專利名稱：胃泌素在陰離子交換蛋白2中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、藥理學(xué)領(lǐng)域，具體是指胃泌素作為調(diào)節(jié)劑在陰離子交換蛋白2中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胃泌素又稱為促胃液素，其基因位于17號染色體g區(qū)，長度為4. lkb，是ー種重要的肽類胃腸激素，它主要由胃幽門部黏膜的G細(xì)胞分泌。人體產(chǎn)生的胃泌素肽類按長度分有三種其中活性最高的是由17個(gè)氨基酸合成的多肽，稱小胃泌素，它是胃竇提取物的主要形式I. Gastrin-34 有 34 個(gè)氨基酸，稱作 biggastrin ；2. Gastrin-17 有 17 個(gè)氨基酸，稱作 Iittlegastrin ；3. Gastrin-14有14個(gè)氨基酸,稱作minigastrin,而此14個(gè)氨基酸就有全部的生理活性。人體正常胃泌素的生理值為空腹血清胃泌素為20 160ng/L ;餐后將增高2 3倍。目前市場上已經(jīng)有五肽胃泌素用于臨床診斷，但僅用于胃液分析，并非治療用藥，對于慢性萎縮性胃炎等疾病的治療多局限于飲食調(diào)整和中醫(yī)調(diào)理，無法達(dá)到標(biāo)本兼治的目的，如中國專利文獻(xiàn)號CN101890157A中記載的“胃泌素在抑制胃腸腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用”，該文獻(xiàn)公開了胃泌素在抑制胃腸腫瘤細(xì)胞中的新的應(yīng)用，即胃癌靶基因陰離子交換蛋白I與腫瘤抑制蛋白P16相互作用，誘發(fā)胃癌，而胃泌素能夠有效地抑制胃癌靶基因AEl和pl6的表達(dá)，從而達(dá)到治療胃癌的目的。陰離子交換蛋白2(AE2)在人的腎、腸、血管、肺、膽管上皮細(xì)胞、小腸黏膜隱窩細(xì)胞、絨毛細(xì)胞的刷狀緣及早孕絨毛中存在，其中以胃AE2表達(dá)最為豐富。一旦AE2表達(dá)異常，則會(huì)導(dǎo)致眾多病理變化。AE2-/-小鼠，則表現(xiàn)為瘦弱、牙無法萌出和嚴(yán)重生長遲緩，大部分死于斷乳期。此外，該種小鼠還表現(xiàn)無胃酸癥?？梢?，AE2是機(jī)體不可或缺的重要成分。陰離子交換蛋白2是介導(dǎo)胃泌素調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH值的重要因子。AE2調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)PH值、細(xì)胞內(nèi)Cl—和HCO3-的代謝，AE2在多種細(xì)胞中均有分布，但是在壁細(xì)胞含量最高。病理情況下，免疫組化發(fā)現(xiàn)在胃體癌和胃底癌患者中AE2表達(dá)缺乏或降低，血清胃泌素水平也下降，并且血清胃泌素水平和胃癌大小負(fù)相關(guān)。正常胃液pH參考值為O. 8 I. 8 ;空腹胃液游離酸0 30U ;總酸度10 50U ；基礎(chǔ)胃酸分泌量(BAO) :1. 92 5. 88mmol/h ;最大胃酸分泌量(MAO) 3 23mmol/h (女性略低)；高峰胃酸分泌量(PAO) 12. 23 28. 97mmol/h。胃酸缺乏癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)ρΗ3· 5 7. O為低酸，ρΗ7.0為無酸。胃酸缺乏的病因精神緊張、發(fā)熱、植物神經(jīng)功能紊亂等，能引起交感神經(jīng)神經(jīng)興奮的因素，可暫時(shí)抑制胃酸分泌，導(dǎo)致胃酸減少。刺激性食物和藥物長期服用對胃粘膜有強(qiáng)烈刺激的飲食及藥物，如濃茶、烈酒、辛辣或水楊酸鹽類藥物直接作用于胃粘膜導(dǎo)致胃酸分泌減少。萎縮性胃炎、胃癌、惡性貧血等疾病，可引起胃酸明顯減少或缺乏。十二指腸液的反流，胰液中的磷脂與膽汁和胰消化酶一起，能溶解粘液，并破壞胃粘膜屏障，促使H+及胃蛋白酶反彌散入粘膜，引起損傷。免疫因素免疫功能的改變能夠引起萎縮性胃炎導(dǎo)致胃酸分泌減少。胃切除術(shù)后，也可引起胃酸分泌減少。甲狀腺功能減低50%患者胃酸缺乏或無胃酸，這因有抗胃泌素抗體存在之故，糖尿病患者常伴有免疫缺陷，可引起胃酸缺乏?，F(xiàn)有技術(shù)中有采用奧美拉唑進(jìn)行胃壁細(xì)胞中酸泵的抑制，是ー種弱堿性物質(zhì)，抑制H+/K+JVTP酶(質(zhì)子泵)的活性。這種對胃酸形成的抑制作用呈劑量相關(guān)性，并高度抑制基礎(chǔ)胃酸分泌和刺激性胃酸分泌。人體靜脈給予奧美拉唑能夠迅速降低胃內(nèi)酸度，24小時(shí)內(nèi)平均下降90%。幽門螺桿菌是導(dǎo)致胃炎的主要因素。幽門螺桿菌和胃酸一起是導(dǎo)致消化性潰瘍的主要因素。奧美拉唑與抗生素合用可根除幽門螺桿菌，這與迅速緩解癥狀、胃粘膜修復(fù)率高及消化性潰瘍病的長期緩解相關(guān)，并因此減少了胃腸道出血等并發(fā)癥。質(zhì)子泵抑制劑所致胃酸減少，可増加胃腸道內(nèi)正常菌群的數(shù)量，如沙門菌和彎曲桿菌屬感染胃腸道的危險(xiǎn)性可能増加。由于奧美拉唑在抑制胃酸的同時(shí)會(huì)影響消化功能，引起腹脹等不適癥狀，甚至發(fā)生萎縮性胃炎，影響患者生活質(zhì)量，且慢性萎縮性胃炎及胃酸缺乏與胃癌發(fā)生相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提出一種胃泌素在陰離子交換蛋白2中的應(yīng)用，將其作為陰離子交換蛋白的調(diào)節(jié)劑，糾正了以往的錯(cuò)誤觀點(diǎn)即認(rèn)為胃酸分泌增多造成胃黏膜損傷及反復(fù)修復(fù)，并由此誘發(fā)胃癌，所以大量應(yīng)用奧美拉唑等質(zhì)子泵抑制劑以抑制胃酸分泌。通過胃泌素適量促進(jìn)胃酸的分泌及胃黏膜修復(fù)以產(chǎn)生保護(hù)胃黏膜的有益效果，目前并沒有能夠用于刺激胃酸分泌的藥物問世，在此背景下，胃泌素具有良好的臨床應(yīng)用前景。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明涉及一種胃泌素在陰離子交換蛋白2中的應(yīng)用，即將胃泌素作為調(diào)節(jié)劑用于陰離子交換蛋白2(AE2)的表達(dá)。所述的應(yīng)用進(jìn)ー步包括用于促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性。所述的促進(jìn)采用ΙΟ,-ΙΟ'οΙ/Ι的胃泌素培養(yǎng)或皮下注射胃泌素實(shí)現(xiàn)。所述的培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)-30天。所述的應(yīng)用進(jìn)ー步包括用于制備治療胃酸缺乏癥的藥物。所述的胃酸缺乏癥包括但不限于慢性胃炎。所述的藥物用于促進(jìn)胃酸分泌。本發(fā)明的關(guān)鍵在于胃泌素通過調(diào)節(jié)ΑΕ2蛋白促進(jìn)離子交換，刺激胃酸的分泌，對于胃酸缺乏患者(尤其是胃炎、胃癌導(dǎo)致的胃酸缺乏患者)具有胃粘膜保護(hù)作用。本發(fā)明為胃泌素應(yīng)用于胃酸缺乏提供依據(jù)，將為胃酸缺乏癥的患者帶來新的希望。


圖I為實(shí)施例中胃泌素刺激小鼠胃黏膜增厚示意圖。
圖2為實(shí)施例中胃泌素通過ΑΕ2作用保護(hù)小鼠胃黏膜示意圖。
圖3為實(shí)施例中胃泌素刺激小鼠AE2的表達(dá)示意圖。
圖4為實(shí)施例中胃泌素促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)AE2的表達(dá)示意圖。
圖5為實(shí)施例中胃泌素促進(jìn)離子轉(zhuǎn)運(yùn)示意圖。
圖6為實(shí)施例中胃泌素通過膽囊收縮素B受體(CCKBR)調(diào)節(jié)AE2的表達(dá)示意圖。
圖7為實(shí)施例中胃泌素刺激胃酸分泌示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例I

(I)胃泌素刺激小鼠胃黏膜增厚
利用化學(xué)刺激法構(gòu)建慢性萎縮性胃炎動(dòng)物模型取成年健康雌性C57BL/6小鼠50只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組對照組，實(shí)驗(yàn)組給予氨水(O. 05% O. 1% )，采用ロ服給藥法取代小鼠飲用水；こ醇(40% )，每雙周一、四空腹灌胃一次，毎次8ml/kg;脫氧膽酸鈉(20mmol/L)，單周每日灌胃一次，毎次8ml/kg。對照組給予雙蒸水為飲用水，生理鹽水取代脫氧膽酸鈉、酒精灌胃，每次8ml/kg。
化學(xué)建模四個(gè)月后，胃泌素組給予皮下注射胃泌素(0.4mg/ml)，每天兩次，每次2mg/kg (血中胃泌素濃度約l(T7mol/L);連續(xù)給藥30天。通過樣本全胃的石臘切片、HE染色觀察發(fā)現(xiàn)利用化學(xué)刺激法成功構(gòu)建慢性萎縮性胃炎動(dòng)物模型，胃泌素可治療慢性萎縮性胃炎，減輕胃粘膜萎縮癥狀，通過鏡下測量小鼠胃粘膜厚度，發(fā)現(xiàn)胃泌素治療組小鼠的胃粘膜相對于對照組明顯增厚(圖1A)，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)胃泌素治療組和對照組的小鼠胃粘膜厚度具有顯著性差異(圖1B)。
⑵胃泌素通過AE2作用保護(hù)小鼠胃黏膜。
對模型小鼠胃組織HE染色顯示正常胃粘膜組織，在分泌胃酸的壁細(xì)胞細(xì)胞膜和胞漿中可見明顯的AE2陽性分布(棕色)，(圖2A和B) ；HE染色顯示胃組織呈慢性萎縮性胃炎表現(xiàn)，部分腺體萎縮，單箭頭顯示腺體腸化明顯，AE2表達(dá)陰性，而雙箭頭顯示相對正常的胃泌酸腺體，AE2表達(dá)陽性(圖2C和D) ；HE染色顯示胃粘膜腺體萎縮，星號顯示明顯的炎細(xì)胞浸潤表現(xiàn)，提示胃粘膜炎癥反應(yīng)明顯，但是由于給予了 10_7mol/L胃泌素干渉后，胃粘膜腺體仍表達(dá)豐富的AE2蛋白(圖2E和F)。

(3)胃泌素刺激小鼠AE2的表達(dá)。
重復(fù)化學(xué)刺激法構(gòu)建慢性萎縮性胃炎動(dòng)物模型模型，給予不同濃度的胃泌素處理，取小鼠胃組織進(jìn)行石蠟包埋、切片，用免疫組織化學(xué)的方法進(jìn)行AE2表達(dá)的檢測，發(fā)現(xiàn)相對于給予生理鹽水的對照組，在血中10_1(1，10_9，10_8，10_6mol/L濃度的胃泌素作用下，均可見AE2的表達(dá)增加(圖3)。

(4)胃泌素促進(jìn)AE2的表達(dá)。

SGC7901細(xì)胞系用含有10,、10_9、10_8、10' 10_6mol/L五種不同濃度的胃泌素的培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí),提取蛋白進(jìn)行western blot檢測，隨著胃泌素濃度的增加，AE2表達(dá)升高(圖4A)。動(dòng)物試驗(yàn)中，C57小鼠隨機(jī)分為四組，分別給予生理鹽水，胃泌素，胃泌素和DIDS，DIDS靜脈注射，15分鐘后，注射胃泌素組小鼠的AE2mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高，而AE2的阻斷劑能夠抑制胃泌素對AE2表達(dá)的促進(jìn)作用(圖4B)。

(5)胃泌素促進(jìn)離子轉(zhuǎn)運(yùn)。

將SGC7901細(xì)胞用l(T7mol/L胃泌素培養(yǎng)24小時(shí)，其細(xì)胞內(nèi)PH值由7.86±0. 30降至7.22±0.25，而每分鐘pH值的變化率(dpHi/dt)由O. 091 ±0.031每分鐘增至0.23±0.066毎分鐘。說明了胃泌素促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性(圖5)。
(6)胃泌素通過膽囊收縮素B受體(CCKBR)調(diào)節(jié)AE2的表達(dá)
設(shè)計(jì)并構(gòu)建SSKBR干擾載體并驗(yàn)證其有效性，選擇干擾效果最佳的載體進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)(見圖6A左)。選擇I號干擾載體轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞,提取蛋白進(jìn)行western blot分析，可見AE2表達(dá)降低(見圖6A右)，說明CCKBR介導(dǎo)了胃泌素上調(diào)AE2的作用。此外， SGC7901經(jīng)過不同濃度的CCKBR的阻斷劑丙谷胺處理，AE2表達(dá)呈現(xiàn)出依次遞減的表現(xiàn)(圖6B)，進(jìn)ー步證實(shí)胃泌素通過膽囊收縮素B受體調(diào)節(jié)AE2。

(7)胃泌素刺激胃酸分泌
SGC7901細(xì)胞系用含有胃泌素的培養(yǎng)液培養(yǎng)8、10、12、24小時(shí)，細(xì)胞內(nèi)pH值隨時(shí)間延長而遞減，證明其具有刺激胃酸分泌的作用(圖7A)。C57小鼠分為四組，分別給予生理鹽水、胃泌素、胃泌素和DIDS、DIDS靜脈注射，15分鐘后測量胃酸分泌情況，結(jié)果顯示，胃泌素刺激了胃酸的分泌，而DIDS通過抑制AE2的功能而使胃泌素對胃酸的分泌作用受到抑制(圖7B)。

具體實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)和處理SGC7901細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37°C，含5% CO2的空氣的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，細(xì)胞以2-5xl05個(gè)/mL的密度接種，加入指定濃度的胃泌素或者AE2蛋白特異性抑制劑DIDS(Sigma).免疫印跡法將處理過的細(xì)胞用SDS裂解，提取全蛋白備用，配制10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，將此前裂解的蛋白質(zhì)分別加入上樣孔中，并開始電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白通過電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上(AmershamBioscience,UK)。硝酸纖維膜用含5%的脫脂牛奶封閉以后,分別孵育AE2的ー抗和相應(yīng)ニ抗。最用用辣根過氧化物酶(CellSignaling，MA, U. S. A)按照使用說明檢測信號。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少三次。離子交換活性的檢測將HEK-293T細(xì)胞以及用胃泌素、胃泌素+DIDS、單獨(dú)使用DIDS按照相應(yīng)濃度處理的細(xì)胞分別接種在35mm的培養(yǎng)皿上，用不含血清的培養(yǎng)液洗過之后用ImL含2 μ MBCECF-AM的不含血清的培養(yǎng)液在37°C孵育20分鐘。然后用不含血清的培養(yǎng)液洗兩遍，再用含Cl-的 Ringer ' s 緩沖液(5mMglucose, 5mMpotassiumgluconate, ImMcalciumgluconate,ImMMgSO4, 2. 5mMNaH2P04, 25mMNaHC03, IOmMHepes, pH7. 4)避光孵育 20 分鐘。在培養(yǎng)皿中對不同細(xì)胞爬片分別用含HOmMNaCl的Ringer' s緩沖液和含140mMsodiumgluconate的Ringer' s 緩沖液交替的進(jìn)行灌流。用裝備有 NIK0NTE2000EMicroscope ,HAMAMATSUIRCCDJVCcoIorvideomonitor, DAD-8VCPP8pinchvalve 灌流系統(tǒng)(激發(fā)波長 440and490nm,發(fā)射波長528.7nm)的離子成像儀來獲得并記錄下熒光圖象。然后用高何尼日利亞菌素法通過在四個(gè)pH值6. 5,7. 0,7. 5和8. O的熒光強(qiáng)度校正來得到pH曲線。在單個(gè)HEK293T細(xì)胞內(nèi)的C1_/HC03_交換活性通過Cl—的滲出以及重新滲入時(shí)引起的與pH曲線線形相關(guān)變化得到。胃酸測定C57小鼠分為四組，分別給予生理鹽水、単一胃泌素、胃泌素和DIDS共同、単一DIDS靜脈注射，15分鐘后進(jìn)行胃酸分泌情況測試。結(jié)果分析由于胃泌素在體內(nèi)的作用存在級聯(lián)放大效應(yīng)，因此相對胃癌細(xì)胞系，短時(shí)間內(nèi)即顯現(xiàn)出效果，在人胃癌SGC7901細(xì)胞系用含有胃泌素的培養(yǎng)液培養(yǎng)8、10、12、24小吋，提取蛋白進(jìn)行westernblot檢測，結(jié)果表明AE2的表達(dá)明顯升高。 在動(dòng)物試驗(yàn)中，C57小鼠分為四組，分別給予生理鹽水、10,至10_6mol/L単一胃泌素、胃泌素和DIDS共同、單ー DIDS靜脈注射，15分鐘后，注射胃泌素組小鼠的AE2mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高，而AE2的阻斷劑DIDS能夠抑制胃泌素對AE2表達(dá)的促進(jìn)作用。將SGC7901細(xì)胞用10_7mol/L的胃泌素培養(yǎng)24小時(shí)以內(nèi)，其細(xì)胞內(nèi)pH值由7. 86±0· 30降至7. 22±0· 25，而每分鐘pH值的變化率(dpHi/dt)由0. 091 ±0. 031每分鐘增至0. 23±0. 066毎分鐘。說明胃泌素促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性。胃泌素通過膽囊收縮素B受體(CCKBR)調(diào)節(jié)AE2的表達(dá)設(shè)計(jì)并構(gòu)建針對SSKBR的干擾載體，轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞,提取蛋白進(jìn)行westernblot分析,可見AE2表達(dá)降低(見圖3上)，SGC7901經(jīng)過不同濃度的CCKBR的阻斷劑丙谷胺處理，AE2表達(dá)呈現(xiàn)出依次遞減的表現(xiàn)。C57小鼠分為四組，分別給予生理鹽水、10,至10_6mol/L単一胃泌素、胃泌素和DIDS共同、単一 DIDS靜脈注射，15分鐘后進(jìn)行胃酸分泌情況測試，測量小鼠的胃酸分泌情況，結(jié)果顯示，胃泌素刺激了胃酸的分泌，而DIDS通過抑制AE2的功能阻斷胃泌素促進(jìn)胃酸分泌的作用(見圖3上)。SGC7901細(xì)胞系用含有胃泌素的培養(yǎng)液培養(yǎng)8、10、12、24小吋，細(xì)胞內(nèi)PH值不斷下降。
權(quán)利要求
1.一種胃泌素在陰離子交換蛋白2中的應(yīng)用，其特征在于，將胃泌素作為調(diào)節(jié)劑用于陰離子交換蛋白2的表達(dá)。
2.—種胃泌素在陰離子交換蛋白2中的應(yīng)用，其特征在于，用于促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征是，所述的促進(jìn)采用10_1(l-10_6mOl/L的胃泌素培養(yǎng)或皮下注射胃泌素實(shí)現(xiàn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是，所述的培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)-30天。
5.一種胃泌素的應(yīng)用，其特征在于，用于制備治療胃酸缺乏癥的藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征是，所述的胃酸缺乏癥包括但不限于慢性胃炎。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征是，所述的藥物用于促進(jìn)胃酸分泌。
全文摘要
一種醫(yī)藥領(lǐng)域的胃泌素在陰離子交換蛋白2中的應(yīng)用，將胃泌素作為調(diào)節(jié)劑用于陰離子交換蛋白2的表達(dá)以及用于制備治療胃酸缺乏癥的藥物。本發(fā)明將胃泌素作為陰離子交換蛋白2的調(diào)節(jié)劑，糾正了以往的錯(cuò)誤觀點(diǎn)即認(rèn)為胃酸分泌增多造成胃黏膜損傷及反復(fù)修復(fù)，并由此誘發(fā)胃癌，所以大量應(yīng)用奧美拉唑等質(zhì)子泵抑制劑以抑制胃酸分泌。通過胃泌素適量促進(jìn)胃酸的分泌及胃黏膜修復(fù)以產(chǎn)生保護(hù)胃黏膜的有益效果，目前并沒有能夠用于刺激胃酸分泌的藥物問世，在此背景下，胃泌素具有良好的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號A61P1/04GK102847140SQ201210376849
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月28日
發(fā)明者索文昊, 王美喬 申請人:上海博奧德醫(yī)藥科技有限公司