專利名稱：用于黃病毒科治療的化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及非免疫抑制性的環(huán)孢菌素在治療黃病毒科病毒感染及其誘發(fā)的疾病中的新用途。
背景技術(shù)：
環(huán)孢菌素包括一組結(jié)構(gòu)上不同的環(huán)狀聚-N-甲基化十一肽，一般具有藥理學(xué)特別是免疫抑制或抗炎活性。首個(gè)被分離的環(huán)孢菌素是天然存在的真菌代謝物環(huán)孢菌素或環(huán)孢霉素，也稱為環(huán)孢菌素A。
已明確環(huán)孢菌素A通過(guò)阻斷IL-2的轉(zhuǎn)錄起始來(lái)干擾T細(xì)胞的活化過(guò)程而發(fā)揮作用。環(huán)孢菌素A與多種細(xì)胞類型中含有的17kD胞質(zhì)蛋白質(zhì)(命名為親環(huán)蛋白)形成復(fù)合體，該蛋白質(zhì)與涉及蛋白質(zhì)折疊的肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶相同。
然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)結(jié)合于親環(huán)蛋白是免疫抑制活性的必要但并非充分標(biāo)準(zhǔn)。環(huán)孢菌素A/親環(huán)蛋白復(fù)合體也可連接于隸屬磷酸酶超家族的名為鈣依賴磷酸酶(calcineurin，CN)的細(xì)胞蛋白質(zhì)。該結(jié)合消除了其磷酸酶活性，致使轉(zhuǎn)錄因子NF-AT沉默。CN/NF-AT途徑的抑制是環(huán)孢菌素A介導(dǎo)的免疫抑制的重要機(jī)制。
已經(jīng)鑒定了緊密結(jié)合于親環(huán)蛋白卻不具有免疫抑制性的環(huán)孢菌素。當(dāng)環(huán)孢菌素在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(Mixed lymphocyte Reaction，MLR)中的活性不高于環(huán)孢菌素A的5％、優(yōu)選不高于2％時(shí)，認(rèn)為該環(huán)孢菌素為非免疫抑制性的。混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)見(jiàn)T.Meo在“Immunological Methods”，L.Lefkovits和B.Peris編輯，Academic Press，N.Y.227-239頁(yè)(1979)中的描述。將來(lái)自Balb/c小鼠(雌性，8-10周大)的脾細(xì)胞(0.5×106)，與0.5×106經(jīng)射線照射(2000rads)或絲裂霉素C處理的CBA小鼠(雌性，8-10周齡)脾細(xì)胞共孵育5天。射線照射的同種異體細(xì)胞引發(fā)了Balb c脾細(xì)胞的增殖反應(yīng)，后者可通過(guò)DNA中經(jīng)標(biāo)記的前體物的摻入來(lái)測(cè)量。由于刺激物細(xì)胞已經(jīng)射線照射(或絲裂霉素C處理)，它們不會(huì)對(duì)增殖的Balb/c細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)，而仍保留其抗原性。將MLR中確定的測(cè)試化合物的IC50與平行實(shí)驗(yàn)中環(huán)孢菌素A相比較。此外，非免疫抑制性環(huán)孢菌素缺乏抑制CN及下游NF-AT途徑的能力。
EP 0484281和美國(guó)專利號(hào)5,767,069公開(kāi)了非免疫抑制性環(huán)孢菌素在治療AIDS或AIDS相關(guān)疾病中的用途。正如申請(qǐng)EP 2004/009804中公開(kāi)，結(jié)合于親環(huán)蛋白的非免疫抑制性環(huán)孢菌素也對(duì)丙型肝炎病毒(HCV)具有抑制作用。
非A非B肝炎的主要病原HCV的持續(xù)感染，與肝臟疾病如慢性肝炎、肝硬化或肝細(xì)胞肝癌密切相關(guān)。這些肝臟疾病的發(fā)展是重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題。有效的抗HCV治療還僅限于干擾素治療或干擾素和利巴韋林(ribavirin)的聯(lián)合治療。然而，由于約半數(shù)接受這些已知藥物治療的HCV病人體內(nèi)病毒并未清除，對(duì)替代性抗HCV藥物仍有強(qiáng)烈需求。
丙型肝炎病毒感染或HCV誘導(dǎo)疾病的實(shí)例如慢性肝炎、肝硬化或肝癌(如肝細(xì)胞肝癌)。非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素也可用于如預(yù)防性治療HCV感染的母親分娩的新生兒，或暴露于病毒的醫(yī)療工作者，或移植物受者如器官或組織移植物受者(如肝臟移植)以清除移植后可能的復(fù)發(fā)性HCV感染。
HCV是丙型肝炎病毒屬(hepaciviruses)的唯一成員。丙型肝炎病毒屬、黃病毒屬和瘟病毒屬(pestiviruses)是黃病毒科家族中3個(gè)不同的屬。黃病毒屬包括超過(guò)68個(gè)成員，根據(jù)其血清學(xué)相關(guān)性可進(jìn)行分組(Calisher等人，J.Gen.Virol.1993，7037-43)。臨床癥狀各異，包括發(fā)熱、腦炎和出血熱(Fields Virology，F(xiàn)ields，B.N.，Knipe，D.M.和Howley，P.M.編輯，Lippincott Raven publishers，Philadelphia，PA，1996，第31章，931-959)。與人類疾病相關(guān)而受全球關(guān)注的黃病毒，包括登革出血熱病毒(DHF)、黃熱病病毒、休克綜合征及日本腦炎病毒(Halstead，S.B.，Rev.Infect.Dis.，1984，6，251-264；Halstead，S.B.，Science，239476-481，1988；Monath，T.P.，New Eng.J.Med.1988，319，641-643)。
瘟病毒屬包括牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、豬瘟病毒(CSFV，也稱為豬霍亂病毒)以及綿羊邊界病病毒(BDV)(Moennig，V.等人，Adv.Vir.Res.1992，41，53-98)。家畜(牛、豬和綿羊)的瘟病毒感染導(dǎo)致世界范圍內(nèi)的巨大經(jīng)濟(jì)損失。BVD引發(fā)牛的粘膜疾病，對(duì)家畜產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)有顯著影響(Meyers，G.和Thiel，H.-J.，Advances in Virus Research，1996，47，53-118；Moening V.等人，Adv.Vir.Res.1992，41，53-98)。人瘟病毒尚未如動(dòng)物瘟病毒那樣得到廣泛表征。然而，血清學(xué)調(diào)查提示人類中也存在相當(dāng)量的瘟病毒暴露。
瘟病毒屬和丙型肝炎病毒屬是黃病毒科家族中密切相關(guān)的病毒種屬。該家族中其他密切相關(guān)的病毒包括GB病毒A、GB病毒A樣病原、GB病毒B和GB病毒C(也稱為庚型肝炎病毒，HGV)。丙型肝炎病毒屬(丙型肝炎病毒，HCV)由感染人類的多種密切相關(guān)但基因分型不同的病毒組成。存在約6種HCV基因型以及50種以上的亞型。由于瘟病毒和丙型肝炎病毒屬的相似性，也由于肝病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中難以有效生長(zhǎng)，牛病毒性腹瀉病毒(BVD)常用作研究HCV病毒的替代物。
瘟病毒屬和丙型肝炎病毒屬的基因排列非常相似。這些正鏈RNA病毒具有單個(gè)大的開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼病毒復(fù)制所需的所有病毒蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)表達(dá)為多聚蛋白質(zhì)，受細(xì)胞內(nèi)和病毒編碼的蛋白酶翻譯中或翻譯后加工以產(chǎn)生成熟的病毒蛋白質(zhì)。負(fù)責(zé)病毒基因組RNA復(fù)制的病毒蛋白質(zhì)大致位于羧基末端。三分之二的ORF被命名為非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白質(zhì)。瘟病毒屬和丙型肝炎病毒屬ORF中非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)部分的基因排列和多聚蛋白質(zhì)加工很相似。瘟病毒屬和丙型肝炎病毒屬中成熟的非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白質(zhì)從非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)編碼區(qū)的氨基端到ORF羧基端，按序列順序由p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B組成。HCV的基因排列如

圖1所示。
瘟病毒屬和丙型肝炎病毒屬的NS蛋白質(zhì)共享特定蛋白質(zhì)功能特征性的序列結(jié)構(gòu)域。例如，二者中的病毒NS3蛋白質(zhì)都具有絲氨酸蛋白酶和解旋酶特有的氨基酸序列基序(Gorbalenya等人.(1988)Nature 33322；Bazan和Fletterick(1989)Virology 171637-639；Gorbalenya等人.(1989)NucleicAcid Res.173889-3897)。與之類似，瘟病毒屬和丙型肝炎病毒屬的NS5B蛋白質(zhì)具有RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶的特征性基序(Koonin，E.V.和Dolja，V.V.(1993)Crit.Rev.Biochem.Molec.Biol.28375-430)。
瘟病毒屬和丙型肝炎病毒屬NS蛋白質(zhì)在病毒生命周期中的實(shí)際作用和功能直接類似。二者中的NS3絲氨酸蛋白酶均負(fù)責(zé)其ORF位點(diǎn)下游多聚蛋白質(zhì)前體的所有蛋白水解加工(Wiskerchen和Collett(1991)Virology184341-350；Bartenschlager等人.(1993)J.Virol.673835-3844；Eckart等人.(1993)Biochem.Biophys.Res.Comm.192399-4067；Grakoui等人.(1993)J.Virol.672832-2843；Grakoui等人.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9010583-10587；Hijikata等人.(1993)J.Virol.674665-4675；Tome等人.(1993)J.Virol.715312-5322)。兩種病毒中NS3蛋白質(zhì)均作用如解旋酶(Kim等人.(1995)Biochem.Biophys.Res.Comm.215160-166；Jin和Peterson(1995)Arch.Biochem.Biophys.，32347-53；Warrener和Collett(1995)J.Virol.691720-1726)。最后，瘟病毒屬和丙型肝炎病毒屬的NS5B蛋白質(zhì)具有預(yù)測(cè)的RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶活性(Behrens等人.(1996)EMBO J.1512-22；Lechmann等人.(1977)J.Virol.718416-8428；Yuan等人.(1997)Biochem.Biophys.Res.Comm.232231-235；Hagedorn，PCTWO 97/12033；Zhong等人.(1998)J.Virol.729365-9369)。
本發(fā)明提供了非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素在預(yù)防或治療黃病毒科病毒感染及其誘發(fā)的疾病中的用途。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，提供了包括非免疫移植性環(huán)孢菌素的藥物組合物和聯(lián)合，以及利用所述藥物組合物和聯(lián)合治療黃病毒科病毒感染及其誘發(fā)的疾病的方法。
本發(fā)明范圍內(nèi)包括的黃病毒的一般論述見(jiàn)Fields Virology，F(xiàn)ields，N.，Knipe，D.M.和Howley，P.M.編輯，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，PA；第31章(1996)。明確的黃病毒包括但不僅限于，Absettarov病毒；阿爾弗(Alfuy)病毒；Apoi病毒；Aroa病毒；Bagaza病毒；Banzi病毒；Bououi病毒；巴休夸拉(Bussuquara)病毒；Cacipacore病毒；卡雷島(Carey Island)病毒；達(dá)喀爾蝙蝠(Dakar bat)病毒；登革病毒1、2、3和4；Edge Hill病毒；恩特伯蝙蝠(Entebbe bat)病毒；Gadgets Gully病毒；Hanzalova病毒；Hypr病毒；伊利烏斯(Ilheus)病毒；以色列火雞腦膜腦炎病毒；日本腦炎病毒；朱格拉(Jugra)病毒；朱蒂亞帕(Jutiapa)病毒；凱丹姆(Kadam)病毒；喀什(Karshi)病毒；Kedougou病毒；Kokoera病毒；庫(kù)坦戈(Koutango)病毒；Kumlinge病毒；Kunjin病毒；科薩努爾(Kyasanur)森林??；Langat病毒；跳躍病(Loupingill)病毒；Meaban病毒；Modoc病毒；Montano myotis白質(zhì)腦炎；墨累(Murray)溪谷腦炎病毒；Naranjal病毒；Negishi病毒；Ntaya病毒；鄂木斯克(Osmk)出血熱病毒；金邊(Phnom-penh)蝙蝠病毒；Powassan病毒；布拉沃(Rio Bravo)病毒；羅西奧(Rocio)病毒；Royal Farm病毒；俄羅斯春夏腦炎病毒；Saboya病毒；圣路易(St.Louis)腦炎病毒；Sal Vieja病毒；San Perlita病毒；Saumarex Reef病毒；塞皮克(Sepik)病毒；Sokuluk病毒；斯蓬德韋尼(Spondweni)病毒；Stratford病毒；Temusu病毒；秋勒尼(Tyuleniy)病毒；烏干達(dá)S型(Uganda S)病毒，尤蘇它(Usutu)病毒，威塞爾斯布朗病(Wesselsbron)病毒；西尼羅河病毒；Yaounde病毒；黃熱病病毒；以及Zika病毒。
本發(fā)明范圍內(nèi)包括的瘟病毒也見(jiàn)述于Fields Virology(Id.)。明確的瘟病毒包括但不僅限于，牛病毒性腹瀉病毒(“BVDV”)；豬瘟病毒(“CSFV”，也稱為豬霍亂病毒)；以及邊界病病毒(“BDV”)。
本發(fā)明內(nèi)包括的黃病毒科家族的其他成員包括但不僅限于，GB病毒A、GB病毒A樣病原、GB病毒B以及GB病毒C(也稱為庚型肝炎病毒，HGV)。此外，包括約6種HCV基因型和50種以上亞型的丙型肝炎病毒屬(丙庚型肝炎病毒，HCV)也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
若在如Quesniaux在Eur.J.Immunol.1987 17 1359-1365中所述競(jìng)爭(zhēng)性ELISA測(cè)試中，環(huán)孢菌素與人重組親環(huán)蛋白的結(jié)合力至少為環(huán)孢菌素A的五分之一，則認(rèn)為該環(huán)孢菌素與親環(huán)蛋白結(jié)合。在該測(cè)試中，在親環(huán)蛋白與包被BSA的-環(huán)孢菌素A孵育的過(guò)程中加入待測(cè)環(huán)孢菌素，計(jì)算其可達(dá)無(wú)競(jìng)爭(zhēng)物對(duì)照反應(yīng)50％抑制水平的要求濃度(IC50)。結(jié)果表述為結(jié)合率(BR)，是測(cè)試化合物IC50與同時(shí)測(cè)試的環(huán)孢菌素A本身IC50的比值以10為底的對(duì)數(shù)。因此，BR為1.0提示測(cè)試化合物與人親環(huán)蛋白的結(jié)合力為環(huán)孢菌素A的十分之一，而負(fù)值則提示結(jié)合力比環(huán)孢菌素A強(qiáng)。對(duì)HCV有活性的環(huán)孢菌素其BR小于0.7，優(yōu)選等于或小于零。
非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素的實(shí)例包括如式I的化合物 其中W為MeBmt、二氫-MeBmt、8’-羥基-MeBmt或O-乙酰基-MeBmt1；X為αAbu、纈氨酸、蘇氨酸、Nva或0-甲基蘇氨酸(Me0Thr)；R為脯氨酸、Sar、(D)-甲基絲氨酸、(D)-甲基丙氨酸，或(D)-甲基絲氨酸(O乙?；?；Y為甲基亮氨酸、硫代甲基亮氨酸、γ-羥基-甲基亮氨酸、甲基異亮氨酸、甲基纈氨酸、甲基蘇氨酸、甲基丙氨酸、MeaIle或MeaThr；N-乙基纈氨酸、N-乙基異亮氨酸、N-乙基蘇氨酸、N-乙基苯丙氨酸、N-乙基酪氨酸或N-乙基蘇氨酸(O乙?；?Z為纈氨酸、亮氨酸、甲基纈氨酸或甲基亮氨酸，Q為甲基亮氨酸、γ-羥基-甲基亮氨酸、甲基丙氨酸或脯氨酸，T1為(D)丙氨酸或賴氨酸，T2為甲基亮氨酸或γ-羥基-甲基亮氨酸，且
T3為甲基亮氨酸或甲基丙氨酸。
優(yōu)選的式I化合物為如式Ia的化合物 其中W’為MeBmt、二氫MeBmt或8’-羥基-MeBmt；X為αAbu、纈氨酸、蘇氨酸、Nva或0-甲基蘇氨酸(Me0Thr)；R’為Sar、(D)-甲基絲氨酸、(D)-甲基丙氨酸，或(D)-甲基絲氨酸(O乙?；?；Y’為甲基亮氨酸、γ-羥基-甲基亮氨酸、甲基異亮氨酸、甲基纈氨酸、甲基蘇氨酸、甲基丙氨酸、MeaIle或MeaThr；N-乙基纈氨酸、N-乙基異亮氨酸、N-乙基蘇氨酸、N-乙基苯丙氨酸、N-乙基酪氨酸或N-乙基蘇氨酸(O乙?；?Z為纈氨酸、亮氨酸、甲基纈氨酸或甲基亮氨酸；且Q’為甲基亮氨酸、γ-羥基-甲基亮氨酸，或甲基丙氨酸。基團(tuán)W’、X、Y’、Z、Q’和R’獨(dú)立具有以下優(yōu)選顯著性W’優(yōu)選為W”，其中W”為MeBmt或二氫-MeBmt；X優(yōu)選為X’，其中X’為αAbu或Nva，更優(yōu)選為X”，其中X”為αAbu；R’優(yōu)選為R”，其中R”為Sar；Y’優(yōu)選為Y”，其中Y”為γ-羥基-甲基亮氨酸、甲基纈氨酸、甲基蘇氨酸、甲基異亮氨酸、N-乙基異亮氨酸或N-乙基纈氨酸；Z優(yōu)選為Z’，其中Z’為纈氨酸或甲基纈氨酸；且Q’優(yōu)選為Q”，其中Q”為甲基亮氨酸；式Ia優(yōu)選的一組化合物中，W’為W”，X為X’，Y’為Y”，Z為Z’，Q’為Q”，且R’為R”。
式Ia優(yōu)選化合物的實(shí)例為a)[二氫-MeBmt]1-[γ-羥基-甲基亮氨酸]4-環(huán)孢菌素；BR*＝0.1；IR＜1％b)[甲基纈氨酸]4-環(huán)孢菌素；BR＝0.1；IR＜1％
c)[甲基異亮氨酸]4-環(huán)孢菌素；BR＝-0.2；IR＜1％d)[甲基蘇氨酸]4-環(huán)孢菌素；e)[γ-羥基-甲基亮氨酸]4-環(huán)孢菌素；BR＝0.4；IR＜1％f)[乙基異亮氨酸]4-環(huán)孢菌素；BR＝0.1；IR＜2％g)[乙基纈氨酸]4-環(huán)孢菌素；BR＝0；IR＜2％h)[Nva]2-[γ-羥基-甲基亮氨酸]4-環(huán)孢菌素；i)[γ-羥基-甲基亮氨酸]4-[γ-羥基-甲基亮氨酸]6-環(huán)孢菌素；j)[甲基纈氨酸]5-環(huán)孢菌素；BR＝0.4；IR＝5.3％k)[甲基0蘇氨酸]3-[(D)甲基丙氨酸]3-[甲基纈氨酸]5-環(huán)孢菌素；j)[8’-羥基-MeBmt]1-環(huán)孢菌素；BR＝0.35；IR＝1.8％k)[甲基丙氨酸]6-環(huán)孢菌素；BR＝-0.4；IR＝ 3.2l)[γ-羥基-甲基亮氨酸]9-環(huán)孢菌素；BR＝0.15；IR＝2.9IR＝免疫抑制性比率，為相對(duì)于環(huán)孢菌素A的活性百分比。
非免疫抑制性環(huán)孢菌素的其他實(shí)例為WO 98/28330、WO 98/28329和WO 98/28328中公開(kāi)的化合物，其內(nèi)容在此處引用作為參考，如式II所示化合物 其中Wa為 其中Ra為式Ic或Id的殘基-CH2-CH＝CH-CH2-R4Ic或-CH2-SH-R′4Id其中R4為C1-4烷硫基、氨基C1-4烷硫基、C1-4烷基氨基C1-4烷硫基、二C1-4烷基氨基C1-4烷硫基、嘧啶硫基、噻唑硫基、N-C1-4烷基咪唑硫基、羥基C1-4烷基苯硫基、羥基C1-4烷基苯氧基、硝基苯氨基或2-氧代嘧啶-1-基，且R’4為C1-4烷基，Xa為Abu；Ra為-NMe-CH(Rb)-CO-，其中Rb為H或-S-Alk-R0，其中Alk-R0為甲基；或Alk為直鏈或支鏈C2-6亞烷基或C3-6環(huán)亞烷基且R0為H；OH；COOH；C2-5烷氧基-羰基；NR1R2，其中R1和R2均獨(dú)立選自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C3-6環(huán)烷基和苯基，其各自任選由鹵素、C1-4烷氧基、C2-5烷氧基羰基、氨基、C1-4烷基氨基和/或二C1-4烷基氨基，以及芐基和雜環(huán)基所取代，所述芐基和雜環(huán)基為飽和或不飽和且含有5或6個(gè)環(huán)成員及1至3個(gè)雜原子；或R1和R2與它們相連的氮原子形成一個(gè)4至6元雜環(huán)，其可以含有另一個(gè)選自氮、氧和硫的雜原子，且任選由C1-4烷基、苯基或芐基所取代；或者R1和R2各自獨(dú)立為式Ib的基團(tuán) 其中R1和R2如上定義，R3為H或C1-4烷基，且n為2至4的整數(shù)；Ya為甲基亮氨酸或γ-羥基-甲基亮氨酸；Za為纈氨酸；且Qa為甲基亮氨酸，前提是當(dāng)Ya為甲基亮氨酸時(shí)Rb不為H，或其可藥用鹽。
在式II中，當(dāng)R1和/或R2為雜環(huán)殘基時(shí)，可為吡啶、四氫吡啶基、哌啶基、咪唑基、唑基或噻唑基。當(dāng)R1和R2與相連的氮原子形成雜環(huán)殘基時(shí)，該雜環(huán)殘基的實(shí)例可選自氮雜環(huán)丁烷基、哌啶基、哌嗪基、N-甲基哌嗪基、N-苯基哌嗪基、N-芐基哌嗪基、吡啶基、咪唑基、嗎啉代、硫代嗎啉代、四氫吡啶基、甲基四氫吡啶基(例如4-甲基四氫吡啶基)或苯基四氫吡啶基(例如4-苯基四氫吡啶基)。
可以通過(guò)一系列方法得到式I、Ia或II的化合物，所述方法可分為
1)發(fā)酵2)生物轉(zhuǎn)化3)衍生4)部分合成5)全部合成如EP 0484281 A1、WO 00/01715、WO 98/28330、WO 98/28329或WO98/28328中所公開(kāi)，其內(nèi)容在此處引用作為參考。
本發(fā)明的一系列其他特定或備選實(shí)施方案中也提供1.1在所需個(gè)體中預(yù)防或治療黃病毒科感染或黃病毒科誘發(fā)的疾病的方法，包括向所述受試者施用治療有效量的非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素，如式I、Ia或II的化合物。
根據(jù)本發(fā)明，可施用能有效減輕或消除一種或多種黃病毒科感染或誘發(fā)疾病的病征或癥狀的劑量的非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素，例如該劑量可有效降低受試者血清樣品中測(cè)量的黃病毒病毒量。
1.2抑制培養(yǎng)基中黃病毒復(fù)制的方法，包括向該培養(yǎng)基中加入有效劑量的非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素，如式I、Ia或II的化合物。
1.3抑制所需受試者中黃病毒復(fù)制的方法，包括向該受試者施用治療有效量的非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素，如式I、Ia或II的化合物。
1.4預(yù)防所需移植受者中HCV感染復(fù)發(fā)的方法，包括向所述受體施用治療有效量的非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素，如式I、Ia或II的化合物。
2.非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素，如式I、Ia或II的化合物，在制備用于上述任一方法的藥物組合物中的用途。
3.用于上述任一方法的藥物組合物，包括非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素，如式I、Ia或II的化合物，以及一種或多種其可藥用稀釋劑或載體。
通過(guò)如根據(jù)后文描述方法的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物或臨床試驗(yàn)，能展示非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素(此下稱為“本發(fā)明環(huán)孢菌素”或“受試非免疫抑制環(huán)孢菌素”)在治療上文說(shuō)明疾病中的用途。
A.體外細(xì)胞培養(yǎng)物在含有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)Huh-7和MH-14細(xì)胞、HCV復(fù)制子細(xì)胞。在DMEM和F12培養(yǎng)基的1∶1混合物內(nèi)培養(yǎng)PH5CH8細(xì)胞，其中補(bǔ)充100ng/ml表皮生長(zhǎng)因子、10μ/ml胰島素、0.36μg/ml氫化可的松、5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、5μg/ml亞油酸、20ng/ml硒、4μg/ml胰高血糖素、10ng/ml催乳素、10μg/ml慶大霉素、200μg/ml卡那霉素和2％FBS。
免疫印跡分析如K.Watashi等人，Virology 2001，286，391-402所述實(shí)施免疫印跡分析。用于本實(shí)驗(yàn)的一級(jí)抗體為抗-NS5A、抗-NS5B和抗-β-肌動(dòng)蛋白(Sigma)抗體。
間接免疫熒光分析如K.Watashi(同上)所述實(shí)施間接免疫熒光分析。本實(shí)驗(yàn)中所用的一級(jí)抗體為抗-NS5A和抗-PDI(StressGen)抗體。
逆轉(zhuǎn)錄(RT)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析如生產(chǎn)商推薦利用Sepasol-RNA I Super(nacalai tesque)分離培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA。根據(jù)生產(chǎn)商指示，使用一步RNA PCR試劑盒(Takara)實(shí)施RT-PCR分析。檢測(cè)2’，5’-寡腺苷酸合成酶及雙鏈RNA依賴性蛋白激酶的mRNA所用的引物分別為5’-CCGTGAAGTTTGAGGTCCAG-3’、5’-GACTAATTCCAAGACCGTCCG-3’和5’-TGGCCGCTAAACTTGCATATC-3’、5’-GCGAGTGTGCTGGTCACTAAAG-3’。
Northern印跡分析如H.Kishine等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，2002，47，119-125所述實(shí)施Nothern印跡分析。本實(shí)驗(yàn)中所用的與NS5B序列互補(bǔ)的探針如H.Kishine(同上)所述。
實(shí)時(shí)RT-PCR分析如T.Takeuchi等人，Gastroenterology，1999，116，636-642所述，利用ABI PRISM 7700序列檢測(cè)儀(AppliedBiosystems)定量HCV基因組RNA的5’-UTR。在此實(shí)驗(yàn)中使用的正向及反向引物分別為5’-CGGGAGAGCCATAGTGG-3’和5’-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3’。熒光探針為5’-CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’。也利用TaqMan核糖體RNA對(duì)照試劑(Applied Biosystems)定量核糖體RNA，作為內(nèi)部對(duì)照。
體外HCV感染實(shí)驗(yàn)如N.Kato等人.Jpn.J.Cancer Res.1996，87，787-792以及M.Ikada等人，Virus Res.，1998，56，157-167所述實(shí)施體外HCV感染實(shí)驗(yàn)。用制備自HCV陽(yáng)性供血者的血漿1B-2(相當(dāng)于104至105HCVRNA拷貝)感染PH5CH8細(xì)胞(1×105)。孵育后24小時(shí)將細(xì)胞用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌三次，并保存于新鮮培養(yǎng)基內(nèi)。
轉(zhuǎn)染和報(bào)告物測(cè)定根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明，分別利用FuGENE 6(Roche)和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)轉(zhuǎn)染入MH-14和H9細(xì)胞。根據(jù)K.Watashi(同上)所述進(jìn)行報(bào)告物測(cè)定。該研究中所用的報(bào)告質(zhì)粒為pNFAT-Luc、pAP1-Luc、pNFKB-Luc(PathDetect Reporter System；Stratagene)，以及pRL-TK(Dual-luciferase報(bào)告測(cè)定系統(tǒng)；Promega)。
本發(fā)明中多種環(huán)孢菌素對(duì)利用MH-14細(xì)胞的HCV基因組復(fù)制的作用為自主復(fù)制，其中HCV亞基因組復(fù)制子如圖1A所示。利用本發(fā)明的環(huán)孢菌素如1μg/ml[甲基異亮氨酸]4-環(huán)孢菌素以及用作陽(yáng)性對(duì)照的100U/mlIFNα處理7天，可將HCV NS5A及NS5B蛋白降至免疫印跡分析檢測(cè)不到的水平。間接免疫熒光分析顯示，用本發(fā)明1μg/ml環(huán)孢菌素處理的所有細(xì)胞中NS5A蛋白的產(chǎn)生均下降，而作為內(nèi)部對(duì)照的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記性蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)的水平在該條件下并不改變。本發(fā)明的環(huán)孢菌素降低了該測(cè)定中HCV復(fù)制細(xì)胞中HCV蛋白質(zhì)的表達(dá)。
通過(guò)northern印跡分析，分析用或不用本發(fā)明環(huán)孢菌素或IFNα處理7天的MH-14細(xì)胞中的復(fù)制子RNA。利用本發(fā)明的1μg/ml環(huán)孢菌素如[甲基異亮氨酸]4-環(huán)孢菌素處理，將復(fù)制子RNA的量降低至不可檢測(cè)水平。利用100U/ml IFNα的處理產(chǎn)生了類似的效果。此外，滴度逐漸降低且第7天時(shí)HCV RNA的水平降低至最初水平的約1/400。當(dāng)用IFNα共處理時(shí)，在任一檢查時(shí)間點(diǎn)(第3、5和7天時(shí))，相對(duì)于用環(huán)孢菌素或IFNα單獨(dú)處理有進(jìn)一步下降用環(huán)孢菌素和IFNα處理7天的MH-14細(xì)胞中復(fù)制子RNA水平相對(duì)于僅用IFNα處理細(xì)胞中的水平顯著下降。
此外，用HCV陽(yáng)性血漿處理PH5CH8細(xì)胞(非腫瘤性肝細(xì)胞系)，然后利用實(shí)時(shí)RT-PCR分析定量孵育后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的HCV RNA基因組滴度。雖然孵育后第5天時(shí)細(xì)胞內(nèi)HCV RNA基因組的滴度相對(duì)于第1天提高了約10倍，用本發(fā)明環(huán)孢菌素如[甲基異亮氨酸]4-環(huán)孢菌素或IFNα連續(xù)處理時(shí)，并未觀察到這些時(shí)間點(diǎn)處的HCV RNA基因組滴度發(fā)生顯著升高。本發(fā)明環(huán)孢菌素抑制了HCV感染的培養(yǎng)肝細(xì)胞的復(fù)制。
結(jié)果如圖2E、2F及2G所示利用[甲基異亮氨酸]4-環(huán)孢菌素(■)、或非親環(huán)蛋白結(jié)合性環(huán)孢菌素(●)(如6-[[R-(E)]-6，7-二去氫-N，4-二甲基-3-氧-L-2-氨基辛酸]-7-L-纈氨酸-環(huán)孢菌素A)處理的MH-14細(xì)胞實(shí)施免疫印跡分析(2E)、間接免疫熒光分析(2F)和實(shí)時(shí)RT-PCR分析(2G)。2E和2F中對(duì)照(第1行)，無(wú)處理；2E中CysA 1μg/ml；2E(■)和2F(■)中[甲基異亮氨酸]4-環(huán)孢菌素1μg/ml；2E(■)和2F(■)中非親環(huán)蛋白結(jié)合性環(huán)孢菌素1μg/ml。
確定抗病毒活性的其他細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)上述方法及以下所述的某些方法使用HCV。然而，可僅通過(guò)改變細(xì)胞體系和病毒病原體，使所述方法可用于黃病毒科的其他成員。
可用于檢測(cè)HCV及其受抑的基于細(xì)胞的方法能評(píng)價(jià)含有HCV復(fù)制子的Huh7細(xì)胞中復(fù)制子RNA的水平?？稍跇?biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些細(xì)胞，如補(bǔ)充10％胎牛血清、1×非必需氨基酸、Pen-Strep-Glu(分別為100單位/升、100微克/升及2.92mg/升)和G418(500至1000微克/毫升)的DMEM培養(yǎng)基(高糖，不含丙酮酸)。在不含有G418的相同培養(yǎng)基中可完成抗病毒篩查測(cè)定。為保持細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將細(xì)胞以低密度如每孔1000個(gè)細(xì)胞接種在96孔平板上。接種細(xì)胞后立即加入測(cè)試混合物即受試非免疫抑制性環(huán)孢菌素，并在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3至7天。然后移去培養(yǎng)基，準(zhǔn)備進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取(復(fù)制子RNA+宿主RNA)。然后可利用實(shí)時(shí)RT-PCR(Q-RT-PCR)方法擴(kuò)增復(fù)制子RNA，并定量之。
復(fù)制子RNA定量中所見(jiàn)的差異，是測(cè)試混合物即受試非免疫抑制性環(huán)孢茵素的抗病毒能力的表現(xiàn)之一。在典型實(shí)驗(yàn)中，在陰性對(duì)照和非活性化合物中產(chǎn)生的復(fù)制子量類似。據(jù)此可得知兩種情況下黃病毒和瘟病毒RT-PCR的測(cè)量閾值周期是否大致相同。在此類實(shí)驗(yàn)中，表達(dá)某一化合物的抗病毒有效性的方法之一是從該測(cè)試化合物的閾值RT-PCR周期(Ct測(cè)試化合物)中減去陰性對(duì)照的平均閾值RT-PCR周期(Ct陰性對(duì)照)。該值被稱為值為3.3表示復(fù)制子產(chǎn)生有1個(gè)對(duì)數(shù)減少。重組干擾素α-2a(如Roferon-A，Hoffmann-Roche，NJ，USA)可作為陽(yáng)性對(duì)照與測(cè)試化合物即受試非免疫抑制性環(huán)孢茵素共同使用。此外，可在稀釋系列中測(cè)試化合物(一般為100、33、10、3和1∶M時(shí))。每一濃度下的 值能用于計(jì)算50％有效濃度(EC50)。
如前文所述，通過(guò)改變細(xì)胞體系和病毒病原體可將上述測(cè)定用于黃病毒科的其他成員。確定某一受試非免疫抑制性環(huán)孢菌素有效性的方法包括對(duì)如Holbrook MR等人.Virus Res.2000，69，31；Markland W.等人.Antimicrob.Agents.Chemother.2000，44，859；Diamond MS等人，J.Virol.2000，74，7814；Jordan I等人.J.Infect Dis..2000，182，1214；Sreenivasan V等人.J.Virol．Methods 1993，45(1)，1；或Baginski SG等人.Proc.Natl.Acad.Sci USA 2000，97(14)7981中所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的改良或?qū)崟r(shí)RT-PCR技術(shù)。例如，可使用HuH7細(xì)胞中的HCV復(fù)制子系統(tǒng)(Lohmann V等人.Science，1999，285(5424，110)或其改良(Blight等人.2000)。
細(xì)胞保護(hù)測(cè)定可基本如Baginski，S.G.等人.“Mechanism of action of a pestiviruscompound”PNAS USA 2000，97(14)，7981-7986所述實(shí)施測(cè)定。在使用前24小時(shí)將MDBK細(xì)胞(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC)接種于96孔培養(yǎng)平板上(每孔4,000細(xì)胞)。當(dāng)用BVDV(NADL株，ATCC)以每細(xì)胞0.02噬斑形成單位(PFU)的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染后，向感染和未感染細(xì)胞中加入受試非免疫抑制性環(huán)孢菌素系列稀釋液，使生長(zhǎng)培養(yǎng)基中終濃度為0.5％DMSO。每一稀釋液可一式兩份、一式三份或一式四份測(cè)試?？烧{(diào)節(jié)細(xì)胞密度和病毒接種物以確保整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段中的持續(xù)細(xì)胞生長(zhǎng)，使感染后4天時(shí)未處理對(duì)照組中病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞破壞超過(guò)90％。4天后，利用50％TCA固定平板并用磺酰羅丹明B染色?？稍谖遄x出器讀出550nm處的光密度。50％有效濃度(EC50)值定義為實(shí)現(xiàn)病毒細(xì)胞病變減少50％的受試非免疫抑制性環(huán)孢菌素濃度。
噬斑減少測(cè)定通過(guò)噬斑減少測(cè)定可于一式兩份24孔平板中確定受試非免疫抑制性環(huán)孢菌素的有效濃度。以100PFU/孔的病毒感染細(xì)胞單層。然后將補(bǔ)充2％失活血清和0.75％甲基纖維素的MEM中的受試非免疫抑制性環(huán)孢菌素的系列稀釋液加入單層。再將培養(yǎng)物在37℃下孵育3天，然后用50％乙醇和0.8％結(jié)晶紫固定，洗滌并在空氣中干燥。計(jì)數(shù)噬斑以確定達(dá)到90％病毒抑制的濃度。
產(chǎn)量減少測(cè)定通過(guò)產(chǎn)量減少測(cè)定，可于一式兩份24孔平板上確定減少病毒量的6個(gè)對(duì)數(shù)時(shí)每一受試非免疫抑制性環(huán)孢菌素的濃度?？扇鏐aginski，S.G.等人.“Mechanism of action of a pestivirus compound”PNAS USA 2000，97(14)，7981-7986所述并輔以微小改動(dòng)，實(shí)施該測(cè)定。于BVDV(NADL株)以每細(xì)胞0.1 PFU感染復(fù)數(shù)(MOI)感染前24小時(shí)，將MDBK細(xì)胞接種于24孔平板上(每孔2×105細(xì)胞)。向細(xì)胞中加入非免疫抑制性環(huán)孢菌素的系列稀釋液使生長(zhǎng)培養(yǎng)基中終濃度為0.5％DMSO。每一稀釋濃度可一式兩份、一式三份或一式四份測(cè)試。3天后用多個(gè)凍融循環(huán)溶解細(xì)胞培養(yǎng)物(細(xì)胞單層和上清液)，并通過(guò)噬斑測(cè)定定量病毒產(chǎn)量。簡(jiǎn)言之，于使用前24小時(shí)將MDBK細(xì)胞接種至6孔平板中(每孔5×105細(xì)胞)。將細(xì)胞與0.2mL測(cè)試裂解產(chǎn)物孵育1小時(shí)，洗滌并以生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的0.5％瓊脂糖覆蓋。3天后，以3.5％福爾馬林固定細(xì)胞單層并以1％結(jié)晶紫(w/v 50％乙醇中)染色以顯示噬斑。然后計(jì)數(shù)噬斑以確定達(dá)到病毒量減少6個(gè)對(duì)數(shù)的濃度。
改造以檢測(cè)黃病毒科病毒的非基于細(xì)胞的測(cè)定核酸擴(kuò)增技術(shù)現(xiàn)已成為鑒定生物樣品中數(shù)目大且仍在增長(zhǎng)的微生物，如結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)，人免疫缺陷病毒(HIV)以及丙型肝炎病毒(HCV)所選的方法。核酸擴(kuò)增技術(shù)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA)。核酸擴(kuò)增技術(shù)需要至少一部分黃病毒科基因組的核苷酸序列。此類序列可從發(fā)表文獻(xiàn)和基因數(shù)據(jù)庫(kù)中得到。
擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)程序擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)程序分為兩類基本類型多相和均相。多相檢測(cè)的特征在于通過(guò)如洗滌等設(shè)計(jì)從雜交探針中除去非雜交探針的明確步驟，而均相檢測(cè)中不從結(jié)合探針中除去游離探針的物理分離步驟。存在多種多相和均相檢測(cè)方法。
多相檢測(cè)如DNA印跡為一種多相檢測(cè)技術(shù)。在DNA印跡中，利用電泳將擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)大小和電荷分離開(kāi)。通過(guò)擴(kuò)散、真空化或電印跡將大小分級(jí)分離的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到膜或?yàn)V器上。然后在溶液中使標(biāo)記的檢測(cè)探針與膜結(jié)合靶雜交，洗滌濾器除去任何非雜交探針，通過(guò)多種方法中的任一種檢測(cè)膜上雜交的探針。
其他類型的多相檢測(cè)是基于如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物特異性捕獲的方法。與PCR聯(lián)合使用的方法之一包括利用半抗原或配體(如生物素)標(biāo)記引物，擴(kuò)增后利用抗體-或鏈霉親和素-包被的微板捕獲該標(biāo)記。另一引物則以報(bào)告分子如熒光素標(biāo)記，通過(guò)加入抗熒光素抗體，辣根過(guò)氧化酶(HRP)綴合物進(jìn)行檢測(cè)。此類方法不如使用與確定的目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的檢測(cè)探針特異。
均相檢測(cè)由于在均相檢測(cè)系統(tǒng)中沒(méi)有將雜交和非雜交檢測(cè)探針物理性分離，這些方法比多相方法需要的步驟少，因此也更不易受污染。可購(gòu)買的利用均相檢測(cè)的熒光性或化學(xué)發(fā)光性標(biāo)記的試劑盒包括TaqMan系統(tǒng)(AppliedBiosystems；Foster City，CA)、BDProbeTecET系統(tǒng)(Becton Dickinson；Franklin Lakes，NJ)、QPCR系統(tǒng)5000(Perkin-Elmer Corp.；Norwalk，CT)以及雜交保護(hù)測(cè)定(Gen Probe Inc.；San Diego)。
TaqMan系統(tǒng)實(shí)時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增子。與擴(kuò)增子內(nèi)部一個(gè)區(qū)域雜交的檢測(cè)探針中，5’端含有供體熒光團(tuán)如熒光素而3’端含有一個(gè)淬滅劑部分如羅丹明。當(dāng)淬滅劑和熒光團(tuán)位于同一寡核苷酸上時(shí)，供體熒光受抑。擴(kuò)增過(guò)程中探針結(jié)合于靶標(biāo)。當(dāng)Taq聚合酶合成取代鏈時(shí)，該酶取代并裂解檢測(cè)探針。檢測(cè)探針的裂解使熒光團(tuán)與淬滅劑彼此分離，導(dǎo)致供體熒光信號(hào)增強(qiáng)。該過(guò)程在每一輪擴(kuò)增中均被重復(fù)。熒光信號(hào)的量隨著擴(kuò)增子的增加而增強(qiáng)。
分子信標(biāo)也使用淬滅劑和熒光團(tuán)。信標(biāo)為與靶擴(kuò)增子互補(bǔ)的探針，但其每端均含有互補(bǔ)寡核苷酸的短序列(約5個(gè)核苷酸)。分別以熒光團(tuán)和淬滅劑標(biāo)記信標(biāo)的5’和3’端。當(dāng)信標(biāo)不與靶雜交時(shí)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，從而使熒光團(tuán)與淬滅劑彼此接觸，導(dǎo)致熒光淬滅。環(huán)形區(qū)域中含有與復(fù)制子互補(bǔ)的區(qū)域。一旦與靶標(biāo)雜交，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)而淬滅劑與熒光團(tuán)分離，從而能產(chǎn)生熒光信號(hào)。熒光儀實(shí)時(shí)測(cè)量該信號(hào)。
BDProbeTecET系統(tǒng)使用TaqMan和分子信標(biāo)相結(jié)合的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法。探針中含有發(fā)夾環(huán)形結(jié)構(gòu)并含有熒光素和羅丹明標(biāo)記。然而在該系統(tǒng)中，與靶分子互補(bǔ)的區(qū)域不在環(huán)內(nèi)而位于羅丹明標(biāo)記的3’端區(qū)域。并非含有與靶標(biāo)互補(bǔ)的序列，該單鏈環(huán)含有限制酶BsoBI的限制性位點(diǎn)。該單鏈序列并非該酶的底物。熒光素和羅丹明標(biāo)記在擴(kuò)增前彼此靠近，淬滅熒光素的熒光。鏈取代擴(kuò)增將探針轉(zhuǎn)化為雙鏈分子。然后BsoBI限制性酶可裂解分子，導(dǎo)致標(biāo)記分離以及熒光信號(hào)的增強(qiáng)。
QPCR系統(tǒng)5000使用了利用釕標(biāo)記的電化學(xué)發(fā)光。使用生物素化的引物。擴(kuò)增后生物素產(chǎn)物被鏈酶親和素包被的順磁珠所捕獲。通過(guò)抽吸將磁珠轉(zhuǎn)移到電化學(xué)流式細(xì)胞中并磁性吸附于電極的表面。一旦受電刺激，釕標(biāo)記的探針就會(huì)發(fā)光。
在所有使用探針檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法中檢測(cè)探針的設(shè)計(jì)均至關(guān)重要。好的檢測(cè)探針只與特定擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，而不與非特異產(chǎn)物雜交。其他優(yōu)化檢測(cè)方法的關(guān)鍵事件包括探針的標(biāo)記和最大化樣品通量。
標(biāo)記方法和報(bào)告分子可通過(guò)若干種不同方法標(biāo)記檢測(cè)探針。向探針中酶摻入32P或35S是同位素標(biāo)記最常用的方法。在雜交和洗滌后，在自顯影膠片上檢測(cè)信號(hào)。
可將探針以多種分子酶標(biāo)記以實(shí)施非放射性檢測(cè)。酶促地?fù)饺肷锼兀缓笠訟P底物如磷酸5-溴-4-氯-3-吲哚酯(BCIP)和氮藍(lán)四唑(NBT)，用鏈酶親和素綴合的堿性磷酸酶檢測(cè)之?；瘜W(xué)發(fā)光底物如Lumi-Phos 530或Lumi-Phos Plus(Lumigen，Southfield，MI)也可與AP一同使用。此外可以酶促地將洋地黃毒苷-11-dUTP摻入DNA或RNA，而抗洋地黃毒苷AP綴合物可用于比色或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。
還有多種其他類型報(bào)告分子，包括化學(xué)發(fā)光部分如吖啶酯。也可使用多種熒光部分。也可使用電化學(xué)發(fā)光化合物如三(2，2′-聯(lián)吡啶)釕(II)。對(duì)這些以及類似技術(shù)的進(jìn)一步討論可見(jiàn)于Schiff ER，de Medina M，Kahn RS.Semin Liver Dis.1999；19(增補(bǔ)1∶3-15)。
多相或均相測(cè)定中任一種均可用于評(píng)價(jià)本發(fā)明環(huán)孢菌素對(duì)黃病毒家族中某一病毒的有效性。
B臨床實(shí)驗(yàn)?zāi)技傆?jì)15名患有慢性丙型肝炎感染或其他黃病毒科感染的病人參加為期2周的研究。每一病人均接受本發(fā)明的環(huán)孢菌素如[甲基異亮氨酸]4-環(huán)孢菌素，劑量為口服7至15mg/kg。確定每一病人中第0天和第14天時(shí)丙型肝炎抗原(或其他黃病毒科病毒抗原)的血清水平。
患有丙型肝炎感染的人可能顯示以下一項(xiàng)或多項(xiàng)病征或癥狀(a)ALT升高，(b)抗HCV抗體測(cè)試陽(yáng)性，(c)HCV-RNA測(cè)試陽(yáng)性證實(shí)的HCV存在，(d)慢性肝病的臨床特征，(e)肝細(xì)胞損傷。此類標(biāo)準(zhǔn)不僅用于診斷丙型肝炎，也可用于評(píng)價(jià)病人對(duì)藥物治療的反應(yīng)。
已知在未控制的丙型肝炎中血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)會(huì)升高，而一般定義這些血清酶，特別是ALT恢復(fù)正常為對(duì)治療完全反應(yīng)(Davis等人，1989，New Eng.J.Med.3211501-1506)。ALT為肝細(xì)胞破壞時(shí)釋放出的酶，為HCV感染的癥狀酶。
為了跟蹤對(duì)藥物治療反應(yīng)的受試者中HCV復(fù)制或其他黃病毒復(fù)制過(guò)程，可通過(guò)如嵌套聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)定來(lái)測(cè)量血清樣品中的病毒RNA，所述測(cè)定使用的兩組引物來(lái)自HCV基因組N53和N54非結(jié)構(gòu)基因區(qū)(Farci等人，1991，New Eng.J.Med.32598-104.Ulrich等人，1990，J.Clin.Invest.，861609-1614)或另一黃病毒科病毒中類似區(qū)域。
肝活檢樣品的組織學(xué)檢查可用作評(píng)價(jià)HCV復(fù)制的第二標(biāo)準(zhǔn)。見(jiàn)如Knodell等人，1981，Hepatology 1431-435，其中組織性活動(dòng)指數(shù)(肝門炎癥、點(diǎn)狀或橋接壞死、小葉損傷及纖維化)提供了一種疾病活動(dòng)度的評(píng)分方法。
實(shí)施本發(fā)明方法所需的日劑量取決于，如所用的非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素、宿主、施用方式、治療的疾病的嚴(yán)重性。優(yōu)選的日劑量范圍為每天約1至50mg/kg，單劑或分次施用。病人合適的日劑量為口服或靜脈內(nèi)注射約1至20mg/kg。適于口服的單位劑型包括約0.25至10mg/kg的活性成分如[甲基異亮氨酸]4-環(huán)孢菌素，以及一種或多種可藥用稀釋劑或載體。
本發(fā)明環(huán)孢菌素可通過(guò)任何常規(guī)途徑施用，具體而言為胃腸道內(nèi)，如口服(如以飲用溶液劑、片劑或膠囊劑形式)，或腸胃外，如以可注射溶液劑或混懸劑的形式。優(yōu)選藥物組合物可為如那些基于微乳劑如UK2,222,770A中所述者。
本發(fā)明的環(huán)孢菌素可作為單一成分施用或與其他藥物一同施用，如具有抗黃病毒活性的藥物，例如干擾素如干擾素-α-2a或干擾素-α-2b(如IntronRA、RoferonR、AvonexR、RebifR或BetaferonR)，或與水溶性聚合物或人白蛋白綴合的干擾素如albuferon，抗病毒劑如利巴韋林(ribavirin)、拉米夫定(lamivudine)、NV08或NM283，HCV或其他黃病毒編碼因子如NS3/4A蛋白酶、解旋酶或RNA聚合酶的抑制劑或此類抑制劑的前體藥物，抗纖維化藥物如N-苯基-2-嘧啶氨基衍生物(如伊馬替尼imatinib)，免疫調(diào)節(jié)劑如N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，如伊馬替尼，免疫調(diào)節(jié)劑，如麥考酚酸、其鹽或前體藥物如麥考酚酸鈉或麥考酚酸酯，或者S1P受體激動(dòng)劑如FTY720或其任選磷酸化的類似物(例如公開(kāi)于EP627406A1、EP778263A1、EP1002792A1、WO02/18395、WO02/76995、WO02/06268、JP2002316985、WO03/29184、WO03/29205、WO03/62252和WO03/62248中者)。
干擾素與水溶性聚合物的綴合物中，尤其包括與聚環(huán)氧烷均聚物如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、其共聚物及其嵌段共聚物的綴合物。除基于聚環(huán)氧烷聚合物外，可使用有效的非抗原性材料如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、碳水化合物型聚合物等。此類干擾素聚合物綴合物描述于美國(guó)專利號(hào)4,766,106、4,917,888，歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?236987，歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?510356以及國(guó)際申請(qǐng)公布號(hào)WO95/13090。由于聚合修飾能有效降低抗原性反應(yīng)，外源性干擾素不必完全為自體來(lái)源。用于制備聚合綴合物的干擾素可由哺乳動(dòng)物提取物中制備，如人、反芻動(dòng)物或牛干擾素，或重組制備。優(yōu)選與聚乙二醇綴合的干擾素，即聚乙二醇化干擾素。
特別優(yōu)選的干擾素聚合物為聚乙二醇化α-干擾素如聚乙二醇化干擾素-α-2a、聚乙二醇化干擾素-α-2b；聚乙二醇化共有區(qū)干擾素或聚乙二醇化純化干擾素-α產(chǎn)物。聚乙二醇化干擾素-α-2a描述于如歐洲專利593,868中，并可以商品名PEGASYS(Hoffmann-La Roche)購(gòu)得。聚乙二醇化干擾素-α-2b描述于如歐洲專利975,369中，并可以商品名PEG-INTRON A(Schering Plough)購(gòu)得。聚乙二醇化共有區(qū)干擾素描述于WO 96/11953。優(yōu)選的聚乙二醇化α-干擾素為聚乙二醇化干擾素-α-2a及聚乙二醇化干擾素-α-2b。同樣優(yōu)選聚乙二醇化共有區(qū)干擾素。
利巴韋林(1-β-D-呋喃核糖基-1-1，2，4-三唑-3-甲酰胺)為合成的非干擾素誘導(dǎo)性廣譜抗病毒核苷類似物，以商品名Virazole(The Merk Index，第11版，編輯Budavar，S，Merck&Co.，Inc.，Rahway，NJ，p1304，1989)出售。美國(guó)專利號(hào)3,798,209以及RE29,835公開(kāi)并要求保護(hù)利巴韋林。利巴韋林與鳥苷結(jié)構(gòu)類似，并具有針對(duì)包括黃病毒在內(nèi)的若干DNA和RNA病毒的活性(Gary L.Davis，Gastroenterology 118S104-S114，2000)。
利巴韋林能使40％病人中血清轉(zhuǎn)氨酶水平降至正常，但不會(huì)降低HCV-RNA的血清水平(Gary L.Davis，Gastroenterology 118S104-S114，2000)。因此，利巴韋林本身對(duì)降低病毒RNA水平無(wú)效。此外，利巴韋林具有顯著毒性且已知會(huì)誘發(fā)貧血。利巴韋林并未批準(zhǔn)用于抗HCV的單藥治療；但已經(jīng)批準(zhǔn)與干擾素α-2a或干擾素α-2b聯(lián)合使用治療HCV。
所用共用藥物的日劑量取決于如所用化合物、宿主、施用途徑及治療疾病的嚴(yán)重性。例如，拉米夫定可按每日劑量100mg施用。聚乙二醇化干擾素可每周腸胃外外施用1至3次，優(yōu)選每周1次，每周總劑量2至1千萬(wàn)IU，更優(yōu)選5至1千萬(wàn)IU，更優(yōu)選8至1千萬(wàn)IU。
根據(jù)前文，本發(fā)明的其他方面還提供4.藥物組合物，包括a)第一種藥物非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素如式I、Ia或II的化合物，以及b)共用藥物如上述第二藥物，如可用于上述任何方法中者。
5.如上述定義的方法，包括如同時(shí)或依次共同施用治療有效量非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素如式I、Ia或II的化合物，以及共用藥物，如上述定義的第二藥物。
此處所用的術(shù)語(yǔ)“共同施用”或“聯(lián)合施用”或類似術(shù)語(yǔ)，是包括對(duì)一個(gè)病人施用選擇的治療劑，且包括其中不必須通過(guò)同一途徑或同時(shí)施用藥物的治療方案。
施用本發(fā)明的藥物組合相對(duì)于僅施用其中一種藥物活性成分的單藥治療能產(chǎn)生有益作用，如協(xié)同治療效應(yīng)。優(yōu)選的協(xié)同組合為非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素加上干擾素，后者任選綴合于聚合物。
另一優(yōu)選的組合為非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素與麥考酚酸、其鹽或前體藥物的組合，或與S1P受體激動(dòng)劑如FTY720的組合。
聯(lián)合或輪替療法本發(fā)明的活性化合物可與另一抗黃病毒藥物組合或輪替施用。在聯(lián)合療法中，同時(shí)施用有效劑量的兩種或多種藥物，而在輪替或順序步驟療法中，順序或依次施用有效劑量的每一藥物。所給劑量取決于該藥吸收、失活以及排泄的速率以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他因素。還應(yīng)注意劑量值也根據(jù)有待治療疾病的嚴(yán)重性而有所不同。此外應(yīng)當(dāng)理解對(duì)于任一具體受試者而言，特定的劑量方案和程序應(yīng)當(dāng)根據(jù)個(gè)體需求和施用及監(jiān)督組合物施用人員的專業(yè)判斷而隨時(shí)間修正。在優(yōu)選實(shí)施方案中，希望抗黃病毒化合物的EC50為10-15∶M，或優(yōu)選小于1-5∶M。
已經(jīng)認(rèn)識(shí)到在長(zhǎng)期使用某一抗病毒藥物治療后會(huì)產(chǎn)生黃病毒的耐藥性變體。最常因編碼病毒復(fù)制所用酶的基因發(fā)生突變而產(chǎn)生耐藥性。可通過(guò)將化合物與第二也許第三種誘導(dǎo)與主要藥物誘導(dǎo)的突變不同的抗病毒化合物聯(lián)合或輪替施用，來(lái)延長(zhǎng)、增強(qiáng)或恢復(fù)藥物對(duì)病毒感染的有效性?；蛘呖赏ㄟ^(guò)此類聯(lián)合或輪替治療改變?cè)撍幬锏乃幋鷦?dòng)力學(xué)、生物分布或其他參數(shù)。一般而言，聯(lián)合治療一般較輪替治療更為優(yōu)選，因?yàn)榍罢吣芡瑫r(shí)對(duì)病毒施加多重脅迫。
如上所述，多種病毒治療如干擾素和利巴韋林可與本發(fā)明中非免疫抑制性環(huán)孢菌素聯(lián)合或輪替施用。其他非限制性實(shí)例包括(1)蛋白酶抑制劑實(shí)例包括基于底物的NS3蛋白酶抑制劑(Attwood等人，Antiviralpeptide derivatives，PCT WO 98/22496，1998；Attwood等人，AntiviralChemistry and Chemotherapy 1999，10，259-273；Attwood等人，Preparation and use of amino acid derivatives as anti-viral agents，GermanPatent Pub.DE 19914474；Tung等人.Inhibitors of serine proteases，particularly hepatitis C virus NS3 protease；PCT WO 98/17679)，包括α酮酰胺和肼基脲、終止于親電子試劑如硼酸或膦酸鹽的抑制劑(Llinas-Brunet等人.Hepatitis C inhibitor peptide analogues，PCT WO99/07734)正被研究。
也研究了非基于底物的NS3蛋白酶抑制劑如2，4，6-三羥基-3-硝基-苯甲酰胺衍生物(Sudo K.等人，Biochemiscal and Biophysical ResearchCommunications，1997，238 643-647；Sudo K.等人.Antiviral Chemistryand Chemotherapy，1998，9，186)，包括RD3-4082和RD3-4078，前者以14碳鏈取代酰胺而后者處理對(duì)-苯氧基苯基。
菲醌Sch 68631為HCV蛋白酶抑制劑(Chu M等人TetrahedronLetters 377229-7232，1996)。在同一作者的另一實(shí)例中，分離自真菌灰黃青霉(Penicillium grieofulvum)的Sch 351633，被鑒定為蛋白酶抑制劑(ChuM.等人，Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 91949-1952)。通過(guò)基于大分子eglin c設(shè)計(jì)選擇性抑制劑，可達(dá)到針對(duì)HCV NS3蛋白酶的納摩爾級(jí)效力。Eglin c分離自水蛭，為若干種絲氨酸蛋白酶如灰色鏈霉菌(S.griseus)蛋白酶A和B、-糜蛋白酶、類胰凝乳蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶的強(qiáng)力抑制劑。Qasim M.A.等人，Biochemistry 361598-1607，1997。
公開(kāi)用于治療HCV的蛋白酶抑制劑的美國(guó)專利包括如，Spruce等人的美國(guó)專利號(hào)6,004,933，其中公開(kāi)了一組用于抑制HCV內(nèi)肽酶2的半胱氨酸蛋白酶抑制劑；Zhang等人的美國(guó)專利號(hào)5,990,276，其中公開(kāi)了丙型肝炎NS3蛋白酶的合成抑制劑；Reyes等人的美國(guó)專利號(hào)5,538,865。如NS3絲氨酸蛋白酶抑制劑的肽公開(kāi)于Corvas International，Inc.的WO02/008251，以及Schering Corporation的WO 02/08187和WO 02/008256。HCV抑制劑三肽公開(kāi)于Boehringer Ingelheim的美國(guó)專利號(hào)6,534,523、6,410,531及6,420,380，以及Bristol Myers Squibb的WO 02/060926。HCV的NS3絲氨酸蛋白酶抑制劑二芳基肽公開(kāi)于Schering Corporation的WO02/48172。HCV的NS3絲氨酸蛋白酶抑制劑Imidazoleidinones公開(kāi)于Schering Corporation的WO 02/18198以及Bristol Myers Squibb的WO02/48157。Vertex Pharmaceuticals的WO 98/17679以及Bristol MyersSquibb的WO 02/48116也公開(kāi)了HCV蛋白酶抑制劑。
(2)噻唑烷衍生物，其反相HPLC測(cè)定中顯示出對(duì)NS3/4A融合蛋白質(zhì)和NS5A/5B底物相關(guān)抑制(Sudo K.等人，Antiviral Research，1996，32，9-18)，尤其是化合物RD-1-6250，其中含有長(zhǎng)烷基鏈取代的稠合的肉桂酰部分，RD4 6205和RD4 6193；(3)Kakiuchi N.等人.J.FEBS Letters 421，217-220；Takeshita N.等人.Analytical Biochemistry，1997，247，242-246中鑒定的噻唑烷和N-苯甲酰苯胺類；(4)在SDS-PAGE和放射自顯影中具有針對(duì)蛋白酶活性的菲醌，分離自鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)液，Sch 68631(Chu M.等人，Tetrahedron Letters，1996，37，7229-7232)，以及Sch 351633，分離自真菌灰黃青霉，在閃爍鄰近測(cè)定中具有活性(Chu M.等人，Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9，1949-1952)；(5)解旋酶抑制劑(Diana G.D.等人，Compounds，compositions andmethods for treatment of hepatitis C，美國(guó)專利號(hào)5,633,388；Diana G.D.等人，Piperidine derivatives，pharmaceutical compositions thereof andtheir use in the treatment of hepatitis C，PCT WO 97/36554)；(6)核苷酸聚合酶抑制劑及膠霉毒素(Ferrari R.等人.Journal ofVirology，1999，73，1649-1654)，以及天然產(chǎn)物淺藍(lán)菌素(Lohmann V.等人.Virology，1998，249，108-118)；(7)與病毒5’非編碼區(qū)域(NCR)序列延伸互補(bǔ)的反義硫代磷酸酯寡脫氧核苷酸(S-ODN)(Alt M.等人，Hepatology，1995，22，707-717)，或包括NCR3’端的核苷酸326-348及位于HCV RNA核心編碼區(qū)的核苷酸371-388(Alt M.等人，Archives of Virology，1997，142，589-599；Galderisi U.等人，Journal of Cellular Physiology，199，181，251-257)；或能提高治療有效性的與HCV基因組任一部分互補(bǔ)的反義序列。
(8)IRES依賴性翻譯抑制劑(Ikeda N等人，Agent for the prevention andtreatment of hepatitis C，日本專利公布號(hào)JP-08268890；Kai Y等人.Prevention and treatment of viral diseases，日本專利公布號(hào)JP-10101591)；(9)核酶如核酸酶抗性核酶(Maccjak，D.J.等人，Hepatology 1999，30，abstract 995)，以及Barber等人美國(guó)專利號(hào)6,043,077和Draper等人美國(guó)專利號(hào)5,869,253及5,610,054中教導(dǎo)的；以及(10)也已開(kāi)發(fā)了用于治療黃病毒科感染的核苷類似物。見(jiàn)如題為““2’-C-Methyl-3’-O-L-Valine Ester Ribofuranosyl Cytidine For Treatmentof Flaviviridae Infections”的專利申請(qǐng)WO 2004/002422 A2，以及美國(guó)專利號(hào)6,812,219。
Idenix Pharmaceuticals在國(guó)際公布號(hào)WO 01/90121和WO 01/92282中公開(kāi)了分支核苷酸在治療黃病毒(包括HCV)和瘟病毒中的用途。特別地，Idenix出版物中公開(kāi)了治療人類及其他宿主動(dòng)物丙型肝炎感染(以及黃病毒和瘟病毒)的方法，包括施用有效劑量生物活性的1’、2’、3’或4’-分支B-D或B-L核苷或其可藥用鹽或前體藥物，可單獨(dú)施用或與另一抗病毒藥物組合施用，任選具有可藥用載體。
其他公開(kāi)某些核苷類似物用于治療丙型肝炎病毒的專利申請(qǐng)包括BioChem Pharma，Inc.(現(xiàn)為Shire Biochem，Inc.)中請(qǐng)的PCTCA00/01316(WO 01/32153；申請(qǐng)于2000年11月3日)和PCT/CA01/00197(WO01/60315；申請(qǐng)于2001年2月19日)；Merck&Co.，Inc.申請(qǐng)的PCT/US02/01531(WO 02/057425；申請(qǐng)于2002年1月18日)和PCT/US02/03086 (WO 02/057287；申請(qǐng)于2002年1月18日)；Roche申請(qǐng)的PCT/EP01/09633 (WO 02/18404；出版于2001年8月21日)；以及Pharmasset，Ltd的PCT公布號(hào)WO 01/79246(申請(qǐng)于2001年4月13日)、WO 02/32920(申請(qǐng)于2001年10月18日)以及WO 02/48165。
Emory University PCT公布號(hào)WO 99/43691名為“2’-Fluoronucleosides”，公開(kāi)了某些2’-氟代核苷在治療HCV中的用途。
Eldrup等人(Oral Session V，Hepatitis C Virus，F(xiàn)laviviridae；第16屆國(guó)際抗病毒研究會(huì)議(2003年4月27日，Savannah，GA))描述了2’-修飾核苷在HCV抑制中結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系。
Bhat等人(Oral Session V，Hepatitis C Virus，F(xiàn)laviviridae，2003(OralSession V，Hepatitis C Virus，F(xiàn)laviviridae；第16屆國(guó)際抗病毒研究會(huì)議(2003年4月27日，Savannah，GA)；A75頁(yè))描述了可能的HCV RNA復(fù)制抑制劑核苷類似物的合成與藥代動(dòng)力學(xué)特征。作者報(bào)告2’-修飾的核苷在基于細(xì)胞的復(fù)制子測(cè)定中具有強(qiáng)大的抑制活性。
Olsen等人(Oral Session V，Hepatitis C Virus，F(xiàn)laviviridae；第16屆國(guó)際抗病毒研究會(huì)議(2003年4月27日，Savannah，GA)；A76頁(yè))也描述了2’-修飾的核苷對(duì)HCV RNA復(fù)制的作用。
11.其他各種化合物包括1-氨基-烷基環(huán)己烷(Gold等人，美國(guó)專利號(hào)6,034,134)、烷基脂(Chojkier等人，美國(guó)專利號(hào)5,922,757)、維生素E及其他抗氧化劑(Chojkier等人，美國(guó)專利號(hào)5,922,757)、squalent、金剛胺、膽汁酸(Ozeki等人，美國(guó)專利號(hào)5,846,99964)、N-(膦?；阴；?-L-天冬氨酸(Diana等人，美國(guó)專利號(hào)5,830,905)、苯二羧酰胺(Diane等人，美國(guó)專利號(hào)5,633,388)、聚腺苷酸衍生物(Wang等人，美國(guó)專利號(hào)5,496,546)、2’3’-二脫氧肌苷(Yarchoan等人，美國(guó)專利號(hào)5,026,687)、苯并咪唑(Colacino等人，美國(guó)專利號(hào)5,891,874)、植物提取物(Tsai等人，美國(guó)專利號(hào)5,837,257；Omer等人，美國(guó)專利號(hào)5,725,859；以及美國(guó)專利號(hào)6,056,961)，以及哌啶類(Diana等人，美國(guó)專利號(hào)5,830,905)。
12.受體激動(dòng)劑如艾沙托立賓(isatoribine)(ANA975和ANA245)，為TOLL樣受體激動(dòng)劑的核苷類似物(美國(guó)專利號(hào)5,041,426及4,880,784)。
13.取代的硫代芳基脲衍生物如1-(4-戊氧基-3-三氟甲基苯基)3-(吡啶-3-羰基)硫脲(美國(guó)公布號(hào)2004/0138205，美國(guó)系列號(hào)10/716,175)。
14.能提高聯(lián)合療法有效性的化合物，包括抗葉酸、5-氟嘧啶(包括5-氟尿嘧啶)、胞嘧啶類似物如β-L-1，3-二氧戊環(huán)基胞嘧啶或β-L-1，3-二氧戊環(huán)基5-氟胞嘧啶、抗代謝劑(包括嘌呤抗代謝物、阿糖胞苷、氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤，甲氨蝶呤及6-硫鳥嘌呤)、羥基脲、有絲分裂抑制劑(包括CPT-11、依托泊苷(VP-21)、紫杉酚，及長(zhǎng)春花生物堿類如長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿)、烷化劑(包括但不僅限于白消安、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、ifofamide、氮芥、苯丙氨酸氮芥和噻替哌)、非典型烷化劑、含鉑化合物、博來(lái)霉素、抗腫瘤抗生素、蒽環(huán)類如阿霉素和dannomycin、蒽二酮、拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑、激素物質(zhì)(包括但不僅限于皮質(zhì)類固醇(地塞米松、強(qiáng)的松和甲基強(qiáng)的松)、雄激素如氟甲睪酮和甲基睪酮、雌激素如己烯雌酚、抗雌激素如他莫昔芬、LHRH類似物如亮丙瑞林、抗雄激素如氟他胺、氨魯米特、醋酸甲地孕酮和甲羥孕酮)、天冬酰胺酶、卡莫司汀、羅氮芥、六甲密胺、達(dá)卡巴嗪、米托坦、鏈脲霉素、順鉑、卡鉑、左levamasole和亞葉酸。本發(fā)明化合物可與酶治療劑以及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)物如干擾素、白介素、腫瘤壞死因子、巨噬集落刺激因子和集落刺激因子組合使用。
權(quán)利要求
1.一種環(huán)孢菌素在制備用于預(yù)防或治療黃病毒科感染或黃病毒科誘發(fā)的疾病的藥物組合物中的用途，其中所述環(huán)孢菌素(i)結(jié)合于人重組親環(huán)蛋白，其結(jié)合率(BR)小于0.7，其中BR為競(jìng)爭(zhēng)性ELISA測(cè)試的該環(huán)孢菌素的IC50與同時(shí)測(cè)試的環(huán)孢菌素A的IC50之比值的底數(shù)為10的對(duì)數(shù)；且(ii)在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中的活性不大于環(huán)孢菌素A活性的5％。
2.權(quán)利要求1的環(huán)孢菌素在制備抑制黃病毒科病毒復(fù)制的藥物組合物中的用途。
3.權(quán)利要求2的環(huán)孢菌素的用途，其中黃病毒科病毒為黃病毒屬(flavivirus)、瘟病毒屬(pestivirus)或丙型肝炎病毒屬(hepacivirus)。
4.權(quán)利要求1、2或3的用途，其中環(huán)孢菌素為式I化合物 其中W為MeBmt、二氫-MeBmt、8’-羥基-MeBmt或O-乙?；?MeBmt1；X為αAbu、纈氨酸、蘇氨酸、Nva或0-甲基蘇氨酸(Me0Thr)；R為脯氨酸、Sar、(D)-甲基絲氨酸、(D)-甲基丙氨酸，或(D)-甲基絲氨酸(O乙?；?；Y為甲基亮氨酸、硫代甲基亮氨酸、γ-羥基-甲基亮氨酸、甲基異亮氨酸、甲基纈氨酸、甲基蘇氨酸、甲基丙氨酸、MeaIle或MeaThr；N-乙基纈氨酸、N-乙基異亮氨酸、N-乙基蘇氨酸、N-乙基苯丙氨酸、N-乙基酪氨酸或N-乙基蘇氨酸(O乙?；?Z為纈氨酸、亮氨酸、甲基纈氨酸或甲基亮氨酸，Q為甲基亮氨酸、γ-羥基-甲基亮氨酸、甲基丙氨酸或脯氨酸，T1為(D)丙氨酸或賴氨酸，T2為甲基亮氨酸或γ-羥基-甲基亮氨酸，且T3為甲基亮氨酸或甲基丙氨酸；式Ia的化合物 其中W’為MeBmt、二氫MeBmt或8’-羥基-MeBmt；X為αAbu、纈氨酸、蘇氨酸、Nva或0-甲基蘇氨酸(Me0Thr)；R’為Sar、(D)-甲基絲氨酸、(D)-甲基丙氨酸，或(D)-甲基絲氨酸(O乙?；?；Y’為甲基亮氨酸、γ-羥基-甲基亮氨酸、甲基異亮氨酸、甲基纈氨酸、甲基蘇氨酸、甲基丙氨酸、MeaIle或MeaThr；N-乙基纈氨酸、N-乙基異亮氨酸、N-乙基蘇氨酸、N-乙基苯丙氨酸、N-乙基酪氨酸或N-乙基蘇氨酸(O乙?；?Z為纈氨酸、亮氨酸、甲基纈氨酸或甲基亮氨酸；且Q’為甲基亮氨酸、γ-羥基-甲基亮氨酸，或甲基丙氨酸；或式II的化合物 其中Wa為 其中Ra為式Ic或Id的殘基 或-CH2-SH-R’4Id其中R4為C1-4烷硫基、氨基C1-4烷硫基、C1-4烷基氨基C1-4烷硫基、二C1-4烷基氨基C1-4烷硫基、嘧啶硫基、噻唑硫基、N-C1-4烷基咪唑硫基、羥基C1-4烷基苯硫基、羥基C1-4烷基苯氧基、硝基苯氨基或2-氧代嘧啶-1-基，且R’4為C1-4烷基，Xa為Abu；Ra為-NMe-CH(Rb)-CO-，其中Rb為H或-S-Alk-R0，其中Alk-R0為甲基；或Alk為直鏈或支鏈C2-6亞烷基或C3-6環(huán)亞烷基且R0為H；OH；COOH；C2-5烷氧基-羰基；NR1R2，其中R1和R2均獨(dú)立選自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C3-6環(huán)烷基和苯基，其各自任選由鹵素、C1-4烷氧基、C2-5烷氧基羰基、氨基、C1-4烷基氨基和/或二C1-4烷基氨基，以及芐基和雜環(huán)基所取代，所述芐基和雜環(huán)基為飽和或不飽和且含有5或6個(gè)環(huán)成員及1至3個(gè)雜原子；或R1和R2與它們相連的氮原子形成一個(gè)4至6元雜環(huán)，其可以含有另一個(gè)選自氮、氧和硫的雜原子，且任選由C1-4烷基、苯基或芐基所取代；或者R1和R2各自獨(dú)立為式Ib的基團(tuán) 其中R1和R2如上定義，R3為H或C1-4烷基，且n為2至4的整數(shù)；Ya為甲基亮氨酸或γ-羥基-甲基亮氨酸；Za為纈氨酸；且Qa為甲基亮氨酸，前提是當(dāng)Ya為甲基亮氨酸時(shí)Rb不為H，或其可藥用鹽。
5.用于預(yù)防或治療黃病毒科感染或黃病毒科誘發(fā)的疾病的藥物組合物，其包含權(quán)利要求1的環(huán)孢菌素及其一種或多種可藥用的稀釋劑或載體。
6.藥物組合，其包括a)第一種藥物，其是權(quán)利要求1的環(huán)孢菌素，以及b)具有抗黃病毒特性的共用藥物。
7.用于預(yù)防或治療黃病毒科感染或黃病毒科誘發(fā)的疾病的藥物組合，其包含a)第一種藥物，其是權(quán)利要求1的環(huán)孢菌素，以及b)選自具有抗黃病毒特性的藥物、抗纖維化藥物、免疫調(diào)節(jié)劑或S1P受體激動(dòng)劑的共用藥物。
8.權(quán)利要求6的藥物組合，其中具有抗黃病毒特性的共用藥物選自干擾素、利巴韋林、白介素、NS3蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、菲醌、噻唑烷衍生物、噻唑烷、N-苯甲酰苯胺、解旋酶抑制劑、聚合酶抑制劑、核苷類似物、膠霉毒素、淺藍(lán)菌素、反義硫代磷酸酯寡脫氧核苷酸、IRES依賴性翻譯抑制劑以及核酶。
9.預(yù)防或治療需要其的受試者中黃病毒科感染或黃病毒科誘發(fā)的疾病的方法，其包括向所述受試者施用治療有效量的權(quán)利要求1的環(huán)孢菌素。
10.抑制培養(yǎng)基中黃病毒科病毒復(fù)制的方法，其包括向培養(yǎng)基中加入有效量的權(quán)利要求1的環(huán)孢菌素。
11.抑制需要其的受試者中黃病毒科病毒復(fù)制的方法，其包括向該受試者施用治療有效量的權(quán)利要求1的環(huán)孢菌素。
12.權(quán)利要求9或10的方法，其包括同時(shí)或依次共同施用治療有效量的如權(quán)利要求1定義的環(huán)孢菌素以及選自具有抗黃病毒特性藥物、抗纖維化藥物、免疫調(diào)節(jié)劑或S1P受體激動(dòng)劑的共用藥物。
13.權(quán)利要求12的方法，其中具有抗黃病毒特性的共用藥物選自干擾素、利巴韋林、白介素、NS3蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、菲醌、噻唑烷衍生物、噻唑烷、N-苯甲酰苯胺、解旋酶抑制劑、聚合酶抑制劑、核苷類似物、膠霉毒素、淺藍(lán)菌素、反義硫代磷酸酯寡脫氧核苷酸、IRES依賴性翻譯抑制劑以及核酶。
全文摘要
公開(kāi)了如此處定義的式(I)、(Ia)或(II)的非免疫抑制性的結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素，其性質(zhì)可用于預(yù)防或治療黃病毒科感染以及黃病毒科病毒誘發(fā)的疾病。
文檔編號(hào)A61P1/16GK101084005SQ200580043992
公開(kāi)日2007年12月5日 申請(qǐng)日期2005年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月23日
發(fā)明者B·魏德曼 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司