專利名稱：三氧化二砷在離子交換蛋白中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及三氧化二砷的新用途，具體是指三氧化二砷作為激動劑在離子交換蛋白中的應用。
背景技術：
三氧化二砷(Arsenic(III)oxide)的結(jié)構(gòu)式為 化學式As2O3，分子量197.84，性狀三氧化二砷有非晶系、等軸晶系、單斜晶系的結(jié)晶或無色粉末三種狀態(tài)。它們既容易被還原也容易被氧化。熔點砷華275℃白砷石313℃，溶解度2g/100ml。三氧化二砷具有抗腫瘤藥物作用。在中國專利申請?zhí)朇N02132755.6，公開了一種防治血管再狹窄的藥物，它是用三氧化二砷作為制備防治血管再狹窄的局部給藥的藥物應用。該藥物具有明顯的抑制損傷處血管內(nèi)膜增生、防治再狹窄的作用。在中國專利申請?zhí)朇N200410043871.8，公開了一種治療惡性腦腫瘤的三氧化二砷局部緩釋化療藥。該發(fā)明是由三氧化二砷和高分子生物分解型多聚體材料的復合，采用聚合物藥劑復合法將抗腫瘤作用的三氧化二砷融合于可降解的聚合物高分子聚合物中。通過聚合物的溶蝕和水解，將藥物緩慢、持續(xù)、穩(wěn)定地釋放并發(fā)揮作用。但是，至今為止尚未見到有關三氧化二砷作為激動劑在離子交換蛋白中的應用的報道。陰離子交換蛋白2(AE2)是陰離子交換蛋白家族成員，在細胞膜上普遍存在，其功能是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外酸堿平衡、細胞體積和細胞穩(wěn)態(tài)。各國科學家都對其進行著結(jié)構(gòu)與功能的研究，在研究過程中，如能夠有它的激動劑、抑制劑，將使對陰離子交換蛋白2的研究更深入和便利。目前市場上只有陰離子交換蛋白2抑制劑，無激動劑報道及研發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于擴展三氧化二砷的用途，將其作為激動劑在離子交換蛋白中的應用。
本發(fā)明的目的是通過以下技術方法來實現(xiàn)的本發(fā)明涉及三氧化二砷作為激動劑在離子交換蛋白中的應用。涉及三氧化二砷作為激動劑在陰離子交換蛋白中的應用。還涉及三氧化二砷作為激動劑在陰離子交換蛋白2中的應用。
為了更好的理解本發(fā)明，發(fā)明人采用急性粒細胞性白血病細胞系NB4，急性單核細胞性白血病細胞系U937，急性粒細胞性白血病細胞系HL-60，Kasumi-1以及慢性髓性白血病細胞系K562進行了以下實驗免疫印跡法、流式細胞儀檢測細胞凋亡、白血病細胞分化檢測、半定量RT-PCR、離子交換活性的檢測。結(jié)果顯示了三氧化二砷明顯促進AE2的離子轉(zhuǎn)運活性。進一步說明三氧化二砷是AE2激動劑。
本發(fā)明所公開三氧化二砷在離子交換蛋白中的應用，其優(yōu)點表現(xiàn)在開發(fā)出陰離子交換蛋白2的激動劑，可作為試劑供今后實驗室研究使用。
由于陰離子交換蛋白2調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外酸堿平衡、細胞體積和細胞穩(wěn)態(tài)，如陰離子交換蛋白2功能低下會導致疾病，而它的激動劑可通過刺激陰離子交換蛋白2的功能而發(fā)揮治療作用。因此該發(fā)明有申請國家新藥的前景。


圖1三種濃度0.5(A)，1(D)，2(E)μM三氧化二砷與NB4細胞(白血病細胞)進行孵育0-48小時，分別用蛋白印記檢測AE2表達發(fā)現(xiàn)0.5uM一直上調(diào)AE2表達，1，2μM濃度先上調(diào)后下調(diào)AE2表達。對0.5μM上調(diào)AE2表達進行RNA水平的分析(B和C)顯示RNA并不升高，說明三氧化二砷直接結(jié)合AE2并穩(wěn)定AE2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
圖2用離子成像分析系統(tǒng)對單細胞的離子轉(zhuǎn)運活性進行分析，發(fā)現(xiàn)三氧化二砷明顯促進AE2的離子轉(zhuǎn)運活性，DIDS(4，4.di-isothiocyanostilbene-2，2.-disulphonate)為已知的AE2抑制劑。
圖3三氧化二砷具有降解細胞內(nèi)RARa蛋白的作用，用AE2抑制劑明顯減輕了RARa的降解，進一步說明三氧化二砷是AE2激動劑。
圖4三氧化二砷具有誘導細胞凋亡的作用，用流式和細胞計數(shù)的方法進一步證明1和2μM誘導的NB4細胞凋亡可以被AE2抑制劑DIDS阻斷。A，流式圖；B，A的三組數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果，橫坐標為分組，縱坐標為凋亡細胞比率；C，NB4細胞計數(shù)；D，不表達AE2的Kasumi-1細胞進行對照?？v坐標為凋亡細胞數(shù)。
分組1，不加藥對照；2，加DIDS；3，加1μM三氧化二砷；4，加2μM三氧化二砷；5，加1μM三氧化二砷+DIDS；6，加2μM三氧化二砷+DIDS。
圖5三氧化二砷具有使線粒體膜電位崩塌并誘導細胞凋亡的作用，用流式和蛋白免疫印記的方法進一步證明1和2μM誘導的NB4細胞線粒體膜電位崩塌可以被AE2抑制劑DIDS阻斷。A，NB4流式圖；B，對照Kasumi-1細胞；C和D分別為A和B的三組數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果，Bcl-2和Mcl-1為抗凋亡蛋白，Bax為誘導凋亡蛋白。分組1，不加藥對照；2，加DIDS；3，加1μM三氧化二砷；4，加2μM三氧化二砷；5，加1μM三氧化二砷+DIDS；6，加2μM三氧化二砷+DIDS。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述。
實施例1細胞培養(yǎng)和處理急性粒細胞性白血病細胞系NB4(由Michael Lannotte21博士提供)，急性單核細胞性白血病細胞系U937，急性粒細胞性白血病細胞系HL-60，Kasumi-1以及慢性髓性白血病細胞系K562(來自中國上海生命科學院細胞庫)用含有10％加熱后胎牛血清的1640培養(yǎng)液，在37℃，含5％CO2的空氣以及濕潤的條件下進行培養(yǎng)。在進行實驗的時候，細胞以2-5×105個/ml的密度接種，加入指定濃度的As2O3或者AE蛋白特異性抑制劑DIDS(Sigma)。細胞活率用trypan-blue檢測。
免疫印跡法準備好的樣品用9％-10％的SDS-聚丙烯酰胺分析，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上(Amersham Bioscience，UK)。用0.2％的麗春紅染色確保蛋白條帶的存在。用含5％的TBS封閉以后，分別和AE2的抗體，RARα的抗體，PML的抗體(Santa cruz，RA)，Na+-K+-ATP酶抗體(Sigma，RA)及β-actin抗體(Oncogene，MA)孵育.用辣根過氧化物酶(Cell Signaling，Beverly，MA)按照使用說明檢測信號。所有實驗均重復至少三次并獲得相似結(jié)果。流式細胞儀檢測細胞凋亡用線粒體跨膜電位與Annexin V在流式細胞儀上檢測凋亡細胞。用PBS懸浮大約106個細胞和10μg/ml的rhodamine 123(Rh123，Sigma，St.Louis，MO)在37℃孵育30分鐘。然后用PBS洗一次，再用50μg/ml的propidium iodide(PI，Sigma，St.Louis，MO)染色，用流式細胞儀(Beckman Counter)分別檢測Rh123和PI的熒光的強度。Annexin V檢測使用的是ApoAlert Annexin V kit(BD Biosciences，Palo Alto，CA)，同樣也是用流式細胞儀(Beckman Coulter，Miami，F(xiàn)L)來檢測。
白血病細胞分化檢測用鼠抗CD11b及CD11c的抗體通過流式細胞儀來檢測白血病細胞的分化。簡單來說，用100μl的磷酸緩沖液(PBS)重懸細胞，然后用phycoerythrin(PE)標記的抗CD11c(Beckman)抗體或者fluoresceinisothiocyanate(FITC)標記的抗鼠的CD11b(Beckman)抗體在暗室冰上孵育30分鐘。PE或FITC標記的抗鼠抗體用作非特異陰性對照。細胞洗過之后用流式細胞儀檢測(Beckman Coulter，Miami，F(xiàn)L)，每個樣品至少需要100,000個細胞。
半定量RT-PCR用Trizol試劑(Invitrogen，USA)從細胞中抽提總RNAs。然后用TaKaRa RNA PCR kit(Takara，Dalian，China)按照指示進行逆轉(zhuǎn)錄。AE2和β-actin的cDNAs使用以下引物來擴增AE2的是CGG CGG TGAGAA CAT(上游)和GGC ATG GGC ATC TCA TTG(下游)，-actin cDNA的是CAT CCT CAC CCT GAA GTA CCC(上游)和AGC CTG GAT AGC AAC GTACAT G(下游).PCR的擴增使用了35個循環(huán)。用94℃，30s進行變性，58℃，45s進行退火，72℃，60s進行延伸。使用的PCR儀是GeneAmp PCR System 9600(Perkin-Elmer，Norwalk，CT，USA)，用β-actin的信號強度來校準擴增AE2片段的信號強度。
離子交換活性的檢測將HEK-293T田胞接種在35mm的玻璃皿上，用不含血清的培養(yǎng)液洗過之后用1ml含2μM BCECF-AM的不含血清的培養(yǎng)液在37℃孵育20分鐘。然后用不含血清的培養(yǎng)液洗兩遍，再用含Cl-的Ringer′s緩沖液(5mM glucose，5mM potassium gluconate，1mM calcium gluconate，1mMMgSO4，2.5mM NaH2PO4，25mM NaHCO3，10Mm Hepes pH7.4)在黑暗中孵育20分鐘。玻璃皿用含140mM NaCl的Ringer′s緩沖液和含140mMsodium gluconate的Ringer′s緩沖液交替的進行微灌流，同時還在上述兩種灌流液中分別加入了As2O32μM，以及陰離子交換蛋白抑制劑DIDS100μM進行微灌流。用裝備有NIKON TE2000E Microscope，HAMAMATSU IRCCD JVC color video monitor，DAD-8VCPP 8pinch valve灌流系統(tǒng)(激發(fā)波長440 and 490nm，發(fā)射波長528.7nm.)的離子成像儀來獲得并記錄下熒光圖象。然后用高鉀尼日利亞菌素法通過在四個pH值6.5，7.0，7.5和8.0的熒光強度校正來得到pH曲線。在單個HEK293T細胞內(nèi)的Cl-/HCO3交換活性通過Cl-的滲出以及重新滲入時引起的與pH曲線線形相關變化得到。
結(jié)果1、三種濃度0.5(A)，1(D)，2(E)μM三氧化二砷與NB4細胞(白血病細胞)進行孵育0-48小時，分別用蛋白印記檢測AE2表達發(fā)現(xiàn)0.5μM一直上調(diào)AE2表達，1，2μM濃度先上調(diào)后下調(diào)AE2表達。對0.5μM上調(diào)AE2表達進行RNA水平的分析顯示RNA并不升高，說明三氧化二砷直接結(jié)合AE2并穩(wěn)定AE2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
2、用離子成像分析系統(tǒng)對細胞的離子轉(zhuǎn)運活性進行分析，發(fā)現(xiàn)三氧化二砷明顯促進AE2的離子轉(zhuǎn)運活性。
3、三氧化二砷具有降解細胞內(nèi)RARa蛋白的作用，用AE2抑制劑明顯減輕了RARa的降解，進一步說明三氧化二砷是AE2激動劑。
4、三氧化二砷具有誘導細胞凋亡的作用，用流式和細胞計數(shù)的方法進一步證明1和2μM誘導的NB4細胞凋亡可以被AE2抑制劑DIDS阻斷。
5、三氧化二砷具有使線粒體膜電位崩塌并誘導細胞凋亡的作用，用流式和蛋白免疫印記的方法進一步證明1和2μM誘導的NB4細胞線粒體膜電位崩塌可以被AE2抑制劑DIDS阻斷。
權利要求
1.三氧化二砷作為激動劑在離子交換蛋白中的應用。
2.三氧化二砷作為激動劑在陰離子交換蛋白中的應用。
3.三氧化二砷作為激動劑在陰離子交換蛋白2中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及三氧化二砷的新用途，具體是指三氧化二砷作為激動劑在離子交換蛋白中的應用。其優(yōu)點表現(xiàn)在開發(fā)出陰離子交換蛋白2的激動劑，可作為試劑供今后實驗室研究使用；由于陰離子交換蛋白2調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外酸堿平衡、細胞體積和細胞穩(wěn)態(tài)，如陰離子交換蛋白2功能低下會導致疾病，而它的激動劑可通過刺激陰離子交換蛋白2的功能而發(fā)揮治療作用。因此該發(fā)明有申請國家新藥的前景。
文檔編號A61P43/00GK1861096SQ200610024909
公開日2006年11月15日 申請日期2006年3月21日 優(yōu)先權日2006年3月21日
發(fā)明者傅國輝 申請人:上海交通大學醫(yī)學院