專利名稱：Gm－csf部分與聚合物的綴合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及包含GM-CSF部分(即，具有GM-CSF活性的部分)與聚合物的綴合物。此外，本發(fā)明還涉及(尤其是)含有該綴合物的組合物、合成該綴合物的方法，以及用于進(jìn)行該綴合物給藥的方法。
背景技術(shù)：
人類造血系統(tǒng)的一個(gè)重要功能是替換各種白細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞/肥大細(xì)胞)、紅細(xì)胞(即，紅血球)以及血凝塊形成細(xì)胞(例如，巨核細(xì)胞/血小板)。這些?；?xì)胞都是由位于骨髓內(nèi)的造血前體細(xì)胞形成的。被稱作“集落刺激因子”的專一性類激素糖蛋白，控制著這些造血前體細(xì)胞分化和成熟為眾多專化血細(xì)胞的任一種。
一種這樣的集落刺激因子是粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子或“GM-CSF”。顧名思義，這種集落刺激因子促進(jìn)了白細(xì)胞(例如粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)的增殖和分化，但是GM-CSF也能促進(jìn)其它類型細(xì)胞的形成。隨著細(xì)胞因子、免疫和炎性的刺激，大量不同類型的細(xì)胞(包括活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞)產(chǎn)生GM-CSF。天然的GM-CSF是一種127個(gè)氨基酸的糖蛋白，根據(jù)糖基化的程度可具有多種分子量。
在藥理學(xué)方面，已經(jīng)對(duì)癌癥患者給予GM-CSF，以加速化療期間被殺死的白細(xì)胞的替換。同理，為了加速白細(xì)胞的替換，已經(jīng)對(duì)骨髓替換治療的白血病患者給予這種集落刺激因子。已經(jīng)提議其它的應(yīng)用，例如加速傷口愈合。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.6,6899,351。
一種與當(dāng)前GM-CSF治療形式有關(guān)的缺點(diǎn)是用藥的頻率。因?yàn)镚M-CSF治療一般需要每天注射，患者厭惡這種治療方案有關(guān)的不便和不適。與此同時(shí)，患者需要經(jīng)常驗(yàn)血以確定白細(xì)胞計(jì)數(shù)(這需要拜訪保健醫(yī)生)，許多患者更喜歡麻煩少和/或涉及注射次數(shù)少的可替代療法。
對(duì)于這些問(wèn)題的一種解決方案是提供延長(zhǎng)釋放形式的GM-CSF。例如，美國(guó)專利No.5,942,253描述了GM-CSF的聚(乳酸-共-羥基乙酸)或者其它可生物降解聚合物的微球。然而，微球的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，需要若干合成步驟。因此，這種延長(zhǎng)釋放的方法具有理論上可以避免的復(fù)雜性。
已經(jīng)有描述，PEG化或者聚(乙二醇)衍生物結(jié)合至蛋白質(zhì)作為一種延長(zhǎng)蛋白質(zhì)體內(nèi)半衰期的手段，籍此產(chǎn)生延長(zhǎng)的藥理學(xué)活性。例如，美國(guó)專利No.5,880,0255描述了一種GM-CSF與聚(乙二醇)的綴合物，其形成于與2，2，2-三氟乙磺酸酯衍生的分子量為5,000道爾頓的線性單甲氧基聚(乙二醇)的反應(yīng)。
盡管具有上述的這種綴合物，仍然需要含有GM-CSF的其它綴合物，例如，分子量大于5,000道爾頓的聚合物，具有不同結(jié)構(gòu)(如，分支和/或分叉結(jié)構(gòu))、不同結(jié)合位點(diǎn)、位點(diǎn)特異性或位點(diǎn)選擇性結(jié)合位點(diǎn)等等的聚合物。
因此，本領(lǐng)域還需要另外的GM-CSF部分-聚合物綴合物。此外，本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案因此針對(duì)這些綴合物以及含有該綴合物的組合物，和如本文描述的相關(guān)方法，認(rèn)為這些是新穎的并且現(xiàn)有技術(shù)完全無(wú)啟示。
發(fā)明概述 因此，在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種綴合物，該綴合物含有如下結(jié)構(gòu) 其中POLY是一種水溶性聚合物；(a)為0或1；X1，當(dāng)存在時(shí)，是一含有一個(gè)或多個(gè)原子的間隔部分；R1是有機(jī)基團(tuán)；GM-CSF是GM-CSF部分。
在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種綴合物，該綴合物含有如下結(jié)構(gòu) 其中POLY是一種水溶性聚合物；X是一含有一個(gè)或多個(gè)原子的間隔部分；(b)為0或數(shù)值為1至10的整數(shù)(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)；(c)為0或數(shù)值為1至10的整數(shù)(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)；R2各自獨(dú)立地為H或者有機(jī)基團(tuán)；R3各自獨(dú)立地為H或者有機(jī)基團(tuán)；并且GM-CSF是GM-CSF部分。
在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種綴合物，該綴合物含有GM-CSF部分，所述GM-CSF部分包括內(nèi)部的胺直接或者通過(guò)含有一個(gè)或多個(gè)原子的間隔部分共價(jià)地結(jié)合至分支的水溶性聚合物。
在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，該組合物含有如本文提供的一種綴合物。
在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，該組合物含有(i)一種綴合物，該綴合物含有人GM-CSF，所述人GM-CSF直接或者通過(guò)含有一個(gè)或多個(gè)原子的間隔部分共價(jià)地結(jié)合至水溶性聚合物，其中，所述的水溶性聚合物具有大于5,000道爾頓的平均分子量，并規(guī)定，當(dāng)該水溶性聚合物是分支的水溶性聚合物時(shí)，所述的分支水溶性聚合物不包括賴氨酸殘基；和(ii)一種藥學(xué)上可接受的賦形劑，其中，所述組合物中至少約85％綴合物具有總計(jì)一至二個(gè)聚合物結(jié)合至人GM-CSF。
在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于將一種綴合物給藥于患者的方法，該方法包括對(duì)患者給予如本文提供的藥物組合物的步驟。
在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于制備一種綴合物的方法，該方法包括在綴合條件下使GM-CSF部分與聚合試劑接觸以產(chǎn)生如本文提供的綴合物和/或組合物。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是實(shí)施例1中所述的綴合物溶液的SEC-HPLC分析色譜圖。
圖2是實(shí)施例1中所述的組合物的陰離子交換純化色譜圖。
圖3顯示了實(shí)施例1中所述的綴合物餾分的SDS-PAGE結(jié)果。
圖4是實(shí)施例2中所述的綴合物溶液的SEC-HPLC分析色譜圖。
圖5是實(shí)施例3中所述的組合物的陰離子交換純化色譜圖。
圖6是實(shí)施例4中所述的綴合物溶液的SEC-HPLC分析色譜圖。
圖7是實(shí)施例5中所述的綴合物溶液的SEC-HPLC分析色譜圖。
圖8是SEC-HPLC分析實(shí)施例6中所述的綴合物溶液而得到的色譜圖。
發(fā)明詳述 在詳細(xì)描述本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案之前，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于特定的聚合物、合成技術(shù)、GM-CSF部分等，它們是可以變化的。
應(yīng)當(dāng)注意的是，在此說(shuō)明書和權(quán)利要求書中，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”、“某種(個(gè))”包括了復(fù)數(shù)形式，除非上下文另外明確指示。因此，例如，“一種聚合物”包括一種聚合物以及兩種或更多種相同或不同的聚合物；“一種藥學(xué)上可接受的賦形劑”是指一種藥學(xué)上可接受的賦形劑以及兩種或更多種相同或不同的藥學(xué)上可接受的賦形劑，等等。
在說(shuō)明本發(fā)明和要求本發(fā)明的權(quán)利中，根據(jù)下面提供的定義來(lái)應(yīng)用下列術(shù)語(yǔ)。
本文所用的“PEG”、“聚乙二醇”和“聚(乙二醇)”是可以互換的。典型地，根據(jù)本發(fā)明所用的PEGs包括如下的結(jié)構(gòu)“-(OCH2CH2)n-”，其中(n)為2至4000。如本文所用的，根據(jù)是否末端的氧被取代，PEG還包括“-CH2CH2-O(CH2CH2O)n-CH2CH2-”和“-(OCH2CH2)nO-。貫穿說(shuō)明書和權(quán)利要求書，應(yīng)當(dāng)記住，術(shù)語(yǔ)“PEG”包括了具有各種末端或“封端”基團(tuán)的結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ)“PEG”也指一種包括大多數(shù)即大于50％的-OCH2CH2-或-CH2CH2O-重復(fù)亞單元的聚合物。在涉及特定的形式時(shí)，該P(yáng)EG可以具有任意數(shù)目的多種分子量以及結(jié)構(gòu)或幾何形狀如“分支”、“線性”、“分叉”、“多功能”等，下面將進(jìn)行更詳細(xì)地描述。
術(shù)語(yǔ)“封端”和“封末端”在本文可以互換使用，是指具有封端部分的聚合物的一種末端或者終端。典型地，即使非必要地，所述的封端部分包括羥基或C1-20烷氧基，更優(yōu)選C1-10烷氧基以及進(jìn)一步優(yōu)選C1-5烷氧基。因此，封端部分的例子包括烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基和芐氧基)，以及芳基、雜芳基、環(huán)、雜環(huán)等等。應(yīng)當(dāng)記住的是，在聚合物中所述的“封端”部分可以包括末端單體的一個(gè)或多個(gè)原子(例如CH3(OCH2CH2)n-中的封端部分“甲氧基”)。此外，可以考慮上述物質(zhì)的飽和、非飽和、取代和非取代的形式。另外，所述的封端基團(tuán)也可以是硅烷。該封端基團(tuán)還可有利地包括可檢測(cè)的標(biāo)記。當(dāng)所述聚合物具有包含可檢測(cè)標(biāo)記的封端基團(tuán)時(shí)，應(yīng)用合適的檢測(cè)器可測(cè)定該聚合物和/或該聚合物偶合的部分(例如，活性劑)的數(shù)量和/或位置。這些標(biāo)記包括，但不限于，熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、酶標(biāo)記中應(yīng)用的部分、比色部分(例如，染料)、金屬離子、放射性殘基等等。合適的檢測(cè)器包括光度計(jì)、薄膜、分光計(jì)等等。所述的封端基團(tuán)還可有利地包括磷脂。當(dāng)所述聚合物具有含磷脂的封端基團(tuán)時(shí)，聚合物和得到的綴合物被賦予獨(dú)特的性質(zhì)。典型的磷脂包括，但不限于，選自被稱為磷脂酰膽堿的磷脂類的那些。特定的磷脂包括，但不限于，選自二月桂酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、山萮酰磷脂酰膽堿、花生酰磷脂酰膽堿，和卵磷脂。
本文所述的“非天然存在的”聚合物，是指在自然界中尚未全部發(fā)現(xiàn)的聚合物。但是，非天然存在的聚合物可含有已經(jīng)天然存在的一個(gè)或多個(gè)單體或單體區(qū)段，只要自然界尚未發(fā)現(xiàn)全部的聚合物結(jié)構(gòu)。
如“水溶性聚合物”中的術(shù)語(yǔ)“水溶性”是指在室溫下能溶于水的任何聚合物。典型地，水溶性聚合物，在過(guò)濾后能夠透射至少約75％、更優(yōu)選至少約95％的被相同溶液透射的光。以重量為基礎(chǔ)，水溶性聚合物優(yōu)選至少約35％(按重量)可溶于水，更優(yōu)選至少約50％(按重量)可溶于水，還更優(yōu)選約70％(按重量)可溶于水，并更進(jìn)一步優(yōu)選至少約85％(按重量)可溶于水。盡管如此，最優(yōu)選的是水溶性聚合物約95％(按重量)可溶于水或者可完全溶于水。
上下文中的水溶性聚合物如PEG的分子量，可以被表示為數(shù)均分子量或者重均分子量。除非另有說(shuō)明，本文所有涉及的分子量都是指重均分子量。兩種分子量即數(shù)均分子量和重均分子量的測(cè)定，都可以應(yīng)用凝膠滲透色譜或其它液相色譜技術(shù)來(lái)檢測(cè)。也可以應(yīng)用其它的方法來(lái)測(cè)定分子量的值，如應(yīng)用末端基團(tuán)分析或依數(shù)性檢測(cè)(例如，冰點(diǎn)降低、沸點(diǎn)提高或滲透壓)來(lái)測(cè)定數(shù)均分子量，或者應(yīng)用光散射技術(shù)、超速離心法或粘度測(cè)量法來(lái)確定重均分子量。本發(fā)明的聚合物通常是多分散的(即，所述聚合物的數(shù)均分子量與重均分子量不相等)，具有較低多分散性數(shù)值，優(yōu)選小于約1.2，更優(yōu)選小于約1.15，甚至更優(yōu)選小于約1.10，還甚至更優(yōu)選小于約1.05，最優(yōu)選小于約1.03。如本文所使用的，有時(shí)引用一種具有重均分子量或數(shù)均分子量的水溶性聚合物；這種引用應(yīng)當(dāng)被理解為這種水溶性聚合物是從具有所述分子量的水溶性聚合物的組合物獲得的。
當(dāng)與特定官能團(tuán)一起使用時(shí)，所用的術(shù)語(yǔ)“活性”或“活化的”是指反應(yīng)性官能團(tuán)易于與另一個(gè)分子的親電體或親核體反應(yīng)。這與那些為了起反應(yīng)需要強(qiáng)催化劑或非常不實(shí)用的反應(yīng)條件的基團(tuán)(即，“不起反應(yīng)”或“惰性”基團(tuán))大不相同。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“官能團(tuán)”或其任意同義詞是指包括了其保護(hù)形式以及非保護(hù)形式。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“間隔部分”、“鍵”或“連接鍵”是指用來(lái)連接互聯(lián)的部分如聚合物末端與GM-CSF部分或GM-CSF部分的親電體或者親核體的一個(gè)或多個(gè)原子。所述的間隔部分可以是水解條件下穩(wěn)定的或者可以包括生理?xiàng)l件下可水解的或者可酶降解的鍵。
“烷基”是指長(zhǎng)度通常為約1至15個(gè)原子的烴鏈。這種烴鏈優(yōu)選地但非必要地為飽和的，并且可以是支鏈或直鏈，但通常優(yōu)選直鏈。典型的烷基基團(tuán)包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、3-甲基戊基等等。本文所用的“烷基”包括環(huán)烷基以及含烷基的環(huán)亞烷基。
“低級(jí)烷基”是指含有1至6個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)，而且可以是直鏈或支鏈。低級(jí)烷基的非限定性實(shí)例包括甲基、乙基、正丁基、異丁基和叔丁基。
“環(huán)烷基”是指飽和或不飽和環(huán)形烴鏈，包括橋環(huán)、稠環(huán)或螺環(huán)化合物，優(yōu)選由3至約12個(gè)碳原子組成，更優(yōu)選3至約8個(gè)碳原子?！碍h(huán)亞烷基”是指通過(guò)在環(huán)系統(tǒng)上的任意兩個(gè)碳原子位置與烷基鏈鍵合而嵌入烷基鏈的環(huán)烷基基團(tuán)。
“烷氧基”是指-O-R基團(tuán)，其中R是烷基或取代的烷基，優(yōu)選C1-6烷基(例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基，等等)。
術(shù)語(yǔ)“取代”，如在“取代烷基”中的“取代”，是指用一個(gè)或多個(gè)非干涉性取代基取代的部分(例如，烷基基團(tuán))，所述非干涉性取代基例如，但不限于烷基、C3-8環(huán)烷基例如環(huán)丙基、環(huán)丁基等等；鹵素，例如，氟代、氯代、溴代和碘代；氰基；烷氧基；低級(jí)苯基；取代的苯基；等等。“取代的芳基”是指具有一個(gè)或者多個(gè)非干涉性取代基的芳基。對(duì)于苯環(huán)上的取代，該取代基可以是任何取向(即，鄰位、間位或者對(duì)位)。
“非干涉性取代基”是指這樣一些基團(tuán)，即當(dāng)它們?cè)诜肿又写嬖跁r(shí)，通常與分子內(nèi)含有的其它官能團(tuán)不起反應(yīng)。
“芳基”是指一個(gè)或多個(gè)芳環(huán)，每個(gè)環(huán)為5或6個(gè)核心碳原子。芳基包括可以是稠合的如萘基、或者不稠合的如聯(lián)苯的多重芳環(huán)。芳環(huán)也可以與一個(gè)或者多個(gè)環(huán)烴、雜芳基或雜環(huán)稠合或者不稠合。如本文所用的，“芳基”包括雜芳基和雜環(huán)。
“雜芳基”是指這樣的芳基基團(tuán)，即其含有一至四個(gè)雜原子，優(yōu)選硫、氧或氮，或者它們的組合。雜芳環(huán)還可以與一個(gè)或多個(gè)環(huán)烴、雜環(huán)、芳基或雜芳環(huán)稠合。如本文所用的，“雜芳基”包括取代的雜芳基。
“雜環(huán)”或“雜環(huán)的”是指一個(gè)或多個(gè)5-12個(gè)原子(優(yōu)選5-7個(gè)原子)的環(huán)，具有或不具有不飽和性或芳香性，并且具有至少一個(gè)環(huán)的原子不是碳原子。優(yōu)選的雜原子包括硫、氧和氮。如本文所用的，“雜環(huán)”包括取代的雜環(huán)。
“取代的雜芳基”是指具有一個(gè)或多個(gè)非干涉性基團(tuán)如取代基的雜芳基。
“取代的雜環(huán)”是指具有一個(gè)或多個(gè)形成于非干涉性取代基的支鏈的雜環(huán)。
如本文所用的，“有機(jī)基團(tuán)”應(yīng)當(dāng)包括烷基、取代的烷基、芳基和取代的芳基。
“親電體”和“親電基團(tuán)”是指一個(gè)離子或原子或數(shù)個(gè)原子，其可以是電離的，具有一個(gè)親電的中心即尋找電子、能與親核體反應(yīng)的中心。
“親核體”和“親核基團(tuán)”是指一個(gè)離子或原子或數(shù)個(gè)原子，其可以是電離的，具有一個(gè)親核的中心即尋找親電中心或能與親電體反應(yīng)的中心。
“水解條件下可降解的”或“可水解的”鍵或化學(xué)鍵是指在生理?xiàng)l件下與水發(fā)生反應(yīng)(即被水解)的化學(xué)鍵。優(yōu)選在pH 8、25℃條件下的水解半衰期小于約30分鐘的化學(xué)鍵?；瘜W(xué)鍵在水中的水解趨勢(shì)不僅取決于連接兩個(gè)給定原子的鍵的一般類型，也取決于該兩個(gè)給定原子結(jié)合的取代基。適合的、水解條件下不穩(wěn)定的或弱的鍵包括但不限于羧酸酯、磷酸酯、酸酐、縮醛、縮酮、酰氧基烷基醚、亞胺、原酸酯、肽和寡核苷酸。
“可酶降解的鍵”是指可以被一種或多種酶降解的鍵。
“水解條件下穩(wěn)定的”鍵或化學(xué)鍵是指在水中基本穩(wěn)定的化學(xué)鍵，通常為共價(jià)鍵，換言之，在生理?xiàng)l件下經(jīng)過(guò)延長(zhǎng)時(shí)間以可觀測(cè)到的程度不經(jīng)歷水解。在水解條件下穩(wěn)定的鍵實(shí)例包括，但不限于，如下碳-碳鍵(例如，在脂肪鏈中)、醚、酰胺、尿烷等等。通常，水解條件下穩(wěn)定的鍵是指生理?xiàng)l件下其水解速度表現(xiàn)為小于約1-2％/天。在多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)教科書中可以找到代表性化學(xué)鍵的水解速度。
“藥學(xué)上可接受的賦形劑”是指任選地可以包括在組合物中并對(duì)于用藥的患者不會(huì)引起顯著性毒副作用的賦形劑。
本文所用的“治療有效量”是指在血流或者靶組織中提供該綴合物(或者相應(yīng)不綴合的GM-CSF部分)的所需水平而需要的聚合物-(GM-CSF)部分綴合物的量。準(zhǔn)確的量取決于許多因素，例如，特定的GM-CSF部分、治療組合物的組分和物理性質(zhì)、計(jì)劃的患者總數(shù)、給藥模式、個(gè)體患者的考慮因素等等，而且是所屬領(lǐng)域的人員容易確定的。
“多官能”是指聚合物自身具有三個(gè)或更多的官能團(tuán)，其中所述的官能團(tuán)可以是相同的或不同的。多官能聚合試劑通常包含約3-100個(gè)官能團(tuán)，或3-50個(gè)官能團(tuán)、或3-15個(gè)官能團(tuán)、或3-10個(gè)官能團(tuán)，或者在聚合物骨架內(nèi)包含3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)官能團(tuán)。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“GM-CSF部分”是指具有GM-CSF活性的部分。GM-CSF部分也可具有至少一個(gè)適于與聚合試劑反應(yīng)的親電基團(tuán)或親核基團(tuán)。GM-CSF部分是一種蛋白質(zhì)，即含有一系列氨基酸組成的單體，任選地在一個(gè)或多個(gè)位置糖基化。此外，術(shù)語(yǔ)“GM-CSF部分”既包括綴合前的GM-CSF部分也包括綴合后的GM-CSF部分殘基。如下面進(jìn)行的更詳細(xì)解釋，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以確定任何已知的部分是否具有GM-CSF活性。含有對(duì)應(yīng)于選自SEQ ID NO1，SEQ IDNO2和SEQ ID NO3的序列的氨基酸序列的蛋白質(zhì)是GM-CSF部分，以及與其基本上同源的蛋白質(zhì)或多肽，和始于甲硫氨酰基殘基的SEQID NO 1、2和3的任一者，在這兩個(gè)實(shí)例中其生物特性能夠產(chǎn)生GM-CSF活性。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“GM-CSF部分”包括故意修飾的蛋白質(zhì)，例如，通過(guò)位點(diǎn)引導(dǎo)的誘變或者偶然的突變。術(shù)語(yǔ)“GM-CSF部分”也包括具有1至6個(gè)另外的糖基化位點(diǎn)的衍生物，在蛋白質(zhì)的羧基末端上具有至少一個(gè)另外的氨基酸的衍生物(其中該另外的氨基酸包括至少一個(gè)糖基化位點(diǎn))，以及具有包含至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的氨基酸序列的衍生物。
術(shù)語(yǔ)“基本上同源”是指，特定的個(gè)體序列，例如突變序列，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)取代、缺失或添加而與參照序列不同，其凈效應(yīng)不會(huì)在參照序列和主題序列之間產(chǎn)生相反的功能相異性。就本發(fā)明的目的而言，具有大于百分之九十五同源性、等同生物特性(盡管可能不同程度的活性)和等同表達(dá)特征的序列被認(rèn)為是基本上同源的。就確定同源性的目的而言，成熟序列的切斷應(yīng)當(dāng)不予考慮。具有較少程度的同源性、可比的生物活性和等同生物表達(dá)特征的序列被認(rèn)為是基本上等同的。本文所用的典型GM-CSF部分包括那些具有的序列基本上同源于選自SEQ ID NO1、SEQ ED NO2和SEQ ID NO3的一個(gè)或多個(gè)序列的蛋白質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)“片段”是指這樣的任何蛋白質(zhì)或者多肽，即其具有保留一定程度GM-CSF活性的一部分GM-CSF部分的氨基酸序列。所述片段包括通過(guò)GM-CSF蛋白的蛋白水解降解或者通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)方法化學(xué)合成而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽。確定特定片段是否具有GM-CSF活性可由普通技術(shù)人員實(shí)施。本文描述了可用于證實(shí)這種活性的適當(dāng)檢測(cè)方法。
GM-CSF部分的“缺失變異體”是指其中GM-CSF部分的一個(gè)氨基酸殘基已缺失并且該缺失氨基酸前后的氨基酸殘基通過(guò)酰胺鍵(例外的實(shí)例為缺失的氨基酸殘基位于所述肽或蛋白質(zhì)的末端)連接的肽或蛋白質(zhì)。缺失變異體包括只有一個(gè)氨基酸殘基缺失的實(shí)例，以及兩個(gè)氨基酸缺失、三個(gè)氨基酸缺失、四個(gè)氨基酸缺失的實(shí)例，等等。但是，每個(gè)缺失變異體都必須保留一定程度的GM-CSF活性。
GM-CSF部分的“取代變異體”是指其中GM-CSF部分的一個(gè)氨基酸殘基已缺失并且一個(gè)不同的氨基酸取代之的肽或蛋白質(zhì)。取代變異體包括只有一個(gè)氨基酸殘基被取代的實(shí)例，以及兩個(gè)氨基酸被取代、三個(gè)氨基酸被取代、四個(gè)氨基酸被取代的實(shí)例，等等。但是，每個(gè)取代變異體都必須具有一定程度的GM-CSF活性。
GM-CSF部分的“添加變異體”是指其中GM-CSF部分的一個(gè)氨基酸殘基已被添加至氨基酸序列并且相鄰的氨基酸殘基通過(guò)酰胺鍵(例外的實(shí)例為添加的氨基酸殘基位于所述肽或蛋白質(zhì)的末端，其中只有一個(gè)酰胺鍵結(jié)合該被添加的氨基酸殘基)結(jié)合至該被添加的氨基酸殘基的肽或蛋白質(zhì)。添加變異體包括只一個(gè)氨基酸殘基被添加的實(shí)例，以及兩個(gè)氨基酸被添加、三個(gè)氨基酸被添加、四個(gè)氨基酸被添加的實(shí)例，等等。但是，每個(gè)添加變異體都必須具有一定程度的GM-CSF活性。
術(shù)語(yǔ)“患者”是指患有或易患可通過(guò)給予活性劑(例如，綴合物)預(yù)防或治療的病癥的活生物體，并且包括人和動(dòng)物。
“任選”或“任選地”是指隨后所述的情況可以發(fā)生，也可以不發(fā)生，所以，該描述包括了所述情況發(fā)生的實(shí)例和所述情況沒(méi)有發(fā)生的實(shí)例。
“基本上”(除非在別處特定上下文中明確地定義或者上下文中清楚地另外規(guī)定)是指幾乎全部地或完全地，例如，滿足如下的一種或多種大于50％，等于或大于51％，等于或大于75％，等于或大于90％，等于或大于95％的狀況。
除非上下文中清楚地另外規(guī)定，當(dāng)術(shù)語(yǔ)“約”位于一數(shù)值之前時(shí)，應(yīng)當(dāng)將該數(shù)值理解為所述數(shù)值的平均數(shù)±10％。
所述肽中氨基酸殘基縮寫如下苯丙氨酸為Phe或F；亮氨酸為L(zhǎng)eu或L；異亮氨酸為Ile或I；甲硫氨酸為Met或M；纈氨酸為Val或V；絲氨酸為Ser或S；脯氨酸為Pro或P；蘇氨酸為Thr或T；丙氨酸為Ala或A；酪氨酸為Tyr或Y；組氨酸為His或H；谷氨酰胺為Gln或Q；天冬酰胺為Asn或N；賴氨酸為L(zhǎng)ys或K；天冬氨酸為Asp或D；谷氨酸為Glu或E；半胱氨酸為Cys為C；色氨酸為Trp或W；精氨酸為Arg或R；及甘氨酸為Gly或G。
在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種綴合物，該綴合物含有GM-CSF部分，該部分直接地或者通過(guò)含有一個(gè)或多個(gè)原子的間隔部分共價(jià)結(jié)合至水溶性聚合物。本發(fā)明的綴合物具有一種或多種如下的特征。
GM-CSF部分 如前所述，術(shù)語(yǔ)“GM-CSF部分”應(yīng)當(dāng)包括綴合前的GM-CSF部分以及結(jié)合(直接地或通過(guò)間隔部分)至水溶性聚合物之后的GM-CSF部分。但是，應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)GM-CSM部分被結(jié)合(直接地或通過(guò)間隔部分)至水溶性聚合物時(shí)，由于與至聚合物的鍵(或者結(jié)合至聚合物的間隔部分)相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)共價(jià)鍵的存在，該GM-CSF部分稍有改變。通常，被結(jié)合至另一個(gè)分子的GM-CSF部分的這種些微改變形式被稱為GM-CSF部分的“殘基”。
GM-CSF部分可以獲自非組合方法或組合方法，并且本發(fā)明對(duì)此無(wú)限制。
GM-CSF部分可以非組合方法獲得。例如，GM-CSF可獲自血源。特別是，可以應(yīng)用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知技術(shù)(例如，沉淀技術(shù)、離心技術(shù)、色譜技術(shù))從人血漿或組織中分離。
GM-CSF部分可以獲自重組方法。例如，編碼人GM-CSF(優(yōu)選GM-CSF部分)的cDNA已經(jīng)被分離、定性和克隆至表達(dá)載體。參見(jiàn)，例如美國(guó)專利No.5,078,996和5,891,429，和Wong等(1985)“人GM-CSF互補(bǔ)DNA的分子克隆和天然和重組蛋白質(zhì)的純化，”Science218819，和Cantrell等(1985)“人粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子的克隆、測(cè)序和表達(dá)，”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，Vol.826250?？梢詰?yīng)用在細(xì)菌(大腸埃希桿菌(Escherichia coli))、哺乳動(dòng)物(例如，中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞)和酵母(例如，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的GM-CSF部分。
一旦被表達(dá)，內(nèi)源性的人GM-CSF是一種分子量約22,000道爾頓的單體糖蛋白。本發(fā)明提供了被表達(dá)的氨基酸序列如SEQ ID NO1。本文優(yōu)選地用作GM-CSF部分的是任意數(shù)量的人GM-CSF的氨基酸序列。在各種表達(dá)系統(tǒng)中，已產(chǎn)生了至少三種不同的人GM-CSF蛋白沙格司亭；莫拉司亭；瑞拉司亭；和依格司亭。沙格司亭是在釀酒酵母中表達(dá)的，與內(nèi)源性的人GM-CSF相比在23位上具有亮氨酸的氨基酸取代(SEQ ID NO2)，并且是O-糖基化的。莫拉司亭是在大腸埃希桿菌表達(dá)的并且是非糖基化的。瑞格司亭是在倉(cāng)鼠卵細(xì)胞(CHO)中產(chǎn)生的并且是完全糖基化的。這些蛋白質(zhì)的甲硫氨?；鸵脖豢紤]到，其中甲硫氨酸(methione)殘基在全部氨基酸序列之前。除非特別注明，如本文所提供的氨基酸殘基的數(shù)字位置分配都是基于SEQ ID NO1。
可以簡(jiǎn)述用于制備GM-CSF部分(無(wú)論是人GM-CSF或者是具有GM-CSF活性的不同蛋白質(zhì))的典型重組方法。這些方法包括構(gòu)建編碼想要的多肽或片段的核酸，克隆該核酸至表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(例如，植物，諸如大腸埃希桿菌的細(xì)菌，諸如釀酒酵母的酵母，或者諸如中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞或幼倉(cāng)鼠腎臟細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞)，以及表達(dá)該核酸以產(chǎn)生想要的多肽或片段。所述的表達(dá)可以通過(guò)外源性表達(dá)(當(dāng)宿主細(xì)胞天然地含有想要的遺傳編碼時(shí))或者通過(guò)內(nèi)源性表達(dá)而發(fā)生。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，在體外和在原核和真核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生和表達(dá)重組多肽的方法是已知的。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.4,868,122。
為了便于鑒定和純化重組的多肽，用于編碼抗原表位標(biāo)記的核酸序列或其它親和性結(jié)合序列可以被插入或者與該編碼序列一起添加至框架內(nèi)，籍此產(chǎn)生融合蛋白，其含有想要的多肽或適于結(jié)合的多肽。通過(guò)首次使含有融合蛋白的混合物經(jīng)由裝有針對(duì)融合蛋白中抗原表位標(biāo)記或其它結(jié)合序列的結(jié)合部分(例如，抗體)的親和柱，可以鑒定和純化融合蛋白，籍此將融合蛋白結(jié)合在柱內(nèi)。然后，用適當(dāng)?shù)娜芤?如酸性溶液)沖洗柱子以釋放結(jié)合的融合蛋白而回收融合蛋白。也可通過(guò)裂解宿主細(xì)胞、分離多肽(例如通過(guò)尺寸排除色譜法)及收集多肽，鑒定和純化重組多肽。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，用于鑒定和純化重組多肽的這些和其它方法是已知的。但是，在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的是GM-CSF部分不是融合蛋白的形式。
根據(jù)用于表達(dá)具有GM-CSF活性的蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，GM-CSF部分可以是非糖基化的或者是被糖基化的，兩種形式都可應(yīng)用。也就是說(shuō)，GM-CSF部分可非糖基化的或者GM-CSF部分可被糖基化。在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的是GM-CSF部分被糖基化。糖基化的實(shí)例包括O-糖基化和N-糖基化。認(rèn)為，內(nèi)源性的人GM-CSF的糖基化位點(diǎn)是絲氨酸9(O-糖基化)、蘇氨酸10(O-糖基化)、天冬酰胺27(N-糖基化)和天冬酰胺37(N-糖基化)。任何GM-CSF部分的優(yōu)選的糖基化排列將發(fā)生在這些位點(diǎn)(或者對(duì)應(yīng)于已知GM-CSF部分的這些位置的位點(diǎn))。因此，GM-CSF部分可具有一定程度的糖基化，所述糖基化選自無(wú)糖基化；在一個(gè)位點(diǎn)糖基化；在兩個(gè)位點(diǎn)糖基化；在三個(gè)位點(diǎn)糖基化；和在四個(gè)位點(diǎn)糖基化。特別優(yōu)選的糖基化排列是僅在絲氨酸9和蘇氨酸10為O-糖基化并且無(wú)N-糖基化。
具有GM-CSF活性的部分可被有利地修飾，以包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，例如賴氨酸、半胱氨酸和/或精氨酸，目的是使聚合物易于結(jié)合至氨基酸內(nèi)的原子。例如，美國(guó)專利No.6,608,183描述了可以用作GM-CSF部分的GM-CSF的“添加半胱氨酸”序列以及制備該“添加半胱氨酸”序列的方法。此外，GM-CSF部分可被修飾以包括非-天然存在的氨基酸殘基。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，添加氨基酸殘基和非-天然存在的氨基酸殘基的技術(shù)都是熟知的。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.5,393,870和J.March，高等有機(jī)化學(xué)反應(yīng)機(jī)理和結(jié)構(gòu)，第四版(紐約Wiley-Interscience，1992)。
此外，GM-CSF部分可被有利地修飾以包括結(jié)合官能團(tuán)(而不是通過(guò)添加含有官能團(tuán)的氨基酸殘基)。例如，GM-CSF部分可被修飾以包括巰基。另外，GM-CSF部分可被修飾以包括N-末端α碳。此外，GM-CSF部分可被修飾以包括一個(gè)或多個(gè)糖部分。也可應(yīng)用被修飾而含有胺氧基、醛基或其它官能團(tuán)的GM-CSF部分。另外，也可應(yīng)用GM-CSF的氧化變異體作為GM-CSF部分。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.5,358,707。也包括GM-CSF衍生物作為GM-CSF部分。參見(jiàn)美國(guó)專利No.5,298,603。
GM-CSF部分的非限定性實(shí)例包括下面這些人GM-CSF；具有GM-CSF活性的雜合蛋白，和具有GM-CSF活性的肽模擬物。上述任何能保持至少一定程度GM-CSF活性的生物學(xué)活性片段，缺失變異體，取代變異體或添加變異體，也可用作GM-CSF部分。
對(duì)于任何已知的部分，都可能確定是否該部分具有GM-CSF活性。例如，如美國(guó)專利No.5,393,870中所述，可收集源自健康捐贈(zèng)者髂嵴的人骨髓，放入溶液并離心分離，收集細(xì)胞并稀釋用于后續(xù)的培養(yǎng)。經(jīng)培養(yǎng)，可鑒定細(xì)胞的每個(gè)集落，并可將所述GM-CSF部分加至適宜的集落且檢驗(yàn)相對(duì)于對(duì)照的加速增殖。也可應(yīng)用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的其它方法，以確定已知的部分是否具有GM-CSF活性。這些方法對(duì)于確定該部分自身(和因此可用作“GM-CSF部分”)和相應(yīng)的聚合物-部分綴合物的GM-CSF活性都是有用的。
GM-CSF部分的非限定性實(shí)例包括下面這些如可在SEQ IDNO1、SEQ ED NO2和SEQ ID NO3中的任一者識(shí)別的人GM-CSF；其切斷形式；雜合變異體，和具有GM-CSF活性的肽模擬物。上述任何能保持至少一定程度GM-CSF活性的生物學(xué)活性片段、缺失變異體、取代變異體或添加變異體，也可用作GM-CSF部分。
根據(jù)用于表達(dá)具有GM-CSF活性的蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，GM-CSF部分可以是非糖基化的或者是被糖基化的，兩種形式都可應(yīng)用。也就是說(shuō)，GM-CSF部分可為非糖基化的或者GM-CSF部分可被糖基化。
水溶性聚合物 如前所討論的，每一綴合物含有直接地或通過(guò)含一個(gè)或多個(gè)原子的間隔部分結(jié)合至水溶性聚合物的GM-CSF。就水溶性聚合物而言，所述水溶性聚合物是非肽類的、無(wú)毒的、非天然存在的并且生物相容的。就生物相容性而言，經(jīng)臨床工作者例如醫(yī)師評(píng)估，如果單獨(dú)使用材料或者與其它材料(例如，如GM-CSF部分的活性劑)一起使用與活組織結(jié)合相關(guān)的有益效果超過(guò)了有害作用，那么該材料被認(rèn)為是生物相容的。就非-免疫原性而言，如果材料在體內(nèi)預(yù)期應(yīng)用沒(méi)有產(chǎn)生不想要的免疫反應(yīng)(例如，形成抗體)或，如果產(chǎn)生了免疫反應(yīng)，而臨床工作者評(píng)估為這種反應(yīng)不視為臨床上顯著的或重要的，那么該材料被認(rèn)為是非免疫原性的。
另外，所述水溶性聚合物的典型特征在于具有2至約300個(gè)末端。這種聚合物的實(shí)例包括，但不限于，聚(亞烷基二醇)如聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(“PPG”)、乙二醇與丙二醇的共聚物等，聚(氧乙基化多元醇)，聚(烯醇)，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(羥基烷基甲基丙烯酰胺)，聚(羥基烷基甲基丙烯酸酯)，聚(多糖)，聚(α-羥基酸)，聚(乙烯醇)，聚磷腈，聚噁唑啉，聚(N-丙烯酰嗎啉)和任意上述物質(zhì)的組合。
所述的聚合物不限于特定的結(jié)構(gòu)并且可以為線型(例如烷氧基PEG或雙官能PEG)，或者非線型如分支、分叉、多臂(例如結(jié)合多元醇核的PEG)，和樹(shù)枝狀。另外，聚合物的內(nèi)部結(jié)構(gòu)可以被組織成任意數(shù)量的不同模式，并且可以選自均聚物、交替共聚物、無(wú)規(guī)則共聚物、嵌段共聚物、交替三聚物、無(wú)規(guī)則三聚物和嵌段三聚物。
活化PEG和用于與所述GM-CSF形成綴合物的其它活化水溶性聚合物(統(tǒng)稱“聚合物試劑”)包括適于偶合至GM-CSF部分上想要的位點(diǎn)的活化官能團(tuán)。因此，聚合物試劑包括與所述GM-CSF部分起反應(yīng)的官能團(tuán)。用于使這些聚合物與活性部分綴合的代表性聚合物試劑和方法是本領(lǐng)域中已知的且進(jìn)一步描述在Zalipsky，S.等的“官能化聚(乙二醇)在多肽修飾中的應(yīng)用”(“Use of FunctionalizedPoly(Ethylene Glycols)for Modification of Polypeptides”)《聚乙二醇化學(xué)生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用》(PolyethyleneGlycol ChemistryBiotechnical and Biomedical Applications)，J.M.Harris，Plenus Press，New York(1992))和Zalipsky(1995)《高等藥物綜述》(Advanced Drug Reviews)16157-182。
一般來(lái)說(shuō)，綴合物中水溶性聚合物的重均分子量為約100道爾頓至約150,000道爾頓。然而，典型范圍包括重均分子量在大于5,000道爾頓至約150,000道爾頓的范圍、大于5,000道爾頓至約100,000道爾頓的范圍、約6,000道爾頓至約100,000道爾頓的范圍、約6,000道爾頓至約90,000道爾頓的范圍、約10,000道爾頓至約85,000道爾頓的范圍、大于10,000道爾頓至約85,000道爾頓的范圍、約15,000道爾頓至約85,000道爾頓的范圍、約20,000道爾頓至約85,000道爾頓的范圍、約20,000道爾頓至約60,000道爾頓的范圍、約53,000道爾頓至約85,000道爾頓的范圍、約25,000道爾頓至約120,000道爾頓的范圍、約29,000道爾頓至約120,000道爾頓的范圍、約35,000道爾頓至約120,000道爾頓的范圍、和約40,000道爾頓至約120,000道爾頓的范圍。對(duì)于任意給定的水溶性聚合物而言，優(yōu)選具有一種或多種這些分子量范圍的PEG。
水溶性聚合物的典型重均分子量包括約100道爾頓、約200道爾頓、約300道爾頓、約400道爾頓、約500道爾頓、約600道爾頓、約700道爾頓、約750道爾頓、約800道爾頓、約900道爾頓、約1,000道爾頓、約1,500道爾頓、約2,000道爾頓、約2,200道爾頓、約2,500道爾頓、約3,000道爾頓、約4,000道爾頓、約4,400道爾頓、約4,500道爾頓、約5,000道爾頓、約5,500道爾頓、約6,000道爾頓、約7,000道爾頓、約7,500道爾頓、約8,000道爾頓、約9,000道爾頓、約10,000道爾頓、約11,000道爾頓、約12,000道爾頓、約13,000道爾頓、約14,000道爾頓、約15,000道爾頓、約20,000道爾頓、約22,500道爾頓、約25,000道爾頓、約30,000道爾頓、約35,000道爾頓、約40,000道爾頓、約45,000道爾頓、約50,000道爾頓、約55,000道爾頓、約60,000道爾頓、約65,000道爾頓、約70,000道爾頓和約75,000道爾頓。也可以應(yīng)用總分子量為上述任意數(shù)量的分支形式的水溶性聚合物(例如含有兩個(gè)20,000道爾頓聚合物的分支40,000道爾頓水溶性聚合物)。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述的綴合物沒(méi)有與重均分子量小于約6,000道爾頓的PEG的任何PEG部分直接或間接結(jié)合。
當(dāng)用作聚合物時(shí)，PEG通常包括許多的(OCH2CH2)單體或者(CH2CH2O)單體，根據(jù)該P(yáng)EG是如何定義的。如本說(shuō)明書通篇所用的，重復(fù)單元的數(shù)量以下標(biāo)“n”來(lái)標(biāo)明，例如“(OCH2CH2)n。”因此，(n)數(shù)值通常落入下列范圍的一種或多種2至約3400，約100至約2300，約100至約2270，約136至約2050，約225至約1930，約450至約1930，約1200至約1930，約568至約2727，約660至約2730，約795至約2730，約795至約2730，約909至約2730，和約1,200至約1,900。對(duì)于任何分子量是已知的特定聚合物，通過(guò)聚合物的總重均分子量除以重復(fù)單體分子量來(lái)確定重復(fù)單元(即“n”)的數(shù)量是可能的。
就水溶性聚合物的分子量而言，在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種綴合物，所述的綴合物含有直接或者通過(guò)包括一個(gè)或多個(gè)原子的間隔部分共價(jià)結(jié)合至水溶性聚合物的GM-CSF部分，其中所述水溶性聚合物的分子量大于5,000道爾頓。
用于本發(fā)明中一種特別優(yōu)選的聚合物是封端的聚合物，也就是，具有至少一個(gè)末端被相對(duì)惰性基團(tuán)如低級(jí)烷氧基基團(tuán)(即C1-6烷氧基)封端的聚合物，當(dāng)然，也可使用羥基。例如，當(dāng)聚合物是PEG時(shí)，優(yōu)選使用甲氧基-PEG(通常稱為mPEG)，它是PEG的線型形式，其中該聚合物的一個(gè)末端帶有甲氧基(-OCH3)，而另一個(gè)末端是羥基或可被任選地化學(xué)修飾的其它官能團(tuán)。
在一種用于本發(fā)明的形式中，游離或未結(jié)合的PEG為在每一末端用羥基終止的線型聚合物HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH，其中，(n)通常為0至約4,000的范圍。
上述的聚合物，α-二羥基聚(乙二醇)、ω-二羥基聚(乙二醇)，可以表示為HO-PEG-OH簡(jiǎn)化形式，應(yīng)當(dāng)理解，-PEG-符號(hào)可以代表下列的結(jié)構(gòu)單元-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-，其中，(n)如上所定義。
用于本發(fā)明的另一種類型的PEG是甲氧基-PEG-OH，或簡(jiǎn)寫為mPEG，其中一個(gè)末端是相對(duì)惰性的甲氧基基團(tuán)，而另一個(gè)末端是羥基基團(tuán)。mPEG的結(jié)構(gòu)表示如下。
CH3O-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH其中，(n)如上所述。
多臂或分支PEG分子，如美國(guó)專利No.5,932,462中描述的那些，也可用作PEG聚合物。例如，PEG可以具有下述結(jié)構(gòu) 其中polya和polyb為PEG骨架(相同或者不同)，如甲氧基聚(乙二醇)；R″是不起反應(yīng)的部分，如H、甲基或PEG骨架；并且P和Q是不起反應(yīng)的鍵。在有些實(shí)例中，分支的PEG分子包括賴氨酸殘基。在有些實(shí)例中，含賴氨酸殘基的分支PEG試劑具有如下的結(jié)構(gòu)(盡管表示的是含琥珀酰亞胺基的結(jié)構(gòu)，也可用除琥珀酰亞胺基外起反應(yīng)的基團(tuán)來(lái)代替) 在一些實(shí)例中，優(yōu)選的是，所述聚合物試劑(以及從這種聚合物試劑制備的相應(yīng)的綴合物)缺少聚合物部分通過(guò)“-OCH2CONHCH2CO-”基團(tuán)與賴氨酸胺基相連的賴氨酸殘基。在其它的實(shí)例中，優(yōu)選的是，所述聚合物試劑(以及從這種聚合物試劑制備的相應(yīng)的綴合物)缺少包括賴氨酸殘基(其中該賴氨酸殘基被用于影響分支)的分支水溶性聚合物。
此外，所述的PEG可包含分叉的PEG。分叉PEG的實(shí)例表示為下列結(jié)構(gòu) 其中X是一個(gè)或多個(gè)原子的間隔部分，并且每個(gè)Z都是通過(guò)定義長(zhǎng)度的原子鏈將活化末端基團(tuán)連接至C-H的碳原子。國(guó)際申請(qǐng)No.PCT/US99/05333公開(kāi)了可用于本發(fā)明一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中的各種分叉PEG結(jié)構(gòu)。所述的將Z官能團(tuán)連接至分支碳原子的原子鏈用作束縛基團(tuán)并且可以包括，例如，烷基鏈、醚鏈、酯鏈、酰胺鏈及其組合。
所述的PEG聚合物可包含具有反應(yīng)性基團(tuán)如羧基沿著PEG長(zhǎng)度而不是PEG鏈末端共價(jià)地結(jié)合的接枝PEG分子。所述接枝的起反應(yīng)基團(tuán)可以與直接或通過(guò)間隔部分如亞烷基相結(jié)合。
除了上述形式的PEG，所述聚合物也可以制備成在聚合物中具有一種或多種弱的或可降解的鍵(例如水解條件下可降解的鍵)，包括任何上述的聚合物。例如，PEG可被制備成在該聚合物內(nèi)具有易于水解的酯連接。如下所示，這種水解導(dǎo)致聚合物分裂成較低分子量的片段-PEG-CO2-PEG-+H2O→-PEG-CO2H+HO-PEG- 其它的水解條件下可降解的鍵，用作聚合物骨架內(nèi)可降解的鍵，包括碳酸酯鍵；亞胺鍵，其產(chǎn)生于，例如，胺與醛反應(yīng)(參見(jiàn)，例如，Ouchi等，(1997)Polymer Preprints 38(1)582-3)；磷酸酯鍵，其形成于，例如，醇與磷酸基團(tuán)反應(yīng)；通常由醛與肼反應(yīng)形成的腙鍵；通常由醛與醇之間反應(yīng)形成的縮醛鍵；例如通過(guò)甲酸根與醇之間反應(yīng)形成的原酸酯鍵；例如，由聚合物如PEG末端上的胺基與另一個(gè)PEG鏈的羧基反應(yīng)而形成的某些酰胺鍵；例如，由帶有末端異氰酸基團(tuán)的PEG與PEG醇反應(yīng)形成的尿烷鍵；例如，聚合物如PEG末端的胺基與肽的羧基形成的肽鍵；和，例如，如聚合物末端的亞磷酰胺基與寡核苷酸的5′羥基形成的寡核苷酸鍵。
一種或多種可降解的進(jìn)入聚合物鏈的鍵的存在，可提供對(duì)給藥時(shí)綴合物的最后想要的藥理性質(zhì)予以另外的控制。例如，可以給予大的且相對(duì)惰性的綴合物(例如，具有結(jié)合至GM-CSF部分的一條或多條高分子量PEG鏈，例如，具有分子量大于約20,000的一條或多條PEG鏈，其中該綴合物基本上不具有生物活性)，它被水解產(chǎn)生具有一部分初始PEG鏈的生物活性綴合物。通過(guò)這種方式，綴合物的特性可以更有效地修改以平衡隨時(shí)間過(guò)程的聚合物生物活性。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，上述涉及基本上水溶性聚合物片段決不是窮舉的，而只是說(shuō)明性的，具有上述性質(zhì)的任意聚合物材料都被考慮到。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“聚合物試劑”通常上是指完整分子，其可包含水溶性聚合物片段以及官能團(tuán)。
綴合物 如上所述，本發(fā)明的綴合物包括共價(jià)地結(jié)合(直接地或通過(guò)間隔部分)至GM-CSF部分的水溶性聚合物。典型地，對(duì)于任何特定的綴合物，一至四個(gè)水溶性聚合物被共價(jià)地結(jié)合至GM-CSF部分(其中，對(duì)于每個(gè)水溶性聚合物而言，該水溶性聚合物可直接地或通過(guò)間隔部分共價(jià)地結(jié)合至GM-CSF部分)。但是，在一些實(shí)例中，聚合物可帶有分別被結(jié)合至GM-CSF部分(同樣，就每個(gè)水溶性聚合物而言，直接地或者通過(guò)間隔部分而結(jié)合)的1、2、3、4、5、6、7、8或更多水溶性聚合物。此外，所述的綴合物可包括至多8個(gè)分別被結(jié)合至GM-CSF部分的水溶性聚合物，至多7個(gè)分別被結(jié)合至GM-CSF部分的水溶性聚合物，至多6個(gè)分別被結(jié)合至GM-CSF部分的水溶性聚合物，至多5個(gè)分別被結(jié)合至GM-CSF部分的水溶性聚合物，至多4個(gè)分別被結(jié)合至GM-CSF部分的水溶性聚合物，至多3個(gè)分別被結(jié)合至GM-CSF部分的水溶性聚合物，至多2個(gè)分別被結(jié)合至GM-CSF部分的水溶性聚合物，和至多1個(gè)被結(jié)合至GM-CSF部分的水溶性聚合物。
在GM-CSF部分與水溶性聚合物(或者被結(jié)合至水溶性聚合物的間隔部分)之間的特定鍵取決于許多因素。這種因素包括，例如，所應(yīng)用的特定的鍵化學(xué)，特定的GM-CSF部分，在GM-CSF部分內(nèi)可用的官能團(tuán)(用于與聚合物連接或轉(zhuǎn)化成適宜的結(jié)合位點(diǎn))，在GM-CSF部分內(nèi)可能存在的另外的反應(yīng)性官能團(tuán)，等等。
在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，在GM-CSF部分與聚合物(或者被結(jié)合至聚合物的間隔部分)之間的鍵是水解條件下穩(wěn)定的鍵，諸如酰胺、尿烷(也稱作氨基甲酸酯)、胺、硫醚(也稱作硫化物)，或者尿素(脲)。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述的鍵不是源自帶有官能團(tuán)的聚合物試劑與GM-CSF部分的反應(yīng)，其中所述的官能團(tuán)選自三嗪、肼、酰肼、醛、氨基脲、馬來(lái)酰亞胺、乙烯基砜、苯乙二醛、異氰酸酯、異硫氰酸酯、胺以及帶有GM-CSF部分的三氟乙磺?；?tresyl)官能團(tuán)。
在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，在GM-CSF部分與水溶性聚合物(或者被結(jié)合至水溶性聚合物的間隔部分)之間的鍵是可降解的鍵。通過(guò)這種方式，連接GM-CSF部分的鍵是“可降解的”。換言之，水溶性聚合物(與間隔部分，當(dāng)存在時(shí))裂解(通過(guò)水解，酶工藝，或其它)，籍此產(chǎn)生天然的或未綴合的GM-CSF部分。優(yōu)選地，可降解的鍵產(chǎn)生水溶性聚合物(和任意的間隔部分)，其在體內(nèi)自GM-CSF部分分離而不留下水溶性聚合物(和任意間隔部分)的任何片段。典型可降解鍵包括碳酸酯、羧酸酯、磷酸酯、硫醚、酐、縮醛、縮酮、酰氧基烷基醚、亞胺，和原酸酯。應(yīng)用本領(lǐng)域常用的偶合方法，通過(guò)對(duì)GM-CSF部分(例如，蛋白C末端的羧基或者蛋白內(nèi)含有的氨基酸如絲氨酸或蘇氨酸的側(cè)鏈羥基)和/或聚合物試劑適當(dāng)?shù)男揎?，可以容易地制備這種鍵。但是，最優(yōu)選的是，適當(dāng)活化的聚合物與在GM-CSF部分內(nèi)含有的非修飾官能團(tuán)反應(yīng)而容易地形成的可水解鍵。
就鍵而言，在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種綴合物，其含有在一氨基酸殘基處直接或通過(guò)包含一個(gè)或多個(gè)原子的間隔部分共價(jià)地結(jié)合至水溶性聚合物的GM-CSF部分。
所述的綴合物(相對(duì)于未綴合的GM-CSF部分)可以具有或可以不具有可檢測(cè)程度的GM-CSF活性。換言之，本發(fā)明的綴合物具有約0％至約100％或者更多未修飾的母體GM-CSF部分的生物活性。優(yōu)選地，具有很少或無(wú)GM-CSF活性的化合物通常包括將聚合物與所述部分連接的可降解鍵，因此，不考慮綴合物缺少活性，活性的母體分子(或它具有GM-CSF活性的衍生物)通過(guò)降解鍵(例如，通過(guò)水溶液誘導(dǎo)鍵裂解的水解)而被釋放出來(lái)。根據(jù)具有已利用的GM-CSF活性的特定部分的已知活性，應(yīng)用適宜的體外或體內(nèi)模型，可以確定這種活性。
優(yōu)選地，通過(guò)應(yīng)用水解條件下可裂解和/或酶可降解的鍵例如尿烷、酰胺、碳酸酯或含酯鍵，便于可降解鍵的降解。這樣，通過(guò)選擇聚合物分子的大小和能提供理想清除特性的官能團(tuán)類型，可以調(diào)整綴合物的清除通過(guò)單個(gè)水溶性聚合物的裂解。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以確定聚合物的適宜分子大小以及可裂解的官能團(tuán)。例如，應(yīng)用常規(guī)試驗(yàn)，通過(guò)首先制備不同重均分子量和可降解官能團(tuán)的各種聚合物-(CM-CSF)綴合物，然后通過(guò)將綴合物給予患者并定期取血樣和/或尿樣獲得每個(gè)綴合物的清除狀況，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可確定適宜的分子大小和可裂解官能團(tuán)。一旦已獲得了每種被檢驗(yàn)綴合物的一系列清除狀況，就可以確定具有想要的清除狀況的綴合物。
對(duì)于具有將GM-CSF部分與水溶性聚合物偶合的、水解穩(wěn)定的鍵的綴合物，該綴合物一般會(huì)具有可檢測(cè)程度的GM-CSF活性。例如，這種綴合物典型特征在于其具有滿足下列一個(gè)或多個(gè)相對(duì)于未綴合GM-CSF部分的百分比的生物活性至少約2％，至少約5％，至少約10％，至少約15％，至少約25％，至少約30％，至少約40％，至少約50％，至少約60％，至少約80％，至少約85％，至少約90％，至少約95％，至少約97％，至少約100％，和大于105％(當(dāng)在適宜的模型中檢測(cè)時(shí)，諸如本文提供的和/或本領(lǐng)域熟知的那些)。優(yōu)選地，帶有水解條件下穩(wěn)定的鍵(例如，酰胺鍵)的綴合物會(huì)具有至少一定程度的未修飾母體GM-CSF部分的生物活性。
現(xiàn)在將描述典型綴合物。預(yù)計(jì)GM-CSF部分具有(至少部分地)與人GM-CSF相似于或相關(guān)的氨基酸序列。因此，如前所示，當(dāng)引用人GM-CSF的特定位置或原子時(shí)，這種引用只是為了方便而且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠容易地確定具有GM-CSF活性的其它部分內(nèi)相應(yīng)的位置或原子。特別是，本文提供的關(guān)于人GM-CSF的描述常常不僅適用于人GM-CSF，也適用于任意的上述的片段、缺失變異體、取代變異體和添加變異體。
GM-CSF部分上的氨基基團(tuán)提供了在GM-CSF部分與水溶性聚合物之間的結(jié)合點(diǎn)。在SEQ E)NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3中提供的每種人GM-CSF部分都包含14個(gè)賴氨酸殘基以及一個(gè)氨基末端，其中每個(gè)賴氨酸殘基含有一個(gè)可用于綴合的ε-氨基。參見(jiàn)SEQ E)NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3。因此，典型的結(jié)合點(diǎn)包括在位置25、26、28、49、55、59、61、66、64、73、77、110、114和115的任何一個(gè)或多個(gè)的氨基酸上的結(jié)合(通過(guò)賴氨酸殘基的含胺基側(cè)鏈)。此外，另一種GM-CSF部分包含含15個(gè)胺基的賴氨酸殘基(參見(jiàn)SEQ ID NO3)。因此，這種GM-CSF的優(yōu)選結(jié)合點(diǎn)包括在位置23、25、26、28、49、55、59、61、66、64、73、77、110、114和115的任何一個(gè)的與賴氨酸相關(guān)的胺基殘基上的結(jié)合。
許多合適的水溶性聚合物試劑的實(shí)例可用于與GM-CSF部分的可利用胺基形成共價(jià)鍵。下面的表1提供了特定的實(shí)例，以及相應(yīng)的綴合物。表中，變量(n)表示重復(fù)單體單元的數(shù)量，“(GM-CSF)”表示與水溶性聚合物綴合后的GM-CSF部分。雖然表1中的每個(gè)聚合物部分例如，(OCH2CH2)n或(CH2CH2O)n以“CH3”基團(tuán)終止，但是可以其它的基團(tuán)(如H和芐基)來(lái)代替。
表1胺基特定性聚合物試劑以及形成的GM-CSF部分綴合物






可以多種技術(shù)實(shí)現(xiàn)聚合物試劑綴合至GM-CSF部分的胺基。在一種方法中，可將GM-CSF部分綴合至用琥珀酰亞胺基衍生物(或其它活化的酯基，其中與描述的用于琥珀酰亞胺基衍生物的那些相似的方法可用于其它活化的含酯基聚合物試劑)官能化的聚合物試劑。在該方法中，可在pH 7.0至9.0的含水介質(zhì)中將帶有琥珀酰亞胺基的聚合物試劑結(jié)合至GM-CSF部分，盡管不同的反應(yīng)條件(例如，較低的pH如6至7，或不同的溫度和/或低于15℃)可導(dǎo)致聚合物結(jié)合至GM-CSF部分上的不同位置。
可使用例如含有反應(yīng)性酯的聚合物試劑制備典型綴合物，其包括下列結(jié)構(gòu) 其中POLY為水溶性聚合物，是0或1；X1，當(dāng)存在時(shí)，為含有一個(gè)或多個(gè)原子的間隔部分；R1為氫或有機(jī)基團(tuán)；并且GM-CSF為GM-CSF部分。
關(guān)于對(duì)應(yīng)于在上一段落中參照的結(jié)構(gòu)，本文所提供的任何水溶性聚合物可以定義為POLY，本文所提供的任意的間隔部分可定義為X1(當(dāng)存在時(shí))，本文所提供的任何有機(jī)基團(tuán)可定義為R1(在R1不是氫的情況)，和本文所提供的任何GM-CSF部分可定義為GM-CSF。關(guān)于對(duì)應(yīng)于在上一段落中參照的結(jié)構(gòu)，優(yōu)選的是POLY為聚(乙二醇)如H3CO(CH2CH2O)n-，其中(n)為數(shù)值為3至4000的整數(shù)；(a)為1；X1為C1-6亞烷基，更優(yōu)選地選自亞甲基(即-CH2-)，亞乙基(即-CH2-CH2-)和亞丙基(即-CH2-CH2-CH2-)；R1為H或低級(jí)烷基如甲基或乙基；及GM-CSF為人GM-CSF。
另一個(gè)用于將GM-CSF部分綴合至聚合物試劑的方法通常是應(yīng)用還原胺化反應(yīng)，將GM-CSF部分的伯胺與用酮、醛或它們的水合形式(例如，水合酮和水合醛)官能化的聚合物試劑綴合。在該方法中，GM-CSF部分的伯胺與醛或酮(或者水合醛或水合酮的相應(yīng)含羥基的基團(tuán))的羰基反應(yīng)，由此形成希夫堿(Schiff base)。然后，通過(guò)應(yīng)用還原劑如硼氫化鈉，可將希夫堿還原性地轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的綴合物。選擇性反應(yīng)(例如，可能在N-端)是可能的，特別是涉及以酮或α-甲基分支的醛官能化聚合物和/或在特定的反應(yīng)條件下(例如，降低的pH)。
可使用例如含有醛(或水合醛)或酮或(水合酮)的聚合物試劑制備典型綴合物，其包括下列結(jié)構(gòu) 其中POLY為水溶性聚合物；(d)是0或1；X2，當(dāng)存在時(shí)，為含有一個(gè)或多個(gè)原子的間隔部分；(b)是數(shù)值為1至10的整數(shù)；(c)是數(shù)值為1至10的整數(shù)；R2，在任何情況下都獨(dú)立地為氫或有機(jī)基團(tuán)；R3，在任何情況下都獨(dú)立地為氫或有機(jī)基團(tuán)；并且GM-CSF為GM-CSF部分。
關(guān)于對(duì)應(yīng)于在上一段落中參照的結(jié)構(gòu)，本文所提供的任意的水溶性聚合物可以定義為POLY，本文所提供的任意的間隔部分可定義為X2(當(dāng)存在時(shí))，本文所提供的任意的有機(jī)基團(tuán)可獨(dú)立地定義為R2和R3(在R2和R3獨(dú)立地不是氫的情況)，和本文所提供的任意的GM-CSF部分可定義為GM-CSF。關(guān)于對(duì)應(yīng)于在上一段落中參照的結(jié)構(gòu)，在這些實(shí)例中優(yōu)選的是POLY為聚(乙二醇)如H3CO(CH2CH2O)n-，其中(n)為數(shù)值為3至4000的整數(shù)；(d)為1；X1為酰胺例如，-C(O)NH-；(b)為2至6，更優(yōu)選4；(c)為2至6，更優(yōu)選4；每個(gè)R2和R3都獨(dú)立地為H或低級(jí)烷基，當(dāng)是低級(jí)烷烴時(shí)更優(yōu)選地為甲基；及GM-CSF為人GM-CSF。在其它實(shí)例中，優(yōu)選的是，該綴合物包括如下的結(jié)構(gòu) 其中每個(gè)(n)獨(dú)立地為數(shù)值為3至4000的整數(shù)；X2如上定義；(b)為2至6；(c)為2至6；R2，在任何情況下都獨(dú)立地為氫或低級(jí)烷基；并且GM-CSF為GM-CSF部分。
羧基代表另一種官能團(tuán)，它可作為GM-CSF部分上的結(jié)合點(diǎn)。結(jié)構(gòu)上，所述的綴合物包括如下 其中，GM-CSF和相鄰的羰基對(duì)應(yīng)于含羧基的GM-CSF部分；X為間隔部分，優(yōu)選地選自O(shè)、N(H)和S的雜原子；并且POLY為水溶性聚合物如PEG，任選地在封端部分終止。
C(O)-X鍵源自在帶有末端官能團(tuán)的聚合物衍生物與含羧基的GM-CSF部分之間的反應(yīng)。如上所述，特定的鍵將依賴于所用的官能團(tuán)類型。如果聚合物是用羥基末端-官能化的或“活化的”，得到的鍵是羧酸酯，并且X為O。如果聚合物骨架是用巰基官能化的，得到的鍵是硫酯，并且X為S。當(dāng)使用某些多臂、分支或分叉的聚合物時(shí)，C(O)-X部分，及特別是X部分，可以是相對(duì)地較復(fù)雜的而且可包括較長(zhǎng)的鍵結(jié)構(gòu)。
含酰肼部分的聚合物試劑也用于在羰基上的綴合。對(duì)于GM-CSF部分不含羰基部分的情況，羰基部分可通過(guò)還原任意羧酸(例如，C-末端羧酸)和/或通過(guò)提供GM-CSF部分的糖基化形式(其中被添加的糖帶有羰基部分)而被引入。下面的表2提供了含有酰肼部分的聚合物試劑的特定實(shí)例，以及相應(yīng)的綴合物。此外，通過(guò)使含有活化酯的聚合物試劑與肼(NH2-NH2)或肼基甲酸叔丁酯NH2NHCO2C(CH3)3反應(yīng)，任何含有活化酯(例如，琥珀酰亞胺基團(tuán))的聚合物試劑可被轉(zhuǎn)化成含酰肼部分。表中，變量(n)代表重復(fù)單體單元的數(shù)量，并且“＝C-(GM-CSF)”代表綴合至聚合物試劑之后的GM-CSF部分。任選地，腙鍵可用適當(dāng)?shù)倪€原劑還原。雖然表2中的每個(gè)聚合物部分例如，(OCH2CH2)n或(CH2CH2O)n都以“CH3”基團(tuán)終止，但是可以其它的基團(tuán)(如H和芐基)來(lái)代替之。
表2羧基特定性聚合物試劑及其形成的GM-CSF部分綴合物
效結(jié)合位點(diǎn)。GM-CSF部分的半胱氨酸殘基中的巰基可與特異性與巰基反應(yīng)的活化PEG反應(yīng)，例如，N-馬來(lái)酰亞胺基聚合物或其它的衍生物，例如美國(guó)專利No.5,739,208，國(guó)際專利公布No.WO01/62827以及下面的表3中所描述的。
對(duì)于SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3，都有四個(gè)含巰基的半胱氨酸殘基。盡管不希望被理論所束縛，但是認(rèn)為這些序列中所有的半胱氨酸殘基都參與了二硫鍵。結(jié)果是，與參加二硫鍵的半胱氨酸殘基的綴合可破壞GM-CSF部分的三級(jí)結(jié)構(gòu)并且可能顯著地降低了它的全部活性。因此，在任意特定的GM-CSF部分缺少巰基或要避免二硫鍵破壞的情況，應(yīng)用常規(guī)的合成技術(shù)可將半胱氨酸殘基添加至GM-CSF部分。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.6,608,183和國(guó)際專利公布WO90/12874所描述的方法，其中這種方法可適用于GM-CSF部分。此外，也可應(yīng)用常規(guī)的基因工程方法將半胱氨酸殘基引入GM-CSF部分。
下列表3中提供了特定的實(shí)例以及相應(yīng)的綴合物。表中，變量(n)代表重復(fù)的單體單元的數(shù)量，并且“-S-(GM-CSF)”代表綴合至水溶性聚合物之后的GM-CSF部分。盡管表3中的每個(gè)聚合物部分例如，(OCH2CH2)n或(CH2CH2O)n都以“CH3”基團(tuán)終止，但是也可用其它基團(tuán)(如H和芐基)代替之。
表3巰基特定性聚合物試劑及其形成GM-CSF部分綴合物



對(duì)于從帶有一個(gè)或多個(gè)馬來(lái)酰亞胺官能團(tuán)(不考慮馬來(lái)酰亞胺是否與GM-CSF部分上的氨基或巰基發(fā)生反應(yīng))的水溶性聚合物形成的綴合物，相應(yīng)的馬來(lái)酰胺酸形式的水溶性聚合物也可與GM-CSF部分反應(yīng)。在一定條件下(例如，pH約7-9和在水存在下)，馬來(lái)酰亞胺環(huán)將“打開(kāi)”以形成相應(yīng)的馬來(lái)酰胺酸。然后，馬來(lái)酰胺酸與GM-CSF部分的氨基或巰基反應(yīng)。典型的基于馬來(lái)酰胺酸的反應(yīng)圖解表示如下。POLY代表水溶性聚合物，并且GM-CSF代表GM-CSF部分。
根據(jù)本發(fā)明，代表性綴合物可具有如下的結(jié)構(gòu)POLY-L0，1-C(O)Z-Y-S-S-(GM-CSF)其中POLY為水溶性聚合物，L為任選連接鍵，Z為選自O(shè)、NH和S的雜原子，Y是選自C2-10烷基、C2-10取代的烷基、芳基以及取代的芳基，并且GM-CSF為GM-CSF部分。在美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)No.2005/0014903中描述了可與GM-CSF部分反應(yīng)且產(chǎn)生這種類型綴合物的聚合物試劑。
至于聚合物試劑，這里和其它處所述的那些可從商業(yè)來(lái)源購(gòu)買(例如，Nektar Therapeutics，亨茨維爾，阿拉巴馬州)。此外，在文獻(xiàn)中描述了制備聚合物試劑的方法。
GM-CSF部分和水溶性聚合物可直接結(jié)合或者間接結(jié)合，在直接結(jié)合的情況中，在GM-CSF部分與聚合物之間沒(méi)有任何插入的原子，在間接結(jié)合的情況中，一個(gè)或多個(gè)原子位于GM-CSF部分與聚合物之間。對(duì)于間接結(jié)合而言，“間隔部分”用作在GM-CSF部分與水溶性聚合物之間的鍵。構(gòu)成間隔部分的所述一個(gè)或多個(gè)原子可包括一個(gè)或多個(gè)碳原子、氮原子、硫原子、氧原子及其組合。間隔部分可包括酰胺、仲胺、氨基甲酸酯、硫醚和/或二硫基團(tuán)。特定的間隔部分(包括“X”、X1和X2)的非限定性實(shí)例包括選自如下的那些-O-、-S-、-S-S-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-C(S)-、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-、-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-O-、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-O-CH2-、-CH2-C(O)-O-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-O-CH2-、-C(O)-O-CH2-CH2-、-NH-C(O)-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-CH2-、-NH-CH2-、-NH-CH2-CH2-、-CH2-NH-CH2-、-CH2-CH2-NH-CH2-、-C(O)-CH2-、-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-、-O-C(O)-NH-[CH2]h-(OCH2CH2)j-、二價(jià)的環(huán)烷基、-O-、-S-、氨基酸、-N(R6)-，以及任意上述的兩種或多種的組合，其中R6為H或選自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基的有機(jī)基團(tuán)，(h)是0至6，并且(j)是0至20。其它的特定間隔部分具有如下的結(jié)構(gòu)-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-、-NH-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-、和-O-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-，其中每個(gè)亞甲基后面的下標(biāo)值表示結(jié)構(gòu)中包括的亞甲基數(shù)量，例如，(CH2)1-6是指該結(jié)構(gòu)可含有1、2、3、4、5或6個(gè)亞甲基。另外，任意的上述間隔部分可進(jìn)一步包括含有1至20個(gè)環(huán)氧乙烷單體單元即，-(CH2CH2O)1-20的環(huán)氧乙烷寡聚物鏈。也就是說(shuō)，環(huán)氧乙烷寡聚物鏈可出現(xiàn)在間隔部分的前面或后面，并且任選地在含有兩個(gè)或多個(gè)原子的間隔部分的任意兩個(gè)原子之間。此外，如果寡聚物與聚合物片段相鄰并且僅代表聚合物片段的延伸，那么寡聚物鏈不被視為間隔部分的一部分。間隔部分不包括糖或碳水化合物(亦即，間隔部分明確地不包括糖基化殘基的糖)。可通過(guò)糖基化殘基(例如，糖或碳水化合物)結(jié)合水溶性聚合物。在那些需要這種排列的實(shí)例中，本申請(qǐng)是指如“通過(guò)糖基化殘基將GM-CSF部分共價(jià)地結(jié)合至水溶性聚合物”的排列。
如上所述，在一些實(shí)例中水溶性聚合物-(GM-CSF)綴合物包括非線型水溶性聚合物。這種非線型水溶性聚合物包括分支的水溶性聚合物(但是也考慮了其它的非線型水溶性聚合物)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述的綴合物包括GM-CSF部分，其包括直接地或通過(guò)包含一個(gè)多個(gè)原子的間隔部分共價(jià)地結(jié)合至分支水溶性聚合物的內(nèi)部胺基。如本文所用的，內(nèi)部胺基是非N-末端氨基酸部分(并且既包括N-末端胺基，也包括N-末氨基酸側(cè)鏈的任意胺基)的胺基。對(duì)于含有包括SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3序列的GM-CSF部分，例如，內(nèi)部的胺基位于每個(gè)賴氨酸殘基的每個(gè)鏈上。
應(yīng)當(dāng)注意的是，盡管這種綴合物包括了在GM-CSF部分的內(nèi)部氨基酸上被結(jié)合至GM-CSF部分的分支水溶性聚合物，也可在其它的位置上將另外的分支水溶性聚合物結(jié)合至相同的GM-CSF部分。因此，例如，包括在GM-CSF部分的內(nèi)部氨基酸上被(直接地或通過(guò)間隔部分)結(jié)合至GM-CSF部分的分支水溶性聚合物的綴合物，可進(jìn)一步包括被直接地或通過(guò)含有一個(gè)或多個(gè)原子的間隔部分共價(jià)地結(jié)合至N-末端氨基酸殘基的另外的分支水溶性聚合物，優(yōu)選地在N-末端氨基上。如上所述，在一些實(shí)例中，分支水溶性聚合物缺少賴氨酸殘基，其中聚合物部分通過(guò)“-OCH2CONHCH2CO-”基團(tuán)被結(jié)合至賴氨酸的胺基。在其它的實(shí)例中，優(yōu)選的是，分支水溶性聚合物缺少賴氨酸殘基(其中賴氨酸殘基被用于影響分支)。優(yōu)選的分支水溶性聚合物包括如下的結(jié)構(gòu) 其中每個(gè)(n)獨(dú)立地為數(shù)值3至4000的整數(shù)。
組合物 綴合物通常是組合物的部分。一般地，組合物含有多個(gè)綴合物，優(yōu)選地盡管非必要地，每個(gè)綴合物帶有分別被共價(jià)地結(jié)合(直接地或通過(guò)間隔部分)至一GM-CSF部分的一、二、三或四個(gè)水溶性聚合物。但是，所述的組合物也可含有帶有被結(jié)合至任意特定GM-CSF部分的四、五、六、七、八個(gè)或更多聚合物的其它綴合物。
至于組合物中的綴合物，所述組合物通常滿足一種或多種下列的特征組合物中綴合物至少約85％具有被結(jié)合至GM-CSF部分的1至5個(gè)聚合物；組合物中綴合物至少約85％具有被結(jié)合至GM-CSF部分的1至4個(gè)聚合物；組合物中綴合物至少約85％具有被結(jié)合至GM-CSF部分的1至3個(gè)聚合物；組合物中綴合物至少約85％具有被結(jié)合至GM-CSF部分的1至2個(gè)聚合物；組合物中綴合物至少約85％具有被結(jié)合至GM-CSF部分的1個(gè)聚合物(即，被單PEG化)；組合物中綴合物至少約95％具有被結(jié)合至GM-CSF部分的1至5個(gè)聚合物；組合物中綴合物至少約95％具有被結(jié)合至GM-CSF部分的1至4個(gè)聚合物；組合物中綴合物至少約95％具有被結(jié)合至GM-CSF部分的1至3個(gè)聚合物；組合物中綴合物至少約95％具有被結(jié)合至GM-CSF部分的1至2個(gè)聚合物；組合物中綴合物至少約95％具有被結(jié)合至GM-CSF部分的1個(gè)聚合物(即，被單PEG化)；組合物中綴合物至少約99％具有被結(jié)合至GM-CSF部分的1至5個(gè)聚合物；組合物中綴合物至少約99％具有被結(jié)合至GM-CSF部分的1至4個(gè)聚合物；組合物中綴合物至少約99％具有被結(jié)合至GM-CSF部分的1至3個(gè)聚合物；組合物中綴合物至少約99％具有被結(jié)合至GM-CSF部分的1至2個(gè)聚合物；和，組合物中綴合物至少約99％具有被結(jié)合至GM-CSF部分的1個(gè)聚合物(即，被單PEG化)。
在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的是，含綴合物的組合物不含或基本上不含白蛋白。也可優(yōu)選的是，所述組合物不含或基本上不含不具備GM-CSF活性的蛋白質(zhì)。因此，優(yōu)選的是，所述組合物是85％、更優(yōu)選95％和最優(yōu)選99％不含白蛋白。此外，優(yōu)選的是，所述組合物是85％、更優(yōu)選95％和最優(yōu)選99％不含不具備GM-CSF活性的任意蛋白質(zhì)。至于白蛋白在組合物中存在的情況，本發(fā)明的典型組合物基本上沒(méi)有包含將GM-CSF部分的殘基連接至白蛋白的聚(乙二醇)聚合物的綴合物。
在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其含有(i)一種綴合物，其含有直接地或者通過(guò)包括一個(gè)或多個(gè)原子的間隔部分共價(jià)地結(jié)合至水溶性聚合物的人GM-CSF，其中所述的水溶性聚合物具有大于5,000道爾頓的重均分子量；和(ii)一種藥學(xué)上可接受的賦形劑，其中，組合物中綴合物至少約85％具有被結(jié)合至GM-CSF部分的1至2個(gè)聚合物。在一些實(shí)例中，所述藥物組合物包括這樣的條件當(dāng)水溶性聚合物是分支水溶性聚合物時(shí)，該分支水溶性聚合物缺少賴氨酸殘基，其中聚合物部分通過(guò)“-OCH2CONHCH2CO-”基團(tuán)被結(jié)合至賴氨酸的胺基。在其它的實(shí)例中，所述藥物組合物包括這樣的條件水溶性聚合物缺少賴氨酸殘基(其中賴氨酸殘基被用于影響分支)。
通過(guò)選擇適宜的聚合物試劑、聚合物試劑與GM-CSF部分的比例、溫度、pH條件以及綴合物反應(yīng)的其它方面，可實(shí)現(xiàn)控制用于任何特定部分的、所需數(shù)量的聚合物。此外，通過(guò)純化的手段，可實(shí)現(xiàn)減少或消除不想要的綴合物(例如，帶有4個(gè)或更多被結(jié)合的聚合物的那些綴合物)。
例如，可將水溶性聚合物-(GM-CSF)部分綴合物純化，以獲得/分離不同的綴合種類。明確地講，將產(chǎn)物混合物純化，以得到每個(gè)GM-CSF部分的任意處1、2、3、4、5或更多個(gè)的平均值的PEG，通常，每個(gè)GM-CSF部分有1、2或3個(gè)PEG。用于最終綴合物反應(yīng)混合物純化的策略依賴于許多因素，包括，例如，所用的聚合物試劑的分子量、特定的GM-CSF部分、想要的給藥方案以及殘余的活性和個(gè)體綴合物的體內(nèi)特性。
需要時(shí)，應(yīng)用凝膠過(guò)濾色譜法和/或離子交換色譜法可以分離具有不同分子量的綴合物。換言之，凝膠過(guò)濾色譜法用于基于它們不同的分子量(這種不同基本上對(duì)應(yīng)于水溶性聚合物部分的平均分子量)而分餾不同數(shù)量的聚合物-與-(GM-CSF)部分比率例如，1-mer，2-mer，3-mer，等等，其中，“1-mer”表示1個(gè)聚合物被結(jié)合至GM-CSF部分(或，當(dāng)聚合物為PEG時(shí)，為單PEG化)，“2-mer”表示2個(gè)聚合物被結(jié)合至GM-CSF部分(或，當(dāng)聚合物為PEG時(shí)，為雙PEG化)，等等。例如，在典型反應(yīng)中，將20,000道爾頓蛋白質(zhì)隨機(jī)地綴合至分子量為約20,000道爾頓的PEG試劑，得到的反應(yīng)混合物可含有分子量為約20,000道爾頓的未修飾的蛋白質(zhì)，分子量為約40,000道爾頓的單PEG化蛋白質(zhì)(或“1-mer”)，分子量為約60,000道爾頓的雙PEG化蛋白質(zhì)(或“2-mer”)，等等。
盡管可用這種方法來(lái)分離PEG和具有不同分子量的其它水溶性聚合物-(GM-CSF)部分綴合物，但是對(duì)于分離在GM-CSF部分內(nèi)具有不同的聚合物結(jié)合位點(diǎn)的位置異構(gòu)體，這種方法通常是無(wú)效的。例如，凝膠過(guò)濾色譜法可用于分離1-mer、2-mer、3-mer等彼此的混合物，但是，每個(gè)回收的PEG-mer組合物可包含被結(jié)合至GM-CSF部分內(nèi)不同的反應(yīng)性氨基(例如，賴氨酸殘基)的PEG。
適于實(shí)現(xiàn)這種類型分離的凝膠過(guò)濾柱包括可從AmershamBiosciences(皮斯卡塔韋，紐約州)得到的Superdex和Sephadex柱。特定柱子的選擇取決于想要的分餾范圍。一般地應(yīng)用適當(dāng)?shù)木彌_液，如磷酸、醋酸等，可實(shí)現(xiàn)洗脫。可用許多不同的方法分析收集的餾分，例如，(i)用于蛋白質(zhì)含量的280nm吸光率，(ii)基于染料的蛋白分析，用牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)，(iii)用于PEG含量的碘檢驗(yàn)(Sims等，(1980)Anal.Biochem，10760-63)，(iv)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS PAGE)，然后，使用碘化鋇著色，和高效液相色譜。
借助于應(yīng)用例如C18柱或C3柱(Amersham Biosciences或Vydac)的逆相-高效液相色譜(RP-HPLC)方法的逆相色譜法，或借助于應(yīng)用離子交換柱例如可從Amersham Biosciences獲得的Sepharose離子交換柱的離子交換色譜法，可實(shí)現(xiàn)位置異構(gòu)體的分離?？梢詰?yīng)用任一種方法來(lái)分離具有相同分子量的聚合物-活性劑異構(gòu)體(位置異構(gòu)體)。
優(yōu)選地，所述的組合物基本上不含無(wú)GM-CSF活性的蛋白質(zhì)。此外，優(yōu)選地，所述的組合物基本上不含所有其它的非共價(jià)結(jié)合的水溶性聚合物。但是，在有些情況下，所述的組合物可含有水溶性聚合物-(GM-CSF)部分綴合物與未被綴合的GM-CSF的混合物。
任選地，本發(fā)明的組合物進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的賦形劑。需要時(shí)，可將該藥學(xué)上可接受的賦形劑添加至綴合物以形成組合物。
典型的藥學(xué)上可接受的賦形劑包括，但不限于，選自下述的那些碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽、抗微生物劑、抗氧化劑、表面活性劑、緩沖劑、酸、堿，及其組合。
碳水化合物如糖，衍生的糖如醛糖醇、醛糖酸、酯化糖和/或糖聚合物可用作賦形劑。特定的碳水化合物賦形劑包括，例如單糖，如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麥芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；和醛糖醇，如甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨醇(葡糖醇)、吡喃糖基山梨醇、肌醇等。
所述的賦形劑也可包括無(wú)機(jī)鹽或緩沖劑如檸檬酸、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硝酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，及其組合。
所述的組合物也可包括用于預(yù)防或阻止微生物生長(zhǎng)的抗微生物劑。適于本發(fā)明的抗微生物劑的非限定性實(shí)例包括苯扎氯銨、芐索氯銨、芐醇、西吡氯銨、氯代丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、硫柳汞(thimersol)，及其組合。
抗氧化劑也可存在于所述的組合物中?？寡趸瘎┍挥糜诜乐寡趸?，籍此防止綴合物或制劑的其它組分變質(zhì)。適用于本發(fā)明的抗氧化劑包括，例如，抗壞血酸棕櫚酸酯、丁羥茴醚、丁羥甲苯、次磷酸、單硫代甘油、沒(méi)食子酸丙酯、亞硫酸氫鈉、甲醛次硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉，及其組合。
表面活性劑可用作賦形劑。典型表面活性劑包括聚山梨酯，如“吐溫20”和“吐溫80”和普郎尼克(pluronic)如F68和F88(兩種都可從新澤西州橄欖山BASF公司獲得)；山梨聚糖酯；類脂，如磷脂如卵磷脂和其它的磷脂酰膽堿，磷脂酰乙醇胺(但是不優(yōu)選脂質(zhì)體形式)，脂肪酸和脂肪酯；甾體類，如膽固醇；和絡(luò)合劑，如EDTA，和鋅及其它適宜的陽(yáng)離子。
酸或堿可用作組合物中的賦形劑?？蓱?yīng)用的酸的非限定性實(shí)例包括選自下述的這些酸鹽酸、醋酸、磷酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、甲酸、三氯醋酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富馬酸、及其組合。適宜的堿的實(shí)例包括，但不限于選自下述的堿氫氧化鈉、醋酸鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀、醋酸銨、醋酸鉀、磷酸鈉、磷酸鉀、檸檬酸鈉、甲酸鈉、硫酸鈉、硫酸鉀、富馬酸鉀，及其組合。
組合物中綴合物(即，在活性劑與聚合物試劑之間形成的綴合物)的量根據(jù)許多因素而變化，但是當(dāng)組合物被儲(chǔ)存于單位劑量的容器(例如，小藥瓶)中時(shí)優(yōu)選地為治療上有效的量。另外，可以將所述的藥物制劑封裝于注射器中。通過(guò)增加量綴合物的重復(fù)給藥以確定產(chǎn)生臨床上想達(dá)到的終點(diǎn)的量，來(lái)實(shí)驗(yàn)性確定治療上有效的量。
組合物中任意個(gè)體賦形劑的量都根據(jù)賦形劑的活性和組合物的特定需要而變化。通常，任意個(gè)體賦形劑的最適量由常規(guī)的實(shí)驗(yàn)來(lái)確定，即，制備含有不同量的賦形劑(從低到高的范圍)的組合物，檢驗(yàn)穩(wěn)定性和其它參數(shù)，然后確定獲得最佳性能并無(wú)明顯副作用的范圍。
但是，通常情況下，組合物中含有賦形劑的量為約1％至約99％(按重量)，優(yōu)選地約5％至約98％(按重量)，更優(yōu)選地約15％至約95％(按重量)的賦形劑，最優(yōu)選地濃度小于30％(按重量)。
上述的這些藥學(xué)上可接受的賦形劑以及其它的賦形劑都被記載于《藥物學(xué)與實(shí)踐》(“RemingtonThe Science & Practiceof Pharmacy”)，第19版，Williams & Williams，(1995)，《醫(yī)師桌上參考手冊(cè)》(“Physician′s Desk Reference”)，第52版，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)，以及Kibbe，A.H.《藥用賦形劑手冊(cè)》(Handbook of Pharmaceutical Excipients)，第3版，美國(guó)制藥協(xié)會(huì)，華盛頓特區(qū)，2000。
本發(fā)明也提供了一種制備綴合物的方法，該方法包括，在綴合條件下，使GM-CSF部分與聚合物試劑接觸。如本文所提供的，所述的方法不必包括進(jìn)行保護(hù)和脫保護(hù)的步驟。下面的實(shí)驗(yàn)部分提供了用于制備綴合物的典型方法。一旦制備了綴合物，就可將藥學(xué)上可接受的賦形劑添加到綴合物以提供藥物組合物。
所述的藥物組合物包括了所有類型的制劑并且特別是那些適于注射的制劑，例如，可被復(fù)配成液體的粉末或凍干品。用于注射前復(fù)配固體組合物的適宜稀釋劑實(shí)例包括注射用抑菌水、5％葡萄糖水、磷酸鹽緩沖鹽水、林格液、鹽水、無(wú)菌水、去離子水，及其組合。至于液體的藥物組合物，考慮溶液和混懸液。
在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，該方法包括將綴合物傳輸給患者，該方法包括對(duì)患者給予如本文所提供的藥物組合物的步驟。這種方法具有實(shí)用性如，其中，作為用于篩選藥物組合物毒性(針對(duì)已知標(biāo)準(zhǔn)的自身毒性或者其它組合物的毒性來(lái)相關(guān)地檢驗(yàn)毒性)的方法。此外，所述的方法通過(guò)給予治療有效量藥物組合物可用于治療患有對(duì)用綴合物治療有響應(yīng)的病癥的患者?？赏ㄟ^(guò)例如靜脈注射、肌肉注射、皮下注射等進(jìn)行給藥。用于胃腸外給藥的適宜制劑類型包括可直接注射用(ready-for-injection)的溶液、用于使用前與溶劑組合的干粉，可直接注射用的混懸液、用于使用前與載體組合的干燥不溶的組合物，和乳液和用于用藥前需稀釋的濃縮液，及其它。
如前所述，傳輸?shù)姆椒捎糜谥委熁加芯Y合物用藥可以治療或預(yù)防的病癥的患者。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可鑒別特定綴合物可有效地治療的病癥。例如，在給予化療劑之前、同時(shí)或之后，對(duì)患者給予所述的綴合物。此外，可對(duì)經(jīng)骨髓移植(例如患有急性骨髓性白血病的患者)的患者給予所述的綴合物，其中用藥發(fā)生于骨髓移植(自體的或異體的)之前、同時(shí)或之后。另外，綴合物通過(guò)增強(qiáng)外周單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒活性可用于治療癌癥、粘膜炎、口腔炎、腹瀉、創(chuàng)傷愈合、肺泡蛋白沉積癥和高膽固醇血癥。最后，所述的綴合物也可用作疫苗佐劑。
給藥的實(shí)際劑量根據(jù)年齡、體重、個(gè)體的一般狀況以及被治療病癥的嚴(yán)重程度、衛(wèi)生保健專業(yè)人員的判斷和給予的綴合物而變化。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，治療上有效量是已知的，和/或描述在相關(guān)的參考教科書和文獻(xiàn)中。一般地，根據(jù)體重，治療上有效量為約0.001mg至100mg的范圍，優(yōu)選地劑量為0.01mg/天至75mg/天，和更優(yōu)選地劑量為0.10mg/天至50mg/天。根據(jù)活性，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可計(jì)算出基于國(guó)際單位活性的相應(yīng)劑量。
任何特定綴合物(同理，優(yōu)選作為藥物組合物的組分而提供)的單位劑量可以多種用藥方案而給藥，這取決于臨床人員的判斷、患者的需要等。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，特定的用藥方案是已知的或者可應(yīng)用常規(guī)的方法實(shí)驗(yàn)性確定。典型用藥方案包括，但不限于，下述給藥每日五次、每日四次，每日三次，每日兩次，每日一次，每周三次，每周兩次，每周一次，每月兩次，每月一次，及其任意的組合。一旦達(dá)到了臨床的終點(diǎn)，停止該組合物的給藥。
應(yīng)當(dāng)理解的是，盡管結(jié)合優(yōu)選的特定實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，以上的描述以及隨后的實(shí)施例都是為了舉例說(shuō)明而不是限制本發(fā)明的范圍。在其它方面，對(duì)于本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，在本發(fā)明的范圍內(nèi)的優(yōu)點(diǎn)和改進(jìn)將是顯而易見(jiàn)的。
實(shí)驗(yàn) 除非另有說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施利用有機(jī)合成等的常規(guī)技術(shù)，這屬于現(xiàn)有技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有全面的解釋。除非特別聲明，試劑和材料是商業(yè)上可獲得的。參見(jiàn)，例如，J.March，《高等有機(jī)化學(xué)反應(yīng)機(jī)理與結(jié)構(gòu)》，第4版，(紐約Wiley-Interscience，1992)，見(jiàn)上。
在下面的實(shí)施例中，發(fā)明人已作出努力確保所用數(shù)字(例如，數(shù)量、溫度等)的精確度，但是應(yīng)當(dāng)考慮實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另有說(shuō)明，溫度是攝氏度，壓力為在海平面等于或接近大氣壓。
即使本發(fā)明引用了本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它縮寫，使用了其它試劑和材料，以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它方法，但是為了方便提供了下列列表和方法描述。
縮寫 NaCNBH3氰基硼氫化鈉 HCl 鹽酸 HEPES 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸 K或kDa 千道爾頓 SEC 尺寸排除色譜法 HPLC高效液相色譜法 SDS-PAGE十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法 SDS-PAGE分析 應(yīng)用Bio-Rad系統(tǒng)(Mini-PROTEAN III Precast GelElectrophoresis System)，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)分析所標(biāo)明的樣品。將樣品與樣品緩沖液混合。然后，將制備的樣品裝至凝膠并運(yùn)行約三十分鐘。
SEC-HPLC分析 在安捷倫1100HPLC系統(tǒng)(安捷倫)上進(jìn)行尺寸排除色譜法(SEC-HPLC)分析。應(yīng)用Shodex protein KW-804柱(300×8mm，Phenomenex)，在pH 7.4的條件下，分析樣品。柱的流速為0.5mL/分鐘。應(yīng)用280nm的UV檢測(cè)被洗脫的蛋白質(zhì)和PEG-蛋白質(zhì)綴合物。
離子-交換色譜法 憑借AKTAprime系統(tǒng)(Amersham Biosciences)，應(yīng)用HiTrap Q Sepharose HP陰離子交換柱(Amersham Biosciences)來(lái)純化實(shí)施例1至6中制備的PEG化GM-CSF綴合物。至于所制備的各綴合物溶液，將綴合物溶液裝載于用pH 7.5的20nM Tris緩沖液(緩沖液A)預(yù)平衡的柱子中，然后用十倍柱容積的緩沖液A沖洗以除去未反應(yīng)的PEG試劑。隨后，增加含有0-100％緩沖液B(含有0.5M NaCl緩沖液的20mM Tris，pH 7.5)的緩沖液A梯度。用UV檢測(cè)儀在280nm監(jiān)視洗脫物。首先洗脫任何較高-mer(例如，3-mer，4-mer等等)，隨后是2-mer，然后1-mer，最后是未綴合的GM-CSF。根據(jù)色譜圖，合并餾分，應(yīng)用SEC-HPLC或SDS-PAGE測(cè)定各綴合物的純度。
對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸序列的重組人GM-CSF(hGM-CSF)應(yīng)用于實(shí)施例1-6，并且可從商業(yè)途徑獲得。通過(guò)確保重組人GM-CSF存在于無(wú)胺基的緩沖液中，應(yīng)用(必要時(shí))本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的緩沖液交換技術(shù)，制備hGM-CSF儲(chǔ)備液。
實(shí)施例140kDa mPEG-N-羥基琥珀酰亞胺衍生物與hGM-CSF的PEG化 分支的mPEG-N-羥基琥珀酰亞胺衍生物，40kDa，(“mPEG2-NHS”) 將氬氣保護(hù)下儲(chǔ)存于-20℃的40kDa mPEG2-NHS加溫至室溫。將五倍過(guò)量(相對(duì)于在已測(cè)量等分的hGM-CSF貯存溶液中hGM-CSF的量)的已加溫mPEG2-NHS溶解于2mM HCl中，形成10％試劑溶液。將10％試劑溶液迅速地加至等分的hGM-CSF貯存溶液(1mg/mL溶于磷酸鈉緩沖液中，pH 7.0)并充分混合。在加入PEG試劑后，檢測(cè)反應(yīng)混合物的pH，并利用常規(guī)的技術(shù)調(diào)節(jié)至7.0。為了使mPEG2-NHS通過(guò)酰胺鍵偶合至hGM-CSF，將反應(yīng)溶液放置慢速實(shí)驗(yàn)室振蕩器(SlowSpeed Lab Rotator)上過(guò)夜以利于室溫下綴合。用Tris緩沖液終止反應(yīng)。所得綴合物溶液的特征如下所述。
圖1顯示了綴合物溶液SEC-HPLC分析的色譜圖。PEG化反應(yīng)產(chǎn)生了57％1-mer(單綴合物或一個(gè)PEG被結(jié)合至hGM-CSF)和13％2-mer(雙綴合物或兩個(gè)PEG被結(jié)合至hGM-CSF)類型。
應(yīng)用陰離子-交換色譜法來(lái)純化綴合物。圖2顯示了陰離子-交換純化后的色譜圖。收集綴合物的餾分并用SDS-PAGE來(lái)分析(圖3)。被純化的綴合物可達(dá)100％純。
應(yīng)用這種相同的方法，利用含其它重均分子量的mPEG2-NHS可以制備其它的綴合物。
實(shí)施例230kDa線型mPEG-琥珀酰亞胺基α-甲基丁酸酯衍生物與hGM-CSF的PEG化 線型mPEG-琥珀酰亞胺基α-甲基丁酸酯衍生物，30kDa(“mPEG-SMB”) 將氬氣保護(hù)下儲(chǔ)存于-20℃的30kDa mPEG-SMB加溫至室溫。將十倍過(guò)量(相對(duì)于在已測(cè)量等分的hGM-CSF貯存溶液中hGM-CSF的量)的已加溫mPEG-SMB溶解于2mM HCl中，形成10％試劑溶液。將10％試劑溶液迅速地加至等分的hGM-CSF貯存溶液(1mg/mL溶于磷酸鈉緩沖液中，pH 7.0)并充分混合。在加入mPEG-SMB后，檢測(cè)反應(yīng)混合物的pH，并利用常規(guī)的技術(shù)調(diào)節(jié)至7.0。為了使mPEG-SMB通過(guò)酰胺鍵偶合至hGM-CSF，將反應(yīng)溶液放置慢速實(shí)驗(yàn)室振蕩器上過(guò)夜以利于室溫下綴合。用Tris緩沖液終止反應(yīng)。所得綴合物溶液的特征如下所述。
圖4顯示了綴合物溶液SEC-HPLC分析的色譜圖。SEC-HPLC分析揭示PEG化反應(yīng)產(chǎn)生了58％ 1-mer(單綴合物或一個(gè)PEG被結(jié)合至hGM-CSF)和14％ 2-mer(雙綴合物或兩個(gè)PEG被結(jié)合至hGM-CSF)類型。應(yīng)用Q Sepharose高效柱和Tris緩沖液的陰離子-交換色譜法也用于純化綴合物。所得綴合物種類的分離情況類似于圖2中所示。
應(yīng)用這種相同的方法，利用具有其它重均分子量的mPEG-SMB可以制備其它的綴合物。
實(shí)施例3
20kDa mPEG-哌啶酮與hGM-CSF的PEG化， 可以自Nektar Therapeutics(Huntsville，AL)獲得分子量為20,000道爾頓的mPEG-哌啶酮(mPEG-PIP)。所述聚合物試劑的基本結(jié)構(gòu)表示如下 線型mPEG-哌啶酮衍生物，20kDa(“mPEG-PIP”) 將氬氣保護(hù)下儲(chǔ)存于-20℃的20kDa mPEG-PIP加溫至室溫。將五十至一百倍過(guò)量(相對(duì)于在已測(cè)量等分的hGM-CSF貯存溶液中hGM-CSF的量)的已加溫mPEG-PIP溶解于10mM磷酸鈉(pH 7.0)中，形成10％試劑溶液。將10％試劑溶液迅速地加至等分的hGM-CSF貯存溶液(1mg/mL溶于磷酸鈉緩沖液中，pH 7.0)并充分混合。在加入mPEG-PIP后，檢測(cè)反應(yīng)混合物的pH，并利用常規(guī)的技術(shù)調(diào)節(jié)至7.0，然后攪拌30分鐘。然后，加入還原劑、氰基硼氫化鈉，來(lái)制備13mMNaCNBH3。將反應(yīng)溶液放置慢速實(shí)驗(yàn)室振蕩器上過(guò)夜以利于室溫下綴合。用Tris緩沖液終止反應(yīng)。所得綴合物溶液的特征如下所述。
PEG化反應(yīng)產(chǎn)生了超過(guò)30％的1-mer(單綴合物或一個(gè)PEG被結(jié)合至hGM-CSF)。由于PEG環(huán)結(jié)構(gòu)的高選擇性，只得到很少2-mer。
陰離子-交換色譜法也用于純化綴合物。圖5描述了陰離子-交換純化的情況。
實(shí)施例420kDa線型mPEG-丁醛衍生物與hGM-CSF的PEG化 線型mPEG-丁醛衍生物，20kDa(“mPEG-ButyrALD”) 將氬氣保護(hù)下儲(chǔ)存于-20℃的20kDa mPEG-ButyrALD加溫至室溫。將三十倍過(guò)量(相對(duì)于在已測(cè)量等分的hGM-CSF貯存溶液中hGM-CSF的量)的已加溫mPEG-ButryALD溶解于Milli-Q水中，形成10％試劑溶液。將10％試劑溶液迅速地加至等分的hGM-CSF貯存溶液(1mg/mL溶于磷酸鈉緩沖液中，pH 7.0)并充分混合。在加入mPEG-ButryALD后，檢測(cè)反應(yīng)混合物的pH，并利用常規(guī)的技術(shù)調(diào)節(jié)至6.0，然后攪拌30分鐘。然后，加入還原劑、氰基硼氫化鈉，來(lái)制備9mM NaCNBH3。將反應(yīng)溶液放置慢速實(shí)驗(yàn)室振蕩器上過(guò)夜以利于室溫下綴合。用Tris緩沖液終止反應(yīng)。所得綴合物溶液的特征如下所述。
mPEG-ButryALD的醛基基團(tuán)可與hGM-CSF相關(guān)的伯胺反應(yīng)，并且經(jīng)還原劑如氰基硼氫化鈉還原通過(guò)仲胺與所述伯胺共價(jià)成鍵。因?yàn)镻EG化反應(yīng)是在pH 6.0條件下進(jìn)行的，PEG衍生物與hGM-CSF的結(jié)合更易于選擇N-末端。圖6顯示了綴合物溶液的SEC-HPLC色譜圖。PEG化反應(yīng)產(chǎn)生了75％ 1-mer(一個(gè)PEG被結(jié)合至hGM-CSF或單PEG化)和4％ 2-mer(雙綴合物或兩個(gè)PEG被結(jié)合至hGM-CSF)類型。應(yīng)用Q Sepharose高效柱和Tris緩沖液的陰離子-交換色譜法也用于純化綴合物。所得綴合物種類的分離情況類似于圖5中所示。
應(yīng)用此種相同的方法，利用具有其它重均分子量的mPEG-ButyrALD可以制備另外的綴合物。
實(shí)施例530kDa線型mPEG-丁醛衍生物與hGM-CSF的PEG化 線型mPEG-丁醛衍生物，30kDa(“mPEG-ButyrALD”) 將氬氣保護(hù)下儲(chǔ)存于-20℃的30kDa mPEG-ButyrALD加溫至室溫。將三十倍過(guò)量(相對(duì)于在已測(cè)量等分的hGM-CSF貯存溶液中hGM-CSF的量)的已加溫mPEG-ButryALD溶解于Milli-Q水中，形成10％試劑溶液。將10％試劑溶液迅速地加至等分的hGM-CSF貯存溶液(1mg/mL溶于磷酸鈉緩沖液中，pH 7.0)并充分混合。在加入mPEG-ButryALD后，檢測(cè)反應(yīng)混合物的pH，并利用常規(guī)的技術(shù)調(diào)節(jié)至6.0，然后攪拌30分鐘。然后，加入還原劑、氰基硼氫化鈉，來(lái)制備9mM NaCNBH3。將反應(yīng)溶液放置慢速實(shí)驗(yàn)室振蕩器上過(guò)夜以利于室溫下綴合。用Tris緩沖液終止反應(yīng)。所得綴合物溶液的特征如下所述。
mPEG-ButryALD的醛基基團(tuán)可與hGM-CSF相關(guān)的伯胺反應(yīng)，并且經(jīng)還原劑如氰基硼氫化鈉還原通過(guò)仲胺與所述伯胺共價(jià)成鍵。因?yàn)镻EG化反應(yīng)是在pH 6.0條件下進(jìn)行的，PEG衍生物與hGM-CSF的結(jié)合更易于選擇N-末端。圖7顯示了綴合物溶液的SEC-HPLC色譜圖。PEG化反應(yīng)產(chǎn)生了63％ 1-mer(一個(gè)PEG被結(jié)合至hGM-CSF或單PEG化)和20％ 2-mer(雙綴合物或兩個(gè)PEG被結(jié)合至hGM-CSF)類型。應(yīng)用Q Sepharose高效柱和Tris緩沖液的陰離子-交換色譜法也用于純化綴合物。綴合物種類的分離情況類似于圖2中所示。
應(yīng)用此種相同的方法，利用具有其它重均分子量的mPEG-ButyrALD可以制備另外的綴合物。
實(shí)施例640kDa分支mPEG2-丁醛衍生物與hGM-CSF的PEG化 分支mPEG-丁醛衍生物，40kDa(“mPEG2-ButyrALD”) 將氬氣保護(hù)下儲(chǔ)存于-20℃的40kDa mPEG2-ButyrALD加溫至室溫。將三十倍過(guò)量(相對(duì)于在已測(cè)量等分的hGM-CSF貯存溶液中hGM-CSF的量)的已加溫mPEG2-ButyrALD溶解于Milli-Q水中，形成10％試劑溶液。將10％試劑溶液迅速地加至等分的hGM-CSF貯存溶液(1mg/mL溶于磷酸鈉緩沖液中，pH 7.0)并充分混合。在加入mPEG2-ButryALD后，檢測(cè)反應(yīng)混合物的pH，并利用常規(guī)的技術(shù)調(diào)節(jié)至6.0，然后攪拌30分鐘。然后，加入還原劑、氰基硼氫化鈉，來(lái)制備9mM NaCNBH3。將反應(yīng)溶液放置慢速實(shí)驗(yàn)室振蕩器上過(guò)夜以利于室溫下綴合。用Tris緩沖液終止反應(yīng)。所得綴合物溶液的特征如下所述。
mPEG2-ButryALD的醛基基團(tuán)可與hGM-CSF相關(guān)的伯胺反應(yīng)，并且經(jīng)還原劑如氰基硼氫化鈉還原通過(guò)仲胺與所述伯胺共價(jià)成鍵。因?yàn)镻EG化反應(yīng)是在pH 6.0條件下進(jìn)行的，PEG衍生物與hGM-CSF的結(jié)合更易于選擇N-末端。圖8顯示了綴合物溶液的SEC-HPLC色譜圖。PEG化反應(yīng)產(chǎn)生了65％ 1-mer(一個(gè)PEG被結(jié)合至hGM-CSF或單PEG化)和10％ 2-mer(雙綴合物或兩個(gè)PEG被結(jié)合至hGM-CSF)類型。應(yīng)用Q Spepharose高效柱和Tris緩沖液的陰離子-交換色譜法也用于純化綴合物。所得綴合物種類的分離情況類似于圖2中所示。
應(yīng)用此種相同的方法，利用具有其它重均分子量的mPEG2-ButyrALD可以制備另外的綴合物。
實(shí)施例7hGM-CSF與mPEG-SBA的PEG化 可以自Nektar Therapeutics(Huntsville，AL)獲得分子量為20,000道爾頓的mPEG-琥珀酰亞胺基丁酸酯。聚合物試劑的基本結(jié)構(gòu)表示如下 將GM-CSF溶于去離子水中，加入三乙胺以將pH升高至7.2-9。然后，在這種溶液中，加入1.5至10倍摩爾過(guò)量的mPEG-SBA。室溫下攪拌得到的混合物數(shù)小時(shí)。
用SDS-PAGE分析反應(yīng)混合物以確定蛋白質(zhì)的PEG化程度。
實(shí)施例820K mPEG-MAL與被嵌入半胱氨酸的hGM-CSF的綴合
mPEG-MAL，20K 根據(jù)WO 90/12874中描述的工藝，用一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基嵌入GM-CSF。
將氬氣保護(hù)下儲(chǔ)存于-20℃的20K mPEG-MAL加溫至室溫。將五至二十倍過(guò)量的已加溫20K mPEG-MAL溶解于去離子水中，以制備10％mPEG MAL溶液。將mPEG MAL溶液迅速地加至等分的GM-CSF貯存溶液(1mg/mL溶于50mM HEPES中，pH 7.0)并充分混合。在室溫反應(yīng)1小時(shí)后，將反應(yīng)瓶轉(zhuǎn)移至冷室，并且在Rotomix(低速，Thermolyne)上于4℃下使反應(yīng)過(guò)夜進(jìn)行。
應(yīng)用凝膠過(guò)濾色譜法純化綴合物的混合物。開(kāi)發(fā)尺寸排除色譜方法來(lái)分析反應(yīng)的混合物，以及最終的產(chǎn)物。SDS-PAGE分析也可被用于表征樣品。
實(shí)施例930K mPEG-MAL與GM-CSF的綴合 mPEG-MAL，30K 根據(jù)WO 90/12874中描述的工藝，用一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基嵌入GM-CSF。
將氬氣保護(hù)下儲(chǔ)存于-20℃的30K mPEG-MAL加溫至室溫。將五至二十倍過(guò)量的已加溫30K mPEG-MAL溶解于去離子水中，以制備10％mPEG MAL溶液。將mPEG MAL溶液迅速地加至等分的GM-CSF貯存溶液(1mg/mL溶于50mM HEPES中，pH 7.0)并充分混合。在室溫反應(yīng)1小時(shí)后，將反應(yīng)瓶轉(zhuǎn)移至冷室，并且在Rotomix(低速，Thermolyne)上4℃下使反應(yīng)過(guò)夜進(jìn)行。
應(yīng)用凝膠過(guò)濾色譜法純化綴合物的混合物。開(kāi)發(fā)尺寸排除色譜方法來(lái)分析反應(yīng)混合物，以及最終的產(chǎn)物。SDS-PAGE分析也被用于表征樣品。
實(shí)施例10典型(GM-CSF)-PEG綴合物的體外活性 測(cè)定實(shí)施例1-6中描述的綴合物的體外活性。所有被檢驗(yàn)的綴合物都有生物活性。
實(shí)施例11-19 重復(fù)實(shí)施例1-9的每一個(gè)，只是用SEQ ID NO1 GM-CSF代替了SEQ ID NO2的GM-CSF部分。
實(shí)施例20綴合物的體外活性 測(cè)定實(shí)施例11-19中描述的綴合物的體外活性。所有被檢驗(yàn)的綴合物都有生物活性。
序列表SEQ ID NO1APARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQESEQ ID NO2APARSPSPSTQPWEHVNAIQEALRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQESEQ ID NO3APARSPSPSTQPWEHVNAIQEARLLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE
權(quán)利要求
1.一種綴合物，其含有如下結(jié)構(gòu) 其中POLY是水溶性聚合物；(a)為0或1；X1，當(dāng)存在時(shí)，是含有一個(gè)或多個(gè)原子的間隔部分；R1是有機(jī)基團(tuán)；GM-CSF是GM-CSF部分。
2.權(quán)利要求1的綴合物，其含有如下結(jié)構(gòu) 其中(n)是數(shù)值為3至4000的整數(shù)；X1如上定義；R1為選自甲基、乙基、丙基和異丙基；并且GM-CSF是人GM-CSF。
3.權(quán)利要求1的綴合物，其含有如下結(jié)構(gòu) 其中，(n)是數(shù)值為3至4000的整數(shù)，并且GM-CSF是人GM-CSF。
4.一種綴合物，其包括下列結(jié)構(gòu) 其中POLY為水溶性聚合物；(d)是0或1；X2，當(dāng)存在時(shí)，為含有一個(gè)或多個(gè)原子的間隔部分；(b)是數(shù)值為1至10的整數(shù)；(c)是數(shù)值為1至10的整數(shù)；R2，在任何情況下都獨(dú)立地為H或有機(jī)基團(tuán)；R3，在任何情況下都獨(dú)立地為H或有機(jī)基團(tuán)；并且GM-CSF為GM-CSF部分。
5.權(quán)利要求4的綴合物，其含有如下結(jié)構(gòu) 其中(n)是數(shù)值為3至4000的整數(shù)；X2如上定義；(b)為2至6；(c)為2至6；R2，在任何情況下都獨(dú)立地為H或低級(jí)烷基；并且GM-CSF為人GM-CSF。
6.權(quán)利要求5的綴合物，其含有如下結(jié)構(gòu) 其中，(n)是數(shù)值為3至4000的整數(shù)，并且GM-CSF是人GM-CSF。
7.權(quán)利要求4的綴合物，其含有如下結(jié)構(gòu) 其中每個(gè)(n)是數(shù)值為3至4000的整數(shù)；X如上定義；(b)為2至6；(c)為2至6；R2，在任何情況下都獨(dú)立地為H或低級(jí)烷基；并且GM-CSF為GM-CSF部分。
8.權(quán)利要求5的綴合物，其含有如下結(jié)構(gòu) 其中每個(gè)(n)獨(dú)立地是數(shù)值為3至4000的整數(shù)；并且GM-CSF是人GM-CSF。
9.一種綴合物，其包括GM-CSF部分，所述的GM-CSF部分包含直接地或通過(guò)包含一個(gè)或多個(gè)原子的間隔部分共價(jià)地結(jié)合至分支水溶性聚合物的內(nèi)部胺基。
10.權(quán)利要求9的綴合物，其中，所述的綴合物進(jìn)一步包含直接地或通過(guò)含有一個(gè)或多個(gè)原子的間隔部分共價(jià)地結(jié)合至N-末端氨基酸殘基的另外的分支水溶性聚合物。
11.權(quán)利要求9的綴合物，其中所述的分支水溶性聚合物缺少通過(guò)-OCH2CONHCH2CO-鍵結(jié)合至賴氨酸胺基的賴氨酸殘基。
12.權(quán)利要求9的綴合物，其中所述的分支水溶性聚合物含有下結(jié)構(gòu) 其中，每個(gè)(n)獨(dú)立地是數(shù)值為3至4000的整數(shù)。
13.權(quán)利要求1、4或9的綴合物，其中，所述各綴合物中的水溶性聚合物選自聚(烯化氧)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉和聚(丙烯酰嗎啉)。
14.權(quán)利要求13的綴合物，其中各水溶性聚合物是聚(烯化氧)。
15.權(quán)利要求14的綴合物，其中各聚(烯化氧)是聚(乙二醇)。
16.權(quán)利要求15的綴合物，其中，所述聚(乙二醇)在末端上用一種封端部分封端，所述的封端部分選自羥基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烴氧基、取代的烯烴氧基、炔烴氧基、取代的炔烴氧基、芳基氧基和取代的芳基氧基。
17.權(quán)利要求15的綴合物，其中，所述聚(乙二醇)在末端上用甲氧基封端。
18.權(quán)利要求1、4或9的綴合物，其中，所述的水溶性聚合物具有大于5,000道爾頓至約150,000道爾頓范圍的總重均分子量。
19.權(quán)利要求18的綴合物，其中，所述聚(乙二醇)具有約6,000道爾頓至約100,000道爾頓范圍的總重均分子量。
20.權(quán)利要求19的綴合物，其中，所述聚(乙二醇)具有約15,000道爾頓至約85,000道爾頓范圍的總重均分子量。
21.權(quán)利要求20的綴合物，其中，所述聚(乙二醇)具有約20,000道爾頓至約85,000道爾頓范圍的總重均分子量。
22.權(quán)利要求21的綴合物，其中，所述聚(乙二醇)具有約20,000道爾頓至約60,000道爾頓范圍的總重均分子量。
23.權(quán)利要求1或4的綴合物，其中，所述的水溶性聚合物是分支的。
24.權(quán)利要求1、4或9的綴合物，其中，所述的GM-CSF部分選自人GM-CSF，和任意前述的生物學(xué)活性片斷、缺失變異體、取代變異體或添加變異體。
25.權(quán)利要求1、4或9的綴合物，其中，所述的GM-CSF部分是重組取得的。
26.權(quán)利要求1、4或9的綴合物，其中，至多三個(gè)水溶性聚合物被結(jié)合至GM-CSF部分。
27.權(quán)利要求1、4或9的綴合物是雙PEG化的形式。
28.權(quán)利要求1、4或9的綴合物是單PEG化的形式。
29.權(quán)利要求1、4或9的綴合物。其中所述的GM-CSF部分是非糖基化的。
30.權(quán)利要求1、4或9的綴合物。其中所述的GM-CSF部分是糖基化的。
31.一種藥物組合物，其含有(i)一種綴合物，其含有直接地或者通過(guò)包括一個(gè)或多個(gè)原子的間隔部分共價(jià)地結(jié)合至水溶性聚合物的GM-CSF，其中所述的水溶性聚合物具有大于5,000道爾頓的重均分子量；和(ii)一種藥學(xué)上可接受的賦形劑，其中，所述組合物中的所述綴合物至少約85％具有被結(jié)合至人GM-CSF部分的1至2個(gè)聚合物。
32.權(quán)利要求31的組合物，其中，在所述各綴合物中的各所述水溶性聚合物選自聚(烯化氧)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉和聚(丙烯酰嗎啉)。
33.權(quán)利要求32的組合物，其中，所述各水溶性聚合物為聚(烯化氧)。
34.權(quán)利要求33的組合物，其中，所述各聚(烯化氧)是聚(乙二醇)。
35.權(quán)利要求34的組合物，其中，所述聚(乙二醇)在末端上用一種封端部分封端，所述的封端部分選自羥基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烴氧基、取代的烯烴氧基、炔烴氧基、取代的炔烴氧基、芳基氧基和取代的芳基氧基。
36.權(quán)利要求34的組合物，其中，所述聚(乙二醇)在末端上用甲氧基封端。
37.權(quán)利要求34的組合物，其中，所述聚(乙二醇)具有大于5,000道爾頓至約150,000道爾頓范圍的總重均分子量。
38.權(quán)利要求37的組合物，其中，所述聚(乙二醇)具有約6,000道爾頓至約100,000道爾頓范圍的總重均分子量。
39.權(quán)利要求38的組合物，其中，所述聚(乙二醇)具有約15,000道爾頓至約85,000道爾頓范圍的總重均分子量。
40.權(quán)利要求39的組合物，其中，聚(乙二醇)具有約20,000道爾頓至約85,000道爾頓范圍的總重均分子量。
41.權(quán)利要求40的組合物，其中，所述聚(乙二醇)具有約20,000道爾頓至約60,000道爾頓范圍的總重均分子量。
42.權(quán)利要求41的組合物，其中，在所述各綴合物中的所述各水溶性聚合物是線型水溶性聚合物。
43.權(quán)利要求31的組合物，其中，在所述各綴合物中的所述各水溶性聚合物是分支的水溶性聚合物。
44.權(quán)利要求43的組合物，其中所述的分支水溶性聚合物缺少通過(guò)-OCH2CONHCH2CO-鍵結(jié)合至賴氨酸胺基的賴氨酸殘基。
45.權(quán)利要求31的組合物，規(guī)定當(dāng)所述水溶性聚合物是分支的水溶性聚合物時(shí)，所述的分支水溶性聚合物缺少用于影響分支的賴氨酸殘基。
46.權(quán)利要求43的組合物，其中，所述的分支水溶性聚合物含有括下列結(jié)構(gòu) 其中，每個(gè)(n)獨(dú)立地是數(shù)值為3至4000的整數(shù)。
47.權(quán)利要求31的組合物，其中，所述的人GM-CSF包括SEQ ID NO1的氨基酸序列。
48.權(quán)利要求31的組合物，其中，所述的人GM-CSF包括SEQ ID NO2的氨基酸序列。
49.權(quán)利要求31的組合物，其中，所述的人GM-CSF為重組取得的。
50.權(quán)利要求48的組合物，其中，所述的人GM-CSF是非糖基化的。
51.權(quán)利要求48的組合物，其中，所述的人GM-CSF是糖基化的。
52.一種藥物組合物，其包括(i)權(quán)利要求1、4或9的綴合物；和(ii)一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。
53.權(quán)利要求31或52的組合物，其中所述的組合物基本上不含白蛋白。
54.權(quán)利要求31或52的組合物，其中所述的組合物基本上不含無(wú)GM-CSF活性的蛋白質(zhì)。
55.權(quán)利要求31或52的組合物，其中所述的組合物基本上不含非共價(jià)地結(jié)合的水溶性聚合物。
56.權(quán)利要求31或52的組合物，是凍干形式。
57.權(quán)利要求31或52的組合物，是液體形式。
58.權(quán)利要求31或52的組合物，其中所述組合物中的所述綴合物至少約90％具有一個(gè)或兩個(gè)被結(jié)合至人GM-CSF的聚合物。
59.權(quán)利要求58的組合物，其中所述組合物中的所述綴合物至少約95％具有一個(gè)或兩個(gè)被結(jié)合至人GM-CSF的聚合物。
60.一種用于對(duì)患者進(jìn)行一種綴合物給藥的方法，該方法包括對(duì)患者給予權(quán)利要求31或52的藥物組合物的步驟。
61.權(quán)利要求60的方法，是以皮下注射方式實(shí)現(xiàn)的。
62.一種用于制備一種綴合物的方法，其包括，在綴合條件下使GM-CSF部分與聚合物試劑進(jìn)行接觸以得到權(quán)利要求1、4或9的綴合物。
63.權(quán)利要求62的方法，其中不實(shí)施保護(hù)和脫保護(hù)步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供了粒－巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM－CSF)部分與一個(gè)或多個(gè)水溶性聚合物的綴合物。典型地，所述的水溶性聚合物是聚(乙二醇)或者其衍生物。本發(fā)明還提供了含有該綴合物的組合物，制備該綴合物的方法，和對(duì)患者給予含有該綴合物的該組合物的方法。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101031323SQ200580031170
公開(kāi)日2007年9月5日 申請(qǐng)日期2005年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月16日
發(fā)明者M·J·博薩德, 張平 申請(qǐng)人:尼克塔治療亞拉巴馬公司