專利名稱：對次表面組織和液體的拉曼光譜分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過探測漫散射光的拉曼特征來確定體內(nèi)次表面組織的 特性的方法和裝置。例如，所述方法和裝置適于透過皮膚、指甲或其它 表面組織來探測體內(nèi)骨骼的拉曼光譜特征，而不需要通過切割或穿刺而 使骨骼組織暴露出來。
背景技術(shù)：
對骨骼和其它生物組織及活組織進(jìn)行調(diào)査研究的領(lǐng)域包括各種各樣 的分析技術(shù)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)評估特定患者、人或動物的骨骼質(zhì)量或組織成分 是重要的，針對許多這樣的情況而開發(fā)出了這些技術(shù)。例如，患骨質(zhì)疏 松癥的人與正常人相比，骨折的風(fēng)險顯著增加。對退變性骨骼疾病(例 如骨質(zhì)疏松癥)的診斷是重要的，從而使患者可以調(diào)整他們的生活方式 或?qū)で蟾深A(yù)以降低骨折的顯著風(fēng)險。在肌骨組織研究中發(fā)現(xiàn)了另一示例。 該領(lǐng)域的一個重要方面是使用仔細(xì)挑選的許多正常的并且在許多情況下 是轉(zhuǎn)基因動物對具有功能的組織成分和分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。
但是，至今為止，很少有用于檢查骨骼的細(xì)節(jié)或其它組織的成分的 非侵入性或最小侵入性方法。在對遺傳疾病或代謝疾病的動物模型的研 究中，標(biāo)準(zhǔn)的過程是犧牲動物并采集組織標(biāo)本以供研究。顯然優(yōu)選的是， 研究活動物并且使用導(dǎo)致最小不適或傷害的方法。在長時間監(jiān)測組織變 化的研究中，最能體驗到這種需要。
顯然，在檢查人類患者時，犧牲過程并不是一種選擇。當(dāng)前用于評 估骨骼質(zhì)量的可用方法主要基于射線照相，特別是雙能X射線吸收測量
法(DEXA)。但是，這種技術(shù)僅能夠測量骨骼的無機(jī)相(羥磷灰石)，而 有機(jī)相(主要是膠原I)在很大程度上是不可見的。眾所周知，骨骼的材 料強(qiáng)度取決于膠原成分和羥磷灰石成分這兩者。因此，DEXA技術(shù)忽視
了評估骨骼質(zhì)量所需的一個關(guān)鍵數(shù)據(jù)。至今為止，僅僅公知的用于獲取 有機(jī)(膠原)數(shù)據(jù)的過程涉及分析物理暴露出的骨骼或通過活組織切片 而切下的樣本。這兩者通常都會使患者不適或疼痛。
紅外和拉曼光譜法提供了豐富的與寬范圍的組織和液體的生化狀態(tài)
有關(guān)的信息(例如，參見US 6，681，133或WO 01/52739)。在骨骼分析中， 例如，這些技術(shù)可以提供礦物/基質(zhì)比、礦物結(jié)晶度、基質(zhì)交聯(lián)和機(jī)械負(fù) 載所引起的可逆變化和不可逆變化的有關(guān)信息。不幸的是，利用這些方 法進(jìn)行的分析局限于表面研究，即對暴露骨骼的研究。紅外輻射通常在 被水完全吸收之前穿透到組織中不多于幾個微米。近紅外范圍(700至 850nm)穿透得更深，但是多重散射會導(dǎo)致失去詳細(xì)空間信息。共焦顯微 鏡法是一種用于探測樣本深處的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，但對于活組織被排除，因為 密集的焦點(diǎn)產(chǎn)生局部加熱和組織損害。此外，這種技術(shù)在諸如生物組織 的漫散射介質(zhì)中基本上效果較弱，在漫散射介質(zhì)中，該技術(shù)僅對于大約 十倍于光子在該介質(zhì)中平均自由程的深度是實(shí)用的。
彈性散射光子已經(jīng)用于在散射表面之下探測組分信息。例如， B.B.Das等在Rep. Prog. Phys. 60， 227 ( 1997)中描述了一種使用時間選通 (time gating)的方法。這種技術(shù)依賴于這樣的事實(shí)，即光穿透漫散射介 質(zhì)花費(fèi)的時間有限。因此，因此稍后將在較低的深度發(fā)生散射事件，因 此監(jiān)測散射信號隨時間的變化從理論上講應(yīng)當(dāng)提供關(guān)于在逐漸變深的深 度處的散射中心的性質(zhì)的信息。
用于提取對醫(yī)學(xué)診斷至關(guān)重要的信息的拉曼光譜法的廣泛應(yīng)用促使 研究一種能夠測量次表面拉曼散射的系統(tǒng)。理論上講，這種系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)能 夠?qū)ζは鹿趋篮蛙浌?、軟骨?cartilage sack)內(nèi)的腰間盤組織、具有不 同材料和功能特性的腱和韌帶、由體內(nèi)膜狀覆層再次進(jìn)行保護(hù)的內(nèi)臟壁 或食道組織進(jìn)行成分分析。但是，Das等的彈性散射技術(shù)不能直接延伸到 拉曼光譜法。由于用于產(chǎn)生拉曼光的截面小得多，所以光子的非彈性散 射是弱得多的過程。這導(dǎo)致了弱得多的信號。此外，拉曼信號更加易受 發(fā)光或樣本損害的干擾。
一種已經(jīng)用于從拉曼散射獲取深度信息的方法在下文中進(jìn)行了描
述Jun Wu等所著白勺"Three dimensional imaging of objects embedded in turbid media with fluorescence and Raman spectroscopy" ， Appl. Optics 34 (18) ， 3425 (1995)。該論文描述了一種利用熒光衰減和拉曼散射的快 速上升時間，根據(jù)表面照射和散射光子的最早探測之間的時間延遲來推 斷深度信息的技術(shù)。設(shè)置一單光子探測系統(tǒng)以從被1MHz的脈沖激光束 照射時開始監(jiān)測來自樣本表面的反向散射光子。光子到達(dá)時間針對多個 脈沖照射的擴(kuò)展，顯示出具有開始時間延遲，它是散射對象的深度特性。 從A. Carden和M.D. Morris, J. Biomed. Optics 5, 259(2000)中可顯見 使用非侵入性拉曼骨骼探測可以獲得的益處，其中來自骨骼的信號質(zhì)量 對于得出關(guān)于是否存在疾病的精準(zhǔn)診斷是至關(guān)重要的。但是，骨膠原的 常規(guī)拉曼信號被不期望的來自覆層組織的拉曼信號掩蓋，因此，通常借 助活組織切片檢查來獲得與化學(xué)組成有關(guān)的數(shù)據(jù)。
已認(rèn)識到需要一種執(zhí)行次表面拉曼光譜法的另選非侵入性或最小侵 入性方法。這種方法應(yīng)該能夠提供克服了 DEXA的限制的更加靈活的體 內(nèi)分析技術(shù)的基礎(chǔ)。具體而言，DEXA在獲取與骨骼成分相關(guān)的部分信 息方面受到限制，但是期望基于拉曼的技術(shù)的應(yīng)用范圍更加廣泛。

發(fā)明內(nèi)容
因而，本發(fā)明的一個目的是提供一種能夠提取體內(nèi)組織和活組織(諸 如骨骼組織)的次表面化學(xué)組成信息的基于拉曼光譜法的分析技術(shù)。本 發(fā)明的另一目的是在不需要任何切割、穿刺或用于使目標(biāo)次表面組織暴 露出來的外科手術(shù)介入的情況下實(shí)現(xiàn)這種分析。
因此，本發(fā)明提供了一種對次表面組織或液體進(jìn)行皮下檢查的方法， 所述方法包括利用探測光束照射表面組織；從表面上的一個或更多個 收集區(qū)或位置收集在所述表面下散射的光，所述收集區(qū)與所述探測光束 隔開；以及從所收集的光中探測一個或更多個拉曼光譜特征。然后，可 以根據(jù)所述拉曼光譜特征得出生物醫(yī)學(xué)特性或化學(xué)特性。
更一般性地說，本發(fā)明提供了一種透過漫散射上覆組織確定次表面 組織或液體的一個或更多個特性的方法，所述方法包括以下步驟在所
述上覆組織的表面上的進(jìn)入?yún)^(qū)提供入射光；從所述表面上的收集區(qū)收集 在所述上覆組織內(nèi)散射的光，所述收集區(qū)與所述進(jìn)入?yún)^(qū)隔幵；以及在所 收集的光中探測與所述入射光在光譜上相關(guān)的源自所述次表面組織或液 體的一個或更多個拉曼特征。
所述上覆組織可以是皮膚或指甲，所述次表面組織或液體可以是骨 骼、軟骨、乳房組織或血液，但是也有許多其它應(yīng)用，某些應(yīng)用可能需 要外科手術(shù)介入以暴露出用于遮蓋和保護(hù)要研究的下層或器官的上覆層 (諸如膜或粘液)。要研究的組織可以是液體形式，諸如血液、淋巴液或 者關(guān)節(jié)內(nèi)的液體、眼睛內(nèi)的液體或膜之間的液體。
在許多情況下，單個進(jìn)入?yún)^(qū)和收集區(qū)足以得到可用的拉曼光譜數(shù)據(jù)。 在其它情況下，可以使用有不同物理間隔的一個或更多個進(jìn)入?yún)^(qū)以及一-個或更多個收集區(qū)，并且例如通過使用根據(jù)多個間隔的數(shù)據(jù)以優(yōu)先選擇 所述次表面組織的拉曼信號，將如此獲得的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行組合，從而得 到所述次表面組織的所需特性的更加精確的確定。
在中心進(jìn)入?yún)^(qū)周圍圍繞或分布單個或多個收集區(qū)是有利的，因為這
與簡單移位的收集區(qū)相比提供了增大的收集面積。另選的是，可以使用 在單個收集區(qū)周圍圍繞或分布的單個或多個進(jìn)入?yún)^(qū)。同心環(huán)形或其它形
狀的進(jìn)入?yún)^(qū)和收集區(qū)可能未被充分利用。例如， 一圈緊密封裝的端接光 纖可能填充相關(guān)環(huán)的大約60%。優(yōu)選的是，光學(xué)利用收集環(huán)或進(jìn)入環(huán)的
至少10%。
優(yōu)選的是，相關(guān)的進(jìn)入?yún)^(qū)和收集區(qū)不重疊。
本發(fā)明還提供了通過解釋所確定的次表面組織的特性來對人或動物 的醫(yī)學(xué)狀況進(jìn)行診斷的相關(guān)方法。
本發(fā)明提供了用于確定次表面組織的一個或更多個特征的對應(yīng)裝置。
本發(fā)明還提供了一種測量漫散射組織的次表面拉曼光譜的方法，所 述方法包括以下步驟
a) 利用光探針照射所述組織；
b) 收集被所述組織散射的光；以及
C)對所收集的光的至少一部分進(jìn)行光譜分離，以探測一個或更多個 拉曼光譜特征，
其中被所述樣本散射的光是從所述樣本的表面上的多個空間位置處 收集的，各空間位置距照射點(diǎn)的距離不同，在各空間位置處收集的所述 光的至少一部分被單獨(dú)地進(jìn)行光譜色散以形成多個拉曼光譜，并且其中 所述方法還包括下述步驟
d)對所述多個拉曼光譜進(jìn)行分析以提取與所述組織的次表面區(qū)域 的拉曼光譜有關(guān)的信息。
因此，采用該方法，非破壞性地獲得了光譜信息，該光譜信息可用 于解釋和確定漫散射組織在表面層下方的性質(zhì)和組成。本發(fā)明有效地實(shí) 現(xiàn)了對從所述樣本得到的拉曼信號進(jìn)行空間選通，從而將來自與表面層 的組成不同的次表面層的拉曼信號隔離出來的方案。所述方法在此被稱
為空間偏移拉曼光譜法(SORS)。
將本發(fā)明用于在樣本內(nèi)的不同深度處具有一種或更多種不同化學(xué)組 成的組織時，從在空間上自探測激光束的入射點(diǎn)偏移了不同量的區(qū)域收 集拉曼光譜會得到一系列光譜(兩個或更多個光譜)，每個光譜都包括從 所述組織內(nèi)的不同深度發(fā)出的拉曼信號。所采集的該系列光譜所包括的 從組織表面層和組織次表面層產(chǎn)生的拉曼信號的相對貢獻(xiàn)不同。在收集 該數(shù)據(jù)系列時，當(dāng)信號收集點(diǎn)從探測激光束的入射點(diǎn)移開時，表面層信 號的貢獻(xiàn)減小得比由組織本體內(nèi)更深層的不同組成所產(chǎn)生的信號的貢獻(xiàn) 要快得多。這使得能夠直接地或者為了更高程度的分離而通過對所收集 的光譜集進(jìn)行數(shù)值處理(例如多元數(shù)據(jù)分析或光譜彼此間的定標(biāo)相減
(scaled subtraction)),來提取較深的次表面組織的貢獻(xiàn)。
在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，收集了兩個或更多個拉曼光譜并利用定標(biāo)
相減對其進(jìn)行分析，將從照射點(diǎn)處收集的或在距該照射點(diǎn)最近處收集的
拉曼光譜從距該照射點(diǎn)較遠(yuǎn)處收集的拉曼光譜中減去，由此可以識別該
組織的次層的拉曼光譜特征。
在另一另選例中，如果已知組織的表面的化學(xué)組成的拉曼光譜，則
通過從所收集的光的拉曼光譜中定標(biāo)減去該已知拉曼光譜，對所收集的
拉曼光譜進(jìn)行分析。
在一另選的優(yōu)選實(shí)施方式中，在距照射點(diǎn)不同的距離處收集至少20 個拉曼光譜并釆用多元數(shù)據(jù)分析對所述多個拉曼光譜進(jìn)行分析。主成分 分析可用作所述多元數(shù)據(jù)分析。
本發(fā)明的優(yōu)選特征是以兩個或更多個不同波長照射組織，其中所收 集的光是拉曼光譜與熒光的組合，從而拉曼光譜可從所收集的光中提取 出來。
所述組織、收集用光學(xué)器件與照射點(diǎn)中的至少一個可以相對于其余 的移動，從而能夠在距照射點(diǎn)不同的距離處收集拉曼光譜。例如，可以 提供其上安放有對象肢體或頭部的可移動臺，并且安排探測光束來追蹤 所述肢體或頭部的移動，由此所述對象組織相對于用于在距照射點(diǎn)不同 的距離處收集散射光的固定的收集用光學(xué)器件進(jìn)行移動。
可從距照射點(diǎn)不同的距離處的點(diǎn)區(qū)域收集散射光，或者可從基本上 與從照射點(diǎn)測得的距離成橫向的多條基本平行的線收集散射光。
另選的是，使用光纖提供探測光束，并可使用圍繞所述探測光束光 纖布置成多個同心圓的光纖來收集散射光，由此在距所述照射點(diǎn)的不同 半徑處的同心環(huán)中收集所述散射光。
理想的是，光探針大于200 nm且小于2000 nm，并可由例如針對溫 度可調(diào)的一個或更多個準(zhǔn)單色激光器或二極管激光器來產(chǎn)生。為了避免 血紅蛋白的吸收，所述光探針優(yōu)選地大于600nm，并且為了避免黑色素 的吸收，波長優(yōu)選地大于800nm。
在一另選方面中，本發(fā)明提供了對在漫散射組織內(nèi)的不同深度處產(chǎn) 生的拉曼光譜進(jìn)行選擇性測量的裝置，所述裝置包括光源，其利用探 測光束來照射組織；收集用光學(xué)器件，用于收集被所述組織散射的光， 并將其傳遞到光譜儀；探測裝置，用于探測被所述光譜儀色散的光；其 中，所述裝置適于在所述組織的表面上的多個空間位置處收集散射光， 各空間位置距照射點(diǎn)的距離不同，并且所述光譜儀對在各空間位置處收 集的光的至少一部分單獨(dú)地進(jìn)行光譜色散以形成多個拉曼光譜，并且其 中所述裝置還包括分析器，所述分析器用于從所述多個拉曼光譜中識別
所述組織的次層的拉曼光譜所特有的特征。
所述光源可由例如針對溫度可調(diào)的一個或更多個準(zhǔn)單色激光器或二 極管激光器構(gòu)成。
在另一另選方面中，本發(fā)明提供了一種診斷方法，所述診斷方法包 括使用如上所述的方法，從組織收集一個或更多個拉曼光譜，所述組 織由上覆組織的表面區(qū)域和與所述上覆組織不同的深層組織的次層區(qū)域 構(gòu)成。
優(yōu)選的是，在所述一個或更多個所收集的拉曼光譜中識別所述組織 的次層區(qū)域的拉曼光譜所特有的一個或更多個特征，并且將其與從健康 控制樣本獲得的特征進(jìn)行比較。
上面闡述的方法和裝置可以具體用于確定人體或動物體中的體內(nèi)組 織的特性，并用于確定組織的生物醫(yī)學(xué)特性。
本發(fā)明還提供了包括內(nèi)窺鏡的如上所述的裝置，從而能夠使用所描 述的拉曼技術(shù)來研究皮下和內(nèi)部組織或液體。
現(xiàn)在將參照附圖僅通過實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說明。


圖1示出了本發(fā)明的原理，其中光源10的照射導(dǎo)致了體內(nèi)骨骼組織
處的拉曼散射16;
圖2a至2c示出了本發(fā)明可以使用的一些不同的組織構(gòu)造；
圖3a至3c示出了不同的進(jìn)入?yún)^(qū)和收集區(qū)的布置；
圖4示出了使用光學(xué)裝置50、 54來改變環(huán)形收集區(qū)的直徑的布置；
圖5示出了使用反射鏡60來增強(qiáng)拉曼光子的收集的應(yīng)用；
圖6a示出了用于與光譜探測器22連接的、進(jìn)行次表面體內(nèi)組織分
析的光學(xué)頭；
圖6b示出了包含本發(fā)明的內(nèi)窺鏡；
圖7a和7b示出了圖6的光學(xué)頭與連接器的平面詳細(xì)圖8示意性地示出了根據(jù)本發(fā)明的分析裝置，設(shè)置所述分析裝置來
提取在代表體內(nèi)組織的樣本的表面層下產(chǎn)生的拉曼光譜；
圖9示出了根據(jù)本發(fā)明的用于收集空間偏移的拉曼光譜的點(diǎn)收集幾 何形狀；
圖10示出了根據(jù)本發(fā)明的用于收集空間偏移的拉曼光譜的同心圓 收集幾何形狀；
圖11示出了使用本發(fā)明的分析裝置以不同偏移產(chǎn)生的兩層樣本的一
系列拉曼光譜；
圖12示出了圖11的樣本的拉曼光譜的絕對強(qiáng)度與偏移距離的相關(guān)
性；
圖13示出了圖12的拉曼光譜相對于偏移距離的比率；
圖14示出了縮放成與反式芪譜帶的高度相同的同一兩層樣本的一 系列拉曼光譜；
圖15示出了圖14的各光譜中的PMMA的貢獻(xiàn)；
圖16針對同一樣本示出了反式芪拉曼信號與源自PMMA層的熒光 的相對比率，其是空間收集偏移量的函數(shù)；
圖17示出了使用根據(jù)本發(fā)明的分析裝置獲得的對同一樣本的一系 列拉曼光譜的PCA分析結(jié)果；以及
圖18示出了使用根據(jù)本發(fā)明的分析方法獲得的拉曼光譜針對同一 樣本進(jìn)行簡單減法處理的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)在參照圖1，在示意性截面圖中示出了工作中的本發(fā)明的實(shí)施方 式。使用包括激光器9或由激光器9提供的光源10來照射體內(nèi)組織14 的表面12的局部進(jìn)入?yún)^(qū)，體內(nèi)組織14在本實(shí)施例中由皮層15和下面的 骨骼組織20組成。來自所述光源的入射輻射通過樣本(尤其是上皮層) 發(fā)生漫散射。 一些輻射可被組織吸收， 一些輻射可能會引起例如熒光發(fā) 光，并且一些輻射通過組織表面12后未發(fā)生變化地再度顯現(xiàn)。
入射輻射中較小比例的光子被非彈性散射，由此產(chǎn)生拉曼光子，例 如如拉曼事件16所示。拉曼光子繼而通過組織被漫散射。 一些拉曼光子 可被吸收，例如由此產(chǎn)生熒光，而一些拉曼光子穿過表面12后未發(fā)生變 化地顯現(xiàn)，從而在收集器18處被收集。
拉曼光子經(jīng)歷第二次拉曼事件的可能性非常小。
例如使用探測器22中的濾波器或光譜儀以及適宜的傳感器對收集
的光進(jìn)行分析，并且在分析器23中進(jìn)一步使用所確定的拉曼光譜或光譜 特征。所述探測器可以使用傅立葉變換而不是常規(guī)的色散分光技術(shù)。
通常，大部分拉曼光子將在光源10的附近產(chǎn)生，在此處入射輻射最 強(qiáng)。例如通過使用與光源10相配的光學(xué)器件在光源10處收集光，可以 對這些拉曼光子進(jìn)行最好的探測。然而，隨著距光源的距離的增加，源 自光源附近的拉曼光子的強(qiáng)度要比源自距光源更遠(yuǎn)處的、特別是來自組 織內(nèi)較深處的拉曼光子的強(qiáng)度下降得更快。因此，通過將收集光的位置 與組織被照射的位置隔開，可以實(shí)現(xiàn)對來自組織內(nèi)較深處的拉曼光子的 優(yōu)選取樣。
在圖1中，拉曼事件16發(fā)生在次表面骨骼層20中或在其頂部?？?以調(diào)整光源10與收集器18之間(或等同的進(jìn)入?yún)^(qū)11與收集區(qū)19之間) 的間隔d來選擇特定深度。然而，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，以一定范圍的 間隔d收集光，分析器23用于根據(jù)所收集的光針對不同"值的拉曼特征 來推斷組織的深度相關(guān)特性。
可以通過對多個間隔的拉曼信號進(jìn)行數(shù)值處理來優(yōu)先選擇特定層的 拉曼信號。同樣，可以通過類似的數(shù)值處理優(yōu)選去除一層或更多層的拉 曼信號。這種數(shù)值處理可以是根據(jù)不同間隔的信號的簡單加權(quán)比較或相 減，或者可以使用更復(fù)雜的PCA技術(shù)。
在圖1中，體內(nèi)組織14在表皮組織15和骨骼組織20之間顯示出明 顯的邊界。圖2a至2c中示出了一些其它組織構(gòu)造。在圖2a中，從表面 層30至深層32存在漸變，深層32可以是漫散射型的或者可以是部分不 透明或完全不透明的，在這些層之間的界面處產(chǎn)生代表層32的拉曼光子。 在圖2b中，表面層30與深層32被另外一透明或半透明層34隔開，該 透明或半透明層34例如可以為充有體液的空間。圖2c中示出了更為復(fù) 雜的組織結(jié)構(gòu)，其中，漸變或突變的次層36和38嵌入在表面層30之下 或之內(nèi)。
這里使用的拉曼技術(shù)和裝置可以作為定位癌感染組織的獨(dú)立技術(shù)或 者在乳癌的情況下與諸如乳房X線照相術(shù)的現(xiàn)有技術(shù)相結(jié)合，從而應(yīng)用 于例如對癌組織的非侵入性檢查。在針對乳癌的結(jié)合方法中，乳房X線 照相術(shù)將用于識別乳房內(nèi)的可疑區(qū)域，然后拉曼技術(shù)將用于探測該可疑 區(qū)域并識別它們的性質(zhì)。這可以緩解對活組織切片檢查的需要，并提供 了即時的結(jié)果，因此大大降低了患者的損傷。所描述的拉曼技術(shù)特別適 于乳房的深層探測，因為與許多其它類型的組織相比，乳房組織表現(xiàn)出 較長的光子散射路徑長度以及較低的吸收系數(shù)。
在適當(dāng)情況下，可以將拉曼裝置組合到內(nèi)窺鏡裝置中。這樣，可以 探測體腔，或者使用部分侵入性技術(shù)來探測優(yōu)選不應(yīng)受到破壞的身體區(qū) 域，但是希望有能穿過周圍組織或膜而進(jìn)入這些區(qū)域的拉曼探測。這些
區(qū)域例如為大腦(例如，用于識別阿茨海默癥(Alzheimer's disease)和 早老癥(Hutchinson，s disease)以及CJD)、肝臟、心臟、腎、前列腺、靜脈、 神經(jīng)系統(tǒng)、脊髓和膝蓋骨。其它目標(biāo)生理狀況包括對腎和膀胱中的結(jié)石 的性質(zhì)的探測。
所描述的拉曼方法和裝置也可以用于對血液特性的尤其是透過皮膚 的非侵入性探測。在這種應(yīng)用中，本發(fā)明用于去除源自皮膚的壓倒性的 拉曼和熒光信號，從而揭示來自血管中所包含的血液的下層信號。這樣， 可以檢測并測量葡萄糖水平、氧合作用、微生物、膽固醇的類型和量以 及諸如尿素、總蛋白質(zhì)和白蛋白的其它血液成分。可以研究諸如淋巴液 和眼淚的其它液體。
為了提高組織與光源和/或收集器之間的耦合，可以使用折射率匹配 液體。也可將諸如丙三醇的折射率匹配液體沉積到組織中，以局部地并 暫時地減少光子散射。這增加了所描述的技術(shù)的工作深度。可以將折射 率匹配液體稱為"對比劑"或"圖像增強(qiáng)劑"。
可以使用各種幾何形狀以單個、多個或可變的間隔實(shí)現(xiàn)光的入射輻 射和收集。在圖3a中，樣本表面上存在單個照射或進(jìn)入?yún)^(qū)40。與該照射 區(qū)隔開的是單個收集點(diǎn)或區(qū)域42，或者是多個區(qū)域，如虛線所示。另選 的是，可以移動單個收集區(qū)或等效的照射區(qū)以提供可變間隔。在圖3b中，單個照射區(qū)40被一環(huán)形收集區(qū)44或者被多個環(huán)形收集
區(qū)或一可變半徑的環(huán)形收集區(qū)所圍繞，如虛線所示?？梢允褂脭喹h(huán)或與 照射點(diǎn)距離相似的多個分離的區(qū)域來代替環(huán)形收集區(qū)。
在圖3c中，使用環(huán)形照射區(qū)46和中央收集點(diǎn)48,由此減小了產(chǎn)生 給定數(shù)目的拉曼光子所需的入射輻射的局部強(qiáng)度。所述環(huán)的半徑可以改 變，或者將所述環(huán)設(shè)置為具有一定范圍的半徑的多個環(huán)。也可使用由多 個分離的照射區(qū)構(gòu)成的斷環(huán)，所述多個分離的照射區(qū)分布在距收集中心 點(diǎn)的距離相似的位置處。
通常，在進(jìn)入或收集區(qū)的比例盡可能大的條件下收集光或提供入射 輻射是有利的。然而，在實(shí)際的實(shí)施方式中，覆蓋率會受到限制。例如， 在環(huán)內(nèi)排列圓柱光纖時，10%的覆蓋率可能就已足夠，但優(yōu)選的是25%， 并且60%或更高也是可能的。
在簡化的實(shí)施方式中，通過靠近樣本表面的單根光纖可以提供單個 進(jìn)入?yún)^(qū)，利用收集用光纖的線性陣列可以提供多個收集區(qū)。光纖可類似 地用于提供環(huán)形和其它構(gòu)造的單個和多個固定間隔，并且可使用多種機(jī) 械裝置來提供可變間隔。
為了提供可變半徑的進(jìn)入?yún)^(qū)或收集區(qū)，還可以使用諸如圖4中所例 示的光學(xué)裝置?？梢哉{(diào)整位于組織與收集器之間的光學(xué)器件50和/或樣本 到探測器的距離，以將來自組織表面的不同部分的光引導(dǎo)至與光源10同 心的收集器18上。能夠利用光學(xué)器件驅(qū)動器54沿軸向52平移的透鏡裝 置(和/或照射源以及拉曼收集器/探測器)將來自半徑變化的環(huán)形區(qū)域的 光引導(dǎo)到收集器上，但也可以設(shè)想其它構(gòu)造。
在圖5中示出了另一方面，該方面可以用于上述任何一種配置。向 樣本表面提供一個或更多個反射鏡元件60。當(dāng)入射輻射或拉曼輻射自組 織出現(xiàn)而遠(yuǎn)離收集器18時，這些反射鏡元件使出現(xiàn)的輻射改變方向返回 組織。這增大了入射輻射的強(qiáng)度，因此增加了組織內(nèi)拉曼光子的產(chǎn)生， 并且還增大了在收集器18處接收到的拉曼光子的比例。這些反射鏡元件 優(yōu)選地不出現(xiàn)在靠近光源10或進(jìn)入?yún)^(qū)的表面，而是靠近收集區(qū)。
在另選實(shí)施方式中，通過利用直接放置在組織表面上或者在還使用
其它成像光學(xué)器件的情況下放置在成像平面上的蔽光框(mask),可以使 用非成像光學(xué)器件(諸如在Applied Optics第35巻第758頁中描述的非 成像光學(xué)器件)來實(shí)現(xiàn)更高的收集效率。該蔽光框擋住了組織的適當(dāng)區(qū) 域從而僅收集來自期望空間偏移的信號。蔽光優(yōu)選地與諸如電荷耦合器 件的探測器同步，從而使來自該探測器的順序讀數(shù)與提供根據(jù)照射區(qū)和 收集區(qū)之間的相應(yīng)的順序間隔所收集的光的蔽光框相關(guān)。所述蔽光可以 是機(jī)械的，并且還可以在成像光學(xué)器件與非成像型探測器之間進(jìn)行。
圖6a示出了本發(fā)明的實(shí)際實(shí)施方式，該實(shí)施方式包括通過光纖束72 而連接到探測器22的光學(xué)頭70。光學(xué)探測的結(jié)果被送入膝上型計算機(jī)或 其它計算機(jī)23，該膝上型計算機(jī)或其它計算機(jī)23對拉曼特征進(jìn)行分析以 推斷組織14的特性。在(未按比例繪制的)圖7a的平面示意圖中示出 了光學(xué)頭70的細(xì)節(jié)。 一束光源光纖74端接在所述頭的中央?yún)^(qū)域中。這 些光源光纖嵌入在諸如環(huán)氧樹脂的填充物76中，并被環(huán)形間隔元件78 圍繞。收集用光纖80端接在圍繞所述間隔元件的環(huán)形區(qū)域中，也嵌入在 一填充物中，并被外套管圍繞。該配置適于包括上述各種反射鏡和光學(xué) 裝置。
在該特定實(shí)施方式中，各光纖具有直徑為200 pm的芯以及使光纖厚 度達(dá)到230 pm的包層。內(nèi)束由七根光源光纖74構(gòu)成，外束由26根收集 用光纖80構(gòu)成。使間隔物78具有能夠?qū)⑹占霉饫w80與所述頭的中心 隔開約3 mm的大小，并且使收集用光纖的末端近似均勻地分布在關(guān)于所 述中心半徑恒定的環(huán)形區(qū)域內(nèi)。該收集用光纖應(yīng)當(dāng)適于執(zhí)行光學(xué)或近紅 外拉曼操作，并且可由二氧化硅制成。
照射用光纖和收集用光纖距光學(xué)頭約100cm遠(yuǎn)地端接在圖7b示意性 例示的連接器中。所述連接器提供六根照射用光纖和二十六根收集用光 纖以連接到圖6的探測器22中，該探測器22包括在827nm處工作的光 源照射準(zhǔn)單色激光器和Kaiser Holospec光學(xué)分析器。
在圖6b中將本發(fā)明實(shí)現(xiàn)為內(nèi)窺鏡。插入管90用于通過自然的或經(jīng) 外科手術(shù)形成的孔92而進(jìn)入人體或動物體。照射用纖維和收集用纖維端 接在探測頭(未顯示)中，并通過插入管而穿回到控制手柄94?？梢栽?br> 控制手柄中或在相連的探測器單元22中執(zhí)行光學(xué)探測。
圖8中示出了用于識別來自體內(nèi)次表面組織的深度特定拉曼光譜的 另一空間選通分析裝置的示意圖。下面描述的特征和改變可以適當(dāng)?shù)貞?yīng) 用于已經(jīng)討論過的更一般性的實(shí)施方式。該裝置通常包括激光器IOI、拉
曼探測裝置102、 103以及分析器104。使用功率為12mW的諸如二極管 激光器的準(zhǔn)單色激光器(在組織分析的情況下，優(yōu)選地在827nm處工作) 產(chǎn)生所述裝置的探測光束105,利用常規(guī)光學(xué)器件將該探測光束105導(dǎo)向 樣本。該樣本具有表面層106和化學(xué)組成與所述表面層不同的較深層107。
圖8中示出的實(shí)際配置是實(shí)驗性的。樣本的各層構(gòu)成了實(shí)際體內(nèi)組 織的模型，并且為了方便起見而安放在工作臺上。但是，替換成具有很 小改動的真實(shí)體內(nèi)組織是簡單明了的。在當(dāng)前的展示中，使用在514nm 處工作的氬離子激光器。
對于該裝置，使用佩林布洛卡棱鏡(Pdlin-Brocaprism，未示出)來 阻擋激光等離子體線。所述裝置包括焦距為1 m的透鏡108，該透鏡108 用于在樣本上以法向入射角將激光束弱聚焦成直徑為300 pm的點(diǎn)。通過 使用光圈值(f-rmmber)約為1的直徑為2"的收集透鏡109按反向散射幾 何形狀收集由于照射樣本而產(chǎn)生的拉曼光，并利用透鏡109按2.5的放大 倍率將其成像在光譜儀102 (其是拉曼探測裝置的一部分)的狹縫上。優(yōu) 選地使用傳統(tǒng)成像光譜儀102 (例如光圈值為6.3的Spex Triplemate ) 使拉曼光色散并將該拉曼光成像在CCD照相機(jī)103上。照相機(jī)103優(yōu)選 地是用液氮冷卻的背照式深耗盡層CCD照相機(jī)(例如Andor， DU420-BU2 (250 nm) 1024X255有效像素)。這種照相機(jī)在拉曼光譜區(qū)域 中的CCD量子效率為大約65X并且其像素尺寸為26 pmX26 pm。將光 譜儀102的末級狹縫寬度設(shè)定為120 pm?？?0像素縱向合并(bin) CCD
以保持在收集側(cè)的空間選擇性。
將樣本106、 107安放在x-y-z微定位臺110上，所述微定位臺110 包括受控驅(qū)動器(未示出)，該受控驅(qū)動器可將所述臺與末級光學(xué)器件一 起(在圖8中垂直地)移動以使激光束相對于樣本的入射點(diǎn)固定在該樣 本上。在該構(gòu)造中，拉曼探測裝置102、 103總是從空間中的固定成像區(qū)
中收集反向散射拉曼移位光子，并且在泵浦光束(pump beam)入射點(diǎn)保 持固定在其在樣本表面上的位置處的同時在整個該成像區(qū)中對樣本進(jìn)行 掃描。也可使用濾波器(未示出)來阻擋任何殘余彈性散射探測激光到 達(dá)光譜儀102。使用從探測光束入射點(diǎn)橫向偏移的點(diǎn)收集，來部署上述 SORS裝置(圖9)。另選的是，可以使用可移動臺或其它移動控制裝置 來實(shí)現(xiàn)一個或更多個的樣本、照射點(diǎn)和拉曼探測裝置之間的相對移動。
針對光學(xué)行為與分層漫射體內(nèi)組織相似的測試樣本對利用與上述裝 置相似的裝置的拉曼光譜進(jìn)行收集，在該測試樣本中，第一層106由寬1 cm、高約4cm的光徑為lmm的比色管(cuvette)構(gòu)成，該比色管具有 定制的熔融石英前窗口和后窗口 ，填充有直徑約為20 pm的PMMA(聚(甲 基丙烯酸甲酯))球體。在填充期間，通過在比色皿(cell)上進(jìn)行機(jī)械拍 打，將所述球體松散地塞在該比色皿中以消除任何較大的空隙。該第一 層之后是第二層107，該第二層107由光徑為2mm的另一比色皿構(gòu)成， 該另一比色皿中填充有利用缽和杵研磨的反式芪細(xì)粉。使用這些比色管 是為了提供簡單的樣本處理方法，它們并不是所述裝置的必要特征。
在探測激光束入射到使第一層106位于最上層的樣本上的情況下， 利用一基本點(diǎn)收集幾何形狀來收集使用在此處描述的SORS方法的空間 偏移拉曼光譜，其中從自探測光束的入射點(diǎn)橫向移位的點(diǎn)進(jìn)行收集(圖 9)。如圖9所示的收集幾何形狀的點(diǎn)代表本發(fā)明的方法的最簡實(shí)施方式。 另一方面，圖10中所示的不需要使用x-y定位臺的同心圓幾何形狀有利 地獲得高得多的收集效率，但是需要使用光纖以使各圓成像在光譜儀狹 縫上的不同高度處，使得在色散后它們在CCD 103上的像能夠被成像在 分離的水平條紋上，使光譜在CCD上的垂直位置對應(yīng)于樣本表面上的相 對于探測光束入射點(diǎn)的給定偏移收集距離。在Jiaying Ma和Dor Ben-Amotz的題為"Rapid Micro-Raman Imaging using Fiber-Bundle Image Compression" (Applied Spectroscopy第51巻，第12號，1997年)的文 章中描述了使用光纖束來收集拉曼光譜，通過引用將其內(nèi)容合并于此。
當(dāng)然，顯而易見的是，可以釆用其它的另選收集幾何形狀，同時仍 然可實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的空間偏移拉曼光譜收集。
另外，在不進(jìn)行樣本照射時，可收集表示背景和裝置噪聲的"樣本
上(above the sample)"拉曼光譜。然后可以從拉曼光譜集合中減去該"樣 本上"拉曼光譜，以從光譜中去除噪聲。
當(dāng)采用諧振拉曼技術(shù)來獲取拉曼光譜，由此入射探測光束的波長被 調(diào)諧為與待研究材料的發(fā)色團(tuán)(chromphore)相匹配時，拉曼信號會被由 于電子激勵而產(chǎn)生的熒光(冷光)淹沒。例如，在對骨骼的室溫研究或 體內(nèi)研究中將激發(fā)出熒光，但在較冷的樣本中更可能激發(fā)出磷光。類似 地，金屬系的拉曼探測常常會激發(fā)出室溫磷光。
在這種情況下，利用SORS法可以在兩個或更多個激光波長處使拉 曼光譜恢復(fù)(recover)。這依賴于下述事實(shí)熒光背景的光譜輪廓通常不 依賴于激勵波長，而拉曼光譜依賴于激勵波長。因此，在兩個或更多個 不同的照射波長下在距照射點(diǎn)相同的空間距離處收集的光譜可以彼此相 減，以給出拉曼譜帶處于其中的導(dǎo)數(shù)型圖，并且可以對其進(jìn)行數(shù)學(xué)處理 以給出看起來更真實(shí)的拉曼光譜。在S. E. J. Bell, E. S. O. Bourguignon和 A. C. Dennis的題為"Subtracted shifted Raman spectroscopy (SSRS) method" (Analyst, 1998， 123， 1729-1734)的文章中描述了用于識別拉曼 譜帶的該技術(shù)。該技術(shù)還被稱作如P. Matousek, M. Towrie和A. W. Parker IJ.在同名論文(Raman Spec., 33, 128-242(2002))中所描述的移位激勵拉 曼差技術(shù)(Shifted Excitation Raman Difference technique (SERD))，通過 引用將其內(nèi)容合并于此。
可借助分立的激光器或借助單個激光器(諸如二極管激光器)來產(chǎn) 生兩個或更多個波長的入射輻射，其輸出例如通過溫度調(diào)節(jié)而改變。所 需波長差通常約為拉曼譜帶的一半寬度，通常約為5 cm"至10 cm"。
圖11中示出了在相對于拉曼收集點(diǎn)和激光在樣本表面上的入射點(diǎn)的 空間偏移度變化的情況下測定的針對上述測試樣本的一組拉曼光譜。為 了進(jìn)行比較，還顯示了在各單獨(dú)的測量中測得的純層(pure layer)的拉 曼光譜。圖11中的頂部光譜是純反式芪的光譜，而底部光譜是純PMMA 的光譜。在零偏移(0 mm)時測得的光譜表示使用常規(guī)拉曼儀器通常將 獲得的拉曼光譜。顯然，該光譜包含來自樣本頂層和底層的可感知貢獻(xiàn)，
并且在空間偏移光譜中頂層的貢獻(xiàn)隨偏移距離而逐漸減小。對于實(shí)際應(yīng) 用，在需要恢復(fù)底層的純譜處，頂層信號可能表示對于下層的拉曼信號 來說不可接受的失真。當(dāng)拉曼收集點(diǎn)與探測光束入射點(diǎn)之間的橫向偏移 增大時這兩個信號之間的逐漸分離可使用SORS方法清楚地實(shí)現(xiàn)，并且
可從所例示的數(shù)據(jù)集中清楚地觀察到。在〉2mm的距離處(圖11中從上 數(shù)的第三個光譜)，可以實(shí)現(xiàn)下層拉曼信號對頂層拉曼信號的比率的一個 數(shù)量級的改善。
圖12示出了個體光譜的絕對拉曼強(qiáng)度對空間偏移的依賴性。該數(shù)據(jù) 是通過將兩個強(qiáng)反式芪譜帶(1575 cm"、 1595 cm'1、 1632 cm'1和1641 cm層1 處)和PMMA的譜帶(約809 cm"、 1455 cm"和1728 cm"處)進(jìn)行數(shù) 值擬合而獲得的。該曲線圖清楚地展示了，當(dāng)拉曼收集點(diǎn)從探測照射區(qū) 側(cè)向移動(即，橫向偏移增大)時，來自底層的拉曼信號要比來自頂層 的拉曼信號減小得慢得多。這導(dǎo)致了底層對頂層的總體相對拉曼強(qiáng)度比 隨著空間偏移的增大而提高，如圖13所示。
為了將使用本發(fā)明的方法和裝置針對上述測試樣本而實(shí)現(xiàn)的對比度 提高進(jìn)行量化，獲取在偏移為3.5mm處的具有較長獲取時間(IOOO秒) 的拉曼光譜。圖14示出了該光譜以及按比例縮放成與反式芪譜帶的高度 相同的按零偏移獲取的拉曼光譜。通過從這些光譜中減去純反式甚光譜， 獲得了PMMA在個體光譜中的貢獻(xiàn)(參見圖15)。通過將它們擬合，我 們得出，通過將頂層光譜成分去除，下層的對比度提高了 15倍。另一個 顯著的觀察結(jié)果是，使用該空間選通方法而獲得的信噪比相比于其它替 代方法更好。
在零偏移的條件下測得的由1 mmPMMA層造成的拉曼反式萬信號 的總衰減約為80。然而，通過進(jìn)一步改進(jìn)收集效率例如通過采用圖IO 所示的圓形收集幾何形狀，或通過使用較小的光圈數(shù)和較高吞吐量的光 譜儀，同樣在常規(guī)拉曼光譜法中不可避免地存在的通過漫射過程而導(dǎo)致 的該信號損失可以得到有效彌補(bǔ)。
圖16展示了本發(fā)明的空間選通分析裝置和方法的另一有用特征。該 分析裝置能夠抑制下層拉曼光譜中的熒光，如果該熒光源自頂層的話。
圖16所示的曲線給出了反式芪拉曼信號與源自PMMA層的熒光的相對
比率，以及熒光的絕對強(qiáng)度(其為空間收集偏移的函數(shù))。通過引入2.5 mm 的位移，反式芪拉曼強(qiáng)度相對于熒光強(qiáng)度被提高了約2倍。
在需要對從表面層和次表面層獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比在原始光譜內(nèi)可直 接實(shí)現(xiàn)的分離更大的分離的情況下，通過使收集點(diǎn)和探測發(fā)起點(diǎn)偏移， 可以使用圖8的分析器104進(jìn)行多元數(shù)據(jù)分析過程。利用SORS收集的 數(shù)據(jù)特別適合多元數(shù)據(jù)分析，這是因為如果想應(yīng)用該方法，就仍然需要 在各種偏移量處測得的拉曼光譜的集合。為了實(shí)現(xiàn)有效的數(shù)值分解，該 集合內(nèi)的光譜的數(shù)目理想地至少應(yīng)當(dāng)比樣本中存在的層的數(shù)目高一個數(shù) 量級。為證明該點(diǎn)，采用主成分分析(PCA)形式的多元分析。
將使用此處描述的SORS方法和裝置生成的在圖8中表示的PMMA 與反式芪雙層系上獲取的大約二十個拉曼光譜輸入Matlab Rll (The MathworksInc.，Natick，MA)中，并利用內(nèi)建腳本和本地編寫的腳本進(jìn)行 處理。對原始數(shù)據(jù)集進(jìn)行奇異值分解后生成的十個最大本征矢量包含在 PCA循環(huán)中。該數(shù)據(jù)集中不包括PMMA與反式芪的純譜，并且不進(jìn)行基 線校正。
當(dāng)需要對表面層和次表面層的光譜特征進(jìn)行完全分離時，多元數(shù)據(jù) 簡化技術(shù)是有優(yōu)勢的。這些數(shù)據(jù)簡化技術(shù)還提供將各層的光譜特征分離 的手段，所述層可能具有中度至高度的光譜重疊或者在其中由于純成分 的光譜不可得或不可知而導(dǎo)致個體成分對譜帶包絡(luò)的貢獻(xiàn)不可知。
圖17中示出了由多元分析得出的恢復(fù)因子。該過程將這樣收集的拉 曼光譜清楚地分解為兩個單層(即PMMA (頂層)和反式芪(底層))的 純譜。通過以ca. 1595 cm"譜帶(像素730)為目標(biāo)來恢復(fù)純反式芪的因 子，并且通過以ca. 809 cm"譜帶(像素80)為目標(biāo)來恢復(fù)純PMMA的 因子。冷光背景因子可根據(jù)原始輸入光譜之一構(gòu)建。使用通常用于基線 校正的迭代多項式擬合運(yùn)算法(LieberCA和Mahadevan-Jansen A 2003) 來生成該因子。在該情況下，利用三階多項式的100個擬合循環(huán)被用于 生成所述基線。該基線用作代表冷光背景的因子。然后將這三個因子用 于重構(gòu)誤差小于3%的數(shù)據(jù)集。
盡管在上述實(shí)施例中收集了 二十個分離的拉曼光譜，但在可以進(jìn)行 個體拉曼光譜的定標(biāo)相減的情況下，需要少至2或3個光譜。即使釆用 多元數(shù)據(jù)分析，盡管優(yōu)選的是對至少一個因子(其數(shù)目大于要識別的成 分的數(shù)目)進(jìn)行分析，但是使用較小的數(shù)據(jù)集(例如約10個光譜)也常 ?？梢猿晒Φ剡M(jìn)行這種分析。
以下是本發(fā)明人用于解釋在此描述的分析方法和裝置的功效的當(dāng)前
理論。該理論得到由本發(fā)明人進(jìn)行的蒙特卡羅(Monte Carlo)散射建模 研究的支持，該研究得出的結(jié)果與實(shí)驗非常好地符合。隨著收集點(diǎn)的空 間偏移，光子遷移效應(yīng)的隨機(jī)性質(zhì)導(dǎo)致來自不同層的拉曼信號的相對含 量發(fā)生變化。遷移光子實(shí)質(zhì)上在介質(zhì)內(nèi)經(jīng)歷了"隨機(jī)行走(mndomwalk)"， 且光子的方向在沿著傳播距離的每個傳輸長度中都被隨機(jī)化。當(dāng)從樣本 表面上的探測光束入射的點(diǎn)處收集拉曼信號時，由于探測光子的密度在 樣本的曝光點(diǎn)處最高，因此光譜包含的來自頂層的信號貢獻(xiàn)相對較大。 隨著樣本深度的增加，當(dāng)光子強(qiáng)度經(jīng)光子漫射過程而逐漸減弱時，探測 強(qiáng)度快速減小。此外，在樣本較深層處產(chǎn)生的拉曼光在傳播回表面時會 發(fā)生散射并經(jīng)歷相同的漫射。因此，這導(dǎo)致了在較深樣本層產(chǎn)生的拉曼 光譜的強(qiáng)度進(jìn)一步減弱。該效應(yīng)導(dǎo)致與以相同幾何形狀針對被探測的 光學(xué)透明介質(zhì)而收集的信號相比，當(dāng)從樣本表面上的探測光束入射點(diǎn)處 收集信號時，收集到的在樣本表面產(chǎn)生的拉曼光子的比例基本大于在較 深樣本層產(chǎn)生的拉曼光子的比例。
然而，當(dāng)從自探測光束入射點(diǎn)橫向偏移的點(diǎn)處收集拉曼光時，樣本 內(nèi)探測光的強(qiáng)度沿樣本深度變得更為均等地分布。這是因為入射光首先 必須從探測入射點(diǎn)通過樣本側(cè)向傳播到收集區(qū)，并且在途中通過光子漫 射而隨機(jī)化。因此，在從探測入射點(diǎn)偏移的位置處收集的散射拉曼信號 所包含的較深層信號的比例大于從探測光束入射點(diǎn)收集的光譜中的該比
所描述的空間選通分析裝置和方法因此提供了用于從漫散射介質(zhì)內(nèi) 的個體層中提取純拉曼信號的極為有力但簡單的手段。被探測樣本的深 度可以大大超過傳輸長度，而傳輸長度對傳統(tǒng)的共焦拉曼顯微鏡法卻設(shè)
置了深度限制。在上述實(shí)施例中，介質(zhì)的傳輸長度估計為200 pm。重要
的是，所述裝置和方法可以"盲目"地使用，即不需具有關(guān)于各層的化 學(xué)成分的任何先驗知識。該技術(shù)因而對于工業(yè)和醫(yī)療應(yīng)用中對漫散射材 料的敏感次表面非破壞性探測具有理想的先決條件。
在已知樣本僅由組成不同的兩個層(諸如體內(nèi)皮層和骨骼層)構(gòu)成
的情形下(如果這是未知的，則可從純PCA直接獲得該信息)，所述方
法和裝置可用于提取個體層的純信號而無需涉及多元數(shù)據(jù)分析技術(shù)。這 在兩層的兩個光譜均包括不重疊的可識別譜帶的情況下是可能的。在該 情況下，可使用簡單的定標(biāo)相減將各個體層的光譜彼此分離。在該處理 中，通過利用兩個不同的空間偏移量所測得的兩個光譜的定標(biāo)相減，消 除一個拉曼成分，所述定標(biāo)相減抵消了該處理中的一個光譜成分或另一
個光譜成分。圖18中示出了該簡單提取過程的結(jié)果。該分析中使用的光 譜是采用零偏移和2 mm的偏移測得的。盡管可適用性要求滿足上述條 件，但結(jié)果顯然令人滿意。相反，上述的PCA分析可在不知道樣本的不 同層的組成的情況下使用。
因此，很顯然并非在所有情況下都需要利用本發(fā)明生成完整的拉曼 光譜。在對所涉及材料或要被探測的組分有一定的了解時，例如使用一 個或更多個帶通濾波器對各拉曼光譜特征進(jìn)行的探測也可以利用在此描 述的SORS方法和裝置來完成。
通常情況下對兩層的"抑制"或分離的確切程度取決于多種參數(shù)。 這些參數(shù)包括頂層的厚度、下層基質(zhì)(matrix)的厚度、探測光束的直徑、 確切的收集幾何形狀、使用的探測光的波長以及介質(zhì)的傳輸長度。對于 非侵入性次表面探測，憑經(jīng)驗可以認(rèn)為理想的偏移應(yīng)當(dāng)達(dá)到上覆介質(zhì)的 厚度或數(shù)個厚度。此外，為了使該技術(shù)有效，光束直徑應(yīng)當(dāng)小于頂層的 厚度。 一般說來，頂層越薄且下層基質(zhì)越厚，越有利于將兩個成分更好 地光譜分離。
由此，本發(fā)明特別適合用在非侵入性醫(yī)學(xué)診斷應(yīng)用。但是，探測光 子或拉曼光子的任何程度的吸收將導(dǎo)致來自樣本表面的拉曼信號的總產(chǎn) 生量減少。因此，為了使SORS分析有效，在基本上無任何吸收的波長
處進(jìn)行測量是重要的。在活組織的情況下，在NIR (約800nm)中的血 紅蛋白吸收區(qū)(〉600nm)外很好地滿足了這一條件。因此，對于活組織 而言，優(yōu)選的激光源產(chǎn)生波長至少為600nm的光。產(chǎn)生800nm以上的光 的激光源也是適當(dāng)?shù)?，因為這降低了黑色素對入射光的吸收。此外，在 該波長處，骨骼組織具有相對較低的熒光。
但是，對本發(fā)明而言，不必使用波長為514nm或者大于600nm的光。 探測波長的選擇實(shí)質(zhì)上是在深度刺穿(其隨波長的變長而改善)與探測 器的量子效率(波長越短該值越高)之間進(jìn)行的權(quán)衡。如前所述，在此 使用的探測器3是基于硅技術(shù)的背照式深耗盡層CCD探測器。選擇該探 測器是因為其具有目前可得到的最佳靈敏度和信噪比，但也可以使用其 它探測器。較長的波長避免了激勵拉曼光譜中的H20模，但針對Si探測 的截止限制為1.1 ,。 InGaAs探測器可在較長的波長下使用，但這些探 測器目前具有降低的靈敏度。
作為SORS分析的潛在醫(yī)學(xué)應(yīng)用的實(shí)施例，眾所周知，從骨骼組織 測得的拉曼光譜表示其生化狀態(tài)。光譜中的峰表示礦物組分(例如磷酸 鹽、碳酸鹽、氫氧化物以及間隙和殘留水分子)和有機(jī)材料(主要是膠 原基質(zhì))。因此，如果在骨骼結(jié)構(gòu)中存在異常，則礦物峰和膠原峰的相對 強(qiáng)度將會與正常的不同。
產(chǎn)生在漫散射基質(zhì)中埋藏的化學(xué)特定的信號的技術(shù)適用于許多醫(yī)學(xué) 應(yīng)用。實(shí)際上，可預(yù)想到，次表面信息的非破壞性提取將具有如下的醫(yī) 學(xué)應(yīng)用對嵌入損害的檢測，以及對腫瘤、皮膚和血液組分的評估。
使用本發(fā)明的方法和裝置，可以從大大超過常規(guī)共焦顯微鏡法能夠 達(dá)到的深度的深度處取回充分純的拉曼光譜。此外，本發(fā)明的優(yōu)勢在于， 本發(fā)明與連續(xù)波(cw)激光光束的使用相兼容并適于工業(yè)和醫(yī)療應(yīng)用中 的遠(yuǎn)程監(jiān)視。
權(quán)利要求
1.一種透過漫散射上覆組織在體內(nèi)確定次表面組織或液體的一個或更多個特性的方法，所述方法包括以下步驟(a)在所述上覆組織的表面上的進(jìn)入?yún)^(qū)提供入射光；(b)從所述表面上的收集區(qū)收集在所述上覆組織內(nèi)散射的光，所述收集區(qū)與所述進(jìn)入?yún)^(qū)隔開；以及(c)在所收集的光中探測與所述入射光在光譜上相關(guān)的源自所述次表面組織的一個或更多個拉曼特征。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括根據(jù)所述拉曼特征 來確定所述次表面組織或液體的所述特征。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述次表面組織或液體包 括骨骼、軟骨、乳房組織以及血液中的一種。
4. 如權(quán)利要求1、 2或3所述的方法，其中，所述上覆組織包括皮 膚和指甲之一。
5. 如任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中，所述探測步驟包括對 所收集的光進(jìn)行光譜色散，以形成拉曼光譜。
6. 如權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中，所述探測步驟包 括對所收集的光進(jìn)行過濾，以將所述拉曼光譜特征中的一個或更多個分開。
7. 如任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中，所述收集步驟包括按所述進(jìn)入?yún)^(qū)和所述收集區(qū)之間的表面上的多個間隔收集光。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中，確定所述特性包括將根據(jù)不 同間隔的拉曼特征與所述上覆組織和次表面組織或液體內(nèi)的不同深度或 深度分布相關(guān)聯(lián)。
9. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中，確定所述特性包括將根據(jù)不 同間隔的拉曼特征相組合，以針對深度或深度分布進(jìn)行選擇。
10. 如任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中，所述收集步驟包括-從與一共同進(jìn)入?yún)^(qū)隔開不同距離的多個收集區(qū)收集光。
11. 如任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中， 一個或更多個收集區(qū)圍 繞進(jìn)入?yún)^(qū)。
12. 如權(quán)利要求ll所述的方法，其中，各收集區(qū)均為環(huán)，并且所述 散射光被多個收集用光纖收集，所述多個收集用光纖圍繞用于向所述進(jìn) 入?yún)^(qū)提供入射輻射的一個或更多個照射用光纖分布。
13. 如權(quán)利要求1至9中任一項所述的方法，其中， 一個或更多個進(jìn)入?yún)^(qū)圍繞一共同收集區(qū)。
14. 如任一前述權(quán)利要求所述的方法，所述方法還包括對布置在 所收集的光的路徑上的收集用光學(xué)器件進(jìn)行調(diào)節(jié)，來調(diào)節(jié)收集區(qū)與進(jìn)入 區(qū)之間的距離。
15. 如任一前述權(quán)利要求所述的方法，所述方法還包括在所述收 集區(qū)之外、所述上覆組織的表面附近布置一個或更多個反射鏡元件以將 光反射回所述組織中。
16. —種在體內(nèi)測量漫散射組織的次表面拉曼光譜的方法，所述方 法包括以下步驟-a) 利用入射輻射的光探針照射所述組織；b) 收集被所述組織散射的光；以及C)對所收集的光的至少一部分進(jìn)行光譜分離，以探測一個或更多個 拉曼光譜特征，其中被所述組織散射的光是從所述組織的表面上的多個 空間位置處收集的，各空間位置距照射點(diǎn)的距離不同，在各空間位置處 收集的所述光的至少一部分被單獨(dú)地進(jìn)行光譜色散以形成多個拉曼光 譜，并且其中所述方法還包括下述步驟d)對所述多個拉曼光譜進(jìn)行分析以提取與所述組織的次表面區(qū)域 的拉曼光譜有關(guān)的信息。
17. 如任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中，收集到至少兩個拉曼 光譜并使用定標(biāo)相減對其進(jìn)行分析，將在與所述照射點(diǎn)距離最近處收集 的拉曼光譜從與所述照射點(diǎn)距離較遠(yuǎn)處收集的拉曼光譜中減去，由此識 別出所述組織的次層的拉曼光譜的特征。
18. 如權(quán)利要求1至16中任一項所述的方法，其中，針對所述組織 的表面的化學(xué)組成的拉曼光譜是己知的，并且通過從所收集的光的拉曼 光譜中定標(biāo)減去所述已知拉曼光譜來對所述拉曼光譜進(jìn)行分析。
19. 如權(quán)利要求1至16中任一項所述的方法，其中，利用多元數(shù)據(jù)分析對所述多個拉曼光譜進(jìn)行分析。
20. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中，利用主成分分析對所述多個拉曼光譜進(jìn)行分析。
21. 如權(quán)利要求19或20中任一項所述的方法，其中，在距所述照 射點(diǎn)不同的距離處收集至少二十個拉曼光譜。
22. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，以兩個或更多個 不同波長照射所述組織，并且所收集的光是拉曼光譜與熒光的組合，并 且其中所述方法還包括從所收集的光中提取所述拉曼光譜的步驟。
23. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，使所述組織、所 述收集用光學(xué)器件和所述照射點(diǎn)或照射區(qū)域中的至少一個相對于其余的 進(jìn)行移動，從而能夠在距所述照射點(diǎn)不同的距離處收集拉曼光譜。
24. 如權(quán)利要求23所述的方法，其中，提供其上安放有所述組織的 可移動臺，并安排所述探測光束來追蹤所述組織的移動，由此所述組織 相對于用于在距所述照射點(diǎn)不同的距離處收集散射光的固定的收集用光 學(xué)器件進(jìn)行移動。
25. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述散射光是從距所述照射 點(diǎn)距離不同的點(diǎn)區(qū)域收集的。
26. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述散射光是從多條基本平 行的線收集的，所述多條基本平行的線基本與從所述照射點(diǎn)測得的距離 成橫向。
27. 如權(quán)利要求16至23中任一項所述的方法，其中，使用光纖來 提供所述探測光束，并使用圍繞所述探測光束光纖排列成多個同心圓的 光纖來收集所述散射光，由此在距所述照射點(diǎn)的不同半徑處的同心環(huán)中 收集所述散射光。
28. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，結(jié)合使用光譜儀 和電荷耦合器件照相機(jī)對所收集的光進(jìn)行光譜色散。
29. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述光探針或入 射輻射是利用連續(xù)波激光器產(chǎn)生的。
30. 如權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述光探針包括兩個或更多 個單獨(dú)的波長并且是由一個或更多個激光器產(chǎn)生的。
31. 如權(quán)利要求30所述的方法，其中，所述光探針是由單個可調(diào)諧 激光器產(chǎn)生的。
32. 如權(quán)利要求30所述的方法，其中，所述光探針的所述兩個或更 多個單獨(dú)的波長是由兩個或更多個對應(yīng)的激光器產(chǎn)生的。
33. 如任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中，所述入射輻射具有大 于600nm的波長。
34. 如任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中，所述入射輻射具有大 于800nm的波長。
35. —種確定患者在目標(biāo)組織中是否有癌病變的方法，所述方法包括執(zhí)行任一前述權(quán)利要求的步驟，以在所述目標(biāo)組織中測量癌病變所特有的一個或更多個拉曼光譜特征；以及基于所述拉曼光譜特征，確定所述患者在所述目標(biāo)組織中是否有癌 病變。
36. —種確定患者是否有與該患者的骨骼組織有關(guān)的醫(yī)學(xué)病變的方 法，所述方法包括執(zhí)行任一前述權(quán)利要求的步驟，以測量所述骨骼組織所特有的一個 或更多個拉曼光譜特征；以及根據(jù)所述拉曼光譜特征，確定所述患者是否有骨骼組織病變。
37. —種在無外科手術(shù)介入的情況下對次表面組織或液體執(zhí)行體內(nèi) 皮下檢查的方法，所述方法包括利用探測光束照射表面組織；從所述表面上的與所述探測光束隔開的一個或更多個收集區(qū)收集在 所述表面下散射的光；以及從所收集的光中探測一個或更多個拉曼光譜特征。
38. 如權(quán)利要求37所述的方法，其中，所述次表面組織或液體是骨骼、軟骨、乳房組織以及血液中的一種。
39. 如權(quán)利要求37或38所述的方法，其中，所述收集區(qū)與所述探 測光束不重疊。
40. —種透過漫散射上覆組織在體內(nèi)確定次表面組織或液體的一個或更多個特性的裝置，所述裝置包括光源，其被布置成在所述上覆組織的表面上的進(jìn)入?yún)^(qū)提供入射光； 收集器，其被布置成從所述表面上的收集區(qū)收集在所述上覆組織內(nèi)散射的光，所述收集區(qū)與所述進(jìn)入?yún)^(qū)隔開；以及探測器，其被布置成探測與所述入射光在光譜上相關(guān)的源自所述次 表面組織或液體的一個或更多個拉曼特征。
41. 如權(quán)利要求40所述的裝置，所述裝置還包括分析器，所述分析 器適于從所述拉曼特征推導(dǎo)出所述次表面組織或液體的一個或更多個特 性。
42. 如權(quán)利要求41所述的裝置，所述裝置適于根據(jù)所述進(jìn)入?yún)^(qū)與所 述收集區(qū)之間的多個間隔來收集光，所述分析器適于組合根據(jù)所述多個 間隔的拉曼特征，從而針對一深度或深度分布進(jìn)行選擇。
43. 如權(quán)利要求40、 41或42所述的裝置，其中，所述次表面組織 包括骨骼、軟骨、乳房組織以及血液中的至少一種。
44. 如權(quán)利要求40至43中任一項所述的裝置，其中，所述上覆組 織包括皮膚和指甲中的至少一種。
45. 如權(quán)利要求40至44中任一項所述的裝置，其中，所述探測器 包括光譜儀，所述光譜儀被布置成對所收集的光進(jìn)行光譜色散以分離出 所述拉曼特征。
46. 如權(quán)利要求40至44中任一項所述的裝置，其中，所述探測器 包括被布置成選擇所述拉曼特征的一個或更多個濾波器。
47. 如權(quán)利要求40至46中任一項所述的裝置，其中，所述進(jìn)入?yún)^(qū) 或所述收集區(qū)是圍繞這兩個區(qū)域中的另一個區(qū)域的環(huán)形區(qū)域。
48. 如權(quán)利要求47所述的裝置，所述裝置還包括光學(xué)設(shè)置，所述光 學(xué)設(shè)置適于可控地調(diào)節(jié)所述環(huán)形區(qū)域的直徑。
49. 如權(quán)利要求40至48中任一項所述的裝置，所述裝置還包括蔽光裝置，所述蔽光裝置被布置成可控地調(diào)節(jié)所述進(jìn)入?yún)^(qū)與所述收集區(qū)之 間的間隔。
50. 如權(quán)利要求40至48中任一項所述的裝置，所述裝置還包括一 個或更多個反射鏡元件，所述一個或更多個反射鏡元件被布置在所述一 個或更多個收集區(qū)和進(jìn)入?yún)^(qū)之外且與所述上覆組織的表面鄰近，用以將 光反射回所述組織。
51. —種對在漫散射組織內(nèi)的不同深度處產(chǎn)生的拉曼光譜進(jìn)行體內(nèi)選擇性測量的裝置，所述裝置包括光源(1)，其利用入射輻射的探測光束來照射所述組織； 收集用光學(xué)器件，用于收集被所述組織散射的光，并將其傳遞到光譜儀；探測裝置，用于探測被所述光譜儀色散的光；其中，所述裝置適于在所述組織的表面上的多個空間位置處收集散 射光，各空間位置距照射點(diǎn)的距離不同，并且所述光譜儀(2)對在各空 間位置處收集的光的至少一部分單獨(dú)地進(jìn)行光譜色散以形成多個拉曼光 譜，并且其中所述裝置還包括分析器(4)，所述分析器(4)用于從所述 多個拉曼光譜中識別所述組織(6， 7)的次層的拉曼光譜所特有的特征。
52. 如權(quán)利要求51所述的裝置，其中，所述分析器適于執(zhí)行拉曼光 譜之間的定標(biāo)相減。
53. 如權(quán)利要求51所述的裝置，其中，所述分析器適于對所述拉曼 光譜進(jìn)行多元數(shù)據(jù)分析。
54. 如權(quán)利要求53所述的裝置，其中，所述分析器適于對所述拉曼 光譜進(jìn)行主成分分析。
55. 如權(quán)利要求51至54中任一項所述的裝置，所述裝置還包括可 移動臺，所述可移動臺用于使所述組織、所述收集用光學(xué)器件和所述照 射點(diǎn)中的至少一個發(fā)生相對移動，從而能夠在距所述照射點(diǎn)不同的距離 處收集拉曼光譜。
56. 如權(quán)利要求55所述的裝置，其中，所述可移動臺是可移動樣本臺，并且其中設(shè)置有針對所述組織的移動來追蹤所述探測光束的裝置，由此所述樣本可相對于固定的收集用光學(xué)器件進(jìn)行移動從而能夠在距所述照射點(diǎn)的多個不同距離處收集散射光。
57. 如權(quán)利要求51至54中任一項所述的裝置，其中，所述收集用 光學(xué)器件包括圍繞所述探測光束布置成多個同心圓的光纖。
58. 如權(quán)利要求51至57中任一項所述的裝置，其中，所述光源是 連續(xù)波激光器。
59. 如權(quán)利要求51至58中任一項所述的裝置，其中，所述探測裝 置包括電荷耦合器件照相機(jī)。
60. 如權(quán)利要求40至59中任一項所述的裝置，其中，所述入射輻 射具有大于600nm的波長。
61. 如權(quán)利要求40至60中任一項所述的裝置，其中，所述入射輻 射具有大于800nm的波長。
62. —種在無外科手術(shù)介入的情況下對次表面組織執(zhí)行體內(nèi)檢查的 醫(yī)學(xué)皮下檢查裝置，所述裝置包括探測光束源，其被布置成照射表面組織；收集器，其被布置成從所述表面上的與所述探測光束隔開的一個或更多個收集區(qū)收集在所述表面下散射的光；以及探測器，其被布置成從所收集的光中探測一個或更多個拉曼光譜特征。
63. 如權(quán)利要求62所述的裝置，其中，所述收集區(qū)與所述探測光束 不重疊。
64. 如權(quán)利要求62或63所述的裝置，所述裝置還包括分析器，所 述分析器被布置成根據(jù)所述拉曼光譜特征推導(dǎo)出所述次表面組織的一個 或更多個特性。
65. 如權(quán)利要求40至61中任一項所述的裝置，所述裝置被實(shí)現(xiàn)為 內(nèi)窺鏡，所述內(nèi)窺鏡通過自然的或經(jīng)外科手術(shù)形成的孔進(jìn)入從而在體內(nèi) 進(jìn)行檢査。
66. —種診斷方法，所述診斷方法包括使用如權(quán)利要求1至39中 任一項所述的方法，從樣本收集一個或更多個拉曼光譜，所述樣本由上 覆組織的表面區(qū)域和與所述上覆組織不同的深層組織的次層區(qū)域構(gòu)成。
67. 如權(quán)利要求66所述的診斷方法，所述診斷方法還包括在所述 一個或更多個所收集的拉曼光譜中識別所述樣本(6、 7)的次層區(qū)域的拉曼光譜所特有的一個或更多個特征，并且將所述一個或更多個所識別 的特征與從健康控制樣本獲得的特征進(jìn)行比較。
全文摘要
本發(fā)明涉及對次表面組織和液體的拉曼光譜分析。公開了用于在體內(nèi)確定人體或動物體中的次表面組織或液體的特性的裝置和方法。在表面上的一個或更多個進(jìn)入?yún)^(qū)提供入射輻射，并且從與所述進(jìn)入?yún)^(qū)隔開的一個或更多個收集區(qū)收集光。在所收集的光中探測拉曼特征，并且根據(jù)該拉曼特征得出深度相關(guān)信息。
文檔編號A61B5/103GK101115986SQ200580047024
公開日2008年1月30日 申請日期2005年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月9日
發(fā)明者安東尼·維廉·帕克, 帕維爾·馬陶謝克 申請人:科學(xué)技術(shù)設(shè)備委員會