專利名稱：Hsp60的肽和apl型衍生物及藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及60kDa的人熱休克蛋白(縮寫為hHsp60)，以及源自其的變異性肽配體(altered peptde ligands，縮寫為APL)。本發(fā)明還涉及含有這樣的肽的藥物組合物，其用于治療類風濕性關節(jié)炎(RA)。
背景技術：
RA是一種病因學未知的自身免疫疾病，該疾病影響世界上大約1％的人口。其為一種特征在于關節(jié)的慢性炎癥的綜合征，盡管也可以觀察到全身性的表現(xiàn)。這種疾病開始是滑膜的炎癥并常常引起相鄰軟骨和骨的侵蝕性破壞，這導致80％的患者中度身體無力和導致早的死亡(Moctezuma，J.F.(2002)Manifestaciones articulares de laArtritis Reumatide.Revista Mexicana de Reumatolog ía17211-219)。RA可以在任何年齡出現(xiàn)，不區(qū)分種族或人種群，但是其開始的最大發(fā)生率出現(xiàn)在25和55歲之間。在患有RA的人中，女性超過男性，比例為3∶1(Emery，P.(2002)Early referralrecommendation for newly diagnosed rheumatoid arthritisevidence based development of to clinical guide.Ann Rheum Dis.61290-297)。
RA的原因未知。其為一種與遺傳、環(huán)境、免疫學和激素因素的存在有關的疾病。某些基因在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用，與傾向于形成RA相關。同時，一些具有RA的人不具有這些基因，并且其他具有這些基因的人從未形成該疾病。因此，有人提出遺傳背景是重要的但不是決定性的。
在自身免疫疾病的模型中，具有與自身抗原相似的結構的微生物抗原可以引起對自身抗原的交叉應答，產(chǎn)生耐受機制的改變并永久保持自身免疫應答。通常來說，由感染性因子產(chǎn)生的在組織中的損傷和局部壞死可以揭示出自身抗原隱蔽表位，其能夠激活自身反應性T細胞(Albert，L.J.(1999)Mechanisms of DiseaseMolecular Mimicryand autoimmunity.N Engl J Med 3412068-2074)。
在耐受和免疫/自身免疫之間的T淋巴細胞轉變階段在不同水平上受到調節(jié)。該轉變中的兩個重要參數(shù)是抗原呈遞細胞(縮寫為APC)的成熟狀態(tài)和由免疫系統(tǒng)所檢測到的自身抗原的水平(Ohashi，P.S.(2002)Making and breaking tolerance.Current Opinion inImmmunology 14744-759)。
當前試圖解釋自身免疫疾病發(fā)展的一種假說認為當自身的肽遞呈至它們時，在缺乏先天免疫系統(tǒng)的信號或危險信號時APC保持相對不成熟并誘導自身反應性T細胞的耐受(Steiman，R.M.(2000)Theinduction of tolerance by dendritic cells that have capturedapoptotic cells.J Exp Med.191411-416)。外周耐受的誘導也與自身抗原的濃度相關(Kurts，C.(1999)CD8 T cell ignorance ortolerance to islet antigens depends on antigen dose.PNAS9612703-12707)。由于它們表達水平的增加而引起的自身抗原遞呈的增加，使得它們被自身反應性無知T細胞檢測到。如果自身抗原的水平在缺少促進APC成熟的事件時增加，則對這些抗原的耐受得到保持，否則，這發(fā)生在存在促炎信號或其他促進APC成熟的事件時，則無知T細胞的激活打破了這種耐受，并且發(fā)展出了自身免疫疾病(Janeway，C.A.(2002)Innate immune recognition.Annu RevImmunol.20197-216)。
已經(jīng)成為研究RA起因的目標的感染性因子尤其是EB病毒、逆轉錄病毒、丙型肝炎病毒、結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)(縮寫為Mt)和幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)。
RA發(fā)病機理的特征是引起軟骨和骨的進行性破壞的不同類型細胞的協(xié)同作用。
在正常情況下，在炎性細胞因子如TNFα、IL-1、IL-6、IL-15、IL-16、IL-17、IL-1和IFNγ與抗炎細胞因子如IL-4、IL-11、IL-13和IL-1或TNFα的拮抗劑之間存在平衡。然而，在RA中這種平衡移向有利于炎性細胞因子(Arend，W.P.(2001)Cytokine imbalance inthe pathogenesis of rheumatoid arthritisThe role ofinterleukin-1 receiving antagonist.Semin Arthritis Rheum30(2)1-6)。
外源性抗原或自身抗原的識別有可能是一系列引起RA患者關節(jié)破壞的事件的原因。這種現(xiàn)象引起了與不同細胞因子的刺激相協(xié)作的T CD4+淋巴細胞的激活，誘導它們分化為細胞Th1，結果釋放了促炎細胞因子(IL-2和INFγ)(Simón，A.J.(2001)Biological therapyin Rheumatoid Arthritis.Magazine of Clinical Investigation53(5)452-459)。許多研究者一致認為關節(jié)的慢性炎癥由浸潤滑膜的這些激活的T細胞誘導。這些細胞因子對巨噬細胞的作用引起了大量的TNFα和IL-1的產(chǎn)生。這引起了一系列局部的和全身性的作用，調控在內皮細胞中粘附分子的表達(LFA1，ICAM-1)，其募集其他細胞至炎癥位點。它們也刺激巨噬細胞、成纖維細胞、軟骨細胞和破骨細胞釋放其他炎癥介質，如IL-15和IL-8。TNFα和IL-1刺激滑膜的增殖，這導致血管翳的形成，它們也可以誘導B淋巴細胞分化成產(chǎn)生可能參與關節(jié)破壞的抗體的細胞。它們也抑制由Th2細胞產(chǎn)生的抗炎細胞因子(IL-4和IL-14)的產(chǎn)生，并刺激肝細胞釋放IL-6。IL-6促進急性階段的蛋白質的產(chǎn)生，所述蛋白質參與強化免疫應答(Forre，O.(2000)New possibilities of treatment in AR.Scand J Rheumatol29(2)73-84)。
自身抗原中涉及RA發(fā)病機理的是Hsp60，其為一種屬于Hsp家族的蛋白質，Hsp是具有異常進化保守性的免疫原性蛋白。針對陌生Hsp的免疫應答是抵御細菌感染的重要機制。針對這些蛋白質的抗體在健康的人中和在患有自身免疫疾病的患者中可以是豐富的，并且它們可以與自身抗原交叉反應(Chen，W.(1999)Human 60-kDa Heat-ShockProteinTo Danger Signal to the Innate Immune System.J Immunol.1623212-3219)。
Mt的Hsp65與哺乳動物的Hsp60同源。這暗示，Hsp60可以在RA患者中被識別為自身抗原。當比較骨關節(jié)炎患者與RA患者時，在這些RA患者的滑液中B淋巴細胞對分枝桿菌的Hsp65的增殖應答增加。該應答的強度與滑液炎癥相關聯(lián)。與其他炎性疾病相比，這種應答對于RA不是特異性的(Life，P.(1993)Responses to Gram negativeenteric bacterial antigens by synovial T cells from patiens withjuvenile chronic arthritisrecognition of heat shock proteinhsp60.J Rheumatol.201388-1396)。
對于免疫系統(tǒng)，Hsp的濃度是一種可能的危險信號，所述Hsp從死亡細胞釋放，并且可以誘導炎性應答并開始APC的成熟。Hsp是細胞內蛋白，其不在細胞膜中表達，不分泌，從而Hsp是構成危險信號的有吸引力的候選分子(Van den Berg，WB.(1998)Jointinflammation and cartilage destruction may occur uncoupled.Springer Semin Immunopathol.20149-164)。
已經(jīng)提出了數(shù)種使用Hsp60或其衍生肽的制劑，其用于治療一些自身免疫病理學狀態(tài)。例如在專利EP0262710中，提出使用Mt的Hsp60的數(shù)種肽來治療和診斷自身免疫疾病，特別是關節(jié)炎疾病。本發(fā)明基于這樣的事實先前感染數(shù)種細菌可以在遺傳易感的人中引發(fā)自身免疫疾病的產(chǎn)生，例如RA患者可以顯示出對微生物抗原的高度反應性。
在專利EPO322990中，相同的這些發(fā)明人提出了Mt的Hsp60的其他肽的用途，用于與前面的專利相同的目的。
在專利申請WO9610039中，他們打算使用Mt的Hsp60的肽來診斷和治療自身免疫關節(jié)炎。
在專利申請WO9711966中，作者打算使用hHsp60的非保守區(qū)的肽，所述hHsp60與可以在RA患者的T細胞中引起耐受的細菌的Hsp60不一致。
專利申請WO0143691提出了由hHsp60的肽和它們的變體特異地組成的藥物制劑用于預防炎性疾病例如RA的用途。
在專利US6180103中，作者打算使用稱為p277的Hsp60的肽及其類似物來診斷和預防I型糖尿病。
專利US5993803保護了Hsp60、肽p227和這種蛋白質的一組衍生肽用于減輕器官移植過程中自身免疫應答的嚴重度的用途。
近來已經(jīng)考慮到，動脈粥樣硬化表現(xiàn)出一系列與自身免疫過程相似的特征。在專利申請WO0072023中，作者提出了使用含有蛋白質Hsp60的制劑來治療和診斷動脈粥樣硬化和冠心病的方法。
在專利申請WO02057795中，保護了一種新的方法，所述方法使用Hsp家族的蛋白質和來自病原體如病毒和細菌的蛋白質來診斷和治療骨質疏松癥。
目前，RA還不能治愈。當前的治療方法集中在減輕病痛、減少炎癥、延緩關節(jié)損害和改善患者的功能和安康。
近來已經(jīng)詳細描述了免疫調節(jié)藥物，它們阻斷在RA中參與炎癥應答的開始和保持的細胞因子，目的是終止或減緩該疾病的發(fā)展。對于這種類型的療法，存在兩種類型的藥物阻斷腫瘤壞死因子(縮寫為TNFα)的作用的藥物和抑制白細胞介素1(IL-1)的作用的藥物。
盡管結果是所述的抗-TNFα和抗-IL-1療法有療效，但感染百分數(shù)較高。許多用這些藥物治療的患者產(chǎn)生了嚴重的感染，在一些情況中(包括其他自身免疫疾病、瘤形成等)甚至是致命的。此外，它們是十分昂貴的藥物(Breshinan，B.(1998)Treatment of rheumatoidarthritis with recombinant human anti-interleukin-1 antagonist.Arthritis Reum.412196-2204)。
已經(jīng)提出口服耐受性(oral tolerance)作為形成針對某些抗原的外周耐受性的方法。取決于抗原施用的劑量和頻率，這可以通過主動抑制(active suppression)、無變應性或克隆缺失的機制進行誘導。該方法可以誘導調節(jié)性T細胞，所述T細胞由抗原以特異性方式激活，但是獨立地行使其作用(主動抑制)。為了發(fā)生調控作用，不必施用假定致病的抗原，而是在炎癥病灶中能誘導主動抑制的任何其他抗原，從而抑制所述致病性效應細胞的活性。II型膠原(縮寫為CII)是在這方面更常使用的自身抗原。在RA患者中使用雞和牛CII進行的研究的結果給出了矛盾的結果(Trentham，D.E.(1993)Effects oforal administration of type II collagen in rheumatoid arthritis.Science 2611727-1730；Sieper，J.(1996)Oral type II collagentreatment in early rheumatoid arthritisto double-blind，placebo-controlled，randomize trial.Arthritis Rheum.3941-51)。
專利US6153200打算使用Hsp70(屬于Hsp家族的蛋白質)的肽來誘導RA患者中對口服途徑的耐受。
已經(jīng)提出用于誘導耐受的另一種變化形式是通過APL肽，基于這樣的事實如果對于某種抗原性肽的特異性T CD4+淋巴細胞識別由感受態(tài)APC呈遞的該抗原，則T細胞被激活。然而，如果相同的T細胞首先被不同形式的所述抗原(其中與TcR的接觸位點之一被稍微改變)激活，這可以導致所述T細胞的部分激活或甚至是失活。這種抗原稱為APL。APL類似于在與TcR或與MHC接觸的重要位置有一個或數(shù)個置換的免疫原性肽，其干擾對于T細胞的完全激活所必需的事件的級聯(lián)。
在概念上來說，除了其他效果以外，可以將APL設計成具有與免疫原性肽(激動劑)相似的特性，以增加T細胞對于特定抗原的應答。這種效果在病理學狀態(tài)如傳染性疾病下是有利的。也可以將肽設計成具有對于免疫原性肽的拮抗劑特性，所述特性可以有利于控制自身免疫疾病，因為它們可以作為TcR的拮抗劑(M.De Magistris(1992)Antigen analog-major complex histocompatibility complexes actas antagonist of the T cell receptor.Cell 68625-634)、部分激動劑或誘導介導主動抑制的調節(jié)性T細胞群(Evavold，B.D.(1991)Separation of IL-4production from Thcell proliferationby an altered T cell ligand.Science 2521308-1310)而阻斷T細胞應答。
在試驗上操縱肽配體的內在性質的能力使得能夠適當改變免疫細胞應答的性質、過程和效力。
直至現(xiàn)在，已經(jīng)在人中進行了使用APL型肽的兩個臨床試驗以治療自身免疫疾病。在這兩個測定法中，所述的肽源自髓鞘堿性蛋白的位置83-93的表位。其中一個試驗包括142位多發(fā)性硬化癥患者，并由于9％的患者產(chǎn)生了超敏反應而暫停了(Ludwig Kapposi(2000)Induction of non-encephalitogenic type 2 T helper-cellautoimmune response in multiple sclerosis after administrationof an altered peptide ligand in to placebo controlled，randomized phase II trial.Nature Medicine 101176-1182)。
另一個試驗包括25位患者并且也中斷了，因為在三名患者中觀察到疾病的惡化(Bibiana Bielekova(2000)Encephalitogenicpotential of the myelin basic protein peptide(amino acids 83-99)in multiple sclerosisResults of to phase II clinical trialwith an altered peptide ligand.Nature Medicine 61167-1175)。該工作的主要作者分析了決定這些陰性結果的因素，并認為在APL的位點上進行的改變可能引起了對于HLA的新的聯(lián)合基序(像當APL結合至在患者I中存在的DRB1*0404的情形時所發(fā)生的)，APL-HLA復合物也可以刺激在負選擇中沒有除去的T細胞，所述T細胞可由天然的自身抗原交叉活化。在該試驗中，在藥物制劑中使用高濃度的APL，其可以與自身抗原高度相似地刺激T細胞并誘導不規(guī)則的T細胞應答。(Bibiana Bielekova and Roland Martin(2001)Antigen-specificimmunomodulation via altered peptide tying.J Mol Med.79552-556)。
對于開展這兩個臨床試驗，作者先前沒有分析患者的T細胞對APL的體外應答。他們也沒有考慮由受治療的患者所表達的HLA分子的類型。
治療自身免疫疾病的主要挑戰(zhàn)是發(fā)展可以特異性地去除致病性T細胞而不影響其他不相關T細胞的治療策略。因此，治療研究應該尋找一種安全的、特異的且有效的方式來停止高級自身免疫過程。
與先前的現(xiàn)有技術相比較，本發(fā)明提出使用hHsp60的肽及其APL型衍生肽的用途，它們以特異性的方式誘導了RA過程的抑制性分子機制。
發(fā)明概述本發(fā)明解決了先前提到的問題，提供了形成T細胞表位的60kDa人熱休克蛋白的肽，以在類風濕性關節(jié)炎患者中誘導外周耐受機制，特別是引起無變應性的機制或由調節(jié)性T細胞克隆介導的機制，并且所述肽具有以下序列E18-12MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK(SEQ.ID.NO1)E18-3 SIDLKDKYKNIGAKLVQDVANNTNEEAG(SEQ.ID.NO2)F19-6 IIDPTKVVRTALLDAA(SEQ.ID.NO3)。
專利申請WO9711966旨在人和Mt的Hsp60的肽的用途，基于這樣的事實它們可以在T細胞中誘導耐受，并用于預防RA。這些作者通過施用這些肽給小鼠(事先用pristine誘導了關節(jié)炎)證實了對該疾病的某些改善。與該申請相反，我們證明，我們的肽誘導了主動抑制機制，其以十分有效的方式誘導了外周耐受，證實了在關節(jié)炎的兩個動物模型中以及在使用患者的單核細胞的“離體”測定法中IL-10顯著增加。
眾所周知，在佐劑誘導的關節(jié)炎(AIA)模型中基本的T細胞應答是針對Hsp60的。在這種模型中，我們檢驗出，我們的hHsp60的衍生肽發(fā)揮出十分顯著的治療性保護作用，產(chǎn)生了IL-10的增加和TNFα水平的降低。我們還在膠原誘導的關節(jié)炎(CIA)的動物模型中檢驗出了由這些肽所發(fā)揮出的相同治療效果，在所述CIA動物模型中主要的應答是針對II型膠原的。
這些事實表明，我們的肽的治療能力是獨立于誘導劑的，并且可以在炎癥位點處介導主動抑制機制，所述主動抑制機制可以擴展至在關節(jié)中存在的其他自身抗原，所述其他自身抗原逐漸地有助于在RA過程中發(fā)生的免疫病理過程。這些結果增強了使用我們的制劑來治療RA的治療可能性。
根據(jù)本發(fā)明，這些肽特別可用于設計肽E18-12(SEQ.ID.NO1)和E18-3(SEQ.ID.NO2)的APL型衍生變體，所述變體在與人MHC分子的接觸位點處進行修飾，以及用于設計肽F19-6(SEQ.ID.NO3)的APL型衍生物，所述衍生物在與大鼠MHC分子的接觸位點處進行修飾。各個氨基酸序列是MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK(SEQ.ID.NO1)1 2 34 56 7在下列位置處進行置換位置1置換為A、F、I、L、M、V、W或Y，位置2置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置3置換為A、K、V、R、T、I、P、L、N、S、G、Y或M，位置4置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置5置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V或Y，位置6置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，位置7置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V或Y；SIDLKDKKYKNIGAKLVQDVANNTNEEA(SEQ.ID.NO2)1 2 3 45 6 7 8在下列位置處進行置換
位置1置換為L、I、V、M、Y、W、F或A，位置2置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置3置換為A、F、I、K、L、M、P、R、S、T、V、W或Y；位置4置換為L、I、V、M、Y、W、F或A，位置5置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置6置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置7置換為A、F、I、K、L、M、P、R、S、T、V、W或Y，位置8置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；IIDPTKVVRTALLDAA(F19-6)(SEQ.ID.NO3)12在位置1處置換為H，在位置2處置換為E。
在一個特別的實施方案中，APL型衍生肽具有選自下列的氨基酸序列SEQ.ID.NO4、SEQ.ID.NO5、SEQ.ID.NO6、SEQ.ID.NO7、SEQ.ID.NO8、SEQ.ID.NO9、SEQ.ID.NO10、SEQ.ID.NO11、SEQ.ID.NO12、SEQ.ID.NO13、SEQ.ID.NO14、SEQ.ID.NO15、SEQ.ID.NO16、SEQ.ID.NO17、SEQ.ID.NO18、SEQ.ID.NO19、SEQ.ID.NO20和SEQ.ID.NO21。
本發(fā)明的肽可以通過常規(guī)的肽合成方法來產(chǎn)生。每種具有特定肽的組合物可以通過其在如于隨后將要敘述的實施例中描述的那些試驗中所誘導的免疫應答的水平和質量來檢驗。
在上面和在實施例中所描述的所有序列是有用的，并且還可以用作設計和合成具有改良性質的衍生肽的基礎。
本發(fā)明還包括藥物組合物，其包含一種或多種先前列舉的肽和任選地包括可藥用載體或賦形劑。
將藥物制劑施用給患者將會根據(jù)由特定患者所表達的II類HLA分子。
施用藥物組合物的方式將取決于這些制劑在“離體”測試中誘導的細胞因子模式。含有誘導調控性應答的APL肽的藥物制劑將通過皮內或皮下途徑進行施用。含有誘導TH1應答的原始肽的藥物制劑將能夠通過口服途徑進行施用。
本發(fā)明藥物組合物中的肽的量是在宿主中產(chǎn)生有效免疫應答的量。有效量是當施用時誘導分子機制的量，所述分子機制顯著減小RA的炎癥征兆特征并終止該疾病過程的關節(jié)損傷特征。施用給宿主的藥物組合物的量還可以根據(jù)數(shù)種因素而變化，所述因素通常包括使用的肽、ACR得分(American College of Rheumatology，縮寫為ACR)、II型HLA、診斷有該疾病的時間、年齡、性別、一般健康狀況以及免疫應答水平。
本發(fā)明還涉及治療RA的方法，所述方法包括向患者施用有效量的先前提及的肽或藥物組合物。
附圖簡述部分地，結果在下列圖中用圖表顯示

圖1在AIA模型中，通過皮內途徑用F19-6和F19-7治療的大鼠中關節(jié)炎的臨床征兆的評價。
圖2誘導疾病后第15天，在AIA模型中，大鼠單核細胞中由F19-6和F19-7肽引起的TNFα水平的調節(jié)。
圖3誘導疾病后第15天，在AIA模型中，大鼠單核細胞中由F19-6和F19-7肽引起的IL-10水平的調節(jié)。
圖4未經(jīng)治療的患病動物的關節(jié)切片的光學顯微鏡圖。IS關節(jié)內空間，EC軟骨的侵蝕，P血管翳。用蘇木精-曙紅染色。
圖5通過皮內途徑用F19-7肽治療的動物的關節(jié)切片的光學顯微鏡圖。IS關節(jié)內空間。用蘇木精-曙紅染色。
圖6誘導疾病后第21天，在CIA模型中，大鼠單核細胞中由F19-6和F19-7肽引起的TNFα水平的調節(jié)。
圖7誘導疾病后第21天，在CIA模型中，大鼠單核細胞中由F19-6和F19-7肽引起的IL-10水平的調節(jié)。
圖8RA患者的單核細胞中F19-6和F19-7肽對TNFα水平的調節(jié)。
圖9RA患者的單核細胞中E18-3和E18-12肽對TNFα水平的調節(jié)。
圖10RA患者的單核細胞中E18-3和E18-12肽對IL-10水平的調節(jié)。
圖11RA患者的單核細胞中由E18-3和E18-12肽和它們的APL引起的IL-10水平的調節(jié)。
圖12RA患者的單核細胞中由E18-3和E18-12肽和它們的APL引起的TNFα水平的調節(jié)。
圖13由E18-3和E18-12肽和它們的APL引起的IL-10和TNFα水平的比率。
圖14在AIA模型中，通過皮內途徑用E18-12和E18-12APL1肽治療的大鼠中關節(jié)炎的臨床征兆的評價。
特別的實施方案/實施例的詳細描述實施例1由人HLA呈遞的hHsp60的肽選擇的hHsp60的肽是通過下列所使用的程序被報道為人T細胞表位的那些肽SYFPEITHI(Hans-Georg Rammensee，Jutta Bachmann，Niels Nikolaus Emmerich，Oskar Alexander Bachor and StefanStevanovic.1999.Immunogenetics 50213-219.SYFPEITHIMHC配體和肽基序的數(shù)據(jù)庫(訪問網(wǎng)址http//www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/))和ProPred(Singh，H.and Raghava，G.P.S.2001.ProPredPrediction of HLA-DR bindingsites.Bioinformatics，17(12)1236-37)。
相應于這些肽的序列顯示于表1中。
表1.由人HLA呈遞的hHsp60肽的序列
實施例2Lewis大鼠的hHsp60表位肽從hHsp60的序列開始，根據(jù)在數(shù)據(jù)庫SYFPEITHI(Hans-GeorgRammensee，Jutta Bachmann，Niels Nikolaus Emmerich，OskarAlexander Bachor，Stefan Stevanovic.1999.Immunogenetics50213-219.SYFPEITHIMHC配體和肽基序的數(shù)據(jù)庫(訪問網(wǎng)址http//www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/))中描述的序列基序，我們選擇了與大鼠RT1.B1的MHC-II分子結合的肽。
設計了分析所有9個氨基酸的肽的程序來搜索滿足所述基序的那些肽。我們還包括了變體，其中在所述位置之一不包括被描述為錨點或優(yōu)選的殘基。
相應于于這些肽(F19-6)之一的序列顯示于表2中。
表2.對于大鼠而選取的hHsp60肽的序列
實施例3在參與結合MHC的氨基酸中具有修飾的APL的設計從在實施例1和2中所選擇的肽開始，我們修飾了參與結合特定MHC的位置(位置1、3、4、6、8或9)，試圖增加所述肽對HLA分子的親和力。如果選擇肽用于使用結合基序的方法(SYFPEITHI)，則在這些位置的每一個位置處搜索可以是錨點殘基的最佳殘基，或者如果所述肽的選擇是使用另一類型的算法(ProPred)來進行的，則搜索能增加肽作為MHC配體的得分的殘基。
作為這些分析的結果，肽E18-12在位置1-7處用下面指定的每一個氨基酸置換MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK(E18-12)1 2 34 56 7在下列位置處進行置換位置1置換為A、F、I、L、M、V、W或Y，位置2置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置3置換為A、K、V、R、T、I、P、L、N、S、G、Y或M，
位置4置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置5置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V或Y，位置6置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，位置7置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V或Y。
肽E18-3在位置1-8處用下面指定的每一個氨基酸置換SIDLKDKKYKNIGAKLVQDVANNTNEEA (E18-3)1 2 3 45 6 7 8在下列位置處進行置換位置1置換為L、I、V、M、Y、W、F或A，位置2置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置3置換為A、F、I、K、L、M、P、R、S、T、V、W或Y；位置4置換為L、I、V、M、Y、W、F或A，位置5置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置6置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置7置換為A、F、I、K、L、M、P、R、S、T、V、W或Y，位置8置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y。
肽F19-6在位置1和2處用如下指定的氨基酸置換IIDPTKVVRTALLDAA(F19-6)12在位置1處置換為H，在位置2處置換為E。
這兩個置換導致產(chǎn)生了肽F19-7IIDPTHVVRTELLDAA(F19-7)(SEQ.ID.NO4)。
實施例4Lewis大鼠中由佐劑和膠原誘導關節(jié)炎雌性近交Lewis大鼠(RT1.B1 MHC)用于該試驗，由NationalCenter for the Production of Laboratory Animals(CENPALAB，Cuba)提供。隨機選擇大鼠，重量大約為101-120g，以及5-8周大。
所使用的疾病誘導劑之一是不完全弗氏佐劑(IFA)(Sigma，USA)中的Mt(H37Ra，Difco，England)。關節(jié)炎的另一種誘導劑是IFA中的牛II型膠原。
在該實施例中，使用兩種誘導劑來通過針對兩種不同自身抗原的免疫應答而在大鼠中引起關節(jié)炎。眾所周知，在用Mt作為疾病誘導劑的關節(jié)炎動物模型中，T細胞的基本應答是針對Hsp60的(Anderton，SM(1995)Activation of T cells recognizing self 60-kD heatshock protein can protecta gainst experimental arthritis.J.Exp.Med.181943-952)。在使用膠原作為誘導劑的模型中，產(chǎn)生了顯著的抗體應答以及T細胞克隆以對抗這種抗原(M Griffiths(1988)Immunogenetics of collagen-induced arthritis in rats.Inten.Rev.Immunology 41-15)。
我們開發(fā)這兩種動物模型的基本目標是在兩種模型中評價我們的肽，目的是證明這些肽的保護性效果是獨立的還是依賴于大鼠中用作關節(jié)炎誘導劑的自身抗原。
實施例5臨床征兆的評價根據(jù)以下為該目的而準備的平均水平來評估每只大鼠所呈現(xiàn)的與關節(jié)炎發(fā)展相關的炎癥級別0分正常的爪；1分踝或腕輕微但不確定的發(fā)紅，或者限于個別趾的明顯發(fā)紅和炎癥，與受影響的趾的數(shù)目無關；
2分踝和腕的中度發(fā)紅和炎癥；3分整個爪(包括趾)的嚴重發(fā)紅和炎癥；4分涉及多個關節(jié)的爪的最大炎癥和變形。
根據(jù)所述確立的打分系統(tǒng)對四個爪分別進行評價，每個爪可以得到多達4分。因此，每只大鼠可以最多得到16分。
在誘導疾病后每5天進行目視評估。
關節(jié)炎征兆的臨床評價證明，在相應于沒有誘導疾病的健康對照組(組IV)的動物和相應于誘導了疾病但沒有用肽治療的患病對照組(組III)的動物之間存在有顯著的統(tǒng)計學差別，如在圖1中所顯示的。
實施例6肽合成所述的肽在注射器中通過Fmoc/tBu策略合成。使用的樹脂是Fmoc-AM-MBHA(0.54mmol/g)，在機械攪拌下連續(xù)進行合成方案。在用TFA處理后，凍干所述的肽并通過HPLC和質譜法進行表征。
實施例7肽的皮內施用將動物分成4組，每組12只大鼠。在三組動物(組I-組III)中誘導疾病，并將兩組用肽治療，和一組作為疾病誘導的對照。在用Mt誘導疾病后12、17和22天，用肽治療的兩組動物中每只大鼠接受在100μL體積的PBS中的200μg肽。
將分成四組的動物以以下方式進行處理●組I用肽F19-6治療的動物●組II用肽F19-7治療的動物●組III不用肽治療的動物(疾病誘導對照)●組IV沒有誘導疾病并且沒有用肽治療的動物(陰性對照)。
誘導后第15、21、28和35天，每組處死三只動物，取出脾臟并從關節(jié)取得樣品以用于組織病理學分析。
如圖1中所顯示的，與關節(jié)炎發(fā)展相關的征兆逐漸開始。在相應于疾病發(fā)展的對照組的組III動物中，從誘導關節(jié)炎后第10天開始，炎癥過程的發(fā)展變得明顯，其開始為下關節(jié)輕微發(fā)紅并擴展至關節(jié)的其他地方直至在一些大鼠中變得嚴重。
在該圖中，很明顯，肽F19-6(相應于hHsp60的原始表位)及其變體APL F19-7的施用在用這兩種肽治療的動物中引起關節(jié)炎臨床征兆的明顯減輕。在用肽F19-6和F19-7治療的組和作為疾病陽性對照的組之間獲得了統(tǒng)計學上顯著的差異(P＜0.05)。
在該測定法中獲得的結果證實，肽F19-6和F19-7在受治療的動物中發(fā)揮了保護作用，因為有可能在大鼠中觀察到疾病幾乎完全緩解。
實施例8mRNA分離將分離自大鼠脾臟的單核細胞孵育大約20小時。隨后，棄去上清液，并且將1mL試劑TRI REAGENT TM(SIGMA，USA)加入至每個孔中并將其置于室溫下5分鐘。隨后，按照供應商建議的方案進行mRNA的分離。
實施例9RNA的逆轉錄為了獲得互補DNA，使用了Gene Amp RNA PCR Kit(Perkin-Elmmer，USA)系統(tǒng)。使用了1mg相應于每個樣品的mRNA，并如供應商所建議的連續(xù)進行所述方案。
反應體系在循環(huán)變溫器(thermocycler)(Minicycler，MJResearch，USA)中根據(jù)以下要素進行孵育第一個循環(huán)，在42℃下1小時，隨后在95℃下5分鐘以及在4℃下5分鐘。
實施例10聚合酶鏈式反應對細胞因子TNFα和IL-10以及編碼酶GAP-DH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶，縮寫為GAP-DH)的組成型基因進行聚合酶鏈式反應(PCR)。
對于每個反應，在供應商建議的終體積為25μL的緩沖液(KCl 50mM、Tris-HCl 10mM，pH 9.0、0.1％Triton X-100和MgCl21.5mM)中，使用10pmol每種引物、5mL DNA模板、0.25mL DNA熱穩(wěn)定聚合酶(Taq-Pol)(Perkin-Elmmer，USA)。
關于GAP-DH的反應體系在循環(huán)變溫器(Minicycler，MJResearch，U.S)中根據(jù)以下程序進行孵育第一個循環(huán)，94℃(變性溫度)下3分鐘、94℃下1分鐘、58℃(雜交溫度)下1分鐘和72℃(延伸溫度)下1分鐘，隨后35個循環(huán)，每個循環(huán)為94℃下1分鐘、58℃下1分鐘和72℃下1分鐘。最后是72℃下3分鐘的延伸步驟。
對于細胞因子，繼續(xù)先前的要點，僅在雜交溫度上不同。對于IL-10，雜交溫度是54℃，對于TNFα，雜交溫度是64℃。
實施例11通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物PCR的結果通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析。獲取電泳圖像并用Molecular Program Analyst(BioRad)進行分析。對于每種細胞因子，結果表示為mRNA的相對水平。
實施例12每種細胞因子的mRNA相對水平的統(tǒng)計分析為了測定受治療動物組之間的細胞因子模式的差異(根據(jù)每種細胞因子的mRNA的相對水平)，使用Kruskal-Wallis和Student-Newman-Keuls檢驗(Statistical package Sigma Stat v 21997，GraphPad Software，Inc).
統(tǒng)計分析證明，誘導疾病后第15天，與疾病對照組相比，所述的肽顯著減少了TNFα的水平。
這些結果顯示在圖2中，其中GI相應于用F19-6肽治療的動物，GII代表用F19-7肽治療的大鼠組，GIII代表未受治療的患病組，GIV包括健康的動物。很明顯地證明，用肽治療引起了該細胞因子的相對水平的降低，所述細胞因子主要負責誘導動物中的炎癥過程。對于細胞因子TNFα的情況，在用所述肽治療的組之間和在用作疾病陽性對照的組中存在有在統(tǒng)計學上顯著的差異。在用所述肽治療的不同組之間以及在它們與用作疾病陰性對照的組之間均沒有顯示出顯著差異。該結果表明，這兩種肽的施用引起了TNFα水平的降低，幾乎直到如健康動物中一樣的這種細胞因子的正常水平。
為了測定用于該研究的肽是否可以刺激抗炎細胞因子如IL-10的產(chǎn)生，評價了相應于這種細胞因子的mRNA的相對水平。
IL-10參與了通過T細胞介導的應答來誘導外周耐受。IL-10直接調節(jié)T細胞以抑制IL-2、IL-5和TNFα的產(chǎn)生。
圖3顯示了在誘導疾病后第15天，不同治療組中IL-10表達水平的定量測量。在該圖中，GI相應于用F19-6肽治療的動物，GII代表用F19-7肽治療的大鼠組，GIII代表未受治療的患病動物組，GIV包括健康的動物。
用這些肽治療動物引起了IL-10的相對表達水平的增加。我們在用兩種肽治療的組之間沒有獲得統(tǒng)計學上顯著的差異，但是這些組與構成陽性對照和陰性對照的動物之間存在著差異。從這些結果我們可以推斷，所述肽作用的在于引起涉及所述疾病的發(fā)病機理的T細胞的功能表型發(fā)生變化，增加抗炎細胞因子如IL-10的產(chǎn)生水平，并減少促炎細胞因子如TNFα的產(chǎn)生水平。
實施例13組織病理學分析為了證實在該動物模型的動物中觀測到的臨床征兆和分析兩種肽恢復或減緩由Mt產(chǎn)生的破壞性過程的能力，我們對每組的動物關節(jié)進行病理學分析。
通過CIGB的病理學組分析了相應于關節(jié)的切片。
將關節(jié)在10％福爾馬林的中性緩沖液中固定并脫鈣。組織在乙醇梯度中脫水，包埋在石蠟中，并切成5μm的切片。隨后，將樣品安放在載玻片上，并且用蘇木精-曙紅混合物染色并在光學顯微鏡中觀察。
組織學分析的結果顯示于表3中。
表3.組I至組IV的動物關節(jié)的組織學分析的總結
在表3中，P代表血管翳；EC軟骨侵蝕；IM骨髓浸潤；HO破骨細胞過度增生；G肉芽腫病反應；PMN多形核細胞。
在包括于第15天處死的那些動物的組III的動物中，明顯存在引起軟骨侵蝕和骨髓浸潤的血管翳。此外，觀察到用Mt誘導時的典型的肉芽腫病反應，并且常常觀察到破骨細胞的過度增生，所述的破骨細胞是對骨物質具有巨大破壞力的巨大細胞。這些組織學結果再現(xiàn)了在RA患者中出現(xiàn)的關節(jié)改變的特征性征兆，并證明我們已經(jīng)開發(fā)出了合適的動物模型來評價藥理學候選物。
圖4A相應于組III動物的關節(jié)。我們可以觀察到存在侵入整個關節(jié)內空間之中的血管翳，其朝向軟骨延伸，在那里顯現(xiàn)出侵蝕，以及朝著骨髓侵入。圖4B顯示了相應于骨髓的區(qū)域的放大圖，其中清晰觀察到了血管翳為富含吞噬細胞的肉芽組織。
如圖5中顯示的，在通過皮內途徑用F19-7肽進行的治療(組II)中，在第15天處死的動物沒有表現(xiàn)出組織學改變，只是存在多形核細胞和豐富的疤痕組織；這與組III的特征在于存在嚴重的組織學征兆的其余動物相反。
如表3中顯示的，用F19-6和F19-7肽治療的動物組在第一次檢測的過程中幾乎沒有顯示出組織學異樣。在用F19-7肽治療的動物中顯現(xiàn)出對關節(jié)炎發(fā)展的更大的保護作用。在該治療組中所涉及的大鼠中的一半(6只)沒有表現(xiàn)出任何組織學征兆，這與用F19-6治療的動物組相一致，其中僅有兩只大鼠沒有表現(xiàn)出組織病理學損害。在用F19-6和F19-7肽治療的組中，在誘導關節(jié)炎后第15和21天沒有觀察到血管翳的存在，這表明這些肽的施用引起了關節(jié)炎發(fā)展過程中炎癥反應的特征性細胞事件的出現(xiàn)的延遲。重要的是，在誘導關節(jié)炎后35天處死的用F19-7肽治療的動物中，僅一只大鼠顯現(xiàn)出該疾病發(fā)展的特征性組織學異樣。這些結果表明，除了延遲了該疾病的臨床表現(xiàn)之外，用該肽治療動物引起了關節(jié)炎的組織病理學征兆的幾乎完全的緩解，顯示了F19-7APL相對于含有原始表位的肽F19-6的治療優(yōu)越性。
實施例14.使用來自用II型膠原誘導了關節(jié)炎的大鼠的單核細胞，對由F19-6和F19-7肽誘導的細胞因子模式進行體外評價在該測定法中使用了其中用在IFA中的牛II型膠原誘導了關節(jié)炎的患病大鼠。取出每只受分析大鼠的脾臟，并分離出單核細胞。
將從脾臟分離出的單核細胞在24孔平板(Costar，USA)中于1.5mL RPMI 1640中進行培養(yǎng)。該測定法一式三份地進行，總共3×106細胞/孔用濃度為5mg/mL的F19-6和F19-7肽培養(yǎng)24小時，并在37℃下和在5％CO2的潮濕氣氛中進行孵育。沒有用所述肽進行培養(yǎng)的細胞用作陰性對照。
隨后，分離mRNA并以與先前實施例中所描述的相同的方式進行核酸的逆轉錄和PCR。如實施例12中所描述的，反應產(chǎn)物的分析通過瓊脂糖凝膠電泳來進行。為了根據(jù)每個樣品的mRNA的相對水平來測定細胞因子模式的差異，如實施例13中的描述采用統(tǒng)計檢驗。
在圖6中顯示了，相應于誘導疾病后第21天，沒有用肽培養(yǎng)的細胞和在體外用F19-6和F19-7肽刺激的細胞的TNFα水平。字母A代表沒有用肽培養(yǎng)的細胞的TNFα水平，字母B代表當細胞用F19-6肽刺激時該細胞因子的值，字母C相應于當細胞用F19-7肽刺激時TNFα的水平。在該圖中，CII代表其中用II型膠原誘導了關節(jié)炎的動物組，對照表示健康的動物組。
圖7顯示了，相應于誘導疾病后第21天，沒有用肽培養(yǎng)的細胞和在體外用F19-6和F19-7肽刺激的細胞的IL-10水平，字母A代表沒有用肽培養(yǎng)的細胞的IL-10水平，字母B代表當細胞用F19-6肽刺激時該細胞因子的值，字母C相應于當細胞用F19-7肽刺激時IL-10的水平。在該圖中，CII代表其中用II型膠原誘導了RA的動物組，對照表示健康的動物組。
如在這兩輻圖中觀察到的，F(xiàn)19-6和F19-7肽在體外減少了TNFα的水平，但是對于IL-10，僅F19-7肽顯著增加了IL-10水平。
這些結果表明，在其中用膠原誘導了關節(jié)炎的動物模型中，F(xiàn)19-7肽能調控所述細胞因子的模式以調節(jié)表型。因此我們可以確認，這種源于hHsp60的肽的體外免疫調節(jié)作用可以延伸至關節(jié)炎的動物模型，在該動物模型中參與所述疾病發(fā)展的誘導劑不是Mt或相關的自身抗原。
這些結果說明，F(xiàn)19-7可以誘導對結構相關的抗原的耐受性，能在炎癥位點處介導體內主動抑制。
根據(jù)這些結果我們可以認為，F(xiàn)19-7肽在動物中引起針對由Mt或II型膠原誘導的關節(jié)炎的保護作用，所述保護作用是由產(chǎn)生IL-10的調節(jié)性T細胞介導的。該效果可以擴展至存在于關節(jié)中的其他自身抗原，所述其他自身抗原逐漸地有助于在RA過程中發(fā)生的免疫病理過程。
實施例15對于F19-6和F19-7肽，在RA患者中的細胞因子測量使用RA患者的血液進行了測量細胞因子TNFα、IFNδ和IL-10的測定法。hHsp60的肽增加或減少參與所述疾病的發(fā)病機理的不同細胞因子的潛力在本測定法中進行了評價。
從10mL在1×PBS中作1/2稀釋的每位患者的血液開始，將5mL該稀釋液加入至在15mL的離心管中的3mL Ficoll-Paque(Amershan)中，所述離心管以1200rpm離心30分鐘。提取相應于單核細胞的環(huán)。隨后，細胞用15mL 1×PBS洗滌兩次，并在每次洗滌后將它們在900rpm下離心。最后，將細胞粒狀沉淀重懸浮于含有10％胎牛血清并補充有青霉素(100U/mL)、鏈霉素(100μg/mL)、25mM/L HEPES和2mM L-谷氨酰胺(全部從Gibco BRL獲得)的RPMI 1640中。
以800μL的體積，將獲得的單核細胞以106個細胞/孔的數(shù)目接種在24孔平板(Costar)中。隨后，加入濃度為0.5μg/mL-100μg/mL的hHsp60的肽以便獲知對于調控所述細胞因子水平來說每種肽的最佳濃度。1％植物凝集素(PHA)用作細胞刺激的陽性對照，而單獨的RPMI 1640用作基底細胞生長的對照。
將細胞培養(yǎng)24小時，隨后取出每孔的上清液，作1/2稀釋，并根據(jù)供應商的建議通過使用特異性試劑盒(Quantikine，R&D Systems)來測定細胞因子的濃度。
RA患者的單核細胞中由F19-6和F19-7肽調控的TNFα水平顯示于圖8中。在該圖中，字母A代表沒有用肽進行體外培養(yǎng)的細胞；而B相應于在體外用F19-6肽刺激的細胞，C代表在體外用F19-7肽刺激的細胞。在該圖中，當用肽刺激的細胞所分泌的細胞因子水平相對于未經(jīng)刺激的細胞存在統(tǒng)計學上顯著的差異時，在相應細胞因子的水平的柱中標示不同的字母。
如在圖8中觀察到的，在標為P19和P21的患者中，與未經(jīng)刺激的細胞相比，F(xiàn)19-6和F19-7肽顯著地降低了TNFα的水平，盡管在患者P19中該細胞因子水平的降低比用F19-7肽時更顯著。
在標為P13的患者中，F(xiàn)19-6肽增加了TNFα的水平，然而，當用F19-7肽刺激該患者的單核細胞時該細胞因子的水平顯著降低。這些結果表明，F(xiàn)19-7肽，盡管將它設計為由大鼠的MHC呈遞，但它們可以降低該細胞因子的水平，所述細胞因子主要負責RA的特征性炎癥過程，因而該肽是治療該疾病的潛在治療候選物。
實施例16對于E18-12和E18-3肽，在RA患者中細胞因子的測量使用RA患者的血液進行了測量細胞因子TNFα、IFNδ和IL-10的測定法。hHsp60的肽增加或減少參與所述疾病的發(fā)病機理的不同細胞因子的潛力在這些測定法中進行了評價。
從每位患者抽取10mL血液，將血液在1×PBS中作1/2稀釋。將5mL該稀釋液加入至在15mL的離心管中的3mL Ficoll-Paque(Amershan)中，并以1200rpm離心30分鐘。提取相應于單核細胞的環(huán)。隨后，細胞用15mL 1×PBS洗滌兩次，并在每次洗滌后將它們在900rpm下離心。最后，將沉淀物重懸浮于含有10％胎牛血清并補充有青霉素(100U/mL)、鏈霉素(100μg/mL)、25mM/L HEPES和2mML-谷氨酰胺(全部從Gibco BRL獲得)的RPMI 1640培養(yǎng)基中。
以800μL的體積，將獲得的單核細胞以106個細胞/孔的數(shù)目接種在24孔平板(Costar)中。然后，加入濃度為0.5μg/mL-100μg/mL的hHsp60的肽以便獲知對于調控所述細胞因子水平來說每種肽的最佳濃度。1％植物凝集素(PHA)用作細胞刺激的陽性對照，而單獨的RPMI 1640用作基底細胞生長的對照。
將細胞培養(yǎng)24小時，隨后取出每孔的上清液，作1/2稀釋，并根據(jù)供應商的建議通過使用特異性試劑盒(Quantikine，R&D Systems)來測定細胞因子的濃度。
RA患者的單核細胞中由E18-3和E18-12肽調控的TNFα水平顯示于圖9中。以P4、P5和P16表示的患者表達DR 0306分子，標識為P7、P8和P12的患者表達DR 0303分子，而P9患者表現(xiàn)出DR0506基因型，和患者P10具有基因型DR 0204。在該圖中，字母A代表沒有用肽進行體外培養(yǎng)的細胞；而B相應于在體外用E18-3肽刺激的細胞，C代表在體外用E18-12肽刺激的細胞。
在該圖中，當用肽刺激的細胞所分泌的細胞因子水平相對于未經(jīng)刺激的細胞存在統(tǒng)計學上顯著的差異時，在相應細胞因子的水平的柱中標示不同的字母。
如在圖9中觀察到的，在用E18-12和E18-3肽刺激的患者單核細胞中TNFα合成的誘導取決于這些患者表達的II型HLA分子。在表達基因型DR 0306的患者P4、P5和P6中，與沒有用肽刺激的細胞相比，觀察到TNFα濃度的統(tǒng)計學上顯著的增加。
在基因型DR 0506的患者P9和患者P10 DR 0204中發(fā)生了相同的效果。
當用我們的肽刺激單核細胞時，在表現(xiàn)DR 0303基因型的患者P7、P8和P12中沒有觀察到TNFα水平的任何差異。
E18-3和E18-12肽對IL-10水平的調節(jié)顯示于圖9中，其中字母A表示沒有用肽進行體外培養(yǎng)的細胞，而B相應于在體外用E18-3肽刺激的細胞，C表示在體外用E18-12肽刺激的細胞。
在IL-10的情況下，如在圖10中觀察到的，在患者P9和P10中該細胞因子顯著減少，但是在其余患者中沒有顯著改變。
從這些觀察結果我們可以推斷，E18-12和E18-3肽在外周單核細胞中誘導了TH1表型。
原始肽(E18-12或E18-3)的治療性變體可以通過口服途徑施用，因而它們將誘導有助于顯著促進減少炎癥的耐受機制。
實施例17由衍生型APL肽誘導的RA患者中的細胞因子測量從前面的結果，我們決定使用生物信息學工具在與HLA分子的接觸位點處修飾這些相應于T細胞表位的原始肽，從而經(jīng)修飾的APL型肽將能夠將細胞因子的模式改變?yōu)檎{節(jié)性表型。此外，在每種這些肽中進行的修飾符合對于大多數(shù)由患者表達的HLA分子所報道的肽結合基序，所述修飾在理論上將促進每種肽與不同HLA分子的相互作用。
使用RA患者的血液進行了測量細胞因子TNFα和IL-10的測定法。從hHsp60衍生的APL型肽增加或減少參與所述疾病的發(fā)病機理的不同細胞因子的潛力在這些測試中進行評價。此外，在該評價中將原始肽(E18-3，E18-12)包括在內作為試驗對照。
在這些測試中評價的APL肽如下MGPKGRTVIILQSWGSPKVTK(SEQ.ID.NO5)MGPKGRTVIIMQSWGSPKVTK(SEQ.ID.NO6)MGPKGRTVIIAQSWGSPKVTK(SEQ.ID.NO7)MGPKGRTVIIEQSLGSPKVTK(SEQ.ID.NO8)MGPKGRTVIIEQSMGSPKVTK(SEQ.ID.NO9)MGPKGRTVIILQSLGSPKVTK(SEQ.ID.NO10)MGPKGRTVIILQSMGSPKVTK(SEQ.ID.NO11)MGPKLRTVIIEQSWGSPKVTK(SEQ.ID.NO12)MGPKLRTVIILQSMGSPKVTK(SEQ.ID.NO13)SIDLKDKLKNIGAKLVQDVANNTNEEA(SEQ.ID.NO14)
SIDLKDKYKNIGAKLSQDVANNTNEEA(SEQ.ID.NO15)SIDLKDKLKNIGAKLSQDVANNTNEEA(SEQ.ID.NO16)SIDLKDKYKNAGAKLVQDVANNTNEEA(SEQ.ID.NO17)SIDLKDKYKNIGAKLVQLVANNTNEEA(SEQ.ID.NO18)SIDLKDKYKNIGAKLVQAVANNTNEEA(SEQ.ID.NO19)SIDLKDKYKNIGAKLVQDVANNANEEA(SEQ.ID.NO20)SIDLKDKYKNIGAKLVQLVANNANEEA(SEQ.ID.NO21)。
從每位患者抽取10mL血液并在1×PBS中作1/2稀釋。將5mL該稀釋液加入至在15mL的離心管中的3mL Ficoll-Paque(Amershan)中，并以1200rpm離心30分鐘。提取相應于單核細胞的環(huán)。隨后，細胞用15mL 1×PBS洗滌兩次，并在每次洗滌后將它們在900rpm下離心。最后，將沉淀物重懸浮于含有10％胎牛血清并補充有青霉素(100U/mL)、鏈霉素(100μg/mL)、25mM/L HEPES和2mM L-谷氨酰胺(全部從Gibco BRL獲得)的RPMI 1640培養(yǎng)基中。
以800μL的體積，將獲得的單核細胞以106個細胞/孔的數(shù)目在24孔平板(Costar)中進行培養(yǎng)。細胞用濃度為40μg/mL的肽[E18-3、E18-12、E18-3APL1(SEQ.ID.NO18)、E18-3APL2(SEQ.ID.NO21)、E18-12APL1(SEQ.ID.NO5)、E18-12APL3(SEQ.ID.NO12)]進行刺激，一式三份。RPMI 1640用作基底細胞生長的對照。
將細胞培養(yǎng)24小時，隨后取出每孔的上清液，作1/2稀釋，并根據(jù)供應商的建議通過使用特異性試劑盒(Quantikine，R&D Systems)來測定細胞因子的濃度。
在圖11中顯示了由原始肽(E18-12和E18-3)和一組APL型肽(E18-3APL1(SEQ.ID.NO18)；E18-3APL2(SEQ.ID.NO21)；E18-12APL1(SEQ.ID.NO5)；E18-12APL3(SEQ.ID.NO12))引起的IL-10的水平。在該圖中，字母表明了統(tǒng)計學上顯著的差異(我們僅指單獨地每位患者中不同肽和對照細胞之間的統(tǒng)計學顯著性)。此外，患者P4和P6的細胞沒有用肽E18-3APL2和E18-12APL3刺激。顯然，在所有患者中，相對于未經(jīng)刺激的細胞，肽E18-3APL1十分顯著地增加了IL-10的水平。在一些患者(如P2和P4)中由該肽引起的增加比由未經(jīng)刺激的細胞產(chǎn)生的量高大約9倍，并且在患者如P1、P3和P5中高大約5倍。此外，由于在患者P1、P4和P6中IL-10水平的顯著增加，用E18-12APL1獲得了相似的結果。另一方面，與代表陰性對照的細胞相比較，原始肽或肽E18-3APL2和E18-12APL3都沒有引起IL-10水平的增加。
在圖12中顯示了同一組患者中由不同肽引起的TNFα水平。在該圖中，字母表示統(tǒng)計學上顯著的差異(我們僅指單獨地每位患者中不同肽和對照細胞之間的統(tǒng)計學顯著性)。此外，患者P4和P6的細胞沒有用肽E18-3APL2和E18-12APL3刺激。如可作出評價的，所有患者都沒有以相同的強度對不同肽的刺激作出應答，盡管眾所周知該應答是相當均一的。另一方面，更多地增加TNFα產(chǎn)量的肽是E18-12APL1，主要是在患者P4和P5中，然而與陰性對照相比患者P1、P2和P3顯示了稍微的增加。此外，肽E18-3APL1在多數(shù)患者中具有相似的行為。在肽E18-3APL1的情況下，患者P2、P4和P5的細胞顯示了TNFα水平較多的增加，盡管較不顯著。在該測試中，我們獲得了與前面使用原始肽的評價相似的結果。前面的結果表明，肽或其APL都沒有在患者的單核細胞中引起TNFα表達的降低。
這些結果可能是矛盾的，因為此類增加IL-10產(chǎn)生的APL促進了TNFα水平的增加。在圖13中顯示了由原始肽和它們的APL所引起的IL-10和TNFα的水平的比率。在該圖中，字母表示統(tǒng)計學上顯著的差異(我們僅指單獨地每位患者中不同肽和對照細胞之間的統(tǒng)計學顯著性)。此外，患者P4和P6的細胞沒有用肽E18-3APL2和E18-12APL3刺激。明顯的是，IL-10的增加相對于TNFα水平來說要高得多，因為在6位患者的4位中用E18-3APL1刺激的細胞顯示了高于1的指數(shù)，這表明IL-10的水平超過了TNFα的水平。此外，在所有患者中，相對于構成陰性對照的細胞，在用肽E18-3APL1刺激的細胞中IL-10的水平要高得多，顯示了統(tǒng)計學上顯著的差異。在E18-12APL1的情況下，相對于陰性對照的差異不是那么顯著。所以，盡管E18-3APL1增加了TNFα的水平，但凈主要效果是IL-10水平的增加，這可以理解為使應答偏向于有利于免疫抑制性細胞因子的方向。
該研究的結果是非常有前景的，因為它暗示這兩種APL可以施用給患者并且可以誘導能分泌IL-10的調節(jié)性T細胞的亞群，其介導全身水平的主動抑制。通過分析這些結果我們可以得出的另一部分結論是，這些APL幾乎在所有經(jīng)研究的患者中展示了均一的行為，而不依賴于他們具有的基因型。這些結果非常令人鼓舞，因為它將使得這些APL的施用在所有患者中具有相同的效果，而不考慮在他們所具有的HLA-II分子類型方面存在的差異。
根據(jù)我們的試驗結果，本發(fā)明的基本優(yōu)勢是含有相應于T細胞表位的人熱休克蛋白Hsp60的免疫調節(jié)肽或這些肽的APL型變體的藥物組合物的用途，所述藥物組合物可有效地用于治療RA患者，誘導特異性的免疫應答，所述免疫應答旨在沉默涉及該疾病的免疫病理機制的自身反應性T細胞克隆。
我們在本發(fā)明中提出的治療是合理的并可以擴展至大量的患者，并且其也可以與目前用于該疾病的療法相組合地使用。
實施例18在其中用Mt誘導了關節(jié)炎的動物模型中，APL型衍生肽的治療效果的評價將動物分成12組，每組8只大鼠。在11組動物(組I-組XI)中誘導疾病，其中10組用肽治療，1組保留用作疾病誘導的對照。在用Mt誘導疾病后12、14、16、18、20、22、24、26天，用肽治療的動物組中每只大鼠接受在100μL體積的PBS中的50μg肽。
將分成12組的動物以以下方式進行處理 組I接受肽E18-12(SEQ.ID.NO1) 組II接受相應于SEQ.ID.NO5的肽 組III接受相應于SEQ.ID.NO8的肽
組IV接受相應于SEQ.ID.NO12的肽 組V接受相應于SEQ.ID.NO13的肽 組VI接受肽E18-3(SEQ.ID.NO2) 組VII接受相應于SEQ.ID.NO14的肽 組VIII接受相應于SEQ.ID.NO15的肽 組IX接受相應于SEQ.ID.NO16的肽 組X接受相應于SEQ.ID.NO17的肽 組XI不接受肽(疾病誘導的對照) 組XII沒有誘導疾病或施用任何肽(陰性對照)。
誘導后第21和35天，每組處死數(shù)只動物，取出脾臟并從關節(jié)取得樣品以用于組織病理學分析。
在用APL型肽治療的動物組中，與未經(jīng)治療的動物組和用E18-12和E18-3治療的組相比較，臨床改善明顯。
這些結果得到了組織病理學分析和細胞因子測量的證實，證明在所有情況中APL型衍生肽優(yōu)于原始肽。
在圖14中，我們顯示了屬于這種動物模型的四組動物中該疾病的演變圖。在本情況中，所述的組是組I(用E18-12治療的動物)、組II(用E18-12APL1 SEQ.ID.NO5治療的動物)、組XI(疾病誘導的對照)和組XII(健康動物)。在該圖中，不同字母表示顯著的差異(p＜0.001)(其指在指定的測量日，所有組之間的統(tǒng)計學顯著性)。
在該圖中可以看出，從誘導疾病后第12天開始，組I、II和XI的動物開始顯示RA的特征性臨床征兆。許多動物還顯示出關節(jié)外的表現(xiàn)如耳、尾和四肢中的小結。第20天左右，在三個患病動物組中觀察到最嚴重的RA表現(xiàn)。在用E18-12治療的動物中，在第21天，我們沒有看出相對于疾病誘導對照組的顯著差異。然而，在誘導疾病后第35天左右，該組動物中的臨床征兆顯著低于組XI的那些(p＜0.001)。這些結果表明，E18-12肽的保護性效果在第35天左右顯現(xiàn)。從該意義上來說，推薦在疾病早期施用該肽以便在第21天獲得更好的結果。然而，在組II動物的情況下，與組I和XI相比，炎癥的臨床征兆明顯更小(p＜0.001)，這表明該肽在誘導了疾病的動物中發(fā)揮了強而有效的保護作用。
序列表<110>Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología<120>HSP60的肽和APL型衍生物及藥物組合物<130>pepMC<140>
<141>
<160>21<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>1Met Gly Pro Lys Gly Arg Thr Val Ile Ile Glu Gln Ser Trp Gly Ser1 5 10 15Pro Lys Val Thr Lys20<210>2<211>28<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>2Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Tyr Lys Asn Ile Gly Ala Lys Leu Val1 5 10 15Gln Asp Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ala Gly20 25
<210>3<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>3Ile Ile Asp Pro Thr Lys Val Val Arg Thr Ala Leu Leu Asp Ala Ala1 5 10 15<210>4<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>4Ile Ile Asp Pro Thr His Val Val Arg Thr Glu Leu Leu Asp Ala Ala1 5 10 15<210>5<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>5Met Gly Pro Lys Gly Arg Thr Val Ile Ile Leu Gln Ser Trp Gly Ser1 5 10 15Pro Lys Val Thr Lys20
<210>6<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>6Met Gly Pro Lys Gly Arg Thr Val Ile Ile Met Gln Ser Trp Gly Ser1 5 10 15Pro Lys Val Thr Lys20<210>7<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>7Met Gly Pro Lys Gly Arg Thr Val Ile Ile Ala Gln Ser Trp Gly Ser1 5 10 15Pro Lys Val Thr Lys20<210>8<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>8
Met Gly Pro Lys Gly Arg Thr Val Ile Ile Glu Gln Ser Leu Gly Ser1 5 10 15Pro Lys Val Thr Lys20<210>9<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>9Met Gly Pro Lys Gly Arg Thr Val Ile Ile Glu Gln Ser Met Gly Ser1 5 10 15Pro Lys Val Thr Lys20<210>10<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>10Met Gly Pro Lys Gly Arg Thr Val Ile Ile Leu Gln Ser Leu Gly Ser1 5 10 15Pro Lys Val Thr Lys20<210>11<211>21
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>11Met Gly Pro Lys Gly Arg Thr Val Ile Ile Leu Gln Ser Met Gly Ser1 5 10 15Pro Lys Val Thr Lys20<210>12<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>12Met Gly Pro Lys Leu Arg Thr Val Ile Ile Glu Gln Ser Trp Gly Ser1 5 10 15Pro Lys Val Thr Lys20<210>13<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>13Met Gly Pro Lys Leu Arg Thr Val Ile Ile Leu Gln Ser Met Gly Ser1 5 10 15Pro Lys Val Thr Lys20
<210>14<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>14Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Leu Lys Asn Ile Gly Ala Lys Leu Val1 5 10 15Gln Asp Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ala20 25<210>15<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>15Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Tyr Lys Asn Ile Gly Ala Lys Leu Ser1 5 10 15Gln Asp Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ala20 25<210>16<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽
<400>16Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Leu Lys Asn Ile Gly Ala Lys Leu Ser1 5 10 15Gln Asp Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ala20 25<210>17<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>17Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Gly Ala Lys Leu Val1 5 10 15Gln Asp Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ala20 25<210>18<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>18Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Tyr Lys Asn Ile Gly Ala Lys Leu Val1 5 10 15Gln Leu Val Ala Ash Asn Thr Ash Glu Glu Ala20 25<210>19
<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>19Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Tyr Lys Asn Ile Gly Ala Lys Leu Val1 5 10 15Gln Ala Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ala20 25<210>20<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>20Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Tyr Lys Asn Ile Gly Ala Lys Leu Val1 5 10 15Gln Asp Val Ala Asn Asn Ala Asn Glu Glu Ala20 25<210>21<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>21Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Tyr Lys Asn Ile Gly Ala Lys Leu Val
1 5 10 15Gln Leu Val Ala Asn Asn Ala Asn Glu Glu Ala20 2權利要求
1.構成T細胞表位的60kDa人熱休克蛋白的肽，所述肽用于在類風濕性關節(jié)炎患者中誘導外周耐受機制，特別是引起無變應性的機制或由調節(jié)性T細胞克隆介導的機制，其特征在于具有以下序列E18-12 MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK(SEQ.ID.NO1)E18-3SIDLKDKYKNIGAKLVQDVANNTNEEAG(SEQ.ID.NO2)F19-6IIDPTKVVRTALLDAA(SEQ.ID.NO3)。
2.根據(jù)權利要求1的肽，其特征在于是肽E18-12(SEQ.ID.NO1)的APL型衍生肽，其在與人MHC分子的接觸位點處進行修飾，其中氨基酸序列MGPKGRTVIIEQSWGSPKVTK1 2 34 56 7在下列位置處進行置換位置1置換為A、F、I、L、M、V、W或Y，位置2置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置3置換為A、K、V、R、T、I、P、L、N、S、G、Y或M，位置4置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置5置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V或Y，位置6置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，位置7置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V或Y。
3.根據(jù)權利要求2的APL型衍生肽，其具有選自下列的氨基酸序列SEQ.ID.NO5、SEQ.ID.NO6、SEQ.ID.NO7、SEQ.ID.NO8、SEQ.ID.NO9、SEQ.ID.NO10、SEQ.ID.NO11、SEQ.ID.NO12和SEQ.ID.NO13。
4.根據(jù)權利要求1的肽，其特征在于是肽E18-3(SEQ.ID.NO2)的APL型衍生肽，其在與人MHC分子的接觸位點處進行修飾，其中氨基酸序列SIDLKDKKYKNIGAKLVQDVANNTNEEA1 2 3 45 6 7 8在下列位置處進行置換位置1置換為L、I、V、M、Y、W、F或A，位置2置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置3置換為A、F、I、K、L、M、P、R、S、T、V、W或Y；位置4置換為L、I、V、M、Y、W、F或A，位置5置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置6置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，位置7置換為A、F、I、K、L、M、P、R、S、T、V、W或Y，位置8置換為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y。
5.根據(jù)權利要求4的APL型衍生肽，其具有選自下列的氨基酸序列SEQ.ID.NO14、SEQ.ID.NO15、SEQ.ID.NO16、SEQ.ID.NO17、SEQ.ID.NO18、SEQ.ID.NO19、SEQ.ID.NO20和SEQ.ID.NO21。
6.根據(jù)權利要求1的肽，其特征在于是肽F19-6(SEQ.ID.NO3)的APL型衍生肽，其在與大鼠MHC分子的接觸位點處進行修飾，其中氨基酸序列IIDPTKWRTALLDAA (F19-6)1 2在位置1處置換為H，在位置2處置換為E，從而產(chǎn)生了肽F19-7(SEQ.ID.NO4)。
7.藥物組合物，其含有一種或多種權利要求1-6的肽以及可藥用載體或賦形劑。
8.根據(jù)權利要求7的藥物組合物，其用于治療類風濕性關節(jié)炎。
9.治療類風濕性關節(jié)炎的方法，包括向患者施用有效量的根據(jù)權利要求1-6中任一項的肽或根據(jù)權利要求7的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及形成T細胞表位的60－kDa人熱休克蛋白的肽以及從其衍生的肽，所述衍生的肽在與MHC分子的接觸位點處進行修飾，它們可用于在類風濕性關節(jié)炎患者中誘導外周耐受機制，特別是引起無變應性的機制或由調節(jié)性T細胞克隆介導的機制。本發(fā)明還涉及含有這樣的肽的藥物組合物，其用于治療類風濕性關節(jié)炎。
文檔編號A61K38/17GK101065398SQ200580040389
公開日2007年10月31日 申請日期2005年9月22日 優(yōu)先權日2004年9月24日
發(fā)明者M·D·C·多明格斯奧爾塔, G·R·帕德龍帕洛馬雷斯, N·洛佩斯馬林, N·洛倫索佩雷斯, A·巴爾貝拉貝當古, A·埃爾南德斯加西亞, V·莫雷拉科爾多瓦, C·科斯梅迪亞斯, N·J·梅里諾加西亞, A·巴斯克斯博納切亞, J·蘇亞雷斯阿爾巴 申請人:遺傳工程與生物技術中心