專利名稱：低劑量促紅細(xì)胞生成素用于刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞、器官再生以及減緩末端器官損傷進(jìn)程的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及促紅細(xì)胞生成素(EPO)(特別是低劑量)的單獨(dú)應(yīng)用或是與其它化學(xué)、熱力、機(jī)械以及生物制品的聯(lián)合使用，用于誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞的生理遷移、增殖和分化，用于刺激血管生成，用于治療與內(nèi)皮祖細(xì)胞機(jī)能障礙相關(guān)的疾病，以及生產(chǎn)治療這些疾病的藥物組合物，此外還可以用于生產(chǎn)含有EPO和其它適合的活性成分的藥物組合物，用于刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞、器官保護(hù)作用和器官再生(特別是促進(jìn)新血管和組織的生成)以及減緩器官損傷的發(fā)展。
本發(fā)明還涉及EPO(特別是本發(fā)明提出的低劑量的EPO)和/或其它適合的活性物質(zhì)在美容處理方面的應(yīng)用(特別是外用)，即對(duì)于人或動(dòng)物的“美容護(hù)理”，特別是用于預(yù)防或減少皺紋和細(xì)紋，增強(qiáng)結(jié)締組織，護(hù)膚和緊膚(特別是面部肌膚)，抵御有害的環(huán)境因素，以及用作化妝品的粉底。此外，本發(fā)明的EPO的外用還能阻止老年斑的形成和進(jìn)一步發(fā)展，改善膚質(zhì)，支持細(xì)胞復(fù)壯過(guò)程以及加快頭發(fā)生長(zhǎng)速度。
本發(fā)明還涉及EPO，特別是低劑量的EPO，特別是以后面“與本發(fā)明要求相符的EPO劑量”這一段落中所規(guī)定的劑量EPO，用于生產(chǎn)適合以EPO在人體或動(dòng)物體內(nèi)的自然生理節(jié)律的方式使用的藥物組合物的應(yīng)用。人體內(nèi)源性EPO在下午較晚的時(shí)候有一個(gè)峰值(每天的最高值)，因此前述的創(chuàng)造性的低劑量EPO最好在上午，特別是在上午6:00～10:00的時(shí)段內(nèi)使用，從而達(dá)到最大的生物學(xué)和治療效果。在這個(gè)時(shí)段內(nèi)，EPO以單一劑量或多種劑量使用。根據(jù)本發(fā)明，基于過(guò)去所有的使用案例，單一劑量或多種劑量的使用被認(rèn)為是特別適合的，尤其是在人體和動(dòng)物體或者細(xì)胞的美容和治療方面。
根據(jù)本發(fā)明，在EPO應(yīng)用的另一個(gè)實(shí)施例中，在以低劑量EPO、特別是創(chuàng)造性的低劑量EPO進(jìn)行體外預(yù)培養(yǎng)后，內(nèi)皮祖細(xì)胞和其它可用作細(xì)胞治療的細(xì)胞群共同使用，或者在體內(nèi)局部或系統(tǒng)使用低劑量、特別是本發(fā)明的低劑量EPO，通過(guò)該方法以確?？捎糜诩?xì)胞治療的組織細(xì)胞充分結(jié)合到血管系統(tǒng)。因此，本發(fā)明還涉及EPO(特別是低劑量的EPO)在體內(nèi)與內(nèi)皮祖細(xì)胞和至少一種細(xì)胞治療的細(xì)胞群的聯(lián)合應(yīng)用，特別是在上午6:00～10:00的時(shí)段內(nèi)，以增加可用于細(xì)胞治療的細(xì)胞群的沉淀，從而充分地結(jié)合到血管系統(tǒng)。本發(fā)明還涉及EPO在體外的應(yīng)用，特別是在低劑量下，用于與內(nèi)皮祖細(xì)胞和至少一種可用于細(xì)胞治療的細(xì)胞群的培養(yǎng)，以促進(jìn)可用于細(xì)胞治療的細(xì)胞群的沉淀，從而充分的結(jié)合到血管系統(tǒng)。
本發(fā)明還涉及EPO，特別是低劑量的EPO的應(yīng)用，特別是用于生產(chǎn)可預(yù)防或治療疾病的藥物組合物或試劑盒，或者在移植或植入的過(guò)程中，連續(xù)地或按時(shí)間先后順序地與至少一種其它的化學(xué)、熱力、機(jī)械或生物制品(特別是一種藥理學(xué)活性物質(zhì))聯(lián)合使用，以提升內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和功能，和/或促進(jìn)再生，或者是減緩組織損傷的發(fā)展。
本發(fā)明還涉及EPO的應(yīng)用，特別是在生產(chǎn)預(yù)防或治療疾病的藥物組合物或試劑盒方面的應(yīng)用，或者在移植或植入的過(guò)程中，特別是低劑量的情況下，連續(xù)地或按時(shí)間先后順序地使用EPO以及至少一種其它的化學(xué)、熱力、機(jī)械或生物制品，特別是一種藥理學(xué)活性成分一起使用，以提升內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和功能和/或刺激再生，或者是減緩組織損傷的進(jìn)程。
因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明涉及連續(xù)地、按時(shí)間先后順序地或同步地使用低劑量的EPO以及一種或多種其它的藥物活性物質(zhì)，例如VEGF，GM-CSF，M-CSF，血小板生成素，SDF-1，SCF，NGF，PIGF，HMG共還原酶抑制劑，ACE抑制劑，AT-1阻斷劑和NO供體，通過(guò)這種方式可以提升內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量及功能，和/或誘導(dǎo)再生，或者是減緩組織損傷的進(jìn)程。關(guān)于這一點(diǎn)，本發(fā)明的目的是影響以下過(guò)程A)優(yōu)化骨髓內(nèi)或干細(xì)胞的特定組織小環(huán)境中干細(xì)胞和/或內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量；B)干細(xì)胞和/或內(nèi)皮祖細(xì)胞從骨髓或其它“干細(xì)胞”小環(huán)境向外周血中的遷移；C)優(yōu)化在外周血中和/或體外選擇性培養(yǎng)條件下，最好是在氧濃度為0.1～10％的低氧條件下，干細(xì)胞和/或內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量；D)干細(xì)胞和/或內(nèi)皮祖細(xì)胞向損傷部位的定位；E)干細(xì)胞和/或內(nèi)皮祖細(xì)胞向靶組織的黏附和遷移；F)內(nèi)皮祖細(xì)胞引導(dǎo)的新血管生成。
因此，本發(fā)明還涉及連續(xù)地、按時(shí)間先后順序地或同步地使用低劑量EPO，可以是體內(nèi)的或體外的，必要的話可同時(shí)使用一種/多種化學(xué)、熱力、機(jī)械或生物制品，通過(guò)這種方式提升內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和功能，和/或誘導(dǎo)再生，或減緩組織損傷的進(jìn)程。上文中已描述了的一個(gè)可選的和較好的應(yīng)用方法，是以適合內(nèi)源性EPO產(chǎn)生的自然生理節(jié)律的方式，即在上午6:00～10:00這一時(shí)段內(nèi)使用EPO。
本發(fā)明還涉及低劑量EPO的應(yīng)用，用于刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的生理遷移、增殖和分化，刺激血管生成，治療與內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙相關(guān)的疾病，以及用于生產(chǎn)治療這些疾病的藥物組合物，該含有EPO以及其它用于刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的適當(dāng)?shù)幕钚猿煞值乃幬锝M合物，適用于具有以下癥狀的病人a)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙；b)具有至少一種心血管危險(xiǎn)因子，例如高血壓、高膽固醇血癥、非對(duì)稱二甲基精氨酸(ADMA)水平升高、胰島素抵抗、高同型半胱氨酸血癥；和c)至少一種末端器官損傷，如左心室肥大，微量白蛋白尿，認(rèn)知功能障礙，頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層增厚，蛋白尿或腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)＜80ml/min，特別是30，最好是40～80ml/min。本發(fā)明涉及前述低劑量EPO在上面a)到c)所描寫的患者群的應(yīng)用，在一個(gè)實(shí)施例中，適合使用EPO的時(shí)段是上午的6:00～10:00。
背景技術(shù)：
血管內(nèi)皮層是襯附于血管內(nèi)壁的一層細(xì)胞。內(nèi)皮層使血液與其他血管層分隔。但是，內(nèi)皮層不僅是一個(gè)完全被動(dòng)的屏障，它還活躍地參與血管舒縮狀態(tài)的調(diào)節(jié)。這種功能也被稱為內(nèi)皮依賴性血管擴(kuò)張。因?yàn)槠湮恢?，?nèi)皮層始終承受著血液流動(dòng)的壓力以及新陳代謝的壓力。在致病條件下，例如高血液壓力，高LDL水平，非對(duì)稱二甲基精氨酸(其作為NO合成酶的內(nèi)源性抑制劑)水平升高，高膽固醇血癥，腎功能受限至腎小球?yàn)V過(guò)率在30、特別是40～80ml/min，胰島素抵抗，或高血糖，經(jīng)?？梢詫?dǎo)致內(nèi)皮層功能缺失，隨后可能會(huì)發(fā)生形態(tài)學(xué)上可檢測(cè)到的損傷，例如動(dòng)脈粥樣硬化斑的形成，和/或更進(jìn)一步的末端器官損傷，例如左心室肥大，微量白蛋白尿，蛋白尿，神經(jīng)疾病或微循環(huán)損傷。內(nèi)皮功能變化或減弱、以及內(nèi)皮功能障礙的非常早期的信號(hào)是內(nèi)皮依賴性血管舒張降低。
在冠心病的情況下，或者無(wú)冠心病而危險(xiǎn)因子存在的情況下，特別是高血壓，腎功能受限，高脂蛋白血癥，高同型半胱氨酸血癥，胰島素抵抗或糖尿病，內(nèi)皮功能缺失明顯表現(xiàn)為NO(內(nèi)皮細(xì)胞源性舒張因子)生成減少和內(nèi)皮素生成增加。高血漿內(nèi)皮素水平導(dǎo)致細(xì)胞的異常增生、炎癥、血管瘤和嚴(yán)重的血管變窄。內(nèi)皮功能障礙還表現(xiàn)為ICAM-1和VCAM-1之類黏附分子生成的增加，導(dǎo)致血小板和單核細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮黏附程度增加，從而導(dǎo)致了血管壓力的增加。在各種不同系統(tǒng)中，這種不均衡促進(jìn)了血管收縮、黏附、聚集、血液凝固，動(dòng)脈粥樣硬化以及粥樣動(dòng)脈血栓塞癥的發(fā)生。甚至連精神壓力導(dǎo)致的內(nèi)皮功能障持續(xù)長(zhǎng)達(dá)4個(gè)小時(shí)。
內(nèi)皮細(xì)胞也參與新血管的生成。血管生成在很多過(guò)程中都是非常重要的，例如胚胎形成、女性生殖周期、創(chuàng)傷愈合、腫瘤生長(zhǎng)以及缺血區(qū)域的新血管生成。最初，出生后的血管構(gòu)建主要是血管新生過(guò)程。血管形成可以理解為由已存在的血管系統(tǒng)以毛細(xì)血管出芽的方式形成新血管的過(guò)程。在血管形成過(guò)程中，首先是環(huán)繞在血管周圍的基底膜被蛋白水解酶降解，然后血管周圍的細(xì)胞外間質(zhì)被分割成碎塊。血管形成刺激因子的釋放導(dǎo)致已分化的內(nèi)皮細(xì)胞向趨化刺激因子遷移，在該過(guò)程中它們同時(shí)進(jìn)行增殖和變異。然后相鄰內(nèi)皮細(xì)胞環(huán)接并形成具有毛細(xì)血管基本結(jié)構(gòu)的新血管管腔。隨后開始了新的基底膜的合成。
然而，近期的研究顯示，成人機(jī)體的新血管形成不僅依賴于脈管生成機(jī)制，而且還依賴于血管生成機(jī)制。眾所周知，在血管生成過(guò)程中，新血管由內(nèi)皮祖細(xì)胞在原位分化而形成。血管生成局限于胚胎形成過(guò)程中的理論被在健康的人和動(dòng)物外周血中發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)的事實(shí)駁倒。通過(guò)動(dòng)物模型證實(shí)，來(lái)源于骨髓的內(nèi)皮祖細(xì)胞活躍地參與了新血管形成。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，一個(gè)表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原的特異性CD34+白細(xì)胞亞群在缺血區(qū)域形成。此外，對(duì)成年機(jī)體內(nèi)血管形成起重要作用的內(nèi)皮祖細(xì)胞可以通過(guò)體外培養(yǎng)CD133+和CD34+細(xì)胞獲得(Asahara et al.，Science，275(1997)，964-967；Corsby et al.，Circ.Res.，87(2000)，728-730；Gehling et al.，Blood，95(2000)，3106-3112)。此外還發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)注射CD34+細(xì)胞或經(jīng)培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞能加速糖尿病鼠的血流恢復(fù)(Schatteman et al.，J.Clin.Invest.，106(2000)，571-578)以及改善體內(nèi)新血管生成(Asahara et al.，Circ Res.，85(1999)，221-228；Crosby et al.，Circ.Res.，87(2000)，728-730；Murohara et al.，J.Clin Invest.，105(2000)，1527-1536)。還有資料顯示，CD34+細(xì)胞誘導(dǎo)的新血管生成能增強(qiáng)心臟功能(Kocher et al.，Nat.Med.，7(2001)，430-436)。除CD34+細(xì)胞之外，相應(yīng)地分化轉(zhuǎn)化后的CD34-單核血細(xì)胞也能作為內(nèi)皮祖細(xì)胞的來(lái)源。
然而，內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移和分化的機(jī)理尚未完全闡明。分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的研究顯示，不同的細(xì)胞活素類和血管新生因子對(duì)骨髓中的內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移具有促進(jìn)作用。例如，眾所周知的如VEGF和GM-CSF之類的促血管新生因子能增加內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量(Asahara et al.，EMBO，J.，18(1999)，3964-3972；Takahashi et al.，Nat.med.，5(1999)，434-438)。VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)是一種存在多種異構(gòu)體的蛋白，它能與兩種酪氨酸激酶受體VEGF-R1(flt1)和VEGF-R2(fit2)結(jié)合，這兩種受體可存在于正生長(zhǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的表面(Wernert et al.，Angew.Chemie，21(1999)，3432-3435)。VEGF受體通過(guò)Ras-Raf-Map激酶途徑激活，導(dǎo)致在內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮祖細(xì)胞表面上蛋白激酶和特異粘合素的表達(dá)，并最終導(dǎo)致這些細(xì)胞向脈管生成促進(jìn)因子的增殖和遷移。GM-CSF(粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子)是迄今已知的主要用于刺激白血球(包括嗜中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞)的細(xì)胞因子。PIGF(胎盤生長(zhǎng)因子)已知是一種內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移刺激因子而不是增殖刺激因子。根據(jù)Llevadot等人的研究(J.Clin.Invest.，108(2001)，399-405)，HMG-CoA還原酶抑制劑，尤其是作為降脂藥物使用并且能降低冠心病發(fā)病率和死亡率的他仃類降脂藥物，能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移。Dimmeler等人的研究(J.Clin.Invest.，108(2001)，391-397)進(jìn)一步顯示象阿托伐他汀和辛伐他汀等的他仃類降脂藥物顯著提高了在單核細(xì)胞中內(nèi)皮祖細(xì)胞及外周血中分離得到的CD34+干細(xì)胞的分化(體內(nèi)和體外)。例如，用他仃類藥物處理小鼠，可導(dǎo)致已分化的內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量增加，而且，他仃類降脂藥物顯示出和VEGF同樣強(qiáng)的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供手段和方法，用于提高對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的刺激作用和治療機(jī)體功能障礙、特別是和內(nèi)皮祖細(xì)胞相關(guān)的功能障礙，還在于提供用于不同組織的保護(hù)和再生的方法和手段。
為解決這些技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明指出，促紅細(xì)胞生成素(EPO)和/或其衍生物，特別是低劑量的EPO，可以用于刺激人體或動(dòng)物體內(nèi)的內(nèi)皮祖細(xì)胞的生理遷移，內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖，內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的分化，和/或內(nèi)皮祖細(xì)胞向脈管生成和/或血管生成刺激因子的遷移。對(duì)于內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移和/或分化的創(chuàng)造性的刺激再次提出了一種重要的新治療策略，用于增加出生后的新血管生成、特別是脈管生成，用于治療與內(nèi)皮祖細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙相關(guān)的疾病，以及通過(guò)化學(xué)、熱力、機(jī)械和生物制品用于受損的不同組織的保護(hù)和再生。
本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題還包括，低劑量的EPO和/或其衍生物用于治療與內(nèi)皮祖細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的疾病或病理狀態(tài)的應(yīng)用。
此外，本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題還包括，低劑量的EPO和/或其衍生物用于處于病態(tài)的不同組織類型的保護(hù)和再生、或治療與不同的組織功能障礙相關(guān)的病理狀態(tài)的應(yīng)用。
通過(guò)連續(xù)地、按時(shí)間先后順序地或同步地使用低劑量的EPO以及一種或者多種其它的化學(xué)、熱力、機(jī)械或者生物制品還解決了潛在的技術(shù)問(wèn)題。
因此，本發(fā)明特別涉及下列A)～K)的單獨(dú)或組合的實(shí)施例A)EPO的應(yīng)用，優(yōu)選的是用于生產(chǎn)預(yù)防或治療疾病的藥物組合物，其中所述EPO和/或藥物組合物適合于在上午6:00～10:00的時(shí)段內(nèi)用于人或動(dòng)物體內(nèi)。
B)EPO的應(yīng)用，優(yōu)選的是與實(shí)施例A)相結(jié)合，特別是用于生產(chǎn)預(yù)防或治療疾病的藥物組合物，其中所述藥物組合物是低劑量的，適合用于預(yù)防或治療具有以下病理表現(xiàn)的人或動(dòng)物a)至少一種內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙，b)至少一種心血管危險(xiǎn)因子，例如高血壓、高脂蛋白血癥，胰島素抵抗、ADMA水平升高或高同型半胱氨酸血癥，和c)至少一種末端器官損傷，例如左心室肥大，微量白蛋白尿，認(rèn)知功能障礙，頸動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，蛋白尿或腎小球?yàn)V過(guò)率＜80ml/min、特別是30～80ml/min。
C)EPO的應(yīng)用，優(yōu)選的是與實(shí)施例A)、B)或A)和B)相結(jié)合，用于人或動(dòng)物的美容護(hù)理，特別是用于去除皺紋，增強(qiáng)結(jié)締組織，護(hù)膚和緊膚，免受有害環(huán)境因素影響，去除老年斑，促進(jìn)表皮再生，加快頭發(fā)生長(zhǎng)速度和/或作為化妝品的粉底。
D)EPO的應(yīng)用，優(yōu)選的是與實(shí)例A)，B)或A)和B)相結(jié)合，用于生產(chǎn)化妝品，特別是外用的化妝品，用于人或動(dòng)物的美容護(hù)理，特別是用于去皺，增強(qiáng)結(jié)締組織，護(hù)膚和緊膚，免受有害環(huán)境因素影響，去除老年斑，促進(jìn)表皮再生，加快頭發(fā)生長(zhǎng)和/或作為化妝品的粉底。
E)EPO的應(yīng)用，優(yōu)選的是與實(shí)施例A)，B)，C)或D)中的任一種或多種相結(jié)合，用于生產(chǎn)含有EPO和由內(nèi)皮祖細(xì)胞與至少一種可用于細(xì)胞治療的細(xì)胞群的混合物組成藥物組合物，用于人或動(dòng)物的組織或器官的再生，其中所述混合物在使用前即與EPO在體外進(jìn)行接觸。
F)EPO的應(yīng)用，優(yōu)選的是與實(shí)施例A)，B)，C)，D)或E)中的任一種或多種相結(jié)合，和/或一種由內(nèi)皮祖細(xì)胞與至少一種可用于細(xì)胞治療的細(xì)胞群組成的混合物的應(yīng)用，用于生產(chǎn)一種含有EPO和由內(nèi)皮祖細(xì)胞與至少一種可用于細(xì)胞治療的細(xì)胞群組成的混合物的藥物組合物，其中EPO在人體或動(dòng)物體的使用在所述混合物之前、之后或同時(shí)使用。
G)EPO的應(yīng)用，優(yōu)選的是與實(shí)施例A)～F)中的任一種或多種相結(jié)合，和/或至少一種化學(xué)、熱力、機(jī)械或生物制品，特別是一種藥物活性成分的應(yīng)用，用于生產(chǎn)含有EPO和至少一種化學(xué)、熱力、機(jī)械或生物制品、用于預(yù)防和或治療疾病的藥物組合物或試劑盒，其中所述的藥物組合物適合用于連續(xù)地，按時(shí)間先后順序地或者同時(shí)地使用EPO以及至少一種化學(xué)、熱力、機(jī)械或生物制品。因此，本發(fā)明還涉及以上文G)所描述的方式使用EPO，其中所述機(jī)械制品為人工假肢，優(yōu)選用作替代牙齒、骨骼或者韌帶/腱的植入支持物。因此，本發(fā)明還涉及以上文G)所描述的方式使用EPO，其中所述生物制品為實(shí)體器官，例如肝臟、腎臟、心臟、胰腺或皮膚。在這個(gè)意義上，頭發(fā)移植體也可以被理解為生物制品。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明還涉及EPO用于生產(chǎn)藥物組合物或試劑盒，該藥物組合物或試劑盒可系統(tǒng)使用，也可在前述形式的生物制品或人工假肢的植入位點(diǎn)局部使用，所述人工假肢可以是牙齒的植入支持物，牙齒替代物，牙齒植入體，骨骼替代物，骨骼植入體(例如髖關(guān)節(jié)修補(bǔ)物)，韌帶/腱替代物(例如交叉韌帶)，其中所述EPO在所述生物或機(jī)械制品植入前系統(tǒng)或局部使用，以人工假肢為例，在植入前幾個(gè)星期系統(tǒng)或局部使用EPO，再實(shí)施植入。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述生物或機(jī)械制品，例如人工假肢的植入，可以在使用EPO的同時(shí)進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施例中，EPO的使用可以在所述人工假肢或者是生物/機(jī)械制品植入之后進(jìn)行。根據(jù)這些實(shí)施例，將要植入如牙齒或骨骼修補(bǔ)物的植入體的組織或機(jī)體結(jié)構(gòu)被動(dòng)員和調(diào)節(jié)，這樣可以使生物或機(jī)械制品(例如植入體)更好、更快的融合，例如通過(guò)長(zhǎng)在機(jī)體結(jié)構(gòu)之上或之內(nèi)。
H)根據(jù)A)～G)中的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例的EPO的應(yīng)用，其中所述藥物組合物在使用過(guò)程中不會(huì)導(dǎo)致人或動(dòng)物血球比容值的增加，特別是不超過(guò)EPO使用前血球比容值的10％。
I)根據(jù)A)～H)中的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例的EPO在藥物組合物中的應(yīng)用，其中所述EPO適合用于所述疾病的預(yù)防、處理和治療，以一個(gè)不會(huì)激活紅血球生成的低劑量應(yīng)用，特別是0.001～90IU/kg人體體重/周，優(yōu)選的是50IU/kg人體體重/周。
K)根據(jù)A)～I(xiàn))中的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例的EPO的應(yīng)用，其中所述病變可以是高膽固醇血癥，糖尿病，胰島素抵抗，內(nèi)皮介導(dǎo)的慢性炎癥，內(nèi)皮增生(包括網(wǎng)狀內(nèi)皮增生)，動(dòng)脈粥樣硬化癥，老年性心血管疾病，四肢缺血性病變，子癇前癥，雷諾氏癥，肝臟疾病(如肝炎，肝硬化，急性或慢性肝衰竭)，骨骼和軟骨失調(diào)或損傷，粘膜失調(diào)或損傷(特別是在胃腸道中)，克羅恩氏病，潰瘍性結(jié)腸炎，妊娠高血壓綜合癥，慢性或急性腎衰竭，特別是晚期腎衰竭，腎功能受限至腎小球?yàn)V過(guò)率在30～80ml/min，微量白蛋白尿，蛋白尿，ADMA水平升高或創(chuàng)傷及其后遺癥。
本發(fā)明還涉及含有EPO，內(nèi)皮祖細(xì)胞以及至少一種可用于細(xì)胞治療的細(xì)胞的試劑盒的生產(chǎn)，其中所述的EPO優(yōu)選的以低劑量存在。
本發(fā)明中，令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，低劑量EPO可導(dǎo)致內(nèi)皮祖細(xì)胞的生理遷移，同時(shí)增加循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量，并誘導(dǎo)其分化。除此之外，在這種病理?xiàng)l件下出現(xiàn)的內(nèi)皮祖細(xì)胞功能不足得到了補(bǔ)償。根據(jù)本發(fā)明，晚期的慢性腎衰竭患者體內(nèi)的循環(huán)干細(xì)胞數(shù)量雖然和健康的試驗(yàn)人員一樣多，但是這些患者體內(nèi)的干細(xì)胞喪失了經(jīng)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的能力。因此，和健康的試驗(yàn)人員相比，慢性腎衰竭患者體內(nèi)能夠黏附并且表現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞顯型的細(xì)胞數(shù)量明顯減少(de Groot et al.，Kidney Int.2004；66641-6)。腎小球?yàn)V過(guò)率為30、主要是40～80ml/min的中度腎功能受限患者即可表現(xiàn)出這種內(nèi)皮祖細(xì)胞功能下降。根據(jù)本發(fā)明，在使用本發(fā)明的低劑量EPO后，無(wú)論是腎功能障礙的患者還是腎功能正常的患者和/或試驗(yàn)人員體內(nèi)，循環(huán)干細(xì)胞的數(shù)量都顯著增加了50％以上。尤其是內(nèi)皮顯型的細(xì)胞數(shù)量顯著增加。細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用低劑量EPO處理后，腎小球?yàn)V過(guò)率為30、特別是40～80ml/min的慢性腎衰竭患者體內(nèi)內(nèi)皮祖細(xì)胞減弱了的粘附能力增加了3倍。對(duì)于腎健康的試驗(yàn)人員和/或患者，其黏附能力則增加了2～3倍。已分化的內(nèi)皮祖細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力是形成新的組織和/或血管的基本先決條件之一。通過(guò)這個(gè)方式，EPO能夠誘導(dǎo)組織或器官中的新血管生成、特別是血管生成，在這里腎臟是一個(gè)特例，在腎臟中對(duì)應(yīng)血管生成或脈管生成的刺激被釋放了。
根據(jù)本發(fā)明，在人或動(dòng)物體內(nèi)，特別是在成熟的機(jī)體內(nèi)，低劑量EPO可以刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的生理遷移，內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化成為內(nèi)皮細(xì)胞，和/或誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移以利于血管生成和血管新生。在這個(gè)意義上講，根據(jù)本發(fā)明，低劑量EPO利于刺激發(fā)生血管病變的組織或器官中通過(guò)新血管生成作用刺激新血管形成。此外，也可以通過(guò)使用低劑量EPO對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的刺激來(lái)誘導(dǎo)形成內(nèi)皮組織。根據(jù)本發(fā)明，低劑量EPO因此也可以用于治療人或動(dòng)物與內(nèi)皮祖細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙相關(guān)的各種疾病。表現(xiàn)出這種功能障礙的患者群體通常具有某些心血管風(fēng)險(xiǎn)因子，例如高血壓、高膽固醇血癥、胰島素抵抗、高同型半胱氨酸血癥、ADMA水平升高，以及末端器官損傷，例如左心室肥大，微量白蛋白尿，蛋白尿或腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)為30ml/min、特別是40～80ml/min。
本發(fā)明還涉及低劑量EPO在組織功能受到化學(xué)、熱力、機(jī)械或生物制品危害時(shí)的保護(hù)和修復(fù)的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明，低劑量EPO的外用還涉及預(yù)防和減少皮膚、特別是面部肌膚上的皺紋，保護(hù)肌膚以及減少老年斑。根據(jù)本發(fā)明，這種低劑量EPO或其衍生物的使用可以與一種或者多種其它的化學(xué)、熱力、機(jī)械或者生物制品持續(xù)地、按時(shí)間先后地或同步地使用。根據(jù)本發(fā)明，在治療上，低劑量EPO可以適合其生理節(jié)奏的方式使用，以取得最大的生物學(xué)效應(yīng)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，內(nèi)皮祖細(xì)胞與用低劑量EPO體外預(yù)培養(yǎng)后和/或在體內(nèi)局部或系統(tǒng)使用低劑量EPO后，與其它可用作細(xì)胞治療的細(xì)胞群同時(shí)使用，通過(guò)這種方式確?？捎糜诩?xì)胞治療的組織細(xì)胞的沉淀并充分的結(jié)合到血管系統(tǒng)上。
根據(jù)本發(fā)明，“促紅細(xì)胞生成素”或“EPO”應(yīng)理解為這樣一種物質(zhì)，其在適當(dāng)?shù)母邉┝肯驴刂聘杉?xì)胞的生長(zhǎng)，由成紅血球細(xì)胞向紅血細(xì)胞的成熟過(guò)程。
EPO是一個(gè)糖蛋白，166個(gè)氨基酸組成，有3個(gè)糖基化位點(diǎn)，分子量約為34000Da。EPO誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化過(guò)程中，可誘導(dǎo)球蛋白的合成，增加亞鐵血紅素復(fù)合體的合成，同時(shí)增加鐵蛋白受體的數(shù)量。這樣，細(xì)胞就可以攜帶更多的鐵并合成有功能的血紅蛋白。在成熟的紅細(xì)胞中，血紅蛋白攜帶氧。因此，紅細(xì)胞及其所含的血紅蛋白在機(jī)體供氧過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。這些過(guò)程是由EPO和內(nèi)皮祖細(xì)胞表面的相應(yīng)受體之間的相互作用而啟動(dòng)的(Graber and Krantz，Ann.Rev.Med.29(1978)，51-56)。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“促紅細(xì)胞生成素”包括每一種來(lái)源的EPO，特別是人和動(dòng)物的EPO。這里使用的這一術(shù)語(yǔ)不僅包括天然存在的、即野生型EPO，還包括具有野生型EPO同樣的生物學(xué)效應(yīng)的EPO衍生物、類似物、修飾體、突變蛋白、突變體，或其它形式。
根據(jù)本發(fā)明，“衍生物”功能性等同物或者EPO的衍生物應(yīng)該理解為，在保留了EPO基本結(jié)構(gòu)的同時(shí)，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)原子或分子基團(tuán)以及殘基的取代、特別是例如乙二醇之類的糖鏈的取代而得到，和/或氨基酸序列與天然存在的人或動(dòng)物的EPO蛋白至少在一個(gè)位點(diǎn)上不同，但是在氨基酸水平和可比的生物學(xué)活性方面具有很高的同源度。本發(fā)明中使用的EPO衍生物可以是來(lái)源于WO 94/25055、EP 0148605B1、WO 95/05465或其他來(lái)源。
“同源性”特別的是指序列的同一性至少達(dá)到80％，優(yōu)選的是達(dá)85％，最好是達(dá)到90％、95％、97％以及99％以上。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員都知道，術(shù)語(yǔ)“同源性”是指兩個(gè)或多個(gè)多肽分子之間關(guān)系的密切度。這種一致性可以是完全的一致，也可以是氨基酸的保守互換。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“衍生物”還包括融合蛋白，其N端或C端聯(lián)結(jié)了其它蛋白的功能性區(qū)域。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，這個(gè)其他蛋白可以是例如GM-CSF、VEGF、PIGF、他仃類降脂藥物或一種內(nèi)皮祖細(xì)胞的刺激因子。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述的其它蛋白也可以是一種對(duì)已分化的內(nèi)皮細(xì)胞具有刺激作用的因子，例如血管生成素，VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)或bGFG(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)。bGFG和VEGF這些生長(zhǎng)因子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有很強(qiáng)的趨化作用和促有絲分裂作用。
EPO衍生物與天然EPO之間的區(qū)別可以通過(guò)突變表現(xiàn)出來(lái)，所述突變例如缺失、取代、插入、增加、堿基交換和/或?qū)PO的氨基酸序列進(jìn)行編碼的核苷酸序列的重組。根據(jù)本發(fā)明，EPO優(yōu)選為(EPO-)α，(EPO-)β，Aranesp(阿法達(dá)貝泊汀)或者CERA(持續(xù)EPO受體拮抗劑)。當(dāng)然，這種區(qū)別也可以是自然發(fā)生的序列突變，例如來(lái)自其它生物的序列，或者是發(fā)生自然突變的序列或用本技術(shù)領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法(例如使用化學(xué)制劑或物理制劑)在編碼EPO的核苷酸序列上選擇性誘導(dǎo)突變得到的序列。因此，根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“衍生物”還包括突變的EPO分子，即突變蛋白。
根據(jù)本發(fā)明，EPO的多肽或蛋白類似物也可以使用。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“類似物”包括與EPO具有不同氨基酸序列的化合物，但其三級(jí)結(jié)構(gòu)與EPO卻非常相似，因此具有相似的生物活性。舉例來(lái)說(shuō)，EPO類似物可以是這樣的化合物，其氨基酸殘基在適合的空間構(gòu)型下可以使EPO與其受體相結(jié)合，因此能夠模擬EPO結(jié)合區(qū)域的基本表面特性。這類化合物在例如Wrighton等的文獻(xiàn)(Science，273(1996)，458)中已經(jīng)作了描述。根據(jù)本發(fā)明，所使用的EPO可以用很多方法生產(chǎn)，例如可以從正常人的尿液或再生障礙性貧血患者的尿液或血漿(包括血清)中分離得到(Miyake et al.，J.B.C.252(1977)，5558)。人EPO可以通過(guò)人體腎癌細(xì)胞的組織培養(yǎng)物得到(JA未審查的申請(qǐng)55790/1979)，從具有產(chǎn)生人EPO能力的人淋巴母細(xì)胞獲得(JA未審查的申請(qǐng)40411/1982)，還可以從通過(guò)人細(xì)胞系的融合得到的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得。EPO也可以用基因技術(shù)的方法獲得，即通過(guò)基因工程方法在細(xì)菌、酵母或植物、動(dòng)物或人的細(xì)胞系中通過(guò)編碼相應(yīng)EPO氨基酸序列的DNA或RNA來(lái)合成目的蛋白。這些方法在例如EP0148605 B2、EP0205564 B2和EP0411678 B1中已被描述。
本發(fā)明特別涉及低劑量EPO和/或其衍生物的應(yīng)用，用于在人或動(dòng)物(特別是在成熟機(jī)體內(nèi))，可以刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的生理遷移、增殖、誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化成為內(nèi)皮細(xì)胞，和/或誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞向血管生成或脈管生成刺激物的遷移。
本發(fā)明還涉及順序連用低劑量EPO和至少一種合適的化學(xué)、熱力、機(jī)械或生物制品、特別是一種藥理學(xué)活性成分，從而提高內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能和數(shù)量，同時(shí)加強(qiáng)低劑量EPO對(duì)器官的保護(hù)和再生作用。
此外，本發(fā)明涉及連續(xù)地、按時(shí)間先后順序地或同步地使用低劑量EPO以及一種或多種其它藥理學(xué)活性物質(zhì)，例如VEGF，GM-CSF，M-CSF，血小板生成素，SCF，SDF-1，NGF，PIGF，HMG輔酶抑制劑，ACE抑制劑，AT-1阻斷劑以及NO供體，目的是提高內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能和數(shù)量和/或誘導(dǎo)組織再生以及減緩組織損傷的進(jìn)展。關(guān)于這一點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于影響以下進(jìn)程A)優(yōu)化骨髓或干細(xì)胞特定組織小環(huán)境中干細(xì)胞和/或內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量；B)干細(xì)胞和/或內(nèi)皮祖細(xì)胞從骨髓或其它“干細(xì)胞”小環(huán)境向外周血中的遷移；C)在外周血和/或體外選擇性培養(yǎng)，特別是氧濃度為0.1～10％的低氧培養(yǎng)條件下，優(yōu)化干細(xì)胞和/或內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量；D)干細(xì)胞和/或內(nèi)皮祖細(xì)胞在損傷部位的定位；E)干細(xì)胞和/或內(nèi)皮祖細(xì)胞向靶組織黏附和遷移；F)內(nèi)皮祖細(xì)胞引起的新血管形成。
本發(fā)明因此涉及低劑量EPO離體預(yù)培養(yǎng)后，同時(shí)或不同時(shí)間使用內(nèi)皮祖細(xì)胞以及一種或多種有治療作用的細(xì)胞群，特別是肝細(xì)胞、肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞或胰島移植物，和/或在體內(nèi)局部或系統(tǒng)使用低劑量EPO，從而提高和加速這些可用于細(xì)胞治療的細(xì)胞群的功能，定位，血管生成，以及與接受者血液循環(huán)的連接。
本發(fā)明涉及EPO(特別是低劑量)的應(yīng)用，或者是用于“美容護(hù)理”的外用活性物質(zhì)應(yīng)用的，特別是用于預(yù)防和及時(shí)減少皺紋和細(xì)紋，增強(qiáng)結(jié)締組織，護(hù)膚和緊膚(特別是面部皮膚)，阻止有害的外部環(huán)境因素，還可用作化妝品的粉底。外用EPO還可以阻止老年斑形成和進(jìn)一步發(fā)展，改善膚質(zhì)，促進(jìn)皮膚復(fù)壯過(guò)程和再生。此外，EPO還可以加速頭發(fā)生長(zhǎng)。
本發(fā)明還涉及低劑量EPO用于生產(chǎn)適合以適應(yīng)其生理節(jié)律使用的藥物組合物的應(yīng)用。內(nèi)源性EPO的分泌在下午較晚的時(shí)候達(dá)到最高峰(每天的最高值)，因此低劑量EPO的使用最好在上午，特別是在6:00～10:00的時(shí)段內(nèi)進(jìn)行，以達(dá)到其生物學(xué)、治療或美容的最佳效果。
本發(fā)明涉及低劑量EPO的應(yīng)用，目的在于刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的生理遷移，和/或刺激增殖和分化，和/或誘導(dǎo)新血管生成，和/或用于治療與內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙相關(guān)的疾病，和/或用于生產(chǎn)治療這些疾病的藥物組合物，以及生產(chǎn)包括EPO和其它適合的、用于刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的活性物質(zhì)的藥物組合物，針對(duì)具有以下特征的病患a)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙；b)至少一種心血管危險(xiǎn)因素，如高血壓、高膽固醇血癥，胰島素抵抗或高同型半胱氨酸血癥，ADMA水平升高；和c)至少一種末端器官損傷，例如左心室肥大，微量白蛋白尿，認(rèn)知功能障礙，頸動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，蛋白尿或腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)＜80ml/min、特別是30、主要在40～80ml/min。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，本發(fā)明還涉及到連續(xù)地、按時(shí)間先后順序地或同步地使用低劑量EPO以及一種或多種其它的化學(xué)、熱力、機(jī)械或生物制品。通過(guò)這種方式提高內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能和增加內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量，和/或誘導(dǎo)再生或減緩組織損傷的進(jìn)程。這些機(jī)械制品可以是人工假肢，優(yōu)選用于替代牙齒，骨頭或者韌帶/肌腱的植入支持物。此外，所述生物制品可以是實(shí)體器官，例如肝臟、腎臟、心臟、胰腺、皮膚，甚至是頭發(fā)移植物。因此，本發(fā)明提出，為了使同時(shí)、之前或之后植入的機(jī)械制品(例如人工假肢)，或生物制品更好，更快，更有效地生長(zhǎng)和融合入周圍機(jī)體組織，可以使用EPO、特別是低劑量的EPO。本發(fā)明還涉及EPO用于生產(chǎn)藥物組合物或試劑盒的應(yīng)用，用于改善，特別是提高或加快生物制品或人工假肢與周圍機(jī)體組織的融合，特別是牙齒、牙齒替代物、牙齒植入物或其它人工假肢，例如骨骼替代物、骨骼植入物、特別是髖關(guān)節(jié)修補(bǔ)物或者韌帶/肌腱替代物(例如交叉韌帶)。關(guān)于這一點(diǎn)，如果需要，EPO可以與有細(xì)胞治療作用的細(xì)胞群和/或內(nèi)皮祖細(xì)胞聯(lián)合使用。在一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施例中，上述EPO用于生產(chǎn)可以改善、提升或加快生物制品或人工假肢與周圍機(jī)體組織(特別是病人的靶組織、靶標(biāo)骨骼或靶標(biāo)軟骨)融合的藥物組合物或試劑盒，此過(guò)程所使用的機(jī)械制品可以由鋼，陶瓷，塑料或其它基質(zhì)材料制成。此外，本發(fā)明中，成骨細(xì)胞，具有成骨潛力的細(xì)胞，血小板，血細(xì)胞或者類似制品都適合用于細(xì)胞治療。在另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述機(jī)械制品與有機(jī)黏合劑(例如纖維膠)一起包含在藥物組合物或藥物試劑盒中。
根據(jù)本發(fā)明，“內(nèi)皮祖細(xì)胞”(EPC)應(yīng)理解為在血液中循環(huán)著的，能分化成為內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞。胚胎發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)的內(nèi)皮祖細(xì)胞是成血管細(xì)胞。成熟機(jī)體中存在的內(nèi)皮祖細(xì)胞是成血管細(xì)胞樣細(xì)胞，可以通過(guò)培養(yǎng)單核細(xì)胞(特別是CD34+到CD14+單核細(xì)胞)獲得，和/或從外周血分離得到的CD34+干細(xì)胞獲得。
根據(jù)本發(fā)明，“遷移”或者“生理遷移”應(yīng)理解為來(lái)自骨髓或可替代的“干細(xì)胞”小環(huán)境的干細(xì)胞和/或內(nèi)皮祖細(xì)胞被生長(zhǎng)因子激活的過(guò)程，其中干細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入血液，特別是外周血。
根據(jù)本發(fā)明，“增殖”應(yīng)理解為細(xì)胞變大并隨后分裂成兩個(gè)或更多子細(xì)胞的能力。因此，EPO介導(dǎo)的對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的刺激特別地與內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和分裂能力相關(guān)。
根據(jù)本發(fā)明，內(nèi)皮祖細(xì)胞的“分化”應(yīng)理解為源于骨髓或特定組織小環(huán)境的單核細(xì)胞經(jīng)由內(nèi)皮祖細(xì)胞發(fā)展為內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程?！皟?nèi)皮細(xì)胞”應(yīng)理解為是形成內(nèi)皮，也就是血管或血漿腔的單層細(xì)胞層的細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞的特征在于能釋放血管活性物質(zhì)例如EDRF(內(nèi)皮衍生的松弛因子)，或者是收縮物質(zhì)例如內(nèi)皮素，以及抑制或激活血液凝結(jié)的因子和調(diào)節(jié)血管滲透能力的因子。內(nèi)皮細(xì)胞還合成內(nèi)皮下連接組織的成分，特別是IV型和V型膠原蛋白，細(xì)胞粘連蛋白(例如層粘連蛋白、纖維結(jié)合素、凝血栓蛋白)，生長(zhǎng)因子(例如平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)因子)以及促進(jìn)形成新血管的因子。
根據(jù)本發(fā)明，內(nèi)皮祖細(xì)胞的“轉(zhuǎn)移”應(yīng)理解為血液中的內(nèi)皮祖細(xì)胞向血管生成或血管新生刺激因子移動(dòng)并在該處聚集的現(xiàn)象?！把苌纱碳ひ蜃印睉?yīng)理解為一種在人或動(dòng)物體的組織或血管中的化學(xué)刺激物，可以特定地作用于內(nèi)皮祖細(xì)胞，使其在體內(nèi)向該化學(xué)刺激物的產(chǎn)生位點(diǎn)轉(zhuǎn)移。血管生成刺激因子就是通過(guò)這種方式誘導(dǎo)新血管生成。“血管新生刺激因子”應(yīng)理解為一種在人或動(dòng)物的組織或血管中的化學(xué)刺激物，特定地作用于已分化的內(nèi)皮細(xì)胞，使其在體內(nèi)向該化學(xué)刺激物的產(chǎn)生位點(diǎn)轉(zhuǎn)移。血管生成過(guò)程就是通過(guò)這種方式由血管新生刺激因子誘導(dǎo)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，使用低劑量EPO和/或其衍生物以提高正分化的內(nèi)皮祖細(xì)胞的黏附能力。根據(jù)本發(fā)明，EPO可特別用于提高內(nèi)皮祖細(xì)胞的黏附(也就是細(xì)胞間的黏附)能力。正分化的內(nèi)皮祖細(xì)胞或已分化的內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用是構(gòu)建新血管或形成新內(nèi)皮組織的基本條件之一。細(xì)胞黏附作用是由蛋白質(zhì)分子介導(dǎo)的。
本發(fā)明還涉及低劑量EPO用于刺激新血管構(gòu)建，特別是脈管生成方面的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明，“脈管生成”應(yīng)理解為正分化的內(nèi)皮祖細(xì)胞在原位形成新血管的過(guò)程。因此，根據(jù)本發(fā)明，低劑量EPO可以刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞更活躍地參與新血管形成或者在局部形成新血管以修復(fù)受損的血管區(qū)域。因此，根據(jù)本發(fā)明，低劑量EPO或其衍生物的使用可以促進(jìn)新血管構(gòu)建和/或在局部形成新血管以替代受損血管。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供了低劑量EPO和/或其衍生物用于刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的應(yīng)用，用于形成內(nèi)皮組織。
在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，提供了低劑量EPO和/或其衍生物在人或動(dòng)物體內(nèi)治療與內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙相關(guān)的病理狀態(tài)或疾病或其后遺癥的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明，“疾病”、“病理狀態(tài)”或“紊亂”應(yīng)理解為一種器官或整個(gè)機(jī)體受到損傷的生命過(guò)程，可導(dǎo)致主觀可感受到的或客觀可檢測(cè)到的身體上的、情緒上的或精神上的變化。根據(jù)本發(fā)明，這些疾病特別與內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能障礙相關(guān)，即有這種功能障礙的細(xì)胞不是直接導(dǎo)致發(fā)病就是間接誘導(dǎo)發(fā)病。另外，根據(jù)本發(fā)明，應(yīng)理解“疾病”、“病理狀態(tài)”或“紊亂”，作為器官或整個(gè)機(jī)體受到損傷的生命過(guò)程，可以通過(guò)應(yīng)用低劑量EPO或適當(dāng)?shù)幕钚晕镔|(zhì)來(lái)阻止，或者是減慢這些過(guò)程。這里的“后遺癥”應(yīng)理解為在原發(fā)疾病基礎(chǔ)上發(fā)生的其他病變。
根據(jù)本發(fā)明，內(nèi)皮祖細(xì)胞的“功能障礙”應(yīng)理解為一種重要的細(xì)胞功能的損傷，例如新陳代謝能力，應(yīng)激反應(yīng)，運(yùn)動(dòng)性，分裂行為或分化行為。內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能障礙意味著，內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖行為不完全或者不充分。由于EPO可以刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖，內(nèi)皮祖細(xì)胞和已分化的內(nèi)皮細(xì)胞的分裂不足可以得到補(bǔ)償，同時(shí)還可以增加內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量。內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能障礙可以表現(xiàn)為這些細(xì)胞分化成內(nèi)皮細(xì)胞的功能的減弱。也可以表現(xiàn)為其黏附能力的減弱和/或向血管新生或血管生成刺激因子遷移能力的障礙。內(nèi)皮祖細(xì)胞的這些功能障礙可以削弱或阻止新血管組織形成和/或脈管生成。高血壓，高脂蛋白血癥，ADMA血液水平升高，尿毒癥或糖尿病都可以導(dǎo)致內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙。舉例來(lái)說(shuō)，內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能障礙可以表現(xiàn)為，在NO合成酶(NOS)催化下L-精氨酸轉(zhuǎn)化為NO減少，內(nèi)皮素增加和/或ICAM-1和VCAM-1等血管細(xì)胞黏附分子增加。
根據(jù)本發(fā)明，與內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙相關(guān)的病變有高膽固醇血癥，糖尿病，胰島素抵抗，內(nèi)皮介導(dǎo)的慢性炎癥(例如血管炎癥)，內(nèi)皮增生(包括網(wǎng)狀內(nèi)皮增生)，動(dòng)脈粥樣硬化癥，老年性心血管疾病，四肢缺血性紊亂，子癇前癥，雷諾氏癥，懷孕導(dǎo)致的高血壓，急性或慢性肝衰竭、特別是末期腎衰竭，腎功能受限至腎小球?yàn)V過(guò)率在30～80、特別是40～80ml/min，微量白蛋白尿，蛋白尿，ADMA水平升高，創(chuàng)傷愈合及其后遺癥。
“高膽固醇血癥”表現(xiàn)為血液中膽固醇濃度升高。初級(jí)高膽固醇血癥最常見(jiàn)的表現(xiàn)形式是多基因高膽固醇血癥。次級(jí)高膽固醇血癥則常常伴隨糖尿病，腎病綜合癥，甲狀腺機(jī)能減退以及肝功能紊亂。
“糖尿病”是具有不同病因和癥狀的各種形式的葡萄糖代謝損傷。導(dǎo)致糖尿病在血管系統(tǒng)的相關(guān)并發(fā)癥的主要是AGE-RAGE系統(tǒng)。AGE(晚期糖基化終末產(chǎn)物)是經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的多步驟反應(yīng)，然后將蛋白或脂類長(zhǎng)時(shí)間暴露在還原糖(例如葡萄糖)而形成的。AGE的形成發(fā)生在正常的老化過(guò)程中，在糖尿病和阿爾茨海默氏癥患者中有所增加。結(jié)合到AGE導(dǎo)致了氧化應(yīng)激，激活了NF-κB轉(zhuǎn)錄因子，從而打破了內(nèi)皮系統(tǒng)的自我平衡。
“胰島素抵抗”應(yīng)理解為各種機(jī)體細(xì)胞的信號(hào)傳輸障礙，從而阻滯胰島素的生理信號(hào)級(jí)聯(lián)，受此影響的病人因此出現(xiàn)葡萄糖代謝障礙。
“內(nèi)皮介導(dǎo)的慢性炎癥”是指由于人或動(dòng)物的機(jī)體及其組織對(duì)有害刺激的抵抗反應(yīng)而導(dǎo)致的的紊亂或疾病。特定的信號(hào)分子改變了內(nèi)皮細(xì)胞的特性，其結(jié)果就是，通過(guò)與其它細(xì)胞類型啟動(dòng)的相互作用使白細(xì)胞黏附在內(nèi)皮細(xì)胞上，最終滲透進(jìn)組織并在該處引發(fā)炎癥反應(yīng)。內(nèi)皮介導(dǎo)的炎癥的一個(gè)例子就是白細(xì)胞血管炎癥。在內(nèi)皮介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的是NF-κB轉(zhuǎn)錄因子。導(dǎo)致內(nèi)皮介導(dǎo)的慢性炎癥的另一個(gè)系統(tǒng)是AGE-RAGE系統(tǒng)。
“內(nèi)皮增生”應(yīng)理解為在非血小板減少性紫癜中，內(nèi)皮的退化和增殖改變?！熬W(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生”應(yīng)理解為網(wǎng)狀組織細(xì)胞系統(tǒng)疾病，例如網(wǎng)狀組織、網(wǎng)狀細(xì)胞增生，網(wǎng)狀組織細(xì)胞增生和韓-薛-柯氏病(Hand-Schüller-Christian)。
“雷諾氏癥”應(yīng)理解為由于血管收縮(即血管痙攣)引起的陣發(fā)性缺血狀態(tài)，通常發(fā)生在手指動(dòng)脈。初級(jí)的雷諾氏疾病是四肢末梢部分供血小血管的單純性功能損傷，而次級(jí)的雷諾氏疾病則伴隨其它疾病，例如血管炎癥。
“子癇前癥”是一種母性機(jī)體的內(nèi)皮和血管疾病，似乎是由來(lái)源于胎盤的內(nèi)皮物質(zhì)作用所引起的一種多系統(tǒng)功能紊亂，可導(dǎo)致多個(gè)器官的功能損傷，并表現(xiàn)出不同的癥狀。其特有的循環(huán)損傷是由于血管壓力變化增加在局部劇烈變化所引起的。對(duì)于子癇前癥的發(fā)病機(jī)理，已證實(shí)內(nèi)皮功能障礙是其重要組成部分。
根據(jù)本發(fā)明，“腎衰竭”應(yīng)理解為腎臟排泄尿液中所含物質(zhì)的受限。到晚期，腎臟也喪失了調(diào)節(jié)電解液，水和酸堿平衡的能力。末期腎衰竭的特征是腎臟排泄和內(nèi)分泌功能的崩潰。
根據(jù)本發(fā)明，腎衰竭可以是急性腎衰竭，也被稱為急性腎功能不全，腎休克或精力衰竭休克。急性腎衰竭通常由一種可逆的腎損傷所引起的腎臟排泄功能突然地部分或全部喪失。其起因可能是血容量過(guò)低引起的低灌注，失血(多發(fā)傷，胃腸或產(chǎn)后出血，心臟、血管、腹部或前列腺部位的外科大手術(shù))引起的低血壓和脫水，休克(心肌梗塞、栓塞)，嚴(yán)重的感染(膿血癥，腹膜炎，膽囊炎)，溶血(溶血-尿毒綜合癥，突發(fā)性血紅蛋白尿，輸血反應(yīng))，肌肉分解(擠壓綜合癥，橫紋肌分解，肌炎，燒傷)，水和電解質(zhì)損失(劇烈嘔吐，腹瀉，過(guò)多發(fā)汗，腸梗阻，急性胰腺炎)。其它的原因則可能是腎毒性物質(zhì)，例如外源性毒素如苯胺、乙二醇化合物，甲醇及類似物，或者是內(nèi)源性毒素如肌血球素和草酸鹽。急性腎損傷的另一個(gè)原因是腎功能紊亂，例如腎炎或腎移植后的排斥反應(yīng)。急性腎衰竭也可能是由于尿流受阻導(dǎo)致的尿滯留所引起。根據(jù)本發(fā)明，在治療急性腎衰竭時(shí)創(chuàng)造性的使用EPO、特別是低劑量EPO，可以防止或至少是減緩急性腎衰竭的發(fā)展。
根據(jù)本發(fā)明，腎衰竭也可以是慢性腎衰竭。慢性腎衰竭的起因是腎的血管，腎小球及腎小管間質(zhì)性腎功能紊亂，感染以及先天性或獲得性組織缺陷。慢性腎衰竭的病因除此之外還包括慢性腎小球病，慢性腎盂腎炎，止痛藥性腎病，梗阻性尿路病，動(dòng)脈硬化和小動(dòng)脈硬化。慢性腎衰竭發(fā)展到末期就是尿毒癥。根據(jù)本發(fā)明，使用低劑量EPO治療慢性腎衰竭，可以減緩其發(fā)展進(jìn)程。
本發(fā)明因此特別地涉及EPO、特別是低劑量EPO在生產(chǎn)藥物方面的應(yīng)用，所述藥物可以用于防止、減少或減緩腎組織損傷，和/或促進(jìn)急、慢性腎衰竭引起腎組織損傷的再生。
根據(jù)本發(fā)明，腎功能受限狀態(tài)應(yīng)理解為腎小球?yàn)V過(guò)率降至＜80ml/min的情況。腎功能受限涉及早期腎小球病變，腎小管間質(zhì)性和血管性腎損害。根據(jù)本發(fā)明，使用低劑量EPO治療腎功能受限可以減緩其進(jìn)程或促進(jìn)受損腎組織和/或功能的再生。
根據(jù)本發(fā)明，“微量白蛋白尿”應(yīng)理解為一種患者排泄的尿液中自蛋白的含量超過(guò)30mg/24hr的非正常生理現(xiàn)象的臨床表現(xiàn)。這種白蛋白排泄的增加是腎功能惡化的一個(gè)早期癥狀，是伴隨腎臟結(jié)構(gòu)改變的最初病理變化，隨之而來(lái)的是腎臟構(gòu)造的結(jié)構(gòu)變化。
根據(jù)本發(fā)明，“蛋白尿”應(yīng)理解為一種患者排泄的尿液中蛋白質(zhì)的含量超過(guò)150mg/24hr的非正常生理現(xiàn)象的臨床表現(xiàn)。這種尿液排泄的蛋白的增加(＞150mg/24hr)是病態(tài)的，需要進(jìn)一步的內(nèi)科檢查和治療。
根據(jù)本發(fā)明，“ADMA水平升高”應(yīng)被理解為患者血中ADMA濃度超過(guò)1.3umol/l的臨床癥狀。這種ADMA濃度升高與內(nèi)皮功能障礙相關(guān)，是內(nèi)皮組織新陳代謝功能障礙導(dǎo)致的結(jié)果。
根據(jù)本發(fā)明，“創(chuàng)傷愈合”應(yīng)理解為受損傷組織的再生和創(chuàng)口愈合，特別是新結(jié)締組織和毛細(xì)管形成的生理過(guò)程。創(chuàng)傷愈合涉及一期創(chuàng)傷愈合(初級(jí)概念的修復(fù))，在創(chuàng)傷整齊的情況下，快速，無(wú)并發(fā)癥的愈合，基本上完全愈合。這是由于在傷口邊緣形成的新結(jié)締組織最少，有良好的血液供應(yīng)。在創(chuàng)傷邊緣較遠(yuǎn)，特別是粉碎性或壞死性的創(chuàng)傷邊緣，并且創(chuàng)傷發(fā)生感染的情況下，則需要進(jìn)行后續(xù)的二期創(chuàng)傷愈合(次級(jí)概念的修復(fù))。在這些情況下，肉芽組織形成并填充進(jìn)缺損組織(細(xì)菌感染的結(jié)果)，形成的傷疤組織面積更大。從邊緣開始的上皮形成，意味著創(chuàng)傷愈合完成。這種創(chuàng)傷愈合分為潛伏期，增殖期和修補(bǔ)期三個(gè)階段。潛伏期又被分為血痂形成的滲出期(特別是創(chuàng)傷發(fā)生的頭幾個(gè)小時(shí))和自溶分解代謝的吸收期(創(chuàng)傷發(fā)生后1～3天)。增殖期的特點(diǎn)是由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原蛋白進(jìn)行合成代謝修復(fù)，該過(guò)程發(fā)生在創(chuàng)傷形成后的4～7天。修復(fù)期在創(chuàng)傷形成后第8天開始，其特征為肉芽組織轉(zhuǎn)變?yōu)榘毯劢M織。
根據(jù)本發(fā)明，“創(chuàng)傷”應(yīng)理解為伴隨或不伴隨物質(zhì)損失的機(jī)體組織連貫性的破壞，可以由機(jī)械傷害或身體上相關(guān)的細(xì)胞損傷引起。根據(jù)本發(fā)明，創(chuàng)傷也是一種病變。創(chuàng)傷的類型包括由機(jī)械，熱力，化學(xué)性因素、輻射和疾病引起的創(chuàng)傷。機(jī)械性創(chuàng)傷是由外力引起，特別是切傷和刺傷，擠壓傷、割裂傷、撕裂傷以及擦傷，抓、咬傷，和射傷。熱力創(chuàng)傷是暴露于熱或冷所引起的?；瘜W(xué)創(chuàng)傷主要是由于酸或堿導(dǎo)致的灼傷。輻射所引起的創(chuàng)傷是例如光化學(xué)或電離輻射導(dǎo)致的。疾病引起的創(chuàng)傷主要是充血性創(chuàng)傷，外傷性創(chuàng)傷，糖尿病性創(chuàng)傷等。根據(jù)本發(fā)明，使用低劑量EPO(特別是外用或靜脈注射給藥)，可以促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)。
本發(fā)明涉及低劑量EPO的應(yīng)用，用于治療高膽固醇血癥，糖尿病，胰島素抵抗，內(nèi)皮介導(dǎo)的慢性炎癥，內(nèi)皮增生(包括網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生)，動(dòng)脈粥樣硬化癥，老年性心血管疾病，四肢缺血性疾病，子癇前癥，雷諾氏癥，肝臟疾病如肝炎，肝硬化，急性或慢性肝衰竭，骨質(zhì)和軟骨失調(diào)或損傷，粘膜失調(diào)或損傷(特別是在胃腸道中)，克羅恩氏病，潰瘍性結(jié)腸炎，妊娠高血壓綜合癥，慢性或急性腎衰竭，特別是晚期腎衰竭，腎功能受限至腎小球?yàn)V過(guò)率＜80、特別30～80ml/min、優(yōu)選的是40～80ml/min，微量白蛋白尿，蛋白尿，或創(chuàng)傷及其后遺癥。
根據(jù)本發(fā)明，給病人使用的EPO的劑量應(yīng)該達(dá)到治療上有效的劑量，即該劑量應(yīng)該足以治愈一種前述的疾病(特別是與內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙相關(guān)的疾病)，或預(yù)防該疾病的發(fā)生，停止該疾病的發(fā)展，和/或減輕該疾病的癥狀。給病人使用的劑量大小取決于很多因素，例如病人的年齡、體重、性別、疾病的嚴(yán)重程度等等。
“創(chuàng)造性的EPO劑量”根據(jù)本發(fā)明，上文所提出的所有應(yīng)用，方法和組合物，優(yōu)選使用的EPO都是少量的，少于已知的通常用于治療腎性貧血所使用的劑量。根據(jù)本發(fā)明，特別是在體內(nèi)，低劑量或用量，即對(duì)每個(gè)病人來(lái)說(shuō)，EPO的劑量為1～2000，優(yōu)選的是20～2000單位(IU；國(guó)際單位)/周，更優(yōu)的是20～1500IU/周，更優(yōu)的是20～1000IU/周，更優(yōu)的是20～950IU/周，更優(yōu)的是20～900IU/周，更優(yōu)的是20～850IU/周，更優(yōu)的是20～800IU/周，更優(yōu)的是20～750IU/周，更優(yōu)的是20～700IU/周，更優(yōu)的是20～650IU/周，更優(yōu)的是20～600IU/周，更優(yōu)的是20～550IU/周，更優(yōu)的是20～500IU/周，更優(yōu)的是20～450IU/周，更優(yōu)的是20～400IU/周，更優(yōu)的是20～350IU/周，更優(yōu)的是20～300IU/周，更優(yōu)的是20～250IU/周，更優(yōu)的是20～200IU/周，更優(yōu)的是20～150IU/周，視病變的嚴(yán)重程度和腎功能而定。根據(jù)本發(fā)明，可以使用的劑量為1～450，更優(yōu)的是1～9IU/周。所有前述的與本發(fā)明相關(guān)的劑量，例如1～2000單位(IU)/周/病人，更優(yōu)的是500～2000IU/周/病人，都是適用于亞紅細(xì)胞增多性的劑量，也就是說(shuō)該劑量不會(huì)引起血細(xì)胞比容的增加，而且與EPO使用前相比，血細(xì)胞比容的增加不會(huì)超過(guò)10％，特別是5％，更好的是2％。根據(jù)本發(fā)明，亞紅細(xì)胞增多性的劑量對(duì)應(yīng)于每周約1～90單位(IU)EPO/kg體重的劑量，更優(yōu)的是1～45IU EPO/kg體重，更優(yōu)的是1～30IU EPO/kg體重，更優(yōu)的是1～20IU EPO/kg體重，更優(yōu)的是1～15IUEPO/kg體重，更優(yōu)的是1～10IU EPO/kg體重，更優(yōu)的是1～4IU EPO/kg體重，或者等同于Aranesp的劑量為每周0.001～0.4μg/kg體重，0.001～0.3μg/kg體重，0.001～0.25μg/kg體重，0.001～0.2μg/kg體重，0.001～0.15μg/kg體重，0.001～0.1μg/kg體重，0.001～0.09μg/kg體重，0.001～0.08μg/kg體重，0.001～0.07μg/kg體重，0.001～0.06μg/kg體重，0.001～0.05μg/kg體重，0.001～0.04μg/kg體重，0.001～0.03μg/kg體重，0.001～0.02μg/kg體重，0.001～0.01μg/kg體重，0.001～0.009μg/kg體重，0.001～0.008μg/kg體重，0.001～0.007μg/kg體重，0.001～0.006μg/kg體重，0.001～0.005μg/kg體重，0.001～0.004μg/kg體重，0.001～0.003μg/kg體重，0.001～0.002μg/kg體重。Aranesp是一種雙重聚乙二醇化的EPO。
根據(jù)本發(fā)明，這里所提出的所有應(yīng)用，方法和組合物，特別優(yōu)選使用的EPO是低劑量的，少于已知的通常用于治療腎性貧血所使用的劑量。根據(jù)本發(fā)明，低劑量或低用量用藥(特別是在體內(nèi))，即對(duì)每個(gè)病人，應(yīng)理解為EPO的劑量為0.001～90，優(yōu)選的是0.001～50單位(IU；國(guó)際單位)/kg體重/周，特別是0.05～45IU/kg/周，特別是0.05～40IU/kg/周，特別是0.05～35IU/kg/周，特別是0.05～33IU/kg/周，特別是0.05～31IU/kg/周，特別是0.05～29IU/kg/周，特別是0.05～27IU/kg/周，特別是0.05～25IU/kg/周，特別是0.05～23IU/kg/周，特別是0.05～21IU/kg/周，特別是0.05～19IU/kg/周，特別是0.05～17IU/kg/周，特別是0.05～15IU/kg/周，特別是0.05～13IU/kg/周，特別是0.05～11IU/kg/周，特別是0.05～9IU/kg/周，特別是0.05～7IU/kg/周，特別是0.05～5IU/kg/周，特別是0.05～3IU/kg/周，特別是0.05～1IU/kg/周，取決于紊亂的嚴(yán)重程度和腎功能。根據(jù)本發(fā)明，可以使用的劑量為0.001～20，首選的是0.05～10IU/kg/周。根據(jù)本發(fā)明，所有前述劑量，例如0.01～90單位(IU)/kg/周/病人，特別是例如0.01～50IU/kg/周/病人，是亞紅細(xì)胞增多性的劑量，或者換句話說(shuō)該劑量不會(huì)引起血細(xì)胞比容的增加，特別是與EPO使用前相比，血細(xì)胞比容的增加不會(huì)超過(guò)10％，特別是5％，更好的是2％。根據(jù)本發(fā)明，亞紅細(xì)胞增多性的劑量對(duì)應(yīng)于每周約1～90單位(IU)EPO/kg體重的劑量，特別是0.001～50IU EPO/kg體重，特別是0.001～45IU EPO/kg體重，特別是1～15IU EPO/kg體重，特別是1～10IUEPO/kg體重，特別是1～4IU EPO/kg體重，或者等同于Aranesp的劑量為每周0.000005～0.45μg/kg體重，0.00025～0.250μg/kg體重，0.00025～0.225μg/kg體重，0.00025～0.2μg/kg體重，0.00025～0.175μg/kg體重，0.00025～0.165μg/kg體重，0.00025～0.155μg/kg體重，0.00025～0.145μg/kg體重，0.00025～0.135μg/kg體重，0.00025～0.125μg/kg體重，0.00025～0.115μg/kg體重，0.00025～0.105μg/kg體重，0.00025～0.095μg/kg體重，0.00025～0.085μg/kg體重，0.00025～0.075μg/kg體重，0.00025～0.065μg/kg體重，0.00025～0.055μg/kg體重，0.00025～0.045μg/kg體重，0.00025～0.35μg/kg體重，0.00025～0.025μg/kg體重，0.00025～0.015μg/kg體重，0.00025～0.005μg/kg體重。Aranesp是一種雙重聚乙二醇化的EPO。與最初通常用于治療腎性貧血的90～150IU/kg體重/周的劑量(開始作為標(biāo)準(zhǔn)的劑量為4000～8000IU/周，如果治療效果不佳甚至更高)相比，本發(fā)明所提供的用于治療與內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙相關(guān)的疾病或病理狀態(tài)的上述的低劑量——例如0.001～90單位/kg/周/病人，特別是0.001～50單位/kg/周/病人的劑量——是極其低的。
除非發(fā)特別說(shuō)明，以上提到的劑量是每周使用一次的劑量，盡管該劑量也可以在一周內(nèi)分成多個(gè)單一劑量，即多劑量使用。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明涉及低劑量EPO和/或其衍生物、即前面的章節(jié)所定義的“創(chuàng)造性的EPO劑量”的應(yīng)用，作為活性物質(zhì)用于生產(chǎn)藥物組合物，或者治療與內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙相關(guān)的病理狀態(tài)和疾病的藥物。
根據(jù)本發(fā)明，“活性物質(zhì)”應(yīng)理解為一種內(nèi)源性或外源性物質(zhì)，該物質(zhì)能以不同的方式與靶分子或靶細(xì)胞或靶組織接觸，影響組織、器官或有機(jī)體的特定功能。因此，根據(jù)本發(fā)明，EPO作為創(chuàng)造性的藥物組合物的活性物質(zhì)，一旦與內(nèi)皮祖細(xì)胞接觸，能夠在人或動(dòng)物體內(nèi)影響內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、分化和遷移行為，通過(guò)這種方式，內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能障礙能夠得到補(bǔ)償，并且能夠有效控制、減輕/消除，或者有效預(yù)防由此所引起的疾病。低劑量EPO的使用不僅可以誘導(dǎo)器官再生，而且可以減緩不同器官和系統(tǒng)功能受限的發(fā)展進(jìn)程。
根據(jù)本發(fā)明，“藥物組合物”或“藥物”應(yīng)理解為一種用作診斷、治療和/或預(yù)防用途的混合物，換句話說(shuō)，是一種促進(jìn)或恢復(fù)人或動(dòng)物健康的混合物，該混合物包含至少一種天然或人工合成的具有治療效果的活性物質(zhì)。該藥物組合物既可以是固體混合物，也可以是液體混合物。例如，含有所述活性成分的藥物組合物可能含有一種或多種藥理上容易吸收的組分。另外，所述藥物組合物還可以含有專業(yè)領(lǐng)域常用的添加劑，例如穩(wěn)定劑，修飾劑，釋放劑，分解劑，乳化劑，或其它在生產(chǎn)藥物組合物常用的物質(zhì)。
本發(fā)明特別提供了一種EPO(特別是低劑量的EPO)和/或其衍生物作為一種活性物質(zhì)用于生產(chǎn)藥物的應(yīng)用，所述藥物可以用于治療高膽固醇血癥，糖尿病，胰島素抗性，內(nèi)皮介導(dǎo)的慢性炎癥(例如血管炎癥)，內(nèi)皮增生(包括網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生)，動(dòng)脈粥樣硬化癥，老年性心血管疾病，四肢缺血性疾病，雷諾氏癥，肝臟疾病(如肝炎，肝硬化，急性或慢性肝衰竭)，骨質(zhì)和軟骨失調(diào)或損傷，粘膜失調(diào)或損傷(特別是在胃腸道中)，克羅恩氏病，潰瘍性結(jié)腸炎，子癇前癥，妊娠高血壓綜合癥，慢性或急性腎衰竭(特別是晚期腎衰竭)，腎功能受限至腎小球?yàn)V過(guò)率＜80ml/min、特別是30，優(yōu)選的是40～80ml/min，微量白蛋白尿，蛋白尿，ADMA水平升高或創(chuàng)傷及其繼發(fā)癥。
該藥物組合物根據(jù)本發(fā)明既適合局部使用，也適合系統(tǒng)給藥。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該藥物組合物作可用作注射給藥，特別是靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)或皮下注射。更適宜的，含有EPO的藥物有注射或灌輸劑型。
在進(jìn)一步的應(yīng)用中，含有EPO的藥物組合物還可以口服給藥。舉例來(lái)說(shuō)，含有EPO的藥物的劑型可以是液體劑型，例如溶液、懸液或乳液，或者是固體劑型，例如藥片。
在進(jìn)一步的應(yīng)用中，所述藥物組合物還適合肺部給藥或吸入式給藥。因此根據(jù)本發(fā)明，EPO可以以治療上有效的形式直接向病人的肺部給藥。這種方式不需注射，而且給藥快速。通過(guò)肺部給藥，相對(duì)數(shù)量的EPO可以通過(guò)肺部吸收到血液中，使血液中EPO的濃度升高。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，肺部給藥的藥物組合物可以是水溶液或非水溶液，或粉劑。如果是粉劑，則最好含有EPO的顆粒，顆粒的直徑最好小于10μm，這樣的話，藥物就能到達(dá)患者肺葉，甚至深達(dá)肺泡。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，需要通過(guò)肺部途徑給藥的藥物是氣霧劑。
本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例涉及EPO在生產(chǎn)治療與內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙相關(guān)的疾病的藥物組合物方面的應(yīng)用，該藥物組合物不僅含有活性物質(zhì)EPO，還含有至少另外一種刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的活性物質(zhì)。
該活性物質(zhì)最好能夠刺激骨髓中或其它干細(xì)胞小環(huán)境中的內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移。根據(jù)本發(fā)明，上述物質(zhì)可以是一種能夠刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的分裂行為也就是增殖的活性成分。根據(jù)本發(fā)明，還有另外一種可能性是，該活性物質(zhì)能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化和/或遷移行為。上述刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的活性物質(zhì)特別優(yōu)選為VEGF，PIGF，GM-CSF，HMG-CoA還原酶抑制劑，特別是他仃類降脂藥物如辛伐他汀、美伐他汀或阿托伐他汀，ACE抑制劑，例如依那普利、雷米普利或群多普利，AT-1阻斷劑，例如依貝沙坦、氯沙坦或奧美沙坦，和/或NO供體，特別是L-精氨酸。
根據(jù)本發(fā)明，所述至少一種另外的活性成分可以并不刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞，而是特別作用于已分化的內(nèi)皮細(xì)胞，即誘導(dǎo)其增殖和/或遷移。特別的，所述該活性成分是bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)或血管生成素。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例涉及EPO和/或其衍生物作為活性成分在生產(chǎn)藥物組合物方面的應(yīng)用，該藥物組合物可以刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞，特別是可以刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移，增殖，分化為內(nèi)皮細(xì)胞和/或向血管生成或脈管新生刺激物的轉(zhuǎn)移。根據(jù)本發(fā)明，EPO和/或其衍生物可以作為活性成分用于生產(chǎn)藥物組合物，用于刺激的血管生成和/或內(nèi)皮形成，特別是人或動(dòng)物體內(nèi)。
本發(fā)明因此還涉及藥物組合物，該藥物組合物用于刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞、特別是刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移，增殖，誘導(dǎo)其向內(nèi)皮細(xì)胞的分化和/或向血管生成或脈管生成刺激因子的轉(zhuǎn)移，用于刺激新血管生成和/或內(nèi)皮形成，以及治療人或動(dòng)物與內(nèi)皮祖細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙相關(guān)的疾病。特別的，本發(fā)明涉及含有活性物質(zhì)EPO和至少一種刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞和/或已分化的內(nèi)皮細(xì)胞的其它活性成分的藥物組合物或藥物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明涉及含有EPO和至少一種其它活性成分的藥物組合物，所述另外的活性成分選自VEGF，PIGF，GM-CSF，HMG-CoA還原酶抑制劑，特別是他仃類降脂藥物如辛伐他汀、美伐他汀或阿托伐他汀，ACE抑制劑，例如依那普利、雷米普利或群多普利，AT-1阻斷劑，例如依貝沙坦、氯沙坦或奧美沙坦，和/或NO供體，特別是L-精氨酸，bFGF和血管生成素。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例涉及EPO在生產(chǎn)可移植內(nèi)皮細(xì)胞制品方面的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明，在這個(gè)實(shí)施例中，內(nèi)皮細(xì)胞的生產(chǎn)可以通過(guò)先在EPO作用下對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)，然后移植到受體的機(jī)體中，特別是患有與內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙相關(guān)的疾病的機(jī)體。例如，單核細(xì)胞(MNC)可以通過(guò)密度梯度離心從血液分離，并在體外以合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)。單核細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)方法已有描述，例如Asahara在Science，275(1997)，964-967；Dimmeler等在J.Clin.Invest.，108(2001)，391-397和Llevadot等在J.Clin.Invest.，108(2001)，399-405的文章。緊接著在EPO作用下進(jìn)一步培養(yǎng)單核細(xì)胞，刺激MNC中所含的內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和分化行為，特別是增加已分化的黏附性內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量。根據(jù)本發(fā)明，MNC可以在有EPO和至少一種另外的能刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和分化的活性物質(zhì)存在的情況下培養(yǎng)。特別優(yōu)選的，該所述的另外物質(zhì)有VEGF，PIGF，GM-CSF，NO供體，例如L-精氨酸，ACE抑制劑，例如依那普利、雷米普利或群多普利，AT-1阻斷劑，例如依貝沙坦、氯沙坦或奧美沙坦，HMG-CoA還原酶抑制劑，例如他仃類降脂藥物，特別是辛伐他汀、美伐他汀或阿托伐他汀。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，在低劑量EPO作用下離體預(yù)培養(yǎng)和/或體內(nèi)局部或系統(tǒng)性使用低劑量EPO后，內(nèi)皮祖細(xì)胞可與其它有細(xì)胞治療作用的細(xì)胞群同時(shí)給病人使用，所述可用于細(xì)胞治療的細(xì)胞群，例如肝細(xì)胞、肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞或胰島細(xì)胞。這種方法可以促使用于細(xì)胞治療的組織細(xì)胞沉淀并充分黏附到血管系統(tǒng)上。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例涉及EPO在生產(chǎn)藥物組合物或試劑盒方面的應(yīng)用，所述藥物組合物或試劑盒用于連續(xù)地、按時(shí)間先后地或同步地使用低劑量EPO以及一種或多種其它的化學(xué)、熱力、機(jī)械或生物制品，以增加內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能和數(shù)量，誘導(dǎo)再生以及減緩組織損傷進(jìn)程。所述機(jī)械制品可以是人工假肢，例如替代牙齒，骨頭，韌帶/肌腱的植入支持物。所述生物制品可以是實(shí)體器官，例如肝臟、腎臟、心臟、胰腺、或皮膚，甚至是植入式頭發(fā)。因此，本發(fā)明的EPO、特別是低劑量EPO的使用，為了使之前、同時(shí)或之后植入的機(jī)械制品(如人工假肢)或者生物制品能夠更好、更快、更有效地生長(zhǎng)以及與周邊的組織結(jié)構(gòu)融合。因此，本發(fā)明還涉及EPO在生產(chǎn)藥物組合物或試劑盒方面的應(yīng)用，所述藥物組合物或試劑盒用于改善，特別促進(jìn)和/或加快生物制品或人工假肢與周圍機(jī)體組織的融合，特別是牙齒，牙齒替代物，牙齒植入物或其它人工假肢，例如骨骼替代物，骨骼植入體，特別使髖關(guān)節(jié)修補(bǔ)物，韌帶/肌腱替代物(如交叉韌帶)。關(guān)于這一點(diǎn)，如果需要，EPO可以與適合用于細(xì)胞治療的細(xì)胞群和/或內(nèi)皮祖細(xì)胞一起使用。在上述EPO在生產(chǎn)藥物組合物或試劑盒的應(yīng)用中，所述藥物組合物或試劑盒用于改善，特別是促進(jìn)和/或加快生物制品或人工假肢與周圍機(jī)體組織(特別是靶組織，靶骨骼或靶軟骨組織)的融合。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述機(jī)械制品可以由鋼，陶瓷，塑料或其它材料制成。此外，在本應(yīng)用中，成骨細(xì)胞，具有成骨潛力的細(xì)胞，血小板，血細(xì)胞或者類似制品可用作適合用于細(xì)胞治療的細(xì)胞群。在一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施例中，所述機(jī)械制品特別地與有機(jī)黏合劑(例如纖維膠)一起成為藥物組合物或藥物試劑盒的組成成分。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，EPO或適合的活性物質(zhì)以外用的方式應(yīng)用，即所謂的“美容護(hù)理”，特別用于預(yù)防和及時(shí)減少皺紋，增強(qiáng)結(jié)締組織，護(hù)膚和緊膚(特別是面部皮膚)，阻止有害的外部環(huán)境因素，以及作為化妝品的粉底。而且，EPO外用可以阻止老年斑的形成和進(jìn)一步發(fā)展，改善膚質(zhì)，不僅能促進(jìn)皮膚復(fù)壯過(guò)程(特別是表皮再生)，還能加速頭發(fā)生長(zhǎng)。
此外的一個(gè)應(yīng)用形式中，低劑量EPO以適應(yīng)生理節(jié)律的方式使用。內(nèi)源性EPO的產(chǎn)生在下午較晚的時(shí)候有一個(gè)最高點(diǎn)(每天的最高值)，因此低劑量EPO的使用最好是在上午進(jìn)行，特別是在上午6:00～10:00的時(shí)段內(nèi)，通過(guò)這種方式以期達(dá)到生物學(xué)的最大效果。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，用低劑量EPO對(duì)被移植的組織或器官進(jìn)行預(yù)處理和/或進(jìn)一步處理。在該例中，移植體在移植前，特別是即將移植但還在供體體內(nèi)的時(shí)刻可以用低劑量EPO處理。受體機(jī)體在移植前一刻也可以用低劑量的EPO處理。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)在移植前或移植后對(duì)被移植的器官或組織以EPO進(jìn)行處理，可以確保在移植后，通過(guò)誘導(dǎo)新血管生成在移植處快速生成新血管，這些新形成的血管可迅速連接到受體的血管系統(tǒng)。內(nèi)皮可以通過(guò)這種方式迅速形成。低劑量EPO對(duì)移植器官或組織的處理能夠促進(jìn)其在體內(nèi)迅速生長(zhǎng)，從而顯著降低發(fā)生排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。此外，低劑量EPO還可以刺激器官的再生功能。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，移植器官或組織在移植前可以用低劑量EPO和至少一種內(nèi)皮祖細(xì)胞刺激因子的混合物處理。上述刺激因子優(yōu)選至VEGF，PIGF，GM-CSF，HMG-CoA還原酶抑制劑，例如他仃類降脂藥物，特別是辛伐他汀、美伐他汀或阿托伐他汀，ACE抑制劑，例如依那普利、雷米普利或群多普利，AT-1阻斷劑，例如依貝沙坦、氯沙坦或奧美沙坦，或NO供體，特別是L-精氨酸。在另一個(gè)實(shí)施例中，器官或組織在移植前不僅用EPO處理，還用另一種能刺激已分化的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的物質(zhì)處理。所述物質(zhì)特別優(yōu)選的是血管生成素或bFGF。在另一個(gè)實(shí)施例中，EPO對(duì)移植器官或組織的預(yù)處理可以通過(guò)單獨(dú)使用內(nèi)皮祖細(xì)胞實(shí)現(xiàn)，如果需要，所述內(nèi)皮祖細(xì)胞可以進(jìn)行體外擴(kuò)增。
在本發(fā)明的又一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，低劑量EPO被用來(lái)制造可植入或可移植的、含有細(xì)胞的體外器官或組織。根據(jù)本發(fā)明，體外生產(chǎn)的器官或組織可以在植入或移植前用低劑量EPO處理，以刺激受體內(nèi)的內(nèi)皮祖細(xì)胞，特別是刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移、轉(zhuǎn)移、增殖和分化行為。在體外器官或組織植入或移植后，受體機(jī)體最好進(jìn)一步以與本發(fā)明相適應(yīng)的低劑量EPO處理。根據(jù)本發(fā)明，體外器官或組織在移植或植入前以EPO處理，以及必要的時(shí)候以EPO對(duì)受體進(jìn)行后處理，可以確保在體內(nèi)進(jìn)行移植或植入后，通過(guò)誘導(dǎo)體外器官或組織的新血管生成快速形成新血管，這些新形成的血管可以迅速連接到受體的血管系統(tǒng)。通過(guò)這種方式還能夠?qū)崿F(xiàn)內(nèi)皮快速形成以及內(nèi)皮再生。因此，這種用低劑量EPO對(duì)體外移植器官或組織系統(tǒng)的處理能夠促進(jìn)其向受體內(nèi)快速生長(zhǎng)，從而顯著降低排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，而且還能保護(hù)移植體。
“體外器官或組織系統(tǒng)”應(yīng)理解為一種可移植或可植入的，含有細(xì)胞的組織或者器官。該組織或器官通過(guò)使用規(guī)定的細(xì)胞和/或組織在規(guī)定的離體培養(yǎng)條件下生產(chǎn)?！翱芍踩氲捏w外器官或組織系統(tǒng)”應(yīng)理解為一個(gè)除了含有細(xì)胞外，還含有外源性材料的系統(tǒng)?！翱梢浦驳捏w外器官或組織系統(tǒng)”應(yīng)理解為一個(gè)含有細(xì)胞的系統(tǒng)，不僅含有相同或不同個(gè)體的細(xì)胞、組織或器官，而且還含有外源性物質(zhì)。特別的，體外器官或組織的特征是其與欲取代的身體器官或組織非常相似，使它們?cè)隗w內(nèi)能夠承擔(dān)被取代的天然器官或組織的功能。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述體外器官或組織系統(tǒng)在植入或移植前，同時(shí)用EPO和至少另一種內(nèi)皮祖細(xì)胞刺激因子處理。這種因子優(yōu)選是一種或多種選自以下群組的物質(zhì)VEGF，PIGF，GM-CSF，HMG-CoA還原酶抑制劑，特別是他汀類降脂藥物如辛伐他汀、美伐他汀或阿托伐他汀，ACE抑制劑，例如依那普利、雷米普利或群多普利，AT-1阻斷劑，例如依貝沙坦、氯沙坦或奧美沙坦，以及NO供體。在另一個(gè)實(shí)施例中，體外器官或組織系統(tǒng)在植入或移植前不僅用EPO處理，還用另一種能夠刺激已分化的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的物質(zhì)處理。特別優(yōu)選的，這種物質(zhì)是血管生成素或bFGF。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述體外器官或組織系統(tǒng)還可以含有單獨(dú)的內(nèi)皮祖細(xì)胞，如果需要，所述內(nèi)皮祖細(xì)胞可以在體外進(jìn)行擴(kuò)增。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例涉及低劑量EPO用于生產(chǎn)血管修復(fù)體或心瓣膜的應(yīng)用，其中所述血管修復(fù)體或心瓣膜在引入機(jī)體、特別是人體內(nèi)之前以EPO涂覆。通過(guò)以EPO涂覆血管修復(fù)體或心瓣膜，可以確保刺激受體體內(nèi)的內(nèi)皮祖細(xì)胞。特別是，刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞從骨髓的遷移、增殖、分化成內(nèi)皮細(xì)胞以及向植入的血管修復(fù)體或心瓣膜的遷移。在以這種方法生產(chǎn)的血管修復(fù)體或心瓣膜被引進(jìn)體內(nèi)后，該機(jī)體可以用EPO、特別是以按照本發(fā)明的劑量使用EPO進(jìn)行進(jìn)一步處理。這樣，在植入的血管修復(fù)體上內(nèi)皮層可以更快形成，向身體相關(guān)區(qū)域內(nèi)的生長(zhǎng)也更快。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，單獨(dú)的內(nèi)皮祖細(xì)胞(如果需要，可以在體外進(jìn)行擴(kuò)增)被另外的用于涂覆血管修復(fù)體或心瓣膜。
本發(fā)明涉及在體外刺激內(nèi)皮細(xì)胞形成的方法，包括a)通過(guò)密度梯度離心的方法從血液中分離含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的細(xì)胞群；b)在細(xì)胞培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述分離的、含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的細(xì)胞群；和c)在低劑量EPO存在的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞群。
根據(jù)本發(fā)明，所述細(xì)胞群的培養(yǎng)可在另一種能刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的物質(zhì)存在的條件下進(jìn)行。
本發(fā)明還涉及一種用于治療與內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙相關(guān)疾病的方法，其中EPO以“與本發(fā)明要求相符的EPO劑量”這一段落中所說(shuō)明的低劑量，單獨(dú)的或與至少一種其它的化學(xué)、熱力、機(jī)械或生物制品聯(lián)合使用。本發(fā)明提供的這一方法特別適用于治療人體的疾病，例如高膽固醇血癥，糖尿病，胰島素抵抗，內(nèi)皮介導(dǎo)的慢性炎癥，例如血管炎癥，內(nèi)皮增生包括網(wǎng)狀內(nèi)皮增生，動(dòng)脈粥樣硬化癥，老年性心血管疾病，四肢缺血性紊亂，雷諾氏癥，肝臟疾病如肝炎，肝硬化，急性或慢性肝衰竭，骨質(zhì)和軟骨失調(diào)或損傷，粘膜失調(diào)或損傷，特別是在胃腸道中，克羅恩氏病，潰瘍性結(jié)腸炎，子癇前癥，妊娠高血壓綜合癥，慢性或急性腎衰竭，特別是晚期腎衰竭，腎功能受限至腎小球?yàn)V過(guò)率＜80ml/min、特別30～80ml/min，優(yōu)選的是40～80ml/min，微量白蛋白尿，蛋白尿，ADMA水平升高或創(chuàng)傷及其后遺癥。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，提供了一種用于治療與內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙相關(guān)的疾病的方法，即對(duì)病人除了使用EPO外，還至少使用另一種活性成分，該活性成分可選自VEGF，PIGF，GM-CSF，HMG-CoA還原酶抑制劑和NO供體。優(yōu)選的，所述的HMG-CoA還原酶抑制劑是一種他仃類降脂藥物，例如辛伐他汀、美伐他汀或阿托伐他汀。優(yōu)選的，所述ACE抑制劑可以是例如依那普利、雷米普利或群多普利的活性成分。AT-1阻斷劑可以是例如依貝沙坦、氯沙坦或奧美沙坦的活性成分。所使用的NO供體最好是L-精氨酸。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，提供了一種治療與內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙相關(guān)的疾病的方法，內(nèi)皮祖細(xì)胞可以從人體的血液中分離，使用低劑量EPO在體外擴(kuò)增并分化成為內(nèi)皮細(xì)胞，然后純化和分離已分化的內(nèi)皮細(xì)胞或正在分化的內(nèi)皮祖細(xì)胞后，選擇性的將其移植到病人由內(nèi)皮祖細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙而引起損傷的身體區(qū)域、組織或器官中，從而在該處誘導(dǎo)新內(nèi)皮的形成。通過(guò)這種方式，病人受到損傷的身體區(qū)域、組織或器官能夠得到更有針對(duì)性和更快的治療。這個(gè)實(shí)施例的用于治療與內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙相關(guān)的疾病的方法包括以下步驟a)用密度梯度離心的方法從血液中分離含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的細(xì)胞群；b)在細(xì)胞培養(yǎng)基上培養(yǎng)上述含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的細(xì)胞群；c)在低劑量EPO存在的條件下培養(yǎng)含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的細(xì)胞群，以刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和/或分化成為內(nèi)皮細(xì)胞；d)分離和純化已分化了的內(nèi)皮細(xì)胞；和e)把已分化的內(nèi)皮細(xì)胞移植到患有與內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙相關(guān)的疾病的機(jī)體內(nèi)。
在移植了已分化的內(nèi)皮細(xì)胞后，機(jī)體可以進(jìn)一步用EPO處理，特別是在本發(fā)明規(guī)定的低劑量下，即“與本發(fā)明要求相適應(yīng)的EPO劑量”這一段落的中所說(shuō)明的劑量，例如1～90IU/kg/周，最好是0.001～90IU/kg/周或20～2000IU/kg/周。
根據(jù)本發(fā)明，含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的細(xì)胞群的體外培養(yǎng)可以在至少一種其它活性成分存在的情況下進(jìn)行，該種活性成分可選自VEGF，PIGF，GM-CSF，HMG-CoA還原酶抑制劑，ACE抑制劑，AT-l阻斷劑和NO供體。優(yōu)選的，用于培養(yǎng)的HMG-CoA還原酶抑制劑是一種他仃類降脂藥物，例如辛伐他汀、美伐他汀或阿托伐他汀，ACE抑制劑可以是例如依那普利、雷米普利或群多普利的物質(zhì)，所述AT-1阻斷劑可以是例如依貝沙坦、氯沙坦或奧美沙坦的物質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的細(xì)胞群可以連續(xù)地、按時(shí)間先后地或同步地使用低劑量EPO以及一種或多種其它化學(xué)、熱力、機(jī)械或生物制品，通過(guò)這種方法可增加內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和增強(qiáng)其功能，和/或刺激再生或減緩組織損傷的進(jìn)程。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例涉及一種治療血管紊亂的方法，包括以下步驟a)通過(guò)密度梯度離心的方法從血液中分離含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的細(xì)胞群；b)在細(xì)胞培養(yǎng)基上培養(yǎng)含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的細(xì)胞群；c)在低劑量EPO的條件下培養(yǎng)含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的細(xì)胞群，以刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和/或分化成為內(nèi)皮細(xì)胞；d)分離和純化已分化的內(nèi)皮細(xì)胞；和e)移植內(nèi)皮細(xì)胞到患有血管紊亂的體內(nèi)。
在內(nèi)皮細(xì)胞移植到患有血管紊亂的體內(nèi)后，機(jī)體可以用EPO，特別是在本發(fā)明的低劑量下，即“與本發(fā)明要求相適應(yīng)的EPO劑量”這一段落中所定義的劑量，例如0.001～90單位/kg/周或20～2000IU/kg/周進(jìn)行進(jìn)一步處理。
根據(jù)本發(fā)明，所述含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的細(xì)胞群可以在至少一種其它活性物質(zhì)存在的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，所述活性成分可選自VEGF，PIGF，GM-CSF，ACE抑制劑，AT-1阻斷劑和/或HMG-CoA還原酶抑制劑。優(yōu)選的，所述用于培養(yǎng)的ACE抑制劑是例如依那普利、雷米普利或群多普利的物質(zhì)，AT-1阻斷劑可以是例如依貝沙坦、氯沙坦或奧美沙坦的物質(zhì)，HMG-CoA還原酶抑制劑是一種他仃類降脂藥物，例如辛伐他汀、美伐他汀或阿托伐他汀。
根據(jù)本發(fā)明，所述含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的細(xì)胞群可以連續(xù)地、按時(shí)間順序地或同步地使用低劑量EPO以及一種或多種其它的化學(xué)、熱力、機(jī)械或生物制品，通過(guò)這種方法可增加內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和增強(qiáng)其功能，和/或引起再生或減緩組織損傷的進(jìn)程。所述機(jī)械制品可以是人工假肢，例如用于替代牙齒，骨頭，韌帶/肌腱的植入支持物。所述生物制品可以是實(shí)體器官，例如肝臟、腎臟、心臟、胰腺、皮膚或植入式頭發(fā)。根據(jù)本發(fā)明，使用EPO特別是低劑量EPO，可以使同時(shí)，之前或之后植入的機(jī)械制品(例如人工假肢)，或生物制品更好、更快、更有效地與周邊的機(jī)體組織融合。因此，本發(fā)明還涉及EPO生產(chǎn)藥物組合物或試劑盒的應(yīng)用，所述藥物組合物或試劑盒可以改善、特別是促進(jìn)和/或加快生物制品或人工假肢和周邊機(jī)體組織的融合，特別是牙齒，牙齒替代物，牙齒植入物或其它人工假肢，例如骨骼替代物，骨骼植入物，特別是髖關(guān)節(jié)修復(fù)體或者韌帶或腱替代物(例如交叉韌帶)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，EPO與可用于細(xì)胞治療的細(xì)胞群和/或內(nèi)皮祖細(xì)胞聯(lián)合使用。前述EPO用于生產(chǎn)藥物組合物或試劑盒，以改善，特別是促進(jìn)和/或加快生物制品或人工假肢與周圍集體組織，(特別是病人的靶組織，靶骨骼或靶軟骨組織)的融合。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述機(jī)械制品可以由鋼，陶瓷，塑料或其它材料制成。此外，在本應(yīng)用中，成骨細(xì)胞，具有成骨潛力的細(xì)胞，血小板，血細(xì)胞或者類似制品可用作適合用于細(xì)胞治療的細(xì)胞群。在另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述機(jī)械制品特別地與有機(jī)黏合劑(例如纖維膠)一起包含在藥物組合物或藥物試劑盒中。
本發(fā)明提供了一種治療血管紊亂的方法，內(nèi)皮祖細(xì)胞可以從人體的血液中分離，使用低劑量EPO在體外擴(kuò)增并分化成為內(nèi)皮細(xì)胞，然后對(duì)分化了的內(nèi)皮細(xì)胞或正在分化的內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行純化和分離，然后選擇性的移植到受損的血管或肌肉區(qū)域，從而在該處誘導(dǎo)血管生成。通過(guò)這種方式，受損的血管或肌肉組織能夠得到更有針對(duì)性和更快的治療。這個(gè)用于治療血管紊亂的方法特別適合治療血管性疾病例如局部缺血，特別是大腦缺血，四肢缺血性病變，中風(fēng)，急性動(dòng)脈梗塞，動(dòng)脈梗塞性疾病，雷諾氏疾病和麥角中毒。
本發(fā)明其它的優(yōu)選例子在從屬權(quán)利要求中給出。
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)介紹。


圖1顯示了循環(huán)的CD34+干細(xì)胞(cSC)的FACD分析結(jié)果，(A-D)病人樣本；(E-F)同型對(duì)照；cSC的識(shí)別通過(guò)CD34標(biāo)記物(B和F)的補(bǔ)充表達(dá)，典型的低到中度CD45抗原表達(dá)(C和G)以及典型的光散射性質(zhì)(D和H)實(shí)現(xiàn)。cSC的絕對(duì)數(shù)量以每100,000個(gè)單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞來(lái)計(jì)算。
圖2顯示了流式細(xì)胞儀對(duì)循環(huán)的干細(xì)胞進(jìn)行的定量分析結(jié)果。該圖顯示了使用rhEPO(重組人EPO)處理后0，2，4，6和8周后與時(shí)間相關(guān)的結(jié)果。n＝11，結(jié)果對(duì)應(yīng)平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。中間值以直線表示。
*.p＜0.01，與2周時(shí)對(duì)照；ψp＜0.05，與4周時(shí)對(duì)照；#p＜0.05，與8周時(shí)對(duì)照。
圖3顯示了培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)的定量分析結(jié)果。該圖顯示了，rhEPO處理增加了EPC的相對(duì)數(shù)量。在用rhEPO處理前以及處理2，4，6，8周后分別從病人腎中分離EPC，根據(jù)其黏附能力和兩種標(biāo)記物acLDL-Dil和UEA-1 FITC對(duì)其進(jìn)行鑒定。n＝11，結(jié)果對(duì)應(yīng)平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。中間值以直線表示。
*.p＜0.01，與處理前比較；#p＜0.001，與處理前比較。
圖4顯示了培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)的定量分析結(jié)果。該圖顯示了，用rhEPO治療前，與相應(yīng)年齡和性別的健康個(gè)體相比，病人的EPC的絕對(duì)數(shù)量明顯減少。與對(duì)照組相比，腎貧血病人表現(xiàn)出明顯的EPC功能紊亂。腎貧血病人在用rhEPO治療8周后，減少了的功能性EPC數(shù)量得到了補(bǔ)償。在用rhEPO治療前及治療2，4，6，8周后分別從病人腎中分離EPC，根據(jù)其黏附能力和兩種標(biāo)記物acLDL-Dil和UEA-1 FITC對(duì)其進(jìn)行鑒定。n＝11。作為例子該圖給出了8周的療程和所有的對(duì)照。絕對(duì)值以單一數(shù)據(jù)形式顯示。而且，還給出了框圖(90％、75％、50％、25％和10％以及平均值)。作為健康對(duì)照組，相應(yīng)年齡和性別的試驗(yàn)個(gè)體的EPC也進(jìn)行了分離及類似的分析(n＝11)。
圖5顯示了健康的年輕試驗(yàn)人群的經(jīng)培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)的定量分析結(jié)果。該圖顯示rhEPO治療(30IU依泊艾汀β/kg體重/周)增加了EPC的相對(duì)數(shù)量。在rhEPO治療前從試驗(yàn)者中及治療1，2，3，4，5，6，7周后的病人體內(nèi)分別分離了EPC，并根據(jù)其黏附能力和兩種標(biāo)記物acLDL-Dil和UEA-1 FITC對(duì)其進(jìn)行鑒定。n＝4，結(jié)果對(duì)應(yīng)平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖6顯示了培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)的定量分析結(jié)果。這個(gè)有代表性的圖片顯示與相應(yīng)年齡和性別的健康個(gè)體相比，尿毒癥病人的EPC的絕對(duì)數(shù)量明顯減少(頂上一行＝體內(nèi))。與對(duì)照組相比，腎功能受限的病人表現(xiàn)出明顯的EPC功能障礙。用尿毒癥患者的血清培養(yǎng)健康試驗(yàn)人員的內(nèi)皮祖細(xì)胞，可以發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化能力降低(底下一行＝體外)。因此，因此，由于尿毒癥導(dǎo)致的腎功能受限可以導(dǎo)致內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能障礙。
圖7顯示了46個(gè)尿毒癥導(dǎo)致的腎功能受限的病人與46個(gè)相應(yīng)年齡和性別的健康對(duì)照者的經(jīng)培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞定量分析結(jié)果，以框圖的形式表示(90％、75％、50％、25％和10％以及平均值)。相對(duì)于健康個(gè)體，尿毒癥病人的內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。與健康對(duì)照組相比，腎功能受限的患者，具有明顯的EPC功能障礙。
圖8顯示了EPO對(duì)創(chuàng)傷愈合的作用。該圖顯示了，用組織打孔器在老鼠身上造成標(biāo)準(zhǔn)的皮膚創(chuàng)傷，在使用EPO處理7～8天后，傷口已完全愈合。作為對(duì)照的，用生理鹽水處理的傷口到13-14天后依然沒(méi)有完全愈合。EPO或生理鹽水的處理在皮膚創(chuàng)傷前7天即開始進(jìn)行。重組人EPO每周進(jìn)行皮下注射一次(0.1mg/kg Aranesp)(每組n＝5)。
圖9顯示了EPO減少了急性腎衰竭(急性腎機(jī)能不全)導(dǎo)致的腎功能的喪失。本研究中使用了Sprague Dawley鼠(250～300g)，以克他命(120mg/kg)和若朋(10mg/kg)進(jìn)行麻醉。在誘導(dǎo)急性腎衰竭前，按0.1μg/kg體重的劑量給一組試驗(yàn)鼠注射Aranesp。作為對(duì)照，同時(shí)給另一群試驗(yàn)動(dòng)物皮下注射生理鹽水。用動(dòng)脈夾夾住右腎動(dòng)脈，使流進(jìn)腎的血流被阻斷45分鐘。在這段時(shí)間內(nèi)，切除左腎。在另一群對(duì)照組中，進(jìn)行虛假手術(shù)。在該過(guò)程中，打開腹部露出左腎動(dòng)脈，在不阻止血液供應(yīng)的情況下切除對(duì)側(cè)的右腎。麻痹所有動(dòng)物60分鐘，并于手術(shù)后24小時(shí)將其處死。對(duì)于以生理鹽水處理的動(dòng)物，右腎長(zhǎng)達(dá)45分鐘的缺血以及隨后的重新灌注導(dǎo)致腎功能快速的大規(guī)模喪失。這可由血清肌氨酸酐水平在缺血-重灌注后24小時(shí)后達(dá)到之前的7倍這一事實(shí)中得到證明(p＜0.05)。與此相比，對(duì)于EPO類似物Aranesp處理過(guò)的動(dòng)物，在缺血和再灌注的誘導(dǎo)損傷1天后，血清中肌氨酸酐水平只增加了4倍。對(duì)于左腎被切除，而右腎只進(jìn)行了虛假手術(shù)的動(dòng)物，肌氨酸酐水平并沒(méi)有上升。該圖顯示了在缺血再灌注損傷24小時(shí)后，用EPO處理的(IP+EPO)，用NaCl處理的(IR)，以及進(jìn)行了虛假手術(shù)(sham OP)的動(dòng)物血清中肌氨酸酐的濃度。從圖中明顯可以看出，用Aranesp處理的動(dòng)物和沒(méi)有用Aranesp處理(用NaCl處理)的對(duì)照組動(dòng)物相比，在缺血再灌注損傷24小時(shí)后，其血清中肌氨酸酐的濃度幾乎只有后者的一半。
圖10顯示了在誘導(dǎo)急性腎衰竭后分別使用Aranesp和NaCl處理的試驗(yàn)組的Kaplan-Mayer生存曲線。本研究中使用了8周齡的Sprague Dawley鼠，以克他命(120mg/kg)和若朋(10mg/kg)麻醉。在第0天時(shí)切除右腎并立刻置于用于組織學(xué)檢查的福爾馬林中。結(jié)扎左腎的上下兩極的供血?jiǎng)用}。這樣，腎損害出現(xiàn)在相應(yīng)的腎區(qū)域，只有中間三分之一的部分還保持功能。試驗(yàn)鼠每周一次皮下注射Aranesp(0.1μg/kg體重)或NaCl。與用生理鹽水處理的動(dòng)物相比，用EPO類似物Aranesp處理的動(dòng)物表現(xiàn)出明顯的生存優(yōu)勢(shì)(p＝0.027；Log rank檢驗(yàn))。
兩組試驗(yàn)動(dòng)物組分別用Aranesp和生理鹽水處理，圖10是它們的Kaplan-Mayer生存曲線，圖11～18則顯示在誘導(dǎo)急性腎衰竭6周后，光學(xué)顯微鏡觀察到的兩個(gè)動(dòng)物組的腎切片圖。
圖11顯示了急性腎衰竭的sprague Dawley鼠經(jīng)每周一次用NaCl處理后6周內(nèi)的生理變化，NaCl處理在誘導(dǎo)急性腎衰竭后即開始。急性腎衰竭是由于右腎被切除以及左腎上下兩極的部分供血?jiǎng)用}被結(jié)扎引起的。該圖顯示了一個(gè)典型的與嚴(yán)重高血壓損傷相關(guān)的、以洋蔥皮狀血管壁增生為特征的、中等大小的腎小球前血管增生(即已知的動(dòng)脈內(nèi)膜炎引起的Fahr’s惡性腎硬化)。
圖12顯示了急性腎衰竭的Sprague Dawley鼠經(jīng)每周一次用NaCl處理后6周內(nèi)的生理變化，NaCl處理在誘導(dǎo)急性腎衰竭后即開始。急性腎衰竭是由于右腎切除以及左腎上下極的部分供血?jiǎng)用}被結(jié)扎所引起。該圖顯示了florid病灶性節(jié)段性腎小球硬化，即所謂的FSGS(右腎腎小球)增生。另一個(gè)(左側(cè))腎小球表現(xiàn)出回旋的缺血性崩潰。在圖的下部可以看到一個(gè)嚴(yán)重內(nèi)皮損傷的小血管。觀察到的生理改變是高血壓導(dǎo)致的器官損傷或與5/6腎切除后的腎負(fù)荷過(guò)重所引起。
圖13顯示了急性腎衰竭的Sprague Dawley鼠經(jīng)每周一次用NaCl處理后6周內(nèi)的生理變化，NaCl處理在誘導(dǎo)急性腎衰竭后即開始。急性腎衰竭是由于右腎切除以及左腎上下極的部分供血?jiǎng)用}被結(jié)扎所引起。該圖顯示了一個(gè)代償性增大的腎小球幾乎完全性的硬化或損傷，以及其傳入小動(dòng)脈明顯的透明變性纖維或者蛋白樣壞死。
圖14顯示了急性腎衰竭的Sprague Dawley鼠經(jīng)1每周一次用NaCl處理后6周內(nèi)的生理變化，NaCl處理在誘導(dǎo)急性腎衰竭后即開始。急性腎衰竭是由于右腎切除以及左腎的供應(yīng)腎上下極的部分供血?jiǎng)用}被結(jié)扎所引起。該圖顯示了以洋蔥皮狀血管壁增生為特征的小型腎小球前血管增生和與嚴(yán)重高血壓損傷引起的壁壞死，即所謂的惡性腎硬化(見(jiàn)右圖)。正常的(還)未受到損傷的動(dòng)脈見(jiàn)左圖。
圖15顯示了急性腎衰竭的Sprague Dawley鼠每周一次用Aranesp(EPO)處理(0.1mgAranesp/kg)后6周內(nèi)的生理變化，Aranesp處理在誘導(dǎo)急性腎衰竭后即開始。急性腎衰竭是由于右腎切除以及左腎上下極的部分供血?jiǎng)用}被結(jié)扎所引起。該圖顯示了一個(gè)輸入血管還柔軟的正常的腎小球。腎小管間質(zhì)沒(méi)有病變信號(hào)。
圖16顯示了急性腎衰竭的Sprague Dawley鼠經(jīng)每周一次用Aranesp(EPO)處理(0.1mgAranesp/kg)后6周內(nèi)的生理變化，Aranesp處理在誘導(dǎo)急性腎衰竭后即開始。急性腎衰竭是由于右腎切除以及左腎的供應(yīng)腎上下兩極的部分動(dòng)脈被結(jié)扎所引起。該圖顯示了一個(gè)具有柔軟的輸入血管的正常的腎小球(630倍放大)。腎小管間質(zhì)沒(méi)有病理信號(hào)。
圖17顯示了急性腎衰竭的Sprague Dawley鼠經(jīng)每周一次用Aranesp(EPO)處理(0。1mg Aranesp/kg)后6周內(nèi)的生理變化，Aranesp處理在誘導(dǎo)急性腎衰竭后即開始。急性腎衰竭是由于右腎切除以及左腎上下極的部分供血?jiǎng)用}被結(jié)扎所引起。該圖顯示了一個(gè)具有柔軟的輸入血管的正常的腎小球。腎小管間質(zhì)沒(méi)有病變信號(hào)。
圖18顯示了急性腎衰竭的Sprague Dawley鼠經(jīng)每周一次用Aranesp(EPO)處理(0。1mg Aranesp/kg)后6周內(nèi)的生理變化，Aranesp處理在誘導(dǎo)急性腎衰竭后即開始。急性腎衰竭是由于右腎切除以及左腎上下極的部分供血?jiǎng)用}被結(jié)扎所引起。該圖顯示了一個(gè)具有柔軟的輸入血管的正常的腎小球(630倍放大)。腎小管間質(zhì)沒(méi)有病變信號(hào)。
圖19顯示了EPO對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程的作用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、EPO對(duì)腎性貧血患者的影響研究了EPO對(duì)晚期腎病(腎衰竭死亡前；肌氨酸酐清除＜35ml/min)引起的腎性貧血(Hb＜10.5g/dl)的作用。11名患者通過(guò)靜脈注射或皮下注射的方式，以每周平均5000IUrhEPO(重組人EPO)的劑量進(jìn)行至少8周的治療。EPO治療后，對(duì)病人血液中的內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行超過(guò)20周的檢驗(yàn)，分別在EPO治療后的0，2，4，6和8周，通過(guò)流式細(xì)胞儀和培養(yǎng)測(cè)試對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和分化狀態(tài)進(jìn)行分析。
循環(huán)的外周血干細(xì)胞(CPBSC)代表了一個(gè)既表達(dá)CD34抗原又表達(dá)CD45抗原的小的細(xì)胞群。借助流式細(xì)胞儀，在ISHAGE方法的基礎(chǔ)上人們研制了一種檢測(cè)CPBSC的數(shù)量的方法(Sutherland et al.，J.Hematother.，5(1996)，213-226)。使用該測(cè)試方法，確定了CD34和CD45細(xì)胞的表達(dá)圖譜和干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)圖譜。通過(guò)這種方法，也確定了每μl CPBSC的絕對(duì)數(shù)量和CPBSC在所有白細(xì)胞中的百分含量。
圖1顯示了建立在ISHAGE基礎(chǔ)上的循環(huán)血中CD34+干細(xì)胞的FACS分析結(jié)果。
圖2顯示了用FACE分析超過(guò)8周測(cè)得的CD34+干細(xì)胞的數(shù)量。
細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試根據(jù)Asahara的方法(Science，275(1997)，964-967)，通過(guò)Ficoll密度離心法從人血樣品中分離出外周血單核細(xì)胞(PBMC)。細(xì)胞被涂布到含有纖維結(jié)合素的EC基本培養(yǎng)基的平板上培養(yǎng)。EC基本培養(yǎng)基的組成為EBM-2基本培養(yǎng)基(Clonetics公司)和EGM-2Quots(hEGF；GA-100(慶大霉素，兩性霉素B)FBS，VEGF，hFGF-B(w/肝素)，R3-IGF-1，抗壞血酸，肝素)。培養(yǎng)4天后，洗滌平板以除去非黏附細(xì)胞。保留下的黏附細(xì)胞用胰島素處理，并再次涂布。繼續(xù)培養(yǎng)3天。在分離后的第7天，根據(jù)兩種不同內(nèi)皮標(biāo)記物的陽(yáng)性染色鑒別內(nèi)皮表型的細(xì)胞。這兩個(gè)標(biāo)記物分別是Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?acLDL-Dil)和荊豆凝集素-1(UEA-1)。該檢測(cè)的結(jié)果如圖3所示。
結(jié)果顯示EPO能使內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移并增加循環(huán)中內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量。同時(shí)，該過(guò)程中，特定病理狀態(tài)下出現(xiàn)的功能不足，例如腎性貧血，得到了改善。這些結(jié)果如圖4所示。
通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在腎病末期患者的循環(huán)血液中的CD34+干細(xì)胞的數(shù)量和健康人群血液中CD34+的數(shù)量相當(dāng)。EPO治療開始后，血液中CD34+的數(shù)量顯著增加超過(guò)50％。細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試發(fā)現(xiàn)，EPO治療后，顯示出內(nèi)皮表型的細(xì)胞數(shù)量顯著增加。在一個(gè)功能型細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試中，內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能提高了3倍多。
實(shí)施例2、通過(guò)系統(tǒng)使用rhEPO促進(jìn)創(chuàng)傷愈合通過(guò)吸入麻醉的方式用異氟醚麻痹FVB/N鼠。將兩后肢用脫毛液脫毛并用70％酒精消毒。使用4mm的一次性無(wú)菌活體組織打孔器在每只試驗(yàn)鼠的右腹部造成皮膚創(chuàng)傷。對(duì)側(cè)則作為內(nèi)部對(duì)照。手術(shù)后使用青霉素G(20000單位/kg)進(jìn)行一次性抗生素處理。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每周一次使用人重組EPO類似物Aranesp(0.1μg/kg體重)進(jìn)行皮下注射。在組織打孔器制造創(chuàng)傷的前7天開始處理。結(jié)果如圖8所示。該圖顯示使用EPO能明顯地加快創(chuàng)傷的修復(fù)過(guò)程。圖19顯示EPO對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)的影響。該圖顯示，用組織打孔器在老鼠身上造成典型皮膚創(chuàng)傷，在使用低劑量EPO處理7～8天后(20IU/kg/周)，傷口已完全愈合。與此相比的是，用生理鹽水處理的傷口，在13～14天后才完全愈合。使用高劑量的EPO(200IU/kg/周)處理的動(dòng)物和對(duì)照組相比，沒(méi)有觀察到傷口愈合過(guò)程的加快。在觀察過(guò)程中，用高劑量EPO處理的試驗(yàn)動(dòng)物中有兩只死亡。用EPO或生理鹽水的處理在皮膚創(chuàng)傷造成的當(dāng)天就開始進(jìn)行。重組人EPO以皮下注射方式(20IU/kgEPO或200IU/kgEPO)每周使用一次(每組中n＝5)。
實(shí)施例3、通過(guò)EPO治療減緩慢性腎損傷的進(jìn)程8周齡的Sprague Dawley鼠用克他命(120mg/kg)和若朋(10mg/kg)麻醉。第0天時(shí)切除右腎并立刻置于福爾馬林中，用于組織學(xué)檢查。結(jié)扎左腎上下極的供血?jiǎng)用}。這樣，腎損害出現(xiàn)在相應(yīng)的腎區(qū)域，只有中間三分之一的部分還保持功能。試驗(yàn)鼠每周一次皮下注射Aranesp(0.1μg/kg體重)，對(duì)照組則注射NaCl。
圖10顯示了兩試驗(yàn)組的Kaplan-Mayer生存曲線。與用生理鹽水處理的動(dòng)物相比，用Aranesp處理后的動(dòng)物表現(xiàn)出明顯的生存優(yōu)勢(shì)。
圖15～18顯示了EPO處理過(guò)的腎組織沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的病理變化，而采用NaCl處理的腎組織可以看到嚴(yán)重的病理變化(和圖8～11相比)。進(jìn)一步的組織學(xué)研究表明，和用生理鹽水處理的動(dòng)物相比，使用Aranesp處理的動(dòng)物的血管密度(CD31)顯著增大。
實(shí)施例4減緩急性腎衰竭的進(jìn)程本研究中使用了體重為250～300g的Sprague Dawley鼠。一組試驗(yàn)鼠在誘導(dǎo)急性腎衰竭前，按0.1μg/kg體重的劑量使用Aranesp。試驗(yàn)鼠用克他命(120mg/kg)和若朋(10mg/kg)麻醉。同時(shí)，作為對(duì)照的試驗(yàn)動(dòng)物，每一只皮下注射生理鹽水。在對(duì)右腎動(dòng)脈使用動(dòng)脈夾后，阻斷血液流進(jìn)腎臟45min。同時(shí)切除左腎。在另一組對(duì)照組進(jìn)行虛假手術(shù)。在該過(guò)程中，打開腹部暴露出左腎動(dòng)脈，但是并不阻止血液供應(yīng)，對(duì)側(cè)的右腎則被切除。所有動(dòng)物在手術(shù)后被麻痹60min，并于手術(shù)后24小時(shí)處死。
在以生理鹽水處理的動(dòng)物中，對(duì)右腎的45min的缺血以及隨后的再灌注導(dǎo)致腎功能的大規(guī)?？焖賳适?。這可以由缺血24小時(shí)并重新灌注后，血清肌氨酸酐水平超過(guò)缺血再灌注前7倍這一事實(shí)得到證明(p＜0.05)。相反，用EPO類似物Aranesp處理后的動(dòng)物，經(jīng)過(guò)缺血再灌注的誘導(dǎo)損傷1天后血清中肌氨酸酐水平只增加了4倍。在進(jìn)行了左腎切除，而右腎只進(jìn)行了虛假手術(shù)的動(dòng)物中，肌氨酸酐水平?jīng)]有上升。該結(jié)果顯示于圖9中。
實(shí)施例5、腎功能受限患者體內(nèi)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化能力降低通過(guò)培養(yǎng)測(cè)試對(duì)46名尿毒癥患者及其相應(yīng)年齡和性別的健康對(duì)照組的內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化狀態(tài)進(jìn)行了分析。研究人員驚奇地發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，尿毒癥患者的內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量明顯減少(圖7)。如果分離健康人的單核細(xì)胞，并在尿毒癥患者的血清存在的條件下進(jìn)行培養(yǎng)健康人的單核細(xì)胞，則發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞分化成內(nèi)皮祖細(xì)胞的能力同樣降低(圖6)。
實(shí)施例6、刺激健康人內(nèi)皮祖細(xì)胞分化能力4個(gè)健康的年輕男性以30IU/kg體重/周的劑量用依泊艾汀β處理8周的時(shí)間。通過(guò)培養(yǎng)測(cè)試，根據(jù)以rhEPO處理前以及處理后第1，2，3，4，5，6和7周他們的細(xì)胞的黏附能力和兩個(gè)標(biāo)志物(acLDL和UEA)，測(cè)定他們的內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)EPC相對(duì)增加了50％以上。
權(quán)利要求
1.促紅細(xì)胞生成素和/或其衍生物用于生產(chǎn)預(yù)防或治療疾病的藥物組合物的應(yīng)用，所述藥物組合物含有劑量為0.001～90IU/kg人體體重/周，優(yōu)選的是0.05～50IU/kg人體體重/周的促紅細(xì)胞生成素，其特征在于，該劑量的促紅細(xì)胞生成素適合用于預(yù)防或治療具有以下癥狀的人類或動(dòng)物患者a)至少一種內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能障礙；b)至少一種心血管的危險(xiǎn)因子如高血壓、高膽固醇血癥，非對(duì)稱性二甲基精氨酸水平過(guò)高，胰島素抗性增強(qiáng)或高同型半胱氨酸血癥；c)至少一種末端器官損傷，如左心室肥大，微量白蛋白尿，認(rèn)知功能障礙，頸動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，蛋白尿或腎小球?yàn)V過(guò)率＜80ml/min、特別是30～80ml/min。
2.促紅細(xì)胞生成素和/或其衍生物用于生產(chǎn)藥物組合物的應(yīng)用，所述藥物組合物含有劑量為0.001～90IU/kg人體體重/周、優(yōu)選的是0.05～50IU/kg人體體重/周的促紅細(xì)胞生成素，其特征在于，該劑量的促紅細(xì)胞生成素適合用于人體或動(dòng)物體的美容護(hù)理，特別是用于去皺，增強(qiáng)結(jié)締組織，護(hù)膚和緊膚，免受有害環(huán)境因素影響，去斑，加快表皮再生，加快頭發(fā)生長(zhǎng)和/或作為化妝品的粉底。
3.促紅細(xì)胞生成素和/或其衍生物用于生產(chǎn)藥物組合物的應(yīng)用，所述藥物組合物含有劑量為0.001～90IU/kg人體體重/周、優(yōu)選的是0.05～50IU/kg人體體重/周的促紅細(xì)胞生成素，用于生產(chǎn)化妝品，特別是外敷產(chǎn)品，其特征在于，該劑量的促紅細(xì)胞生成素適合用于人體或動(dòng)物體的美容護(hù)理，特別是用于去皺，結(jié)締組織的增強(qiáng)，護(hù)膚和緊膚，免受有害環(huán)境因素影響，去斑，加快表皮再生，加快頭發(fā)生長(zhǎng)和/或作為彩妝粉底。
4.促紅細(xì)胞生成素和/或其衍生物用于生產(chǎn)藥物組合物的應(yīng)用，所述藥物組合物含有劑量為0.001～90IU/kg人體體重/周、優(yōu)選的是0.05～50IU/kg人體體重/周的促紅細(xì)胞生成素，和/或內(nèi)皮祖細(xì)胞和至少一種可用于細(xì)胞治療的細(xì)胞群的混合物，其特征在于，該劑量的促紅細(xì)胞生成素適合用于人體或動(dòng)物體的組織或器官的再生，且所述混合物在使用前已在體外與促血紅生成素接觸。
5.促紅細(xì)胞生成素和/或其衍生物用于生產(chǎn)藥物組合物的應(yīng)用，所述藥物組合物含有劑量為0.001～90IU/kg人體體重/周，優(yōu)選的是0.05～50IU/kg人體體重/周的促紅細(xì)胞生成素，和/或內(nèi)皮祖細(xì)胞和至少一種可用于細(xì)胞治療的細(xì)胞群的混合物，其特征在于，該劑量的促紅細(xì)胞生成素適合用于人體或動(dòng)物體的組織或器官的再生，且所述促紅細(xì)胞生成素可以在所述混合物使用之前、之后或同時(shí)使用。
6.促紅細(xì)胞生成素和/或其衍生物用于生產(chǎn)藥物組合物的應(yīng)用，所述藥物組合物含有劑量為0.001～90IU/kg人體體重/周，優(yōu)選的是0.05～50IU/kg人體體重/周的促紅細(xì)胞生成素，和/或至少一種化學(xué)，熱力，機(jī)械或生物制品、特別是藥物活性成分，用于生產(chǎn)防治或治療疾病的、含有所述劑量的促紅細(xì)胞生成素以及至少一種化學(xué)，熱力，機(jī)械或生物制品的藥物組合物和試劑盒，其特征在于，該劑量的促紅細(xì)胞生成素適合用于連續(xù)地、時(shí)控連續(xù)地或同時(shí)地使用促紅細(xì)胞生成素和至少一種化學(xué)，熱力，機(jī)械或生物制品。
7.如權(quán)利要求6所述的促紅細(xì)胞生成素的應(yīng)用，其特征在于，所述機(jī)械制品是人工假體，優(yōu)選用于牙齒，骨頭，韌帶/肌腱的替代物的植入式支持物。
8.如權(quán)利要求6所述的促紅細(xì)胞生成素的應(yīng)用，其特征在于，所述生物制品是固體器官，例如肝臟、腎臟、心臟、胰腺、皮膚或植入式頭發(fā)。
9.促紅細(xì)胞生成素和/或其衍生物用于生產(chǎn)藥物組合物的應(yīng)用，所述藥物組合物含有劑量為0.001～90IU/kg人體體重/周、優(yōu)選的是0.05～50IU/kg人體體重/周的促紅細(xì)胞生成素，其特征在于，該劑量的促紅細(xì)胞生成素適合用于預(yù)防和治療疾病，所述疾病為高膽固醇血癥，糖尿病，胰島素抗性，內(nèi)皮介導(dǎo)的慢性炎癥，內(nèi)皮增生包括網(wǎng)狀內(nèi)皮增生，動(dòng)脈粥樣硬化癥，老年性心血管疾病，四肢缺血性紊亂，子癇前癥，雷諾氏癥，肝臟疾病如肝炎，肝硬化，急性或慢性肝衰竭，骨質(zhì)和軟骨失調(diào)或損傷，粘膜失調(diào)或損傷，特別是在胃腸道中，克羅恩氏病，潰瘍性結(jié)腸炎，妊娠高血壓綜合癥，慢性或急性腎衰竭，特別是晚期腎衰竭，腎功能受限至腎小球?yàn)V過(guò)率在30～80ml/min，微量白蛋白尿，蛋白尿，或創(chuàng)傷及其后遺癥。
10.促紅細(xì)胞生成素和/或其衍生物用于生產(chǎn)藥物組合物的應(yīng)用，所述藥物組合物含有劑量為0.001～90IU/kg人體體重/周，優(yōu)選的是0.05～50IU/kg人體體重/周的促紅細(xì)胞生成素，用于生產(chǎn)含有促紅細(xì)胞生成素，內(nèi)皮祖細(xì)胞和至少一種可用于細(xì)胞治療的細(xì)胞群的試劑盒，其特征在于，所述促紅細(xì)胞生成素優(yōu)選的以低劑量存在。
11.如權(quán)利要求1～10中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述藥物組合物用于促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的生理遷移，內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖，內(nèi)皮祖細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞，和/或內(nèi)皮祖細(xì)胞向血管源性或脈管源性刺激因子的遷移。
12.如權(quán)利要求1～11所述的應(yīng)用，其特征在于，分化過(guò)程中內(nèi)皮祖細(xì)胞的附著能力有所提高。
13.如權(quán)利要求1～12所述的應(yīng)用，其特征在于，刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞引起內(nèi)皮組織的形成。
14.如權(quán)利要求1～13中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞引起新血管形成。
15.0.001～90IU/kg人體體重/周的低劑量促紅細(xì)胞生成素用于治療人體或動(dòng)物體的與內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙相關(guān)的病理狀態(tài)或疾病的應(yīng)用。
16.如權(quán)利要求15所述的應(yīng)用，其特征在于，所述內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙包括內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖能力減弱，分化成內(nèi)皮細(xì)胞的能力減弱，附著能力減弱和/或向血管源性或脈管源性刺激因子遷移的能力減弱。
17.如權(quán)利要求15或16所述的應(yīng)用，其特征在于，所述內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能障礙減弱或防止了內(nèi)皮組織和/或血管的形成。
18.如權(quán)利要求15～17任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能障礙是一個(gè)致病原因。
19.如權(quán)利要求15～18任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，與內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙相關(guān)的病態(tài)或疾病包括高膽固醇血癥，糖尿病，胰島素抗性，內(nèi)皮介導(dǎo)的慢性炎癥，內(nèi)皮增生包括網(wǎng)狀內(nèi)皮增生，動(dòng)脈粥樣硬化癥，老年性心血管疾病，四肢缺血性紊亂，子癇前癥，雷諾氏癥，肝臟疾病如肝炎，肝硬化，急性或慢性肝衰竭，骨質(zhì)和軟骨失調(diào)或損傷，粘膜失調(diào)或損傷，特別是在胃腸道中，克羅恩氏病，潰瘍性結(jié)腸炎，妊娠高血壓綜合癥，慢性或急性腎衰竭，特別是晚期腎衰竭，腎功能受限至腎小球?yàn)V過(guò)率在30～80ml/min，微量白蛋白尿，蛋白尿，高非對(duì)稱性二甲基精氨酸濃度，或創(chuàng)傷及其后遺癥。
20.低劑量、特別是0.001～90IU/kg人體體重/周的劑量的促血紅細(xì)胞生成素的應(yīng)用，其特征在于，用于治療高膽固醇血癥，糖尿病，胰島素抗性，內(nèi)皮介導(dǎo)的慢性炎癥，內(nèi)皮增生包括網(wǎng)狀內(nèi)皮增生，動(dòng)脈粥樣硬化癥，老年性心血管疾病，四肢缺血性紊亂，子癇前癥，雷諾氏癥，肝臟疾病如肝炎，肝硬化，急性或慢性肝衰竭，骨質(zhì)和軟骨失調(diào)或損傷，粘膜失調(diào)或損傷，特別是在胃腸道中，克羅恩氏病，潰瘍性結(jié)腸炎，妊娠高血壓綜合癥，慢性或急性腎衰竭，特別是晚期腎衰竭，腎功能受限至腎小球?yàn)V過(guò)率在30～80ml/min，微量白蛋白尿，蛋白尿，高非對(duì)稱性二甲基精氨酸濃度，或創(chuàng)傷及其后遺癥。
21.如權(quán)利要求1～20中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，每個(gè)星期對(duì)每個(gè)病人使用的促紅細(xì)胞生成素的劑量為0.001～90units/kg。
22.如權(quán)利要求21所述的應(yīng)用，其特征在于，每個(gè)星期對(duì)每個(gè)病人使用的促紅細(xì)胞生成素的劑量為0.05～50units/kg。
23.如權(quán)利要求1～22中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物組合物適用于胃腸道外給藥，特別是靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)的，皮內(nèi)或是皮下給藥，也可以外敷給藥。
24.如權(quán)利要求23所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物組合物的劑型為注射劑或輸液劑。
25.如權(quán)利要求1～22中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物組合物適用于肺部給藥。
26.如權(quán)利要求25所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物組合物的劑型為水溶液，非含水溶液或粉劑。
27.如權(quán)利要求25或26所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物組合物的劑型為氣霧劑。
28.如權(quán)利要求1～22中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物組合物適用于口服。
29.如權(quán)利要求28所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物組合物的劑型是溶液、懸浮液、乳液或藥片。
30.如權(quán)利要求1～29中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物組合物含有至少另一種用于刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的活性成分。
31.如權(quán)利要求30所述的應(yīng)用，其特征在于，所述另一種活性成分是VEGF，PIGF，GM-CSF，ACE抑制劑，AT-1阻斷劑，HMG-CoA還原酶抑制劑和NO供體。
32.如權(quán)利要求31所述的應(yīng)用，其特征在于，所述HMG-CoA還原酶抑制劑是辛伐他汀，美伐他汀，阿托伐他汀之類的他汀類藥物，所述ACE抑制劑是依那普利，雷米普利拉，群拉普利之類的活性成分，和/或所述AT-1阻斷劑是依貝沙坦，氯沙坦或奧美沙坦之類的活性成分。
33.促紅細(xì)胞生成素用于生產(chǎn)可移植內(nèi)皮制劑的應(yīng)用。
34.如權(quán)利要求33所述的應(yīng)用，其特征在于，內(nèi)皮細(xì)胞是通過(guò)在低劑量促紅細(xì)胞生成素、即0.001～90IU/kg人體體重/周的促紅細(xì)胞生成素存在下，由內(nèi)皮祖細(xì)胞體外培養(yǎng)而來(lái)的。
35.如權(quán)利要求33或34所述的應(yīng)用，其特征在于，所述內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)是在有至少另一種活性成分存在下進(jìn)行的，所述另一種活性成分選自VEGF，PIGF，GM-CSF，ACE抑制劑如依那普利、雷米普利拉或群拉普利，AT-1阻斷劑如依貝沙坦、氯沙坦或奧美沙坦，HMG-CoA還原酶抑制劑，特別是辛伐他汀、美伐他汀或阿托伐他汀，以及NO供體，特別是L-精氨酸。
36.低劑量促紅細(xì)胞生成素，即0.001～90IU/kg人體體重/周的促紅細(xì)胞生成素用于組織和/或器官移植的預(yù)治療和/或進(jìn)一步治療的應(yīng)用。
37.如權(quán)利要求36所述的應(yīng)用，其特征在于，所述組織或器官移植的預(yù)治療使用分離的內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行。
38.促紅細(xì)胞生成素用于可植入或可移植的、含細(xì)胞體外器官或組織系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于，在移植或植入之前所述體外器官或組織系統(tǒng)先用促血紅細(xì)胞生成素處理，以促使血管生成和/或內(nèi)皮形成。
39.如權(quán)利要求38所述的應(yīng)用，其特征在于，體外器官或組織系統(tǒng)含有內(nèi)皮祖細(xì)胞。
40.促紅細(xì)胞生成素用于生產(chǎn)人造血管或心瓣膜的應(yīng)用，其特征在于，所述人造血管或心瓣膜涂敷促紅細(xì)胞生成素。
41.如權(quán)利要求40所述的應(yīng)用，其特征在于，所述人造血管或心瓣膜的涂層包含內(nèi)皮祖細(xì)胞。
42.如權(quán)利要求1～41中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，促紅細(xì)胞生成素是人體或動(dòng)物的促紅細(xì)胞生成素。
43.如權(quán)利要求42所述的應(yīng)用，其特征在于，促紅細(xì)胞生成素是其衍生物、類似物、修飾體或突變體。
44.如權(quán)利要求42或43所述的應(yīng)用，其特征在于，促紅細(xì)胞生成素是從人體尿液中，再生障礙性貧血患者的尿液或血漿中，人體腎癌細(xì)胞的組織培養(yǎng)物中，能生成人體促紅細(xì)胞生成素的人體淋巴母細(xì)胞中，或人體或動(dòng)物細(xì)胞系的細(xì)胞融合后獲得的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中分離而來(lái)。
45.如權(quán)利要求42或43所述的應(yīng)用，其特征在于，促紅細(xì)胞生成素通過(guò)DNA重組技術(shù)而獲得。
46.一種藥物組合物，用于刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞，刺激內(nèi)皮組織形成，促使血管生成和/或治療與內(nèi)皮祖細(xì)胞功能紊亂相關(guān)的疾病或病理狀態(tài)，其特征在于，所述藥物組合物包括作為活性成分的促紅細(xì)胞生成素和/或其衍生物，類似物、修飾體或突變體，以及至少一種更具活性的成分，這種更具活性的成分選自VEGF，PIGF，GM-CSF，ACE抑制劑如依那普利、雷米普利拉或群拉普利，AT-1阻斷劑如依貝沙坦、氯沙坦或奧美沙坦，HMG-CoA還原酶抑制劑，以及NO供體，優(yōu)選的是低劑量，特別是0.001～90IU/kg人體體重/周。
47.一種藥物組合物，用于預(yù)防和/或治療用于治療高膽固醇血癥，糖尿病，胰島素抗性，內(nèi)皮介導(dǎo)的慢性炎癥，內(nèi)皮增生包括網(wǎng)狀內(nèi)皮增生，動(dòng)脈粥樣硬化癥，老年性心血管疾病，四肢缺血性紊亂，子癇前癥，雷諾氏癥，肝臟疾病如肝炎，肝硬化，急性或慢性肝衰竭，骨質(zhì)和軟骨失調(diào)或損傷，韌帶及踺失調(diào)或損傷、粘膜失調(diào)或損傷，特別是在胃腸道中，克羅恩氏病，潰瘍性結(jié)腸炎，妊娠高血壓綜合癥，慢性或急性腎衰竭，特別是晚期腎衰竭，腎功能受限至腎小球?yàn)V過(guò)率在30～80ml/min，微量白蛋白尿，蛋白尿，高非對(duì)稱性二甲基精氨酸濃度，或創(chuàng)傷及其后遺癥，其特征在于，所述藥物組合物包括所述藥物組合物包括作為活性成分的促紅細(xì)胞生成素和/或其衍生物，類似物、修飾體或突變體，優(yōu)選的是低劑量，特別是人體體重的0.001～90IU/kg/星期。
48.如權(quán)利要求47所述的藥物組合物，其特征在于還包括至少一種更具活性的成分，該更具活性的成分選自VEGF，PIGF，GM-CSF，ACE抑制劑如依那普利、雷米普利拉或群拉普利，AT-1阻斷劑如依貝沙坦、氯沙坦或奧美沙坦，HMG-CoA還原酶抑制劑，以及NO供體。
49.如權(quán)利要求46或47所述的藥物組合物，其特征在于，所述HMG-CoA還原酶抑制劑是辛伐他汀，美伐他汀，阿托伐他汀之類的他汀類藥物，所述ACE抑制劑是依那普利，雷米普利拉，群拉普利之類的活性成分，和/或所述AT-1阻斷劑是依貝沙坦，氯沙坦或奧美沙坦之類的活性成分。
50.如權(quán)利要求46或47所述的藥物組合物，其特征在于，所述NO供體是L-精氨酸。
51.如權(quán)利要求1～50任一項(xiàng)所述的促紅細(xì)胞生成素用于生長(zhǎng)預(yù)防或治療疾病的藥物組合物的應(yīng)用，其特征在于，所述促紅細(xì)胞生成素和/或藥物組合物適合人體或動(dòng)物體在上午6:00～10:00這一時(shí)段使用。
52.一種試劑盒，含有促紅細(xì)胞生成素、內(nèi)皮祖細(xì)胞和至少一種可用于細(xì)胞治療的細(xì)胞群，其特征在于，所述促紅細(xì)胞生成素優(yōu)選的以低劑量存在。
53.促紅細(xì)胞生成素和/或其衍生物用于生產(chǎn)藥物組合物或試劑盒的應(yīng)用，該藥物組合物/試劑盒中所含的劑量為0.001～90IU/kg人體體重/周、優(yōu)選的是0.05～50IU/kg人體體重/周，用于預(yù)防或治療人體或動(dòng)物體的疾病，其特征在于，所述低劑量的促紅細(xì)胞生成素適合用于改善、特別是促進(jìn)和/或加速機(jī)械或生物制劑的整合，特別是人工假體，特別是植入體，例如牙齒、牙齒替代物、骨骼植入物，骨骼替代物，特別是關(guān)節(jié)修復(fù)、韌帶或腱替代物，例如交叉韌帶，或固體器官移植或人工假體周邊的機(jī)體結(jié)構(gòu)。
54.如權(quán)利要求53所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物制劑或試劑盒還包括細(xì)胞治療劑，特別是內(nèi)皮祖細(xì)胞和/或用于組織和器官再生的細(xì)胞治療用細(xì)胞群。
55.如權(quán)利要求53或54所述的應(yīng)用，其特征在于，所述人工假體由鋼、陶瓷、塑料或其它基體材料制成。
56.一種試劑盒，其特征在于，含有劑量為0.001～90IU/kg人體體重/周、最好是0.05～50IU/kg人體體重/周的促紅細(xì)胞生成素，一種人工假體，如必要還含有一種細(xì)胞治療劑，優(yōu)選內(nèi)皮祖細(xì)胞或其它可用于細(xì)胞治療的細(xì)胞群。
全文摘要
本發(fā)明涉及低劑量促紅細(xì)胞生成素的應(yīng)用，用于刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的生理遷移、增殖和分化，用于促進(jìn)血管發(fā)生，用于治療與內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙相關(guān)的疾病，以及用于生產(chǎn)治療這些疾病的藥物組合物，還涉及含有促紅細(xì)胞生成素以及其它適合的、用于刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的活性成分的藥物組合物。
文檔編號(hào)A61P17/02GK1942200SQ200580009425
公開日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2005年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月23日
發(fā)明者費(fèi)迪南德·赫爾曼·巴爾曼, 赫爾曼·哈勒爾 申請(qǐng)人:埃博普魯斯股份有限公司