專利名稱：與抗病毒免疫相關(guān)的豬isg60基因的tpr結(jié)構(gòu)基序和細(xì)胞定位的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于家畜基因工程領(lǐng)域，具體涉及與豬抗病毒免疫相關(guān)基因結(jié)構(gòu)基序。
背景技術(shù)：
豬是全球最為重要的畜禽產(chǎn)品之一。豬瘟是豬的一種有重大經(jīng)濟(jì)意義的烈性傳染病，全世界每年因?yàn)樨i瘟造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。因此研究豬的抗豬瘟病毒免疫具有重大意義。豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus)是豬瘟的病原，潛伏期小時(shí)，其病毒粒子呈圓形，屬于黃病毒科瘟病毒屬，大小為38 44nm，核衣殼是立體對(duì)稱二十面體，氯化銫中浮密度1. 15 1. 17g/ml，有包膜，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制。豬瘟病毒危害豬和野豬，俗稱“爛腸瘟”，是一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，主要特征是高溫、微血管變性而引起全身出血、壞死、梗塞。豬瘟對(duì)豬危害極為嚴(yán)重，會(huì)造成養(yǎng)豬業(yè)重大損失。自1933年在美國俄亥俄州發(fā)現(xiàn)豬瘟病以來，豬瘟一直是威脅世界養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一，每年給各國造成高達(dá)幾十億美元的損失，我國每年的養(yǎng)豬量約為10億頭，豬的死亡率超過10%，死亡的第一大原因就是豬瘟，直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)40億元。目前對(duì)豬瘟的防治方法是保持豬舍干燥、清潔，夏季注意通風(fēng)，豬舍、用具經(jīng)常消毒。注意氣候變化，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理。早發(fā)現(xiàn)，早隔離，早治療。最近幾年，人們開始研究抗豬瘟病毒基因，并采用克隆方法表達(dá)，發(fā)表了一些文獻(xiàn)，例如題名世界首例“帶有抗豬瘟病毒基因的克隆豬”誕生作者王浩然刊名
中國獸醫(yī)學(xué)報(bào).2008 (9).文摘2008年9月9日，世界首例“帶有抗豬瘟病毒基因的克隆豬”在位于中國長春的吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部誕生。這標(biāo)志著人類首次培育的“帶有抗豬瘟病毒基因的克隆豬”獲得了成功。9月9日17:40至19:10，在吉林大學(xué)原種豬場(chǎng)，3頭“帶有抗豬瘟病毒基因的克隆豬”先后順利誕生，體質(zhì)量分別為1 050、1 100和550g。豬瘟是一種嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)的傳染病。為了培育出能夠抗豬瘟病毒的豬，以吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部畜牧獸醫(yī)學(xué)院賴良學(xué)教授為首席專家和軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所的專家共同組成的課題組，在國家自然科學(xué)基金資助的基礎(chǔ)上，經(jīng)過近2年時(shí)間的協(xié)作攻關(guān)，將能抑制豬瘟病毒的基因轉(zhuǎn)染到“中國實(shí)驗(yàn)小型豬”胎兒成纖維細(xì)胞內(nèi)，并以此體細(xì)胞進(jìn)行核移植制備豬克隆胚胎， 將此胚胎移植到杜洛克代孕母豬體內(nèi)，懷孕114d后順利產(chǎn)出3頭健康的克隆仔豬。經(jīng)對(duì)仔豬體細(xì)胞進(jìn)行基因檢測(cè)，證實(shí)該克隆豬的細(xì)胞帶有所轉(zhuǎn)入的抗豬瘟病毒基因。進(jìn)一步的抗病毒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中。世界首例“帶有抗豬瘟病毒基因的克隆豬”誕生。題名豬瘟病毒衣殼蛋白靶向核酸酶表達(dá)系統(tǒng)的建立及鑒定作者周斌劉珂陳溥言機(jī)構(gòu)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，刊名病毒學(xué)報(bào).2008，M(6) :451-45文摘根據(jù)豬瘟病毒衣殼蛋白(C)基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物， RT-PCR擴(kuò)增獲得編碼豬瘟病毒衣殼蛋白的C基因，將其插入到含有葡萄球菌核酸酶(SN) 基因的真核表達(dá)載體ρ⑶NA-SN中，篩選獲得重組質(zhì)粒ρ⑶NA-C-SN。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染豬腎細(xì)胞 (PK-15)，并經(jīng)G418穩(wěn)定篩選，通過RT-PCR、免疫印跡和間接免疫熒光鑒定表達(dá)的融合蛋白，體外DNA消化試驗(yàn)檢測(cè)核酸酶活性。結(jié)果表明融合蛋白C-SN在H(-15細(xì)胞中獲得了穩(wěn)定表達(dá)，能夠被兔抗豬瘟病毒衣殼蛋白多抗所識(shí)別，并具有良好的核酸酶活性，能夠?qū)NA 進(jìn)行切割。同時(shí)，穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白C-SN的H(-15細(xì)胞系能夠有效抑制豬瘟野毒的增殖， 使其感染性降低IO2 IO3倍。這些結(jié)果為進(jìn)一步將衣殼蛋白靶向病毒滅活策略應(yīng)用于抵抗豬瘟病毒感染奠定了基礎(chǔ)。盡管目前使用的豬瘟疫苗對(duì)豬有很好的保護(hù)作用，但豬瘟卻始終無法得到徹底的根除，而且豬瘟病毒的感染在臨床上也出現(xiàn)了新的特點(diǎn)，除了一般看到的急性臨床癥狀外， 還有一些不表現(xiàn)明顯臨床癥狀的溫和型豬瘟或亞臨床型豬瘟，但抗體檢測(cè)和基因檢測(cè)都呈陽性，也就是所謂的持續(xù)性感染狀態(tài)，長期攜帶病毒而不表現(xiàn)臨床癥狀的豬就成為重要的傳染源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與豬抗病毒免疫相關(guān)基因結(jié)構(gòu)基序，以通過該結(jié)構(gòu)基序，找出能夠用于研究豬瘟病毒感染機(jī)制，并通過揭示該蛋白基因抗豬瘟病毒的機(jī)制，開發(fā)一種治療豬瘟的藥物。本發(fā)明人從經(jīng)過干擾素刺激的豬腎細(xì)胞H(-15中抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增， 得到了一種與豬抗病毒免疫相關(guān)的ISG60基因，該ISG60基因的TPR(tetratriCOp印tide repeat)結(jié)構(gòu)基序含有病毒感染相關(guān)的調(diào)控元件序列，與現(xiàn)有報(bào)道的豬基因的IPR結(jié)構(gòu)沒有顯著同源性。ISG60基因是由1530個(gè)堿基組成，含有完整的開放閱讀框(Open Reading Frame, 0RF)，它的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。本發(fā)明人首先克隆了豬ISG60基因的策略和ISG60基因的特異性引物，對(duì)病毒、細(xì)菌感染有免疫作用的I型干擾素介導(dǎo)刺激機(jī)體產(chǎn)生的豬ISG60基因，以及通過間接免疫熒光的方法(用倒置熒光顯微鏡觀察)鑒定ISG60基因在冊(cè)-15細(xì)胞中定位的策略，從而為進(jìn)一步構(gòu)建各種表達(dá)載體，用于研究ISG60基因抗病毒的反應(yīng)機(jī)理以及病毒與宿主間互相作用奠定基礎(chǔ)。所述的抗病毒免疫相關(guān)的豬ISG60基因的IPR結(jié)構(gòu)基序和細(xì)胞定位，包括以下的步驟(1)基因在染色體上的定位；(2)基因片段的獲得；(3)載體構(gòu)建；(4)基因在細(xì)胞上的定位所述的基因在染色體上的定位，首先是采用豬全基因組芯片分析豬外周血淋巴細(xì)胞的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)ISG60基因在豬瘟病毒感染后表達(dá)量增多，在感染后6天該基因的表達(dá)量最多。通過將ISG60基因的EST序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的豬基因組序列進(jìn)行比對(duì)， 獲得了 ISG60基因在豬染色體上的定位。所述的基因片段的獲得，首先是采用重組人I型干擾素IFN- α 2b刺激豬腎上皮細(xì)胞H(-15細(xì)胞系介導(dǎo)產(chǎn)生ISG60基因。干擾素是一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白質(zhì)，主要分為I型、II型干擾素，其中α、β干擾素屬于I型干擾素，Y干擾素屬于II型干擾素， 干擾素中主要成分是I型干擾素。干擾素刺激豬腎細(xì)胞冊(cè)-15后，ISG60基因的mRNA被大量的轉(zhuǎn)錄，由于細(xì)胞含有RNA、DNA和蛋白質(zhì)等分子，需要從其中抽提出細(xì)胞總RNA，而ISG60 基因的mRNA就包含在細(xì)胞總RNA中。干擾素與細(xì)胞上的干擾素受體結(jié)合后，激活JAK-STAT信號(hào)通路，使STATl與STAT2異源二聚體、干擾素調(diào)節(jié)因子IRF9形成ISGF3的復(fù)合物，ISGF3 復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，與細(xì)胞基因組上干擾素刺激應(yīng)答元件ISRE結(jié)合，啟動(dòng)干擾素刺激基因的轉(zhuǎn)錄。用Trizol抽提誘導(dǎo)后的PK-15的總RNA。1Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，可以直接從細(xì)胞或組織中提取總默其含有苯酚、異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞并抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。取干擾素刺激后的H(-15細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，轉(zhuǎn)移至 1. 5mL EP管，Trizol 600 μ L裂解，上下震蕩混勻，室溫靜置lOmin。加入氯仿200 μ L，上下震蕩20s混勻，室溫靜置:3min。4°C 12，OOOrpm離心lOmin，吸取500 μ L上層RNA溶液至新的EP管，加入500 μ L異丙醇，上下輕柔混勻，室溫下或4°C靜置lOmin。4°C 12，OOOrpm離心lOmin，棄掉上清，加入75%乙醇500yL，上下混勻，4°C 12，OOOrpm離心5min。重復(fù)上述步驟一次。最后50°C IOmin晾干EP管中的RNA，用無RNAase的水溶解。用寡聚核苷酸oligo dT16作為反轉(zhuǎn)錄的引物將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)豬全基因組芯片上的ISG60 5’端的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)序列，利用計(jì)算機(jī)軟件01igo6，設(shè)計(jì)了針對(duì)ISG60基因的特異性引物。用特異性引物PCR擴(kuò)增ISG60基因，并克隆至pMDIS-T載體上，測(cè)序鑒定，確定獲得了 ISG60的基因片段。所述載體的構(gòu)建是將編碼6 XHis的核苷酸標(biāo)記的ISG60基因，亞克隆至ρ⑶NA3. O 真核載體上，將構(gòu)建好的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞。所述ISG60基因在細(xì)胞上的定位，首先是用重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染冊(cè)-15細(xì)胞，然后采用間接免疫熒光技術(shù)觀察ISG60基因在H(-15細(xì)胞上的定位。間接免疫熒光方法吸掉轉(zhuǎn)染36小時(shí)后的H(-15細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌3次細(xì)胞，甲醛與甲醇1 1體積固定，PBS 洗滌3次細(xì)胞；用6 Xhis單克隆抗體37°C孵育60min，PBS洗滌3次細(xì)胞；用FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG 37°C孵育60min，PBS洗滌3次細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。所述IPR結(jié)構(gòu)基序的獲得是將克隆的豬ISG60基因測(cè)序鑒定后，得到包括完整ORF 的核苷酸序列，并推導(dǎo)出了相應(yīng)的氨基酸序列，按已知方法，例如網(wǎng)站(http://tprpred. tuebingen. mpg. de/tprpred)上介紹的TPR基序預(yù)測(cè)方法，對(duì)ISG60基因的推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行IPR基序預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，ISG60基因含7個(gè)IPR結(jié)構(gòu)基序。本發(fā)明首次提供了豬ISG60基因的策略和ISG60基因的特異性引物，本發(fā)明的目的是提供對(duì)病毒、細(xì)菌感染有免疫作用的I型干擾素介導(dǎo)刺激機(jī)體產(chǎn)生的豬ISG60基因，以及鑒定ISG60基因在PK-15細(xì)胞中定位的策略，從而為進(jìn)一步構(gòu)建各種表達(dá)載體，用于研究 ISG60基因抗豬瘟或其它病毒的反應(yīng)機(jī)理以及病毒與宿主間互相作用奠定基礎(chǔ)，具有重大
眉、οISG60基因?yàn)镮型干擾素刺激機(jī)體介導(dǎo)產(chǎn)生的基因，與宿主抗病毒免疫作用有關(guān)。 Tra結(jié)構(gòu)基序一般是由34個(gè)氨基酸殘基組成的序列單元，約3-16串聯(lián)重復(fù)排列組成。IPR 結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，在一些情況下為特異性識(shí)別靶蛋白的特征，在多蛋白復(fù)合體的組裝中發(fā)揮作用。IPR基序所在的蛋白家族參與許多重要的生命活動(dòng)如細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄控制、線粒體和過氧化物酶體的運(yùn)輸?shù)?。TPR(tetratricop印tide repeat)結(jié)構(gòu)基序的蛋白發(fā)現(xiàn)存在于細(xì)菌、藍(lán)藻、酵母和其它真菌、昆蟲、植物、動(dòng)物，包括人類中，并在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體和過氧化物酶體中亞細(xì)胞定位。
IPR基序作為與細(xì)胞分裂周期相關(guān)的蛋白反應(yīng)元件最初在酵母中發(fā)現(xiàn)(Hirano T et,al 1990 ；Sikorski RS, et al. 1990)。IPR結(jié)構(gòu)基序一般是由；34個(gè)氨基酸殘基組成的序列單元(Lamb JR et al 1995)，在基序中位點(diǎn) 4 (W/L/F)，7 (L/I/M)，8 (G/A/S)，11 (Y/L/F)， 20 (A/S/E)，24 (F/Y/L)，27 (A/S/L)，32 (P/K/E)的這8個(gè)氨基酸殘基顯示出較高頻率的保守性(Sikorski RS et al. 1990)。目前研究顯示，IPR基序的三維構(gòu)象表明一個(gè)IPR結(jié)構(gòu)包含兩個(gè)反向平行的α -螺旋(Das AK, et al. 1998)，IPR基序串聯(lián)排列產(chǎn)生一個(gè)右手螺旋的兩性通道結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可能容納靶蛋白的互補(bǔ)區(qū)域。大量證據(jù)表明，IPR基序?qū)Π閭H蛋白的功能(Smith DF1993 ； Chang H-CJ，1994 ；)、細(xì)胞周期(Lamb JR, 1994 ；Sikorski RS, 1993 ；Samejima I，1994)、轉(zhuǎn)錄(Smith RL 1995)、蛋白運(yùn)輸復(fù)合物(Dodt G 1995 ；Brocard C 1994 ；Fransen M, 1995 ； van der Leij I，1993)有重要作用。IPR基序可能表現(xiàn)為一種古老的蛋白與蛋白作用的組件，被不同的蛋白招募并賦予特異的功能。I型干擾素在抗病毒感染中發(fā)揮著重要作用。豬ISG60基因是由I型干擾素刺激產(chǎn)生的免疫因子之一，ISG60基因可能通過自身IPR結(jié)構(gòu)域參與細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄控制、 線粒體和過氧化物酶體的運(yùn)輸而發(fā)揮抗病毒免疫作用。以下是ISG60基因測(cè)序得到的核苷酸序列、推導(dǎo)的氨基酸序列和IPR結(jié)構(gòu)基序序列，列表如下豬測(cè)序得到的核苷酸序列(1)序列特征長度1530堿基對(duì)類型DNA鏈型雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性(2)分子類型核苷酸(3)序列描述atgagtgaggtcaacaagaattctctggagaagatccttccacagctgaaatgccatttcacatggaac ttacctaaggaagaacatgtctggcatgatctagaagacagagtgtgtaaccagactgaacttttaaactctgagttcaaagcgacaatgt acaacttgttggcttacataaaacatttaaatggtcaaaatgaggctgccctggaatacttacagcaagctgaagagtttatccagcaagaacacact gaccaggcagaaatcagaagcctggttacctggggaaactatgcctgggtctattatcacctgggaagactctcagaagctcaaatttatgta gacaaggtgaaacaagtatgtgagaagttctcaaatccttacagtattgagtgtccggagcttgactgtgaagaaggatggacactgctaaagtgt ggaggaaaacaaattgaaaaggcaaaggtgtattttgagaaggctctggaagagaaacccgacaacccagaattctcctctggactggccatcgc gatgtactttctgaatggcaaaccagcgcagcagtcctccgtggatattctcaaggaggccattgagttgagccctgacaatcagtatatcaaag ttctcttggccctgacattgcagaaga
tgaatgaagaagctgaaggggaagagttggttgtagaggccctggaaaaagctcctcgccaaacagatg tcctccgcagtgcagccaaattttaccgagtaaagggtgatctagacaaagctattgaactatttctaacggcactggaatccacaccaaacaa tggctacctctatcaccagattgcatgctgctatagggcaaaagtcaaacaacttctggatgcaggagaatctgaagctagcaggaatagagagat aattgaagaactacggaaatatgccaaggactatgtgaataaagctattgaaaagggactaaatcctctgtatgcatattctgatagcactgag ctcctggaaataggagaatgtcatcagacagctttcagtaaggagctccctagcactgaggcgcaacaacttcatcagcgctcttgcaactctcagg agtatcacgagaagtctgaagacactgcagcecaacagtctttagaaaatttgtccataaacacgaaatcaactgagaaggaaaagatgaaatac caactacagaatggagctgcaaatcagettccacaaagtgcaccaaattcatggtatctccgaggattaattcacaagatgaatggagacctgc tgcaagcagccgcatgctatgagaaggaactgggctacctactaaggaacagcccttcaggcataggcagcattttccagccagcatctgagctg gaagaaggcactgaggaaatggaccagggtgcagatggctctactctcagggagcttcctgaccctggggctgacagagacaggaaggaaagg aaaggaacagagagtcagggcgcctggaatagtggctga豬ISG60基因推導(dǎo)氨基酸序列(1)序列特征長度509氨基酸類型多肽鏈型單鏈幾何結(jié)構(gòu)立體(2)分子類型蛋白質(zhì)(3)序列描述MetSer GluValAsnLysAsn SerLeuGluLys lieLeuProGlnLeuLysCysHisPheThrTrpAsnLeuProLysGlu GluHisValTrp HisAspLeuGluAspArgValCysAsnGlnThrGluLeuLeuAsnSer GluPheLysAla ThrMetTyrAsnLeuLeuAlaTyrIleLysHisLeuAsnGlyGlnAsn GluAlaAlaLeu GluTyrLeuGlnGlnAlaGluGluPhelieGlnGlnGluHisThrAsp GlnAlaGlulie ArgSerLeuValThrTrpGlyAsnTyr AlaTrpValTyrTyrHisLeu GlyArgLeuSer GluAlaGlnlieTyrValAspLysValLysGlnValCysGluLysPhe SerAsnProTyr SerlieGluCysProGluLeuAspCys GluGluGlyTrpThrLeuLeu LysCysGlyGly LysGlnlieGluLysAlaLysValTyr PheGluLysAlaLeuGluGlu LysProAspAsn ProGluPheSerSerGlyLeuAlaIleAlaMetTyrPheLeuAsnGly LysProAlaGln GlnSerSerValAsplieLeuLysGlu AlalieGluLeuSerProAsp AsnGlnTyrlie LysValLeuLeuAlaLeuThrLeuGln LysMetAsnGluGluAlaGlu GlyGluGluLeu ValValGluAlaLeuGluLysAlaProArgGlnThrAspValLeuArgSerAlaAlaLysPheTyrArgValLysGlyAspLeuAspLysAlalieGluLeuPheLeuThrAlaLeuGluSerThrProAsnAsnGlyTyrLeuTyrHisGlnlieAlaCysCysTyrArgAlaLysValLysGlnLeuLeuAspAlaGlyGluSerGluAlaSerArgAshArgGlulielieGluGluLeuArgLysTyrAlaLysAspTyrValAsnLysAlalieGluLysGlyLeuAsnProLeuTyrAlaTyrSerAspSerThrGluLeuLeuGlulieGlyGluCysHisGlnThrAlaPheSerLysGluLeuProSerThrGluAlaGlnGlnLeuHisGlnArgSerCysAsnSerGlnGluTyrHisGluLysSerGluAspThrAlaAlaGlnGlnSerLeuGluAsnLeuSerlieAsnThrLysSerThrGluLysGluLysMetLysTyrGlnLeuGlnAsnGlyAlaAlaAsnGlnLeuProGlnSerAlaProAsnSerTrpTyrLeuArgGlyLeulieHisLysMetAsnGlyAspLeuLeuGlnAlaAlaAlaCysTyrGluLysGluLeuGlyTyrLeuLeuArgAsnSerProSerGlylieGlySerIlePheGlnProAlaSerGluLeuGluGluGlyThrGluGluMetAspGlnGlyAlaAspGlySerThrLeuArgGluLeuProAspProGlyAlaAspArgAspArgLysGluArgLysGlyThrGluSerGln Gly Ala Trp Asn Ser.GlyISG60基因IPR結(jié)構(gòu)基序氨基酸序列(1)序列特征a.長度34氨基酸b.類型多肽c.鏈型單鏈d.幾何結(jié)構(gòu)立體e.數(shù)量7 個(gè)(2)序列描述
氨基酸起始位點(diǎn)
氨基酸終止位點(diǎn)
TPR1 51Ala Thr Mel Tyr Asn Leu Leu AIa Tyr lie Lys His Leu Asn Gly Gln Asn Glu Ala Ala Lcu Glu Tyr Leu Gln Gln Ala Glu GIu Phe lie GIn GIn GIu84
TPR2 94Leu Val Thr Trp Gly Asn Tyr Ala Trp Val Tyr Tyr His Leu Gly Arg Leu Ser Glu Ala Gln He Tyr Val Asp Lys Val Lys Gln Val Cys Glu Lys Phe127
TPR3 138Leu Asp Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Lcu Lys Cys Gly Gly Lys Gbi lie GIu Lys Ala Lys Val Tyr Phe Glu Lys AIa Leu Glu Glu Lys Pro Asp Asn171
TPR4 175Ser Ser Gly Leu Ala lie Ala Met Tyr Phe Leu Asn Gly Lys Pro Ala Gln Gln Ser Ser Val Asp lie Leu Lys Glu Ala lie Glu Leu Ser Pro Asp Asn208
TPR5 209Gln Tyr Ue Lys Val Lcu Leu Ata Leu Tlir Lea Gln Lys Met Asn Glu Glu Ala Glu Gly Glu Glu Leu Val Val Glu Ala Leu Glu Lys Ala Pro Arg Gln242
TPR6 243Thr Asp Val Leu Arg Ser AIa Ala Lys Phe Tyr Arg Val Lys GIy Asp Leu Asp Lys AIa lie Glu Leu Phe Leu Thr Ala Leu GIu Ser Tlir Pro Asn Asn276
TPR7 418Pro Asn Ser Trp Tyr Leu Aig Gly Leu lie His Lys Met Asn Gly Asp Leu Leu GIn Ala Ala Ala Cys Tyr Glu Lys GIu Lcu Gly Tyr Leu Leu Arg Asn451本發(fā)明所述的ISG60基因的核苷酸序列、氨基酸序列及IPR結(jié)構(gòu)基序序列，其功能
與突變的氨基酸序列相同，突變形式包括缺失、無義、插入、錯(cuò)義。含有本發(fā)明所述的ISG60基因在細(xì)胞中定位的策略。含有本發(fā)明所述的構(gòu)建豬ISG60基因抗病毒研究所用的表達(dá)載體的方法。本發(fā)明的原理是干擾素是一種能夠抗病毒的蛋白，其通過刺激細(xì)胞產(chǎn)生許多的
下游抗病毒蛋白發(fā)揮抗病毒作用，而ISG60是干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的下游抗病毒蛋白之一。IPR
基序的三維構(gòu)象表明一個(gè)IPR結(jié)構(gòu)包含兩個(gè)反向平行的α-螺旋，IPR基序串聯(lián)排列產(chǎn)生
10一個(gè)右手螺旋的兩性通道結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為一種蛋白與蛋白作用的組件，ISG60蛋白通過自身IPR結(jié)構(gòu)基序重復(fù)序列參與抗病毒作用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、本發(fā)明提供了與抗病毒免疫相關(guān)的豬ISG60基因的TPR(tetratriCOp印tide repeat)結(jié)構(gòu)基序，該ISG60基因的TPR結(jié)構(gòu)基序含有病毒感染相關(guān)的調(diào)控元件序列，與現(xiàn)有報(bào)道的豬基因的TPR結(jié)構(gòu)沒有顯著同源性。2、本發(fā)明還具體地涉及到克隆豬ISG60基因的策略，提供了鑒定ISG60基因在細(xì)胞中的定位，通過ISG60基因的IPR結(jié)構(gòu)基序，能夠用于研究豬瘟病毒感染機(jī)制，并通過揭示該蛋白基因抗豬瘟病毒的機(jī)制，開發(fā)一種治療豬瘟的藥物。3、有報(bào)道指出，通過酵母雙雜交的方法發(fā)現(xiàn)鼠SGT蛋白與細(xì)小病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白 NSl能相互作用，這種鼠SGT蛋白中含有另一種富含谷氨酰胺的IPR基序。目前國內(nèi)外研究中，對(duì)包含IPR基序的ISG60基因的抗病毒免疫作用的研究尚未被發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明通過基因芯片雜交方法，將感染豬瘟石門病毒后豬外周血淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜與未感染病毒的對(duì)照組相比較，發(fā)現(xiàn)包含IPR基序的干擾素刺激基因ISG60在實(shí)驗(yàn)組中大量上調(diào)，ISG60基因可能通過TPR結(jié)構(gòu)基序改變細(xì)胞對(duì)病毒的特異性反應(yīng)。4、通過預(yù)測(cè)，確定ISG60基因包含7個(gè)IPR基序，IPR基序的克隆為為進(jìn)一步闡明干擾素途徑的基因表達(dá)調(diào)控和抗病毒機(jī)制提供理論依據(jù)，在抗病毒感染研究中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。


圖1用基因特異性引物PCR擴(kuò)增ISG60基因的瓊脂糖凝膠電泳圖；1 :ISG60 基因擴(kuò)增產(chǎn)物 M :lambda DNA(EcoRI/HindIII)。圖2克隆至pMDIS-T載體上ISG60基因雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；M =Iambda DNA (EcoRI/Hindlll) 1 :pMD_ISG60 載體 Hindlll、BamHI 雙酶切。圖3對(duì)ISG60基因的ORF的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；M =Iambda DNA (EcoRI/Hindlll) 1 :PCR 擴(kuò)增 ISG60 的 ORF 的產(chǎn)物。圖4亞克隆至哺乳動(dòng)物表達(dá)載體PCDNA3. 0上的ISG60基因的雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；M =Iambda DNA(EcoRI/Hindlll) 1 :pCDNA_ISG60 載體 Hindlll、XhoI 雙酶切。圖5鑒定克隆的豬ISG60基因在冊(cè)_15細(xì)胞中的定位，ISG60基因在冊(cè)_15細(xì)胞的細(xì)胞漿表達(dá)。
具體實(shí)施例方式下面的優(yōu)選例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)敘述，但并不意味著限制本發(fā)明的范圍。在本發(fā)明的實(shí)施例中所用到的材料包括H(-15(豬腎細(xì)胞)細(xì)胞系、大腸桿菌(Escherichia coli)株DH5 α為本實(shí)驗(yàn)室保存。M-Mlv reverse transcriptase購自Promega公司。限制性內(nèi)切醇、T4連接醇、Taq 酶、dNTP和PCR擴(kuò)增DNA克隆載體pMD18_T Vector購自TaKaRa公司。6XHis鼠單克隆抗體、膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司。FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG購自sigma公司。DNAMarke購自i^ermentas公司。引物合成、序列測(cè)定委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。Trizol、脂質(zhì)體、pCDNA3. 0載體購自invitrogen公司。熒光倒置顯微鏡購自Nikon 公司。大腸桿菌培養(yǎng)基為普通的LB(蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，超純水 1000ml，pH 7. 0)和LA(瓊脂粉15g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g)培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)用5% CO2 37°C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基使用含10% FBS的DMEM(invitrogen Gibco)。實(shí)施例1、豬ISG60基因的EST序列的染色體的定位采用豬全基因組芯片分析豬外周血淋巴細(xì)胞的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)ISG60基因在豬瘟病毒感染后表達(dá)量增多，在感染后6天該基因的表達(dá)量最多。通過將ISG60基因的EST 序列與NCBI網(wǎng)站http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/數(shù)據(jù)庫進(jìn)行核苷酸blast程序分析， 發(fā)現(xiàn)ISG60基因定位于豬染色體14號(hào)染色體上。實(shí)施例2、豬ISG60基因的克隆首先是采用重組人I型干擾素IFN- α 2b刺激豬腎上皮細(xì)胞冊(cè)_15細(xì)胞系介導(dǎo)產(chǎn)生ISG60基因。干擾素是一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的抗病毒蛋白質(zhì)，主要分為I型、II型干擾素，其中α、β干擾素屬于I型干擾素，Y干擾素屬于II型干擾素，干擾素中主要成分是I型干擾素。干擾素刺激豬腎細(xì)胞H(-15后，ISG60基因的mRNA就被大量的轉(zhuǎn)錄，由于細(xì)胞含有RNA、DNA和蛋白質(zhì)等分子，需要從其中抽提出細(xì)胞總RNA，而ISG60基因的mRNA就包含在細(xì)胞總RNA中。干擾素與細(xì)胞上的干擾素受體結(jié)合后，激活JAK-STAT信號(hào)通路，使 STATl與STAT2異源二聚體、干擾素調(diào)節(jié)因子IRF9形成ISGF3的復(fù)合物，ISGF3復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，與細(xì)胞基因組上干擾素刺激應(yīng)答元件ISRE結(jié)合，啟動(dòng)干擾素刺激基因的轉(zhuǎn)錄。用Trizol抽提誘導(dǎo)后的PK-15的總RNA。1Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，可以直接從細(xì)胞或組織中提取總默其含有苯酚、異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞并抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。取干擾素刺激后的H(-15細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，轉(zhuǎn)移至 1. 5mL EP管，Trizol 600 μ L裂解，上下震蕩混勻，室溫靜置lOmin。加入氯仿200 μ L，上下震蕩20s混勻，室溫靜置:3min。4°C 12，OOOrpm離心lOmin，吸取500 μ L上層RNA溶液至新的EP管，加入500 μ L異丙醇，上下輕柔混勻，室溫下或4°C靜置lOmin。4°C 12，OOOrpm離心lOmin，棄掉上清，加入75%乙醇500yL，上下混勻，4°C 12，OOOrpm離心5min。重復(fù)上述步驟一次。最后50°C IOmin晾干EP管中的RNA，用無RNAase的水溶解。用寡聚核苷酸oligo dT16作為反轉(zhuǎn)錄引物，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)豬全基因組芯片上的ISG60 5’端的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)序列，利用計(jì)算機(jī)軟件01igo6，設(shè)計(jì)了針對(duì)ISG60基因的特異性引物。用特異性引物PCR擴(kuò)增ISG60基因(見圖1)，并克隆至 PMD18-T載體上(見圖2)，測(cè)序鑒定，確定獲得了 ISG60的基因片段。用于特異性擴(kuò)增ISG60基因的特異性引物ISG60-T1 gagaacagaccgccatcaISG60-T2 agccaaggataagacttaggga用于亞克隆構(gòu)建哺乳動(dòng)物真核表達(dá)載體ρ⑶NA-ISG60的引物ISG60-P1 :5，GACCAAGCTTATGAGTGAGGTCAACAAGAATTC 3，ISG60-P2
權(quán)利要求
1.一種與抗病毒免疫相關(guān)的豬ISG60基因的IPR結(jié)構(gòu)基序和細(xì)胞定位，其特征在于 包括以下的步驟(1)基因在染色體上的定位；(2)基因片段的獲得；(3)載體構(gòu)建；(4)基因在細(xì)胞上的定位；(5) IPR結(jié)構(gòu)基序的獲得；所述的基因在染色體上的定位，首先是采用豬全基因組芯片分析豬外周血淋巴細(xì)胞的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)ISG60基因在豬瘟病毒感染后表達(dá)量增多，在感染后6天該基因的表達(dá)量最多，通過將ISG60基因的EST序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的豬基因組序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn) ISG60基因定位于豬14號(hào)染色體上；所述的基因片段的獲得，首先是采用重組人I型干擾素IFN-α 2b刺激豬腎上皮細(xì)胞 PK-15細(xì)胞系介導(dǎo)產(chǎn)生ISG60基因，Trizol抽提誘導(dǎo)后的冊(cè)_15的總RNA，用寡聚核苷酸 oligo dT16作為反轉(zhuǎn)錄的引物將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA ；根據(jù)豬全基因組芯片上的ISG605’ 端的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)序列，設(shè)計(jì)針對(duì)ISG60基因的特異性引物，用特異性引物PCR擴(kuò)增 ISG60基因，并克隆至pMDIS-T載體上，測(cè)序鑒定，確定獲得了 ISG60的基因片段；所述載體構(gòu)建是將編碼6XHis的核苷酸標(biāo)記的ISG60基因，亞克隆至pCDNA3. O真核載體上，將構(gòu)建好的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染H(-15細(xì)胞；所述基因在細(xì)胞上的定位，首先是用重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染冊(cè)-15細(xì)胞，然后采用間接免疫熒光技術(shù)觀察ISG60基因在H(-15細(xì)胞上的定位；所述TPR結(jié)構(gòu)基序的獲得是將克隆的豬ISG60基因測(cè)序鑒定后，得到包括完整ORF的核苷酸序列，并推導(dǎo)出了相應(yīng)的氨基酸序列，按已知IPR基序預(yù)測(cè)方法，對(duì)ISG60基因的推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行TPR基序預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，ISG60基因含7個(gè)IPR結(jié)構(gòu)基序。
2.與抗病毒免疫相關(guān)的豬ISG60基因的IPR結(jié)構(gòu)基序和細(xì)胞定位，其特征在于ISG60 基因測(cè)序得到的核苷酸序列如下(1)豬測(cè)序得到的核苷酸序列①序列特征 長度1530堿基對(duì)類型DNA鏈型雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性②分子類型核苷酸③序列描述atgagtgaggtcaacaagaattctctggagaagatccttccacagctgaaatgccatttcacatggaacttac ctaaggaagaacatgtctggcatgatctagaagacagagtgtgtaaccagactgaacttttaaactctgagttcaaagcgacaatgtacaa cttgttggcttacataaaacatttaaatggtcaaaatgaggctgccctggaatacttacagcaagctgaagagtttatccagcaagaacacactgacc aggcagaaatcagaagcctggttacctggggaaactatgcctgggtctattatcacctgggaagactctcagaagctcaaatttatgtagaca aggtgaaacaagtatgtgagaagttctcaaatccttacagtattgagtgtccggagcttgactgtgaagaaggatggacactgctaaagtgtggaggaaaacaaattgaaaaggcaaaggtgtattttgagaaggctctggaagagaaacccgacaacccagaattctcctctggactggccatcgcgatg tactttctgaatggcaaaccagcgcagcagtcctccgtggatattctcaaggaggccattgagttgagccctgacaatcagtatatcaaagttct cttggccctgacattgcagaagatgaatgaagaagctgaaggggaagagttggttgtagaggccctggaaaaagctcctcgccaaacagatgtcct ccgcagtgcagccaaattttaccgagtaaagggtgatctagacaaagctattgaactatttctaacggcactggaatccacaccaaacaatggc tacctctatcaccagattgcatgctgctatagggcaaaagtcaaacaacttctggatgcaggagaatctgaagctagcaggaatagagagataatt gaagaactacggaaatatgccaaggactatgtgaataaagctattgaaaagggactaaatcctctgtatgcatattctgatagcactgagctcc tggaaataggagaatgtcatcagacagctttcagtaaggagctccctagcactgaggcgcaacaacttcatcagcgctcttgcaactctcaggagta tcacgagaagtctgaagacactgcagcccaacagtctttagaaaatttgtccataaacacgaaatcaactgagaaggaaaagatgaaataccaac tacagaatggagctgcaaatcagettccacaaagtgcaccaaattcatggtatctccgaggattaattcacaagatgaatggagacctgctgca agcagccgcatgctatgagaaggaactgggctacctactaaggaacagcccttcaggcataggcagcattttccagccagcatctgagctggaag aaggcactgaggaaatggaccagggtgcagatggctctactctcagggagcttcctgaccctggggctgacagagacaggaaggaaaggaaag gaacagagagtcagggcgcctggaatagtggctga(2)豬ISG60基因推導(dǎo)氨基酸序列①序列特征長度509個(gè)氨基酸類型多肽鏈型單鏈幾何結(jié)構(gòu)立體②分子類型蛋白質(zhì)(3)序列描述MetSerGluVaAsn Lys Asn Ser Leu Glu Lys lie Leu Pro Gln Leu Lys CysHisPheThrTrpAsnLeuProLysGluGluHisVal Trp His Asp Leu Glu Asp Arg ValCysAsnGlnThrGluLeuLeuAsnSerGluPheLys Ala Thr Met Tyr Asn Leu Leu AlaTyrIleLysHisLeuAsnGlyGlnAsnGluAlaAla Leu Glu Tyr Leu Gln Gln Ala GluGluPheIleGlnGlnGluHisThrAspGlnAlaGlu lie Arg Ser Leu Val Thr Trp GlyAsnTyr AlaTrpValTyrTyrHisLeuGlyArgLeu Ser Glu Ala Gln lie Tyr Val AspLysValLysGlnValCysGluLysPheSerAsnPro Tyr Ser lie Glu Cys Pro Glu LeuAsp
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的與抗病毒免疫相關(guān)的豬ISG60基因的IPR結(jié)構(gòu)基序和細(xì)胞定位，其特征在于其序列的一致性達(dá)到60%以上的IPR結(jié)構(gòu)基序的序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了與抗病毒免疫相關(guān)的豬ISG60基因的TPR(tetratricopeptide repeat)結(jié)構(gòu)基序，ISG60基因的TPR結(jié)構(gòu)基序含有病毒感染相關(guān)的調(diào)控元件序列，與現(xiàn)有報(bào)道的豬基因的TPR結(jié)構(gòu)沒有顯著同源性。本發(fā)明還具體地涉及到豬ISG60基因的策略，鑒定了ISG60基因在細(xì)胞中的定位，通過ISG60基因的TPR結(jié)構(gòu)基序，能夠用于研究豬瘟病毒感染機(jī)制，并通過揭示該基因抗豬瘟病毒的機(jī)制，開發(fā)一種治療豬瘟的藥物。
文檔編號(hào)C07K14/47GK102559688SQ20111018005
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月30日
發(fā)明者孫石開, 尹珊, 李延生, 李曉寧, 李曉泉, 羅廷榮, 蘇麗娟, 蔡新斌 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)