專(zhuān)利名稱(chēng)：一種脂肪酸－肌肽復(fù)合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種脂肪酸-肌肽復(fù)合物及其制備方法，屬肽或蛋白質(zhì)的修飾復(fù)合物及其制備的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肌肽(carnosine)是由β-丙氨酸和L-組氨酸構(gòu)成的二肽(β-Ala-L-His)，分子式C9H14N4O3，分子量226.24D，在生物體內(nèi)由肌肽合成酶利用β-丙氨酸和L-組氨酸合成。它廣泛存在于機(jī)體的各器官組織，特別存在于肌肉，腦和眼晶狀體，其濃度可高達(dá)20mmol/L。肌肽是一種新的高效低毒的生物類(lèi)抗氧化劑，可有效的清除超氧陰離子，羥自由基和其他活性氧分子及過(guò)氧化自由基等，并且清除能力隨濃度的增大而增大。肌肽既能夠防止糖類(lèi)的氧化，即清除糖基自由基，也可以中和攻擊細(xì)胞膜蛋白的羰基，防止損傷性交聯(lián)的形成，從而保護(hù)蛋白免受損傷。此外肌肽還具有胞內(nèi)緩沖能力、組織修復(fù)功能、提高免疫應(yīng)答能力，抗凋亡能力以及神經(jīng)保護(hù)功能。體內(nèi)肌肽含量不足會(huì)引起老年癡呆癥、動(dòng)脈粥樣硬化、白內(nèi)障、胃潰瘍等疾病。但肌肽是一種小分子二肽，在體內(nèi)很容易被特異性的肌肽酶降解，并且肌肽是一種水溶性物質(zhì)，通過(guò)天然生物膜屏障的能力較弱，導(dǎo)致物理化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定和生物利用度降低。因此需要研制新型的肌肽產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提出一種脂肪酸-肌肽復(fù)合物，其特征在于，該復(fù)合物具有下列的分子結(jié)構(gòu)通式和簡(jiǎn)式His-Ala-C(O)-(CH2)nCH3和Cn+2-Car，其中n＝4，6，8，10，12，14，該復(fù)合物的分子量為324～465D。該復(fù)合物不但具有天然肌肽的抗氧化活性，而且具有體內(nèi)生物穩(wěn)定性高、體內(nèi)半衰期長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)。利用上述的分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式，可對(duì)該復(fù)合物命名。如n＝6的脂肪酸-肌肽復(fù)合物稱(chēng)為C8-Car復(fù)合物。
本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種脂肪酸-肌肽復(fù)合物的制備方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案是將含游離氨基的肌肽與含酰氯基團(tuán)的脂肪酰氯CH3(CH2)nCClO進(jìn)行SN2親核取代的修飾反應(yīng)，制得脂肪酸-肌肽復(fù)合物粗品溶液，經(jīng)反向高效液相色譜分離、收集復(fù)合物部分、冷凍干燥，得脂肪酸-肌肽復(fù)合物純品，脂肪酰氯分子式中的n＝4，6，8，10，12，或14。
現(xiàn)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。
一種脂肪酸-肌肽復(fù)合物的制備方法，其特征在于，操作步驟第一步 將100mg肌肽干粉與8mL的pH10的100mMNa2CO3-NaHCO3緩沖液混和，得反應(yīng)溶液；第二步向第一步制得的反應(yīng)溶液中滴入6.13μL～6.7mL脂肪酰氯CH3(CH2)nCClO，攪拌反應(yīng)，脂肪酰氯分子式中的n＝4，6，8，10，12，或14；第三步 將經(jīng)第二步處理的反應(yīng)溶液置于0～40℃下，反應(yīng)0.5～24h，期間用NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液的pH值至10；第四步 用HCl調(diào)節(jié)經(jīng)第三步處理的反應(yīng)溶液的pH值至5.0，終止反應(yīng)，用pH10的100mM Na2CO3-NaHCO3緩沖液補(bǔ)足反應(yīng)溶液的體積至10mL，得脂肪酸-肌肽復(fù)合物粗品溶液，取250L粗品溶液進(jìn)行茚三酮比色法測(cè)定修飾程度；第五步 用第四步制得的粗品溶液，上RT-HPLC層析柱，用20％乙腈洗脫，流速為1ml/min，210nm紫外檢測(cè)吸收峰值；第六步 對(duì)第五步收集到的各吸收峰洗脫液進(jìn)行LC/MS檢測(cè)，檢查脂肪酸-肌肽復(fù)合物的分子量；第七步 將第六步檢測(cè)合格的吸收峰洗脫液，冷凍干燥，得到脂肪酸-肌肽純品，分子量為324～465D。
所述的肌肽干粉、脂肪酰氯在Sigma公司有售。
上述方法制得的脂肪酸-肌肽復(fù)合物由肌肽和脂肪酸組成，兩者通過(guò)前者的β-丙氨酸上的游離氨基取代脂肪酰氯上的氯原子發(fā)生SN2親核取代反應(yīng)形成，具有上文所述的分子結(jié)構(gòu)通式His-Ala-C(O)-(CH2)nCH3，其中n＝4，6，8，10，12，14，分子量為324～465D。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是脂肪酸-肌肽復(fù)合物中的酰胺鍵極為穩(wěn)定，使脂肪酸-肌肽復(fù)合物性質(zhì)穩(wěn)定，不易被肌肽酶降解分離，提高了其生物穩(wěn)定性；脂肪酸為親脂性的無(wú)毒化合物，與肌肽穩(wěn)定結(jié)合后，能增強(qiáng)脂肪酸-肌肽復(fù)合物的親脂性，提高其透過(guò)天然生物膜屏障的透過(guò)性，提高了其生物利用度。


圖1為本發(fā)明的脂肪酸-肌肽復(fù)合物的RT-HPLC分離純化圖，其中，峰1是未參與修飾反應(yīng)的肌肽，峰2是脂肪酸-肌肽的修飾產(chǎn)物。
圖2為本發(fā)明的脂肪酸-肌肽復(fù)合物抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用結(jié)果圖。結(jié)果顯示所述的脂肪酸-肌肽復(fù)合物在體內(nèi)具有明顯的抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1～實(shí)施例4均按照上述的制備方法進(jìn)行操作。
實(shí)施例1 脂肪酸-肌肽復(fù)合物的制備方法。本實(shí)施例的特征在于，脂肪酰氯是己酰氯CH3(CH2)nCClO(n＝4)，分子量為134.61D，操作步驟第一步 將100mg肌肽干粉與8mL的pH10的100mMNa2CO3-NaHCO3緩沖液混和，得反應(yīng)溶液；第二步 向第一步制得的反應(yīng)溶液中滴入6.13～306.5μL己酰氯，攪拌反應(yīng)；第三步 將經(jīng)第二步處理的反應(yīng)溶液置于0～40℃下，反應(yīng)0.5～24h，期間用NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液的pH值至10；第四步 用HCl調(diào)節(jié)經(jīng)第三步處理的反應(yīng)溶液的pH值至5.0，終止反應(yīng)，用pH值為10的100mM Na2CO3-NaHCO3緩沖液補(bǔ)足反應(yīng)溶液的體積至10mL，制得脂肪酸-肌肽復(fù)合物粗品溶液，取250μL粗品溶液進(jìn)行茚三酮比色法測(cè)定修飾程度；第五步 用第四步制得的粗品溶液，上RT-HPLC層析柱，用20％乙腈洗脫，流速為1ml/min，210nm紫外檢測(cè)吸收峰值；第六步 對(duì)第五步收集到的各吸收峰洗脫液進(jìn)行LC/MS檢測(cè)，檢查脂肪酸-肌肽復(fù)合物的分子量；第七步 將第六步檢測(cè)合格的吸收峰洗脫液，冷凍干燥，得脂肪酸-肌肽復(fù)合物的純品，分子量為324D。
實(shí)施例2 脂肪酸-肌肽復(fù)合物的制備方法。本實(shí)施例的特征在于，脂肪酰氯是十二酰氯CH3(CH2)nCClO(n＝10)，分子量為218.78D，操作步驟第一步 將100mg肌肽干粉與8mL的pH10的100mMNa2CO3-NaHCO3緩沖液混和，得反應(yīng)溶液；第二步 向第一步制得的反應(yīng)溶液中滴入102.2μL～5.1mL十二酰氯，攪拌反應(yīng)；第三步 將經(jīng)第二步處理的反應(yīng)溶液置于0～40℃下，反應(yīng)0.5～24h，期間用NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液的pH值至10；第四步 用HCl調(diào)節(jié)經(jīng)第三步處理的反應(yīng)溶液的pH值至5.0，終止反應(yīng)，用pH值為10的100mM Na2CO3-NaHCO3緩沖液補(bǔ)足反應(yīng)溶液的體積至10mL，制得脂肪酸-肌肽復(fù)合物粗品溶液，取250μL粗品溶液進(jìn)行茚三酮比色法測(cè)定修飾程度；第五步 用第四步制得的粗品溶液，上RT-HPLC層析柱，用20％乙腈洗脫，流速為1ml/min，210nm紫外檢測(cè)吸收峰值；第六步 對(duì)第五步收集到的各吸收峰洗脫液進(jìn)行LC/MS檢測(cè)，檢查脂肪酸-肌肽復(fù)合物的分子量；第七步 將第六步檢測(cè)合格的吸收峰洗脫液，冷凍干燥，得脂肪酸-肌肽復(fù)合物的純品，分子量為409D。
實(shí)施例3 脂肪酸-肌肽復(fù)合物的制備方法。本實(shí)施例的特征在于，脂肪酰氯是十六酰氯CH3(CH2)nCClO(n＝14)，分子量為274.88D，操作步驟第一步 將100mg肌肽干粉與8mL的pH10的100mMNa2CO3-NaHCO3緩沖液混和，得反應(yīng)溶液；第二步 向第一步制得的反應(yīng)溶液中滴入134.0μL～6.7mL十六酰氯，攪拌反應(yīng)；第三步 將經(jīng)第二步處理的反應(yīng)溶液置于0～40℃下，反應(yīng)0.5～24h，期間用NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液的pH值至10；第四步 用HCl調(diào)節(jié)經(jīng)第三步處理的反應(yīng)溶液的pH值至5.0，終止反應(yīng)，用pH值為10的100mM Na2CO3-NaHCO3緩沖液補(bǔ)足反應(yīng)溶液的體積至10mL，制得脂肪酸-肌肽復(fù)合物粗品溶液，取250μL粗品溶液進(jìn)行茚三酮比色法測(cè)定修飾程度；第五步 用第四步制得的粗品溶液，上RT-HPLC層析柱，用20％乙腈洗脫，流速為1ml/min，210nm紫外檢測(cè)吸收峰值；第六步 對(duì)第五步收集到的各吸收峰洗脫液進(jìn)行LC/MS檢測(cè)，檢查脂肪酸-肌肽復(fù)合物的分子量；第七步 將第六步檢測(cè)合格的吸收峰洗脫液，冷凍干燥，得脂肪酸-肌肽復(fù)合物的純品，分子量為465D。
實(shí)施例4 脂肪酸-肌肽復(fù)合物的制備方法。本實(shí)施例的特征在于，脂肪酰氯是辛酰氯CH3(CH2)nCClO(n＝6)，分子量為162.66D，操作步驟第一步 將100mg肌肽干粉與8mL的pH10.14的100mMNa2CO3-NaHCO3緩沖液混和，得反應(yīng)溶液；第二步 向第一步制得的反應(yīng)溶液中滴入75.5μL～3.75mL辛酰氯，攪拌反應(yīng)；第三步 將經(jīng)第二步處理的反應(yīng)溶液置于0～40℃下，反應(yīng)0.5～24h，期間用NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液的pH值至10；
第四步 用HCl調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液的pH值至5.0，終止反應(yīng)，用pH10.14的100mM Na2CO3-NaHCO3緩沖液補(bǔ)足反應(yīng)溶液的體積至10mL，制得脂肪酸-肌肽復(fù)合物粗品溶液，取250μL粗品溶液進(jìn)行茚三酮比色法測(cè)定修飾程度；第五步 用第四步制得的粗品溶液，上RT-HPLC層析柱，用20％乙腈洗脫，流速為1ml/min，210nm紫外檢測(cè)吸收峰值，檢測(cè)圖譜見(jiàn)圖1，保留時(shí)間為12min的峰的對(duì)應(yīng)物質(zhì)為脂肪酸-肌肽復(fù)合物。
第六步 將第五步收集到的修飾吸收峰溶液，冷凍干燥，得脂肪酸-肌肽復(fù)合物的純品，分子量為352D。
實(shí)施例5 C8-Car復(fù)合物的抗氧化活性。
實(shí)驗(yàn)材料與方法雄性健康昆明小鼠(清潔級(jí)，20-25g，上海復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供)；MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所提供)；雄性健康昆明小鼠禁食過(guò)夜，分為4組，每組8只。第1組，對(duì)照組；第2組，溴代苯損傷組；第3組，肌肽保護(hù)組；第4組，C8-Car復(fù)合物保護(hù)組。所述的C8-Car復(fù)合物是實(shí)施例4的制備產(chǎn)物。
第1組腹腔注射200μL pH7.0磷酸緩沖液；第2組腹腔注射200μL pH7.0磷酸緩沖液；第3組腹腔注射肌肽，4.5mmol/kg；第4組腹腔注射C8-Car復(fù)合物，4.5mmol/kg。記此時(shí)為零時(shí)刻。3小時(shí)后，第1組的每只昆明小鼠胃部灌注0.2mL溶媒；第2，3，4組的每只昆明小鼠胃部灌注0.2mL 0.5mol/L溴代苯，形成損傷。18～24小時(shí)后，取肝，用生理鹽水洗凈，冰浴勻漿，得到肝細(xì)胞勻漿液，用MDA試劑盒測(cè)定其中MDA含量。測(cè)得對(duì)照組的MDA含量為0.105，溴代苯損傷組的MDA含量為0.193，肌肽保護(hù)組的MDA含量為0.146，C8-Car復(fù)合物保護(hù)組的MDA含量為0.085。溴代苯損傷組小鼠肝細(xì)胞勻漿液的MDA含量明顯高于對(duì)照組，C8-Car復(fù)合物保護(hù)組小鼠肝細(xì)胞勻漿液的MDA含量明顯低于肌肽保護(hù)組與溴代苯損傷組的小鼠肝細(xì)胞勻漿液的MDA含量，說(shuō)明C8-Car復(fù)合物具有良好的抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖2。
實(shí)施例5的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)充分證明本發(fā)明的脂肪酸-肌肽復(fù)合物具有天然肌肽所具有的抗氧化活性，此外，還具有天然肌肽所不具有的體內(nèi)生物穩(wěn)定性高、半衰期長(zhǎng)和生物利用率高的優(yōu)點(diǎn)，有望成為治療老年癡呆癥、動(dòng)脈粥樣硬化、白內(nèi)障、胃潰瘍等疾病的新型抗氧化藥物的活性成分。
權(quán)利要求
1.一種脂肪酸-肌肽復(fù)合物，其特征在于，該復(fù)合物具有下列的分子結(jié)構(gòu)通式和簡(jiǎn)式His-Ala-C(O)-(CH2)nCH3和Cn+2-Car，其中n＝4，6，8，10，12，14，該復(fù)合物的分子量為324～465D。
2.權(quán)利要求1所述的脂肪酸-肌肽復(fù)合物的制備方法，其特征在于，操作步驟第一步將100mg肌肽干粉與8mL的pH10的100mMNa2CO3-NaHCO3緩沖液混和，得反應(yīng)溶液；第二步向第一步制得的反應(yīng)溶液中滴入6.13μL～6.7mL脂肪酰氯CH3(CH2)nCClO，攪拌反應(yīng)，脂肪酰氯分子式中的n＝4，6，8，10，12，或14；第三步將經(jīng)第二步處理的反應(yīng)溶液置于0～40℃下，反應(yīng)0.5～24h，期間用NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液的pH值至10；第四步用HCl調(diào)節(jié)經(jīng)第三步處理的反應(yīng)溶液的pH值至5.0，終止反應(yīng)，用pH10的100mM Na2CO3-NaHCO3緩沖液補(bǔ)足反應(yīng)溶液的體積至10mL，得脂肪酸-肌肽復(fù)合物粗品溶液，取250L粗品溶液進(jìn)行茚三酮比色法測(cè)定修飾程度；第五步用第四步制得的粗品溶液，上RT-HPLC層析柱，用20％乙腈洗脫，流速為1ml/min，210nm紫外檢測(cè)吸收峰值；第六步對(duì)第五步收集到的各吸收峰洗脫液進(jìn)行LC/MS檢測(cè)，檢查脂肪酸-肌肽復(fù)合物的分子量；第七步將第六步檢測(cè)合格的吸收峰洗脫液，冷凍干燥，得到脂肪酸-肌肽純品，分子量為324～465D。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脂肪酸-肌肽復(fù)合物的制備方法，其特征在于，第二步中，向第一步制得的反應(yīng)溶液中滴入6.13～306.5μL己酰氯，攪拌反應(yīng)，己酰氯的分子式為CH3(CH2)nCClO，其中n＝4，分子量為134.61D；第七步中，得到的脂肪酸-肌肽復(fù)合物的純品的分子量為324D。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脂肪酸-肌肽復(fù)合物的制備方法，其特征在于，第二步中，向第一步制得的反應(yīng)溶液中滴入102.2μL～5.1mL十二酰氯，攪拌反應(yīng)，十二酰氯的分子式為CH3(CH2)nCClO，其中n＝10，分子量為218.78D；第七步中，得到的脂肪酸-肌肽復(fù)合物的純品的分子量為409D。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脂肪酸-肌肽復(fù)合物的制備方法，其特征在于，第二步中，向第一步制得的反應(yīng)溶液中滴入134.0μL～6.7mL十六酰氯，攪拌反應(yīng)，十六酰氯的分子式為CH3(CH2)nCClO，其中n＝14，分子量為274.88D；第七步中，得到的脂肪酸-肌肽復(fù)合物的純品的分子量為465D。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脂肪酸-肌肽復(fù)合物的制備方法，其特征在于，第二步中，向第一步制得的反應(yīng)溶液中滴入75.5μL～3.75mL辛酰氯，攪拌反應(yīng)，辛酰氯的分子式為CH3(CH2)nCClO，其中n＝6，分子量為162.66D；第七步中，得到的脂肪酸-肌肽復(fù)合物的純品的分子量為352D。
全文摘要
一種脂肪酸—肌肽復(fù)合物及其制備方法。該復(fù)合物具有下列的分子結(jié)構(gòu)通式His－Ala－C(O)－(CH
文檔編號(hào)A61P25/28GK1810828SQ20061002435
公開(kāi)日2006年8月2日 申請(qǐng)日期2006年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月3日
發(fā)明者樓旻, 吳自榮, 黃靜, 張緒瑛, 何成良 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)