專利名稱：特異靶向性藥物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特異靶向性藥物，尤其涉及一種用于治療病毒性肝炎、肝硬化、肝臟腫瘤等肝臟疾病的特異靶向性藥物。
背景技術(shù)：
病毒對(duì)宿主細(xì)胞的特異性選擇在病毒感染的現(xiàn)象中廣泛存在。自然界中存在一類對(duì)肝細(xì)胞具有特異或相對(duì)特異性感染的病毒，稱之為嗜肝病毒。目前已被公認(rèn)的人類嗜肝病毒有人甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒，“庚型肝炎病毒”和新發(fā)現(xiàn)的輸血傳播病毒TTV(含其變異株SANBAN、YONBAN等)、SENV(TTV相關(guān)病毒)、TLMV(TTV樣微小病毒)、CAV(雞白血病病毒)可以引起肝炎病變，但目前尚未被公認(rèn)為嗜肝病毒。另外，臨床上約有10％的病毒性肝炎的病因目前尚未確定，稱之為未分型肝炎病毒。與人乙型肝炎病毒同屬嗜肝去氧核糖核酸病毒的還有土撥鼠肝炎病毒、地松鼠肝炎病毒和鴨肝炎病毒。
肝炎病毒的嗜肝特異性主要依賴病毒蛋白與肝細(xì)胞表面的病毒受體或輔受體特異性結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)嗜肝病毒對(duì)肝細(xì)胞的特異性感染。人甲型肝炎病毒(hepatitis Avirus，HAV)屬小RNA病毒科嗜肝RNA病毒屬。甲型肝炎病毒衣殼蛋白VP1上的細(xì)胞受體結(jié)合區(qū)與肝細(xì)胞表面的受體(HAV cellular receptor-1，HAVcr-1)結(jié)合，介導(dǎo)HAV對(duì)肝細(xì)胞的特異性感染(Kaplan，G.，A.Totsuka，P.Thompson，T.Akatsuka，Y.Moritsugu，and S.M.Feinstone.1996.Identification of a surface glycoproteinon African green monkey kidney cells as a receptor for hepatitis A virus.EMBOJ.154282-4296.；Feigelstock，D.，P.Thompson，P.Mattoo，Y.Zhang，and G.G.Kaplan.1998.The human homolog of HAVcr-1 codes for a hepatitis A viruscellular receptor.J.Virol.726621-6628.)。丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)屬于黃病毒科，核心為單股正鏈RNA，病毒包膜上存在E1、E2兩種糖蛋白，其中E2被證實(shí)是介導(dǎo)HCV感染肝細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白，其肝細(xì)胞表面的對(duì)應(yīng)受體可能是CD81，HCV E2糖蛋白的第480-493及544-551位氨基酸是結(jié)合CD81的關(guān)鍵部位。人乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)屬嗜肝DNA病毒科，其病毒包膜上存在3種表面蛋白，分別稱為大、中、小表面蛋白。其中HBV表面大蛋白Pre-S1區(qū)存在與肝細(xì)胞特異性受體或輔受體結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸序列，并定位于Pre-S1的第2到第47位氨基酸，但相應(yīng)的肝細(xì)胞膜表面受體目前尚未明確。人丁和戊型肝炎病毒及其他肝炎病毒的嗜肝特異性機(jī)理尚未明確。
利用嗜肝病毒的嗜肝特異性分子機(jī)制可介導(dǎo)肝局域性疾病的藥物靶向治療。肝局域性疾病包括病毒性肝炎、肝部腫瘤、肝硬化及其他肝局域性疾病。HBV感染是全球最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，全球約有20億人感染過(guò)HBV，慢性HBV感染者超過(guò)3.5億。每年與HBV感染相關(guān)的死亡人數(shù)高達(dá)100萬(wàn)，每年新增感染估計(jì)是HIV新增感染的2.5～4倍。世界上75％的HBV慢性感染者集中在亞洲(約為2.87億)，中國(guó)是乙型肝炎的高流行區(qū)，70年代末和90年代初兩次全國(guó)肝炎流行病學(xué)調(diào)查的數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)感染過(guò)HBV者6.9億，感染率為57.6％，全國(guó)長(zhǎng)期攜帶HBV者1.2億，HBV表面抗原攜帶率9.75％，現(xiàn)有的慢性乙型肝炎患者2000余萬(wàn)。丙型病毒性肝炎也呈全球性分布，目前全世界有1.7億人感染HCV，美國(guó)大約有HCV感染者390萬(wàn)，我國(guó)丙型肝炎病毒攜帶者3800萬(wàn)人，丙型病毒性肝炎占全球慢性肝炎的60％至70％，約有50％的晚期肝硬化和肝癌由該病毒引起，在美國(guó)是引起肝移植手術(shù)的主要病因。肝癌全世界每年新發(fā)病例26萬(wàn)，占惡性腫瘤的4％，分別位于男性和女性惡性腫瘤的第7和第9位。我國(guó)肝癌約占世界的42.5％，是我國(guó)第3位高發(fā)腫瘤，占各種腫瘤死亡的15％，其導(dǎo)致的人群死亡率高達(dá)20.1/10萬(wàn)人口。肝癌高度惡性，其5年生存率僅為5％。
目前用于治療肝部疾病的藥物包括抗肝癌藥物、核苷類似物抗肝炎病毒藥物和治療肝部疾病的細(xì)胞因子，其中以干擾素(interferon，IFN)應(yīng)用最多。IFN是一類相對(duì)小分子量單鏈蛋白，由Isaaca和Lindenmann于1957年首先發(fā)現(xiàn)，迄今為止已經(jīng)鑒定的人干擾素有近30種，所知的人、鼠、牛、豬、馬等哺乳動(dòng)物的IFN基于生理化學(xué)和生物的差異均分為IFN-alpha(IFNα)、IFN-beta(IFNβ)、IFN-gamma(IFNγ)、IFN-omega(IFNω)、IFN-kappa(IFNκ)、IFN-tau(IFNτ)和IFN-Delta(IFNδ)。其中IFN-a型中又有許多亞型，如α-1a型、α-1b型、α-2a型及a-2b型，亞型成員有20種以上。人IFN-a由166或165個(gè)氨基酸組成，分子量在19000道爾頓左右。目前公認(rèn)的IFN生物學(xué)功能包括廣譜的抗病毒活性、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)三大功能，其中以抗病毒活性最為公認(rèn)，因而IFN被廣泛應(yīng)用于慢性乙型和丙型病毒性肝炎、腫瘤、白血病等多種疾病的治療。IFN是被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市種類最多、銷售額最高的生物技術(shù)產(chǎn)品之一。目前全球HBV和HCV感染者分別高達(dá)3.5億和1億，中國(guó)乙型和丙型病毒性肝患者高達(dá)3000萬(wàn)人。雖然IFN-a是迄今為止治療病毒性肝炎具有肯定療效的藥物，但是由于其血清中半衰期僅有數(shù)小時(shí)(參見(jiàn)Physician’s DeskReference)，因此為了達(dá)到相當(dāng)?shù)乃幮Ь捅仨氉⑸涓邉┝康腎FN。這不僅使IFN的臨床應(yīng)用出現(xiàn)較大的不良副作用(包括神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)毒性)，而且由于這些毒性限制了IFN給藥劑量的進(jìn)一步提高，導(dǎo)致臨床療效尚不理想。由于IFN治療病毒性肝炎或肝臟腫瘤等肝區(qū)域性疾病時(shí)，僅有肝部IFN才發(fā)揮主要的治療作用，而肝臟之外的IFN則是造成肝外不良反應(yīng)的主要原因。因此僅通過(guò)聚乙二醇偶聯(lián)、蛋白偶聯(lián)等方式延長(zhǎng)IFN體內(nèi)半衰期(J.Pharmaceut.Sci.，83601-606，1994)，雖然能延長(zhǎng)給藥時(shí)間間隔、減少給藥次數(shù)，但不能有效降低IFN引起的不良反應(yīng)，也不能提高給藥劑量而提高IFN的療效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供一種特異靶向性藥物，該藥物將介導(dǎo)肝細(xì)胞特異性感染的病毒蛋白或多肽與藥物相結(jié)合，利用病毒蛋白或多肽介導(dǎo)藥物靶向肝臟，從而治療病毒性肝炎等肝臟局域性疾病。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供一種編碼特異靶向性藥物的核酸分子。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之三是提供一種包含上述編碼特異靶向性藥物核酸分子的載體。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之四是提供一種包含上述載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之五是提供一種藥物組合物，該組合物含有安全有效量的特異靶向性藥物和藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之六是提供所述特異靶向性藥物在制備治療肝臟疾病的藥物中的應(yīng)用。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種特異靶向性藥物，它具有通式X-L-Y，其中，X表示氨基酸序列，該序列包含(a)來(lái)源于具有肝臟特異性或相對(duì)特異性感染病毒的蛋白的氨基酸序列，(b)由(a)的序列發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的置換、缺失、插入或添加且與(a)具有相同活性的氨基酸序列，所述病毒蛋白與細(xì)胞感染受體或輔受體相結(jié)合，并介導(dǎo)或輔助病毒的感染；L表示X與Y之間的任一連接，該連接可缺失；Y表示對(duì)正常細(xì)胞、病理狀態(tài)下細(xì)胞、受感染細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞及病原微生物具有藥理或生理作用的藥物和或基團(tuán)；所述X和Y的位置可顛倒，X、L、Y之間可進(jìn)行單一或多倍的排列組合，且多倍排列組合中的各X或Y可相同或不同。
較佳地，所述具有肝臟特異性或相對(duì)特異性感染病毒包括甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒及未分型肝炎病毒；尤其較佳地，所述X序列包含人乙型肝炎病毒表面大蛋白Pre-S1的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物；更佳地，所述X序列包含具有SEQ ID NO1氨基酸序列的人乙型肝炎病毒表面大蛋白Pre-S1多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物；尤其更佳地，所述X序列選自下組(a)具有SEQ ID NO1氨基酸序列的多肽，(b)將SEQ ID NO1氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的置換、缺失、插入或添加且具有與SEQ ID NO1氨基酸序列相同活性的由(a)衍生的多肽；特別優(yōu)選X為具有SEQ ID NO3氨基酸序列的多肽。
較佳地，所述Y是對(duì)正常肝細(xì)胞、病理狀態(tài)下肝細(xì)胞、受感染肝細(xì)胞、肝腫瘤細(xì)胞及肝細(xì)胞內(nèi)病毒或病原微生物具有藥理或生理作用的藥物，包括蛋白質(zhì)、多肽、細(xì)胞毒性藥物、小分子藥物及放射性藥物；尤其較佳地，所述Y為蛋白質(zhì)藥物，包括細(xì)胞因子、干擾素、白細(xì)胞介素、生長(zhǎng)因子、集落刺激因子、趨化因子及該類蛋白質(zhì)藥物的突變體；更佳地，所述Y包含干擾素α、干擾素β、干擾素γ、干擾素ω、干擾素κ、干擾素τ、干擾素δ，或其保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物；尤其更佳地，所述Y選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的干擾素α-2b，(b)由(a)的蛋白發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的置換、缺失、插入或添加且與(a)的干擾素α-2b具有相同活性的衍生蛋白質(zhì)；特別優(yōu)選Y為具有SEQ ID NO5氨基酸序列的干擾素α-2b。
較佳地，所述L為X與Y之間的氨基酸連接；更佳地，所述L為主要由G(甘氨酸)、A(丙氨酸)、S(絲氨酸)和T(蘇氨酸)四種氨基酸組成的氨基酸序列。
本發(fā)明的特異靶向性藥物優(yōu)選為具有SEQ ID NO6的氨基酸序列，尤其優(yōu)選SEQID NO6氨基酸序列第15位氨基酸N(天冬酰氨)被氨基酸Q(谷氨酰氨)替換后產(chǎn)生的SEQ ID NO7氨基酸序列，特別優(yōu)選第13位氨基酸G(甘氨酸)被豆蔻酰化的SEQID NO7氨基酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種核酸分子，它編碼上述特異靶向性藥物的氨基酸序列。
較佳地，所述核酸分子包括下列核苷酸序列之一(1)序列表中SEQ ID NO8或SEQ ID NO9的DNA序列；(2)編碼序列表中SEQ ID NO7氨基酸序列的多核苷酸；(3)與序列表中SEQ ID NO8或SEQ ID NO9的DNA序列具有70％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種載體，它包含上述編碼特異靶向性藥物的核酸分子。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種藥物組合物，該組合物含有安全有效量的特異靶向性藥物和藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明還提供了特異靶向性藥物在制備治療肝臟局域性疾病的藥物中的應(yīng)用。
較佳地，所述肝臟局域性疾病包括病毒性肝炎、肝硬化及肝臟腫瘤。
在本發(fā)明中，X可來(lái)源于具有肝臟特異性或相對(duì)特異性感染的病毒的蛋白，這些病毒包括人甲(Hepatitis A Virus，HAV)、乙(Hepatitis B Virus，HBV)、丙(HepatitisC Virus，HCV)、丁(Hepatitis D Virus，HDV)、戊(Hepatitis E Virus，HEV)以及其他型人類肝炎病毒、鴨肝炎病毒(Duck hepatiris virus，DHV)、土撥鼠肝炎病毒(WHV)、旱獺乙肝病毒(WHBV)、地松鼠肝炎病毒(GSHV)、長(zhǎng)毛猴肝炎病毒(WMHV)、灰蒼鷺乙型肝炎病毒(HHBV)、雪鵝肝炎病毒(SGHV)以及其他動(dòng)物嗜肝病毒、以及其他具有肝臟特異性或相對(duì)特異性感染的病毒。本發(fā)明中的X優(yōu)選地來(lái)源于人HBV、HCV、HAV病毒及其他人嗜肝病毒，進(jìn)一步優(yōu)選地來(lái)源于人HBV表面蛋白及其他介導(dǎo)或輔助人HBV特異性感染肝細(xì)胞的HBV病毒蛋白、人HCV病毒E1和E2蛋白及其他介導(dǎo)或輔助人HCV特異性感染肝細(xì)胞的HCV病毒蛋白、人HAV病毒VP1、VP2、VP3、VP4蛋白及其他介導(dǎo)或輔助人HAV特異性感染肝細(xì)胞的HAV病毒蛋白、以及其他介導(dǎo)或輔助人嗜肝病毒特異性感染肝細(xì)胞的嗜肝病毒蛋白。本發(fā)明中的X還包括能結(jié)合肝細(xì)胞表面特異或相對(duì)特異表達(dá)蛋白的多肽(天然序列或人工序列)或基團(tuán)，這些在肝細(xì)胞表面特異或相對(duì)特異表達(dá)的蛋白包括CD81、低密度脂蛋白受體(low-densitylipoprotein receptor，LDL-R)、氨基葡糖多聚糖(glycosaminoglycans，GAG)、多聚人血清白蛋白(PHSA)、修飾的血清蛋白(modified serum albumin，MSA)、IgA受體、HBV結(jié)合因子(HBV BF)、p80、羧基肽酶D(gp180)、B類I型清道夫受體(scavengerreceptor class B type I，SR-BI)、甘露糖結(jié)合的凝血素DC SIGN(mannose bindinglectins DC SIGN)、L SIGN、無(wú)唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor，ASGPr)、HAV細(xì)胞受體1(HAV cellular receptor 1，HAVcr-1)及其他在肝細(xì)胞表面特異或相對(duì)特異表達(dá)的蛋白。本發(fā)明中的一個(gè)實(shí)施例中，X來(lái)源于人HBV的病毒蛋白，優(yōu)選地來(lái)源于人HBV的表面大蛋白，進(jìn)一步地優(yōu)選來(lái)源于HBV表面大蛋白Pre-S1區(qū)，其序列可進(jìn)一步優(yōu)選地自N和/或C末端縮短0至119個(gè)氨基酸，尤其優(yōu)選X包含SEQ ID1或與該序列具有0.1％至99.9％同源性的氨基酸序列，同時(shí)也包括來(lái)源于不同基因型(包括A至H基因型)和血清型(包括ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq+、adrq-)表面大蛋白序列和突變序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，X特別優(yōu)選地采用如SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
本發(fā)明中X任何部分或末端可被優(yōu)選地修飾，這些修飾包括在其N和/或C末端添加1至1000個(gè)氨基酸組成的多肽序列、在X的任何部分糖基化等化學(xué)修飾，較優(yōu)選地SEQ ID NO7的第13位氨基酸甘氨酸或本發(fā)明所包含其他序列所對(duì)應(yīng)的氨基酸帶有的疏水基團(tuán)，這些疏水基團(tuán)優(yōu)選地具有4個(gè)以上碳原子的飽和或不飽和脂肪酸的丙烯殘基，更優(yōu)選的是豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸或花生四烯酸。疏水基團(tuán)另外還優(yōu)選膽固醇及其類似基團(tuán)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的第13位氨基酸甘氨酸經(jīng)豆蔻酰化(myristoylation)修飾。本發(fā)明中X的任何氨基酸殘基可被替換，在一個(gè)優(yōu)選方案中，SEQ ID NO6的第15位氨基酸N(天冬酰氨)可被氨基酸Q(谷氨酰氨)替代。
本發(fā)明中的L為X與Y之間的任何連接(可完全缺失，使X與Y直接連接)，這些連接包括氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、化學(xué)鍵、核酸(DNA或RNA)、偶聯(lián)劑(包括硫醋類、碳化二亞酰胺、琥珀酰亞胺酯類、二異氰酸酯(例如甲苯-2，6-二異氰酸酯)、谷二醛(gluteraldehydes)、重氮苯和六亞甲基二胺類(例如雙-(對(duì)重氮苯甲?；?-乙二胺)、亞氨酸酯類的雙功能化衍生物(例如己二酰亞胺酸二甲酯)、雙活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)、N-琉拍酞亞胺基-3--(2-吡啶基二硫代)丙酸(SPDP)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)、4-琥珀酰亞胺基氧基羰基-α-甲基-α(2-吡啶基-二硫代)-甲苯(SMPT)以及其他偶聯(lián)劑)，以及其他用于生物分子之間的連接。優(yōu)選地L為多肽連接，較優(yōu)選地含有絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸等柔性氨基酸組成的多肽鏈，更優(yōu)選地L為含有1至999個(gè)氨基酸的多肽鏈。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，L為SEQ ID NO4所示的多肽鏈。
本發(fā)明中Y表示具有藥理或生理作用的藥物或基團(tuán)，優(yōu)選地Y為對(duì)肝細(xì)胞、肝腫瘤細(xì)胞、肝細(xì)胞內(nèi)病毒或肝臟內(nèi)的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞及病原微生物具有藥理或生理作用的藥物或基團(tuán)。Y包括蛋白質(zhì)、多肽、細(xì)胞毒性小分子藥物、放射性藥物及其他藥物，較優(yōu)選地Y為對(duì)肝細(xì)胞、肝腫瘤細(xì)胞、肝細(xì)胞內(nèi)病毒或肝臟內(nèi)的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞及病原微生物具有藥理或生理作用的蛋白質(zhì)，包括細(xì)胞因子、毒性蛋白，更優(yōu)選地Y為細(xì)胞因子，包括干擾素(interferon，IFN)、白細(xì)胞介素(包括白細(xì)胞介素1、白細(xì)胞介素2至白細(xì)胞介素100)、生長(zhǎng)因子(包括肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞增殖素、肝生長(zhǎng)抑制因子、肝促分化因子、促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素、肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子、纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、角蛋白細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因、胰島素樣生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、干細(xì)胞因子、生長(zhǎng)激素、腫瘤特異性生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、集落刺激因子(包括粒細(xì)胞集落刺激因子、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、紅細(xì)胞生成素、干細(xì)胞生成因子、多能集落刺激因子)、趨化因子(包括趨化因子α、β、γ、δ)及這些細(xì)胞因子的突變體和人工設(shè)計(jì)序列。尤其優(yōu)選地Y為干擾素，包括IFNα、β、γ、ω、κ、τ、δ及其突變體和人工設(shè)計(jì)序列。特別優(yōu)選地Y為干擾素α，包括IFNα-1a、α-1b、α-2a、α-2b其突變體和人工設(shè)計(jì)干擾素(包括INFERGEN及其他復(fù)合干擾素(consensus interferon)，以及其他具有干擾素活性的突變體和人工設(shè)計(jì)的干擾素)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，Y為IFNα-2b(SEQ ID NO5)或其突變體。本發(fā)明的Y包括與SEQ ID NO5具有大于50％同源性的氨基酸序列。Y的任何部分或末端可被修飾，這些修飾包括在其N和/或C末端添加1至1000個(gè)氨基酸組成的多肽序列、在Y的任何部分糖基化、去糖基化、聚乙二醇(PEG)及其他化學(xué)修飾。
本發(fā)明中X和Y的位置可顛倒，X、L、Y之間可進(jìn)行單一的或多倍的排列組合，例如但不限于形成X-L-Y-L-X、Y-X-Y等形式。多倍排列組合中的各X或Y可相同或不同。在本發(fā)明中的一個(gè)優(yōu)選方案中，采用X-L-Y結(jié)構(gòu)，X來(lái)源于人乙型肝炎病毒表面大蛋白Pre-S1區(qū)多肽，L為柔性氨基酸鏈接，Y為干擾素α-2b，從而發(fā)明了特異靶向性干擾素，特別優(yōu)選氨基酸序列見(jiàn)SEQ ID NO7，其中X和Y分別位于序列的N和C末端，該特異靶向性IFN，能在延長(zhǎng)IFN半衰期的同時(shí)，將IFN靶向到肝臟，提高了IFN在肝臟的局部濃度，且在增強(qiáng)IFN治療肝部疾病療效的同時(shí)降低肝臟外IFN引起的不良反應(yīng)。。
本發(fā)明的特異靶向性藥物可采用核酸序列編碼(包括DNA和RNA序列)，優(yōu)選地采用DNA序列編碼。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，優(yōu)選的氨基酸序列見(jiàn)SEQ ID NO7，其對(duì)應(yīng)的DNA編碼序列為SEQ ID NO8，本發(fā)明包含與SEQ ID NO8編碼相同氨基酸序列的簡(jiǎn)并DNA序列。在保持簡(jiǎn)并性條件下優(yōu)選地按照細(xì)菌、酵母細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞及其他細(xì)胞或生物喜用密碼子規(guī)律調(diào)整DNA編碼序列，使DNA編碼序列更好地在細(xì)菌、酵母細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞及其他細(xì)胞或生物中表達(dá)。本發(fā)明優(yōu)選地采用酵母細(xì)胞喜用密碼子編碼靶向性干擾素SEQ ID NO7，其相應(yīng)的DNA序列為SEQ ID NO9。進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明對(duì)SEQ ID NO6中的潛在糖基化為點(diǎn)進(jìn)行替換，以避免在酵母表達(dá)過(guò)程中特異靶向性干擾素被過(guò)分糖基化而影響特異靶向性干擾素的活性，替換后的序列為SEQ ID NO7。其他位點(diǎn)經(jīng)替換而形成的序列為本發(fā)明的一部分，本發(fā)明包含與SEQ ID NO8和SEQ ID NO9具有大于50％同源性的DNA序列。
本發(fā)明中的載體包括細(xì)菌表達(dá)載體、酵母表達(dá)載體、動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體、植物細(xì)胞表達(dá)載體、昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體、病毒載體及其他表達(dá)載體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中將編碼特異靶向性藥物的DNA片段克隆入酵母分泌性表達(dá)和胞內(nèi)表達(dá)載體，這些載體包括pPIC9、pPIC9K、pPIC3、pPIC3K、pA0804、pA0815、pHIL-S1、pHIL-D2、pHW010、pPICZ、pPICZα、pGAPZ、pGAPZα、pYAM7SP6、pMEN6K、pMEX9K及其他酵母表達(dá)載體。更優(yōu)選地將編碼特異靶向性藥物的DNA片段克隆入pPIC9K酵母表達(dá)載體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，化學(xué)合成的特異靶向性干擾素編碼DNA片段克隆入pPIC9K酵母表達(dá)載體，形成重組酵母表達(dá)載體pPIC9K-IFN(圖3B)。
本發(fā)明還包含由含有編碼特異靶向性藥物DNA序列表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞宿主和動(dòng)植物宿主，這些細(xì)胞宿主包括細(xì)菌、酵母菌、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞，其中的細(xì)菌包括大腸桿菌DH5α、BL21、JM83、JM107、JM109、C600、KS476、JM109、MC1061、YA21、YK537；動(dòng)物宿主包括牛、羊、豬；植物宿主包括番茄、馬鈴薯、香蕉。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，包含由含有特異靶向性藥物DNA序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母菌，這些酵母菌包括巴斯德畢赤氏母(Pichia pastoris)、博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)、漢遜酵母(Hansenula)、球擬酵母(Torulopsis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，優(yōu)選巴斯德畢赤酵母和多形漢遜酵母，尤其優(yōu)選營(yíng)養(yǎng)缺陷型巴斯德畢赤酵母菌株GS115(NRRLY-15851)、GS190(NRRLY-18014)、PPFI(NRRLY-18017)、KM71和蛋白酶缺陷型巴斯德畢赤酵母菌株SMD 1168，特別優(yōu)選巴斯德畢赤酵母菌株GS115。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，重組的酵母表達(dá)載體pPIC9K-IFN經(jīng)線性化后轉(zhuǎn)化酵母菌GS115，經(jīng)篩選獲得整合有特異靶向性干擾素編碼DNA序列的GS115菌株。
整合有特異靶向性藥物編碼DNA序列的宿主，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)或發(fā)酵，表達(dá)特異靶向性藥物，經(jīng)純化可獲得特異靶向性藥物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，整合有特異靶向性干擾素編碼DNA序列的宿主GS115菌株經(jīng)發(fā)酵表達(dá)特異靶向性干擾素蛋白。這些含有特異靶向性干擾素蛋白的發(fā)酵上清經(jīng)純化后獲得特異靶向性干擾素純蛋白。特異靶向性干擾素按照中國(guó)生物制品規(guī)程(中國(guó)生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)編.[M].北京化學(xué)工業(yè)出版社，2000，373-375.)進(jìn)行活性測(cè)定，表明目的蛋白具有良好的抗病毒活性(0.9×108IU/mg)。同時(shí)，特異靶向性干擾素對(duì)人肝細(xì)胞具有明顯的特異性親和作用。
本發(fā)明中所述藥物組合物含有安全有效量的特異靶向性藥物和藥學(xué)上可接受的載體，這類載體包括淀粉、糊精、蔗糖、乳糖、纖維素類、硬脂酸鎂、吐溫-80、卡波姆、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉、甘油、明膠、聚乙二醇、硫柳汞、尼泊金丙酯、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、三氯叔丁醇、苯甲酸鈉、硼砂、新潔爾滅、山梨醇、丙二醇、異丙醇、月桂氮桌酮，異丙醇/丙二醇、異丙醇/丙二醇、三乙醇胺、氫氧化鈉凡士林、硬脂酸、液狀石蠟、羊毛脂、十八醇、十六醇、單硬脂酸甘油酯、月桂醇硫酸鈉、司盤60、平平加、甘露醇、山梨醇及其他藥物載體。制劑方式包括注射劑、冷凍干燥注射劑、脂質(zhì)體注射劑、靶向給藥注射劑、片劑、膠囊劑、噴霧劑、凝膠劑、凝膠吸入劑、口服液、混懸劑、沖劑、貼劑、丸劑、散劑、注射劑、輸液劑、栓劑、緩釋制劑、控釋制劑及其他制劑。
本發(fā)明還包括特異靶向性藥物在制備治療肝炎(包括甲、乙、丙、丁、戊及其他型病毒性肝炎)、肝硬化、肝臟腫瘤(原發(fā)腫瘤及轉(zhuǎn)移腫瘤)及其他肝臟疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的特異靶向性藥物利用嗜肝病毒的嗜肝特異性分子機(jī)制，將介導(dǎo)肝細(xì)胞特異性感染的病毒蛋白或多肽與治療性分子相連接，產(chǎn)生的特異靶向性藥物可對(duì)病毒性肝炎、肝硬化、肝臟腫瘤等肝臟疾病進(jìn)行靶向治療，在增強(qiáng)藥物療效的同時(shí)又降低藥物對(duì)肝臟以外器官造成的不良反應(yīng)。


圖1特異靶向性干擾素氨基酸序列N連接糖基化位點(diǎn)分析；圖2編碼特異靶向性干擾素DNA序列的酵母菌密碼子偏好性分析；圖3pPIC9K、pPIC9K-IFN圖譜及KEX-2、STE-13酵母內(nèi)源蛋白酶加工位點(diǎn)；圖4特異靶向性干擾素SDS-PAGE電泳圖及HPLC純度分析圖；圖5FITC標(biāo)記的特異靶向性干擾素及rIFNα-2b對(duì)人肝細(xì)胞親和力比較。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1特異靶向性干擾素氨基酸序列的設(shè)計(jì)1.X序列選擇HBV毒株FMC#97表面大蛋白第1到50氨基酸序列(SEQ ID NO3)，該序列包括被廣泛證實(shí)的與肝細(xì)胞表面特異性結(jié)合并介導(dǎo)HBV感染肝細(xì)胞的關(guān)鍵序列。
2.L選擇由柔性氨基酸組成的序列(SEQ ID NO4)，以減少X與Y之間在蛋白構(gòu)象和功能上的相互影響。
3.Y序列選擇IFNα-2b全長(zhǎng)氨基酸序列(SEQ ID NO5)。
4.X和Y分別位于L序列的N末端和C末端，形成的整體序列見(jiàn)SEQ ID NO6。
5.對(duì)SEQ ID NO6進(jìn)行糖基化位點(diǎn)分析(見(jiàn)圖1)，其中第15位氨基酸天冬酰氨為可能的N連接糖基化修飾位點(diǎn)，將其進(jìn)行類似氨基酸突變替換(15N→Q)，以消除特異靶向性干擾素在酵母表達(dá)過(guò)程中出現(xiàn)過(guò)度糖基化而影響IFN和Pre-S1的功能活性，形成的最終特異靶向性干擾素氨基酸序列為SEQ ID NO7。
實(shí)施例2編碼特異靶向性干擾素的DNA序列的設(shè)計(jì)1.選擇畢赤酵母作為特異靶向性干擾素的表達(dá)系統(tǒng)。畢赤酵母是一種用于外源蛋白表達(dá)最成功的真核表達(dá)系統(tǒng)(Cereghino J L，Cregg J M.Heterologous proteinexpression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].FEMS MicrobiolRev，2000，24(1)45-66.)。既具有原核表達(dá)系統(tǒng)繁殖迅速、費(fèi)用低廉及操作方便的特點(diǎn)，又具有外源蛋白質(zhì)加工折疊正確和適度糖基化的真核表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)。因此越來(lái)越廣泛地用于蛋白質(zhì)的大量表達(dá)，目前已有200多種蛋白在該表達(dá)系統(tǒng)中得以表達(dá)(Cregg JM，Cereghino JL，Shi JY，et al.Recombinant protein expression inPichia pastoris[J].Mol Biotechnol，2000，16(1)23-52.)。畢赤酵母具有胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)兩種表達(dá)方式，其中分泌表達(dá)方式因其表達(dá)量高、糖基化完全、二硫鍵和高級(jí)結(jié)構(gòu)形成正確、后續(xù)分離純化簡(jiǎn)便而備受青睞。
2.進(jìn)行特異靶向性干擾素編碼基因設(shè)計(jì)時(shí)考慮如下原則1)特異靶向性干擾素編碼基因盡可能選用巴斯德畢赤酵母醇氧化酶(AOX 1)基因偏愛(ài)的密碼子，降低該基因中畢赤酵母罕用密碼子的比例；2)消除特異靶向性干擾素基因內(nèi)部可能出現(xiàn)的復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)(包括重復(fù)結(jié)構(gòu)、互補(bǔ)結(jié)構(gòu)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)及大片段的反向回文結(jié)構(gòu)等)；3)消除特異靶向性干擾素基因內(nèi)部不適宜基因操作的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；4)在特異靶向性干擾素基因內(nèi)部盡量減少連續(xù)的G-C配對(duì)，增加畢赤酵母偏愛(ài)的A-T配對(duì)，但避免出現(xiàn)基因G+C％失調(diào)。
3.特異靶向性干擾素SEQ ID NO7對(duì)應(yīng)的自然DNA序列為SEQ ID NO8，其酵母密碼子偏好分析見(jiàn)圖2A。經(jīng)過(guò)以上原則的重新設(shè)計(jì)，用于酵母表達(dá)載體的特異靶向性干擾素DNA序列為SEQ ID NO9，其酵母密碼子偏好分析見(jiàn)圖2B，未見(jiàn)偏好小于10％的稀有密碼子。
實(shí)施例3特異靶向性干擾素酵母表達(dá)載體的構(gòu)建1.選擇pPIC9K為特異靶向性干擾素的酵母表達(dá)載體。pPIC9K是Invitrogen公司推出的多拷貝分泌型表達(dá)載體，大小為9.3kb(如圖3A)。該載體含有大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)Col E1和氨芐青霉素及卡那霉素兩個(gè)抗性基因，其中卡那霉素抗性基因還可以使畢赤酵母對(duì)G418產(chǎn)生抗性，可用于多拷貝插入的篩選。載體中使用醇氧化酶基因的啟動(dòng)子(pAOX1)做為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子受葡萄糖抑制，甲醇誘導(dǎo)后才開(kāi)始轉(zhuǎn)錄和翻譯，非常適合于外源基因的表達(dá)。pPIC9K利用a交配因子引導(dǎo)序列的分泌信號(hào)將目的基因產(chǎn)物分泌至胞外。由于畢赤酵母本身僅將總量5％的蛋白分泌至胞外，因此對(duì)分泌表達(dá)的蛋白進(jìn)行分離純化極為方便。該載體在a交配因子引導(dǎo)序列與目的蛋白之間引入了酵母內(nèi)源性蛋白酶KEX-2和STE-13加工位點(diǎn)(圖3C)，使表達(dá)的目的產(chǎn)物經(jīng)酵母內(nèi)源性蛋白酶加工后，可以直接獲得N末端無(wú)a交配因子引導(dǎo)序列的目的蛋白。
2.在設(shè)計(jì)的特異靶向性干擾素DNA序列(SEQ ID NO9)的5’和3’兩端根據(jù)需要分別加入EcoR I、Not I酶切位點(diǎn)粘性末端。化學(xué)合成特異靶向性干擾素DNA序列的正鏈和負(fù)鏈，退火后將特異靶向性干擾素DNA序列克隆入pPIC9K的EcoR I、NotI酶切位點(diǎn)。將鏈接后的載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌中擴(kuò)增，挑取單克隆菌落，抽提質(zhì)粒測(cè)序鑒定正確連入的重組pPIC9K，即pPIC9K-IFN(圖3B)。
實(shí)施例4特異靶向性干擾素的酵母表達(dá)1.酵母表達(dá)載體分為附加體型與整合體型兩種宿主攜帶方式。附加體型的重組載體存在于酵母的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，重組質(zhì)粒在酵母宿主細(xì)胞芽殖分裂、世系傳代中容易丟失，因而難以用于工業(yè)化大型發(fā)酵罐的大生產(chǎn)。整合體型表達(dá)載體是以線形化質(zhì)?；颦h(huán)形質(zhì)粒形式通過(guò)同源重組方法整合到酵母的基因組內(nèi)(單拷貝或多拷貝整合)，然后隨著酵母宿主菌染色體的復(fù)制而復(fù)制，外源目的基因在酵母世系傳代趨于穩(wěn)定，適合用工業(yè)化大型發(fā)酵罐來(lái)進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。pPIC9K即為多拷貝整合體型酵母表達(dá)載2.重組酵母表達(dá)載體pPIC9K-IFN經(jīng)酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌GS115，其方法參照Invitrogen畢赤酵母實(shí)驗(yàn)手冊(cè)。
3.重組酵母克隆的篩選，其篩選方法參照Invitrogen畢赤酵母實(shí)驗(yàn)手冊(cè)。
4.特異靶向性干擾素的誘導(dǎo)表達(dá)將篩選出的重組克隆接種于5ml BMGY培養(yǎng)基中，30℃ 300r/min培養(yǎng)至OD6004.0至6.0。室溫6000r/min離心4min收集菌體，用BMMY懸浮并稀釋至OD6001.0，30℃ 300r/min每12h補(bǔ)充甲醇至0.5％誘導(dǎo)培養(yǎng)48h后收集培養(yǎng)上清，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)。
5.結(jié)果顯示，電轉(zhuǎn)化后的畢赤酵母GS115經(jīng)過(guò)篩選得到1個(gè)最高表達(dá)的轉(zhuǎn)化酵母宿主菌株(GS115/pPIC9K-IFN)。
實(shí)施例5特異靶向性干擾素的分離純化1.在本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)酵母工程菌(GS115/pPIC9K-IFN)的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵罐用)均為已知培養(yǎng)基，如YPD平板、BMGY液體培養(yǎng)基、基礎(chǔ)鹽(合成)培養(yǎng)基(參見(jiàn)“High Cell-Density Fermentation in Pichia Protocols”，editedby David R.Higgins and James M.Cregg，Vol.103，107-120，1998)和FM22培養(yǎng)基；酵母工程菌(GS115/pPIC9K-IFN)的種子培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)、外源蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的方法，均為Pichiafermentation process guidelines(Invitrogen Corporation，2002)上提到的方法或在此基礎(chǔ)上修改的方法。
2.GS115/pPIC9K-IFN高表達(dá)酵母經(jīng)種子培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)、外源蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后，將誘導(dǎo)發(fā)酵48h的菌液10,000r/min離心10min后，取上清用0.45um濾膜過(guò)濾，上清液經(jīng)Hiprep疏水層析、Blue Sepharose FF親和層析、Superdex 75凝膠過(guò)濾層析純化。
3.GS115/pPIC9K-IFN高表達(dá)酵母經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后發(fā)酵液內(nèi)特異靶向性干擾素經(jīng)純化后，SDS-PAGE(圖4A)所示分子量約27kDa處蛋白條帶即為重組酵母表達(dá)的特異靶向性干擾素蛋白，HPLC鑒定純度大于95％(圖4B)。
實(shí)施例6特異靶向性干擾素的干擾素活性檢測(cè)1.通過(guò)WISH-VSV法測(cè)定特異靶向性干擾素的干擾素活性。
2.將人羊膜WISH細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔3.5×1011cell/100ul，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)4-6h，取純化的特異靶向性干擾素做系列稀釋后每孔加入100ul，37℃培養(yǎng)24h后吸棄上清，用含3％牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋水泡性口炎病毒(VSV)至工作濃度(250TCID50/ml)，每孔加入100ul以感染W(wǎng)ISH細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
3.每孔加入200ul0.5％的結(jié)晶紫液(0.5g結(jié)晶紫、0.85g NaCl溶于50ml無(wú)水乙醇、3ml甲醇、47ml水)，置37℃15min，漂洗殘余染料，每孔加入200ul脫色液溶解細(xì)胞內(nèi)染料，測(cè)定每孔的A578nm吸收值，以rHuIFNα-2b為參考品按下列公式計(jì)算特異靶向性干擾素效價(jià)待檢樣品效價(jià)＝標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)×(待檢樣品預(yù)稀釋倍數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋倍數(shù))×(待檢樣品半效稀釋倍數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)品半效稀釋倍數(shù))其中待檢樣品半效稀釋倍數(shù)，即從特異靶向性干擾素溶液至相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品50％最大效應(yīng)點(diǎn)的稀釋倍數(shù)。
4.結(jié)果表明特異靶向性干擾素比活達(dá)到0.9×108IU/mg。
實(shí)施例7特異靶向性干擾素肝細(xì)胞靶向效應(yīng)的檢測(cè)1.人原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)非HBV相關(guān)的肝癌患者外科手術(shù)腫瘤切除物相鄰的正常組織，按文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行分離〔Guguen-Guillouzo，C.，和A.Guillouzo，1986.Methods for preparation of adult and fetal hepatocytes，第1-12頁(yè)，在A.Guillouzo和C.Guguen-Guillouzo編輯的“Isolated and cultured hepatocytes”中.Les E′ditions INSERM Paris，John Libbey and Co.，Ltd.，英國(guó)倫敦〕，培養(yǎng)于添加了3.5×10-6M氫化可的松琥珀酸單酯(hydrocortisone hemisuccinate)、2％二甲基亞亞砜、5％人血清和5％胎牛血清的H培養(yǎng)基中。
2.特異靶向性干擾素和rHuIFNα-2b蛋白的FITC標(biāo)記。將蛋白溶液置于碳酸鹽緩沖液(0.16M Na2CO3，0.33M NaHCO3，pH9.5)中透析過(guò)夜。FITC溶于DMSO中，終濃度為1mg/ml。將透析過(guò)的蛋白溶液置于小瓶中，按250μg FITC/mg蛋白的比例，邊攪拌邊滴加適量的FITC溶液。于4℃，避光攪拌結(jié)合12hr。將Sephadex G25充分膨脹后，仔細(xì)裝柱，柱長(zhǎng)度為15cm，直徑為0.9cm，柱體積為9.5ml。裝柱完畢后，于凝膠表面覆蓋一層濾紙，用PBS充分洗柱。將標(biāo)記的蛋白混合液加入柱中，上樣體積不超過(guò)柱床體積的10％。用PBS洗脫，收集第一個(gè)洗脫峰，檢測(cè)各收集管的A280和A495。計(jì)算熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合比率(F/P)，計(jì)算公式為F/P＝2.87×A495/(A280-0.35×A495)。F/P值為2～4的組份混合，PBS透洗后即為FITC標(biāo)記好的蛋白。
3.人原代肝細(xì)胞于12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔約106細(xì)胞與FITC標(biāo)記的特異靶向性干擾素或rHuIFNα-2b蛋白孵育60分鐘。移除上清后PBS漂洗細(xì)胞2次，經(jīng)1％甲醛固定后于熒光顯微鏡488nm下觀察?？梢?jiàn)特異靶向性干擾素(圖5A)較rHuIFNα-2b(圖5B)對(duì)肝細(xì)胞具有更高的親和力。
序列表<110>劉宏利<120>特異靶向性藥物及其用途<130>NP-10451<160>9<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>119<212>PRT<213>人乙型肝炎病毒<400>1Met Gly Gly Trp Set Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu1 5 10 15Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro20 25 30Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn35 40 45Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly50 55 60Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln65 70 75 80Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Val Ala Pro Pro Pro Ala Ser85 90 95Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu100 105 110Arg Asp Ser His Pro Gln Ala115
<210>2<211>166<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu1 5 10 15Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys20 25 30Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe35 40 45Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile50 55 60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr65 70 75 80Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu85 90 95Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met100 105 110Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr115 120 125Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val130 135 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu145 150 155 160Ser Leu Arg Ser Lys Glu165
<210>3<211>62<212>PRT<213>人乙型肝炎病毒<400>3Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu1 5 10 15Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro20 25 30Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Ash Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn35 40 45Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala50 55 60<210>4<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(7)<400>4Gly Ser Gly Ser Gly Ser1 5
<210>5<211>165<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>5Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met1 5 10 15Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp20 25 30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe50 55 60Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65 70 75 80Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu85 90 95Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys100 105 110Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu115 120 125Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg130 135 140Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser145 150 155 160Leu Arg Ser Lys Glu165
<210>6<211>233<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(233)<220>
<221>MOD_RES<222>(13)..(13)<220>
<221>MUTAGEN<222>(15)..(15)<400>6Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu1 5 10 15Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro20 25 30Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn35 40 45Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Ser Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg65 70 75 80Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser
85 90 95Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly100 105 110Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile115 120 125Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp130 135 140Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu145 150 155 160Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr165 170 175Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln180 185 190Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp195 200 205Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn210 215 220Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu225 230<210>7<211>233<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(233)
<220>
<221>MOD_RES<222>(13)..(13)<400>7Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Gln Leu1 5 10 15Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro20 25 30Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn35 40 45Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Ser Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg65 70 75 80Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser85 90 95Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly100 105 110Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile115 120 125Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp130 135 140Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu145 150 155 160Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr165 170 175Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln180 185 190
Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp195 200 205Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn210 215 220Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu225 230<210>8<211>705<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(705)<400>8atgggaggtt ggtcttccaa acctcgaaaa ggcatgggga cgcaactttc tgttcccaat 60cctctgggat tctttcccga tcaccagttg gaccctgcgt tcggagccaa ctcaaacaat 120ccagattggg acttcaaccc caacaaggat cactggccag aggcaaatca ggtaggagcg 180ggagcaggtt ctggttctgg ttcttgtgac ctaccacaaa cccacagcct gggtagcagg 240aggaccttga tgctcctggc gcagatgagg agaatctctc ttttctcctg cttgaaggac 300agacatgact ttggatttcc ccaggaggag tttggcaacc agttccaaaa ggctgaaacc 360atccctgtcc tccatgagat gatccagcag atcttcaacc tcttcagcac aaaagactca 420tctgctgctt gggatgagac cctcctagac aaattctaca ctgaactcta ccagcagctg 480aatgacctgg aagcctgtgt gatacagggg gtgggggtga cagagactcc cctgatgaag 540gaggactcca ttctggctgt gaggaaatac ttccaaagaa tcactctcta tctgaaagag 600aagaaataca gcccttgtgc ctgggaggtt gtcagagcag aaatcatgag atctttttct 660ttgtcaacaa acttgcaaga aagtttaaga tctaaagagt aatag 705
<210>9<211>705<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(705)<400>9atgggaggtt ggtcttccaa acctagaaaa ggtatgggta ctcaactttc tgttcccaat 60cctctgggat tctttcccga tcaccagttg gaccctgctt tcggagccaa ctcaaacaat 120ccagattggg acttcaaccc caacaaggat cactggccag aggcaaatca ggtaggagct 180ggagcaggtt ctggttctgg ttcttgtgac ttgccacaaa cccactccct gggttccagg 240aggaccttga tgttgctggc tcagatgagg agaatctctc ttttctcctg cttgaaggac 300agacatgact ttggatttcc ccaggaggag tttggcaacc agttccaaaa ggctgaaacc 360atccctgtct tgcatgagat gatccagcag atcttcaact tgttctccac aaaagactca 420tctgctgctt gggatgagac cttgttggac aaattctaca ctgaattgta ccagcagctg 480aatgacctgg aagcctgtgt gatacagggt gtgggtgtga cagagactcc cctgatgaag 540gaggactcca ttctggctgt gaggaaatac ttccaaagaa tcactttgta tctgaaagag 600aagaaatact ccccttgtgc ctgggaggtt gtcagagcag aaatcatgag atctttttct 660ttgtcaacaa acttgcaaga aagtttaaga tctaaagagt aatag 70權(quán)利要求
1.一種特異靶向性藥物，其特征在于，它具有通式X-L-Y，其中，X表示氨基酸序列，該序列包含(a)來(lái)源于具有肝臟特異性或相對(duì)特異性感染病毒的蛋白的氨基酸序列，(b)由(a)的序列發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的置換、缺失、插入或添加且與(a)具有相同活性的氨基酸序列，所述病毒蛋白與細(xì)胞感染受體或輔受體相結(jié)合，并介導(dǎo)或輔助病毒的感染；L表示X與Y之間的任一連接，該連接可缺失；Y表示對(duì)正常細(xì)胞、病理狀態(tài)下細(xì)胞、受感染細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞及病原微生物具有藥理或生理作用的藥物或基團(tuán)；所述X和Y的位置可顛倒，X、L、Y之間可進(jìn)行單一或多倍的排列組合，且多倍排列組合中的各X或Y可相同或不同。
2.如權(quán)利要求1所述的特異靶向性藥物，其特征在于，所述具有肝臟特異性或相對(duì)特異性感染病毒包括甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒及未分型肝炎病毒。
3.如權(quán)利要求1所述的特異靶向性藥物，其特征在于，所述Y是對(duì)正常肝細(xì)胞、病理狀態(tài)下肝細(xì)胞、受感染肝細(xì)胞、肝腫瘤細(xì)胞及肝細(xì)胞內(nèi)病毒或病原微生物具有藥理或生理作用的藥物，包括蛋白質(zhì)、多肽、細(xì)胞毒性藥物、小分子藥物及放射性藥物。
4.如權(quán)利要求3所述的特異靶向性藥物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)藥物包括細(xì)胞因子、干擾素、白細(xì)胞介素、生長(zhǎng)因子、集落刺激因子、趨化因子及該類蛋白質(zhì)藥物的突變體。
5.如權(quán)利要求1或2所述的特異靶向性藥物，其特征在于，所述X序列包含人乙型肝炎病毒表面大蛋白Pre-S1的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
6.如權(quán)利要求5所述的特異靶向性藥物，其特征在于，所述X序列包含具有SEQ ID NO1氨基酸序列的人乙型肝炎病毒表面大蛋白Pre-S1多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
7.如權(quán)利要求6所述的特異靶向性藥物，其特征在于，所述X序列選自下組(a)具有SEQ ID NO1氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO1氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的置換、缺失、插入或添加且具有與SEQ ID NO1氨基酸序列相同活性的由(a)衍生的多肽。
8.如權(quán)利要求7所述的特異靶向性藥物，其特征在于，所述X序列為(b)多肽，優(yōu)選為具有SEQ ID NO3氨基酸序列的多肽。
9.如權(quán)利要求1所述的特異靶向性藥物，其特征在于，所述L為X與Y之間的氨基酸連接。
10.如權(quán)利要求3或4所述的特異靶向性藥物，其特征在于，所述Y包含干擾素α、干擾素β、干擾素γ、干擾素ω、干擾素κ、干擾素τ、干擾素δ，或其保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物。
11.如權(quán)利要求10所述的特異靶向性藥物，其特征在于，所述Y選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的干擾素α-2b；(b)由(a)的蛋白發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的置換、缺失、插入或添加且與(a)的干擾素α-2b具有相同活性的衍生蛋白質(zhì)。
12.如權(quán)利要求11所述的特異靶向性藥物，其特征在于，所述Y為(b)蛋白質(zhì)，優(yōu)選為具有SEQ ID NO5氨基酸序列的干擾素α-2b。
13.如權(quán)利要求9所述的特異靶向性藥物，其特征在于，所述L為主要由G(甘氨酸)、A(丙氨酸)、S(絲氨酸)和T(蘇氨酸)四種氨基酸組成的氨基酸序列。
14.如權(quán)利要求1至13中的任一項(xiàng)所述的特異靶向性藥物，其特征在于，所述藥物具有SEQ ID NO6的氨基酸序列，優(yōu)選SEQ ID NO6氨基酸序列第15位氨基酸N(天冬酰氨)被氨基酸Q(谷氨酰氨)替換，產(chǎn)生SEQ ID NO7氨基酸序列。
15.一種核酸分子，其特征在于，它編碼權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的特異靶向性藥物的氨基酸序列。
16.如權(quán)利要求15所述的核酸分子，其特征在于，它包括下列核苷酸序列之一(1)序列表中SEQ ID NO8或SEQ ID NO9的DNA序列；(2)編碼序列表中SEQ ID NO7氨基酸序列的多核苷酸；(3)與序列表中SEQ ID NO8或SEQ ID NO9的DNA序列具有70％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
17.一種載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求15或16所述的核酸分子。
18.一種用權(quán)利要求17所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
19.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的特異靶向性藥物和藥學(xué)上可接受的載體。
20.權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的特異靶向性藥物在制備治療肝臟局域性疾病的藥物中的應(yīng)用，所述肝臟局域性疾病包括病毒性肝炎、肝硬化及肝臟腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種特異靶向性藥物、編碼該種特異靶向性藥物的核酸序列、含有該核酸序列的表達(dá)載體以及由該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，本發(fā)明還公開(kāi)了特異靶向性藥物在制備治療肝臟疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的特異靶向性藥物將介導(dǎo)肝細(xì)胞特異性感染的病毒蛋白或多肽與治療性藥物相連接，產(chǎn)生的特異靶向性藥物可對(duì)病毒性肝炎、肝硬化、肝臟腫瘤等肝臟疾病進(jìn)行靶向治療，在增強(qiáng)藥物療效的同時(shí)又降低藥物對(duì)肝臟以外器官造成的不良反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61K38/21GK101045156SQ20061002518
公開(kāi)日2007年10月3日 申請(qǐng)日期2006年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月29日
發(fā)明者劉宏利 申請(qǐng)人:劉宏利