專利名稱：一種絲裂霉素c多泡脂質(zhì)體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種絲裂霉素C的緩釋制劑，特別涉及一種絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體及其制備方法。
背景技術(shù)：
絲裂霉素C(Mitomycin C，MMC)是Hata等人于1955年發(fā)現(xiàn)的抗生素類廣譜抗癌藥物，為細(xì)胞周期非特異性藥物。絲裂霉素C對(duì)腫瘤細(xì)胞的G1期、特別是晚G1期及早S期最敏感，在組織中經(jīng)酶活化后，它的作用類似于雙功能或三功能烷化劑，可與DNA發(fā)生交叉聯(lián)結(jié)，抑制DNA合成，對(duì)RNA及蛋白合成也有一定的抑制作用。到目前為止，本品已經(jīng)在臨床上應(yīng)用了20多年，是治療各種實(shí)體瘤的有效藥物。其臨床上主要用于消化道癌癥，對(duì)肺癌、乳腺癌、宮頸癌等也有顯著療效，還可用于惡性淋巴瘤的聯(lián)合治療。另外，絲裂霉素C還可用于小梁切除術(shù)治療青光眼，因切除手術(shù)后常發(fā)生球結(jié)膜下和鞏膜之間成纖維細(xì)胞過度增生、纖維化、瘢痕形成致濾過通道阻塞，使濾過泡難以形成，發(fā)生率可達(dá)15％～30％，而抗代謝物絲裂霉素C可增加小梁切除術(shù)的成功率，已經(jīng)得到多年臨床應(yīng)用的肯定。絲裂霉素C作為抗癌藥物的一種，有嚴(yán)重的全身性毒性，治療窗窄，而藥物本身性質(zhì)不穩(wěn)定，目前只能制成凍干粉針，臨用前配制成溶液靜脈注射。絲裂霉素C在體內(nèi)半衰期短，治療過程中需多次注射給藥，給藥后需有護(hù)理人員看護(hù)，極為不便，患者順應(yīng)性差。
另一方面，Kim等人于1983年最先發(fā)現(xiàn)并研究了多泡(多囊)脂質(zhì)體，他們通過復(fù)乳法，以磷脂、膽固醇和中性脂質(zhì)為成膜材料，以氯仿和乙醚為有機(jī)溶劑，成功制備了多泡脂質(zhì)體，并憑借光學(xué)顯微鏡和電鏡觀察了多泡脂質(zhì)體的微觀結(jié)構(gòu)。在制備過程中，首先將藥物溶液和油相在機(jī)械作用力下形成W/O(油包水)型初乳，再將初乳與外水相混合制得復(fù)乳，通過氮?dú)獯蹈沙ビ袡C(jī)溶劑制得多泡脂質(zhì)體混懸液。多泡脂質(zhì)體顆粒的平均粒徑在5～50μm之間。通過復(fù)乳法制備得多泡脂質(zhì)體具有高包封率(20％～90％)、高載藥量、高穩(wěn)定性(4℃下可保存一年以上)、低滲漏、緩釋作用(可延遲釋放數(shù)天至數(shù)周)。因其非同心圓的拓樸結(jié)構(gòu)，使得多泡脂質(zhì)體在注射部位形成藥物“儲(chǔ)庫”，隨著磷脂雙分子層的不斷代謝，包封在囊泡中的藥物逐步釋放至血液或病變部位，發(fā)揮很好的延遲釋放作用。通過調(diào)節(jié)制備過程中的參數(shù)和處方比例，可以輕松控制藥物釋放時(shí)間在幾天到數(shù)周之間。
然而，目前存在的問題是由于不同的藥物活性成分有不同的理化性質(zhì)和作用機(jī)理，其制備包封率和藥物釋放及制劑穩(wěn)定性有較大的差異，因此針對(duì)具體藥物及其釋放要求，需研究采用特定的處方和工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題即為上述課題，提供一種具有緩釋作用的絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體及其制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案包括一種絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體的制備方法，其可以包括下列步驟①將脂質(zhì)成分溶于有機(jī)溶劑中，以作為脂質(zhì)相，其中該脂質(zhì)成分包括重量比為2∶1～4∶1的中性磷脂和膽固醇，以及在脂質(zhì)成分中占摩爾百分比為2～6％的中性脂質(zhì)，該中性磷脂在脂質(zhì)相中的濃度為20～40mg/ml；②將絲裂霉素C溶于緩沖鹽溶液中使其濃度為20μg/ml～3000μg/ml，調(diào)節(jié)pH為7.4～9.2以作為內(nèi)水相；③將等體積的所述內(nèi)水相加入脂質(zhì)相上層，混合乳化制得油包水型初乳；
④將2～6倍體積的外水相加入所述油包水型初乳的上層，攪拌形成水包油包水(W/O/W)型復(fù)乳，其中外水相中含有3.2～6g/100ml的滲透壓調(diào)節(jié)物；⑤除去步驟④得到的復(fù)乳中的有機(jī)溶劑而制得絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體。
其中，上述中性磷脂及膽固醇為成膜材料；膽固醇為膜穩(wěn)定劑，可通過改變磷脂相轉(zhuǎn)變溫度調(diào)節(jié)脂質(zhì)體膜層的流動(dòng)性，從而改善脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，減小貯存過程中因脂質(zhì)體膜層相變引起的藥物滲漏。膽固醇用量過小，其調(diào)節(jié)作用甚微，當(dāng)用量過大時(shí)難以形成脂質(zhì)體的磷脂雙分子層，研究表明當(dāng)磷脂與膽固醇重量比在2∶1～4∶1之間時(shí)形成的脂質(zhì)體最穩(wěn)定。
本發(fā)明步驟①中所述的中性磷脂是指處于其等電點(diǎn)時(shí)凈電荷為零的磷脂，其選自卵磷脂、大豆磷脂、腦磷脂、鞘磷脂、氫化大豆磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)、二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)等天然和合成磷脂中的一種或幾種；本發(fā)明優(yōu)選自卵磷脂、二油酰磷脂酰膽堿和二油酰磷脂酰乙醇胺。
而本發(fā)明所說的中性脂質(zhì)是指本身沒有形成囊泡能力的，并且缺少帶電荷的或親水的“頭部”基團(tuán)的油或脂肪，如三油酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三癸酸甘油酯、三辛酸甘油酯、三己酸甘油酯、維生素E和角鯊烯中的一種或幾種。其在脂質(zhì)體中主要起支架作用，分布于非同心水性腔室磷脂雙分子層節(jié)點(diǎn)處，支撐起多泡(多囊)脂質(zhì)體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)；中性脂質(zhì)是形成多泡(多囊)脂質(zhì)體的決定性因素之一。本發(fā)明優(yōu)選三油酸甘油酯。
該有機(jī)溶劑可為能溶解脂質(zhì)成分的任何溶劑，通常選自乙醚、氯仿、二氯甲烷、異丙基乙醚、四氫呋喃、鹵代醚和鹵代酯中的一種或幾種。本發(fā)明優(yōu)選二氯甲烷或乙醚-氯仿混合物。更佳為二氯甲烷，因二氯甲烷可有效溶解磷脂和類脂，并且毒性低于氯仿，揮干速率更優(yōu)。
該步驟①的脂質(zhì)成分中還可以含有帶負(fù)電荷或正電荷的類脂，帶電荷類脂可有效調(diào)節(jié)脂質(zhì)體表面電荷，使脂質(zhì)體帶負(fù)電或正電，以增強(qiáng)制劑穩(wěn)定性。該類脂與中性磷脂的重量比為1∶5～1∶60，類脂用量太少作用不明顯，太多則增加成本，本發(fā)明優(yōu)選1∶5～1∶20。
本發(fā)明所述的帶負(fù)電荷的類脂選自磷脂酰絲氨酸、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸(DPPS)、二硬脂酰磷脂酰絲氨酸(DSPS)、磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、磷脂酰肌醇、二棕櫚酰磷脂酰肌醇(DPPZ)、二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPZ)、磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)及二硬脂酰磷脂酸(DSPA)中的一種或幾種；而所述帶正電荷的類脂選自二酰基三甲胺丙烷、二?；装繁?、硬脂胺(SA)及膠原蛋白中的一種或幾種。
本發(fā)明的類脂最優(yōu)選硬脂胺和/或膠原蛋白等帶正電荷的類脂。因?yàn)榻z裂霉素C在堿性條件下呈電負(fù)性，使磷脂雙分子層帶相反電荷有利于提高電負(fù)性藥物的包封率，并可減小藥物滲漏。另外，加入一定電荷類脂可增大水性腔室，從而增大包封體積，并可增加脂質(zhì)體制劑的穩(wěn)定性，減小粒子沉降和聚集。
考慮到絲裂霉素C的分子結(jié)構(gòu)中含有氨基苯醌、氨基甲酸醌及氨雜三丙烷3個(gè)重要組成部分，在酸、堿、光照、高溫條件下均不穩(wěn)定，在酸性溶液中三元環(huán)發(fā)生酸催化開環(huán)，而堿性過強(qiáng)氨甲酸酯鏈水解；加之絲裂霉素C的降解產(chǎn)物無療效，且毒性更大。故為了加強(qiáng)絲裂霉素C的穩(wěn)定性，本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在上述步驟②中，調(diào)節(jié)內(nèi)水相pH值至一定堿性范圍，可減少絲裂霉素C的降解，而pH在8.0～8.7范圍則絲裂霉素C最穩(wěn)定。
較佳地，步驟②的內(nèi)水相中絲裂霉素C的濃度為500～1000μg/ml，在此范圍內(nèi)，即可具有較高的藥物濃度，又可取得較高的包封率。而步驟②中所述的緩沖鹽溶液則選用脂質(zhì)體制備領(lǐng)域中最常規(guī)使用的磷酸鹽緩沖溶液。
步驟②的內(nèi)水相中還可以加入不超過10％(w/v)，一般不超過4％(w/v)的滲透壓調(diào)節(jié)物，以進(jìn)一步增強(qiáng)制劑穩(wěn)定性；其中，此處及下文中所提及的重量體積(w/v)百分比均指g/100ml。
本發(fā)明所述滲透壓調(diào)節(jié)物可為現(xiàn)有技術(shù)中常用于調(diào)節(jié)滲透壓的物質(zhì)，如葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麥芽糖等碳水化合物類，以及氯化鈉等。本發(fā)明優(yōu)選葡萄糖和/或蔗糖。
上述步驟③中所述混合乳化可采用現(xiàn)有技術(shù)，如通過攪拌、振蕩、聲處理、超聲波、高速剪切勻漿機(jī)等裝置和方法來處理；本發(fā)明優(yōu)選采用高速剪切勻漿機(jī)。
而上述步驟④中混合形成復(fù)乳和步驟⑤中的去除溶劑方法均可采用現(xiàn)有技術(shù)，其中去除溶劑方法包括但不僅限于氣流吹干、減壓蒸發(fā)等，通常選用氮?dú)?、氦氣、氬氣等惰性氣體及氫氣、二氧化碳等氣體吹干溶劑，最常用且成本低的是氮?dú)獯蹈伞?br> 本發(fā)明還提供一種絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體，其是由上述制備方法制得的。
本發(fā)明通過將絲裂霉素C制成緩釋“儲(chǔ)庫”制劑，可以解決藥物穩(wěn)定性和全身毒性兩方面問題。將絲裂霉素C包封在脂質(zhì)體中4℃條件下保存可有效降低藥物的降解；藥物緩釋可使局部藥物濃度維持在有效的治療濃度，減少給藥次數(shù)，提高患者順應(yīng)性。本發(fā)明的絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體具有高的包封率，在體內(nèi)、外試驗(yàn)中均顯示有良好的緩釋作用，從而較現(xiàn)有制劑可有更佳的抗細(xì)胞增殖及抗腫瘤效果，并由此降低了用藥次數(shù)及總用藥量，進(jìn)一步降低了全身毒性。


圖1為本發(fā)明絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體的體外釋放-時(shí)間曲線圖。
圖2為本發(fā)明絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體混懸液在小鼠體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間曲線圖。
圖3為作為對(duì)照的現(xiàn)有絲裂霉素C溶液在小鼠體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間曲線圖。
具體實(shí)施例方式
下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。
下面實(shí)施例中絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體粒徑采用粒度大小分析儀檢測(cè)；包封率測(cè)定方法為取0.5mL本發(fā)明絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體混懸液，加入4.5mL生理鹽水，混和均勻，600×g離心5分鐘，分離上清液和沉淀。依據(jù)已建立的分析方法檢測(cè)(中國藥典2005版二部p176)上清液中游離絲裂霉素C濃度；將沉淀用10％的Triton X-100溶液破膜溶解，依法測(cè)定包封的絲裂霉素C的濃度，用以下公式計(jì)算絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體的包封率包封率(％)＝被包封的絲裂霉素C量/混懸液中絲裂霉素C總量×100實(shí)施例1步驟1精密稱取卵磷脂200mg、膽固醇50mg、硬脂胺40mg和三油酸甘油酯17.4mg，用5ml二氯甲烷溶解，作為脂質(zhì)相；步驟2精密稱取5mg絲裂霉素C和蔗糖100mg，用適量蒸餾水溶解，并用磷酸二氫鈉和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8.0，定容至5ml，作為內(nèi)水相，緩慢加入脂質(zhì)相上層；步驟3用高速剪切勻漿機(jī)(Fluko，ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司)將步驟2所得混合物在10000rpm的轉(zhuǎn)速下作用9分鐘，制得W/O型初乳；步驟4為制得二氯甲烷微球混懸液，將20mL含有3.2％(w/v)葡萄糖的外水相加在W/O型初乳的上層，以4500rpm的轉(zhuǎn)速作用15秒鐘，形成二氯甲烷微球的混懸液；步驟5為制得多泡脂質(zhì)體，將上述混懸液注入盛有30mL外水相的1000mL錐形瓶中，通以氮?dú)?8L/min)，37℃水浴20分鐘緩慢除去二氯甲烷；向錐形瓶中加入60mL生理鹽水，在600×g條件下離心5分鐘分離脂質(zhì)體，棄上清液，用生理鹽水洗滌沉淀三次，將所得沉淀再分散在5～10ml生理鹽水中，得多泡脂質(zhì)體混懸液。
測(cè)得絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體粒徑為5～50μm；包封率為87.4％。
實(shí)施例2步驟1精密稱取卵磷脂200mg、膽固醇50mg、膠原蛋白10mg和三油酸甘油酯15.6mg，用5ml二氯甲烷溶解，作為脂質(zhì)相；步驟2精密稱取5mg絲裂霉素C和蔗糖200mg，用適量蒸餾水溶解，并用磷酸二氫鉀和氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH至8.7，定容至5ml，作為內(nèi)水相，緩慢加入脂質(zhì)相上層；步驟3同實(shí)施例1；步驟4為制得二氯甲烷微球混懸液，將20mL含有6.0％(w/v)葡萄糖的外水相加在W/O型初乳的上層，以4500rpm的轉(zhuǎn)速作用15秒鐘，形成二氯甲烷微球的混懸液；步驟5同實(shí)施例1。
測(cè)得絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體粒徑為5～50μm；包封率為75.1％。
實(shí)施例3步驟1精密稱取二油酰磷脂酰膽堿100mg、膽固醇50mg、硬脂胺20mg和三油酸甘油酯3.4mg，用5ml氯仿-乙醚混合物(體積比為1∶1)溶解，作為脂質(zhì)相；步驟2精密稱取2.5mg絲裂霉素C，用適量蒸餾水溶解，并用磷酸氫二鈉和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8.4，定容至5ml，作為內(nèi)水相，緩慢加入脂質(zhì)相上層；步驟3同實(shí)施例1；步驟4為制得氯仿-乙醚微球混懸液，將60mL含有3.2％(w/v)葡萄糖的外水相加在W/O型初乳的上層，以4500rpm的轉(zhuǎn)速作用15秒鐘，形成氯仿-乙醚微球的混懸液；步驟5同實(shí)施例1。
測(cè)得絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體粒徑為5～50μm；包封率為80.6％。
實(shí)施例4步驟1精密稱取二油酰磷脂酰乙醇胺150mg、膽固醇50mg、膠原蛋白15mg和三油酸甘油酯7.5mg，用5ml氯仿-乙醚混合物(體積比為1∶1)溶解，作為脂質(zhì)相；步驟2精密稱取3.75mg絲裂霉素C，100mg蔗糖，用適量蒸餾水溶解，并用磷酸氫二鈉和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.5，定容至5ml，作為內(nèi)水相，緩慢加入脂質(zhì)相上層；步驟3同實(shí)施例1；步驟4為制得氯仿-乙醚微球混懸液，將40mL含有5.7％(w/v)葡萄糖的外水相加在W/O型初乳的上層，以4500rpm的轉(zhuǎn)速作用15秒鐘，形成氯仿-乙醚微球的混懸液；步驟5同實(shí)施例1。
測(cè)得絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體粒徑為5～50μm；包封率為76.8％。
實(shí)施例5步驟1精密稱取卵磷脂200mg、膽固醇100mg、硬脂胺40mg和三油酸甘油酯20.4mg，用5ml二氯甲烷溶解，作為脂質(zhì)相；步驟2精密稱取5mg絲裂霉素C和蔗糖100mg，用適量蒸餾水溶解，并用磷酸氫二鈉和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至9.2，定容至5ml，作為內(nèi)水相，緩慢加入脂質(zhì)相上層；步驟3同實(shí)施例1；步驟4為制得二氯甲烷微球混懸液，將20mL含有3.2％(w/v)葡萄糖外水相加在W/O型初乳的上層，以4500rpm的轉(zhuǎn)速作用15秒鐘，形成二氯甲烷微球的混懸液；步驟5同實(shí)施例1。
測(cè)得絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體粒徑為5～50μm；包封率為81.7％。
實(shí)施例6步驟1精密稱取卵磷脂120mg、膽固醇30mg和三油酸甘油酯1.6mg，用5ml二氯甲烷溶解，作為脂質(zhì)相；步驟2精密稱取5mg絲裂霉素C和葡萄糖200mg，用適量蒸餾水溶解，并用磷酸氫二鉀和氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH至8.0，定容至5ml，作為內(nèi)水相，緩慢加入脂質(zhì)相上層；步驟3～5同實(shí)施例1。
測(cè)得絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體粒徑為5～50μm；包封率為67.4％。
實(shí)施例7步驟1精密稱取卵磷脂200mg、膽固醇100mg、磷脂酰甘油40mg和三油酸甘油酯20.4mg，用5ml二氯甲烷溶解，作為脂質(zhì)相；步驟2精密稱取5mg絲裂霉素C和蔗糖100mg，用適量蒸餾水溶解，并用磷酸氫二鉀和氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH至8.0，定容至5ml，作為內(nèi)水相，緩慢加入脂質(zhì)相上層；步驟3同實(shí)施例1；步驟4為制得二氯甲烷微球混懸液，將20mL含有4％(w/v)蔗糖和40mM精氨酸的外水相加在W/O型初乳的上層，以4500rpm的轉(zhuǎn)速作用15秒鐘，形成二氯甲烷微球的混懸液；步驟5同實(shí)施例1。
測(cè)得絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體粒徑為5～50μm；包封率為54.9％。
實(shí)施例8步驟1精密稱取卵磷脂200mg、膽固醇50mg、硬脂胺40mg和三油酸甘油酯17.4mg，用5ml二氯甲烷溶解，作為脂質(zhì)相；步驟2精密稱取15mg絲裂霉素C和蔗糖100mg，用適量蒸餾水溶解，并用磷酸二氫鈉和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8.0，定容至5ml，作為內(nèi)水相，緩慢加入脂質(zhì)相上層；
步驟3同實(shí)施例1；步驟4同實(shí)施例1；步驟5同實(shí)施例1。
測(cè)得絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體粒徑為5～50μm；包封率為79.4％。
上述實(shí)施例中所用卵磷脂為德固賽公司產(chǎn)品；膠原蛋白、二油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油購于Sigma公司；硬脂胺購于Fluka公司；膽固醇購于上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；三油酸甘油酯購于廣州化學(xué)試劑廠；其余試劑為常規(guī)市售產(chǎn)品。
試驗(yàn)實(shí)施例1 絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體穩(wěn)定性研究1.樣品制備1.1.根據(jù)實(shí)施例1制備三批絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體混懸液，批號(hào)為Y5M3-M1、Y5M3-M2、Y5M3-M3；1.2.根據(jù)實(shí)施例1，但內(nèi)水相中不使用緩沖鹽溶液調(diào)節(jié)pH值，僅用蒸餾水溶解、定容來制備三批絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體混懸液，批號(hào)為Y5M3-N1、Y5M3-N2、Y5M3-N3，以作為對(duì)照。
2.保存及取樣置于4℃冰箱保存，分別于第1、2、3個(gè)月取樣，高效液相法測(cè)定絲裂霉素C含量，計(jì)算含量下降百分比。結(jié)果如下表所示。

結(jié)果表明，經(jīng)調(diào)節(jié)絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體中內(nèi)水相pH，可顯著提高制劑穩(wěn)定性，三個(gè)月含量下降僅為0.3％左右。
試驗(yàn)實(shí)施例2 絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體的體外釋放測(cè)定取實(shí)施例1的絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體混懸液10ml，用40ml磷酸緩沖溶液(pH 8.0)稀釋，將所得混懸液置于37℃恒溫?fù)u床(轉(zhuǎn)速為15rpm)中，在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)取出等量的樣品，以600×g離心分離上清液和沉淀，依法測(cè)定上清液中絲裂霉素C的量，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的藥物釋放百分比用以下公式計(jì)算藥物釋放百分比(％)＝上清液中游離絲裂霉素C的量/多泡脂質(zhì)體中包封的絲裂霉素C原始量×100結(jié)果表明在第6天(144小時(shí))時(shí)，藥物釋放達(dá)到了80％以上，包封的絲裂霉素C基本釋放完全(如圖1所示)。說明本發(fā)明絲裂霉素C的多泡脂質(zhì)體具有明顯的緩釋效果。
試驗(yàn)實(shí)施例3 絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體的小鼠體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)研究通過小鼠肌肉內(nèi)注射的藥物動(dòng)力學(xué)研究，證明絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體的體內(nèi)緩釋作用。
取實(shí)施例1制得的多泡脂質(zhì)體，配制絲裂霉素C濃度為10mg/mL的多泡脂質(zhì)體混懸液備用。
1.動(dòng)物昆明種小鼠80只(雌雄各半，體重為18～22g)，按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)定》飼養(yǎng)、管理小鼠。試驗(yàn)開始前禁食過夜，并做頸動(dòng)脈插管。
2.給藥與血樣采集80只小鼠隨機(jī)分為兩組，分別在右腿肌肉注射2.5mg/kg劑量的絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體混懸液和絲裂霉素C溶液(對(duì)照)。給藥后，在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)通過頸動(dòng)脈插管采集血樣(0.3mL)，每次抽取血樣之后給小鼠注入等體積的生理鹽水。立即10,000×g離心血樣10分鐘，將所得小鼠血漿于-20℃冷凍保存，待進(jìn)一步分析檢測(cè)。
3.樣品檢測(cè)3.1.分析方法的建立精密吸取血漿0.5ml置于5ml塑料離心管中，精密加入100μl內(nèi)標(biāo)對(duì)照硝基苯甲醛的甲醇溶液(1000μg/ml)，加入3.0ml乙酸乙酯，渦旋萃取5min，離心(11,000rpm/min，10min)將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至另一5ml離心管中，下層再加2.0ml乙酸乙酯進(jìn)行第二次萃取，合并乙酸乙酯層，于35～38℃水浴氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)?00μl甲醇復(fù)溶，混勻，離心，取上清液20μl進(jìn)行HPLC分析，記錄色譜圖，以樣品峰和內(nèi)標(biāo)峰面積之比進(jìn)行定量分析。
3.2.樣品檢測(cè)分析測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品的絲裂霉素C量，利用Topfit 2.0程序計(jì)算血藥濃度-時(shí)間關(guān)系數(shù)據(jù)。
4.試驗(yàn)結(jié)果由圖2可知，本發(fā)明絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)呈明顯的緩釋行為，5天(120小時(shí))后檢測(cè)到的血液中絲裂霉素C的濃度仍在1μg/ml左右；而作為對(duì)照的絲裂霉素C溶液(未包封)在肌肉注射后4小時(shí)左右血藥濃度便降低到0.1μg/ml以下(如圖3所示)。因此可以證明，絲裂霉素C經(jīng)多泡脂質(zhì)體包封后，有效實(shí)現(xiàn)了絲裂霉素C的體內(nèi)緩速釋放。
權(quán)利要求
1.一種絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體的制備方法，其包括下列步驟①將脂質(zhì)成分溶于有機(jī)溶劑中，以作為脂質(zhì)相，其中該脂質(zhì)成分包括重量比為2∶1～4∶1的中性磷脂和膽固醇，以及在脂質(zhì)成分中占摩爾百分比為2～6％的中性脂質(zhì)，該中性磷脂在脂質(zhì)相中的濃度為20～40mg/ml；②將絲裂霉素C溶于pH為7.4～9.2的緩沖鹽溶液中，使其濃度為20μg/ml～3000μg/ml，以作為內(nèi)水相；③將等體積的所述內(nèi)水相加入脂質(zhì)相上層，混合乳化制得油包水型初乳；④將2～6倍體積的外水相加入所述油包水型初乳的上層，混合形成水包油包水型復(fù)乳，其中外水相中含有3.2～6g/100ml的滲透壓調(diào)節(jié)物；⑤除去步驟④得到的復(fù)乳中的有機(jī)溶劑而制得絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于該步驟①中所述的脂質(zhì)成分中還含有帶負(fù)電荷或正電荷的類脂，該類脂與中性磷脂的重量比為1∶5～20。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述帶負(fù)電荷的類脂選自磷脂酰絲氨酸、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸、二硬脂酰磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、二棕櫚酰磷脂酰肌醇、二硬脂酰磷脂酰肌醇、磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸及二硬脂酰磷脂酸中的一種或幾種；所述帶正電荷的類脂選自二?；装繁?、二?；装繁?、硬脂胺及膠原蛋白中的一種或幾種。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于該類脂為硬脂胺和/或膠原蛋白。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟①中的中性磷脂選自卵磷脂、大豆磷脂、氫化大豆磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、腦磷脂、鞘磷脂中的一種或幾種；該中性脂質(zhì)選自三油酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三癸酸甘油酯、三辛酸甘油酯、三己酸甘油酯、維生素E和角鯊烯中的一種或幾種；該有機(jī)溶劑選自乙醚、氯仿、二氯甲烷、異丙基乙醚、四氫呋喃、鹵代醚和鹵代酯中的一種或幾種。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于該中性磷脂選自卵磷脂、二油酰磷脂酰膽堿和二油酰磷脂酰乙醇胺，該中性脂質(zhì)為三油酸甘油酯，該有機(jī)溶劑為二氯甲烷或乙醚-氯仿混合物。
7.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟②中將絲裂霉素C溶于pH為8.0～8.7的磷酸鹽緩沖溶液中，使其濃度為500～1000μg/ml，以作為內(nèi)水相。
8.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟②中所述的內(nèi)水相中還可以加入＞0g/100ml，且≤4g/100ml的滲透壓調(diào)節(jié)物。
9.如權(quán)利要求1或8所述的制備方法，其特征在于所述滲透壓調(diào)節(jié)物為葡萄糖和/或蔗糖。
10.如權(quán)利要求1～8任一項(xiàng)所述的制備方法制得的絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體及其制備方法，該制備方法包括下列步驟①將包括中性磷脂、膽固醇和中性脂質(zhì)的脂質(zhì)成分溶于有機(jī)溶劑中，使中性磷脂含量為20～40mg/ml，以作為脂質(zhì)相；②將絲裂霉素C溶于緩沖鹽溶液中使其濃度為20μg/ml～3000μg/ml，以作為內(nèi)水相；③將等體積的所述內(nèi)水相加入脂質(zhì)相上層，混合乳化制得油包水型初乳；④將含有滲透壓調(diào)節(jié)物的外水相加入所述油包水型初乳的上層，攪拌形成水包油包水型復(fù)乳；⑤除去復(fù)乳中的有機(jī)溶劑而制得絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體。該絲裂霉素C多泡脂質(zhì)體具有較高的包封率，并有較佳的緩釋作用，而取得更佳的抗腫瘤效果。
文檔編號(hào)A61K9/127GK101045049SQ200610025159
公開日2007年10月3日 申請(qǐng)日期2006年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月28日
發(fā)明者陸偉根, 陳亭亭 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院