專利名稱：持續(xù)釋放制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明廣泛涉及持續(xù)釋放制劑領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明描述涉及用純化的沒食子酸酯對蛋白和/或肽進(jìn)行制劑化的組合物和方法。在一個實(shí)例中，沒食子酸酯是五沒食子酰葡萄糖(PentaGalloylGlucose，PGG)，其中沒食子酸也稱作3，4，5三羥基苯甲酸，在另一實(shí)例中，沒食子酸酯是表兒茶素沒食子酸酯(EGCG)。
背景為了實(shí)現(xiàn)蛋白或肽的體內(nèi)連續(xù)送遞，需要持續(xù)釋放或持續(xù)送遞制劑來避免重復(fù)施用的需要。持續(xù)藥物送遞的一種方法是通過微膠囊包封，其中活性成分包封在聚合物膜中以產(chǎn)生微粒。
已經(jīng)證明可以將生物活性或藥學(xué)活性劑包封在生物相容性、生物可降解的壁形成材料如聚合物中，以提供持續(xù)或延遲的釋放。在這些方法中，試劑或藥物典型地是用攪拌器、振蕩器或其它動力學(xué)混合技術(shù)溶解、分散或乳化在一種或多種含有壁形成材料的溶劑中。然后除去溶劑，導(dǎo)致形成包封試劑或藥物的微粒。然后可以將這些微粒施用于患者。
目前已經(jīng)確立了作為腸胃外藥物送遞系統(tǒng)的載體的生物相容性和/或生物可降解的聚合物的重要性。要施用的含有活性劑的生物相容性、生物可降解的和相對惰性的物質(zhì)如聚(丙交酯)(PLA)或聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)微球或膜通常利用持續(xù)釋放裝置(綜述參見M.Chasin，Biodegradable polymers for controlled drug delivery.InJ.O.Hollinger Editor，Biomedical Applications of SyntheticBiodegradable Polymers CRC，Boca Raton，F(xiàn)L(1995)，pp.1-15；T.Hayashi，Biodegradable polymers for biomedical uses.Prog.Polym.Sci.194(1994)，pp.663-700；和Harjit Tamber，Pl Johansen，HansP.Merkle and Bruno Gander，F(xiàn)ormulation aspects of biodegradablepolymeric microspheres for antigen delivery Advanced Drug DeliveryReviews，Volume 57，Issue3，10January2005，Pages357-376)。
但是，設(shè)計活性劑的送遞系統(tǒng)仍然存在很多挑戰(zhàn)。所述送遞系統(tǒng)的基本要求是使用的材料是腸胃外應(yīng)用可接受的。如上文所提到的，需要使用的材料對于意欲重復(fù)施用的制劑是生物可降解的。另一個通常需要的質(zhì)量是生物相容性材料應(yīng)該是耐受良好的，生物降解應(yīng)該產(chǎn)生無害的化合物，這些化合物可以從身體除去或整合到中間代謝中。通常用于制造腸胃外制劑的材料是有限的，并且對于腸胃外蛋白制劑仍然是短缺的。
另一個需要的特性是釋放包封的活性劑的足夠良好的控制。通常重要的是在足夠獲得需要的效果并且避免過量濃度的有效時間窗內(nèi)維持活性劑的濃度，所述過量濃度可能導(dǎo)致副作用或不適當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。用單片微粒作為施用后第一天內(nèi)釋放的活性劑的級份達(dá)到需要的釋放動力學(xué)通常是困難的，通常取決于藥物的加載水平。
持續(xù)送遞技術(shù)的另一個需要的特征，特別是當(dāng)應(yīng)用于大分子送遞時，是在制造過程中維持活性劑的完整性。這通常是一個困難的挑戰(zhàn)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)蛋白和肽藥物的生物活性依賴于三維構(gòu)象，該構(gòu)象很容易被破壞。例如，用于制造控釋腸胃外制劑的大多數(shù)聚合物在水中不溶解，因此蛋白或肽在包封步驟中暴露于有機(jī)溶解。與制造控釋制劑相關(guān)的、可能破壞任何特定活性劑的完整性的其它不利脅迫是用于在連續(xù)相中形成聚合物液滴的高剪切力、暴露于聚合反應(yīng)、高溫和不利的低或高pH值。
持續(xù)釋放形式的另一個需要的特性是在釋放過程中，在微粒內(nèi)保持活性劑，特別是蛋白或肽的完整性。根據(jù)選擇的釋放持續(xù)時間，該階段可以是幾天到幾個月。對于由PLGA形成的常規(guī)聚合物基質(zhì)系統(tǒng)，在聚合物的生物降解過程中形成的酸性微環(huán)境可能在體外和體內(nèi)溫育過程中降解摻入其中的活性劑。
現(xiàn)有技術(shù)描述了多種持續(xù)送遞組合物和制備它們的方法，例如，美國專利US 5,916,597；5,019,400；5,922,253；和6,531,154。在很多情況下，摻入的活性劑從生物相容性和生物可降解聚合物中的體內(nèi)釋放最初是高或低的，因此在送遞裝置的壽命中是不均一的。此外，用聚合物進(jìn)行的微膠囊包封容易提供從2周到9個月或更長時間的肽持續(xù)送遞，而對于某些藥物來說，需要較短期的送遞譜。因此，本領(lǐng)域需要具有小于大約一周或兩周的釋放譜的持續(xù)釋放組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了包含穩(wěn)定的持續(xù)釋放復(fù)合物的藥物組合物，所述復(fù)合物包含蛋白和/或肽和沒食子酸酯，該組合物允許在施用復(fù)合物后在體內(nèi)持續(xù)送遞蛋白或肽。因此，本發(fā)明的復(fù)合物可以允許在小于大約1或2周的時間段中將藥物活性肽連續(xù)送遞給受試者。
本發(fā)明的復(fù)合物是通過在使得形成復(fù)合物的條件下組合蛋白或肽和沒食子酸酯形成的。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，復(fù)合物是沒食子酸酯和蛋白或肽的鹽。復(fù)合物在水中是典型地難溶的，并且可以從多種水溶液中純化。由于復(fù)合物是固體形式(如糊、顆粒、分泌或凍干物)，可以制備復(fù)合物，用于作為穩(wěn)定的液體懸浮液或半固體分散體施用給受試者。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，適用于與肽或蛋白形成復(fù)合物的基團(tuán)是沒食子酸酯。優(yōu)選地，酯本身是通過沒食子酸的酸基團(tuán)與諸如糖的另一個化合物上的醇部分的連接而形成的。在一種具體實(shí)施方案中，沒食子酸酯是五沒食子酰基葡萄糖(PGG)，其中沒食子酸也稱作3，4，5-三羥基苯甲酸。在另一實(shí)施方案中，沒食子酸酯是表兒茶素沒食子酸酯(EGCG)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及包含持續(xù)釋放復(fù)合物的組合物，所述復(fù)合物包含蛋白或肽和沒食子酸酯，還涉及制備所述組合物的方法和使用所述組合物的方法。盡管沒食子酸酯是公知的丹寧酸的成分，但是，還沒有描述過如此處描述的用高度純化的丹寧酸的成分如特定的沒食子酸酯與肽和多肽制備鹽，以產(chǎn)生持續(xù)釋放的制劑。本發(fā)明的組合物的優(yōu)點(diǎn)包括在控制的時間段中(如典型地小于大約1或2周)系統(tǒng)或局部送遞復(fù)合物的肽或蛋白部分。也涉及送遞更長的時間段。
如此處用到的術(shù)語“蛋白”和“肽”理解為包含通過酰胺鍵連接的氨基酸的聚合物。典型地，肽包含少于約50個氨基酸，更典型地少于約30個氨基酸殘基，甚至更典型地，少于約20個氨基酸殘基。而蛋白典型地包含超過50個氨基酸，并且具有結(jié)構(gòu)和生物活性。蛋白的生物活性可以是酶活性或可以是賦予構(gòu)象改變的結(jié)合活性。這些術(shù)語意欲包括模擬蛋白或肽的成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)的類似物和衍生物。類似物的例子包括含有一個或多個非天然氨基酸的肽或蛋白。示例的衍生物包括含有氨基酸側(cè)鏈、肽主鏈和/或經(jīng)過衍生的氨基或羧基末端的肽或蛋白。
適于本發(fā)明的制劑的肽包括但不限于enfuvirtide(由Trimeris和Roche以Fuzeon的商品名出售)、血管緊張素原、糊精、ACTH、腎素底物、殺菌肽A-蜂毒肽酰胺、殺菌肽B、爪蟾抗菌肽1、腎素抑制劑肽、鈴蟾肽、骨鈣蛋白、緩激肽、B1抑制劑肽、緩激肽肽拮抗劑，包括公開于2004年10月21日提交的美國專利申請No.10/972,236的緩激肽肽拮抗劑、血管舒張肽、降鈣素、縮膽囊素、促皮質(zhì)素釋放因子、強(qiáng)啡肽A、內(nèi)啡素、角蛭毒素、腦啡肽、Exendin、血纖肽、Galanin、胃泌素、胃泌素釋放肽、胰高血糖樣肽、生長激素釋放因子、OVA肽、促黃體生成激素釋放激素、心房利鈉肽、黑色素濃集激素、腦利鈉肽、Vasonatrin、神經(jīng)激肽、神經(jīng)調(diào)節(jié)肽、神經(jīng)肽Y、神經(jīng)降壓素、Orexin、催產(chǎn)素、加壓素、甲狀旁腺素肽、促乳素釋放肽、生長抑素、生長抑素腫瘤抑制類似物、促甲狀腺素釋放激素及其變體和衍生物(也參見Latham，(1999)Nat.Biotech.，17755)。
可以根據(jù)本發(fā)明制劑化的肽包括但不限于Flt3配體、CD40配體、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、降鈣素、Fas配體、NF-κB的受體激活劑的配體(RANKL)、TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)、ORK/Tek、胸腺基質(zhì)衍生的淋巴生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、肥大細(xì)胞生長因子、干細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、RANTES、生長素、胰島素、促胰島素分泌素、胰島素樣生長因子、甲狀旁腺素、神經(jīng)生長因子、胰高血糖素、白介素1-18、集落刺激因子、淋巴毒素-β、腫瘤壞死因子、白血病抑制因子、制癌蛋白M和細(xì)胞表面分子Elk和Hek的多種配體(如eph相關(guān)激酶或LERKS的配體)。制備所述蛋白的說明可以參見，例如，人細(xì)胞因子Handbook for Basic and Clinical Research，Vol.II(Aggarwal andGutterman，Eds.Blackwell Sciences，Cambridge MA，1998)；生長因子A Practical Approach(McKay and Leigh，Eds.Oxford UniversityPress Inc.，New York，1993)和The Cytokine Handbook(AWThompson，ed.；Academic Press，San Diego CA；1991)。
也可以根據(jù)本發(fā)明對前述任何蛋白的受體制劑化，前提是它們是適于施用給受試者的分子的可溶部分。實(shí)例包括以下物質(zhì)的受體兩種形式的腫瘤壞死因子受體(稱作p55和p75)、白介素-1受體(1型和2型)、白介素-4受體、白介素-15受體、白介素-17受體、白介素-18受體、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體、粒細(xì)胞集落刺激因子受體、制癌蛋白M和白血病抑制因子的受體、NF-κB的受體激活劑(RANK)、TRAIL的受體，以及包含死亡結(jié)構(gòu)域的受體，如Fas或凋亡誘導(dǎo)受體(AIR)。一種特別優(yōu)選的受體是可溶形式的II型IL-1受體；所述蛋白描述于美國專利No.5,767,064，在此全文引入作為參考。
可以根據(jù)本發(fā)明制劑化的其它蛋白包括分化抗原簇的可溶性變體(稱作CD蛋白)，例如，公開于Leukocyte Typing VI(Proceedings ofthe VIth International Workshop and Conference；Kishimoto，Kikutaniet al.，Eds.Kobe，Japan，1996)中的那些，或公開于后續(xù)的專題學(xué)術(shù)討論會的CD分子。所述分子的例子包括CD27、CD30、CD39、CD40及其配體(CD27配體、CD30配體和CD40配體)。這些中的一些是TNF受體家族的成員，該家族也包括41BB和OX40；配體通常是TNF家族的成員(如同41BB配體和OX40配體)；因此，也可以用本發(fā)明制備TNF和TNFR家族的成員。
也可以根據(jù)本發(fā)明對具有酶活性的蛋白制劑化。實(shí)例包括金屬蛋白酶-解聯(lián)蛋白家族成員、多種激酶、葡糖腦苷脂酶、α-半乳糖苷酶A、超氧化物歧化酶、組織纖溶酶原激活劑、因子VIII、因子IX、載脂蛋白E、載脂蛋白A-I、球蛋白、IL-2拮抗劑、α-1抗胰蛋白酶、TNF-α轉(zhuǎn)化酶和許多其它酶。也可以通過應(yīng)用本發(fā)明，對具有酶活性的蛋白的配體進(jìn)行制劑化。
本發(fā)明的組合物和方法也可以用于對其它類型的蛋白進(jìn)行制劑化，包括免疫球蛋白分子或其部分和嵌合抗體(即，具有與鼠抗原結(jié)合區(qū)偶聯(lián)的人恒定區(qū)的抗體)或其片段。可以通過許多公知的技術(shù)操作編碼免疫球蛋白分子的DNA，以產(chǎn)生能夠編碼重組蛋白，如單鏈抗體、親和力增強(qiáng)的抗體或其它基于抗體的蛋白的DNA(參見，例如，Larrick et al.，1989，Biotechnology 7934-938；Reichmann et al.，1988，Nature 332323-327；Roberts et al.，1987，Nature 328731-734；Verhoeyen et al.，1988，Science 2391534-1536；Chaudhary et al.，1989，Nature 339394-397)。術(shù)語人源化抗體也包括單鏈抗體。參見，例如，Cabilly et al.，美國專利No.4,816,567；Cabilly et al.，歐洲專利No.0,125,023 B1；Boss et al.，美國專利No.4,816,397；Boss et al.，歐洲專利No.0,120,694 B1；Neuberger，M.S.et al.，WO 86/01533；Neuberger，M.S.et al.，歐洲專利No.0,194,276 B1；Winter，美國專利No.5,225,539；Winter，歐洲專利No.0,239,400 B1；Queen et al.，歐洲專利No.0 451 216 B1；和Padlan，E.A.et al.，EP 0 519 596 A1。例如，本發(fā)明可以用于制劑化免疫特異性識別特異性細(xì)胞靶的人和/或人源化抗體，所述細(xì)胞靶如上文提到的任意蛋白、人EGF受體、her-2/neu抗原、CEA抗原、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、CD5、CD11a、CD18、NGF、CD20、CD45、Ep-cam、其它癌細(xì)胞表面分子、TNF-α、TGF-β1、VEGF、其它細(xì)胞因子、α4β7整聯(lián)蛋白、IgEs、病毒蛋白(例如巨細(xì)胞病毒)等，以上僅僅提到了少數(shù)幾種。
也可以根據(jù)本發(fā)明制劑化多種融合蛋白。融合蛋白是與異源蛋白或肽融合的蛋白或蛋白的結(jié)構(gòu)域(如可溶性細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)。所述融合蛋白的實(shí)例包括表達(dá)為與免疫球蛋白分子的一部分的融合體的蛋白、表達(dá)為具有拉鏈結(jié)構(gòu)部分的融合蛋白的蛋白，和新的多功能蛋白，如細(xì)胞因子和生長因子(即，GM-CSF和IL-3、MGF和IL-3)的融合蛋白。WO 93/08207和WO 96/40918分別描述了稱作CD40L的分子的多種可溶性寡聚形式，包括免疫球蛋白融合蛋白和拉鏈結(jié)構(gòu)融合蛋白的制備；其中討論的技術(shù)適用于其它蛋白。另一種融合蛋白是重組TNFR:Fc，也稱作“etanercept”。Etanercept是兩個分子的p75TNFα受體的細(xì)胞外部分的二聚體，每個分子由與人IgG1的232個氨基酸的Fc部分融合的235個氨基酸的TNFR衍生的蛋白組成。實(shí)際上，前述任何分子都可以表達(dá)為包括但不限于以下成分的融合蛋白細(xì)胞受體分子的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、酶、激素、細(xì)胞因子、免疫球蛋白分子的一部分、拉鏈結(jié)構(gòu)域和表位。
此處用到的術(shù)語“沒食子酸酯”是指可以與蛋白或肽復(fù)合以形成持續(xù)釋放的復(fù)合物的分子。在一個實(shí)例中，沒食子酸酯分子是五沒食子酰葡萄糖(PGG，本領(lǐng)域也稱作5GG)。據(jù)理解，PGG分子可以具有一個沒食子?；蓚€沒食子?；?、三個沒食子酰基或四個沒食子?；?。此外，據(jù)理解，葡萄糖可以被其它碳主鏈取代，如醇或多元醇，如甘油、乙二醇或適于使用的任何糖基。在另一種實(shí)施方案中，表兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是用于本發(fā)明中與肽或蛋白制備鹽的沒食子酸酯分子。EGCG是分離自綠茶的抗氧化的多酚類黃酮。EGCG酯連接于非糖的環(huán)結(jié)構(gòu)，這點(diǎn)與PGG不同。此外，據(jù)理解，沒食子酸酯可以具有不同的立體化學(xué)形式。例如，PGG可以是α或β形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)此處的教導(dǎo)，能夠鑒定用于本發(fā)明的組合物和方法的合適沒食子酸酯分子。
此處用到的術(shù)語“持續(xù)釋放復(fù)合物”是指在合適組合了此處描述的蛋白或肽和沒食子酸酯后形成的物理和化學(xué)穩(wěn)定的復(fù)合物。該復(fù)合物通常采取沉淀物的形式，該沉淀物是在組合了蛋白或肽和沒食子酸酯的水性或非水制劑后產(chǎn)生的。
此處用到的術(shù)語“持續(xù)送遞”是指在施用后一段時間藥劑的體內(nèi)連續(xù)送遞。例如，試劑的持續(xù)送遞可以由試劑隨時間的持續(xù)療效證明?；蛘?，試劑的持續(xù)送遞可以通過檢測試劑隨時間在體內(nèi)的存在而證明。在一種實(shí)施方案中，持續(xù)送遞少于一周，并且可以少于4天。但是，認(rèn)為持續(xù)送遞可以是用本發(fā)明的組合物達(dá)到的超過1周的時間段，包括兩周以上。
不同pH下與肽或蛋白的PGG或EGCG復(fù)合物的形成會影響藥物送遞的時間。如下文實(shí)施例4和5所示，pH7.0時與肽形成PGG復(fù)合物，導(dǎo)致復(fù)合物在血清中的持續(xù)時間(即，大約1周)比在pH 7.6和pH8.6時形成的復(fù)合物在血清中的持續(xù)時間(即，小于1周)長。因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，通過形成復(fù)合物時的pH部分地控制藥物送遞的持續(xù)時間。代表性的pH范圍是6.0-9.0，pH6.5-8.6、pH7.0-8.6的范圍也是合適的。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，其它pH可能是合適的，并且根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)就可以確定適合與本發(fā)明的丹寧酸酯復(fù)合的特定藥物的所需藥物送遞譜的最適pH。
本發(fā)明的一方面涉及包含藥物活性劑如蛋白或肽和沒食子酸酯的持續(xù)釋放復(fù)合物的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物允許在給受試者施用組合物后蛋白或肽在受試者體內(nèi)的持續(xù)送遞，其中根據(jù)肽和沒食子酸酯復(fù)合物的溶解度，持續(xù)送遞的持續(xù)時間可以改變。例如，在一種實(shí)施方案中，持續(xù)釋放的復(fù)合物在本發(fā)明的藥物組合物施用于受試者之后在小于1周的時間內(nèi)提供藥物活性劑的持續(xù)送遞。在另一種實(shí)施方案中，持續(xù)釋放復(fù)合物在小于4天的時間內(nèi)給受試者提供蛋白或肽的持續(xù)送遞。提供更長或更短時間的持續(xù)送遞的制劑也包括在本發(fā)明的范圍中，如提供1天、2天、3天、4天、5天、6天或一周等的連續(xù)送遞。同樣，認(rèn)為可以對這些組合物進(jìn)行制劑化，使得它們提供超過一周，最多兩周或更長時間的連續(xù)藥物送遞。
任何大小的氨基酸鏈都可以適用于復(fù)合物，只要蛋白或肽具有在與沒食子酸酯組合時形成持續(xù)釋放的非共價復(fù)合物的能力。
除了持續(xù)釋放復(fù)合物，本發(fā)明的藥物制劑可以包含額外的藥學(xué)可接受的載體和/或賦形劑。此處用到的“藥學(xué)可接受的載體”包括任何和所有生理相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，載體適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或腸胃外施用(例如，通過注射)。賦形劑包括藥學(xué)可接受的穩(wěn)定劑和崩解劑。
除了與沒食子酸酯復(fù)合的肽的藥物制劑，本發(fā)明進(jìn)一步包括含有所述復(fù)合物和含有所述復(fù)合物的注射器的包裝的制劑。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有腔的注射器，其中腔內(nèi)包含了蛋白或肽和沒食子酸酯的持續(xù)釋放復(fù)合物。
通過在形成蛋白或肽和沒食子酸酯的持續(xù)釋放復(fù)合物的條件下組合蛋白或肽和沒食子酸酯，制備本發(fā)明的復(fù)合物。因此，本發(fā)明的另一方面涉及制備藥物制劑的方法。在一種實(shí)施方案中，該方法包括提供蛋白或肽和沒食子酸，在形成蛋白或肽和沒食子酸酯的復(fù)合物的條件下組合蛋白或肽和沒食子酸酯，并且制備包含復(fù)合物的藥物制劑。
例如，組合蛋白或肽的溶液和沒食子酸酯的溶液，直到蛋白或肽和沒食子酸酯的持續(xù)釋放復(fù)合物沉淀出溶液。在某些實(shí)施方案中，蛋白或肽和沒食子酸酯的溶液是水溶液。獲得持續(xù)釋放復(fù)合物所必須的蛋白或肽和沒食子酸酯的量可以隨使用的特定蛋白或肽和沒食子酸酯、使用的特定溶劑和/或用于獲得該復(fù)合物的程序而改變。如實(shí)施例中所證明，通常，蛋白或肽在重量/重量基礎(chǔ)上是過量的。
一旦蛋白或肽/沒食子酸酯復(fù)合物沉淀出溶液，可以通過本領(lǐng)域公知的方法，如過濾、離心等從溶液除去沉淀物。然后可以干燥回收的材料，通過本領(lǐng)域公知的方法碾碎或研磨成粉末。或者，可以將糊冷凍，并且凍干?？梢詫⒎勰┬问降膹?fù)合物分散在載體溶液中，形成適于注射的液體懸浮液或半固體分散體。因此，在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物制劑是凍干的固體、液體懸浮液或半固體分散體。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物制劑是無菌制劑。例如，在形成持續(xù)釋放復(fù)合物后，通過γ射線照射或電子束滅菌，可以對復(fù)合物進(jìn)行滅菌。根據(jù)本發(fā)明的方法制備的藥物制劑，包括粉末、液體懸浮液、半固體分散體、凍干的固體及其無菌形式(如通過γ射線照射或滅菌過濾)也包括在本發(fā)明中。
此處用到的術(shù)語“受試者”包括溫血動物，優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人。
此處用到的術(shù)語“施用于受試者”是指通過給受試者中有需要的部位送遞組合物的任何合適的途徑，給受試者分配、送遞或施加組合物(如藥物制劑)，包括通過腸胃外或口服途徑、肌內(nèi)注射、皮下/真皮內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、頰施用、經(jīng)皮送遞而進(jìn)行送遞，和通過直腸、結(jié)腸、陰道、鼻內(nèi)或呼吸道途徑施用。
以下實(shí)施例僅僅是代表性實(shí)施方案，不意欲限制本發(fā)明的完整范圍。
實(shí)施例1實(shí)施例1提供了制備肽B-PGG鹽(1∶1摩爾比的肽B(DOrn Lys ArgPro Hyp Gly Cpg Ser Dtic Cpg)與PGG)的說明。將94mg PGG溶于2ml NaOH溶液(NaOH的濃度是0.10-0.20N)制備PGG的儲液，然后通過0.2um濾器進(jìn)行過濾。在PGG的儲液(1.56mL)中依次加入溶于0.8mL水中的109.4 mg肽B乙酸鹽的溶液，攪拌，并且形成沉淀物。通過離心回收沉淀物。
倒出上清液，用0.5mL水清洗沉淀物3次。在大約30-35℃真空干燥沉淀物大約20小時，產(chǎn)生125mg(76％)。肽B-PGG鹽是米色粉末。
實(shí)施例2以與實(shí)施例1中肽B-PGG相似的方式制備肽A-PGG和丹寧酸酯的鹽。肽A是乙酰Lys Lys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic Cpg。
實(shí)施例3下文表1和2列出了肽A(乙酰Lys Lys Arg Pro Hyp Gly Cpg SerDtic Cpg)和肽B(DOrn Lys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic Cpg)與丹寧酸酯和PGG形成的鹽在水和PBS中的肽含量和溶解度。數(shù)據(jù)表明，PGG肽鹽比丹寧酸酯的鹽具有更高的肽含量。PGG沉淀物比單寧酸酯的鹽具有更高的PBS溶解度。
實(shí)施例4研究了成鹽pH(即NAOH的濃度水平)對產(chǎn)率、肽含量和肽B-PGG鹽的溶解度的影響。在pH7.0，7.2，7.6和8.6制備和分離了四種肽B-PGG鹽。然后確定了它們在水和PBS中的溶解度，以及它們的肽含量。這些結(jié)果證明(表3)，水溶解度、成鹽產(chǎn)率和肽含量隨成鹽過程中pH的增加而增加。
實(shí)施例5該實(shí)施例描述了大鼠中肽B/PGG和肽B/丹寧酸酯鹽的持續(xù)釋放。通過單次皮下注射(10mg/kg劑量)懸浮于TRIS緩沖液中的肽B/PGG鹽和肽B/丹寧酸酯鹽進(jìn)行大鼠藥代動力學(xué)(PK)研究；肽B乙酸鹽的PBS溶液作為對照組。PK研究表明，在pH7.0制備的肽B/單寧酸酯鹽和肽B-PGG鹽持續(xù)釋放1周。但是，在pH7.6和8.6制備的肽B-PGG鹽顯示出與pH7.0時制備的鹽(最多至2周)相比較短的釋放持續(xù)時間(大約2-3天)。
實(shí)施例6通過與實(shí)施例1的描述相似的方法制備肽B(DOrn Lys Arg ProHyp Gly Cpg Ser Dtic Cpg)的PGG鹽的純端基異構(gòu)體(β-PGG)和端基異構(gòu)體的混合物(α+β-PGG)。這些鹽的水溶解度沒有顯著差異。根據(jù)水溶解度，預(yù)期這些鹽的體內(nèi)持續(xù)釋放時間將是相似的。
實(shí)施例7以下實(shí)施例描述了用EGCG與肽制備鹽，在動物藥代動力學(xué)(PK)研究中測定該鹽的持續(xù)釋放。將184mg EGCG溶于2ml 0.2N的NaOH溶液，制備EGCG(Sigma-Aldrich)的儲液，然后通過0.2um濾器進(jìn)行過濾。攪拌下在EGCG的儲液(1.4mL)中緩慢加入溶于1.2mL水的138mg肽B(DOrn Lys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic Cpg)的乙酸鹽的溶液。室溫下將得到的懸浮液攪拌大約10-15分鐘。離心后，倒去上清液，用1mL水清洗沉淀物(離心和倒去上清液3次)。大約30-35℃下真空干燥沉淀物大約20小時，以產(chǎn)生米色粉末狀的218mg(88％)肽B-EGCG鹽。
肽B/EGCG鹽的肽含量是47-50％。1∶3摩爾比的肽與EGCG的鹽的水溶解度在水中是＜0.5mg/ml，在PBS中是＜0.05mg/ml，對于1∶2摩爾比的肽與EGCG，溶解度在水中是大約1mg/ml，在PBS中是大約0.3mg/ml。用單次皮下注射(10mg/kg劑量)懸浮于pH7.0的TRIS緩沖液中的‘593/EGCG鹽進(jìn)行大鼠PK研究。PK結(jié)果表明肽B在很多天持續(xù)釋放，24小時的血液水平＞26ng/ml，96小時減少至大約5ng/ml。
表1.肽A沉淀物
表2.肽B沉淀物
表3.在不同pH形成的肽B沉淀物
盡管以優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，應(yīng)該理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行改變和修飾。因此，所附權(quán)利要求涵蓋了權(quán)利要求范圍內(nèi)的所有等同改變。
上文引用的每篇專利、申請和文章(此后稱作“參考文獻(xiàn)”)和其中引用或參考的每篇文件，包括此處引用的任何專利和/或申請的審批過程中引用的那些(“專利引用的文件”)，以及其中引用或任何參考文獻(xiàn)和任何專利引用的文件中提到的任何制造商的說明書或分類目錄，都在此引入作為參考。此外，本文中引用的所有文件，本文中引用的文件中引用或參考的所有文件，以及本文中或引入本文的任何文件中引用或提到的任何產(chǎn)品的制造商的說明或分類目錄，在此引入作為參考。通過引入本文作為參考的文件或其中的任何教導(dǎo)可以用于實(shí)施本發(fā)明。引入本文作為參考的文件不被承認(rèn)是現(xiàn)有技術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種持續(xù)釋放組合物，包含蛋白或肽和純化的沒食子酸酯的純化的復(fù)合物。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述復(fù)合物是肽和沒食子酸酯的鹽。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述沒食子酸酯選自五沒食子酰葡萄糖(PGG)和表兒茶素沒食子酸酯(EGCG)。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述純化的沒食子酸酯是五沒食子酰葡萄糖(PGG)。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述肽和PGG的鹽在動物中具有1周的釋放持續(xù)時間。
6.權(quán)利要求4的組合物，其中所述肽和PGG的鹽在動物中具有3周的釋放持續(xù)時間。
7.權(quán)利要求3的組合物，其中所述純化的沒食子酸酯是表兒茶素沒食子酸酯(EGCG)。
8.權(quán)利要求2、3或4的任意一項的組合物，其中所述肽是B1肽拮抗劑。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述肽選自i)DOrn Lys Arg Pro HypGly Cpg Ser Dtic Cpg；和ii)乙酰Lys Lys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser DticCpg，其中Dorn是鳥氨酸的D異構(gòu)體，Hyp是反式-4-羥基-脯氨酸，Dtic是1，2，3，4-四氫異喹琳-3-羧酸的D異構(gòu)體，Cpg是環(huán)戊基甘氨酸。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述肽選自i)DOrn Lys Arg ProHyp Gly Cpg Ser Dtic Cpg；和ii)乙酰Lys Lys Arg Pro Hyp Gly Cpg SerDtic Cpg。
11.制備持續(xù)釋放復(fù)合物的方法，包括將蛋白或肽與沒食子酸酯混合和分離沉淀物的步驟。
12.權(quán)利要求11的方法，其中在pH 6.5-8.6之間的pH形成復(fù)合物。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述沒食子酸酯是PGG。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述沒食子酸酯是EGCG。
15.施用持續(xù)釋放復(fù)合物的方法，其中所述復(fù)合物包含蛋白或肽和沒食子酸酯的復(fù)合物的藥學(xué)可接受的制劑。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述沒食子酸酯是PGG。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述沒食子酸酯是EGCG。
18.權(quán)利要求15的方法，其中所述肽是B1肽拮抗劑。
19.權(quán)利要求16的方法，其中所述肽選自選自i)DOrn Lys Arg ProHyp Gly Cpg Ser Dtic Cpg；和ii)乙酰Lys Lys Arg Pro Hyp Gly Cpg SerDtic Cpg，其中Dorn是鳥氨酸的D異構(gòu)體，Hyp是反式-4-羥基-脯氨酸，Dtic是1，2，3，4-四氫異喹琳-3-羧酸的D異構(gòu)體，Cpg是環(huán)戊基甘氨酸。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述肽選自i)DOrn Lys Arg Pro HypGly Cpg Ser Dtic Cpg；和ii)乙酰Lys Lys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser DticCpg。
全文摘要
本發(fā)明廣泛涉及持續(xù)釋放制劑領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明描述涉及用純化的沒食子酸酯對蛋白和/或肽進(jìn)行制劑化的組合物和方法。在一個實(shí)例中，沒食子酸酯是五沒食子酰葡萄糖(PGG)，在另一實(shí)例中，沒食子酸酯是表兒茶素沒食子酸酯(EGCG)。
文檔編號A61K38/00GK1997356SQ200580012459
公開日2007年7月11日 申請日期2005年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月23日
發(fā)明者M·S·戈登伯格, J·H·古 申請人:安姆根有限公司