專利名稱：：作為hiv進入抑制劑和局部殺微生物劑的淀粉－石榴汁復合物的制作方法政府權利本發(fā)明是在美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)GrantPO1HD41761下的美國政府支持下產生的。美國政府可擁有本發(fā)明的某些權利。相關申請的交叉引用本申請根據35USC119(e)要求2004年9月21日提交的美國臨時申請系列號60/611,778的優(yōu)先權，該臨時申請的全部內容通過引用結合到本文中。
背景技術：
：發(fā)明領域本發(fā)明涉及可用作HIV-1或HIV-2進入抑制劑和作為局部殺微生物劑的淀粉-石榴汁復合物，以及通過將所述復合物經陰道給予婦女來預防HIV-1或HIV-2感染的方法。
背景技術：
：大約24年來，獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)這一大疫病已經奪去大約3千萬人生命，在2003年每天造成約14,000例新的人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)感染病例。約有80％的感染是經異性傳播發(fā)生的。在沒有疫苗的情況下，預期可阻斷病毒傳播的局部殺微生物劑給控制該疫病提供了希望?？鼓孓D錄病毒化療藥物在工業(yè)化國家中已降低了AIDS死亡率，但在發(fā)展中國家中只有極微的降低。為防止出現(xiàn)類似的兩極分化現(xiàn)象，殺微生物劑應該是可接受的、可取得的、負擔得起的和加速從開發(fā)到上市的轉變。具有確定的安全記錄和足夠的抗HIV-1活性的已上市藥物賦形劑或者食物可提供這一選擇。全球AIDS流行病已經無情地持續(xù)發(fā)生了大約24年，且還看不到有希望的預防性干預措施。2003年有5百萬例新HIV感染病例和3百萬例AIDS死亡病例[UNAIDSAIDSEpidemicUpdate(December2003)2004[http://www.unaids.org/en/other/functionalities/ViewDocument.asp？href＝http％3a％2f％2fgva-doc-owl％2fWEBcontent％2fDocuments％2fpub％2fPublications％2fIRC-pub06％2fJC943-EpiUpdate2003_en％26％2346％3bpdf]]。到目前為止，伴隨HIV-1感染/AIDS而生活的人數(shù)已達到4千萬人，且如上所述，自從AIDS開始以來已經有大約3千萬人死于該疫病[UNAIDSAIDSEpidemicUpdate(December2003)，2004；WHO/SEAROCDSHIV/AIDSEnd-2000globalestimates(Childrenandadults)，2001[http://w3.whosea.org/hivaids/fact.htm#End-2000％20global％20estimates]。大多數(shù)新感染病例是通過粘膜途徑而獲得的，異性傳播起了主要(≈80％)的作用。雖然每次未經保護的性交行為的傳播發(fā)生率估計很低(0.0001-0.004)，但如果涉及到急性感染的個人，則傳播發(fā)生率顯著增加[Shattock，R.J.，Moore，J.P.InhibitingsexualtransmissionofHIV-1infection，Nat.Rev.Microbiol.，(2003)，125-34；Pilcher，C.D.，Tien，H.，Eron，J.J.，Vernazza，P.L.，Leu，S-Y，Stewart，P.W.，Goh，L-E，Cohen，M.S.BriefbutefficientAcuteHIVinfectionandthesexualtransmissionofHIV，J.Infect.Dis.，(2004)，1891785-1792]，其累積效應是勢不可擋的。適用于全球免疫計劃的抗HIV-1疫苗預期許多年后都不可能獲得。因此，急需其它的預防策略。這包括進行教育工作和實施機械和/或化學屏障方法。后一方法對應于殺微生物劑，即設計來在性交前經陰道(也許還可經直腸)施用以阻斷HIV-1感染(也許還有其它性傳播疾病的傳播)的局部制劑[Shattock，R.J.，Moore，J.P.InhibitingsexualtransmissionofHIV-1infection，Nat.Rev.Microbiol.，(2003)，125-34；Stone，A.MicrobicidesAnewapproachtopreventingHIVandothersexuallytransmittedinfections，Nat.Rev.DrugDiscov.，(2002)，1977-985；Shattock，R.，Solomon，S.Microbicides-aidstosafersex，Lancet，(2004)，3631002-1003；Brown，H.Marvellousmicrobicides.Intravaginalgelscouldsavemillionsoflives，butfirstsomeonehastoprovethattheywork，Lancet，(2004)，3631042-1043]。在概念上，優(yōu)選殺微生物劑制劑的活性成分(1)通過分別防止HIV-1與細胞受體CD4、共同受體CXCR4/CCR5和與樹突細胞/游走細胞上的受體(捕捉病毒并將其傳播到與病毒復制有直接關系的細胞)的結合，阻斷病毒進入易感細胞中[Shattock，R.J.，Moore，J.P.InhibitingsexualtransmissionofHIV-1infection，Nat.Rev.Microbiol.，(2003)，125-34；Moore，J.P.，Doms，R.W.Theentryofentryinhibitorsafusionofscienceandmedicine，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，(2003)，10010598-10602；Pierson，T.C.，Doms，R.W.HIV-1entryinhibitorsnewtargets，noveltherapies，Immunol.Lett.，(2003)，85113-118；Davis，C.W.，Doms，R.W.HIVTransmissionClosingalltheDoors，J.Exp.Med.，(2004)，1991037-1040；Hu，Q.，F(xiàn)rank，I.，Williams，V.，Santos，J.J.，Watts，P.，Griffin，G.E.，Moore，J.P.，Pope，M.，Shattock，R.J.BlockadeofattachmentandfusionreceptorsinhibitsHIV-1infectionofhumancervicaltissue，J.Exp.Med.，(2004)，1991065-1075]，和/或(2)具有殺病毒作用。所述制劑必須不會對靶組織造成不利影響，且在殺微生物劑去除后不應使靶組織變得更易受感染[Fichorova，R.N.，Tucker，L.D.，Anderson，D.J.Themolecularbasisofnonoxynol-9-inducedvaginalinflammationanditspossiblerelevancetohumanimmunodeficiencyvirustype1transmission，J.Infect.Dis.，(2001)，184418-428；Fichorova，R.N.，Bajpai，M.，Chandra，N.，Hsiu，J.G.，Spangler，M.，Ratnam，V.，Doncel，G.F.Interleukins(IL)-1，IL-6andIL-8predictmucosaltoxicityofvaginalmicrobicidalcontraceptives，Biol.Reprod.EpubaheadofprintMay52004[http://www.biolreprod.org/cgi/rapidpdf/biolreprod.104.029603v1]]。用抗逆轉錄病毒藥物進行治療在工業(yè)化國家已經降低了AIDS死亡率，但迄今為止在發(fā)展中國家作用甚微[Weiss，R.AIDSunbeatable20yearson，Lancet，(2001)，3572073-2074]。為避免在殺微生物劑上出現(xiàn)類似的兩極分化現(xiàn)象，應對殺微生物劑加以設計和選擇，使其變得負擔得起和可廣泛獲得，同時使得其研究開發(fā)和上市銷售之間的時間盡可能縮短。如果具有確立的安全記錄的大規(guī)模生產產品被發(fā)現(xiàn)具有抗HIV-1活性，就會促進這一點。通過分別篩選藥物賦形劑(藥物劑型的“非活性”成分)和食物的抗病毒性能，也許可以發(fā)現(xiàn)有資格被考慮用于殺微生物劑開發(fā)的候選者。這個方法已經導致發(fā)現(xiàn)1，2-苯二甲酸醋酸纖維素(用于腸溶片劑和膠囊劑的包衣)可作為有希望的候選殺微生物劑[Neurath，A.R.，Strick，N.，Li，Y-Y，Lin，K.，Jiang，S.Designofa″microbicide″forpreventionofsexuallytransmitteddiseasesusing″inactive″pharmaceuticalexcipients，Biologicals，(1999)，2711-21；Neurath，A.R.，Strick，N.，Li，Y-Y，Debnath，A.K.Celluloseacetatephthalate，acommonpharmaceuticalexcipient，inactivatesHIV-1andblocksthecoreceptorbindingsiteonthevirusenvelopeglycoproteingp120，BMCInfect.Dis.，(2001)，117；Neurath，A.R.，Strick，N.，Jiang，S.，Li，Y-Y，Debnath，A.K.Anti-HIV-1activityofcelluloseacetatephthalateSynergywithsolubleCD4andinductionof″dead-end″gp41six-helixbundles，BMCInfect.Dis.，(2002)，26；Neurath，A.R.，Strick，N.，LiY-YAnti-HIV-1activityofanionicpolymersAcomparativestudyofcandidatemicrobicides，BMCInfect.Dis.，(2002)，227；Neurath，A.R.，Strick，N.，Li，Y-YWaterdispersiblemicrobicidalcelluloseacetatephthalatefilm，BMCInfect.Dis.，(2003)，327]。在本文中描述中和至pH≈7以減少酸性引起的非特異性作用的果汁的篩選結果。石榴因其藥用性能數(shù)千年來一直受到人們的崇拜，且被世界上許多主要宗教認為是神圣的。出于對石榴的崇敬，英國醫(yī)學會(BritishMedicalAssociation)和幾個英國皇家學院(BritishRoyalCollege)在它們的盾徽中描繪了石榴。倫敦皇家醫(yī)學院(RoyalCollegeofPhysiciansofLondon)早在16世紀中葉就將石榴采用到它們的盾徽中[Langley，P.，WhyaPomegranate？，BMJ，2000，3211153-1154]。文學上對石榴種子的避孕威力的提及，最著名的是希臘經典神話。普西芬尼(Persephone，宙斯之女，被冥王劫持娶作冥后)在冥界時吃了六顆石榴果仁(石榴果仁可制石榴汁)，為此秋冬兩季的數(shù)月時間里大地萬物荒蕪。具有諷刺意味的是，本申請證實，石榴汁含有的HIV-1或HIV-2進入抑制劑就對應于一類仍有待開發(fā)的抗逆轉錄病毒藥物[Greene，W.C.，ThebrighteningfutureofHIVtherapeutics，Nat.Immunol.，2004，5867-871]。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供可用作HIV-1或HIV-2進入抑制劑的淀粉-石榴汁復合物。本發(fā)明的又一個目標是預防HIV-1或HIV-2感染。這些目標以及其它目標和優(yōu)點由本發(fā)明來提供。本發(fā)明提供包含石榴汁抗HIV-1或抗HIV-2活性成分的復合物，活性成分在淀粉為水不溶性形式時吸附到淀粉上。所述復合物能抑制HIV-1或HIV-2感染。所述復合物能阻斷HIV-1或HIV-2與CD4受體及CCR5和CXCR4共同受體的結合。本發(fā)明還涉及預防HIV-1或HIV-2感染的方法，所述方法包括給予人的粘膜藥物有效抗HIV-1或抗HIV-2量的上述包含吸附到淀粉上的石榴汁抗HIV-1或抗HIV-2活性成分的復合物。本發(fā)明還涉及包含藥物有效抗HIV-1或抗HIV-2量的上述復合物與藥物可接受載體的組合的藥物組合物。本發(fā)明還涉及預防HIV-1或HIV-2感染的方法，所述方法包括給予人的粘膜藥物有效抗HIV-1或抗HIV-2量的上述藥物組合物。附圖簡述出于說明本發(fā)明的目的，提供了附圖。但是應認識到，本發(fā)明并不受限于附圖中圖示的明確主題。圖1是顯示石榴汁(PJ)分別對HeLa-CD4-LTR-β-gal細胞和U373-MAGI-CCR5E細胞的HIV-1感染的抑制作用的圖。陰影區(qū)域＝HIV-1IIIB；非陰影區(qū)域＝HIV-1BaL。試驗了四種不同的石榴汁(PJ1-PJ4)。感染情況通過測量β-半乳糖苷酶來監(jiān)測。圖2是顯示石榴汁(PJ)分別對CD4與重組gp120IIIB的結合和與BaL的結合的抑制作用的圖。各孔與石榴汁的各稀釋液一起37℃下溫育1小時。各孔除去石榴汁后進行洗滌，加入生物素基-CD4并用ELISA測量其與各孔的結合情況。圖3是顯示石榴汁(PJ)對衍自gp120序列的合成肽的抗體與gp120的結合的抑制作用的圖。將包被gp120IIIB的聚苯乙烯板的各孔與4倍稀釋的石榴汁一起37℃下溫育1小時。各孔除去石榴汁后進行洗滌，加入50倍稀釋的抗肽抗血清[Neurath，A.R.，Strick，N.，Jiang，S.Syntheticpeptidesandanti-peptideantibodiesasprobestostudyinterdomaininteractionsinvolvedinvirusassemblyTheenvelopeofthehumanimmunodeficiencyvirus(HIV-1)，Virol.，(1992)，1881-13]。用ELISA定量結合的IgG。對照孔不加入石榴汁。繪出了與各對照孔比較的吸光度下降值。圖4得自X射線晶體結構，分別顯示了對應于在石榴汁存在下與gp120結合被抑制≥50％的抗肽抗體的區(qū)段在gp120結構上的位置(陰影區(qū)域)，及參與CD4和CXCR4/CCR5共同受體結合的氨基酸殘基在gp120結構上的位置。gp120結構的非陰影部分對應于與gp120的附著不被石榴汁顯著抑制的抗肽抗體。將中和抗體的CD4結構域和抗原結合片斷從gp120-CD4抗體復合物的結構上切除掉[Kwong，P.D.，Wyatt，R.，Robinson，J.，Sweet，R.W.，Sodroski，J.，Hendrickson，W.A.StructureofanHIVgp120envelopeglycoproteinincomplexwiththeCD4receptorandaneutralizinghumanantibody，Nature，(1998)，393648-659](1gc1從蛋白質數(shù)據庫(pdb)檢索到[http://www.rcsb.org/pdb/)]。按文獻描述[Neurath，A.R.，Strick，N.，Li，Y-Y，Debnath，A.K.Celluloseacetatephthalate，acommonpharmaceuticalexcipient，inactivatesHIV-1andblocksthecoreceptorbindingsiteonthevirusenvelopeglycoproteingp120，BMCInfect.Dis.，(2001)，117]，將通過同源模建產生的V3環(huán)添加到結構gp120中。圖形由Molscript[Kraulis，P.J.，MOLSCRIPTaprogramtoproducebothdetailedandschematicplotsofproteinstructures，J.Appl.Cryst.，(1991)，24946-950]和Raster3D[Bacon，D.J.，Anderson，W.F.Afastalgorithmforrenderingspace-fillingmoleculepictures，J.Mol.Graphics，(1988)，6219-220；Merritt，E.A.，Bacon，D.J.Raster3DPhotorealisticmoleculargraphics，MethodsEnzymol.，(1997)，277505-524]產生。指示出了gp120可變環(huán)(V1-V5)的位置和序列的N末端和C末端的位置。圖5是顯示來自石榴汁(PJ)的gp120-CD4結合抑制劑在玉米淀粉上的吸附的圖。將玉米淀粉(PURITY21，NF級(S21)；200mg/ml)加入到經預過濾除去顆粒物的石榴汁中。在≈20℃下混合1小時后，讓淀粉沉淀下來，抽吸除去上清液。將沉淀物重懸(200mg/ml)于磷酸緩沖鹽水中。按對圖2的描述試驗上清液的系列稀釋液對CD4與gp120IIIB的結合的抑制作用。然后確認重懸的沉淀物對gp120BaL-CD4結合的抑制活性。對照淀粉不抑制gp120-CD4結合。圖6是顯示石榴汁(PJ)和PJ-S21分別對gp120IIIB-CD4復合體與表達CXCR4共同受體的細胞的結合的抑制作用的圖。將HIV-1IIIBgp120(5μg)和生物素基-CD4(2.5μg)加入到含有100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)(PBS-BSA)和石榴汁(PJ)(最終3倍稀釋)或PJ-S21(67mg)的100μl磷酸緩沖鹽水(PBS)中。在20℃下1小時后，將各混合物加入到106MT-2細胞中。30分鐘后，用PBS-BSA將細胞洗滌3次，加入PE-鏈霉親和素(一種對生物素特異的熒光標記；0.1μg)。20分鐘后，將細胞洗滌并用1％甲醛-PBS溶液固定。在FACSCalibur流式細胞儀(BectonDickinsonImmunocytometricSystems，SanJose，CA)中進行流式細胞術分析。暴露于gp120-CD4、gp120-CD4+PJ、gp120-CD4+PJ-S21的各細胞和對照細胞的相對熒光值中值分別是13.7、4.0、4.3和2.1。圖7顯示石榴汁和PJ-S21分別對FLSC與表達CCR5的Cf2Th/synCCR5細胞的結合的抑制作用。FLSC是gp120BaL與CD4的D1D2結構域連接組成的嵌合重組蛋白。用基于細胞的ELISA[Zhao，Q.，Alespeiti，G.，Debnath，A.K.AnovelassaytoidentifyentryinhibitorsthatblockbindingofHIV-1gp120toCCR5，Virol.，326299-309]對抑制作用進行定量。PJ-S21的起始濃度是200mg/ml。圖8A和8B是顯示PJ-S21對生物素基-gp120IIIB與外周血單核細胞(PBMC)的結合的抑制作用的圖。將HIV-1IIIB生物素基-gp120(5μg)加入到含有等級量的(gradedquantitiesof)PJ-S21的100μlPBS-BSA中。在20℃下1小時后，將各混合物加入到106PBMC中。30分鐘后，用PBS-BSA將細胞洗滌3次，加入PE-鏈霉親和素(0.1μg)。之后采用上文對圖6描述的程序。對照細胞和在不存在或存在PJ-S21(100，6.25和3.12mg/ml)下暴露于生物素基-gp120的細胞的相對熒光值中值分別是4.1、81.31、12.2、35.2和50.0。100mg的PJ-S21相當于大約320μg從石榴汁吸附到淀粉上的固形物。圖9顯示HIV-1IIIB或BaL復制的抑制情況取決于感染前或感染后PJ-S21的加入時間。為進行比較，測定了在HIV-1之后在不同時間間隔加入到細胞中的非核苷類逆轉錄酶抑制劑TMC-120對感染的抑制作用。病毒感染情況通過對β-半乳糖苷酶的定量來測量。圖10是顯示PJ-S21及其制劑的HIV-1抑制和殺病毒活性的圖。對HIV-1IIIB和BaL感染的抑制情況分別按對圖1的描述進行測定。為測量殺病毒活性，將各病毒與等級量的PJ-S21在37℃下混合5分鐘。低速離心后，用PEG8000沉淀并離心，來分離病毒。將重懸的沉淀病毒和未處理的對照病毒進行系列稀釋，并測定各稀釋液的傳染性。橫坐標上給出的濃度范圍相當于0.31-1,268μg從石榴汁吸附到淀粉上的固形物。發(fā)明詳述本發(fā)明的復合物包含淀粉和石榴汁的抗HIV-1或抗HIV-2活性成分，所述成分吸附到水不溶性形式的淀粉上。所述淀粉是能選擇性吸附石榴汁的抗HIV-1或抗HIV-2活性成分的淀粉。本發(fā)明的復合物能抑制HIV-1或HIV-2感染。所述復合物因此可充當阻斷HIV-1或HIV-2感染的局部殺微生物劑。所述復合物是HIV-1或HIV-2進入抑制劑(即能防止HIV-1或HIV-2進入細胞中)，因為它能阻斷HIV-1或HIV-2與CD4受體及CCR5和CXCR4共同受體的結合。通過將100-250mg的淀粉與1ml的石榴汁組合，優(yōu)選將150-225mg的淀粉與1ml的石榴汁組合，產生所述復合物?？蓪⒈景l(fā)明的淀粉-石榴汁復合物給予男人或女人的粘膜，以預防HIV-1或HIV-2感染。因此，可將所述淀粉-石榴汁復合物應用到身體內表面，如陰道或直腸。給予方式包括局部給予、陰道給予或直腸給予。本發(fā)明對于預防性接觸如性交過程中的HIV-1或HIV-2感染特別有效。為將本發(fā)明復合物給予人，優(yōu)選它為包含藥物有效抗HIV-1或抗HIV-2量的所述復合物和藥物可接受載體的藥物組合物形式。所述藥物可接受載體應優(yōu)選為這樣的載體，它使得本發(fā)明的淀粉-石榴汁復合物能以栓劑、水可分散膜劑、水可分散片劑、海綿劑或凝膠劑的形式給予。其中載體是固體的適合直腸或陰道給予的藥物制劑，最優(yōu)選體現(xiàn)為單位劑量栓劑。合適的載體包括名為“FATTIBASE”的脂肪酸栓劑基料(或氫化植物油栓劑基料)、可可脂及本領域常用的其它材料，所述栓劑可方便地通過將本發(fā)明的復合物與軟化或熔化的載體混合，然后在模子中冷卻并成型來形成。通過將凍干的石榴/淀粉復合物與羥丙基甲基纖維素(“HPMC”)、“PHARMABURST”(一種快速溶解的遞送平臺，堆積密度為0.450，振實密度為0.536，Carr指數(shù)為16.0％，SPIPharma制造)、“CARBOPOL947P”聚合物(Cleveland，OH的Noreon，Inc.制造)和“CARBOPHIL”(美國俄亥俄州Cleveland，OH的Noreon，Inc.制造)組合，可制備粘膜粘附性立即可分散(水可分散)片劑。本發(fā)明的復合物可摻入到水可分散膜劑(類似于廣泛使用的“breathcontrol”條)中。本發(fā)明的復合物也可摻入到在局部施用后會轉化成凝膠的水可分散海綿劑中(參見Neurath等，BMCInfect.Dis.，2003，327；美國專利第6,572,875號和美國專利第6,596,297號，這兩份專利的全部內容通過引用結合到本文中)。根據本發(fā)明使用的藥物組合物也可含有其它活性成分，如殺精子劑、抗微生物劑、防腐劑或其它抗病毒劑。本發(fā)明的藥物組合物也可含有含有添加劑如防腐劑、調味劑(flavor)和香料(fragrance)。這些添加劑可以以任何需要的濃度存在。這些添加劑的濃度將決定于所需的性能、所要釋放的藥物、功效、所需的劑量、溶解時間等。每一種上述制劑都應符合以下要求(1)使用為遞送殺微生物凝膠劑/霜劑所需要的施用器時伴隨產生的廢物處理問題最小化；(2)簡便；(3)小包裝，購買、攜帶和儲存時易辨別；(4)低生產成本；(5)易于在全球多個地方進行工業(yè)大規(guī)模生產；和(6)具有作為直腸殺微生物劑的應用潛力。所述復合物可以以0.5-3g，優(yōu)選1-1.5g的濃度給予。此外，仍有可能生產出貨架期短的基于PJ-S21的凝膠制劑供局部使用，以避免通過適當?shù)牡蜏馗稍锓椒ㄉaPJ-S21干粉的成本。這些制劑無論選擇哪一種，都需要有足夠的質量控制，以確保成品的抗HIV-1或抗HIV-2活性一致和建立可再現(xiàn)的制造條件。在得出本發(fā)明的過程中，用CD4和CXCR4作為細胞受體篩選了各種果汁對HIV-1IIIB的抑制活性。最佳的果汁在以下抑制作用方面經過了試驗(1)對HIV-1BaL感染的抑制作用，試驗用CCR5作為細胞受體；和(2)對gp120IIIB和gp120BaL分別與CXCR4和CCR5的結合的抑制作用。為除去大部分的果汁有色成分，研究了有效成分與可分散賦形劑和其它食物的吸附作用。對選出的復合物試驗了其對原代HIV-1分離物感染的抑制作用。發(fā)現(xiàn)來自石榴汁的HIV-1進入抑制劑能吸附到玉米淀粉上。所得的復合物能阻斷病毒與CD4和CXCR4/CCR5的結合，抑制原始病毒分化體A-G和O群的感染。本文的結果證明了從安全性經過多個世紀得到證實的、廉價、可廣泛獲得的來源生產抗HIV-1殺微生物劑的可行性，條件是它的質量得到足夠的標準化和監(jiān)測。石榴汁含有的幾種成分[Poyrazoglu，E.，Goekmen，V.，Artik，N.Organicacidsandphenoliccompoundsinpomegranates(PunicagranatumL.)GrowninTurkey，J.FoodCompositionandAnalysis，(2002，15567-575；Module2Phytochemicals(minerals，phytamins，andvitamins)]，其從石榴汁以外的天然產物分離出來，據報告具有抗HIV活性，這些成分例如咖啡酸[Mahmood，N.，Moore，P.S.，Detomassi，N.，Desimone，F(xiàn).，Colman，S.，Hay，A.J.P.C.InhibitionofHIV-infectionbycaffeoylquinicacid-derivatives.Antivir.Chem.Chemother.，(1993)，4235-240]、熊果酸[Ma，C.，Nakamura，N.，Miyashiro，H.，Hattori，M.，Shimotohno，K.Inhibitoryeffectsofursolicacidderivativesfromcynomoriumsongaricum，andrelatedtriterpenesonhumanimmunodeficiencyviralprotease，PhytotherapyResearch，(1998)，12s138-142]、兒茶酚和槲皮黃酮[Mahmood，N.，Piacente，S.，Pizza，C.，Burke，A.，Khan，A.I.，Hay，A.J.Theanti-HIVactivityandmechanismsofactionofpurecompoundsisolatedfromRosadamascena，Biochem.Biophys.Res.Commun.，(1996)，22973-79；DeTommasi，N.，Piacente，S.，Rastrelli，L.，Mahmood，N.，Pizza，C.Anti-HIVactivitydirectedfractionationoftheextractsofMargyricarpussetosus，PharmaceuticalBiology，(1998)，3629-32]。但是，與來自石榴汁的進入抑制劑不同的是，這些化合物市售獲得的純化形式經本文描述的ELISA測量發(fā)現(xiàn)并不能阻斷(200μg/ml下)gp120-CD4結合，并且不能吸附到玉米淀粉上。實際上，用淀粉處理石榴汁除去進入抑制劑后的上清液保留有抗HIV-1活性，且與吸附到淀粉上的HIV-1進入抑制劑不同的是，它還能抑制皰疹病毒1型的感染。因此，上清液中的抗病毒活性似乎是非特異性的，可能類似于石榴皮提取物的活性[ReutersNewMedia，IncPomegranatescouldhelpinbattleagainstAIDS，1996Mar10.http://www.aegis.com/news/re/1996/RE960310.html；BritishMuslimsMonthlySurveyMedicalbreakthrough.1996March；IV6[http://artsweb.bham.ac.uk/bmms/1996/03March96.html#Medical％20breakthrough]，但沒有作進一步的表征。另外的信息[Jassim，S.A.A.，Denyer，S.P.，andStewart，G.S.A.B.Antiviralorantifungalcompositioncomprisinganextractofpomegranaterindorotherplantsandmethodofuse，美國專利第5,840,308號(1998年11月24日授予)；Shehadeh，A.A.Herbalextractcompositionandmethodwithimmune-boostingcapability，美國專利第6,030,622號(2000年2月29日授予)；Jassim，S.A.A.，Denyer，S.P.，andStewart，G.S.A.B.Antiviralorantifungalcompositionandmethod，美國專利第6,187,316號(2001年2月2日授予)；Jassim，S.A.A.andDenyer，S.P.Antiviralorantifungalcompositionandmethod，美國專利申請2002/0064567(2002年5月30日公布)]揭示，上述發(fā)現(xiàn)適用于在可破壞本文所述HIV-1進入抑制劑的條件下高溫制備的石榴皮粗提取物。干擾gp120與CD4的結合的抑制劑(圖2和5)阻斷了gp120上參與和CXCR4/CCR5共同受體(圖4、6和7)相互作用的另外位點(圖3)。這完全沒有預料到，不過可以有這樣兩種解釋，PJ-S21中存在多種具有獨特或重疊的特異性的抑制劑，或者誘導了gp120構象變化[Hsu，S-T，Bonvin，A.M.J.J.AtomicinsightintotheCD4binding-inducedconformationalchangesinHIV-1gp120，Proteins，(2004)，55582-593]而導致gp120上的CD4和CXCR4/CCR5結合位點被封鎖。對于其它小分子抑制劑也注意到類似的作用[Neurath，A.R.，Strick，N.，Lin，K.，Debnath，A.K.，Jiang，S.TinprotoporphyrinIXusedincontrolofhememetabolisminhumanseffectivelyinhibitsHIV-1infection，AntiviralChem.Chemother.，(1994)，5322-330]。期望候選殺微生物劑同時封閉HIV-1上一個以上的參與病毒進入的位點，以提高其有效性[Hu，Q.，F(xiàn)rank，I.，Williams，V.，Santos，J.J.，Watts，P.，Griffin，G.E.，Moore，J.P.，Pope，M.，Shattock，R.J.BlockadeofattachmentandfusionreceptorsinhibitsHIV-1infectionofhumancervicaltissue，J.Exp.Med.，(2004)，1991065-1075]。抑制劑的靶位點很可能位于gp120的蛋白質部分當中，因為標記的雪滴花(Galanthusnivalis)凝集素(對末端甘露糖殘基特異)[Hammar，L.，Hirsch，I.，Machado，A.A.，deMareuil，J.，Baillon，J.G.，Bolmont，C.，Chermann，J-CLectin-mediatedeffectsofHIVtype1infectioninvitro，AIDSRes.Hum.Retroviruses，(1995)，1187-95]和其它凝集素與gp120寡糖的結合在石榴汁或PJ-S21存在下并沒有減少(數(shù)據未給出)。已證實通過單克隆抗體或CD4-IgG2重組蛋白封閉HIV-1gp120上的CD4結合位點，足以體外(exvivo)抑制人宮頸組織的HIV-1感染[Hu，Q.，F(xiàn)rank，I.，Williams，V.，Santos，J.J.，Watts，P.，Griffin，G.E.，Moore，J.P.，Pope，M.，Shattock，R.J.BlockadeofattachmentandfusionreceptorsinhibitsHIV-1infectionofhumancervicaltissue，J.Exp.Med.，2004，1991065-1075]，陰道施用時防止病毒傳播給獼猴[Veazey，R.S.，Shattock，R.J.，Pope，M.，Kirijan，J.C.，Jones，J.，Hu，Q.，Ketas，T.，Marx，P.A.，Klasse，P.J.，Burton，D.R.，Moore，J.P.PreventionofvirustransmissiontomacaquemoneysbyavaginallyappliedmonoclonalantibodytoHIV-1gp120，Nat.Med.，2003，9343-346]。因此，預期PJ-S21將會同樣有效。PJ-S21作為局部抗HIV-1殺微生物劑的應用，要求在不同時間和地點生產的各批次之間有合理的一致性。不同的新鮮制備石榴汁和貯藏時間不明的市售石榴汁的gp120-CD4結合抑制活性相似，這提示以上要求是切實可行的。石榴汁在85℃下巴氏滅菌30秒，導致了抑制活性完全喪失。一種市售石榴汁濃縮物暴露于61℃，還有其它兩種大概是高溫蒸發(fā)制備得到的濃縮物，它們的活性都消失或急劇減少。PJ3(添加了果糖和檸檬酸的石榴汁)的gp120-CD4抑制活性未能結合到淀粉上。另外的實驗揭示，這些化合物會干擾抑制劑與玉米淀粉的結合。因此，打算用來生產PJ-S21復合物的石榴汁必須通過過濾法滅菌，且不含添加劑。必須特別注意淀粉的選擇，以便石榴汁的病毒進入抑制劑的有效結合，而淀粉是陰道制劑中常用的藥物賦形劑[Garg，S.，Tambweker，K.R.，Vermani，K.，Garg，A.，Kaul，C.L.，Zaneveld，L.J.D.Compendiumofpharmaceuticalexcipientsforvaginalformulations，PharmaceuticalTechnologyDrugDelivery，(2001)，Sept.14-24.[http://ptech.adv100.com/pharmtech/data/articlestandard/pharmtech/512001/5133/article.pdf]]。在試驗過的多種淀粉中，最好的結果是用PURITY21玉米淀粉NF等級(S21)獲得的。但是認為不同品牌的淀粉都可能是有效的，所以本發(fā)明并不限于S21。對于試驗過的其它品牌的淀粉，要么抑制劑的吸附不完全，要么抑制劑的結合并沒有導致產生在測量gp120-CD4結合抑制情況的ELISA中具有活性的復合物(ARGO玉米淀粉)，大概是因為石榴汁抑制劑發(fā)生了不可逆結合。有趣的是，只有少數(shù)參考文獻涉及到淀粉作為不同化合物的吸附劑的用途，這些化合物如香料[Yao，W.，Yao，H.Adsorbentcharacteristicsofporousstarch，Starch/Starke，2002，54260-263；Whistler，R.L.Microporousgranularstarchmatrixcompositions，U.S.Patent4,985,082issuedJanuary15，1991]、染料[Berset，C.，Clermont，H.，Cheval，S.Naturalredcoloranteffectivenessasinfluencedbyabsorptivesupports，J.FoodSci.，1995，60858-861，879；Stute，R.，Woelk，H.U.Interactionbetweenstarchandreactivedyes，Newtechniquefortheinvestigationofstarch.II.Influenceoffixationreactionofstarch，Starch/Starke，1974，261-9；Seguchi，M.Dyebindingtothesurfaceofwheatstarchgranules，CerealChemistry，1986，63518-520]、低分子量糖類[Tomasik，P.，Wang，Y-J，Jane，J.L.Complexesofstarchwithlow-molecularsaccharides，Starch/Starke，1995，47185-191]、脂類[Zhang，G.，Maladen，M.D.，Hamaker，B.R.Detectionofnovelthreecomponentcomplexconsistingofstarch，protein，andfreefattyacids，J.Agric.FoodChem.，2003，512801-2805；Johnson，J.M.，Davis，E.A.，Gordon，J.Lipidbindingofmodifiedcornstarchesstudiesbyelectronspinresonance，CerealChemistry，1990，67236-240]、蛋白質[Tomazic-Jezic，V.J.，Lucas，A.D.，Sanchez，B.A.Bindingandmeasuringnaturalrubberlatexproteinsonglovepowder，J.ImmunoassayImmunochem.，2004，25109-123]和碘[Conde-Petit，B.，Nuessli，J.，Handshin，S.，Escher，F(xiàn).Comparativecharacterizationofaqueousstarchdispersionsbylightmicroscopy，rheometry，andiodinebindingbehavior，Starch/Starke，1998，50184-192]。本發(fā)明復合物的預定劑量(例如供陰道施用的PJ-S21)是1.0-1.5g(＝3.17-4.76mg從石榴汁吸附到淀粉上的固形物)，即比在體外阻斷HIV-1感染所需的劑量高≥100倍(圖10，表1)，因此預期可符合有希望在體內保護免受病毒陰道攻擊的要求[Moore，J.，Wainberg，M.，Amman，A.，Veazey，R.，Pope，M.，Shattock，R.J.，Doms，R.W.Developmentoffusion/entryinhibitorsastopicalmicrobicides，InProceedingoftheMicrobicides，(2004)28-31March2004；London[http://www.microbicides2004.org.uk/progtue.html]]。這一PJ-S21量從5-7.5ml的石榴汁，即單份石榴汁(150ml)的≤5％得到，證實了這一建議的候選局部殺微生物劑的安全性、可行性和經濟性。實施例現(xiàn)將參考以下非限制性實施例對本發(fā)明進行描述。試劑石榴汁(PJ)購自美國紐約州紐約市當?shù)厣痰?；它們的來源在括號中給出PJ1(MadeiraEnterprisesInc.，Madeira，CA)；PJ2在本發(fā)明人的實驗室中從新鮮成熟的石榴制備得到；PJ3(Sadaf7；Sadaf7Foods，LosAngeles，CA；附加成分果糖、檸檬酸)；PJ4(CortasCanning&RefrigerationCo.S.A.L.，Beirut，Lebanon)；PJ5(Kradjian，Import&WholesaleDistribution，Glendale，CA.，伊朗產品)；PJ6(R.W.Knudson；JustPomegranate；Knudsen&Sons，Inc.，Chico，CA)；PJ7(AromaproductLtd.，美國佐治亞州產品；Tamani，Inc.，NewYork，NY經銷)。所用的淀粉如下PURE-DENTB815玉米淀粉NF、PURE-DENTB816玉米淀粉USP、SpressB825預糊化玉米淀粉NF、SpressB820預糊化玉米淀粉NF、INSTANTPURE-COTETMB792食用淀粉-改性、INSCOSITYTMB656食用淀粉-改性(GrainProcessingCorporation，Muscatine，IN)；PURITY21玉米淀粉NF和PURITY826玉米淀粉NF(NationalStarchandChemicalCompany，Bridgewater，NJ)；RemylineAX-DR糯米淀粉和RemyDR稻米淀粉，中級壓碎(A&BIngredients，F(xiàn)airfield，NJ)；ARGO玉米淀粉(BestFoodsDivision，CPCIntemationalInc.，EngelwoodCliffs，NJ)；STALEY食用純粉狀淀粉(Tate&Lyle，Decatur，IL)；STARCH1500預糊化淀粉NF(Colorcon，WestPoint，PA)。使用了以下聚合物聚乙二醇(PEG)1000NF，1500NF和8000NF；羥丙基甲基纖維素(HPMC)，50cps，USP(Spectrum，NewBrunswick，NJ)；Carbopol974P-NF(B.F.GoodrichCo.，Cleveland，OH)；Carbophil，NoveonAA1(Noveon，Inc.，Clevelan，OH)；和PharmaburstB2(SPIPharma，NewCastle，DE)。Fattibase獲自PaddockLaboratories，Inc.，Minneapolis，MN。采用了以下重組蛋白HIV-1IIIBgp120，生物素基-HIV-1IIIBgp120，CD4和生物素基-CD4(ImmunoDiagnostics，Inc.，Woburn，MA)；HIV-1IIIBBaLgp120和FLSC(由BaLgp120通過20氨基酸接頭與CD4的D1D2結構域連接而組成的全長單鏈蛋白)(在被轉染的293T細胞中產生[Zhao，Q.，Alespeiti，G.，Debnath，A.K.AnovelassaytoidentifyentryinhibitorsthatblockbindingofHIV-1gp120toCCR5，Virol.，326299-309]。藻紅蛋白(PE)標記的鏈霉親和素獲自R&DSystems，Minneapolis，MN。生物素化的雪滴花凝集素獲自EYLaboratories，Inc.，SanMateo，CA。抗衍生自gp120的合成肽(殘基編號按Neurath，A.R.，Strick，N.，Jiang，S.Syntheticpeptidesandanti-peptideantibodiesasprobestostudyinterdomaininteractionsinvolvedinvirusassemblyTheenvelopeofthehumanimmunodeficiencyvirus(HIV-1)，Virol.(1992)，1881-13)的兔抗體按Neurath等，Virol.，(1992)，1881-13的描述制備。對CD4結合位點特異的單克隆抗體(mAb)588D和對gp120V3環(huán)特異的單克隆抗體9284分別獲自S.Zolla-Pazner博士和NENResearchProducts，DuPont，Boston，MA。“一般”形式的非核苷類HIV-1逆轉錄酶抑制劑TMC-120[VanHerrewege，Y.，Michiels，J.，VanRoey，J.，F(xiàn)ransen，K.，Kestens，L.，Balzarini，J.，Lewi，P.，Vanham，G.，Janssen，P.InvitroevaluationofnonnucleosidereversetranscriptaseinhibitorsUC-781andTMC120-R147681ashumanimmunodeficiencyvirusmicrobicides，Antimicrob.AgentsChemother.，(2004)，48337-339]由AlbanyMolecularResearch，Inc.，Albany，NY合成，在對照實驗中以5μM終濃度使用。HIV-1IIIB和BaL的1000倍沉淀濃縮物(分別為6.8×1010個病毒顆粒/ml和2.47×1010個病毒顆粒/ml)獲自AdvancedBiotechnologies，Inc.，Columbia，MD。原代HIV-1分離物、MT-2細胞、HeLa-CD4-LTR-β-gal和U373-MAGI-CCR5E細胞及Cf2Th/synCCR5細胞獲自McKessonBioServicesCorporation，Rockville，MD管理的AIDSResearchandReferenceReagentProgram。用HIV-1長末端重復序列(LTR)-綠色熒光蛋白和熒光素酶報告基因構建物轉導、表達CD4受體及CXCR4和CCR5共同受體的CEMx1745.25M7細胞[Hsu，M.，Harouse，J.M.，Gettie，A.，Buckner，C.，Blanchard，J.，Cheng-Mayer，C.IncreasedmucosaltransmissionbutnotenhancedpathogenicityoftheCCR5-tropic，simianAIDS-inducingsimian/humanimmunodeficiencyvirusSHIVSF162P3mapstoenvelopegp120，J.Virol.，(2003)，77989-998]獲自CeciliaCheng-Mayer博士。該細胞維持在補加10％胎牛血清(FBS)、1μg/ml嘌呤霉素和200μg/mlG418的RPMI-1640培養(yǎng)基中。這些細胞適合用于滴定X4和R5HIV-1分離物和以可靠的再現(xiàn)性測定抗HIV-1藥物的有效性。這用外周血單核細胞(PBMC)是不可能實現(xiàn)的，因為衍自不同個體的外周血單核細胞在對HIV-1感染的易感性方面存在差異[Schwartz，D.H.，Castillo，R.C.，Arango-Jaramillo，S.，Sharma，U.K.，Song，H.F.，Sridharan，G.Chemokine-independentinvitroresistancetohumanimmunodeficiencyvirus(HIV-1)correlatingwithlowviremiainlong-termandrecentlyinfectedHIV-1-positivepersons，J.Infect.Dis.，1997，1761168-1174；Wu，L.，Paxton，W.A.，Kassam，N.，Ruffing，N.，Rottman，J.B.，Sullivan，N.，Choe，H.，Sodroski，J.，Newman，W.，Koup，R.A.，Mackay，C.R.CCR5levelsandexpressionpatterncorrelatewithinfectabilitybymacrophage-tropicHIV-1，invitro，J.Exp.Med.，1997，1851681-1691；Blaak，H.，Ran，L.J.，Rientsma，R.，Schuitmaker，H.SusceptibilityofinvitrostimulatedPBMCtoinfectionswithNS1HIV-1isassociatedwithlevelsofCCR5expressionandbeta-chemokineproduction，Virol.，2000，167237-246]。PBMC按文獻描述[Gartner，S.，Popovic，M.Virusisolationandproduction，InTechniquesinHIVResearch，EditedbyAldovini，A.，Walker，B.D.，NewYork；M.，StocktonPress；199053-70]從HIV-1陰性供體分離得到。制劑為嘗試將gp120-CD4結合活性與石榴汁的大多數(shù)其它成分分離，向每ml石榴汁各加入200mg不同的淀粉制品。在20℃下混合1小時后，傾析掉過量的石榴汁，將沉淀物重懸于1ml蒸餾水中。根據酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)的結果，選出PURITY21玉米淀粉，NF等級(S21)作進一步研究，相應的石榴汁復合物標號為PJ-S21。將PJ-S21凍干，用來制備以下制劑PEG栓劑(50％PJ-S21，45％PEG1000，5％PEG1500)；Fattibase栓劑(50％石榴汁-S21，50％Fattibase)；和粘膜粘附性立即可分散片劑(50％PJ-S21，20％HPMC，20％Pharmaburst，7.5％Carbopol974P和2.5％Carbophil)。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)依靠β-半乳糖苷酶讀取系統(tǒng)測定分別對HIV-1IIIB和BaL感染的抑制作用[Neurath，A.R.，Strick，N.，Li，Y-YAnti-HIV-1activityofanionicpolymersAcomparativestudyofcandidatemicrobicides，BMCInfect.Dis.，(2002)，227]。用MicrolightML2250發(fā)光計(DynatechLaboratories，Inc.，Chantilly，VA)，按Galacto-LightPlusSystem化學發(fā)光報告基因測定法(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)對酶進行定量。為測量殺病毒活性，通過離心和/或用PEG8000沉淀使病毒與過量的滅活劑分離[Neurath，A.R.，Strick，N.，Li，Y-YAnti-HIV-1activityofanionicpolymersAcomparativestudyofcandidatemicrobicides，BMCInfect.Dis.(2002)，227；Neurath，A.R.，Strick，N.，Li，Y-YWaterdispersiblemicrobicidalcelluloseacetatephthalatefilm，BMCInfect.Dis.(2003)，327]。如上所述試驗處理病毒的系列稀釋液的傳染性。獲得了處理病毒和對照病毒的劑量反應曲線(即發(fā)光度對稀釋度)，并計算出病毒滅活百分比[Neurath，A.R.，Strick，N.，Li，Y-YWaterdispersiblemicrobicidalcelluloseacetatephthalatefilm，BMCInfect.Dis.，(2003)，327]。為測定對原代HIV-1毒株感染的抑制情況，將CEMx1745.25M7細胞與100×TCID50的原代HIV-1毒株在不存在或存在等級(graded)濃度的PJ-S21時37℃下溫育3天。實驗重復進行三次。感染情況通過使用Promega(Madison，WI)的試劑盒在Ultra384發(fā)光計(Tecan，ResearchTrianglePark，NC)中測量熒光素酶活性來定量[Hsu，M.，Harouse，J.M.，Gettie，A.，Buckner，C.，Blanchard，J.，Cheng-Mayer，C.IncreasedmucosaltransmissionbutnotenhancedpathogenicityoftheCCR5-tropic，simianAIDS-inducingsimian/hnmanimmunodeficiencyvirusSHIVSF162P3mapstoenvelopegp120，J.Virol.，(2003)，77989-998]。通過ELISA測量CD4-HIV-1gp120結合及其抑制情況。將96孔聚苯乙烯板(ImmulonII，DynatechLaboratories，Inc.，Chantilly，VA)的各孔用100ng/孔的gp120IIIB或gp120BaL包被，并按文獻描述[Neurath，A.R.，Strick，N.，Li，Y.Y.，Debnath，A.K.Celluloseacetatephthalate，acommonpharmaceuticalexcipient，inactivatesHIV-1andblocksthecoreceptorbindingsiteonthevirusenvelopeglycoproteingp120，BMCInfect.Dis.，(2001)，117]進行后包被。將石榴汁和PJ-S21在含有100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)的0.14MNaCl，0.01MTris，0.02％硫柳汞鈉，pH7.0(TS)中的稀釋液分別加入到各孔中，37℃下保持1小時。將各孔用TS洗滌5x。將生物素基-CD4(1μg/ml)(TS-1％明膠中)加入到各孔中，37℃下保持5小時。用TS-0.1％Tween20洗滌1x和用TS洗滌5x后，加入辣根過氧化物酶(HRP)-鏈霉親和素(0.625μg/ml；Amersham，ArlingtonHeights，IL)(TS-2％明膠-0.05％Tween20中)。37℃下30分鐘后，將各孔用TS-0.1％Tween20洗滌4x，用TS洗滌2x。用KirkegaardandPerryLaboratoriesInc.(Gaithersburg，MD)的試劑盒檢測結合的HRP，在450nm處讀取吸光度(A)。吸光度在不存在抑制劑下是1.0-1.5，在不存在生物素基-CD4下是0-0.005。在另一測定中，將CD4(500ng/ml)與生物素基-gp120(1μg/ml)在存在或不存在抑制劑時20℃下混合30分鐘。將混合物的系列稀釋液加入到用抗CD4mAbOKT4(Ortho-ClinicalDiagnostics，Rochester，NY)包被的各孔中，如上所述用HRP-鏈霉親和素檢測被捕獲的生物素基-gp120。為測量抗gp120肽抗體與gp120的結合情況，將各兔抗血清在含有0.1％Tween20(pH8.0)的FBS和山羊血清混合物(9∶1)中稀釋50倍，加入到gp120孔中。用HRP標記的抗兔IgG(Sigma，St.Louis，MO；1μg/ml于TS-10％山羊血清-0.1％Tween20中)檢測結合的IgG。用基于細胞的ELISA測量PJ和PJ-S21分別對HIV-1BaLgp120上的CCR5結合位點的封閉情況[Zhao，Q.，Alespeiti，G.，Debnath，A.K.AnovelassaytoidentifyentryinhibitorsthatblockbindingofHIV-1gp120toCCR5，Virol.，326299-309]。簡單的說，將FLSC(125ng/ml)在不存在或存在等級量的抑制劑時加入到96孔板各孔中用5％甲醛固定的Cf2Th/synCCR5細胞中。37℃下1小時后，用對CD4D2結構域特異的mAbM-T441(125ng/ml；Ancell，Bayport，MN)檢測結合的FLSC，然后依次用生物素化的抗小鼠IgG和HRP-鏈霉親和素進行檢測。結果石榴汁的抗HIV-1活性試驗了各果汁[蘋果、黑櫻桃、藍莓、椰子汁、蔓越桔、接骨木、葡萄(紅)、葡萄柚、蜂蜜、檸檬、萊母酸橙、菠蘿、石榴和甜菜(10％復水干粉)]的系列兩倍稀釋液對表達CD4和CXCR4受體和共同受體的細胞的HIV-1IIIB感染的抑制作用。除藍莓汁、蔓越桔汁、葡萄汁和萊母酸橙汁外，大多數(shù)果汁(4倍稀釋)都沒有抑制活性[50％感染抑制(ED50)的終點在1/16-1/64之間]。來自不同地理區(qū)域的石榴汁一致地具有最高的抑制活性(圖1；陰影區(qū)域)。由于利用CCR5作為共同受體的HIV-1病毒(＝R5病毒)以性傳播為主[Shattock，R.J.，Moore，J.P.InhibitingsexualtransmissionofHIV-1infection，Nat.Rev.Microbiol.，(2003)，125-34；Shattock，R.J.，Doms，R.W.AIDSmodelsMicrobicidescouldlearnfromvaccines，Nat.Med.，(2002)，8425]，因此重要的是要驗證石榴汁是否不但能抑制利用CXCR4作為共同受體的HIV-1IIIB病毒(＝X4病毒)的感染，而且還能抑制HIV-1BaL這種R5病毒的感染。圖1中的結果(非陰影區(qū)域)顯示，后一病毒的感染也被抑制，盡管抑制得不如HIV-1IIIB那么有效。阻斷病毒進入是殺微生物劑開發(fā)的主要目標[Shattock，R.J.，Moore，J.P.InhibitingsexualtransmissionofHIV-1infection，Nat.Rev.Microbiol.，(2003)，125-34；Moore，J.P.，Doms，R.W.Theentryofentryinhibitorsafusionofscienceandmedicine，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(2003)，10010598-10602；Pierson，T.C.，Doms，R.W.HIV-1entryinhibitorsnewtargets，noveltherapies，Immunol.Lett.，(2003)，85113-118；Davis，C.W.，Doms，R.W.HIVTransmissionClosingalltheDoors，J.Exp.Med.，(2004)，1991037-1040；Hu，Q.，F(xiàn)rank，I.，Williams，V.，Santos，J.J.，Watts，P.，Griffin，G.E，Moore，J.P.，Pope，M.，Shattock，R.J.BlockadeofattachmentandfusionreceptorsinhibitsHIV-1infectionofhumancervicaltissue，J.Exp.Med.，(2004)，1991065-1075]。因此，有意義的是要測定石榴汁是否抑制HIV-1包膜糖蛋白gp120與CD4(X4病毒和R5病毒的共同受體)的結合。用石榴汁對gp120IIIB和BaL進行預處理，抑制了隨后可溶性標記CD4的結合(圖2)。這提示一種或多種石榴汁成分與gp120上的CD4結合位點發(fā)生強烈或不可逆的結合。在使用固定化在聚苯乙烯板上的gp120的ELISA中獲得的這些結果，在其中gp120和CD4均為可溶性形式的另一個試驗中得到確認(數(shù)據未給出)。在反向實驗(reverseexperiment)中，用石榴汁預處理CD4未能阻斷隨后的gp120結合。其它具有抗HIV-1活性的果汁(藍莓汁、蔓越桔汁、葡萄汁和萊母酸橙汁)未能阻斷gp120-CD4結合。為描繪出gp120上被石榴汁抑制劑封閉的位點，研究了石榴汁對衍生自gp120氨基酸序列的肽的抗體與gp120IIIB結合的抑制作用。抗體與肽的結合(102-126)、(303-338)、(306-338)、(361-392)、(386-417)、(391-425)、(411-445)和(477-508)受到顯著(≈50％)抑制(圖3)。分別對gp120V3環(huán)(殘基303-338)和CD4結合位點特異的單克隆抗體9284和588D[Skinner，M.A.，Ting，R.，Langlois，A.J.，Weinhold，K.J.，Lyerly，H.K.，Javaherian，K.，Matthews，T.J.CharacteristicsofaneutralizingmonoclonalantibodytotheHIVenvelopeglycoprotein.AIDSRes.Hum.Retroviruses，(1988)，4187-197；Laal，S.，Zolla-Pazner，S.EpitopesofHIV-1glycoproteinsrecognizedbythehumanimmunesystem，InImmunochemistryofAIDS，ChemicalImmunology，Volume56，EditedbyNorrbyE.BaselKarger；199391-111]與gp120的結合各自被抑制97％。一些相關的肽含有參與CD4結合的殘基[Kwong，P.D.，Wyatt，R.，Robinson，J.，Sweet，R.W.，Sodroski，J.，Hendrickson，W.A.StructureofanHIVgp120envelopeglycoproteinincomplexwiththeCD4receptorandaneutralizinghumanantibody，Nature，(1998)，393648-659；Xiang，S.H.，Kwong，P.D.，Gupta，R.，Rizzuto，C.D.，Casper，D.J.，Wyatt，R.，Wang，L.，Hendrickson，W.A.，Doyle，M.L.，Sodroski，J.Mutagenicstabilizationand/ordisruptionofaCD4-boundstaterevealsdistinctconformationsofthehumanimmunodeficiencyvirustype1gp120envelopeglycoprotein，J.Virol.，(2002)，769888-9899；Pantophlet，R.，OllmannSaphire，E.，Poignard，P.，Parren，P.W.I.，Wilson，I.A.，Burton，D.R.FinemappingoftheinteractionofneutralizingandnonneutralizingmonoclonalantibodieswiththeCD4bindingsiteofhumanimmunodeficiencyvirustype1gp120，J.Virol.，(2003)，77642-658]，而所有辨別的肽都包括參與共同受體結合的殘基[Westervelt，P.，Gendelman，H.E.，Ratner，L.Identificationofadeterminantwithinthehumanimmunodeficiencyvirus1surfaceenvelopeglycoproteincriticalforproductiveinfectionofprimarymonocytes，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1991)，883097-3101；Westervelt，P.，Trowbridge，D.B.，Epstein，L.G.，Blumberg，B.M.，Li，Y.，Hahn，B.H.，Shaw，G.M.，Price，R.W.，Ratner，L.Macrophagetropismdeterminantsofhumanimmunodeficiencyvirustype1invivo，J.Virol.，(1992)，662577-2582；Rizzuto，C.D.，Wyatt，R.，Hernandez-Ramos，N.，Sun，Y.，Kwong，P.D.，Hendrickson，W.A.，Sodroski，J.AconservedHIVgp120glycoproteinstructureinvolvedinchemokinereceptorbinding，Science，(1998)，801949-1953；Cormier，E.G.，Dragic，T.ThecrownandstemoftheV3loopplaydistinctrolesinhumanimmunodeficiencyvirustype1envelopeglycoproteininteractionswiththeCCR5coreceptor，J.Virol.，(2002)，768953-8957；Suphaphiphat，P.，Thitithanyanont，A.，Paca-Uccaralertkun，S.，Essex，M.，Lee，T-HEffectofaminoacidsubstitutionoftheV3andbridgingsheetresiduesinhumanimmunodeficiencyvirustype1subtypeCgp120onCCR5utilization，J.Virol.，(2003)，773832-3837；Liu，S.，F(xiàn)an，S.，Sun，Z.StructuralandfunctionalcharacterizationofthehumanCCR5receptorincomplexwithHIVgp120envelopeglycoproteinandCD4receptorbymolecularmodelingstudies，J.Mol.Model(Online)(2003)，9329-336]。圖4顯示gp120的X射線晶體結構上參與受體/共同受體結合的肽和殘基的位置。這些結果提示石榴汁抑制劑也可阻斷gp120-共同受體結合?？笻IV-1抑制劑從石榴汁的分離石榴汁著色很深。因此它不能直接配制成殺微生物劑，因為它會沾污衣物，這是不可接受的。嘗試了從石榴汁中分離或離析出活性成分。為此斷續(xù)努力了四年后，發(fā)現(xiàn)gp120-CD4結合抑制劑能有效地(≥99％)吸附到選定品牌的玉米淀粉上(圖5)，導致產生近乎無色的產物，標號為PJ-S21。PJ-S21懸浮在水或未緩沖的0.14MNaCl中pH為3.2，與陰道的酸性環(huán)境相容，在陰道中施用后仍會保持穩(wěn)定(參見本文)。gp120-CD4結合抑制劑可用乙醇/丙酮5∶4提取而從PJ-S21洗脫出來。提取物干燥后進行重量測定表明，該提取物含有3.17mg固形物/克PJ-S21。由流式細胞術測出，PJ-S21對gp120IIIB-CD4復合物與表達CXCR4細胞的結合的抑制程度和原始石榴汁一樣(圖6)。類似地，由基于細胞的ELISA測出，gp120BaL-CD4融和蛋白與表達CCR5細胞的結合被石榴汁和PJ-S21抑制[Zhao，Q.，Alespeiti，G.，Debnath，A.K.AnovelassaytoidentifyentryinhibitorsthatblockbindingofHIV-1gp120toCCR5，Virol.，326299-309]；(圖7)。因此，PJ-S21是結合細胞受體CD4和共同受體CXCR4/CCR5的X4病毒和R5病毒兩者的抑制劑。由流式細胞術測出，PJ-S21還抑制gp120與PBMC的結合(圖8A和8B)。為確認PJ-S21起到病毒進入抑制劑的作用，將本發(fā)明復合物在HIV-1IIIB和BaL分別感染細胞之前和之后以不同時間間隔加入到細胞中。圖9所示的結果證明PJ-S21能干擾病毒復制周期的早期步驟。要考慮PJ-S21作為局部殺微生物劑，則必須將其配制成能經得起在熱帶環(huán)境中貯藏。加速熱穩(wěn)定性研究揭示，PJ-S21的水懸浮液當在60℃下貯藏30分鐘和在50℃或40℃下貯藏一個星期時，只分別保持其原始活性的4％、11％和33％(由gp120-CD4結合的抑制情況測量出)。另一方面，PJ-S21干粉在50℃下貯藏12個星期(評估中所用的最長時間)后仍完全保持活性。因此，無水制劑是理想的。制備了三種這樣的制劑兩種是栓劑(在37℃下熔化)，一種是片劑(其組成在本文中描述)。片劑中在50℃下、栓劑中在30℃下(被認為是能防止發(fā)生熔化的最高溫度)貯藏12個星期后，PJ-S21抑制活性仍完全得到保持。圖10總結的數(shù)據顯示了PJ-S21及其制劑(除還含有PJ-S21以外的抗HIV-1抑制劑即Carbopol974P[Neurath，A.R.，Strick，N.，Li，Y-YAnti-HIV-1activityofanionicpolymersAcomparativestudyofcandidatemicrobicides，BMCInfect.Dis.，(2002)，227]的片劑外)分別對HIV-1IIIB和BaL感染的抑制作用。與原始石榴汁的抑制活性不同的是，它們對HIV-1IIIB和BaL的抑制活性相似(圖1)。這些制劑也能殺病毒，盡管所需濃度比足以抑制感染的濃度要高。這些實驗還揭示，PJ-S21在所用的實驗條件下沒有細胞毒性。PJ-S21在精液(SF)存在下(SF與PJ-S21之比1∶1(w/w))保持抑制/殺病毒活性。殺微生物劑只有具有對抗屬于不同病毒分化體和表型的原代病毒分離物的抗病毒活性，才能被認為是潛在成功的。PJ-S21符合這個要求，因為它抑制了具有R5和X4R5(＝雙嗜)表型的所有受試分化體的原代HIV-1毒株的感染(表1)。PJ-S21可歸類為“AAAAA”候選殺微生物劑，即是可接受的、可取得的、負擔得起的和從開發(fā)到上市的轉變加速的。因此，可以預期PJ-S21能避開與逆轉錄病毒藥物或許還有一些其它候選殺微生物劑有關的一些問題，即與潛在副作用有關的不確定性、為建立廉價的大規(guī)模生產所需的投資和時間以及供應的壟斷。表1-PJ-S21對原代HIV-1毒株感染的抑制活性原始毒株亞型，所用共同受體ED50*mg/mlED90*mg/ml92RW008A，R50.50±0.052.76±0.2894UG103A，X4R51.42±0.543.42±0.9892US657B，R50.62±0.112.86±0.3393IN101C，R53.56±1.108.87±2.5593MW959C，R51.02±0.193.54±0.9092UG001D，X4R50.62±0.172.94±0.8593THA051E，X4R50.86±0.014.09±0.0893BR020F，X4R54.25±0.788.31±1.04RU570G，R50.42±0.091.54±0.16BCF02O群，R50.59±0.293.92±0.27*ED50(90)＝達到50％(90％)感染抑制的有效劑量一克PJ-S21大約含有3.2mg從石榴汁吸附到淀粉上的抑制劑。應認識到，本說明書是通過舉例說明而不是限制的方式闡明的，并且可作出各種修改和變化而不背離本發(fā)明的精神和范圍。權利要求1.一種包含淀粉和在所述淀粉為水不溶性形式時吸附到所述淀粉上的石榴汁抗HIV-1或抗HIV-2活性成分的復合物，所述復合物抑制HIV-1或HIV-2感染，所述復合物阻斷HIV-1或HIV-2與CD4受體及CCR5和CXCR4共同受體的結合。2.權利要求1的復合物，其中所述復合物抑制HIV-1感染。3.權利要求1的復合物，其中所述復合物抑制HIV-2感染。4.權利要求1的復合物，其中所述復合物通過將100-250mg的所述淀粉與1ml的石榴汁組合來產生。5.一種藥物組合物，所述組合物包含藥物有效抗HIV-1或抗HIV-2量的權利要求1的復合物與藥物可接受載體。6.一種在人中預防HIV-1或HIV-2感染的方法，所述方法包括給予人粘膜藥物有效抗HIV-1或抗HIV-2量的權利要求1的復合物。7.權利要求6的方法，其中所述方法用于預防HIV-1感染。8.權利要求6的方法，其中所述方法用于預防HIV-2感染。9.權利要求6的方法，其中所述給予通過陰道給予來進行。10.權利要求6的方法，其中所述給予通過直腸給予來進行。11.一種在人中預防HIV-1或HIV-2感染的方法，所述方法包括給予人粘膜藥物有效抗HIV-1或抗HIV-2量的權利要求5的藥物組合物。12.權利要求11的方法，其中所述方法用于預防HIV-1感染。13.權利要求11的方法，其中所述方法用于預防HIV-2感染。14.權利要求11的方法，其中給予0.5-3g的所述復合物。15.權利要求11的方法，其中所述給予通過陰道給予來進行。16.權利要求11的方法，其中所述給予通過直腸給予來進行。全文摘要一種包含淀粉和在淀粉為水不溶性形式時吸附到淀粉上的石榴汁抗HIV－1或抗HIV－2活性成分的復合物。所述復合物抑制HIV－1或HIV－2感染，阻斷HIV－1或HIV－2與CD4受體及CCR5和CXCR4共同受體的結合。所述復合物可用于預防HIV－1或HIV－2感染的方法，該方法包括給予人粘膜藥物有效抗HIV－1或抗HIV－2量的復合物。文檔編號A61K36/185GK101031205SQ200580031371公開日2007年9月5日申請日期2005年9月15日優(yōu)先權日2004年9月21日發(fā)明者A·R·紐拉思,N·斯特里克,李遠遙申請人:紐約血液中心有限公司