理系統(tǒng)。
人們對多巴胺及其受體的作用位置進(jìn)行了大量的研究。Cools和Rossum通過電生理實(shí)驗(yàn)和藥理實(shí)驗(yàn)提出可能大腦中不止存在一種多巴胺受體，這是多巴胺研究的一個(gè)里程碑。20世紀(jì)70年代，基于第二信使分析人們研究多巴胺受體，例如cAMP的刺激，以及基于結(jié)合分析，都支持不止一個(gè)多巴胺受體的思想。1979年Kebabian和Calne在他們的一篇綜述中為這種思想奠定了基礎(chǔ)，在他的論文中，擴(kuò)展了Spano的提法，指出多巴胺受體有兩類，D1和D2，有不同的生化和藥學(xué)特性，調(diào)節(jié)不同的生理功能。D1和D2兩個(gè)G-蛋白偶聯(lián)受體作用的G-蛋白和效應(yīng)器及相關(guān)的通路是不同的。盡管生化研究說明這些受體亞型有多么不同，然而，直到20世紀(jì)80年代，利用克隆技術(shù)，通過對多巴胺受體的克隆，才揭示出這些受體的真正的不同程度。結(jié)果表明，至少有5個(gè)多巴受體，分為兩個(gè)亞族，其性質(zhì)分別類似于通過生化和藥理學(xué)定義的D1和D2受體，這兩個(gè)亞族分別稱為D1樣受體(D1和D5)和D2樣受體(D2，D3，D4)。
多巴胺是基底核的主要神經(jīng)遞質(zhì)，在運(yùn)動(dòng)控制和認(rèn)知功能方面起著非常重要的作用。特別是D1樣受體(D1和D5)受體。最近，D1樣受體在大腦功能，尤其是在學(xué)習(xí)和記憶方面的功能，引起了人們巨大的興趣。D1樣受體的刺激太大或太少都會(huì)損害工作記憶。D1受體可能調(diào)節(jié)認(rèn)知、影響Parkinson病。D1受體是前額皮質(zhì)工作記憶關(guān)鍵的神經(jīng)調(diào)節(jié)的影響因素，這個(gè)區(qū)域受許多神經(jīng)疾病的影響。
多巴胺受體為單鏈蛋白，它的N端在雙層類脂膜外側(cè)，C端在膜內(nèi)側(cè)，在雙層類脂膜的中間有7個(gè)疏水的跨膜區(qū)(TMD)。膜外側(cè)和膜內(nèi)側(cè)各有3個(gè)片段，分別稱為外三環(huán)(E1-E3)和內(nèi)三環(huán)(11-13)，它們把各個(gè)TMD聯(lián)接起來；膜外側(cè)有2-3個(gè)糖基位點(diǎn)，和其穩(wěn)定結(jié)構(gòu)作用的雙硫鍵。七個(gè)跨膜螺旋束在一起在膜上形成配體的結(jié)合位點(diǎn)。激動(dòng)劑可能結(jié)合到疏水性的TM結(jié)構(gòu)域上，蛋白質(zhì)的中央，氨基酸殘基高度保守，行成一個(gè)狹窄的結(jié)合口袋，可能是激動(dòng)劑的結(jié)合位點(diǎn)。C未端可能有一些棕櫚酰殘基，能形成與膜更多的連接。與D2樣受體相比，D1樣受體N端為2個(gè)糖蛋白；膜內(nèi)側(cè)第三環(huán)小一些，而C端肽鏈很長。
在腦中，D1受體比其它多巴胺受體的分布廣、表達(dá)高，在紋狀體、伏隔核(nucleus accumbens，NAc)和嗅結(jié)節(jié)能檢測到D1的mRNA，此外，在邊緣系、海馬和丘腦也檢測到D1受體。在內(nèi)莖核(entopeducular nucleus)、黑質(zhì)網(wǎng)狀部(substantianigra pars reticulata)，D1受體有高水平的表達(dá)，但卻檢測不到mRNA，說明在這些區(qū)域D1受體主要以投射存在。D5受體與D1受體相比，在大鼠中的表達(dá)要少得多，其表達(dá)限于海馬、內(nèi)側(cè)乳頭核(1ateral mamillary nucleus)、丘腦的束旁核。在某些嘴側(cè)前腦(rostral forebrain)區(qū)域包括大腦皮層、背側(cè)丘腦、斜角帶、紋狀體能檢測到D5受體的mRNA，在黑質(zhì)、中丘腦和海馬能檢測少量D5受體的mRNA。用D1和D5抗體檢測這兩個(gè)受體在靈長類動(dòng)物的腦組織中不同區(qū)域的細(xì)胞和亞細(xì)胞分布，結(jié)果表明，D1和D5受體在前額頁、前運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)(premotor cortex)、扣帶皮質(zhì)、內(nèi)嗅皮質(zhì)的錐體神經(jīng)元以及海馬和齒狀回中共同表達(dá)。在前皮質(zhì)和海馬，D1和D5受體存在于突觸前和突觸后。在單個(gè)的錐體神經(jīng)元中，D1受體主要集中在樹突刺上，而D5主要集中樹突骨干上。在嗅球，D1受體限于粒狀層、網(wǎng)織層和插入到底外側(cè)核的杏仁體。在尾狀核，D1和D5主要位于中等大小的GABAA神經(jīng)元。D5還存在于類膽堿能中間神經(jīng)元，而D1不存在。D1受體存在于刺突觸后到非對稱突觸的區(qū)域。D1和D5都位于具有多巴胺末端小突觸特征的后突觸密度。突觸前D1和D5受體在軸突上形成不對稱突觸區(qū)。D1位于內(nèi)莖核，黑質(zhì)網(wǎng)狀部，而D5檢測不到，因此，如果D1和D5受體位于有尾的中等突刺神經(jīng)元，也只有D1受體被轉(zhuǎn)送到紋狀體黑質(zhì)末端。D1受體和D5受體在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平上的位置不同，表明D1和D5受體雖然在藥理學(xué)上是相同的但其功能上不是完全一樣的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的多巴胺受體D5的亞型基因以及編碼的蛋白。D5亞型與海馬乙酰膽堿釋放的調(diào)節(jié)有關(guān)。乙酰膽堿是一種神經(jīng)遞質(zhì)，參與各種認(rèn)知過程。D5亞型參與紋狀體的信息的整理，能與gamma-氨基丁酸A(GABAA)受體相互作用，兩個(gè)受體相互抑制其的功能。另外，D5受體調(diào)節(jié)與血壓相關(guān)的信號通路，介導(dǎo)血壓的響應(yīng)，其功能對了解人類高血壓產(chǎn)生的機(jī)制非常重要。
可能還存在沒有克隆的D1樣受體。其中一個(gè)問題是，目前克隆的D1樣受體能否偶合磷酸肌醇(PI)的水解，尚不清楚。然而，腎中的D1樣受體與PI的水解有關(guān)，據(jù)報(bào)道，D1受體能偶合PI水解。在紋狀體，D1偶合PI的更新，不過，仍有爭論。另一個(gè)爭議的問題是，在腎中只檢測到低水平的D1受體的mRNA，不能解釋為什么在腎組織中D1激動(dòng)劑有相對高的結(jié)合水平。最后，有些實(shí)驗(yàn)也揭示，在腎皮質(zhì)膜或腎衍生的細(xì)胞上，與D1選擇性激動(dòng)劑(尤其是SCH23390)的結(jié)合存在兩階段的結(jié)合曲線。所有這些，說明還可能存在一個(gè)沒有識別的亞型。
通過PCR方法，以人類基因組DNA和人類SHSY5Y細(xì)胞的基因組DNA為模板，篩選到D5受體和與之相似的另一個(gè)受體，稱為D5B，并對這一基因進(jìn)行了分析，序列如SEQ ID No.1所示。
Blast分析的結(jié)果顯示，該基因與D5受體(如SEQ ID No.2所示)98％相同，與D5的兩個(gè)假基因94％相似。而D5與兩個(gè)假基因D5ψ1(如SEQ ID No.3所示)和D5ψ2有95％的相同，兩個(gè)假基因之間98％相同，D5B更接近于D5。
通過對D5B、D5和D5一個(gè)假基因D5Ψ(GenBank data base M67440)的序列比較分析發(fā)現(xiàn)，在D5B中，與D5不同的地方總是與D5的假基因相同，與D5的假基因不同的地方總是與D5相同，特別是在COOH端，增加的堿基及其周圍與D5的假基因完全一樣。
我們對照了D5B、D5和D5一個(gè)假基因D5Ψ(GenBank data base M67440)的序列，分析核酸測序的結(jié)果如下。
編碼區(qū)不同的氨基酸標(biāo)注在D5序列上，破折號表示在這個(gè)位置上缺失，展開的∧符號表示在這個(gè)位置上插入，七個(gè)推測的跨膜結(jié)構(gòu)域(TMDs)加上框并標(biāo)記字母I-VII。推測的N糖基化位點(diǎn)用*標(biāo)記，蛋白激酶A的磷酸化位點(diǎn)用上劃線標(biāo)記，蛋白激酶C的磷酸化位點(diǎn)用虛上劃線標(biāo)記，一個(gè)實(shí)方盒表示棕櫚?；陌腚装彼?。

這個(gè)核酸序列93.6％與D5一致，但它含有一個(gè)框內(nèi)終止子(用圓圈標(biāo)出)，因此不能合成功能蛋白受體。分析D5B的序列可以發(fā)現(xiàn)它有一個(gè)開放閱讀框，編碼一個(gè)含478個(gè)氨基酸的G-蛋白偶聯(lián)受體(比D5多一個(gè)氨基酸Glu432谷氨酸)，是一個(gè)有功能的基因。分析這三個(gè)序列，發(fā)現(xiàn)在D5B與D5不同的地方，與D5Ψ相同，而與D5Ψ不同的地方，就與D5相同，在Glu插入點(diǎn)及附近與D5Ψ完全一樣。D5與D5B有10處氨基酸不同，不同的氨基酸有氨基端的Gly5/Arg和Phe15/Leu，第二膜內(nèi)環(huán)I2的Tyr148/His，第二膜外環(huán)E2的Pro202/Leu以及羧基端的Ile400/Met，Tyr410/Cys，Thr419/Pro，Asn422/Asp，Glu423/Gln和Gly432/Ser433。D5B與D5在羧基端的變化較大，有六個(gè)氨基酸不同，而且D5B中有一個(gè)Glu432插入，在此位點(diǎn)形成了Glu四聚體，D5受體的羧基端(CT-tail)影響受體的親和性，推測其親和性可能與D5有差別。這些氨基酸的變化與以前所報(bào)道的D5多態(tài)性變化帶來的9個(gè)氨基酸的不同之間沒有一點(diǎn)關(guān)聯(lián)。
通過序列分析發(fā)現(xiàn)D5B有許多D5受體保守的位點(diǎn)6個(gè)天冬酰胺(星號標(biāo)出的Asn7、Asn74、Asn199、Asn222、Asn351和Asn388)是潛在的N端糖基化位點(diǎn)。其中在氨基端的Asn7是所有多巴胺受體的所共有的結(jié)構(gòu)特征。研究表明DA受體中，同一家族的氨基酸序列在跨膜區(qū)域(TMDs)具有相當(dāng)高的一致性，如D1與D5亞型在TMDs有80％一致。我們發(fā)現(xiàn)D5B與D5在7個(gè)跨膜區(qū)域內(nèi)(用黑線標(biāo)出)也相當(dāng)保守。其中TM2的Asp87是影響D1家族受體活性的重要因素，并且影響激動(dòng)劑的結(jié)合；TM3的Asp120對于結(jié)合兒茶酚胺的胺基有重要作用；TM5的Ser229和Ser233是結(jié)合羥基的供氫載體；TM6的Phe有助于受體與芳香族配體的穩(wěn)定結(jié)合；TM7的Asn351是D1家族受體共有的特征。
TM4與TM5間的E2區(qū)在D1，D5亞型中有明顯差異，D1較短只有27個(gè)氨基酸，D5B與D5一樣較長有41個(gè)氨基酸。膜外環(huán)E1，E2兩個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)Cys113，Cys217是多巴胺受體的保守位點(diǎn)，對于受體三級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性具有重要作用。通過序列分析還發(fā)現(xiàn)一些蛋白激酶磷酸化的靶位點(diǎn)，四個(gè)蛋白激酶A的位點(diǎn)用上劃線標(biāo)出的Thr153、Ser260、Ser275和Ser287)，三個(gè)蛋白激酶C的位點(diǎn)，用上虛線標(biāo)出的Thr153、Ser275和Ser283)，其中五個(gè)位點(diǎn)在膜內(nèi)環(huán)I3區(qū)內(nèi)，而I3區(qū)對于受體與G蛋白的耦聯(lián)有著重要的作用，有著調(diào)節(jié)功能。在羧基端的一些Ser，Thr可以被受體激酶磷酸化。Cys375(用正方形標(biāo)出)可以被棕櫚酰基化，使受體的羧基端可以與質(zhì)膜相鉚定結(jié)合，此氨基酸在D1樣受體中位于羧基端的起始處，而在D2樣受體中則往往在羧基端的結(jié)尾處。D5B與D5的I3區(qū)有50個(gè)氨基酸，都屬短的袢環(huán)結(jié)構(gòu)，D5B與D5在第三膜內(nèi)環(huán)(I3)的一致性，D5B在功能上，屬于Gs型受體。
許多Gs-蛋白偶聯(lián)受體的第三個(gè)胞內(nèi)環(huán)較短，D5B的這個(gè)環(huán)與D5一樣，因此，D5B應(yīng)當(dāng)是一個(gè)Gs蛋白偶聯(lián)受體(見圖1和圖4)，實(shí)驗(yàn)證明確實(shí)如此，D5B是腺苷酸環(huán)化酶關(guān)聯(lián)的Gs蛋白偶聯(lián)受體。文獻(xiàn)報(bào)道，D5和配體的親和性與COOH未端有關(guān)。D5B與D5最大的區(qū)別在于COOH端，因此，可以預(yù)計(jì)兩個(gè)受體與多巴胺的親和性可能不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，D5B對多巴胺的親和性比D5高1倍左右。從圖2和圖3來看，D5和D5B對激動(dòng)劑Dihydrexine和(±)-Choro-APB差別不大。
表一為D1、D5和D5B的分子特征對比表。
表一

在D5B中，與D5不同的地方總是與D5的假基因相同，與D5的假基因不同的地方總是與D5相同，特別是在COOH端，增加的堿基及其周圍與D5的假基因完全一樣(如表一所示)。
D5B介于D5與D5假基因之間，更接近D5，很可能是在進(jìn)化過程中產(chǎn)生的，如果真如前面所說，D5的假基因是3′UTR的Alu序列產(chǎn)生一個(gè)長的RNA轉(zhuǎn)錄子，導(dǎo)致了D5的復(fù)制，隨后將這個(gè)基因拷貝移到了一個(gè)新的位置，從而產(chǎn)生了D5基因的多重性。那么D5B的產(chǎn)生可能是D5復(fù)制過程中保存到現(xiàn)在的一個(gè)中間產(chǎn)物。
綜合以上所述分析，發(fā)明人克隆到的D5B基因是一個(gè)新基因，是Gs型受體，是腺苷酸環(huán)化酶關(guān)聯(lián)的，發(fā)明人采用報(bào)告基因方法和cAMP測定法，研究了這個(gè)基因的藥理學(xué)功能。轉(zhuǎn)染了D5B基因的細(xì)胞濃度依賴性地響應(yīng)D1激動(dòng)劑和多巴胺，D5B對多巴胺的親和性比D5高；D1激動(dòng)劑Dihydrexidine和(±)-Choro-APB都可以激活D5B受體。
由D5基因與多種疾病有關(guān)，可以預(yù)見，D5B可能與某些神經(jīng)精神病(包括Parkinson病、精神分裂癥、藥物依賴、偏頭痛、狂躁、抑郁癥和抽動(dòng)穢語綜合征等)、心臟血管、腎病等有關(guān)。多巴胺受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，控制運(yùn)動(dòng)功能、情緒、內(nèi)分泌生理系統(tǒng)。多巴胺是基底核的主要神經(jīng)遞質(zhì)，在運(yùn)動(dòng)控制和認(rèn)知功能方面起著非常重要的作用。D5B可能在大腦功能，尤其是在學(xué)習(xí)和記憶方面的功能，起著重要的調(diào)節(jié)作用，可以作為研究和開發(fā)相關(guān)疾病的藥物的重要靶點(diǎn)。


圖1轉(zhuǎn)染D5B和D5受體基因的D5B/6CRE/Luci/CHO細(xì)胞、D5/6CRE/Luci/CHO細(xì)胞在不同濃度的多巴胺下孵育6小時(shí)后測定熒光酶活性，縱坐標(biāo)為相關(guān)活力，橫坐標(biāo)為多巴胺濃度(nM)圖2D5B和D5受體基因藥理學(xué)性質(zhì)1D5B/6CRE/Luci/CHO細(xì)胞、D5/6CRE/Luci/CHO細(xì)胞在不同濃度dihydrexidine下孵育6小時(shí)后測定熒光酶活性，縱坐標(biāo)為相關(guān)活力，橫坐標(biāo)為dihydrexidine濃度(nM)圖3D5B和D5受體基因藥理學(xué)性質(zhì)2D5B/6CRE/Luci/CHO細(xì)胞、D5/6CRE/Luci/CHO細(xì)胞在不同濃度chloro-APB下孵育6小時(shí)后測定熒光酶活性，縱坐標(biāo)為相關(guān)活力，橫坐標(biāo)為chloro-APB濃度(nM)圖4HEK293中的D5B受體在不同濃度多巴胺刺激下cAMP的積累轉(zhuǎn)染D5B的HEK293細(xì)胞在不同濃度的多巴胺下共孵30分鐘，用競爭性ELISA法測定cAMP；縱坐標(biāo)為cAMP濃度(pmol/ml)，橫坐標(biāo)為多巴胺濃度(nM)具體實(shí)施方式
實(shí)施例1D5B的克隆方法1用以下引物，以人類基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增D5。引物中實(shí)下劃線為EocRI的酶切位點(diǎn)，波浪下劃線為HindIII的酶切位點(diǎn)。
Primer 15’-GGCGAA TTCGCG TGT GTG TGC GTG CTT GTC AGT GT-3’Primer 25’-GGGAAG CTTCTG AAG TTG GGA CCG CGC ACA GAC CG-3’在下面條件下進(jìn)行反應(yīng)。預(yù)變性94℃5min；變性溫度94℃30s，退火溫度從50到60℃，每2℃一個(gè)循環(huán)，最后在60℃增加20個(gè)循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)中72℃延伸2min，最后72℃延伸7min。
PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化劑盒(vitegene)純化，得0.025μg/μl PCR產(chǎn)物，然后用HindIII(TaKaRa)和EocRI(TaKaRa)共酶切。載體pcDNA3.1也用同樣的方法酶切。
在EP管中依次加入二蒸水、內(nèi)切酶緩沖液、DNA和內(nèi)切酶，混合均勻，37℃保溫2h。酶切后，用Vitgene的PCR產(chǎn)物純化試劑盒，按其說明書進(jìn)行純化，得40μl濃度為0.0015μg/μl的PCR產(chǎn)物。pcDNA3.1載體酶切后去磷酸化，將酶切后的D5的PCR產(chǎn)物稀釋到0.1ng/μl，按以上同樣方法連接，轉(zhuǎn)化Top10F’感受態(tài)細(xì)胞。挑選粗壯的單克隆，于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并測序。
在所挑選的D5的單克隆中，可以篩選到與D5相近的受體D5B。
實(shí)施例2D5B的克隆方法2以人類的SHSY5Y細(xì)胞的基因組DNA為模板，用下兩對引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。
Primer 15′-gca gcc caa gcg gat cct gcg gat ctg cag tcc agc ccg aaa tgc t-3’.
Primer 25′-gaa tag ggc cct cta gat gca tgc tcg agc gga tat ctt aat gga atc cat tcc ggg t-3’在下面條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)，預(yù)變性94℃ 5min；變性溫度94℃ 30s，退火55℃30s，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖膠電泳分析，回收1.5kb的PCR產(chǎn)物，連接到pMDT-18載體(TaKaRa)，對其中的41個(gè)克隆進(jìn)行了測序，其中有24個(gè)克隆是D5受體，12個(gè)克隆是D5B受體，4個(gè)克隆是D5的假基因ψD51和1個(gè)假基因ψD52。
實(shí)施例3基因轉(zhuǎn)染和細(xì)胞培養(yǎng)將CHO細(xì)胞于37℃，含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使用細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectin)試劑，以6CRE響應(yīng)元件、含TATATA盒(TA)最小化啟動(dòng)子和熒光酶酶基因(Luciferase)構(gòu)成報(bào)告基因，將D5B基因和報(bào)告基因轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞內(nèi)。在含0.8mg/mL G418的培養(yǎng)基中篩選到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞D5B/6CRE/TA/Luci。
實(shí)施例4D5B藥物理學(xué)功能測定1——多巴胺將細(xì)胞用相應(yīng)的含600μg/ml G418的完全培養(yǎng)基1640按密度約3×105Cells/ml將D5/6CRE/TA/Luci和D5B/6CRE/TA/Luci細(xì)胞分別接種到兩個(gè)96孔板中，每孔90μl，于37℃，5％的CO2的孵箱中培養(yǎng)24h，然后，加入10μl不同濃度的多巴胺，繼續(xù)于37℃，5％的CO2的孵箱中孵6h，然后在細(xì)胞中，加入100μl螢火蟲熒光酶底物Bright-GloTM，用Analyst HTTM進(jìn)行檢測。結(jié)果參見圖1。
實(shí)施例5D5B藥物理學(xué)功能測定2——D1激動(dòng)劑按照實(shí)施例四的方法，分別用D1激動(dòng)劑Dihydrexidine和(±)-CHLORO-APB代替多巴胺。結(jié)果顯示，Dihydrexidine和(±)-CHLORO-APB都能激活D5B受體，Dihydrexidine與D5和D5B結(jié)合的EC50分別是4.0nM and 5.3nM，結(jié)果參見圖2；(±)-CHLORO-APB結(jié)合D5和D5B受體的EC50分別是EC502.7nM和1.9nM，結(jié)果參見圖3。
實(shí)施例4、5結(jié)果顯示D5B/6CRE/TA/Luci細(xì)胞濃度依賴性地響應(yīng)D1激動(dòng)劑及多巴胺，其親和性不同，D5B對多巴胺的親和性比D5高(圖2)。Dihydrexidine和(±)-CHLORO-APB都能激活D5B受體，dihydrexidine與D5和D5B結(jié)合的EC50分別是4.0nM and 5.3nM(圖2)，(±)-CHLORO-APB結(jié)合D5和D5B受體的EC50分別是EC50 2.7nM和1.9nM(圖3)
實(shí)施例6D5B受體在多巴胺刺激后的cAMP的變化在細(xì)胞轉(zhuǎn)染前，先用無內(nèi)毒素的質(zhì)粒抽提試劑盒，按其說明書，制得超純無內(nèi)毒的DNA。HEK293細(xì)胞用DMEM(含10％的FBS、1％的雙抗和1％的非必需氨基酸)以密度為3×105Cells/ml接種到六孔板，每個(gè)孔1ml，37℃，5％的CO2的孵箱中培養(yǎng)24h，細(xì)胞達(dá)到50％的融合度后，用fuegen 6，按其說明書，將D5B轉(zhuǎn)染細(xì)胞HEK293。于37℃，5％的CO2的孵箱中培養(yǎng)24h后，收獲細(xì)胞，按密度為1×105Cells/ml接種到96孔板中，于37℃，5％的CO2的孵箱中培養(yǎng)過夜后，加入10μl不同濃度的多巴胺，繼續(xù)于37℃，5％的CO2的孵箱中孵0.5h，然后用cAMP試劑盒(low PH，Immunoassay，R&D)測定cAMP。方法如下移去96孔板中的培養(yǎng)基，每個(gè)孔中加入0.1N HCl 200μl，孵育20min，600×g離心，取上清進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。在涂有羊抗兔多克隆抗體的96平板的每個(gè)孔中加入50μl中和液，加入100μl上述細(xì)胞裂解液或標(biāo)準(zhǔn)樣品，再加入50μl cAMP與堿性磷酸化酶的交聯(lián)物，再加50μl cAMP的抗體溶液。封好，室溫下?lián)u(500±50rpm)2h。移去上清，用200μl的Wash Buffer洗滌三次，倒立于吸水紙上，完全去除洗滌液。加入200μl的pNPP磷酸化酶底物，室溫孵育1h，加入50μl的Stop Solution中止反應(yīng)。在405nm測定OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)值計(jì)算cAMP濃度，EC50＝2.75nM，結(jié)果參見圖4。與報(bào)告基因方法基本相符。文獻(xiàn)報(bào)道D5的EC50＝5nM，D5B對多巴胺的親和性比D5大1倍。
序列表序列表一<110>申請人<120>多巴胺受體新亞型D5B基因及編碼的蛋白與應(yīng)用<160>2<210>1<211>1437<212>DNA<213>人<400>
atgctgccgc caaggagcaa cggcaccgcg tacccggggc agttagcgct ataccagcag 60ctggcgcagg ggaacgccgt ggggggctcg gcgggggcac cgccactggg gccctcacag120gtggtcaccg cctgcctgct gaccctactc atcatctgga ccctgctggg caacgtgctg180gtgtgcgcag ccatcgtgcg gagccgccac ctgcgcgcca acatgaccaa cgtcttcatc240gtgtctctgg ccgtgtcaga ccttttcgtg gcgctgctgg tcatgccctg gaaggcagtc300gccgaggtgg ccggttactg gccctttgga gcgttctgcg acgtctgggt ggccttcgac360atcatgtgct ccactgcctc catcctgaac ctgtgcgtca tcagcgtgga ccgctactgg420gccatctcca ggcccttccg ccacaagcgc aagatgactc agcgcatggc cttggtcatg480gtcggcctgg catggacctt gtccatcctc atctccttca ttccggtcca gctcaactgg540cacagggacc aggcggcctc ttggggcggg ctggacctgc caaataacct ggccaactgg600acgctctggg aggaggactt ttgggagccc gacgtgaatg cagagaactg tgactccagc660ctgaatcgaa cctacgccat ctcttcctcg ctcatcagct tctacatccc cgttgccatc720atgatcgtga cctacacgcg catctaccgc atcgcccagg tgcagatccg caggatttcc780tccctggaga gggccgcaga gcacgcgcag agctgccgga gcagcgcagc ctgcgcgccc840gacaccagcc tgcgcgcttc catcaagaag gagaccaagg ttctcaagac cctgtcggtg900atcatggggg tcttcgtgtg ttgctggctg cccttcttca tccttaactg catggtccct960ttctgcagtg gacaccccga aggccctccg gccggcttcc cctgcgtcag tgagaccacc1020ttcgacgtct tcgtctggtt cggctgggct aactcctcac tcaaccccgt catctatgcc1080ttcaacgccg actttcagaa ggtgtttgcc cagctgctgg ggtgcagcca cttctgctcc1140cgcacgccgg tggagacggt gaacatcagc aatgagctca tctcctacaa ccaagacatg1200gtcttccaca aggaaatcgc agctgcctgc atccacatga tgcccaacgc ccttcccccc1260
ggggaccaag aggtggacaa cgatgaggag gaggagagtc ctttcgatcg catgttccag1320atctatcaga cgtccccaga tggtgaccct gttgctgagt ctgtctggga gctggactgc1380gagggggaga tttctttaga caaaataaca cctttcaccc cgaatggatt ccattaa 1437序列表二<110>申請人<120>多巴胺受體新亞型D5B基因及編碼的蛋白與應(yīng)用<160>2<210>1<211>478<212>氨基酸<213>人<400>
Met Leu Pro Pro Arg Ser Asn Gly Thr Ala Tyr Pro Gly Gln Leu15Ala Leu Tyr Gln Gln Leu Ala Gln Gly Asn Ala Val Gly Gly Ser30Ala Gly Ala Pro Pro Leu Gly Pro Ser Gln Val Val Thr Ala Cys45Leu Leu Thr Leu Leu Ile Ile Trp Thr Leu Leu Gly Asn Val Leu60Val Cys Ala Ala Ile Val Arg Ser Arg His Leu Arg Ala Asn Met75Thr Asn Val Phe Ile Val Ser Leu Ala Val Ser Asp Leu Phe Val90Ala Leu Leu Val Met Pro Trp Lys Ala Val Ala Glu Val Ala Gly105Tyr Trp Pro Phe Gly Ala Phe Cys Asp Val Trp Val Ala Phe Asp120Ile Met Cys Ser Thr Ala Ser Ile Leu Asn Leu Cys Val Ile Ser135Val Asp Arg Tyr Trp Ala Ile Ser Arg Pro Phe Arg His Lys Arg150Lys Met Thr Gln Arg Met Ala Leu Val Met Val Gly Leu Ala Trp165Thr Leu Ser Ile Leu Ile Ser Phe Ile Pro Val Gln Leu Asn Trp180His Arg Asp Gln Ala Ala Ser Trp Gly Gly Leu Asp Leu Pro Asn195Asn Leu Ala Asn Trp Thr Leu Trp Glu Glu Asp Phe Trp Glu Pro210Asp Val Asn Ala Glu Asn Cys Asp Ser Ser Leu Asn Arg Thr Try225Ala Ile Ser Ser Ser Leu Ile Ser Phe Tyr Ile Pro Val Ala Ile240Met Ile Val Thr Tyr Thr Arg Ile Tyr Arg Ile Ala Gln Val Gln255
Ile Arg Arg Ile Ser Ser Leu Glu Arg Ala Ala Glu His Ala Gln270Ser Cys Arg Ser Ser Ala Ala Cys Ala Pro Asp Thr Ser Leu Arg285Ala Ser Ile Lys Lys Glu Thr Lys Val Leu Lys Thr Leu Ser Val300Ile Met Gly Val Phe Val Cys Cys Trp Leu Pro Phe Phe Ile Leu315Asn Cys Met Val Pro Phe Cys Ser Gly His Pro Glu Gly Pro Pro330Ala Gly Phe Pro Cys Val Ser Glu Thr Thr Phe Asp Val Phe Val345Trp Phe Gly Trp Ala Asn Ser Ser Leu Asn Pro Val Ile Tyr Ala360Phe Asn Ala Asp Phe Gln Lys Val Phe Ala Gln Leu Leu Gly Cys375Ser His Phe Cys Ser Arg Thr Pro Val Glu Thr Val Asn Ile Ser390Asn Glu Leu Ile Ser Tyr Asn Gln Asp Met Val Phe His Lys Glu405Ile Ala Ala Ala Cys Ile His Met Met Pro Asn Ala Leu Pro Pro420Gly Asp Gln Glu Val Asp Asn Asp Glu Glu Glu Glu Ser Pro Phe435Asp Arg Met Phe Gln Ile Tyr Gln Thr Ser Pro Asp Gly Asp Pro450Val Ala Glu Ser Val Trp Glu Leu Asp Cys Glu Gly Glu Ile Ser465Leu Asp Lys Ile Thr Pro Phe Thr Pro Asn Gly Phe His478
權(quán)利要求
1.多巴胺受體D5B的基因，是下列核苷酸序列之一a)序列表SEQ ID No.1；b)編碼序列表SEQ ID No.2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸。
2.多巴胺受體D5B的蛋白質(zhì)，其特征在于，具有序列表SEQ ID No.2的氨基酸序列。
3.含有權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體。
4.含有權(quán)利要求1所述基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。
5.權(quán)利要求1所述的基因在制備藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種多巴胺受體的新亞型D5B。通過PCR方法得到與多巴胺受體D5相似的一個(gè)新亞型D5B基因，它能編碼一個(gè)含478個(gè)氨基酸的G－蛋白偶聯(lián)受體；與D5受體相比，D5B受體對多巴胺親和性更高。這一新亞型可作為開發(fā)精神、神經(jīng)疾病、心臟血管、腎病藥物的重要靶點(diǎn)。
文檔編號A61P25/00GK1944647SQ200610030320
公開日2007年4月11日 申請日期2006年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月23日
發(fā)明者許治良, 江南, 胡應(yīng)和 申請人:華東師范大學(xué)